![具有多DNA間隔序列的序列轉(zhuǎn)換和信號擴(kuò)增DNA及使用其的檢測方法與流程](http://img.xjishu.com/img/zl/2017/10/161844324963901.gif)
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背景技術(shù):
:檢測試驗樣品中的靶核酸在各個領(lǐng)域中都重要,包括醫(yī)學(xué)和生物學(xué)。許多組合物、測定平臺和程序可用于檢測特異性核酸分子。為了使檢測在臨床環(huán)境中有效,這些程序不僅應(yīng)該是可重現(xiàn)和準(zhǔn)確的,而且還必須是穩(wěn)健和快速的。一種用于從混合核酸序列群擴(kuò)增特定序列的常用方法是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)。由于典型的pcr在三個不同的溫度下進(jìn)行,所以反應(yīng)可能與挑戰(zhàn)相關(guān),例如難以保持精確的溫度,以及時間損失與擴(kuò)增循環(huán)的數(shù)量成比例地增加。雙鏈模板dna變性為單鏈(雖然在一定程度上依賴于特定序列)通常需要使用高“解鏈”溫度,這限制了可用于那些高度耐熱的dna聚合酶的類別。因此,已經(jīng)開發(fā)了等溫擴(kuò)增平臺技術(shù)以在比pcr中使用的反應(yīng)條件更溫和的反應(yīng)條件下檢測核酸。然而,這些等溫擴(kuò)增技術(shù)尚未解決與實現(xiàn)更快反應(yīng)時間相關(guān)的挑戰(zhàn)。以下公開內(nèi)容提供了用于在比pcr中使用的反應(yīng)條件更不嚴(yán)格的反應(yīng)條件下檢測核酸序列(例如dna或rna)的替代方法和組合物。該方法和組合物保持序列選擇性和靈敏度,其允許檢測樣品中可能低濃度的核酸分子和/或短長度的核酸分子。該方法和組合物還減少反應(yīng)時間。在其它方面,本發(fā)明提供了可以在低溫、等溫條件下提高樣品中靶核酸的檢測限的新方法和核酸分子,并且可以簡化或改進(jìn)樣品制備和自動化檢測方法,同時減少反應(yīng)時間。技術(shù)實現(xiàn)要素:一方面,本發(fā)明涉及一種用于檢測樣品中靶核酸的方法,所述方法包括使所述樣品與寡核苷酸、聚合酶和核酸內(nèi)切酶接觸,所述寡核苷酸(序列轉(zhuǎn)換dna或scdna)在5'至3'方向上包含信號dna產(chǎn)生序列(a)、核酸內(nèi)切酶識別位點(b)、多dna間隔序列(pds)和與靶核酸的3'末端互補(bǔ)的序列(c);所述核酸內(nèi)切酶用于切口反應(yīng)。在該方面的實施方式中,該方法還包括確定信號dna的存在或不存在,其中信號dna的存在表明樣品中靶核酸的存在。一方面,本發(fā)明涉及一種用于檢測樣品中靶核酸的方法,所述方法包括使所述樣品與第一寡核苷酸、第二寡核苷酸、聚合酶和核酸內(nèi)切酶接觸,所述第一寡核苷酸(序列轉(zhuǎn)換dna或scdna)在5'至3'方向上包含信號dna產(chǎn)生序列(a)、核酸內(nèi)切酶識別位點(b)、多dna間隔序列(pds)和與靶核酸的3'末端互補(bǔ)的序列(c);所述第二寡核苷酸(信號擴(kuò)增dna或sadna)在5'至3'方向上包含與第一寡核苷酸的信號dna產(chǎn)生序列(a)同源的信號dna產(chǎn)生序列(d)、核酸內(nèi)切酶識別位點(e)(其可以與scdna中的核酸內(nèi)切酶識別位點(b)相同或不同)、多dna間隔序列(pds)(其可以與scdna中的pds相同或不同)和與第一寡核苷酸的信號dna產(chǎn)生序列(a)同源的序列(f);所述核酸內(nèi)切酶用于切口反應(yīng)。在該方面的實施方式中,該方法還包括確定信號dna的存在或不存在,其中信號dna的存在表明樣品中靶核酸的存在。此外,在該方面的一些實施方式中,信號擴(kuò)增dna(sadna)不具有多dna間隔序列(pds)。間隔是多“核酸”間隔,例如可以是多dna間隔(pds)、多rna間隔(prs)或其衍生物或類似物(例如人造核酸)。