交叉引用

本申請(qǐng)要求于2014年8月13日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列第62/037,057號(hào)的權(quán)益，本申請(qǐng)為了所有目的通過引用并入。

背景

5-甲基胞嘧啶是甲基化形式的dna堿基胞嘧啶，其據(jù)信參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控。當(dāng)胞嘧啶被甲基化時(shí)，dna保持相同的序列，但是甲基化基因的表達(dá)可改變。

該化學(xué)物質(zhì)的功能在物種之間顯著變化：在細(xì)菌中，5-甲基胞嘧啶可在多個(gè)位點(diǎn)處存在，且通常用作保護(hù)dna免受天然甲基化-敏感限制酶切除的標(biāo)記物；在植物中，5-甲基胞嘧啶在cpg、cphpg和cphph序列(其中h＝a、c或t)處存在；并且，在真菌和動(dòng)物中，5-甲基胞嘧啶主要在cpg二核苷酸處發(fā)生。大部分真核生物僅甲基化小百分比的這些位點(diǎn)，但在脊椎動(dòng)物中70-80％的cpg胞嘧啶被甲基化。

脊椎動(dòng)物中的胞嘧啶甲基化通常在cpg位點(diǎn)(胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤位點(diǎn)，即其中在dna序列中胞嘧啶后面緊跟的是鳥嘌呤)處發(fā)生。me-cpg的形成由酶dna甲基轉(zhuǎn)移酶催化。約80–90％的cpg位點(diǎn)在人dna中被甲基化，但存在被稱為cpg島的某些區(qū)域，其中cpg二核苷酸均未被甲基化。這些與56％的哺乳動(dòng)物基因的啟動(dòng)子(包括所有廣泛表達(dá)的基因)相關(guān)。百分之一至二的人基因組是cpg簇，并且在cpg甲基化與轉(zhuǎn)錄活性之間存在相反關(guān)系。

本文所述的方法提供評(píng)估樣品中甲基化基因座的量的方法。

概述

提供評(píng)估樣品中甲基化基因座的量的方法。在某些實(shí)施方案中，該方法可包括：(a)用mspji家族成員消化含有未甲基化和甲基化拷貝的基因組基因座的核酸樣品以產(chǎn)生長(zhǎng)度在20-40個(gè)堿基對(duì)的范圍內(nèi)并且具有中心甲基化胞嘧啶的片段群；(b)通過以下步驟連接轉(zhuǎn)接序列a和轉(zhuǎn)接序列b至序列x的靶片段的相應(yīng)端：(i)在轉(zhuǎn)接序列a和b的存在下使式b’-x’-a’的夾板寡核苷酸雜交至(a)的片段，其中x’、a’和b’分別與x、a和b互補(bǔ)，和(ii)連接轉(zhuǎn)接序列a、序列x和轉(zhuǎn)接序列b至彼此以產(chǎn)生式a-x-b的產(chǎn)物；和(c)定量式a-x-b的連接產(chǎn)物的量，從而提供核酸樣品中甲基化基因座的量的估值。

該定量可使用任何方便的方法進(jìn)行，所述方法包括通過qpcr或通過測(cè)序。在一些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)接序列a和b可存在于相同的寡核苷酸分子中，并且步驟(b)的產(chǎn)物是環(huán)狀核酸分子。在這些實(shí)施方案中，該定量可通過以下進(jìn)行：(i)通過滾環(huán)擴(kuò)增(rca)擴(kuò)增環(huán)狀核酸分子，(ii)使rca產(chǎn)物雜交至標(biāo)記的寡核苷酸群，所述標(biāo)記的寡核苷酸群雜交至rca產(chǎn)物中的多個(gè)位置；和(iii)單獨(dú)對(duì)標(biāo)記的rca復(fù)合物的數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)。

如下面更詳細(xì)地討論，在某些情況下，該方法可以用于評(píng)估來自妊娠雌性的無細(xì)胞dna樣品中胎兒dna的量。

還提供了用于實(shí)施該方法的試劑盒。

附圖簡(jiǎn)述

熟練的技術(shù)人員將理解如下所述的附圖僅用于說明目的。附圖并不意在以任何方式限制本教導(dǎo)的范圍。

圖1示意性地說明了主題方法的實(shí)施方案的一些特征。

圖2示意性地說明了主題方法的一個(gè)實(shí)施方式的一些特征。

圖3示意性地說明了主題方法的另一個(gè)實(shí)施方式的一些特征。

圖4示意性地說明了可對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行計(jì)數(shù)的方法。

定義

在更詳細(xì)描述示例性實(shí)施方案之前，闡述以下定義以說明和定義說明書中所用術(shù)語的含義和范圍。

數(shù)值范圍將限定范圍的數(shù)量包括在內(nèi)。除非另外指出，否則分別地核酸從左向右以5'至3'方向書寫；氨基酸序列從左至右以氨基至羧基方向書寫。

除非另有定義，否則本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義相同的含義。singleton,等，dictionaryofmicrobiologyandmolecularbiology,第2d版,johnwiley和sons,newyork(1994)，及hale&markham,theharpercollinsdictionaryofbiology,harperperennial,n.y.(1991)向本領(lǐng)域的技術(shù)人員提供本文所用的許多術(shù)語的一般含義。盡管如此，某些術(shù)語為了清楚和便于參考起見如下定義。

必須注意，除非上下文另外清楚地指出，否則如本文和在所附權(quán)利要求書中所使用，單數(shù)形式“一個(gè)(a)”、“一種(an)”和“所述(the)”包括復(fù)數(shù)參考物。例如，術(shù)語“引物”是指一個(gè)或多個(gè)引物，即單個(gè)引物和多個(gè)引物。還應(yīng)注意權(quán)利要求書可經(jīng)起草以排除任何可選擇的要素。因此，此說明旨在用作使用與權(quán)利要求書要素引用相關(guān)的如“僅有”、“僅僅”等此類排他術(shù)語或使用“否定”限制的先行基礎(chǔ)。

如本文所用，術(shù)語“基因組基因座”指的是限定區(qū)域中的基因組。基因組基因座存在于相同個(gè)體或不同個(gè)體的不同細(xì)胞的基因組中相同位置處。在一個(gè)細(xì)胞或個(gè)體中的基因組基因座具有與不同的細(xì)胞或個(gè)體中的相同基因組基因座相同或非常相似的(即，超過99％相同)核苷酸序列。在不同的細(xì)胞或個(gè)體中相同基因座之間核苷酸序列的差異可能是由于一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代?；蚪M基因座可由基因組坐標(biāo)、名稱或使用符號(hào)定義。

如本文所用，術(shù)語“甲基化狀態(tài)”是指在甲基化位點(diǎn)處胞嘧啶殘基上存在或不存在甲基基團(tuán)。為了清楚起見，未甲基化胞嘧啶將被稱為“未甲基化胞嘧啶”或“未甲基化c”，并且甲基化胞嘧啶(即5-甲基胞嘧啶)將被稱為“甲基化胞嘧啶”、甲基化“c”或“甲基c”。

如本文所用，“甲基化位點(diǎn)”是指已知在基因組基因座中至少有時(shí)甲基化胞嘧啶核苷酸的位置。甲基化位點(diǎn)處的胞嘧啶可為未甲基化胞嘧啶或甲基化胞嘧啶。換言之，術(shù)語“甲基化位點(diǎn)”是指在基因組基因座中的可呈甲基化狀態(tài)的特定胞嘧啶。例如，甲基化位點(diǎn)可以通過基因組坐標(biāo)或相對(duì)于基因的起始密碼子的坐標(biāo)定義。

如本文所用的術(shù)語"對(duì)應(yīng)于"及語法等同物，如“對(duì)應(yīng)的”是指術(shù)語指代的要素之間的特定關(guān)系。例如，對(duì)應(yīng)于更長(zhǎng)核酸中的序列的寡核苷酸含有與該核酸中的核苷酸序列相同或互補(bǔ)的核苷酸序列。

在對(duì)應(yīng)于甲基化位點(diǎn)的寡核苷酸中的核苷酸或者在對(duì)應(yīng)于甲基化胞嘧啶的寡核苷酸中的核苷酸的情況下，當(dāng)兩個(gè)核酸(如，含有甲基化胞嘧啶的寡核苷酸和基因組dna)被比對(duì)或堿基配對(duì)時(shí)，術(shù)語“對(duì)應(yīng)于”及其語法等同物意在鑒定相對(duì)于(即，定位在對(duì)面)甲基化位點(diǎn)對(duì)應(yīng)地定位的核苷酸。再次，除非另外指出(例如，在與特定殘基“不堿基配對(duì)”或“堿基配對(duì)”的核苷酸的情況下)，該“對(duì)應(yīng)于”甲基化位點(diǎn)的核苷酸與任一個(gè)甲基化位點(diǎn)或未甲基化位點(diǎn)堿基配對(duì)。為清楚起見，在寡核苷酸中，在對(duì)應(yīng)于序列(例如基因組基因座)中的甲基化胞嘧啶的位置處的g或c核苷酸可以：a)與序列中的甲基化胞嘧啶堿基配對(duì)，b)與在位置上對(duì)應(yīng)于擴(kuò)增版的序列中的甲基化胞嘧啶的胞嘧啶堿基配對(duì)，或c)與同擴(kuò)增的序列中的此類胞嘧啶互補(bǔ)的g殘基堿基配對(duì)。

如本文所用，“甲基化的序列”是含有甲基化位點(diǎn)的核苷酸序列，即已知至少有時(shí)甲基化的胞嘧啶核苷酸。

如本文所用，術(shù)語“未甲基化”就核苷酸序列而言是指未甲基化的序列的拷貝。

如本文所用，術(shù)語“甲基化”就核苷酸序列而言是指含5-甲基胞嘧啶的序列的拷貝?；蚪M基因座的甲基化可例如改變蛋白質(zhì)的表達(dá)，這引起具有此類甲基化基因座的細(xì)胞中的表型改變(如，癌癥相關(guān)的表型)?？商娲兀蚪M基因座的甲基化可能是沉默的。

