專利名稱：檢測(cè)肝癌巖藻糖基化高爾基蛋白gp73的裝置及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及了一種分離肝癌巖藻糖基化高爾基蛋白GP73(或稱為高爾基蛋白73異質(zhì)體)的預(yù)裝離心柱，還涉及了一種含有該預(yù)裝離心柱的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒和一種含有該預(yù)裝離心柱的酶聯(lián)免疫定量檢測(cè)試劑盒及這些試劑盒的制備方法，屬醫(yī)療產(chǎn)品技術(shù)領(lǐng)域，用于對(duì)肝癌的發(fā)生進(jìn)行早期診斷。
背景技術(shù)：
肝細(xì)胞癌HCC(hepatocellular carcinoma)主要的病因?qū)W是HBV或HCV慢性肝病毒感染，在肝癌發(fā)生前一般有長(zhǎng)時(shí)間的潛伏期-即感染肝病毒至肝癌發(fā)生時(shí)間。據(jù)2006年1月26日《中國(guó)醫(yī)藥報(bào)》報(bào)道以及《癌癥》2005年第六期中文章的介紹，我國(guó)現(xiàn)有乙肝病毒攜帶者1.2億左右，約占世界乙肝病毒攜帶者的1/3；有癥狀的慢性乙肝患者2000萬人，另外我國(guó)還有360萬人肝硬化患者。由于眾多的肝病患者和肝癌高危人群，我國(guó)的肝細(xì)胞癌發(fā)病率最高。根據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)估計(jì)，2000年全球肝癌發(fā)病人數(shù)為56.4萬，死亡54.9萬人；我國(guó)肝癌發(fā)病人數(shù)30.6萬，死亡30.0萬人，占全球50％。
在高危人群中建立早期診斷和監(jiān)測(cè)機(jī)制是非常重要的。早期發(fā)現(xiàn)、早期治療是提高患者生存率的關(guān)鍵，而大多數(shù)患者就診時(shí)已屆中晚期，失去了最佳治療時(shí)機(jī)，高危險(xiǎn)因素包括由乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒導(dǎo)致的慢性肝炎和肝硬化。另外要得到有效治療，篩查和普查的臨床效率依賴于早期診斷。
目前，HCC疾病傳統(tǒng)上的監(jiān)測(cè)是體檢，肝超聲影象分析和血清標(biāo)志系列檢測(cè)。
其中最常使用的血清學(xué)標(biāo)志物是甲胎蛋白AFP，由于甲胎蛋白AFP具有與HCC的相對(duì)特異性，因此目前得到廣泛應(yīng)用，但是部分良性肝病中AFP為陽性和部分肝癌中AFP為陰性，使得依靠AFP用于HCC預(yù)警和監(jiān)測(cè)帶來一定的限制，而且在檢測(cè)HCV相關(guān)的HCC不是很敏感。臨床希望獲得比甲胎蛋白更特異和更靈敏的新血清學(xué)指標(biāo)。
疾病糖生物學(xué)研究結(jié)果顯示，糖基化改變往往是疾病狀態(tài)的特點(diǎn)。惡性腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的物質(zhì)代謝有很大的不同，參與代謝的很多酶都發(fā)生活力的改變，特別是細(xì)胞增殖生長(zhǎng)有關(guān)代謝過程的酶往往明顯增高，使這一代謝過程加快，以適應(yīng)腫瘤細(xì)胞不斷分裂增殖的需要。其中糖基轉(zhuǎn)移酶也是一類在惡性腫瘤細(xì)胞中活力有明顯改變的酶。由于糖鏈的結(jié)構(gòu)是由參與糖鏈合成的各種糖基轉(zhuǎn)移酶的活力所決定，某一糖基轉(zhuǎn)移酶活力的增減可以直接影響糖鏈中某一糖基的多少，所以惡性腫瘤中糖基轉(zhuǎn)移酶活力的變化必然帶來細(xì)胞合成的糖蛋白上糖鏈結(jié)構(gòu)的相應(yīng)變化。
這些結(jié)構(gòu)異常的糖鏈可出現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞表面的糖蛋白上，這些細(xì)胞釋放或脫落的一些可溶性糖綴合物能發(fā)揮免疫抑制或拮抗作用。這種免疫抑制或拮抗作用包括干擾腫瘤相關(guān)抗原的加工與呈遞、抑制淋巴細(xì)胞的增殖，以及消除對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)行殺傷的細(xì)胞毒反應(yīng)等。此外，從癌細(xì)胞釋放的一些糖蛋白或粘蛋白，也可以中和癌患者體內(nèi)相應(yīng)的抗癌抗體而削弱抗癌免疫反應(yīng)。該過程進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞粘附、侵襲和遷移能力的改變，這是造成腫瘤細(xì)胞具有侵襲性和轉(zhuǎn)移能力的一個(gè)重要原因。
眾多研究表明肝癌發(fā)生伴隨著多種蛋白的核心巖藻糖基化。這與肝癌細(xì)胞中巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶異常相關(guān)，通常將核心巖藻糖基化的蛋白稱為其異質(zhì)體。
目前成功的作為腫瘤預(yù)警標(biāo)志物的甲胎蛋白異質(zhì)體AFP-L3就是一個(gè)典型例子，F(xiàn)DA于2005年10月批準(zhǔn)臨床將甲胎蛋白異質(zhì)體AFP-L3作為肝癌預(yù)警指標(biāo)。甲胎蛋白異質(zhì)體AFP-L3是甲胎蛋白在細(xì)胞癌變時(shí)發(fā)生的糖鏈異常的一個(gè)組分，對(duì)于檢測(cè)肝癌的發(fā)生特異性顯著提高。目前研究發(fā)現(xiàn)除了甲胎蛋白糖鏈異常之外，還有抗胰蛋白酶、轉(zhuǎn)鐵蛋白在肝細(xì)胞癌變時(shí)也伴隨產(chǎn)生糖鏈異常。99年日本科學(xué)家Akira Naitoh采用凝集素親和電泳顯影方法檢測(cè)肝病的糖基化異常，發(fā)現(xiàn)在肝癌和肝炎、肝硬化之間，甲胎蛋白異質(zhì)體、抗胰蛋白酶異質(zhì)體、轉(zhuǎn)鐵蛋白異質(zhì)體的含量和比率具有顯著性差異。檢測(cè)甲胎蛋白異質(zhì)體、抗胰蛋白酶異質(zhì)體、轉(zhuǎn)鐵蛋白異質(zhì)體對(duì)于肝癌的早期診斷具有重要意義。