在某些實施方式中,多dna間隔(pds)序列可以包含g、a、t、c或其任何組合。多rna間隔(prs)序列可以包含g、a、u、c或其任何組合。此外,pds序列可以是1至20、1至15、1至10、1至8、1至6、或1至5個堿基長度。如下面更詳細(xì)描述,本文中公開的方法對于檢測樣品中的靶rna特別有用。在核酸內(nèi)切酶識別位點(b)和與靶標(biāo)的3'末端互補(bǔ)的序列(c)之間的多dna間隔(pds)序列的scdna中的放置大大提高了產(chǎn)生信號dna的速率。在另一方面,本發(fā)明涉及加速或增強(qiáng)rna-dna混合雙鏈體的下游、上游和/或相鄰的核酸內(nèi)切酶切口活性。在某些實施方式中,聚合酶可具有鏈置換活性。在另外的實施方式中,聚合酶可以是3'至5'核酸外切酶缺陷、5'至3'核酸外切酶缺陷、或3'至5'核酸外切酶缺陷和5'至3'核酸外切酶缺陷兩者。在一些實施方式中,聚合酶包含dna聚合酶。在實施方式中,核酸內(nèi)切酶可以包含可用于切割寡核苷酸的反應(yīng)中的切口核酸內(nèi)切酶或限制性核酸內(nèi)切酶。雖然本文中公開的方法可以在典型的dna擴(kuò)增條件(例如與標(biāo)準(zhǔn)pcr、反應(yīng)物濃度、時間循環(huán)等相關(guān)的典型溫度)下進(jìn)行,但在一些實施方式中,該方法可以在等溫條件或基本上恒溫下進(jìn)行。在另外的實施方式中,該方法可以在比標(biāo)準(zhǔn)pcr方法中使用的溫度更低的溫度下進(jìn)行。作為一個示例,該方法的一些實施方式可以在等于或低于如下所述的scdna的靶核酸(t)和序列(c)或sadna的信號dna(s)和序列(f)的計算的最佳雜交或退火溫度或?qū)嶒灉y定的雜交或退火溫度的溫度下進(jìn)行。在實施方式中,該方法可以在低于與scdna的序列(c)結(jié)合的靶核酸(t)或與sadna的序列(f)結(jié)合的信號dna(s)的解鏈溫度的溫度下進(jìn)行。在其它實施方式中,該方法可以在允許聚合酶和/或核酸內(nèi)切酶活性的溫度下進(jìn)行。在另外的實施方式中,該方法可以在處于或約為用于檢測樣品中靶核酸的反應(yīng)混合物中存在的聚合酶和/或核酸內(nèi)切酶的最佳反應(yīng)溫度的溫度下進(jìn)行。另一方面,本發(fā)明涉及一種寡核苷酸,其在本文中可稱為“序列轉(zhuǎn)換dna”(或“scdna”),其在5'至3'方向上包含信號dna產(chǎn)生序列(a)、核酸內(nèi)切酶識別位點(b)、多dna間隔(pds)序列和與靶核酸的3'末端互補(bǔ)的序列(c)。另一方面,本發(fā)明涉及一種寡核苷酸,其可以在本文中稱為“信號擴(kuò)增dna”(或“sadna”),其在5'至3'方向上包含與序列轉(zhuǎn)換dna(scdna)的信號dna產(chǎn)生序列(a)同源的信號dna產(chǎn)生序列(d)、核酸內(nèi)切酶識別位點(e)、多dna間隔(pds)序列和與序列轉(zhuǎn)換dna(scdna)的信號dna產(chǎn)生序列(a)同源的序列(f)。另一方面,本發(fā)明涉及信號擴(kuò)增dna,其在5'至3'方向上包含與序列轉(zhuǎn)換dna(scdna)的信號dna產(chǎn)生序列(a)同源的信號dna產(chǎn)生序列(d)、核酸內(nèi)切酶識別位點(e)和與序列轉(zhuǎn)換dna(scdna)的信號dna產(chǎn)生序列(a)同源的序列(f)。本發(fā)明的sc和/或sadna通常是線性的,然而這些dna也可以是圓形的(即微環(huán)dna(mc))。當(dāng)靶核酸的3'末端與微環(huán)scdna結(jié)合時,或者當(dāng)信號dna的3'末端與微環(huán)sadna結(jié)合時,可以引發(fā)滾環(huán)擴(kuò)增(rca)。所得到的rca產(chǎn)物是含有數(shù)千拷貝的scdna或sadna的長單鏈dna片段。在一個實例中,scdna的信號dna產(chǎn)生序列(a)可以與靶核酸(t)的5'末端互補(bǔ)。