包含“未甲基化和甲基化拷貝的基因組基因座”及其語法等同物的樣品是指含有相同基因組基因座的多個(gè)dna分子的樣品，其中該樣品含有未甲基化拷貝的基因組基因座和甲基化拷貝的相同基因座。在此背景下，術(shù)語“拷貝”并不旨在是指該序列是從彼此拷貝。相反，術(shù)語“拷貝”意在指代該序列具有在不同細(xì)胞或個(gè)體中相同的基因座。換言之，樣品含有具有相同核苷酸序列的核酸分子的混合物，除了一些分子含有甲基化胞嘧啶殘基之外。

如本文所用，術(shù)語“甲基化度”是指與未甲基化的特定靶核苷酸物質(zhì)的那些成員相比，甲基化樣品內(nèi)特定靶核苷酸物質(zhì)的相對(duì)數(shù)、百分比或分?jǐn)?shù)。

如本文所用，術(shù)語“混合物”是指要素的組合，其被散布而不是呈任何特定的順序。混合物都是異質(zhì)的，且不是空間上可分離成其不同的成分。要素的混合物的實(shí)例包括其溶解在相同的水溶液中的多個(gè)不同的要素，和附連到隨機(jī)位置(即，不呈特定的順序)的固相載體的多個(gè)不同要素中?；旌衔锊皇强蓪ぶ返摹榱伺e例說明，在空間上分離的表面結(jié)合的多核苷酸的陣列，如本領(lǐng)域中是公知的，不是表面結(jié)合的多核苷酸的混合物，因?yàn)楸砻娼Y(jié)合的多核苷酸的物質(zhì)是空間上不同的并且陣列是可尋址的。

術(shù)語“核苷酸”意在包括不僅含有已知的嘌呤和嘧啶堿基、還已被修飾的其它雜環(huán)堿基的那些部分。此類修飾包括甲基化嘌呤或嘧啶、酰化嘌呤或嘧啶、烷基化核糖或其它雜環(huán)。此外，術(shù)語“核苷酸”包括含有半抗原或熒光標(biāo)記并可不僅含有常規(guī)的核糖和脫氧核糖糖類、而且含其它糖的那些部分。修飾的核苷或核苷酸還包含在糖基部分上的修飾，例如其中羥基基團(tuán)的一個(gè)或多個(gè)被鹵素原子或脂肪族基團(tuán)替代、被官能化為醚、胺等。

術(shù)語“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互換使用以描述任何長(zhǎng)度(例如大于約2個(gè)堿基、大于約10個(gè)堿基、大于約100個(gè)堿基、大于約500個(gè)堿基、大于1000個(gè)堿基、至多約10,000個(gè)或更多個(gè)堿基)的聚合物，由核苷酸(例如脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，且可以被酶促或合成產(chǎn)生(例如，如美國(guó)專利第5,948,902號(hào)和其中引用的參考文獻(xiàn)所描述的pna)，其可與天然存在的核酸以與兩個(gè)天然存在的核酸的方式類似的序列特異性方式雜交，例如可參與沃森-克里克堿基配對(duì)相互作用(watson-crickbasepairinginteractions)。天然存在的核苷酸包括鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶(分別為g、c、a、t和u)。dna和rna分別具有脫氧核糖和核糖糖主鏈，而pna主鏈由通過肽鍵連接的重復(fù)n-(2-氨基乙基)-甘氨酸單元組成。在pna中，各種嘌呤和嘧啶堿基通過亞甲基羰基鍵連接至主鏈。鎖核酸(lna)，通常也被稱為不可接近的rna，是修飾的rna核苷酸。lna核苷酸的核糖部分被連接2'氧和4'碳的額外的橋修飾。該橋"鎖定"呈3'-內(nèi)型(北)構(gòu)象的核糖，其通常以a型雙鏈體存在。只要需要，lna核苷酸可與寡核苷酸中的dna或rna殘基混合。術(shù)語“非結(jié)構(gòu)化核酸”或“una”是含非天然核苷酸的核酸，所述非天然核苷酸以降低的穩(wěn)定性結(jié)合至彼此。例如，非結(jié)構(gòu)化核酸可以含有g(shù)'殘基和c'殘基，其中這些殘基對(duì)應(yīng)于非天然存在的形式，即彼此以降低的穩(wěn)定性堿基配對(duì)、但保留分別與天然存在的c和g殘基堿基配對(duì)的能力的g和c類似物。非結(jié)構(gòu)化核酸描述于us20050233340中，其通過引用并入本文以用于公開una。

如本文所用的術(shù)語“靶多核苷酸”是指所研究的目標(biāo)多核苷酸。在某些實(shí)施方案中，靶多核苷酸含有目標(biāo)和研究的一個(gè)或多個(gè)序列。

如本文所用的術(shù)語“寡核苷酸”表示長(zhǎng)度為約2至200個(gè)核苷酸、最多500個(gè)核苷酸的單鏈核苷酸多聚體。寡核苷酸可為合成的或可以酶促制備，并且在一些實(shí)施方案中，長(zhǎng)度為30至150個(gè)核苷酸。寡核苷酸可含有核糖核苷酸單體(即，可為寡核苷酸)或脫氧核糖核苷酸單體。寡核苷酸的長(zhǎng)度可為例如10至20、21至30、31至40、41至50、51至60、61至70、71至80、80至100、100至150或150至200個(gè)核苷酸。

如本文所用的術(shù)語“引物”是指當(dāng)置于其中誘導(dǎo)與核酸鏈互補(bǔ)的引物延伸產(chǎn)物的合成的條件下時(shí)能夠用作合成起始點(diǎn)的寡核苷酸，即在存在核苷酸和誘導(dǎo)劑如dna聚合酶的情況下和在合適的溫度和ph值下。引物可為單鏈的，并且必須足夠長(zhǎng)以在誘導(dǎo)劑的存在下刺激所需延伸產(chǎn)物的合成。引物的精確長(zhǎng)度將取決于許多因素，包括溫度、引物的來源和使用的方法。例如，對(duì)于診斷應(yīng)用，根據(jù)靶序列的復(fù)雜性，寡核苷酸引物通常含有15-25個(gè)或更多的核苷酸，不過它可以含有更少的核苷酸。本文的引物被選定為與特定靶dna序列的不同鏈基本上互補(bǔ)。這意味著引物必須充分互補(bǔ)以與其各自的鏈雜交。因此，引物序列不需要反映模板的精確序列。例如，非互補(bǔ)核苷酸片段可連接到引物的5'端，其中引物序列的剩余部分與鏈互補(bǔ)?？商娲?，非互補(bǔ)的堿基或更長(zhǎng)的序列可散布在引物中，只要該引物序列與該鏈的序列具有足夠的互補(bǔ)性以與其雜交并由此形成用于延伸產(chǎn)物合成的模板。

術(shù)語“雜交(hybridization)”或“雜交(hybridizes)”是指其中核酸鏈在正常雜交條件下與第二互補(bǔ)核酸鏈退火并形成穩(wěn)定的雙鏈體(同源雙鏈體或異源雙鏈體)且不與不相關(guān)的核酸分子在相同的正常雜交條件下形成穩(wěn)定的雙鏈體的方法。雙鏈體的形成是通過在雜交反應(yīng)中退火兩條互補(bǔ)的核酸鏈來完成的。雜交反應(yīng)可通過調(diào)整雜交反應(yīng)發(fā)生的雜交條件(通常被稱為雜交嚴(yán)格性)下制成為高度特異性的，使得兩條核酸鏈之間的雜交將不形成穩(wěn)定的雙鏈體，例如在正常的嚴(yán)格性條件下保留雙鏈性的區(qū)域的雙鏈體，除非這兩條核酸鏈含有在基本上或完全互補(bǔ)的特異性序列中有一定數(shù)目的核苷酸?？扇菀椎卮_定任何給定的雜交的“正常雜交或正常嚴(yán)格性條件”。參見，例如，ausubel等，currentprotocolsinmolecularbiology,johnwiley&sons,inc.,newyork,orsambrook等，molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress。如本文所用，術(shù)語“雜交(hybridizing)”或“雜交(hybridization)”是指核酸鏈通過堿基配對(duì)與互補(bǔ)鏈結(jié)合的任何方法。

如果兩個(gè)序列在中度到高度嚴(yán)格性雜交和洗滌條件下特異性雜交至彼此，則核酸被認(rèn)為是“可選擇性雜交”至參考核酸序列。中等和高嚴(yán)格性雜交條件是已知的(參見，例如，ausubel,等，shortprotocolsinmolecularbiology,第3版,wiley&sons1995和sambrook等，molecularcloning:alaboratorymanual,第3版,2001coldspringharbor,n.y.)。高度嚴(yán)格性條件的一個(gè)實(shí)例包括在約42c下在50％甲酰胺、5xssc、5x鄧哈特溶液(denhardt’ssolution)、0.5％sds和100ug/ml變性載體dna中雜交，然后是在2xssc和0.5％sds中在室溫下洗滌兩次，以及在0.1xssc和0.5％sds中在42℃下再洗滌兩次。

