通用甲基化分析方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本申請要求于2013年6月17日提交的美國臨時申請?zhí)?1/836, 060的優(yōu)先權(quán)，其 內(nèi)容在此通過引用以其整體并入本文。
[0002] 在整個本申請中，引用了多個出版物。這些出版物的公開內(nèi)容在此通過引用以其 整體并入本申請中以更充分地描述本發(fā)明所涉及的現(xiàn)有技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0003] 人類基因組包含~2800萬個CpG位點，其中約70 %在胞嘧啶的5位處甲基化 (愛德華茲等，2010 (Edwards et al.，2010))。異常的DNA甲基化已經(jīng)與越來越多的發(fā) 育疾病、年齡相關(guān)的神經(jīng)變性病癥、糖尿病和癌癥有關(guān)（羅伯森等，2005(R 〇bertS〇n et al.，2005))。因此，越來越多地研究了 DNA甲基化狀態(tài)的表觀遺傳變化在正常表型改變 和疾病相關(guān)的表性改變兩者中的作用，包括由NIH發(fā)起的路標(biāo)表觀基因組項目（Roadmap Epigenomics Project)以建立多種細(xì)胞類型的參考表觀組。為了完成所述目標(biāo)，可以以單 堿基分辨率和高通量全面地分析DNA甲基化狀態(tài)的全基因組方法和技術(shù)是至關(guān)重要的（蘇 祖基等，2008,萊爾德，2010 (Suzuki et al·，2008, Laird, 2010)) 〇
[0004] 已經(jīng)開發(fā)了超過30種甲基化分析技術(shù)，但是其都具有缺點（萊爾德， 2010 (Laird, 2010))。認(rèn)為由蘇珊克拉克（Susan Clark)和瑪麗安弗羅默（Marianne Frommer)在1994年報道的亞硫酸氫鹽基因組測序（BGS)(克拉克等，1994 (Clark et al.，1994))是最有用的方法。然而，BGS具有一些嚴(yán)重缺點：（1)在亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化產(chǎn) 生序列時存在嚴(yán)重的序列信息丟失，所述序列不能與基因組對齊；（2)對GC富集序列的 強烈偏好（愛德華茲等，2010 (Edwards et al.，2010)) ; (3)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化人工產(chǎn)品 (artifacts)，以及（4)由于在嚴(yán)苛反應(yīng)條件下的高速鏈斷裂，需要大量的長起始DNA(瓦內(nèi) 克等，2002,1997 (Warnecke et al·，2002, 1997))。為進(jìn)一步促進(jìn)全基因組DNA甲基化分析， 需要克服上述局限性的重大改進(jìn)或新方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供了一種化合物，其具有以下結(jié)構(gòu)：

[0009] 其中 Rn 私和 R 3獨立地為 H、烷基、芳基、C (0) NH 2、C (0) R'、CN、N02、C (0) R'、 S(O)2NHR'；
[0010] 其中X是0或NR' ；
[0011] 其中R'是H、烷基或芳基；并且
[0012] 其中η是1至8的整數(shù)，
[0013] 前提條件是，當(dāng)R是
且η為1時，&、R2SR3中的至少一個不為 H0[0014] 本發(fā)明還提供了一種物質(zhì)組合物，其包含具有以下結(jié)構(gòu)的化合物：：
[0016] 其中R是 ，.