在這方面,靶核酸(t)與scdna的信號dna產(chǎn)生序列(a)和序列(c)均結(jié)合。靶核酸(t)與scdna的結(jié)合(在dna連接酶存在下)導(dǎo)致形成微環(huán)scdna(mcscdna),并隨后引發(fā)滾環(huán)擴(kuò)增(rca)。所得到的rca產(chǎn)物是含有數(shù)千拷貝的scdna的長單鏈dna片段。在一個實施方式中,scdna的核酸內(nèi)切酶識別位點在發(fā)夾結(jié)構(gòu)的雙鏈莖環(huán)區(qū)內(nèi),并因此在切口核酸內(nèi)切酶存在下進(jìn)行切割(在莖環(huán)的3'側(cè))。在切口核酸內(nèi)切酶和聚合酶均存在的情況下,可以直接從rca產(chǎn)物產(chǎn)生信號dna。本發(fā)明的方法和寡核苷酸可以與其它擴(kuò)增和/或檢測方案組合使用。例如,根據(jù)本文公開的方法產(chǎn)生的信號dna中的任一種可以用作滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)中的引物。在一個實施方式中,根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的信號dna的3'末端可以與微環(huán)dna模板互補(bǔ),并且可以在結(jié)合信號dna時開始滾環(huán)擴(kuò)增。靶核酸序列可以是感興趣的任何核苷酸序列,并且在一些實施方式中可以包含源自感染劑或微rna的序列。在其它實施方式中,靶核酸可以包含可能與疾病或病癥相關(guān)的基因的序列。在一些實施方式中,核酸內(nèi)切酶識別位點包含與由核酸內(nèi)切酶切割的序列互補(bǔ)的序列。在其它實施方式中,由核酸內(nèi)切酶切割的序列與由核酸內(nèi)切酶特異性識別的序列相鄰(下游或上游)。在另一方面,本發(fā)明涉及一種用于檢測樣品中靶核酸的組合物,所述組合物包含:寡核苷酸(序列轉(zhuǎn)換dna或scdna),其在5'至3'方向上包含信號dna產(chǎn)生序列(a)、核酸內(nèi)切酶識別位點(b)、多dna間隔(pds)序列和與靶核酸的3'末端互補(bǔ)的序列(c);聚合酶;和用于切口反應(yīng)的核酸內(nèi)切酶。在另一方面,本發(fā)明涉及一種用于檢測樣品中靶核酸的組合物,所述組合物包含:第一寡核苷酸(序列轉(zhuǎn)換dna或scdna),其在5'至3'方向上包含信號dna產(chǎn)生序列(a)、核酸內(nèi)切酶識別位點(b)、多dna間隔(pds)序列和與靶核酸的3'末端互補(bǔ)的序列(c);第二寡核苷酸(信號擴(kuò)增dna或sadna),其在5'至3'方向上包含與第一寡核苷酸的信號dna產(chǎn)生序列(a)同源的信號dna產(chǎn)生序列(d)、核酸內(nèi)切酶識別位點(e)(其可以與sadna中的核酸內(nèi)切酶識別位點(b)相同或不同)、多dna間隔(pds)序列(其可以與第一寡核苷酸的pds序列相同或不同)和與第一寡核苷酸的信號dna產(chǎn)生序列(a)同源的序列(f);聚合酶和用于切口反應(yīng)的核酸內(nèi)切酶。在該方面的一些實施方式中,第二寡核苷酸或信號擴(kuò)增dna(sadna)不具有多dna間隔(pds)序列。當(dāng)核酸內(nèi)切酶識別位點是雙鏈時,組合物還可以包含聚合酶和/或在第一和第二寡核苷酸的核酸內(nèi)切酶識別位點處或鄰近能夠切割的核酸內(nèi)切酶。組合物還可以包括用于新合成的dna的熒光檢測的其它試劑,例如反應(yīng)緩沖液、脫氧核糖核苷酸和報道分子,例如熒光團(tuán)修飾的探針dna(例如分子信標(biāo)探針)。可以使用本領(lǐng)域通常已知的報道分子,包括吖啶共軛的探針(即化學(xué)發(fā)光技術(shù))。在另一方面,本發(fā)明涉及一種用于檢測樣品中靶核酸的試劑盒,所述試劑盒包含:寡核苷酸(序列轉(zhuǎn)換dna或scdna),其在5'至3'方向上包含信號dna產(chǎn)生序列(a)、核酸內(nèi)切酶識別位點(b)、多dna間隔(pds)序列和與靶核酸的3'末端互補(bǔ)的序列(c);聚合酶;和用于切口反應(yīng)的核酸內(nèi)切酶。