如本文所用的術(shù)語“雙鏈體”或“雙鏈體的”描述了堿基配對(duì)(即雜交在一起)的兩個(gè)互補(bǔ)的多核苷酸。

如本文所用的術(shù)語“擴(kuò)增”是指合成與模板核酸的一條或兩條鏈互補(bǔ)的核酸分子的方法。擴(kuò)增核酸分子通常包括使模板核酸變性，在低于引物的熔解溫度的溫度下使引物與模板核酸退火，和從引物酶促延伸以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物。變性、退火和延伸步驟可各自進(jìn)行一次。然而，通常變性、退火和延伸步驟進(jìn)行多次，使得擴(kuò)增產(chǎn)物的量經(jīng)常以指數(shù)倍數(shù)增加，雖然指數(shù)擴(kuò)增不是本發(fā)明的方法所需的。擴(kuò)增通常需要脫氧核糖核苷三磷酸、dna聚合酶酶及適用于聚合酶酶的最佳活性的緩沖液和/或輔因子的存在。術(shù)語“擴(kuò)增產(chǎn)物”是指從如本文定義的擴(kuò)增過程中產(chǎn)生的核酸序列。擴(kuò)增反應(yīng)可以是等溫(例如，在滾環(huán)擴(kuò)增的情況下)，或者可能需要熱循環(huán)(在pcr的情況下)。

如在本文中可互換使用的術(shù)語“測(cè)定”、“測(cè)量”、“評(píng)估”、“估計(jì)”、“測(cè)定”和“分析”是指任何形式的測(cè)量，并包括測(cè)定元素存在與否。這些術(shù)語包括定量和/或定性測(cè)定。評(píng)估可以是相對(duì)或絕對(duì)的。“估計(jì)……的存在”包括測(cè)定某物存在的量，以及測(cè)定其存在或不存在。

術(shù)語“分開”當(dāng)指代基因組時(shí)是指分離基因組的一部分與基因組的剩余部分，以產(chǎn)生從所述基因組的剩余部分中分離的產(chǎn)物。術(shù)語“分開”涵蓋富集。

如本文所用的術(shù)語“基因組區(qū)域”是指基因組(例如動(dòng)物或植物基因組，諸如人、猴、大鼠、魚或昆蟲或植物的基因組)的區(qū)域。在某些情況下，在本文所描述的方法中使用的寡核苷酸可以利用參考基因組區(qū)域進(jìn)行設(shè)計(jì)，即已知核苷酸序列的基因組區(qū)域，如染色體區(qū)域，例如其序列被儲(chǔ)存在ncbi的genbank數(shù)據(jù)庫(kù)或者其它數(shù)據(jù)庫(kù)。此類寡核苷酸可以在使用含有測(cè)試基因組的樣品的測(cè)定中使用，其中測(cè)試基因組含有寡核苷酸的結(jié)合位點(diǎn)。

如本文所用的術(shù)語“基因組序列”是指存在于基因組中的序列。

如本文所用的術(shù)語“基因組片段”是指基因組(例如動(dòng)物或植物基因組，諸如人、猴、大鼠、魚或昆蟲或植物的基因組)的區(qū)域?；蚪M片段可以是完整的染色體或染色體的片段。

如本文所用的術(shù)語“親和標(biāo)簽”是指可用于分離附接至親和標(biāo)簽的分子與不含親和標(biāo)簽的其它分子的部分?！坝H和標(biāo)簽”是特異性結(jié)合對(duì)的成員，即其中一個(gè)分子通過化學(xué)或物理方法的分子之一特異性結(jié)合至另一個(gè)分子的兩個(gè)分子。在本文中被稱為“捕獲劑”的特異性結(jié)合對(duì)的互補(bǔ)成員可被固定(例如，色譜載體、珠或平面表面)，以產(chǎn)生特異性結(jié)合親和標(biāo)簽的親和色譜載體。換言之，“親和標(biāo)簽”可結(jié)合至“捕獲劑”，其中親和標(biāo)簽特異性結(jié)合至捕獲劑，從而促進(jìn)分離附接有親和標(biāo)簽的分子與不含親和標(biāo)簽的其它分子。

如本文所用，術(shù)語“生物素部分”是指包含生物素或生物素類似物(諸如脫硫生物素、氧代生物素、2'-亞氨基生物素、二氨基生物素、生物素亞砜，生物胞素等)的親和劑生物素部分以至少10^-8m的親和力結(jié)合至鏈霉親和素。生物素親和劑還可包含接頭，例如，─lc-生物素、─lc-lc-生物素、─slc-生物素或─pegn-生物素，其中n是3-12。

如本文所用的術(shù)語“末端核苷酸”是指在核酸分子的5'或3'端處的核苷酸。核酸分子可呈雙鏈形式(即，雙鏈體的)，或者呈單鏈形式。

如本文所用的術(shù)語“連接”是指酶促催化第一dna分子的5’端處的末端核苷酸與第二dna分子的3’端處的末端核苷酸連結(jié)。

“多個(gè)”含有至少2名成員。在某些情況下，多個(gè)可具有至少10個(gè)、至少100、至少100、至少10,000、至少100,000、至少10⁶、至少10⁷、至少10⁸或至少10⁹或更多個(gè)成員。

如果兩個(gè)核酸是“互補(bǔ)的”，它們?cè)诟叨葒?yán)格性條件下彼此雜交。術(shù)語“完全互補(bǔ)的”用于描述其中一個(gè)核苷酸的每個(gè)堿基與另一個(gè)核酸中的互補(bǔ)核苷酸堿基成對(duì)的雙鏈體。在許多情況下，互補(bǔ)的兩個(gè)序列具有至少10個(gè)、例如至少12個(gè)或15個(gè)核苷酸的互補(bǔ)性，并且在某些情況下可具有一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)非互補(bǔ)堿基。

術(shù)語“消化”意在表示核酸被限制酶裂解的方法。為了消化核酸，限制酶和含有限制酶的識(shí)別位點(diǎn)的核酸是在適用于限制酶的工作條件下接觸。適于可商購(gòu)獲得的限制性酶的活性的條件是已知的，并在購(gòu)買時(shí)與那些酶一起提供。

“寡核苷酸結(jié)合位點(diǎn)”是指寡核苷酸在靶多核苷酸中雜交的位點(diǎn)。如果寡核苷酸“提供”引物的結(jié)合位點(diǎn)，則該引物可以雜交到此寡核苷酸或其補(bǔ)體。

如本文所用的術(shù)語“分離”是指兩個(gè)要素(例如，通過尺寸或親和性等)的物理分離以及一個(gè)要素的降解，從而使另一個(gè)要素完整。

如本文所用的術(shù)語“參考染色體區(qū)域”是指已知的核苷酸序列的染色體區(qū)域，例如染色體區(qū)域，其序列被儲(chǔ)存在例如ncbi的genbank數(shù)據(jù)庫(kù)或者其它數(shù)據(jù)庫(kù)。

如本文所用的術(shù)語“鏈”是指由通過共價(jià)鍵(例如磷酸二酯鍵)共價(jià)連接在一起的核苷酸組成的核酸。

在細(xì)胞中，dna通常以雙鏈形式存在，并因此具有核酸的兩條互補(bǔ)鏈(在本文中被稱為“上”和“下”鏈)。在某些情況下，染色體區(qū)域的互補(bǔ)鏈可被稱為“正”和“負(fù)”鏈，“第一”和“第二”鏈，“編碼”和“非編碼”鏈，“沃森”和“克里克“鏈或”正義“和”反義“鏈。一條鏈指定為頂鏈或底鏈?zhǔn)侨我獾?，并不意味著任何特定的方位、功能或結(jié)構(gòu)。若干示例性哺乳動(dòng)物染色體區(qū)域的第一鏈的核苷酸序列(例如，bac、組件、染色體等)是已知的，并且可例如存在于ncbi的genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中。

如本文所用的術(shù)語“頂鏈”是指核酸的任一條鏈，但不是核酸的兩條鏈。當(dāng)寡核苷酸或引物結(jié)合或退火“僅至頂鏈”時(shí)，其結(jié)合至僅一條鏈而不結(jié)合至另一條。如本文所用的術(shù)語“底鏈”是指與“頂鏈”互補(bǔ)的鏈。當(dāng)一個(gè)寡核苷酸結(jié)合或退火“僅一條鏈”時(shí)，其結(jié)合至僅一條鏈，例如，第一或第二條鏈，但不結(jié)合至另一條鏈。

術(shù)語“共價(jià)連接”是指在兩個(gè)分開的分子，例如一個(gè)雙鏈核酸的頂鏈和底鏈之間產(chǎn)生共價(jià)鍵。連接是一種類型的共價(jià)連接。

如本文所用的術(shù)語“變性”是指通過將雙鏈體放置在適當(dāng)?shù)淖冃詶l件下來分離核酸雙鏈體的堿基對(duì)的至少一部分。變性條件在本領(lǐng)域是公知的。在一個(gè)實(shí)施方案中，為了使核酸雙鏈體變性，雙鏈體可暴露于高于雙鏈體的熔解溫度的溫度下，從而從另一條鏈釋放雙鏈體的一條鏈。在某些實(shí)施方案中，核酸可通過暴露其于至少90℃的溫度持續(xù)適當(dāng)量的時(shí)間(如，至少30秒、長(zhǎng)達(dá)30分鐘)來變性。核酸也可被化學(xué)修飾(例如，使用脲或naoh)。

如本文所用，術(shù)語“標(biāo)記”是指可用于提供可檢測(cè)(優(yōu)選可定量的)作用且可附接至核酸或蛋白質(zhì)的任何原子或分子。標(biāo)記包括但不限于染料和放射性標(biāo)記諸如³²p；結(jié)合部分諸如生物素；半抗原諸如地高辛；發(fā)光性、磷光性或熒光性部分；和單獨(dú)或與可通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fret)抑制或移動(dòng)發(fā)射光譜的部分組合的熒光染料。標(biāo)記可以提供可通過熒光、放射性、比色法、重量分析法、x射線衍射或吸收、磁性、酶活性等檢測(cè)的信號(hào)。標(biāo)記可以是帶電部分(正或負(fù)電荷)，或可替代地，可以為電荷中性。標(biāo)記可包含核酸或蛋白序列或由其組成，只要包含標(biāo)記的序列是可檢測(cè)的。