[0017] 其中 Rp 私和 R 3獨立地為 H、烷基、芳基、C (0) NH 2、C (0) R'、CN、N02、C (0) R'、 S(O)2NHR'；
[0018] 其中X是0或NR' ；
[0019] 其中R'是H、烷基或芳基；并且
[0020] 其中η是1至8的整數(shù)，
[0021] 前提條件是，當(dāng)R是
且η為1時，&、R2SR3中的至少一個不為 Η，
[0022] 所述化合物與CpG甲基轉(zhuǎn)移酶相連接。
[0023] 本發(fā)明還提供了 一種產(chǎn)生雙鏈DNA衍生物的方法，其包含使所述雙鏈DNA與CpG 甲基轉(zhuǎn)移酶和具有以下結(jié)構(gòu)的S-腺苷甲硫氨酸類似物接觸：
[0025] 其中R是能夠通過所述CpG甲基轉(zhuǎn)移酶從所述S-腺苷甲硫氨酸類似物上轉(zhuǎn)移到 所述雙鏈DNA的未甲基化胞嘧啶的5-碳上的化學(xué)基團(tuán)，其是在使得所述化學(xué)基團(tuán)與所述雙 鏈DNA的所述未甲基化胞嘧啶的所述5-碳共價結(jié)合的條件下進(jìn)行，從而產(chǎn)生所述雙鏈DNA 衍生物，其中所述化學(xué)基團(tuán)具有以下結(jié)構(gòu)：

[0028] 其中 Rn 私和 R 3獨立地為 H、烷基、芳基、C (0) NH 2、C (0) R'、CN、N02、C (0) R'、 S(O)2NHR'；
[0029] 其中X是0或NR' ；
[0030] 其中R'是H、烷基或芳基；并且
[0031] 其中η是1至8的整數(shù)，
[0032] 前提條件是，當(dāng)R是
且η是1時，Rp R2SR3中的至少一個不為 H0
[0033] 本發(fā)明還提供了一種確定存在于已知序列的雙鏈DNA序列中的胞嘧啶是否為未 甲基化的方法，其包含：
[0034] a)通過使所述雙鏈DNA與CpG甲基轉(zhuǎn)移酶和具有以下結(jié)構(gòu)的S-腺苷甲硫氨酸類 似物接觸來產(chǎn)生所述雙鏈DNA的衍生物：
[0036] 其中R是化學(xué)基團(tuán)，所述化學(xué)基團(tuán)能夠通過所述CpG甲基轉(zhuǎn)移酶從所述S-腺苷甲 硫氨酸類似物轉(zhuǎn)移到所述雙鏈DNA的未甲基化胞嘧啶的5碳上以使得所述化學(xué)基團(tuán)與所述 雙鏈DNA的所述未甲基化胞嘧啶的所述5碳共價結(jié)合，從而制備衍生的雙鏈DNA，其中所述 化學(xué)基團(tuán)具有以下結(jié)構(gòu)：

[0039] 其中 Rn 私和 R 3獨立地為 H、烷基、芳基、C (0) NH 2、C (0) R'、CN、N02、C (0) R'、 S(O)2NHR'；
[0040] 其中X是0或NR' ；
[0041] 其中R'是H、烷基或芳基；并且
[0042] 其中η是1至8的整數(shù)；
[0043] b)獨立地獲得所述雙鏈DNA衍生物的單鏈；
[0044] c)對在步驟b)中獲得的所述單鏈進(jìn)行測序；以及
[0045] d)將在步驟c)中測定的所述單鏈的序列與沒有產(chǎn)生衍生物的所述雙鏈DNA的相 應(yīng)鏈的序列進(jìn)行比對，
[0046] 其中在衍生物單鏈的所述單鏈中存在尿嘧啶類似物，其替代在沒有產(chǎn)生衍生物的 所述雙鏈DNA的相應(yīng)鏈中的預(yù)定位置上的胞嘧啶，表明了在所述雙鏈DNA的所述位置上的 所述胞嘧啶是未甲基化的。
[0047] 本發(fā)明還提供了一種衍生的DNA分子，其中所述衍生的DNA分子不同于DNA之處 在于其包含核苷酸殘基，所述核苷酸殘基包含具有以下結(jié)構(gòu)的堿基：

[0051] 其中&、1?2和1?3獨立地為!1、烷基、芳基、（：(0)順2、（：(0)1?"、^勵 2、（：(0)1?"、 S(0)2NHR" ；
[0052] 其中X是0或NR' ；
[0053] 其中R"是H、烷基或芳基；并且
[0054] 其中η是1至8的整數(shù)，
[0055] 前提條件是，當(dāng)R'是
且η為1時，RpR2SR3中的至少一個不為 Η，
[0056] 并且其中所述糖是所述核苷酸殘基的糖。
[0057] 本發(fā)明還提供了一種衍生的DNA分子，其中所述衍生的DNA分子不同于DNA之處 在于其包含核苷酸殘基，所述核苷酸殘基包含具有以下結(jié)構(gòu)的堿基：
其中R"是
[0059]
[0060] 其中 Rn 私和 R 3獨立地為 H、烷基、芳基、C (0) NH 2、C (0) R'、CN、N02、C (0) R'、 S(O)2NHR'；
[0061] 其中X是0或NR' ；