在一些實施方式中,試劑盒可以還包含能夠切割核酸內(nèi)切酶識別位點或鄰近核酸內(nèi)切酶識別位點的位點的聚合酶和/或核酸內(nèi)切酶。試劑盒還可以包括用于熒光檢測新合成的dna例如信號dna的試劑,例如反應(yīng)緩沖液、脫氧核糖核苷酸和報道分子,例如熒光團(tuán)修飾的探針dna(例如分子信標(biāo)探針)。試劑盒還可以包括用于實踐本文公開的任何一種方法的說明書。在另一方面,本發(fā)明涉及一種用于檢測樣品中靶核酸的試劑盒,所述試劑盒包含:第一寡核苷酸(序列轉(zhuǎn)換dna或scdna),其在5'至3'方向上包含信號dna產(chǎn)生序列(a)、核酸內(nèi)切酶識別位點(b)、多dna間隔(pds)序列和與靶核酸的3'末端互補(bǔ)的序列(c);第二寡核苷酸(信號擴(kuò)增dna或sadna),其在5'至3'方向上包含與第一寡核苷酸的信號dna產(chǎn)生序列(a)同源的信號dna產(chǎn)生序列(d)、核酸內(nèi)切酶識別位點(e)(其可以與sadna中的核酸內(nèi)切酶識別位點(b)相同或不同)、多dna間隔(pds)序列(其可以與第一寡核苷酸的pds序列相同或不同)和與第一寡核苷酸的信號dna產(chǎn)生序列(a)同源的序列(f)。在一些實施方式中,第二寡核苷酸或信號擴(kuò)增dna(sadna)不具有多dna間隔(pds)序列。在一些實施方式中,試劑盒可以還包含能夠切割核酸內(nèi)切酶識別位點或鄰近核酸內(nèi)切酶識別位點的位點的聚合酶和/或核酸內(nèi)切酶。試劑盒還可以包括用于熒光檢測新合成的dna例如信號dna的試劑,例如反應(yīng)緩沖液、脫氧核糖核苷酸和報道分子,例如熒光團(tuán)修飾的探針dna(例如分子信標(biāo)探針)。試劑盒還可以包括用于實踐本文公開的任何一種方法的說明書。本文公開的方法、寡核苷酸、組合物和試劑盒可以與整體系統(tǒng)平臺組合使用。例如,本發(fā)明的方法、寡核苷酸、組合物和試劑盒可以與abbott’sarchitect系統(tǒng)組合使用。本文公開的方法、寡核苷酸、組合物和試劑盒可以與樣品制備系統(tǒng)平臺一起使用,例如m2000sp樣品制備系統(tǒng)(abbottdiagnostics,abbottpark,il)。類似地,本文公開的方法、寡核苷酸、組合物和試劑盒可以與檢測系統(tǒng)平臺一起使用,例如abbott’si-stat檢測系統(tǒng)(abbottdiagnostics,abbottpark,il)。此外,本發(fā)明的方法、寡核苷酸、組合物和試劑盒可以與任何數(shù)量的其它裝置、測定平臺和儀器一起使用,例如手持式熒光檢測器、微ph計、微流體裝置、微陣列酶檢測系統(tǒng)、免疫色譜條和側(cè)流裝置。本文公開的方法、寡核苷酸、組合物和試劑盒可用于分子診斷領(lǐng)域,包括非感染性和感染性疾病的診斷。例如,本發(fā)明的方法、寡核苷酸、組合物和試劑盒可以用于檢測人體液例如血液、尿液、唾液、汗液和糞便中的微rna、信使rna、非編碼rna和甲基化dna。類似地,本發(fā)明的方法、寡核苷酸、組合物和試劑盒可用于檢測人體液例如血液、尿液、唾液、汗液和糞便中的源自感染性疾病的靶核酸,例如hbv、hcv、hiv、hpv、htlv-1、parvo病毒、結(jié)核病、梅毒、瘧疾和溶組織內(nèi)阿米巴。應(yīng)當(dāng)理解,在本發(fā)明的一些方面,本文公開的sc和sadna可以包含化學(xué)修飾的核苷酸。例如,本文公開的sc和sadna可以包含lna(鎖定核酸)、bna(橋連核酸)、ena(乙烯橋連核酸)、gna(乙二醇核酸)、tna(蘇糖核算)、pna(肽核酸)、嗎啉代核酸、硫代磷酸酯核苷酸、或其組合和/或衍生物??紤]到下面的描述,由本發(fā)明提供的另外的方面、實施方式和優(yōu)點將變得顯而易見。附圖說明圖1a是示意性說明用于檢測樣品中靶核酸的序列轉(zhuǎn)換dna(scdna)的非限制性實例的圖。