GP73(Golgi Protein 73)是個(gè)II型高爾基跨膜蛋白，是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的與肝病病程相關(guān)的一個(gè)蛋白。分子量接近73KD(Kladney et al.，2000，Gene 249，53-65)。在病毒性感染的肝細(xì)胞中高表達(dá)(Kladney，et al.，2000，Gene 249，53-65)，GP73也表達(dá)在膽汁上皮細(xì)胞中。而正常肝細(xì)胞中很少。相反的，肝病患者的肝細(xì)胞顯示對(duì)GP73強(qiáng)烈免疫反應(yīng)。GP73 mRNA和蛋白在不同的轉(zhuǎn)染病毒后的HepG2肝惡性腫瘤細(xì)胞中也高表達(dá)，包括轉(zhuǎn)染腺病毒。在病毒性肝病或非病毒性促成肝病如酒精性肝病，自身免疫性肝病等中GP73顯著性的升高(Kladney，et al.，2002，Hepatology 35(6)1431-40)。
相關(guān)研究還發(fā)現(xiàn)高爾基蛋白GP73比甲胎蛋白AFP可以更早的在早期肝癌中異常升高，而且在慢性病毒性肝病也導(dǎo)致GP73上升。研究發(fā)現(xiàn)對(duì)于早期肝癌的檢測(cè)，GP73的靈敏度比AFP高出2-3倍。但是GP73在良性病毒性肝病中也異常升高，所以單獨(dú)GP73指標(biāo)來預(yù)測(cè)肝癌發(fā)生也存在特異度問題。
2006年Richard R等在Molecular & Cellular Proteomics發(fā)表文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)GP73和肝癌細(xì)胞其他相關(guān)蛋白類似，在肝細(xì)胞癌變后，GP73也發(fā)生核心巖藻糖基化，GP73的核心巖藻糖基化與肝癌的發(fā)生更為密切。實(shí)驗(yàn)證明GP73為指標(biāo)，靈敏度和特異度分別為65％、90％。而采用質(zhì)譜分析方法，以Fuc-GP73為指標(biāo)，靈敏度和特異度分別為90％和100％。
凝集素是一類廣泛存在于自然界的一大類非免疫來源的蛋白質(zhì)或糖蛋白，它能與糖專一性地、非共價(jià)地可逆結(jié)合，并且有凝集血細(xì)胞的作用，故稱為凝集素。
Sumner和Howell于1936年首先從刀豆(jackbean，Canavalia ensiformis)種子純化了伴刀豆凝集素-ConA。ConA能凝集溶液中的糖元和淀粉，ConA的血凝作用可被蔗糖抑制，因而推測(cè)ConA的血凝作用是與細(xì)胞表面糖作用的結(jié)果。
目前已有近千種植物被測(cè)得具有凝集素活性。植物中，不只種子中存在凝集素，根、莖、葉、皮、果實(shí)汁中也發(fā)現(xiàn)有凝集素。除植物外，其它生物，如各種真菌、某些病毒、無脊椎動(dòng)物、脊椎動(dòng)物及至人體的各種組織和器官中都存在凝集素。
凝集素可與糖專一性地結(jié)合。目前按結(jié)合糖的類型，凝集素可分為六類D-甘露糖或D-葡萄糖；N-乙酰氨基葡萄糖；N-乙酰氨基半乳糖；D-半乳糖；L-巖藻糖；麥胚凝集素(WGA)可專一結(jié)合唾液酸。
鑒定得最清楚的植物凝集素家族是豆科，包括刀豆蛋白凝集素ConA、小扁豆凝集素LCA等。
小扁豆學(xué)名兵豆，從小扁豆中提取的凝集素LCA(Lens culinaris lectin)，可以特異結(jié)合核心巖藻糖基，橘果粉孢凝集素AAL也一樣對(duì)核心巖藻糖基結(jié)合。
目前用于Fuc-GP73(或稱為高爾基蛋白73異質(zhì)體)的檢測(cè)方法主要是凝集素親和層析和質(zhì)譜分析方法，但是該方法都無法應(yīng)用到常規(guī)檢測(cè)中。同時(shí)傳統(tǒng)的凝集素親和層析純化糖基化蛋白，存在介質(zhì)中殘留物多，洗脫時(shí)的稀釋導(dǎo)致樣本濃度低等問題。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種分離肝癌高爾基蛋白Fuc-GP73(或稱為高爾基蛋白73異質(zhì)體)的預(yù)裝離心柱及含有該預(yù)裝柱的診斷試劑盒。通過該試劑盒可以真實(shí)地檢測(cè)出血清中Fuc-GP73的含量水平，準(zhǔn)確地診斷出早期原發(fā)性肝癌，具有極高的靈敏度，方法快速簡(jiǎn)便。
一種分離肝癌Fuc-GP73(或稱為高爾基蛋白73異質(zhì)體)的預(yù)裝離心柱，該預(yù)裝離心柱由上部分離管和下部收集管組成，所述上部分離心管裝有偶聯(lián)凝集素的親合介質(zhì)，所述下部收集管中裝有緩沖溶液，所述分離管底部有一濾布，使得瓊脂糖顆粒無法穿過的濾布。
所述凝集素包括小扁豆凝集素LCA和橘果粉孢凝集素AAL。
所述小扁豆凝集素LCA和橘胞粉凝集素AAL可以由商品化購(gòu)買獲得，例如從Sigma公司購(gòu)買。
所述親合介質(zhì)可采用瓊脂糖凝膠為基礎(chǔ)載體的介質(zhì)，如瓊脂糖凝膠sephrose 4B、瓊脂糖凝膠sephrose 6B或瓊脂糖凝膠sephrose FF，瓊脂糖凝膠sephrose CL-4B、瓊脂糖凝膠sephrose CL-6B，所述緩沖溶液為凝集素的活性保護(hù)液。
所述瓊脂糖凝膠為sephrose 4B，緩沖液為凝集素的活性保護(hù)液，含1mmol/L的CaCl2、1mmol/L的MnCl2和50mmol/L的Tris-HCL，PH 7.5。
所述濾布是能阻擋偶聯(lián)有凝集素的親合介質(zhì)穿過而不阻擋液體和蛋白質(zhì)穿過的濾布。
所述裝有偶聯(lián)扁豆凝集素的瓊脂糖凝膠由以下步驟得到的采用Pharmacia公司經(jīng)CNBr活化的Sepharose 4B偶聯(lián)LCA。
(1)將1.5g Sepharose 4B浸泡于1mmol/L HCl至膨脹，移入砂蕊漏斗，以300mL 1mmol/L HCl洗滌約30min；
(2)稱取2mgLCA，溶于7.5mL偶聯(lián)緩沖液(0.1mmol/L NaHCO3，0.5mol/L NaCl，pH 8.3)，與經(jīng)洗滌的Sepharose 4B合并，以帶塞的10mL試管上下顛倒混勻(室溫，2h)；(3)以10mL偶聯(lián)緩沖液洗去未偶聯(lián)的LCA，測(cè)定洗滌液中的LCAI含量，計(jì)得偶聯(lián)率為98％；(4)用0.2mol/L甘氨酸封閉剩余活化基因；(5)依次用10mL 0.1mol/L醋酸緩沖液(pH 4，含0.5mol/L NaCl)和0.1mol/L Tris緩沖液(pH 8，含0.5mol/L NaCl)洗滌3次，再以含0.1％BSA、1mmol/L CaCl2和0.1mmol/L MnCl2的PBS(PBS-BSA)洗滌1次，4℃暫存?zhèn)溆谩?br> 本發(fā)明提供了與微量離心柱配套使用，用于洗脫結(jié)合到LCA-Sepharose上面的Fuc-GP73的洗脫液，其制作方法和組成如下20mmTris-Hcl，NaCL 150mm，ph7.4緩沖液，其中含有500mmα-甲基-D-甘露糖苷，為保證長(zhǎng)時(shí)間保存而不長(zhǎng)菌，加入防腐劑Proclin 300至0.1％。