如本文所用的術(shù)語“標(biāo)記的寡核苷酸”是指具有親和標(biāo)簽(例如，生物素部分)的寡核苷酸、用能夠分離或檢測(cè)的原子或基團(tuán)(例如，賦予不同密度的溴脫氧尿苷或膠態(tài)金顆粒)修飾的寡核苷酸、以及用或光學(xué)可檢測(cè)的標(biāo)記(例如，熒光或另一種類型的發(fā)光標(biāo)記)修飾的寡核苷酸。僅含天然存在的核苷酸的寡核苷酸是未標(biāo)記的寡核苷酸。

如本文所用的術(shù)語“測(cè)序”是指獲得多核苷酸的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的身份(例如，至少20個(gè)、至少50個(gè)、至少100或至少200或更多個(gè)連續(xù)核苷酸的身份)的方法。

術(shù)語“下一代測(cè)序”是指目前由illumina、lifetechnologies和roche等采用的所謂并行的邊合成邊測(cè)序或邊連接邊測(cè)序平臺(tái)。下一代測(cè)序方法也可包括納米孔測(cè)序方法或基于電子檢測(cè)的方法，諸如由lifetechnologies公司商業(yè)化的iontorrent技術(shù)。

如本文所用的術(shù)語“延伸”是指通過添加核苷酸利用聚合酶的引物的延伸。如果延伸退火至核酸的引物，該核酸用作延伸反應(yīng)的模板。

術(shù)語“克隆pcr”是pcr技術(shù)，其中每個(gè)反應(yīng)在單個(gè)模板分子上進(jìn)行，且pcr反應(yīng)彼此保持空間分離。在新一代測(cè)序應(yīng)用中常用的橋pcr和乳液pcr是克隆pcr的實(shí)例。

術(shù)語“橋pcr”是指固相聚合酶鏈反應(yīng)，其中在反應(yīng)中延伸的引物通過其5'端栓系至底物上。在擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增子在栓系的引物之間形成橋。橋pcr(其也可被稱為“簇pcr”)在illumina的solexa平臺(tái)中使用。橋pcr和illumina的solexa平臺(tái)通常描述于多個(gè)公布中，如gudmundsson等(nat.genet.200941:1122-6)、out等(hum.mutat.200930:1703-12)和turner(nat.methods20096:315-6)、美國(guó)專利7,115,400和美國(guó)申請(qǐng)公布第us20080160580和us20080286795號(hào)。橋pcr是一種類型的“克隆pcr”，即是其中每個(gè)反應(yīng)在單個(gè)模板分子上開始且pcr反應(yīng)彼此保持空間分離的pcr技術(shù)。

如本文所用的術(shù)語“條形碼序列”或“分子條形碼”是指用于a)鑒別和/或跟蹤反應(yīng)物中的多核苷酸的來源和/或b)對(duì)初始分子測(cè)序次數(shù)計(jì)數(shù)(例如，在樣品中基本上每個(gè)分子標(biāo)記有不同的序列、然后擴(kuò)增樣品的情況下)的核苷酸的獨(dú)特序列。條形碼序列可在寡核苷酸的5'端、3'端或中間。條形碼序列可以在大小和組成方面變化很大；以下參考文獻(xiàn)為選擇一套適合于特定的實(shí)施方案的條形碼序列提供指導(dǎo)：brenner,美國(guó)專利第5,635,400個(gè)；brenner等，proc.natl.acad.sci.,97:1665-1670(2000)；shoemaker等，naturegenetics,14:450-456(1996)；morris等，歐洲專利公布0799897a1；wallace,美國(guó)專利第5,981,179號(hào)；等。在特定的實(shí)施方案中，條形碼序列度可具有4至36個(gè)核苷酸、或6至30個(gè)核苷酸、或8至20個(gè)核苷酸的范圍內(nèi)的長(zhǎng)度。

如本文所用，術(shù)語“pcr試劑”是指對(duì)模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)所需的所有試劑。如本領(lǐng)域中已知的，pcr試劑基本上包括第一引物、第二引物、熱穩(wěn)定性聚合物和核苷酸。根據(jù)所用的聚合酶，還可存在離子(如，mg²⁺)。pcr試劑可任選地含有可從中擴(kuò)增靶序列的模板。

術(shù)語“分子內(nèi)連接”是指其中核酸鏈的5’端和3’端連接至彼此以產(chǎn)生環(huán)狀dna分子的連接。

如本文所用，術(shù)語“mspji家族限制性內(nèi)切酶”是指在dna分子中在甲基化胞嘧啶的上游或下游的位點(diǎn)處識(shí)別甲基化胞嘧啶并且產(chǎn)生雙鏈斷裂的限制性內(nèi)切酶家族。這些酶不裂解未甲基化的dna。如果dna的兩條鏈被甲基化(這是在cpg甲基化中通常的情況)，那么酶將裂解該dna，以產(chǎn)生長(zhǎng)度為20-40個(gè)堿基對(duì)的片段，這取決于所用的酶。例如，mspji單獨(dú)識(shí)別每個(gè)半甲基化位點(diǎn)，并雙向裂解分別產(chǎn)生32個(gè)堿基或31個(gè)堿基的片段。這些片段含有中心甲基化位點(diǎn)且在每一端處具有4-堿基的5'懸突。所述mspji家族的內(nèi)切核酸酶描述在，例如，zheng等(nucleicacidsres.2010auniquefamilyofmrr-likemodification-dependentrestrictionendonucleases.38:5527-34)和cohen-karni(proc.natl.acad.sci.2011themspjifamilyofmodification-dependentrestrictionendonucleasesforepigeneticstudies108:11040-5)和us20100167942，其通過引用并入用于本家族的酶的細(xì)節(jié)。mspji家族限制性內(nèi)切核酸酶的實(shí)例包括fspei、lpnpi、aspbhi、rlai和sgrti。引用mspji家庭成員，一般地或按照名稱，意圖是指野生型限制性內(nèi)切核酸酶以及具有與野生型限制性內(nèi)切核酸酶氨基酸序列至少90％(例如，至少95％)相同的變體。

如本文所用，術(shù)語“長(zhǎng)度為20-40個(gè)堿基對(duì)的范圍內(nèi)的片段的群體”是指消化片段的混合物。該片段具有中心胞嘧啶殘基(其是mspji家族內(nèi)切核酸酶的識(shí)別位點(diǎn)的一部分)，并且具有3'或5'懸突，這取決于所使用的酶。

如本文所用，短語“連接轉(zhuǎn)接序列a和轉(zhuǎn)接序列b至靶片段的相應(yīng)端”中的術(shù)語“相應(yīng)端”意圖意指該序列a被添加到靶片段的一端且序列b被添加到靶片段的另一端。

本文所述的某些多核苷酸可通過參考式(例如“b’-x’-a’”和“a-x-b”)。此類式按照既定慣例，其中它們描述了呈5’至3’方向取向的多核苷酸。該式的組分，如“a”、“x”和“b”是指多核苷酸內(nèi)的核苷酸的單獨(dú)可定義的序列，其中所述序列被共價(jià)連接在一起，使得由該式所描述的多核苷酸是單分子。在許多情況下，該式的組分在單個(gè)分子中彼此鄰接。按照慣例，式中所示的序列的補(bǔ)體將用撇號(hào)(')來表示，使得序列的補(bǔ)體“a”將為“a'”。此外，除非另有說明或從上下文暗示，否則由式所定義的多核苷酸可在其3'端、其5'端或3'和5'端兩者處具有另外的序列、引物結(jié)合位點(diǎn)、分子條形碼、啟動(dòng)子或間隔基等。

如本文所用，術(shù)語“轉(zhuǎn)接序列a和b”是指不同的序列。

如本文所用，術(shù)語“可連接地鄰接”在彼此可連接地鄰接的兩條寡聚核苷酸序列的上下文中意指兩個(gè)寡核苷酸之間沒有居間的核苷酸，并且它們可彼此連接。

如本文所用，術(shù)語“夾板寡核苷酸”，如本文所用，是指寡核苷酸，當(dāng)其雜交至兩個(gè)或更多個(gè)其它多核苷酸時(shí)作為“夾板”以將多核苷酸置于彼此相鄰，使得它們可以連接在一起，如圖1。

如本文所用，術(shù)語“環(huán)狀核酸分子”是指呈不具有游離的3'或5'端的閉合圈的形式的鏈。

如本文所用，術(shù)語“胎兒分?jǐn)?shù)”是指在妊娠雌性的母體血液中來自發(fā)育中的胎兒的無細(xì)胞dna的百分比。

術(shù)語的其它定義可以出現(xiàn)在整個(gè)說明書中。

示例性實(shí)施方式的描述

提供評(píng)估甲基化基因座的量的方法。在某些實(shí)施方案中，該方法包括：用mspji家族成員消化含有基因組基因座的未甲基化和甲基化的拷貝的核酸樣品以產(chǎn)生長(zhǎng)度在20-40個(gè)核苷酸的范圍內(nèi)的片段群，連接轉(zhuǎn)接序列a和轉(zhuǎn)接序列b至序列x的靶片段的相應(yīng)端，及量化式a-x-b的連接產(chǎn)物的量。還提供了用于實(shí)施該方法的試劑盒。

在描述各種實(shí)施方案之前，應(yīng)理解，本公開的教導(dǎo)內(nèi)容并不限于所描述的特定的實(shí)施方式，并因此可以當(dāng)然變化。還應(yīng)理解本文使用的術(shù)語僅用于描述特定實(shí)施方案的目的，并且無意具有限制性，因?yàn)楸窘虒?dǎo)內(nèi)容的范圍僅受附加權(quán)利要求限制。

本文所用的章節(jié)標(biāo)題僅出于組織性目的并且不解釋為以任何方式限制所描述的主題。雖然本教導(dǎo)內(nèi)容與各種實(shí)施方案一起描述，但并不意味著本發(fā)明的教導(dǎo)內(nèi)容限于此類實(shí)施方案。與此相反，本教導(dǎo)內(nèi)容涵蓋各種替代方案、修改和等同物，如本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解的。