scdna在5'至3'方向上包含信號產(chǎn)生序列(a)、可用于切口反應(yīng)的核酸內(nèi)切酶識別位點(b)、多dna間隔(pds)序列和與靶核酸互補(bǔ)的序列(c)。圖1b是示意性說明用于檢測樣品中靶核酸的信號擴(kuò)增dna(sadna)的非限制性實例的圖。sadna在5'至3'方向上包含與scdna的信號dna產(chǎn)生序列(a)同源的信號dna產(chǎn)生序列(d);核酸內(nèi)切酶識別位點(e)(其可以與scdna的核酸內(nèi)切酶識別位點(b)相同或不同)、多dna間隔(pds)序列(其可以與scdna的pds序列相同或不同)和與第一scdna的信號dna產(chǎn)生序列(a)同源的序列(f)。在一些實施方式中,信號擴(kuò)增dna(sadna)不具有多dna間隔(pds)序列。圖2a是示意性說明用于檢測樣品中靶核酸的靶(t)核酸與序列轉(zhuǎn)換(sc)dna的示例性反應(yīng)進(jìn)展的圖。序列(a)-(c)和pds如圖1a中所述,序列(t)表示靶序列,序列(x)表示當(dāng)與序列(c)結(jié)合的靶(t)通過聚合酶擴(kuò)增時產(chǎn)生的序列,序列(x')表示切口擴(kuò)增序列,序列(s)表示最終產(chǎn)生的信號dna序列。圖2b是示意性說明用于檢測樣品中靶核酸的信號dna(s)與信號擴(kuò)增(sa)dna的示例性反應(yīng)進(jìn)展的圖。序列(d)-(f)和pds如圖1b中所述,序列(s)是由target(t)核酸與scdna反應(yīng)產(chǎn)生的信號dna,如圖2a中所述,序列(y)表示與序列(d)結(jié)合的信號dna(s)通過聚合酶擴(kuò)增時產(chǎn)生的序列,序列(y')表示切口擴(kuò)增序列,序列(s)表示最終產(chǎn)生的信號dna序列。由于sa信號產(chǎn)生序列(d)與sc信號產(chǎn)生序列(a)同源,因此產(chǎn)生相同的信號dna(s)。圖3顯示了實施例1中進(jìn)行的那些反應(yīng)的結(jié)果,表明位于核酸內(nèi)切酶識別位點(b)和scdna的序列(c)之間的pds序列的存在加速了信號dna的擴(kuò)增。圖4顯示了實施例2中進(jìn)行的這些反應(yīng)的結(jié)果,表明位于核酸內(nèi)切酶識別位點(b)和scdna的序列(c)之間的pds序列的存在增強(qiáng)了核酸內(nèi)切酶識別位點(b)的切割。具體實施方式在一般意義上,本發(fā)明涉及核酸構(gòu)建體,其在檢測試驗樣品中的靶核酸中令人驚奇地有效。本文中公開的構(gòu)建體包含允許在靶核酸存在下產(chǎn)生的信號dna產(chǎn)生的核酸序列,其伴隨著反應(yīng)速度的增加。本文公開的方法和核酸構(gòu)建體提供了可有利地在低溫和等溫條件下進(jìn)行靶核酸的選擇、靈敏和快速的檢測。在一方面,本發(fā)明涉及一種寡核苷酸,其在本文中可稱為“信號擴(kuò)增dna”(或“sadna”),其在5'至3'方向上包含與已知的信號dna序列互補(bǔ)的第一序列、核酸內(nèi)切酶識別位點、多dna間隔(pds)序列和與第一序列的同一已知信號dna序列互補(bǔ)的第二序列。第一序列是圖1b中的信號dna產(chǎn)生序列(d),其與scdna的已知信號dna產(chǎn)生序列(a)同源。第二序列是圖1b中的序列(f),與同一scdna的同一已知信號dna產(chǎn)生序列(a)同源。在這方面,第一和第二序列的長度可以變化,但通常每個序列的長度與另一個序列大約相同。在實施方式中,序列的長度可以在約5至約100個核苷酸的范圍內(nèi),但更通常為約5至約30、約10至約30、或約15至約30個核苷酸。核酸內(nèi)切酶識別位點包含可被如本文所述的核酸內(nèi)切酶識別、結(jié)合和切割的序列。這樣的序列通常是本領(lǐng)域已知的。核酸內(nèi)切酶識別位點可以包含核酸內(nèi)切酶結(jié)合位點5'或3'(或5'和3'兩者)的另外的核苷酸,但其長度通常不超過10個核苷酸。