洗脫步驟在洗脫時(shí)，將上述溶液加入其中，在溫箱中溫育30分鐘，并離心收集達(dá)到洗脫的目的。
本發(fā) 明提供了一種采用該預(yù)裝離心柱進(jìn)行純化Fuc-GP73步驟及其相關(guān)試劑組成。
該組合包括預(yù)裝微量離心柱(內(nèi)裝已經(jīng)偶聯(lián)了小扁豆凝集素LCA的瓊脂糖和其保護(hù)液)，清洗液(20mmTris-Hcl，PH7.4緩沖液，0.1％Proclin 300)，洗脫液(20mmTris-Hcl，NaCL 150mm，ph7.4緩沖液，其中含有500mmα-甲基-D-甘露糖苷，0.1％，Proclin 300)。
1.將待檢測(cè)血清完全離心，無溶血；取出預(yù)裝微量離心柱，棄去下層收集管中液體。
2.樣本稀釋吸取250ul血清于試管中，并加入350ul清洗液稀釋、搖勻。
3.加樣吸出450ul稀釋后標(biāo)本加入上部分離心管中。37℃溫箱靜置，此操作請(qǐng)不要蓋離心管蓋子，血清稀釋液將在15分鐘內(nèi)流入下層收集管中；4.將收集管內(nèi)液體棄去；5.往上部離心管中加入清洗液600ul，等待清洗液全部流入下層收集管中(約3分鐘)，蓋上離心管蓋，2000轉(zhuǎn)(或3000轉(zhuǎn))室溫下離心1分鐘；6.棄去下層收集管中液體；7.往上部離心管中加入清洗液600ul，等待清洗液全部流入下層收集管中(約3分鐘)，蓋上離心管蓋，2000轉(zhuǎn)(或3000轉(zhuǎn))室溫下離心1分鐘；8.棄去下層收集管中液體；9.加入洗脫液450ul，等洗脫液體數(shù)滴出現(xiàn)在下層收集管時(shí)，蓋上離心管蓋，放置37℃恒溫箱中，溫育30分鐘；10.取出離心管，2000(或3000轉(zhuǎn))轉(zhuǎn)室溫下離心1分鐘；11.收集流入下層收集管中的液體(樣本1)備檢測(cè)。
本發(fā)明提供了一種含有上述預(yù)裝離心柱的化學(xué)發(fā)光試劑盒及其制作方法。
該化學(xué)發(fā)光試劑盒包括了分離Fuc-gp73(高爾基蛋白73異質(zhì)體)的預(yù)裝離心柱、包被了GP73單克隆抗體的化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)板、陽性對(duì)照物、陰性對(duì)照物、酶標(biāo)記的兔抗GP73多克隆抗體；底物溶液A、顯色液B、Fuc-gp73清洗緩沖液、Fuc-gp73洗脫液、GP73標(biāo)準(zhǔn)品。
本試劑盒的制作方法如下(1)包被將GP73單克隆抗體(市售，Santa Cruze Biotechnology公司)用0.05M檸檬酸緩沖液稀釋后加入酶標(biāo)板各孔，每孔100μl，吸附過夜，用吐溫磷酸鹽緩沖液洗板，再用含牛血清白蛋白的吐溫磷酸鹽緩沖液封閉過夜，甩干后晾干，即獲得單克隆抗體包被酶標(biāo)板?；瘜W(xué)發(fā)光酶標(biāo)板可選用國(guó)產(chǎn)板或進(jìn)口板；規(guī)格可以是96孔平板或12×8、12×4可拆條板；(2)陽性、陰性對(duì)照物陽性對(duì)照物收集GP73陽性肝癌病人腹水，過濾除菌、分裝；陰性對(duì)照物收集GP73陰性正常人血清，過濾除菌、分裝；(3)酶標(biāo)記多抗(市售，Santa Cruze Biotechnology公司)本試劑盒中的酶標(biāo)多克隆抗體是用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記抗體而制備的，步驟如下a)以NaIO4-乙二醇法進(jìn)行HRP的氧化，達(dá)到終濃度10mg/m；b)和HRP在堿性碳酸鹽緩沖液中透析6小時(shí)，實(shí)現(xiàn)HRP對(duì)抗體的標(biāo)記，反應(yīng)結(jié)束后用NaBH4溶液終止反應(yīng)，再對(duì)PBS透析過夜；c)用飽和硫酸銨沉淀，獲得純化的HRP酶標(biāo)抗GP73抗體；(4)輔助試劑的配制方法如下a)底物溶液A通過市售獲得b)顯色液B通過市售獲得c)Fuc-GP73清洗緩沖液20mmTris-Hcl，PH7.4，含0.1％Proclin 300防腐劑d)Fuc-GP73洗脫液20mmTris-Hcl，PH7.4，150mmNaCl，500mmol/L α-甲基-D-甘露糖苷，含0.1％Proclin 300防腐劑d)濃縮洗滌液(20倍濃縮液，20×)PBS(pH7.4)配制的0.05％吐溫20溶液；(5)將預(yù)裝離心柱、包被了GP73單克隆抗體的化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)板、陽性對(duì)照物、陰性對(duì)照物、酶標(biāo)記的抗GP73多抗、底物溶液A、顯色液B、Fuc-GP73清洗緩沖液、Fuc-GP73洗脫液、GP73標(biāo)準(zhǔn)品共同包裝，得到試劑盒。
本發(fā)明還提供了一種含有上述預(yù)裝離心柱的酶聯(lián)免疫定量檢測(cè)試劑盒及其制作。
該試劑盒包括了分離巖藻糖基化GP73(或高爾基蛋白GP73異質(zhì)體)的預(yù)裝離心柱；包被了高爾基蛋白GP73單克隆抗體的酶標(biāo)板；陽性對(duì)照物、陰性對(duì)照物；酶標(biāo)記的抗高爾基蛋白GP73多抗；底物溶液A、顯色液B、反應(yīng)終止液、Fuc-GP73清洗緩沖液、Fuc-GP73洗脫液、GP73標(biāo)準(zhǔn)品、濃縮洗滌液。