除非另有定義，否則本文使用的所有技術(shù)和科技術(shù)語具有與本公開所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的相同含義。盡管在本教導(dǎo)內(nèi)容的實(shí)踐或測(cè)試中還可使用與本文所述的那些方法和材料類似或等效的任何方法和材料，但是現(xiàn)在描述一些示例性方法和材料。

任何公布的引用是針對(duì)其在本申請(qǐng)日期前的公開內(nèi)容，并且不應(yīng)被視為承認(rèn)由于存在先前發(fā)明而使本權(quán)利要求無權(quán)享有此類公布的優(yōu)先權(quán)。此外，所提供的公布日期可不同于可能需要獨(dú)立地證實(shí)的實(shí)際公布日期。

如本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀本公開后所顯而易知，本文中描述和說明的各個(gè)實(shí)施方案的每一個(gè)具有可輕易地與任何其它幾個(gè)實(shí)施方案的的特征分離或組合的分立組分和特征，而不背離本教導(dǎo)內(nèi)容的范圍或精神。任何引用的方法可以所引用的事件順序或在邏輯上可能的任何其它順序來進(jìn)行。

本文提及所有專利和公布(包括此類專利和公布中公開的所有序列)通過引用明確并入。

參考圖1，本方法的一些實(shí)施方案包括使用mspji家族限制性內(nèi)切核酸酶消化含有未甲基化(4和6)和甲基化拷貝(8)的基因組基因座的核酸樣品2。如所示，如果識(shí)別序列在兩條鏈上甲基化(由實(shí)心圓10表示)，則該酶將在識(shí)別序列的兩側(cè)上裂解，如由片段8中的x’表示。該消化產(chǎn)生包含片段群的消化的樣品12，所述片段群的長(zhǎng)度在20-40個(gè)堿基的范圍內(nèi)且具有中心甲基化胞嘧啶。如將是顯而易見的，被消化的初始樣品不是擴(kuò)增的樣品。如果基因組dna被消化，則消化的樣品應(yīng)含有至少幾千、如果沒有至少至少10,000或100,000或更多個(gè)長(zhǎng)為20-40個(gè)堿基對(duì)且對(duì)應(yīng)于不同的甲基化基因座的片段，以及還沒有被消化成小片段(因?yàn)樗鼈兾醇谆?的相同基因座的更長(zhǎng)片段。長(zhǎng)度在20-40個(gè)堿基對(duì)的范圍內(nèi)的這些片段之一對(duì)應(yīng)于序列x的靶片段14。在該方法中，通過連接轉(zhuǎn)接序列a16和轉(zhuǎn)接序列b18至其末端來選擇靶片段14。這通過以下步驟進(jìn)行：(i)在轉(zhuǎn)接序列a16和b18的存在下雜交式b’-x’-a’的夾板寡核苷酸20至12的片，其中x’、a’和b’分別與x、a和b互補(bǔ)以得到雙鏈體21和(ii)連接轉(zhuǎn)接序列a16、序列x14的片段和轉(zhuǎn)接序列b18至彼此以產(chǎn)生式a-x-b的產(chǎn)物22。如將顯而易見的是，設(shè)計(jì)夾板寡核苷酸20及轉(zhuǎn)接序列a16和b18，使得當(dāng)轉(zhuǎn)接序列a和b雜交至呈雙鏈體21的夾板寡核苷酸20時(shí)，序列a16和b18的末端可連接地鄰接序列x的靶片段的末端。夾板寡核苷酸20及轉(zhuǎn)接序列a16和b18僅在圖1中顯示為雙鏈體19以顯示哪個(gè)序列與彼此互補(bǔ)。在實(shí)踐中，夾板寡核苷酸20及轉(zhuǎn)接序列a16和b18在與樣品雜交之前通常不彼此雜交。在實(shí)踐中，各種寡核苷酸可以在單個(gè)容器中與消化的樣品合并，并將混合物加熱、然后冷卻，從而在連接之前使各個(gè)序列變性和退火至彼此。在連接轉(zhuǎn)接序列a16、序列x14的片段及轉(zhuǎn)接序列b12至彼此以產(chǎn)生式a-x-b的產(chǎn)物22之后，可定量產(chǎn)物22的量，從而提供核酸樣品2中甲基化基因座的量的估值。在特定的實(shí)施方案中，所使用的連接酶可能是一個(gè)熱穩(wěn)定連接酶，并且連接步驟可通過循環(huán)反應(yīng)通過多輪變性和復(fù)性進(jìn)行，從而驅(qū)動(dòng)反應(yīng)完成。產(chǎn)物22的定量可以多種不同方式進(jìn)行，如通過定量pcr、通過測(cè)序和通過電子計(jì)數(shù)，其實(shí)例在下文更詳細(xì)地描述。在某些實(shí)施方案中，夾板探針和轉(zhuǎn)接序列可經(jīng)設(shè)計(jì)和/或使用在2013年12月2日提交的英國(guó)專利申請(qǐng)序列第1321191.7號(hào)中所述的方法連接，所述專利申請(qǐng)通過引用并入本文以用于公開那些方法。

在圖2中說明的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)接序列a16和b18可在包含非互補(bǔ)序列40和42的分開的寡核苷酸分子中，其在產(chǎn)物22中提供引物結(jié)合位點(diǎn)。在該實(shí)施方案中，產(chǎn)物22可使用引物44和46擴(kuò)增。在該實(shí)施方案中，產(chǎn)物22的量可通過任何適合的qpcr測(cè)定，如taqman測(cè)定等定量。在另一個(gè)實(shí)施方案中，產(chǎn)物22可例如使用引物44和46或雜交至已添加至引物44和46的尾巴的引物測(cè)序(在存在或不存在擴(kuò)增下)。在這些實(shí)施方案中，產(chǎn)物22的量可通過對(duì)對(duì)應(yīng)于序列x的序列讀短的數(shù)目計(jì)數(shù)來評(píng)估。在可替代的實(shí)施方案中，非互補(bǔ)序列40和/或42可含有分子條形碼且產(chǎn)物22的每個(gè)分子含有不同的條形碼序列。在這些實(shí)施方案中，產(chǎn)物22的量可通過對(duì)與對(duì)應(yīng)于序列x的序列讀短相關(guān)的獨(dú)特的條形碼序列的數(shù)目計(jì)數(shù)來評(píng)估。

在圖3所說明的另一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)接序列a和b存在于單個(gè)寡核苷酸分子50中，且產(chǎn)物22是環(huán)狀核酸分子。在這些實(shí)施方案中，產(chǎn)物22可通過經(jīng)由滾環(huán)擴(kuò)增(rca)擴(kuò)增產(chǎn)物(如，使用引物52，其可與產(chǎn)物中的任何地方的序列互補(bǔ))及然后評(píng)估產(chǎn)生的rca產(chǎn)物的數(shù)目來定量。滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物將在產(chǎn)物22中含有多個(gè)拷貝的每個(gè)序列。在這些實(shí)施方案中，定量可通過雜交rca產(chǎn)物至雜交至rca產(chǎn)物中的多個(gè)位置的標(biāo)記的寡核苷酸群；和單獨(dú)地對(duì)標(biāo)記的rca復(fù)合物的數(shù)量計(jì)數(shù)來進(jìn)行。

圖4說明可實(shí)施本實(shí)施方案的一種方法。在本實(shí)施方式中，產(chǎn)物22由四種產(chǎn)物分子22a、22b、22c和22d組成。在實(shí)踐中，產(chǎn)物22可由至少100、至少1,000或至少10,000或更多個(gè)式a-x-b的產(chǎn)物分子組成。在該實(shí)施方案中，產(chǎn)物通過滾環(huán)擴(kuò)增使用引物52(其可與產(chǎn)物中任何地方的序列互補(bǔ))擴(kuò)增以產(chǎn)生多個(gè)rca產(chǎn)物。滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量可以通過分布rca產(chǎn)物在載體(載片)表面上、使用標(biāo)記的寡核苷酸(例如，熒光標(biāo)記的寡核苷酸)雜交rca產(chǎn)物、然后對(duì)離散信號(hào)在載體區(qū)域中的數(shù)目通過顯微術(shù)(例如熒光顯微術(shù))計(jì)數(shù)來評(píng)估。標(biāo)記可以在分布產(chǎn)物在載體上之前或之后進(jìn)行，因?yàn)槊總€(gè)rca產(chǎn)物含有數(shù)千個(gè)相同的序列的拷貝，應(yīng)該有數(shù)以千計(jì)的標(biāo)記的寡核苷酸結(jié)合位點(diǎn)，從而增大了信號(hào)。在某些實(shí)施方案中，擴(kuò)增和/或檢測(cè)方法可使用在2013年12月2日提交的英國(guó)專利申請(qǐng)序列第1321196.6號(hào)中所述的方法實(shí)施，該專利申請(qǐng)通過引用并入本文以用于公開那些方法。

樣品中甲基化基因座的量可以多種不同的方式表達(dá)。例如，在一些實(shí)施方案中，在定量步驟中獲得的結(jié)果可經(jīng)歸一化至輸入dna的量，并表達(dá)為測(cè)量值/輸入dna的量(如，輸入dna的y量中分子的x數(shù)目)。當(dāng)相比于相同樣品中的其它序列的量時(shí)，該數(shù)量可以提供一個(gè)有用的度量。例如，樣品中的甲基化基因座的相對(duì)量(例如，百分比)可以通過比較由本方法獲得的結(jié)果與對(duì)已知在樣品中總是甲基化的參考基因座獲得的結(jié)果所獲得的結(jié)果來計(jì)算。在本實(shí)施例中，樣品中的參考基因座的量可使用類似的方法(其中可使用相同的酶或另一種mspji家族酶，并且夾板寡核苷酸中的靶特異性序列雜交至對(duì)應(yīng)于參考基因座、而非基因座x的片段)定量。在另一個(gè)實(shí)例中，樣品中的甲基化基因座的相對(duì)量(例如，百分比)可以通過比較由本方法獲得的結(jié)果與針對(duì)已知存在于樣品中的參考基因座獲得的結(jié)果所獲得的結(jié)果來計(jì)算。在本實(shí)施例中，樣品中參考基因座的量可以使用類似的方法(其中可使用除了mspji家族酶之外的酶，例如甲基化不敏感酶，并且夾板寡核苷酸中的靶特異性序列雜交至對(duì)應(yīng)于參考基因座、而非x的片段)定量。在一些實(shí)施方案中，樣品中的甲基化位點(diǎn)的絕對(duì)量可與標(biāo)準(zhǔn)曲線(例如，使用含有已知量的甲基化基因座的對(duì)照樣品產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線)比較，以提供樣品中甲基化基因座的分子的絕對(duì)數(shù)量的估值。