[0062] 其中R'是H、烷基或芳基；并且
[0063] 其中η是1至8的整數(shù)，
[0064] 并且其中所述糖是所述核苷酸殘基的糖。
[0065] 本發(fā)明還提供了一種用于衍生雙鏈DNA分子或者用于確定存在于已知序列的雙 鏈DNA序列中的胞嘧啶是否為未甲基化的試劑盒，其包含：
[0066] a)具有以下結(jié)構(gòu)的化合物：

[0070] 其中 Rp 私和 R 3獨立地為 H、烷基、芳基、C (0) NH 2、C (0) R'、CN、N02、C (0) R'、 S(O)2NHR'；
[0071] 其中X是0或NR' ；
[0072] 其中R'是H、烷基或芳基；并且
[0073] 其中η是1至8的整數(shù)；以及
[0074] b)使用說明書。
[0075] 本發(fā)明還提供了一種確定存在于已知序列的雙鏈DNA序列中的胞嘧啶是否為未 甲基化的方法，其包含：
[0076] a)通過使所述雙鏈DNA與CpG甲基轉(zhuǎn)移酶和具有以下結(jié)構(gòu)的S-腺苷甲硫氨酸類 似物接觸來產(chǎn)生所述雙鏈DNA的衍生物：
[0077]
[0078] 其中R是化學(xué)基團(tuán)，所述化學(xué)基團(tuán)能夠通過所述CpG甲基轉(zhuǎn)移酶從所述S-腺苷甲 硫氨酸類似物轉(zhuǎn)移到所述雙鏈DNA的未甲基化胞嘧啶的5碳上以使得所述化學(xué)基團(tuán)與所述 雙鏈DNA的所述未甲基化胞嘧啶的所述5碳共價結(jié)合，從而制備衍生的雙鏈DNA，其中所述 化學(xué)基團(tuán)具有以下結(jié)構(gòu)：

[0081] 其中1^、1?2和1?3獨立地為!1、烷基、芳基、（：(0)順2、（：(0)1?'、^勵 2、（：(0)1?'、 S(O)2NHR'；
[0082] 其中X是0或NR' ；
[0083] 其中R'是H、烷基或芳基；并且
[0084] 其中η是1至8的整數(shù)；以及
[0085] b)確定在所述雙鏈DNA中的預(yù)定位置上的胞啼啶是否被所述化學(xué)基團(tuán)R所修飾，
[0086] 其中在所述雙鏈DNA中預(yù)定位置上的所述胞啼啶被所述化學(xué)基團(tuán)修飾表示在所 述雙鏈DNA中的所述位置上的所述胞嘧啶為未甲基化的。
【附圖說明】
[0087] 圖1.通過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（MTase)使用AdoMet類似物將C轉(zhuǎn)化為U。MTase將 化學(xué)轉(zhuǎn)化基團(tuán)R從AdoMet類似物轉(zhuǎn)移到胞嘧啶的5位上。在轉(zhuǎn)移之后，在R基團(tuán)與C之間 的以光化學(xué)方式觸發(fā)的分子內(nèi)反應(yīng)促進(jìn)4位上的脫氨基化以形成U類似物。DNA MTase能 夠?qū)⒍喾N官能團(tuán)轉(zhuǎn)移到具有高序列特異性的雙鏈DNA中的胞嘧啶的5位上。
[0088] 圖2. 5-A0MC的合成路線圖。
[0089] 圖3.在5-A0MC的光輻照時間過程中的HPLC圖譜。在輻照3小時之后，主峰是起 始材料5-A0MC (MS-MW實測值298)(左側(cè)）。在12小時光輻照之后，大多數(shù)起始材料被消耗 產(chǎn)生MS-Mff為299的新產(chǎn)物5-A0MU (右側(cè)）。
[0090] 圖4.新的以光化學(xué)方式產(chǎn)生的產(chǎn)物（5-A0MU)的UV吸收光譜顯示出在265nm處 的最大吸收，其為典型的U吸收，而起始材料（5-A0MC)示出· max = 274nm的期望的C吸 收。
[0091] 圖5.由5-A0MC以光化學(xué)方式產(chǎn)生的產(chǎn)物與合成的5-A0MU的混合物在HPLC分析 中表現(xiàn)為單一峰。
[0092] 圖6. 5-A0MC亞磷酰胺的合成。
[0093] 圖7.引物延長的單堿基延伸MS分析表明在光輻照之后在DNA鏈中的5-A0MC轉(zhuǎn)化 為5-A0MU (C到U)，產(chǎn)生摻有addA⑷的引物延伸產(chǎn)物（Mff 3261)，而在對應(yīng)（counterpart) 的DNA鏈中，未修飾的C保持完整，產(chǎn)生摻有ddG的延伸產(chǎn)物（MW3277) (B)。
[0094] 圖8.含有光反應(yīng)性部分的AdoMet類似物的實例結(jié)構(gòu)。札、私和R 3獨立地為H、烷 基、芳基、以0)順2、(：(0)1?'、^勵2、(：(0)1?'、3(0) 2順1?'3是0或冊'；1?'是!1或烷基；并且 η = 1 至 8〇