本發(fā)明提供了可用于檢測樣品中靶核酸的新型序列轉(zhuǎn)換(sc)和信號擴(kuò)增(sa)寡核苷酸構(gòu)建體及其組合,其伴隨著反應(yīng)速度的增加。如圖1a的說明性實施方式所示,用于檢測樣品中靶核酸的序列轉(zhuǎn)換dna(scdna)寡核苷酸在5'至3'方向上包含信號dna產(chǎn)生序列(a)、核酸內(nèi)切酶識別位點(b)、多dna間隔(pds)序列和與靶核酸的3'末端互補(bǔ)的序列(c)。如圖1b的說明性實施方式所示,用于檢測樣品中靶核酸的信號擴(kuò)增dna(sadna)在5'至3'方向上包含與scdna的信號dna產(chǎn)生序列(a)同源的信號dna產(chǎn)生序列(d);核酸內(nèi)切酶識別位點(e)(其可以與scdna的核酸內(nèi)切酶識別位點(b)相同或不同)、多dna間隔(pds)序列(其可以與scdna的pds相同或不同)和包含與scdna的信號dna產(chǎn)生序列(a)同源的序列的序列(f)。在一些實施方式中,信號擴(kuò)增dna(sadna)不具有多dna間隔(pds)序列。如圖1a中所示,本文公開的scdna包括信號產(chǎn)生序列(a)。scdna中的信號產(chǎn)生序列(a)可以包含任何所需的核酸序列,并且不受任何特定序列的限制。如下面更詳細(xì)地討論,信號產(chǎn)生序列(a)提供信號dna的模板的至少一部分(例如圖2中的核酸(s)),其產(chǎn)生表明靶核酸的存在。scdna中的信號產(chǎn)生序列(a)不受長度限制。在一些實施方式中,scdna中的信號產(chǎn)生序列(a)為約5至約100個核酸堿基,以及5至100之間的所有整數(shù)。在實施方式中,scdna中的信號產(chǎn)生序列(a)為約5至約30個核酸堿基,以及5至30之間的所有整數(shù)。在一些實施方式中,scdna中的信號產(chǎn)生序列(a)為約10至約30個核酸堿基,以及10至30之間的所有整數(shù)。在另外的實施方式中,scdna中的信號產(chǎn)生序列(a)為約15至約30個核酸堿基,以及15至30之間的所有整數(shù)(例如約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、約25、約26、約27、約28、約29或約30個堿基)。如圖1b中所示,本文公開的sadna包含與scdna的信號dna產(chǎn)生序列(a)同源的信號dna產(chǎn)生序列(d)和與同一scdna的同一信號dna產(chǎn)生序列(a)同源的序列(f)。在一些實施方式中,為了與scdna的信號dna產(chǎn)生序列(a)同源,序列(d)和(f)與相應(yīng)的信號dna產(chǎn)生序列(a)完全相同。在其它實施方式中,序列(f)與scdna的相應(yīng)信號dna產(chǎn)生序列(a)的序列相同,不同之處在于它為約1至約5、或約1至約4、或約1至約3個、或約1至約2個、或1個3'末端較短的堿基。當(dāng)sadna的信號dna產(chǎn)生序列(d)與scdna的信號dna產(chǎn)生序列(a)同源時,產(chǎn)生相同的信號dna(s)并指數(shù)擴(kuò)增。sc和sadna分別包含可以相同或不同的核酸內(nèi)切酶識別位點(b)和(e)。在單鏈形式(例如圖1a和1b的結(jié)構(gòu))中,核酸內(nèi)切酶識別位點(b)和(e)可以包含與可由核酸內(nèi)切酶切割的序列互補(bǔ)的序列。由核酸內(nèi)切酶切割的序列可以在由核酸內(nèi)切酶識別的序列的內(nèi)部、下游或上游。適當(dāng)?shù)?,?dāng)雙鏈時,核酸內(nèi)切酶識別位點(b)和(e)可被存在于反應(yīng)中的一個或多個核酸內(nèi)切酶識別,并且核酸內(nèi)切酶識別位點(b)和(e)(或與核酸內(nèi)切酶識別位點(b)和(e)相鄰的序列)可以僅在雙鏈dna的一條鏈上被切開(即切割)。如下面更詳細(xì)描述,靶核酸與scdna的互補(bǔ)序列(c)的結(jié)合通過dna聚合酶引發(fā)復(fù)制以產(chǎn)生核酸內(nèi)切酶識別位點(b)的活性雙鏈形式,其現(xiàn)在能夠作為核酸內(nèi)切酶的識別位點(圖2a)。