轉(zhuǎn)接和夾板寡核苷酸的各個(gè)區(qū)域的長(zhǎng)度可根據(jù)所需的應(yīng)用和由轉(zhuǎn)接子載有的裝載物多少(即，多少引物結(jié)合位點(diǎn)、條形碼等)變化很大。在實(shí)踐中，夾板寡核苷酸的序列x’將經(jīng)設(shè)計(jì)以匹配期望通過用本方法中所用的mspji家族限制性內(nèi)切核酸酶消化基因座樣品產(chǎn)生的片段的序列。例如，如果使用mspji，則序列x'的長(zhǎng)度將為約32個(gè)核苷酸，且x的末端將對(duì)應(yīng)于基因組dna中mspji的裂解位點(diǎn)。其它mspji家族成員產(chǎn)生不同的長(zhǎng)度的片段，并因此x'的長(zhǎng)度并不需要是約32個(gè)堿基，如果使用另一種酶包括fspei、lpnpi、aspbhi、rlai和sgrti。在一些情況下，x'可以是長(zhǎng)度在25-35個(gè)核苷酸的范圍內(nèi)。因?yàn)檫@些酶的識(shí)別位點(diǎn)是已知的并且?guī)讉€(gè)基因組(包括人類基因組)的序列是已知的，夾板寡核苷酸的設(shè)計(jì)可以通過手動(dòng)或計(jì)算機(jī)來進(jìn)行。根據(jù)期望的應(yīng)用，轉(zhuǎn)接序列a和b可具有長(zhǎng)度為15至100個(gè)堿基(例如，18至30個(gè)堿基)。如應(yīng)當(dāng)顯而易見的，附接到轉(zhuǎn)接序列、例如引物結(jié)合位點(diǎn)/條形碼等的任何額外的序列的核苷酸序列，應(yīng)設(shè)計(jì)使它們不雜交至研究中的基因組。

在特定的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)接序列中之一可以連接到親和標(biāo)簽，例如生物素部分，使得連接后可將連接產(chǎn)物使用包含親和標(biāo)簽的表面栓系的捕獲劑的固體載體與未連接分子分離，從而將連接產(chǎn)物結(jié)合到固體載體并從樣品中的其它核酸分離那些分子。

如將顯而易見的，在一些實(shí)施方案中使用的引物可含有例如與illumina的可逆性末端終結(jié)方法、roche的焦磷酸測(cè)序法(454)、lifetechnologies的邊連接邊測(cè)序(solid平臺(tái))或lifetechnologies的iontorrent平臺(tái)的使用相容的序列。此類方法的實(shí)例描述于以下參考文獻(xiàn)中：margulies等(nature2005437:376–80)；ronaghi等(analyticalbiochemistry1996242:84–9)；shendure(science2005309:1728)；imelfort等(briefbioinform.200910:609-18)；fox等(methodsmolbiol.2009；553:79-108)；appleby等(methodsmolbiol.2009；513:19-39)和morozova(genomics.200892:255-64)，其通過引用并入以用于上述方法和上述方法的特定步驟的一般描述，包括所有的起始產(chǎn)物、試劑以及每個(gè)步驟的最終產(chǎn)物。

在一些實(shí)施方案中，該方法可在樣品中復(fù)用以定量樣品中的幾個(gè)甲基化基因座。這可以使用數(shù)個(gè)夾板寡核苷酸進(jìn)行，其中對(duì)應(yīng)于x的序列與所研究的基因座互補(bǔ)。該方法可用于分析在相同的反應(yīng)中的至少2個(gè)、至少5個(gè)、至少10個(gè)、至少50個(gè)或至少100個(gè)不同的基因座。

可以采用上述的方法以分析來自幾乎任何生物體(包括但不限于植物、動(dòng)物(例如爬行動(dòng)物、哺乳動(dòng)物、昆蟲、蠕蟲、魚等)、組織樣品、細(xì)菌、真菌(如酵母)、噬菌體、病毒、尸體組織、考古樣品/古樣品等)的基因組dna。在某些實(shí)施方案中，在該方法中使用的基因組dna可源自哺乳動(dòng)物，其中在某些實(shí)施方案中哺乳動(dòng)物是人。在示例性實(shí)施方案中，基因組樣品可含有來自哺乳動(dòng)物細(xì)胞(諸如人、小鼠、大鼠或猴細(xì)胞)的基因組dna。樣品可以從培養(yǎng)的細(xì)胞或臨床樣品的細(xì)胞制備，例如組織活檢、法醫(yī)樣品的刮去或灌洗或細(xì)胞(即，在犯罪現(xiàn)場(chǎng)采集的樣品的細(xì)胞)。在特定的實(shí)施方案中，核酸樣品可從生物樣品諸如細(xì)胞、組織、體液和糞便獲得。目標(biāo)體液包括但不限于血液、血清、血漿、唾液、粘液、痰(phlegm)、腦脊髓液、胸膜液、淚液、淚管液(lactalductfluid)、淋巴液、唾液(sputum)、腦脊髓液、滑膜液、尿液、羊水和精液。在特定的實(shí)施方案中，樣品可以獲自受試者，例如人。在一些實(shí)施方案中，分析的樣品可以是從血液，例如從妊娠雌性的血液獲得的無細(xì)胞dna樣品。

在某些實(shí)施方案中，主題方法可用于確定與疾病(例如，癌癥或肝病諸如慢性肝炎或肝硬化)相關(guān)的靶基因座的甲基化狀態(tài)，其中基因座的甲基化狀態(tài)可用于診斷疾病。在這些實(shí)施方案中，基因組dna的來源可以是組織活檢或含有從患病組織來源的dna的體液。

在某些實(shí)施方案中，主題方法可在無創(chuàng)性產(chǎn)前檢查(nipt)中用于胎兒中的遺傳和表觀遺傳異常診斷，包括胎兒非整倍體，諸如三體性21、三體性18和三體性13；印跡病癥，諸如貝克衛(wèi)斯-威德曼綜合征(beckwith-wiedemannsyndrome)、普拉德-威利和安格爾曼綜合征(prader–williandangelmansyndromes)和奧爾布賴特的遺傳性骨病(albright'shereditaryosteodystrophy)；和其它遺傳缺陷，諸如脆性x綜合征。例如，以下的基因座的高甲基化可能是診斷性的：對(duì)于三體性21，圍繞cryaa、hlcs、c21orf63、olig2、cbr1、sim2、dscam、trpm2、c21orf29、mir155hg、icos配體樣、sim2、dscr6、chr21組00165、prmt2和col18a1的cpg島(lim等，bmcmedgenomics,20147:1；tong等，clinchem,200956:90；tong等，plosone,20105:e15244；chim等，clinchem,200854:500；美國(guó)專利第8,476,013)號(hào)；對(duì)于三體性18，serpinb5(乳腺絲抑蛋白)的啟動(dòng)子序列中、vapa與apcdd1基因之間的高甲基化cpg位，及cidea、chr18組00091、chr18組00094、klhl14、st8sia3、onecut2、rax、chr18組00277、neto1、mbp和nfatc1中的cpg位點(diǎn)(tong等，clinchem,200652:2194；tsui等，plosone,20105:e15069；美國(guó)專利第8,476,013)號(hào)；對(duì)于三體性13，chr13組00016、atp8a2、gsj1、pdx1、mab21l1、rb1、pcdh17、klhl1、pou4f1、gpc6、sox21、zic2、chr13組00385、chr13組00390、chr13組00391、chr13組00395、chr13組00399和proz中的高甲基化位點(diǎn)(美國(guó)專利第8,476,013號(hào))；對(duì)于貝克衛(wèi)斯-威德曼綜合征，11p15.5處的cpg高甲基化位點(diǎn)(coffee等，genetmed,20068:628)；對(duì)于普拉德-威利和安格爾曼綜合征，15q11.2-q13(procter等，clinchem,200652:1276)；與奧爾布賴特的遺傳性骨病相關(guān)的xl基因座(izzi等，plosone,20127:e38579)；及對(duì)于脆性x綜合征，fmr1基因中的cpg位點(diǎn)(hansen等，hummolgenet,19921:571；alisch等，bmcmedgenet,201314:18)。因此，主題方法的夾板寡核苷酸可經(jīng)設(shè)計(jì)為與這些基因座的高甲基化位點(diǎn)互補(bǔ)來診斷產(chǎn)前遺傳和表觀遺傳異常。

在某些實(shí)施方案中，本方法可用于nipt。例如，在rassf1a基因的啟動(dòng)子區(qū)域中的高甲基化序列可用于提高產(chǎn)前rhd基因分型和子癇前期易感性的檢測(cè)(chan等，clinchem,200652:2211；tsui等，prenatdiagn,200727:1212)。因此，主題方法的夾板寡核苷酸可經(jīng)設(shè)計(jì)為與rassf1a基因的啟動(dòng)子區(qū)域中的甲基化序列互補(bǔ)。發(fā)現(xiàn)rassf1(ras相關(guān)(ralgds/af-6)結(jié)構(gòu)域家族1)在胎盤中高甲基化但在母體血細(xì)胞中完全未甲基化。