本試劑盒的制作方法如下(1)包被將GP73單克隆抗體(市售，Santa Cruze Biotechnology公司)用0.05M碳酸緩沖液稀釋后(稀釋濃度為20ug/ml)加入酶標(biāo)板各孔，每孔100μl，吸附過夜，用吐溫磷酸鹽緩沖液洗板，再用含牛血清白蛋白的吐溫磷酸鹽緩沖液封閉過夜，甩干后晾干，即獲得單克隆抗體包被酶標(biāo)板。酶標(biāo)板是聚苯乙烯酶標(biāo)板，可選用國(guó)產(chǎn)板或進(jìn)口板；規(guī)格可以是96孔平板或12×8、12×4可拆條板；(2)陽性、陰性對(duì)照物陽性對(duì)照物收集GP73陽性肝癌病人腹水，過濾除菌、分裝；陰性對(duì)照物收集GP73陰性正常人血清，過濾除菌、分裝；(3)酶標(biāo)記GP73多抗(市售，Santa Cruze Biotechnology公司)本試劑盒中的酶標(biāo)抗體是用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記抗體而制備的，步驟如下a)以NaIO4-乙二醇法進(jìn)行HRP的氧化，達(dá)到終濃度10mg/ml；b)抗體和HRP在堿性碳酸鹽緩沖液中透析6小時(shí)，實(shí)現(xiàn)HRP對(duì)單克隆抗體的標(biāo)記，反應(yīng)結(jié)束后用NaBH4溶液終止反應(yīng)，再對(duì)PBS透析過夜；c)用飽和硫酸銨沉淀，獲得純化的HRP酶標(biāo)抗GP73抗體；(4)輔助試劑的配制方法如下a)底物溶液A磷酸-檸檬酸緩沖液(pH5.0)配制的3％過氧化氫溶液；b)顯色液B四甲基聯(lián)苯胺(TMB)甲醇溶液，濃度為0.1mg/ml；c)GP73清洗緩沖液20mmTris-Hcl，PH7.4，含0.1％Proclin 300防腐劑
d)GP73洗脫液20mmTris-Hcl，PH7.4，150mmNaCl，500mmol/Lα-甲基-D-甘露糖苷，含0.1％Proclin 300防腐劑e)濃縮洗滌液(20倍濃縮液，20×)PBS(pH7.4)配制的0.05％吐溫20溶液；f)反應(yīng)終止液2mol/L硫酸；(5)將預(yù)裝離心柱、包被了GP73單克隆抗體的酶標(biāo)板、陽性對(duì)照物、陰性對(duì)照物、酶標(biāo)記的抗GP73多抗、底物溶液A、顯色液B、Fuc-GP73清洗緩沖液、Fuc-GP73洗脫液、反應(yīng)終止液、GP73標(biāo)準(zhǔn)品共同包裝，得到試劑盒。
本發(fā)明克服了以往檢測(cè)方法操作步驟煩瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、需要配套設(shè)備多等缺點(diǎn)，操作者只需要離心和溫育等簡(jiǎn)單操作，在2小時(shí)內(nèi)就可以完成檢測(cè)，直接定量計(jì)算出血樣標(biāo)本中所含的Fuc-GP73(高爾基蛋白73異質(zhì)體)的含量，以Fuc-GP73含量超過5ng/ml為肝癌陽性判斷，方法簡(jiǎn)便，檢測(cè)快捷，結(jié)果準(zhǔn)確，為肝癌的預(yù)防、診斷、治療提供了支持。


附圖為本發(fā)明預(yù)裝離心柱的剖面結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施例方式
下面用實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。應(yīng)該理解的是，本發(fā)明的實(shí)施例是用于說明本發(fā)明而不是對(duì)本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的具體改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
參見附圖，本發(fā)明提供的一種分離肝癌Fuc-GP73(高爾基蛋白73異質(zhì)體)的預(yù)裝離心柱，由位于上部的分離管1和位于下部的收集管3組成，通?？梢圆捎脤⒎蛛x管插接到收集管上的方式實(shí)現(xiàn)兩者的連接，所述上部分離管裝有偶聯(lián)凝集素的親合介質(zhì)4(為圖面清晰起見，圖中標(biāo)注的是用于裝親合介質(zhì)的管內(nèi)空間，沒有繪出介質(zhì)實(shí)物)，所述下部收集管中裝有緩沖溶液(為圖面清晰起見，圖中標(biāo)注的是用于裝緩沖溶液的管內(nèi)空間，沒有繪出溶液實(shí)物)，所述分離管底部主要是一濾布，該濾布采用能阻擋偶聯(lián)有凝集素的親合介質(zhì)穿過而不阻擋液體和蛋白質(zhì)穿過的濾布，以便在離心分離時(shí)，分離出來的液體和蛋白質(zhì)能夠透過該濾布進(jìn)入下面的收集管?？梢允褂矛F(xiàn)有的這種濾布，并通過在分離管底部設(shè)置一個(gè)夾持塑料墊圈，將濾布固定住。
實(shí)施例1檢測(cè)肝癌Fuc-GP73(高爾基蛋白73異質(zhì)體)的酶聯(lián)免疫定量檢測(cè)試劑盒的制作該試劑盒(96人份)組成包括GP73陰性、陽性對(duì)照物各1瓶；GP73單克隆抗體包被板(96孔)1塊；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的GP73多抗1瓶，6ml/瓶；GP73標(biāo)準(zhǔn)品1瓶；底物溶液A、顯色液B各1瓶，5ml/瓶；反應(yīng)終止液1瓶，5ml/瓶；Fuc-GP73清洗緩沖液 25ml/瓶Fuc-GP73洗脫液 15ml/瓶濃縮洗滌液(20倍濃縮液，20×) 20ml/瓶具體操作如下1.制備GP73-陰性、陽性對(duì)照物1)收集血清從醫(yī)院或血站獲得健康正常人血清、肝癌病人腹水，于-70℃保存?zhèn)溆茫?)分裝GP73陽性對(duì)照物肝癌陽性病人腹水，在無菌條件下分裝入1.5mleppendorf管中，每管0.5ml。貯存于4℃；
陰性對(duì)照物正常人血清，經(jīng)檢定為GP73陰性。取多份以上血清合并成批，經(jīng)60℃1小時(shí)處理后，過濾除菌。在無菌的條件下分裝入1.5ml eppendorf管中，每管0.5ml。貯存于4℃。
2.制作GP73單克隆抗體包被板a)包被酶標(biāo)板采用進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)的12×8可拆條板。將GP73單克隆抗體用0.05mol/L碳酸鹽緩沖液稀釋為20μg/ml后加入酶標(biāo)板各孔，每孔100μl，吸附過夜，用清洗緩沖液洗板，再用該封閉液2％BSA封閉過夜，甩干后晾干，即獲得單克隆抗體包被酶標(biāo)板。按96孔/塊用鋁箔袋包裝、真空封閉；b)制備辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔抗GP73多抗兔抗GP73多抗可以商品化購(gòu)得。
3.抗體的標(biāo)記1)酶的氧化(全過程避光)a)稱取HRP 5mg，加ddH2O 250μl溶解；b)稱取NaIO45mg，加ddH2O 250μl溶解，配制成20mg/mL的濃度；c)往HRP溶液中逐滴加入NaIO4溶液，邊加邊攪拌；d)將混合好的溶液置于4℃，靜置30分鐘；e)取5ml乙二醇溶于25μl ddH2O中，逐滴加入上述混合溶液中，邊加邊攪拌；f)室溫靜置30分鐘；g)酶氧化過程完成，HRP終濃度為10mg/ml。