核酸內(nèi)切酶在新產(chǎn)生的雙鏈核酸內(nèi)切酶位點(b)或與新產(chǎn)生的雙鏈核酸內(nèi)切酶位點(b)相鄰的位點處切割,然后通過dna聚合酶引發(fā)復(fù)制并產(chǎn)生信號dna(s)(參見例如圖2a)。如圖2a中所示,將核酸內(nèi)切酶識別位點(b)取向以致使新復(fù)制的鏈被切割而不是scdna。也就是說,當(dāng)產(chǎn)生新復(fù)制的鏈時,(b)中的核酸內(nèi)切酶識別位點的取向指導(dǎo)新復(fù)制鏈的核酸內(nèi)切酶活性(切開)。因此,核酸內(nèi)切酶識別位點包含與由核酸內(nèi)切酶切口的序列互補(bǔ)的序列,允許sc寡核苷酸在整個反應(yīng)中保持完整(即scdna未被切割或切開)。sc和sadna還可以包含多dna間隔(pds)序列。在scdna中,pds序列位于核酸內(nèi)切酶識別位點(b)和與靶核酸的3'末端互補(bǔ)的序列(c)之間。在sadna中,pds序列位于(e)中的核酸內(nèi)切酶識別位點和與scdna的信號產(chǎn)生序列(a)基本同源的序列(f)之間。在一些實施方式中,信號擴(kuò)增dna(sadna)不具有多dna間隔(pds)序列。sc和sadna的pds序列可以相同或不同。pds序列可以由天然堿基g、a、t或c中的任一個或多個組成,并且可以是3至20、3至18、3至16、3至14、3至14、3至12、3至10、3至8、3至6、或3至5個堿基長度。如下所述,本文公開的一個或多個sc或sadna中的pds序列的存在可以加速根據(jù)本文公開的方法進(jìn)行的反應(yīng)多達(dá)5至60、5至50、5至40、5至30、5至20、或5至10分鐘。如下面更詳細(xì)地描述,從scdna的信號產(chǎn)生序列(a)產(chǎn)生的信號dna(s)與sadna的序列(f)的結(jié)合通過dna聚合酶引發(fā)復(fù)制以產(chǎn)生sadna的核酸內(nèi)切酶識別位點(e)的活性雙鏈形式,其可以作為核酸內(nèi)切酶識別位點(圖2b)。核酸內(nèi)切酶在sadna的新產(chǎn)生的雙鏈核酸內(nèi)切酶位點(e)或與新產(chǎn)生的雙鏈核酸內(nèi)切酶位點(e)鄰近的位點處切割,然后通過dna聚合酶引發(fā)復(fù)制并產(chǎn)生信號dna(s),其與從scdna產(chǎn)生的信號dna(s)相同(圖2b)。如圖2b中所示,核酸內(nèi)切酶識別位點(e)取向為使得新復(fù)制的鏈被切割,而不是sadna。也就是說,當(dāng)產(chǎn)生新復(fù)制鏈時,e中的核酸內(nèi)切酶識別位點的取向指導(dǎo)新復(fù)制鏈的核酸內(nèi)切酶活性(切開)。因此,核酸內(nèi)切酶識別位點包含與由核酸內(nèi)切酶切口的序列互補(bǔ)的序列,允許sa寡核苷酸在整個反應(yīng)中保持完整(即sadna未被切割或切開)。與靶dna互補(bǔ)的scdna的序列(c)不受長度的限制,并且可以是約5至約100個核酸堿基,以及5和100之間的所有整數(shù)。在一些實施方式中,scdna的序列(c)為約5至約30個核酸堿基,以及5至30之間的所有整數(shù)。在一些實施方式中,scdna中的序列(c)為約10至約30個核酸堿基,以及10和30之間的所有整數(shù)。在另外的實施方式中,scdna的序列(c)為約15至約30個核酸堿基,以及15至30之間的所有整數(shù)?;パa(bǔ)序列能夠形成氫鍵相互作用以形成雙鏈核酸結(jié)構(gòu)(例如核酸堿基對)。例如,與第一序列互補(bǔ)的序列包括能夠與第一序列形成沃森-克里克堿基對的序列。如本文所用,術(shù)語“互補(bǔ)”不要求序列在其互補(bǔ)鏈的全長上是互補(bǔ)的,并且包含與另一序列的一部分互補(bǔ)的序列。因此,在一些實施方式中,互補(bǔ)序列包括在序列的整個長度上或其一部分上互補(bǔ)的序列(例如大于序列長度的約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%或約90%)。