在某些實(shí)施方案中，本分方法可用于通過設(shè)計(jì)與在以下基因中的甲基化序列或與以下基因相關(guān)的甲基化序列互補(bǔ)的夾板寡核苷酸檢測(cè)胎兒dna中的高甲基化：sox14、tbx3、six2、tlx3、foxp4、npy、shh、osr2、glis3、prmt8、pax9、six1、isl2、dlx4、cbx4和edg6(nygren等，clinchme,2010,56:1627；美國(guó)專利第8,476,013號(hào))。

在又其它實(shí)施方案中，本方法可用于診斷對(duì)病理妊娠(諸如子癇前期)的易感性。例如，c-myc啟動(dòng)子區(qū)域中的cpg位點(diǎn)和胎兒dna的h19的外顯子1中的高甲基化與子癇前期相關(guān)(rahat等，molhumreprod,2014；lu等，intjmolmed,2014)。因此，在某些實(shí)施方案中，經(jīng)設(shè)計(jì)與這些區(qū)域中的甲基化序列互補(bǔ)的主題方法的夾板寡核苷酸可用于確定對(duì)子癇前期的易感性。

在某些實(shí)施方案中，主題方法可用作診斷的癌癥的一部分。例如，結(jié)腸直腸癌與若干基因中或周圍的cpg島的甲基化增加相關(guān)，所述基因包括bmp3ndrg4、胞裂蛋白9、tfpi2、p14、eya2、alx4、igfbp7、gata4/5、mgmt、tbx5、id4、btg4、mirna-34b/c、cdh13、tpef/hpp1、npy、penk、wif、en1、sctr、inhbb和波形蛋白(zou等cancerepidemiolbiomarkersprev,200716:2686；melotte等，jnatlcancerinst,2009101:916；grützmann等，plosone,20083:e3759；devos等，clinchem,2009,55:1337；wasserkort等，bmccancer,201313:398；hibi等，cancerlett,2011311:96；esteller等，cancerres,200060:129；zou等.cancerepidemiolbiomarkersprev,200716:2686；hinoue等，plosone20094:e8357；hellebrekers等，clincancerres,200915:3990；shen等，jnatlcancerinst,200597:1330；yu等，oncogene,201029:6464；clincancerres,200410:7475；toyota等，cancerres,200868:4123；toyooka等，cancerres,200262:3382；ebert等，neoplasia,2005,7:771；chen等，jnatlcancerinst,200597:112.,cancerepidemiolbiomarkersprev,200716:2686；roperch等，bmccancer,201313:566；mayor等，brjcancer,2009100:1534)。因此，在某些實(shí)施方案中，在主題方法中使用的夾板寡核苷酸可經(jīng)設(shè)計(jì)與那些基因中的甲基化序列互補(bǔ)。

肝細(xì)胞癌和/或肝硬化和/或丙型肝炎病毒感染與同p16、p15、rassf1a、ssbp2、b4galt1、casp8、socs1、hic-1的d17s5基因座、apc、wif-1、runx-3、dlc-1、sfrp-1、dkk、cdh1、klk10、ocgr1、dusp4、npr1、cyp24a1、cdkn2a、ccna1、gstp1、p14、p73、rar-β、ar、dbccr1、irf7和oct6相關(guān)的cpg島的甲基化增加相關(guān)。(wong等，cancerres,199959:71；chu等，jkoreanmedsci,200419:83；wong等，clincancerres,20006:3516；michailidi等，gastroenterolrespract,20142014:597164；yu等，bmccancer,20022:29；yoshikawa等，natgenet,200128:29；kanai等，hepatology,199929:703；liu等，worldjgastroenterol,201117:4718；mah等，biomarkres,20142:5)。因此，在某些實(shí)施方案中，在主題方法中使用的夾板寡核苷酸可經(jīng)設(shè)計(jì)與這些區(qū)域中的甲基化序列互補(bǔ)。

類似地，多發(fā)性骨髓瘤與p16和socs-1的啟動(dòng)子區(qū)域的cpg島的甲基化增加相關(guān)(merlo等，natmed,19951:686；lo等，cancerres,199959:3899；wong等，clincancerres,20039:1047；galm等，blood,2003,101:2784)。因此，在某些實(shí)施方案中，在主題方法中使用的夾板寡核苷酸可經(jīng)設(shè)計(jì)與那些基因中的甲基化啟動(dòng)子序列互補(bǔ)。此外，多種形式的白血病與p15、p16、p14、p53、dapk、nes-1、adamts5、wif-1、sfrp-1、myod1、ptprz1、pparg、foxe3、fbxo39、pkdrej、tcf3、egr4、btg4、pax5、ikzf1、tlx3、rag1、pou2af1、cobl、col6a2、cpvl、dfnb31、eya4、fam24b、fat1、fuca2、inadl、myo3a、pcdhga12、pon3、ror1、synm、tnik、znf502、cdkn2a、ptpro、csmd1、abi3、scgb2a1、vhl、gpx3、igsf4、serpind5、adora3、aire、card15、loc340061、unc5cl、ldoc1、prf1、fabp7、sox11、dlx1、fam62c、sox14、rspo1、adcy5、hand2、spock、mll、ing1、prima1、bcl11b、ltbp2、bnc1、nr2f2、sall1、galgt2、lhx1、dlx4、klk10、tfap2、app、flj21062、bnip3、mgmt、rbp1、gata4、crabp1、lancl1、kcnk12、sorl1、cxorf57、sox9、kiaa0746、asphd2、arhgap17、pmm2、il12a、jdp2、pak1、galns、fgd2、lyar、hoxa9、ahr、robo1、nptx2、cdh1、cdkn2b、hoxd8、mlf-1、pcdh8、cd44、gadd45、zmat3、irf7、klf6和p73的高甲基化相關(guān)(bodoor等，asianpacjcancerprev,201415:75；zhao等，biomarkres,20131:24；martinez-delgado等，intjcancer,2002102:15)。因此，在某些實(shí)施方案中，在主題方法中使用的夾板寡核苷酸可經(jīng)設(shè)計(jì)與那些基因中的甲基化序列互補(bǔ)。

類似地，膽管癌與同opcml、sfrp1、hic1、pten和dcr1相關(guān)的cpg島的高甲基化相關(guān)(sriraksa等，brjcancer,2011104:1313)。因此，在某些實(shí)施方案中，在主題方法中使用的夾板寡核苷酸可經(jīng)設(shè)計(jì)與這些基因中的甲基化cpg島互補(bǔ)。

此外，肺癌與p16、dap激酶、mgmt、srbc、gstp1的啟動(dòng)子區(qū)域中的cpg島的甲基化增加相關(guān)(belinski等，procnatlacadsci,199895:11891；esteller等，cancerres,199959:67；esteller等，cancerres,199959:67；esteller等，procamassoccancerres,199839:92；等，oncogene,200524:6249；esteller等，cancerres,199959:67；jain等，plosone,20127:e35789)。因此，在某些實(shí)施方案中，在主題方法中使用的夾板寡核苷酸可經(jīng)設(shè)計(jì)與同這些基因座相關(guān)的甲基化序列互補(bǔ)。

此外，乳腺癌與sfrp1、sfrp2、sfrp5、brca1、lkb1、er、pr、syk、riz1、gstp1中的cpg島高甲基化相關(guān)(veeck等，oncogene,200625:3479；veeck等，molcancer,20087:83；veeck等，carcinogenesis,200829:991；esteller等，jnatlcancerinst,200092:564；esteller等，cancerres,200161:3225；esteller等，oncogene,200019:164；ottaviano等，cancerres,199454:2552；lapidus等，clincancerres,19962:805；yuan等，cancerres,200161:5558；du等，cancerres,200161:8094；esteller等，cancerres,199858:4515)。因此，在某些實(shí)施方案中，主題方法中使用的夾板寡核苷酸可經(jīng)設(shè)計(jì)與同這些基因中的甲基化序列或同這些基因相關(guān)的甲基化序列互補(bǔ)。

類似地，腎癌與gstp1和vhl的啟動(dòng)子區(qū)域中的cpg島的甲基化增加相關(guān)(esteller等，cancerres,199858:4515；herman等，procnatlacadsci,199491:9700)；子宮內(nèi)膜癌與在hmlh1的啟動(dòng)子區(qū)域中的甲基化增加相關(guān)(esteller等，amjpathol,1999155:1767)；和食道腺癌與在apc的啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化相關(guān)(kawakami等，jnatlcancerinst,200092:1805)。因此，在某些實(shí)施方案中，主題方法中使用的夾板寡核苷酸可經(jīng)設(shè)計(jì)與同這些基因的啟動(dòng)子區(qū)域中的甲基化序列或同這些基因的啟動(dòng)子區(qū)域中的甲基化序列互補(bǔ)。

此外，口腔鱗狀細(xì)胞癌與kif1a、hoxa9、nid2、ednrb、p16、rarβ、cdh-1、cygb和cyca1中的高甲基化相關(guān)(guerrero-preston等，cancerprevres(phila),20114:1061；shaw等，brjcancer,200694:561)；而ednrb和dcc中的高甲基化與惡化前或惡化口腔病變相關(guān)(pattani等，cancerprevres(phila),20103:1093；schussel等，clincancerres,201319:3268)。因此，在某些實(shí)施方案中，在主題方法中使用的夾板寡核苷酸可經(jīng)設(shè)計(jì)與這些基因的啟動(dòng)子區(qū)域中的甲基化序列互補(bǔ)。此外，食道鱗狀細(xì)胞癌與mirna的5’調(diào)控區(qū)域(包括mir-34a、mir-34b/c和mir-129-2)的甲基化增加相關(guān)(chen等，intjcancer,2012130:1607)。因此，在某些方面中，在主題方法中使用的夾板寡核苷酸可經(jīng)設(shè)計(jì)與這些mirna的5’調(diào)控區(qū)域中的甲基化序列互補(bǔ)。食管鱗狀細(xì)胞癌還與gpx3(he等，digdissci,201156:681)；和ecrg4(yue等，worldjgastroenterol,20039:1174)的甲基化增加相關(guān)。因此，在某些實(shí)施方案中，在主題方法中使用的夾板寡核苷酸可經(jīng)設(shè)計(jì)與這些基因的啟動(dòng)子區(qū)域中的甲基化序列互補(bǔ)。