2)抗體的準(zhǔn)備及標(biāo)記(避光)a)調(diào)整抗體濃度到5mg/ml左右(蛋白濃度過低則用PEG20000濃縮)，用pH9.5左右的50mmol/L CB(1mol/L NaHCO3與1mol/L Na2CO3按10∶1的比例混合，使用前以蒸餾水稀釋20倍)透析去甘油或雜質(zhì)(如Tris)，4℃下透析過夜，其中換液3次；b)將抗體與HRP按1∶4混合，于50mmol/L pH9.5 CB中透析6小時(shí)以上，前兩個(gè)小時(shí)換液一次；c)用新鮮配置的1mg NaBH4溶液終止反應(yīng)。搖勻，4℃靜置2小時(shí)，每半小時(shí)搖一次，NaBH4溶液加入的量要合適；d)用pH7.2的10 mM PBS(預(yù)配置0.01mol/L的Na2HPO4和NaH2PO4儲(chǔ)備液，根據(jù)需要的pH值混勻二者成PBS緩沖液)透析過夜。換液一次即可。
3)純化HRP酶標(biāo)抗GP73抗體a)完成標(biāo)記的GP73抗體溶液中逐滴加入飽和硫酸銨溶液，邊加入邊攪拌，直至飽和硫酸銨濃度降低至1/3；b)4℃靜置1小時(shí)；c)8000rpm離心10分鐘，將上清移至新管中，沉淀用等體積PBS重新懸??；d)重復(fù)以上操作，將飽和硫酸銨濃度提高到40％，分別收集上清和沉淀；e)重復(fù)以上操作，將飽和硫酸銨濃度提高到50％，分別收集上清和沉淀；f)重復(fù)以上操作，將飽和硫酸銨濃度提高到60％，分別收集上清和沉淀；g)收集分離的各個(gè)組分，SDS-PAGE鑒定純度；h)提純的HRP-多抗對(duì)PBS透析過夜；i)超濾管離心濃縮純化的HRP-多抗，獲得克分子比接近1∶8的酶標(biāo)抗單克隆抗體。
4)分裝用含10％胎牛血清的緩沖液稀釋由步驟3)獲得的酶標(biāo)抗GP73多抗至合適的工作濃度，按6ml/瓶分裝，貯存于4℃。
4.輔助試劑的配制
1)底物溶液A磷酸-檸檬酸緩沖液(PH5.0)配制的3％過氧化氫溶液，按5ml/瓶分裝；2)顯色液BTMB(0.1mg/ml)甲醇溶液，按5ml/瓶分裝；3)反應(yīng)終止液2mol/L H2SO4，按3ml/瓶分裝；4)Fuc-GP73清洗緩沖液20mmTris-Hcl，PH7.4，含0.1％Proclin 300防腐劑5)Fuc-GP73洗脫液20mmTris-Hcl，PH7.4，150mmNaCl，500mmol/L α-甲基-D-甘露糖苷，含0.1％Proclin 300防腐劑6)濃縮洗滌液(20倍濃縮液，20×)PBS(pH7.4)配制的0.05％吐溫20溶液；實(shí)施例2檢測(cè)肝癌巖藻糖基GP73(高爾基蛋白73異質(zhì)體)的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒的制作該試劑盒(48人份)組成包括GP73陰性、陽性對(duì)照各1瓶；GP73單克隆抗體包被板(96孔)1塊；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的GP73多抗1瓶，6ml/瓶；GP73標(biāo)準(zhǔn)品1瓶底物溶液A、顯色液B各1瓶，5ml/瓶；Fuc-GP73清洗緩沖液 25ml/瓶Fuc-GP73洗脫液 15ml/瓶濃縮洗滌液(20倍濃縮液，20×) 20ml/瓶具體操作如下1.制備GP73-陰性、陽性對(duì)照物1)收集血清從醫(yī)院或血站獲得正常人血清、肝癌病人腹水，于-70℃保存?zhèn)溆茫?)分裝
GP73陽性對(duì)照物肝癌陽性病人腹水，在無菌條件下分裝入1.5mleppendorf管中，每管0.5ml。貯存于4℃；GP73陰性對(duì)照血清正常人血清，經(jīng)檢定為GP73陰性。取多份以上血清合并成批，經(jīng)60℃1小時(shí)處理后，過濾除菌。在無菌的條件下分裝入1.5mleppendorf管中，每管0.5ml。貯存于4℃。
2.制作GP73單克隆抗體包被板a)包被化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)板采用進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)的12×8可拆條板。將步驟1)AFP單克隆抗體用0.05mol/L檸檬酸緩沖液稀釋為20μg/ml后加入酶標(biāo)板各孔，每孔100μl，吸附過夜，用清洗緩沖液洗板，再用該封閉液緩沖液封閉過夜，甩干后晾干，即獲得單克隆抗體包被酶標(biāo)板。按96孔/塊用鋁箔袋包裝、真空封閉；b)制備辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗GP73多抗兔抗GP73抗體可以商品化購(gòu)得。
3.抗體的標(biāo)記1)酶的氧化(全過程避光)a)稱取HRP 5mg，加ddH2O 250μl溶解；b)稱取NaIO45mg，加ddH2O 250μl溶解，配制成20mg/mL的濃度；c)往HRP溶液中逐滴加入NaIO4溶液，邊加邊攪拌；d)將混合好的溶液置于4℃，靜置30分鐘；e)取5ml乙二醇溶于25μl ddH2O中，逐滴加入上述混合溶液中，邊加邊攪拌；f)室溫靜置30分鐘；g)酶氧化過程完成，HRP終濃度為10mg/ml。
2)抗體的準(zhǔn)備及標(biāo)記(避光)
a)調(diào)整抗體濃度到5mg/ml左右(蛋白濃度過低則用PEG20000濃縮)，用pH9.5左右的50mmol/L CB(1mol/L NaHCO3與1mol/L Na2CO3按10∶1的比例混合，使用前以蒸餾水稀釋20倍)透析去甘油或雜質(zhì)(如Tris)，4℃下透析過夜，其中換液3次；b)將抗體與HRP按1∶4混合，于50mmol/L pH9.5 CB中透析6小時(shí)以上，前兩個(gè)小時(shí)換液一次；c)用新鮮配置的1mg NaBH4溶液終止反應(yīng)。搖勻，4℃靜置2小時(shí)，每半小時(shí)搖一次，NaBH4溶液加入的量要合適；d)用pH7.2的10mM PBS(預(yù)配置0.01mol/L的Na2HPO4和NaH2PO4儲(chǔ)備液，根據(jù)需要的pH值混勻二者成PBS緩沖液)透析過夜。換液一次即可。
3)純化HRP酶標(biāo)抗GP73抗體a)完成標(biāo)記的單克隆抗體溶液中逐滴加入飽和硫酸銨溶液，邊加入邊攪拌，直至飽和硫酸銨濃度降低至1/3；b)4℃靜置1小時(shí)；c)8000rpm離心10分鐘，將上清移至新管中，沉淀用等體積PBS重新懸??；d)重復(fù)以上操作，將飽和硫酸銨濃度提高到40％，分別收集上清和沉淀；e)重復(fù)以上操作，將飽和硫酸銨濃度提高到50％，分別收集上清和沉淀；f)重復(fù)以上操作，將飽和硫酸銨濃度提高到60％，分別收集上清和沉淀；g)收集分離的各個(gè)組分，SDS-PAGE鑒定純度；h)提純的HRP-多抗對(duì)PBS透析過夜；