[0095] 圖9.含有光反應(yīng)性基團(tuán)的AdoMet類似物的合成的實例路線圖。
[0096] 圖10.光反應(yīng)性基團(tuán)的溴化物的合成的實例路線圖。
[0097] 圖11.基于DNA甲基轉(zhuǎn)移酶輔助的CpG位點特異性C向U轉(zhuǎn)化的DNA甲基化分析 方法。優(yōu)化的AdoMet類似物用于將轉(zhuǎn)化基團(tuán)遞送至未甲基化的CpG上以使得只有修飾的 C可通過光觸發(fā)的分子內(nèi)反應(yīng)進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為U。后續(xù)測序允許DNA甲基化狀態(tài)以單堿基分 辨率讀出。
[0098] 圖12. Ru (bpy) 32+的雙途徑光催化機制，所述Ru (bpy) 32+是可進(jìn)行缺電子稀經(jīng)和富 電子烯烴兩者的[2+2]環(huán)加成的多功能光催化劑。
[0099] 圖13. A.當(dāng)C用缺電子雙鍵修飾時，通過環(huán)加成中間體進(jìn)行的Ru(bpy)32+_可見光 催化的DNA中的5-位修飾C向U的光轉(zhuǎn)化。B.當(dāng)C用富電子雙鍵修飾時，通過環(huán)加成中間 體進(jìn)行的Ru (bpy)32+-可見光催化的DNA中的5-位修飾的C向U的光轉(zhuǎn)化。
[0100] 圖14.光轉(zhuǎn)化測定。合成了具有在相同CpG位點的環(huán)境中在各鏈上的可光轉(zhuǎn)化的 5_修飾的胞嘧啶（C'）的寡核苷酸。在輻照之前，或者在不存在向U類似物（U'）的光轉(zhuǎn)化 的情況下，可通過限制性內(nèi)切酶HpaII切割位點，然后進(jìn)行PCR擴增，其導(dǎo)致C'被正常C替 換。在光轉(zhuǎn)化之后，PCR可將所得U'轉(zhuǎn)化為正常U，在這種情況下，可用BfaI切割位點。在 DNA中包括其它限制性位點以產(chǎn)生使得凝膠上的條帶或者由質(zhì)譜法獲得的峰可容易分辨的 片段尺寸。
【具體實施方式】
[0101] 術(shù)語
[0102] 除非另外規(guī)定，否則如本文所使用的，各以下術(shù)語將具有如下所列的定義。
[0103] A -腺嘌呤；
[0104] C -胞嘧啶；
[0105] DNA -脫氧核糖核酸；
[0106] G -鳥嘌呤
[0107] RNA -核糖核酸；
[0108] T -胸腺嘧啶；以及
[0109] U -尿嘧啶。
[0110] "核酸"可意指任何核酸分子，包括，但不限于，DNA、RNA及其雜合體。形成核酸分子 的核酸堿基可以是堿基A、C、G、T和U以及其衍生物。這些堿基的衍生物是本領(lǐng)域公知的，并 且在《PCR系統(tǒng)、試劑和消耗品》(PCR Systems，Reagents and Consumables) (?金埃爾默目 錄1996至1997年，羅氏分子系統(tǒng)公司，布蘭奇，新澤西州，美國（Perkin Elmer Catalogue 1996_1997，Roche Molecular Systems，Inc.，Branchburg, New Jersey, USA))中舉例說明。
[0111] 核苷酸的"類型"是指A、G、C、T或U。堿基的"類型"是指腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、 尿嘧啶或胸腺嘧啶。
[0112] "質(zhì)量標(biāo)記物"意指預(yù)定尺寸的分子實體，其能夠通過可斷裂的鍵連接在其它實體 上。
[0113] "固體基底"可意指可黏附核酸或試劑的以固相存在的任何合適的介質(zhì)。非限制性 實例包括芯片、顆?；蛑?。
[0114] "雜交"可意指基于序列互補性使一條單鏈核酸與另一條核酸退火。在核酸之間 的雜交傾向取決于其環(huán)境的溫度和離子強度、核酸的長度以及互補程度。這些參數(shù)對雜交 的影響是本領(lǐng)域公知的（參見薩姆布魯克J，弗里奇EF，馬尼亞蒂斯T. 1989.分子克?。?實驗室手冊·冷泉港實驗室出版社，紐約（Sambrook J，F(xiàn)ritsch EF，Maniatis T. 1989. Molecular cloning:a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.)) 〇
[0115] 本發(fā)明的實施例
[0116] 本發(fā)明提供了一種化合物，其具有以下結(jié)構(gòu)：
[0118] 其中R是 ，
[0120]其中 R!、R2和 1?3獨立地為 H