類似地，外陰鱗狀細(xì)胞癌與mgmt、rassf2a和tsp-1中的高甲基化相關(guān)(guerrero等，intjcancer,2011128:2853)。因此，在某些實(shí)施方案中，在主題方法中使用的夾板寡核苷酸可經(jīng)設(shè)計(jì)與這些基因的啟動(dòng)子區(qū)域中的甲基化序列互補(bǔ)。愛潑斯坦-巴爾病毒相關(guān)胃癌(epstein-barrvirus-associatedgastriccarcinomas)與諸如mint2、mint31、p14、p16、p73和runx3的基因座中的高甲基化相關(guān)(saito等，jmedvirol,201385:121)。因此，在主題方法中使用的夾板寡核苷酸可經(jīng)設(shè)計(jì)與在那些基因座處的甲基化序列互補(bǔ)。

此外，前列腺癌與gstp1、ar、timp2中的高甲基化相關(guān)(lee等，procnatlacadsci,199485:11733；jarrard等，cancerres,199858:5310；pulukuri等，oncogene,200726:5229)。因此，在某些實(shí)施方案中，在主題方法中使用的夾板寡核苷酸可經(jīng)設(shè)計(jì)與這些基因中的甲基化序列互補(bǔ)。視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤與諸如rb的基因的高甲基化啟動(dòng)子序列相關(guān)(stirzaker等，cancerres,199757:2229)。因此，在主題方法中使用的夾板寡核苷酸可經(jīng)設(shè)計(jì)與這些基因的啟動(dòng)子區(qū)域中的甲基化序列互補(bǔ)。類似地，多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤與thbs1的5’調(diào)控區(qū)域中的cpg位點(diǎn)的高甲基化相關(guān)(li等，oncogene,199918:3284)。在某些實(shí)施方案中，在主題方法中使用的夾板寡核苷酸可經(jīng)設(shè)計(jì)與這些基因中的甲基化序列互補(bǔ)。

在一些實(shí)施方案中，主題方法可以用于診斷神經(jīng)變性病癥。例如，在c9orf72處的cpg位點(diǎn)的高甲基化與肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥和額顳葉變性相關(guān)(xi等，amjhumgenent,201392:981；xi等，amjhumgenent,2014)。因此，在某些實(shí)施方案中，主題方法的夾板寡核苷酸可經(jīng)設(shè)計(jì)與c9orf72的cpg位點(diǎn)中的甲基化序列互補(bǔ)。同樣地，在以下基因中在cpg位點(diǎn)處甲基化增加與帕金森氏病(parkinson’sdisease)相關(guān)：kctd5、vav2、mog、trim10、hla-dqa1、arhgef10、gfpt2、hla-drb5、tmem9、mri1、mapt、hla-drb6、lass3、gsttp2、gsttp1(masliah等，epigenetics20138:1030；coupland等，movdiord,2013)。因此，在某些實(shí)施方案中，主題方法的夾板寡核苷酸可經(jīng)設(shè)計(jì)與那些基因的cpg島中的甲基化序列互補(bǔ)。

如上所述，在一些情況下，所分析的樣品可以是從血液、例如從妊娠雌性的血液獲得的無細(xì)胞dna的樣品。在這些實(shí)施方案中，該方法例如可用于檢測(cè)發(fā)育中的胎兒中的染色體異常(如上所述)或計(jì)算樣品中胎兒dna的分?jǐn)?shù)。這些實(shí)施例提供了基于樣品中核酸的甲基化狀態(tài)的母體樣品中的胎兒核酸的檢測(cè)和定量。在一些情況下，來自母體樣品的胎兒核酸的量可以相對(duì)于存在的核酸總量來確定，從而提供樣品中胎兒核酸的百分比。在一些情況下，可在母體樣品中測(cè)定胎兒核酸的拷貝數(shù)。在一些情況下，胎兒核酸的量可以基因座特異性方式且有時(shí)以足夠允許準(zhǔn)確的染色體劑量分析(例如，以檢測(cè)胎兒非整倍性存在或不存在)的靈敏度來測(cè)定。在一些情況下，該方法可用于例如通過以下方法確定母體樣品中的胎兒dna的濃度：a)測(cè)定存在母體樣品中的dna的總量；使用本方法測(cè)定材料樣品中的甲基化的胎兒標(biāo)記物的量；并比較總dna的量與胎兒標(biāo)記物dna的量。母體樣品中的胎兒dna的濃度可以從這些結(jié)果中推斷。在一些情況下，可測(cè)定母體樣品中胎兒核酸的絕對(duì)拷貝數(shù)。

在特定的實(shí)施方案中，提供了從妊娠雌性的血液中獲得的無細(xì)胞dna樣品中評(píng)估胎兒分?jǐn)?shù)的方法。在一些情況下，該方法包括：(a)用mspji家族限制性內(nèi)切核酸酶消化所述樣品以產(chǎn)生長(zhǎng)度在20-40個(gè)堿基對(duì)的范圍內(nèi)且具有中心甲基化胞嘧啶的片段群；(b)通過以下步驟連接轉(zhuǎn)接序列a和轉(zhuǎn)接序列b至僅在胎兒dna中甲基化的多個(gè)靶片段的相應(yīng)端：(i)在轉(zhuǎn)接序列a和b的存在下雜交多個(gè)式b’-x’-a’的夾板寡核苷酸至(a)的片段，其中a’和b’分別與a和b互補(bǔ)，并且序列x’在不同的夾板寡核苷酸之間變化且每個(gè)序列x’與僅在胎兒dna中甲基化的靶片段互補(bǔ)；和(ii)連接轉(zhuǎn)接序列a、序列x和轉(zhuǎn)接序列b至彼此以產(chǎn)生式a-x-b的產(chǎn)物；和(c)定量式a-x-b的產(chǎn)物的量，和(d)歸一化(c)中獲得的量至樣品中的對(duì)照基因座的量，其中所述歸一化提供樣品中胎兒分?jǐn)?shù)的估值。在一些情況下，該方法可使用至少100、至少200、至少300、至少500或至少1000或更多個(gè)不同的夾板寡核苷酸實(shí)施，其中每個(gè)夾板寡核苷酸與僅在胎兒dna中甲基化的序列互補(bǔ)。

在這些情況下，胎兒分?jǐn)?shù)可以通過例如比較(d)中獲得的歸一化的量與標(biāo)準(zhǔn)曲線評(píng)估。在一些情況下，對(duì)照基因座可在染色體21、18和13的一個(gè)或多個(gè)上。在一些情況下，可比較(c)中定量的連接產(chǎn)物的量與在樣品中未差異甲基化的對(duì)照基因座的量。

在某些實(shí)施方案中，分析的雙鏈dna可源自單個(gè)來源(例如，單一受試者等)，而在其它實(shí)施方案中，核酸樣品可以是從多個(gè)來源中提取核酸的匯集物(例如，來自多個(gè)受試者的核酸的匯集物)，其中“多個(gè)”意指兩個(gè)或多個(gè)。因此，在某些實(shí)施方案中，核酸樣品可含有來自2個(gè)或多個(gè)的來源、3個(gè)或多個(gè)來源、5個(gè)或多個(gè)來源、10個(gè)或多個(gè)來源、50個(gè)或多個(gè)來源、100個(gè)或多個(gè)來源、500或多個(gè)來源、1000或多個(gè)來源、5000或多個(gè)來源、高達(dá)并包括約10,000或更多個(gè)來源的核酸。分子條形碼可以允許來自不同來源的序列在它們被分析后加以區(qū)別。

試劑盒

本發(fā)明也提供了用于實(shí)施如上所述的主題方法的試劑盒。在一些實(shí)施方案中，試劑盒可含有至少：(a)mspji家族限制性內(nèi)切核酸酶；(b)轉(zhuǎn)接序列a和轉(zhuǎn)接序列b；(c)式b’-x’-a’的夾板寡核苷酸，其中x’、a’和b’分別與x、a和b互補(bǔ)；且x是長(zhǎng)度為20-40個(gè)堿基對(duì)的基因組序列且具有差異甲基化的中心胞嘧啶；和(d)連接酶。在一些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)接序列a和b可以存在于相同的寡核苷酸分子中。根據(jù)需要，該試劑盒的各種成分可以存在于分開的容器中，或者某些相容組分可預(yù)合并在單個(gè)容器中。

除了上述組分，主題試劑盒還可包括使用該試劑盒的組分來實(shí)施主題方法的說明，即用于樣品分析的說明。用于實(shí)施主題方法的說明通常記錄在適合的記錄介質(zhì)上。例如，說明可印刷在底面，諸如紙或塑料等上。因此，說明可作為包裝說明書存在于試劑盒、試劑盒或其組分的容器的標(biāo)簽(即，與包裝或分裝相關(guān))等中。在其它實(shí)施方案中，說明作為合適的計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)(例如cd-rom、軟磁盤等)上存在的電子存儲(chǔ)數(shù)據(jù)文件存在。在又其它實(shí)施方案中，實(shí)際的說明不存在于試劑盒中，但提供了用于從遠(yuǎn)程來源(例如經(jīng)由互聯(lián)網(wǎng))獲得說明的方式。該實(shí)施方案的實(shí)例是包括網(wǎng)址的試劑盒，可從該網(wǎng)址查看和/或下載說明。與說明一樣，用于獲得說明的該方法記錄在適合的底面上。