i)超濾管離心濃縮純化的HRP-多抗，獲得克分子比接近1∶8的酶標(biāo)抗多抗。
4)分裝用含10％胎牛血清的緩沖液稀釋由步驟3獲得的酶標(biāo)抗GP73多抗至合適的工作濃度，按6ml/瓶分裝，貯存于4℃。
4.輔助試劑的配制1)底物溶液A1.0ml EDTA(1.0×10-2M、1.0ml H2O2(7.5×10-3M)、0.4ml HCl(1.0×10-2M)和0.2ml Tween20(1％)2)顯色液Bluminol 5.0×10-4Mol/L；3)Fuc-GP73清洗緩沖液20mmTris-Hcl，PH7.4，含0.1％Proclin 300防腐劑4)Fuc-GP73洗脫液20mmTris-Hcl，PH7.4，150mmNaCl，500mmol/Lα-甲基-D-甘露糖苷，含0.1％Proclin 300防腐劑5)濃縮洗滌液(20倍濃縮液，20×)PBS(pH7.4)配制的0.05％吐溫20溶液；實(shí)施例3預(yù)裝離心柱的制備和使用1、預(yù)裝離心柱由離心柱和填充介質(zhì)組成，離心柱由上部的離心管和下部的收集管組成，二者套在一起，組成離心柱，輔助試劑包括Fuc-GP73清洗液和Fuc-GP73洗脫液。
2、離心柱填充材料的制備采用Pharmacia公司經(jīng)CNBr活化的Sepharose4B和Sigma公司的LCA，按以下步驟偶聯(lián)(1)將1.5g Sepharose 4B浸泡于1mmol/L HCl至膨脹，移入砂蕊漏斗，以300mL 1mmol/L HCl洗滌約30min；(2)稱取50mg LCA，溶于7.5mL偶聯(lián)緩沖液(0.1mmol/L NaHCO3，pH8.3，0.5mol/L NaCl)，與經(jīng)洗滌的Sepharose 4B合并，以帶塞的10mL試管上下顛倒混勻(室溫，2h)；
(3)以10mL偶聯(lián)緩沖液洗去未偶聯(lián)的LCA。經(jīng)測(cè)定洗滌液中的LCA1含量，計(jì)得偶聯(lián)率為98％；(4)用0.2mol/L甘氨酸封閉剩余活化基因；(5)依次用10mL 0.1mol/L醋酸緩沖液(pH 4，含0.5mol/L NaCl)和0.1mol/L Tris緩沖液(pH 8，含0.5mol/L NaCl)洗滌3次，再以含0.1％BSA，1mmol/L CaCl2和0.1mmol/L MnCl2的PBS(PBS-BSA)洗滌1次，4℃暫存?zhèn)溆谩?br> 3、在上部分離心管中，加入一層濾布，并加一個(gè)塑料墊圈固定，該濾布的孔徑小于瓊脂糖，因此瓊脂糖不能經(jīng)過，但是蛋白質(zhì)量和液體可以流過。取300ul已經(jīng)偶聯(lián)的凝集素的sephrose 4B加入離心柱上部的離心管中。
4、加入1ml-2ml凝集素保存緩沖液，緩沖液充滿存在介質(zhì)的部位，并大部分存在于下面的收集管中，本發(fā)明預(yù)裝離心柱下部收集管中的緩沖液含1mmol/L的CaCl2、1mmol/L MnCl2和50mmol/L Tris-HCL，PH 7.5本預(yù)裝離心柱的使用方法如下1.將待檢測(cè)血清完全離心，無溶血；取出預(yù)裝微量離心柱，棄去下層收集管中液體。
2.樣本稀釋吸取250ul血清于試管中，并加入350ul清洗液稀釋、搖勻。
3.加樣吸出450ul稀釋后標(biāo)本加入上部分離心管中。37℃溫箱靜置，此操作請(qǐng)不要蓋離心管蓋子，血清稀釋液將在15分鐘內(nèi)流入下層收集管中；4.將收集管內(nèi)液體棄去；5.往上部離心管中加入清洗液600ul，等待清洗液全部流入下層收集管中(約3分鐘)，蓋上離心管蓋，2000轉(zhuǎn)(或3000轉(zhuǎn))室溫下離心1分鐘；6.棄去下層收集管中液體；
7.往上部離心管中加入清洗液600ul，等待清洗液全部流入下層收集管中(約3分鐘)，蓋上離心管蓋，2000轉(zhuǎn)(或3000轉(zhuǎn))室溫下離心1分鐘；8.棄去下層收集管中液體；9.加入洗脫液450ul，等洗脫液體數(shù)滴出現(xiàn)在下層收集管時(shí)，蓋上離心管蓋，放置37℃恒溫箱中，溫育30分鐘；10.取出離心管，2000(或3000轉(zhuǎn))轉(zhuǎn)室溫下離心1分鐘；11.收集流入下層收集管中的液體(樣本1)備檢測(cè)。
本發(fā)明的試劑盒的質(zhì)量檢測(cè)方法是1)蛋白載量偶聯(lián)LCA的含量通過計(jì)算偶聯(lián)前蛋白含量減去未偶聯(lián)蛋白獲得含量。要求不低于7mg/ml，在7mg/ml-10mg/ml可以取得較好的結(jié)果。
2)準(zhǔn)確性10份正常陰性質(zhì)控血清(包括特異性對(duì)照血清)參考品的檢測(cè)結(jié)果，無假陽性出現(xiàn)。5份肝癌GP73陽性質(zhì)控血清的參考品檢測(cè)結(jié)果無假陰性出現(xiàn)。
3)精密度隨機(jī)抽取20盒不同批次試劑盒，用同一份肝癌陽性質(zhì)控血清按說明書操作步驟進(jìn)行重復(fù)測(cè)定。計(jì)算每次測(cè)定結(jié)果，求出均值、SD和變異系數(shù)CV。精密度試驗(yàn)結(jié)果顯示批間CV小于15％。
3)檢測(cè)靈敏度根據(jù)GP73標(biāo)準(zhǔn)品稀釋測(cè)定結(jié)果，本試劑盒的檢測(cè)靈敏度為1ng/ml。
4)特異性取四份待測(cè)樣品混合后分為四份混合血清標(biāo)本，每份1ml。分別加入50ng劑量的組織型纖溶酶原激活劑(tPA)、血纖維蛋白溶酶(Plasmin)、或纖粘連蛋白(FN)后制成干擾試驗(yàn)血清標(biāo)本#1、#2、#3，未加任何干擾物的#4混合血清標(biāo)本作為基礎(chǔ)樣品。按說明書操作步驟進(jìn)行測(cè)定并計(jì)算結(jié)果。然后按干擾試驗(yàn)計(jì)算公式計(jì)算干擾率。標(biāo)本#1、#2、#3的干擾誤差均小于5％。
實(shí)施例4用本發(fā)明提供的檢測(cè)肝癌Fuc-GP73(高爾基蛋白73異質(zhì)體)的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒進(jìn)行Fuc-GP73含量檢測(cè)的方法和步驟是一、試劑盒組成1，鼠抗人GP73單抗包被板2，兔抗人GP73多抗酶標(biāo)記物3，化學(xué)發(fā)光底物A和B4，濃縮洗滌液5，預(yù)裝LCA-Sepharose 4B離心管6，LCA清洗液7，LCA洗脫液8，GP73定量標(biāo)準(zhǔn)品9，說明書10，蓋板膜二、標(biāo)本處理和Fuc-GP73純化1.將待檢測(cè)血清完全離心，無溶血；取出預(yù)裝微量離心柱，棄去下層收集管中液體。
2.樣本稀釋吸取250ul血清于試管中，并加入350ul清洗液稀釋、搖勻。
3.加樣吸出450ul稀釋后標(biāo)本加入上部分離心管中。37℃溫箱靜置，此操作請(qǐng)不要蓋離心管蓋子，血清稀釋液將在15分鐘內(nèi)流入下層收集管中；4.將收集管內(nèi)液體棄去；5.往上部離心管中加入清洗液600ul，等待清洗液全部流入下層收集管中(約3分鐘)，蓋上離心管蓋，2000轉(zhuǎn)(或3000轉(zhuǎn))室溫下離心1分鐘；6.棄去下層收集管中液體；
7.往上部離心管中加入清洗液600ul，等待清洗液全部流入下層收集管中(約3分鐘)，蓋上離心管蓋，2000轉(zhuǎn)(或3000轉(zhuǎn))室溫下離心1分鐘；8.棄去下層收集管中液體；9.加入洗脫液450ul，等洗脫液體數(shù)滴出現(xiàn)在下層收集管時(shí)，蓋上離心管蓋，放置37℃恒溫箱中，溫育30分鐘；10.取出離心管，2000(或3000轉(zhuǎn))轉(zhuǎn)室溫下離心1分鐘；11.收集流入下層收集管中的液體(樣本1)備檢測(cè)。
三、定量檢測(cè)Fuc-GP731.設(shè)計(jì)好包被板的位置及數(shù)量，未用的包被板密閉，放入到2-8℃冰箱中。
2.加入50μl已處理樣本1到相應(yīng)的包被板微孔中。
3.37℃溫育30分鐘。
4.洗滌5次，扣干包被板上殘留的液體。
5.依次向各孔中加入100μl的酶結(jié)合物。
6.37℃溫育30分鐘7.洗滌5次，扣干包被板上殘留的液體8.向每孔加入50μl底物液，請(qǐng)預(yù)先將A、B液等體積混合；或向每孔中先加25μl底物A再加25μl底物B，輕輕拍勻5秒鐘。
9.在加入底物后10分鐘內(nèi)采用化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行檢測(cè)。
四、結(jié)果判定制作標(biāo)準(zhǔn)曲線以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定的RLU值為縱坐標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線；計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸系數(shù)R2，當(dāng)R2＞0.95時(shí)本次測(cè)定有效；將檢測(cè)所得的讀值按該試劑標(biāo)準(zhǔn)品曲線計(jì)算Fuc-GP73含量，F(xiàn)uc-GP73含量大于5ng/ml為肝癌陽性判斷。
實(shí)施例5采用本發(fā)明提供的試劑盒對(duì)肝癌病人陽性樣品的檢測(cè)結(jié)果
為判斷本發(fā)明化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒和酶聯(lián)免疫試劑盒與臨床肝癌檢測(cè)結(jié)果的符合率，取本發(fā)明的兩種試劑盒進(jìn)行了對(duì)比檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。采用北京佑安醫(yī)院提供的標(biāo)本進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)50份已知原發(fā)性肝癌陽性標(biāo)本，30份肝硬化血清、80份肝炎，這些肝病標(biāo)本均為臨床病理確診。采用河北紅十字血液中心200份體檢健康血清。分別用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒及酶聯(lián)免疫定量檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)(2種方法檢測(cè)不一致時(shí)以陽性數(shù)量多者計(jì)算)，結(jié)果見表1。
表1.在不同標(biāo)本中檢出率比較

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明對(duì)于50份原發(fā)性肝癌的陽性符合率高達(dá)100％，在肝硬化中的特異性高達(dá)94％，在肝炎中的特異度高達(dá)90％。
權(quán)利要求
1.一種分離巖藻糖基化高爾基蛋白GP73的預(yù)裝離心柱，其特征在于其由上部分離管和下部收集管組成，所述上部離管裝有偶聯(lián)凝集素的親合介質(zhì)，上部的分離管底部有一濾布，所述下部收集管中裝有緩沖溶液。為純化親和吸附的蛋白，并配套清洗液和洗脫液。
2，如權(quán)利要求1所述的分離巖藻糖基化高爾基蛋白GP73的預(yù)裝離心柱，其特征在于所述凝集素為小扁豆凝集素LCA或橘果粉孢凝集素AAL。
3.如權(quán)利要求1所述的分離巖藻糖基化高爾基蛋白GP73的預(yù)裝離心柱，其特征在于所述親和介質(zhì)是采用瓊脂糖凝膠為基礎(chǔ)載體，包括瓊脂糖凝膠sepharose 4B、瓊脂糖凝膠sepharose 6B、或瓊脂糖凝膠sepharose FF、瓊脂糖凝膠sepharose CL-4B、瓊脂糖凝膠sepharose CL-6B。所述緩沖溶液為凝集素的活性保護(hù)液。
4.如權(quán)利要求1所述的分離巖藻糖基化高爾基蛋白GP73的預(yù)裝離心柱，其特征在于所述濾布是能阻擋偶聯(lián)有凝集素的親和介質(zhì)穿過而不阻擋液體和蛋白質(zhì)穿過的濾布。
5.如權(quán)利要求3所述的分離巖藻糖基化高爾基蛋白GP73的預(yù)裝離心柱，其特征在于所述裝有偶聯(lián)小扁豆凝集素的瓊脂糖凝膠通過以下步驟獲得(1)將溴化氫活化的Sepharose 4B用1mmol/L HCl浸泡、洗滌；(2)稱取LCA，溶于偶聯(lián)緩沖液中，與經(jīng)洗滌的Sepharose 4B合并混勻；(3)用偶聯(lián)緩沖液洗去未偶聯(lián)的LCA，測(cè)定洗滌液中的LCA含量。(4)用甘氨酸封閉剩余活化基因，洗滌，4℃暫存?zhèn)溆谩?br> 6.如權(quán)利要求1所述的分離巖藻糖基化高爾基蛋白GP73的預(yù)裝離心柱，其特征在于下部收集管中的緩沖液含1mmol/L的CaCl2、1mmol/L的MnCl2和50mmol/L的Tris-HCL，PH7.5。
7，如權(quán)利要求1所指的預(yù)裝離心柱的使用配套溶液包括清洗緩沖液(20mmol/L Tris-HcL，PH7.4)和洗脫緩沖液(20mmol/LTris-HcL，PH7.4，500mmol/L α-甲基-D-甘露糖苷)。
8.一種檢測(cè)巖藻糖基化高爾基蛋白GP73的定量檢測(cè)試劑盒，其特征為試劑盒所含的標(biāo)本處理系統(tǒng)如權(quán)利要求1所述，經(jīng)過權(quán)利要求1所述的裝置進(jìn)行離心、洗脫獲得Fuc-GP73后，然后進(jìn)行定量檢測(cè)，方法包括放射免疫測(cè)定法、熒光免疫測(cè)定法(時(shí)間分辨熒光技術(shù))、酶免疫測(cè)定法、免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)、化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定法、電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定法。
9.一種如權(quán)利要求8所述的檢測(cè)巖藻糖基化GP73的定量檢測(cè)試劑盒，其特征為標(biāo)本處理系統(tǒng)如權(quán)利要求1所述，檢測(cè)GP73和Fuc-GP73含量采用化學(xué)發(fā)光方法，檢測(cè)試劑盒包括下列組件(1)分離巖藻糖基化GP73的預(yù)裝離心柱；(2)包被了GP73抗體的化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)板；(3)陽性對(duì)照物、陰性對(duì)照物；(4)酶標(biāo)記的抗GP73抗體；(5)化學(xué)發(fā)光底物溶液A、化學(xué)發(fā)光底物顯色液B、Fuc-GP73清洗緩沖液、Fuc-GP73洗脫液、GP73標(biāo)準(zhǔn)品。所述分離肝癌巖藻糖基化GP73的預(yù)裝離心柱由上部分離管和下部收集管組成，所述上部分離管裝有偶聯(lián)凝集素的親合介質(zhì)，所述下部收集管中裝有緩沖溶液。
10.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其制作方法包括以下步驟(1)高滴度的GP73單克隆抗體包被到酶標(biāo)板吸附過夜；(2)用吐溫磷酸鹽緩沖液洗板，再用含牛血清白蛋白的吐溫磷酸鹽緩沖液封閉過夜，甩干后晾干；(3)收集GP73陽性肝癌病人腹水，過濾除菌、分裝，即獲得陽性對(duì)照物或作為陽性質(zhì)控血清。收集GP73陰性正常人血清，過濾除菌、分裝，即獲得陰性對(duì)照物；(4)獲得酶標(biāo)記的兔抗GP73多抗；(5)將預(yù)裝離心柱、包被了GP73單克隆抗體的化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)板、陽性對(duì)照物、陰性對(duì)照物、酶標(biāo)記的兔抗GP73多抗、底物溶液A、顯色液B、Fuc-GP73清洗緩沖液、Fuc-GP73洗脫液、GP73標(biāo)準(zhǔn)品、濃縮洗滌液共同包裝，得到試劑盒。
11.一種如權(quán)利要求8所述的檢測(cè)肝癌巖藻糖基化高爾基蛋白GP73的定量檢測(cè)試劑盒，其特征為標(biāo)本處理系統(tǒng)如權(quán)利要求1所述，檢測(cè)Fuc-GP73含量采用酶聯(lián)免疫定量分析方法，檢測(cè)試劑盒包括下列組件(1)分離肝癌巖藻糖基化高爾基蛋白GP73的預(yù)裝離心柱；(2)包被了GP73抗體的酶標(biāo)板；(3)陽性對(duì)照物、陰性對(duì)照物；(4)酶標(biāo)記的兔抗GP73多抗；(5)底物溶液A、顯色液B、Fuc-GP73清洗緩沖液、Fuc-GP73洗脫液、反應(yīng)終止液、GP73標(biāo)準(zhǔn)品、濃縮洗滌液，所述分離肝癌巖藻糖基化高爾基蛋白GP73的預(yù)裝離心柱由上部分離管和下部收集管組成，所述上部分離管裝有偶聯(lián)凝集素的親合介質(zhì)，所述下部收集管中裝有緩沖溶液。
12.如權(quán)利要求11所述的試劑盒，其制作方法包括以下步驟(1)高滴度的GP73單克隆抗體(市售)包被到酶標(biāo)板吸附過夜；(2)用吐溫磷酸鹽緩沖液洗板，再用含牛血清白蛋白的吐溫磷酸鹽緩沖液封閉過夜，甩干后晾干；(3)收集GP73陽性肝癌病人腹水，過濾除菌、分裝，即獲得陽性對(duì)照物。收集GP73陰性正常人血清，過濾除菌、分裝，即獲得陰性對(duì)照物。(4)獲得酶標(biāo)記的兔抗GP73多抗；(5)將預(yù)裝離心柱、包被了GP73單克隆抗體的酶標(biāo)板、陽性對(duì)照物、陰性對(duì)照物、酶標(biāo)記的兔抗GP73多抗、底物溶液A、顯色液B、Fuc-GP73清洗緩沖液、Fuc-GP73洗脫液、反應(yīng)終止液、GP73標(biāo)準(zhǔn)品、濃縮洗滌液共同包裝，得到試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明涉及了一種分離肝癌相關(guān)巖藻糖基化高爾基蛋白73(或稱為高爾基蛋白73異質(zhì)體)的預(yù)裝離心柱。該離心柱由上部分離管和下部收集管組成。上部分離管裝有偶聯(lián)小扁豆凝集素(LCA)的親合介質(zhì)，上部分離管底部是一個(gè)濾布，下部收集管中裝有緩沖溶液。小扁豆凝集素(LCA)能與巖藻糖基化高爾基蛋白73上的糖鏈相結(jié)合，通過加入洗脫液并離心進(jìn)行純化Fuc－GP73組分。本發(fā)明還涉及了一種含有該預(yù)裝離心柱的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒和一種含有該預(yù)裝離心柱的酶聯(lián)免疫定量檢測(cè)試劑盒及其制備、使用方法。應(yīng)用該試劑盒可快速、簡(jiǎn)便的測(cè)定肝癌巖藻糖基化高爾基蛋白73的含量，準(zhǔn)確的對(duì)肝癌進(jìn)行早期診斷，為肝癌的預(yù)防、診斷、治療提供支持。
文檔編號(hào)G01N33/68GK101062939SQ200710107508
公開日2007年10月31日 申請(qǐng)日期2007年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月17日
發(fā)明者林長(zhǎng)青 申請(qǐng)人:北京熱景生物技術(shù)有限公司