例如,兩個序列可以在超過約2至約100范圍內(nèi)的連串(連續(xù))核苷酸的長度上彼此互補(bǔ),或2至100之間的任何整數(shù)。在一些實施方式中,兩個序列可以在超過約15至約30范圍內(nèi)的連串(連續(xù))核苷酸的長度上彼此互補(bǔ),或15至30之間的任何整數(shù)。如本文所用,互補(bǔ)序列可以包含具有一些序列不匹配的序列。例如,互補(bǔ)序列可以包括與序列長度的至少約70%至100%,優(yōu)選為大于95%互補(bǔ)的序列。盡管一些量的錯配,互補(bǔ)序列通常具有在適當(dāng)條件下選擇性地彼此雜交的能力,例如嚴(yán)格和高度嚴(yán)格的條件,例如本文描述的那些或本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常已知的那些。sc和sadna可以通過已知方法合成。例如,sc和sadna可以使用亞磷酰胺法、磷酸三酯法、h-膦酸酯法或硫代膦酸酯法合成。在一些實施方式中,可以純化sc和/或sadna,例如使用離子交換hplc。sc和sadna可以包括本領(lǐng)域通常已知的化學(xué)修飾。在一些實施方式中,例如sc和sadna可以包含化學(xué)修飾的核苷酸(例如2'-o甲基衍生物、硫代磷酸酯等)、3'末端修飾、5'末端修飾或其任何組合。在一些實施方式中,可以修飾sc和sadna的3'末端,使得擴(kuò)增反應(yīng)不會從sc或sadna的3'末端發(fā)生(例如當(dāng)靶序列或另一非靶序列的結(jié)合,可能作為聚合酶擴(kuò)增的引物)。如圖2a中所示,它是靶核酸(t)的3'末端,而不是啟動dna復(fù)制的scdna。從sc或sadna的3'末端發(fā)起的任何復(fù)制可能導(dǎo)致檢測錯誤(例如假陽性)。此外,例如由scdna與非靶序列之間的結(jié)合、在scdna與靶序列之間的不正確位置的結(jié)合、sc和sadna之間的結(jié)合、或非模板的重新或從頭的dna合成引起的scdna的未修飾的3'末端的非特異性擴(kuò)增反應(yīng)也可能導(dǎo)致檢測錯誤。因此,在實施方式中,sc和sadna包含3'末端修飾,其可以減少或消除任何非期望的擴(kuò)增反應(yīng)的發(fā)生,例如上述討論的那些。3'末端修飾的非限制性實例包括tamra、dabcyl和fam。修飾的其它非限制性實例包括例如生物素化、熒光色素沉淀、磷酸化、硫醇化、胺化、反轉(zhuǎn)核苷酸或無堿基團(tuán)。在另一方面,本發(fā)明包括用于檢測樣品中靶核酸(t)的方法。該方法通常包括使所述樣品與第一寡核苷酸、第二寡核苷酸、聚合酶和核酸內(nèi)切酶接觸,所述第一寡核苷酸(或序列轉(zhuǎn)換dna或scdna)在5'至3'方向上包含信號dna產(chǎn)生序列(a)、核酸內(nèi)切酶識別位點(b)、多dna間隔(pds)序列和與所述靶核酸(t)的3'末端互補(bǔ)的序列(c);所述第二寡核苷酸(或信號擴(kuò)增dna或sadna),其在5'至3'方向上包含與第一寡核苷酸的信號dna產(chǎn)生序列(a)同源的信號dna產(chǎn)生序列(d)、核酸內(nèi)切酶識別位點(e)(與第一寡核苷酸的核酸內(nèi)切酶識別位點(b)相同)、多dna間隔(pds)序列(與第一寡核苷酸的pds相同或不同)和與第一寡核苷酸的信號dna產(chǎn)生序列(a)同源的序列(f);所述核酸內(nèi)切酶用于切口反應(yīng)。在該方面的實施方式中,該方法還包括確定信號dna的存在或不存在,其中信號dna的存在表明樣品中靶核酸的存在。在一些實施方式中,信號擴(kuò)增dna(sadna)不具有多dna間隔(pds)序列。該方法包括使樣品與核酸內(nèi)切酶接觸。核酸內(nèi)切酶可以是切口核酸內(nèi)切酶或限制性核酸內(nèi)切酶,其能夠或可用于切割與scdna內(nèi)的核酸內(nèi)切酶識別位點(b)互補(bǔ)的序列,或與sadna內(nèi)的核酸內(nèi)切酶識別位點(e)互補(bǔ)的序列。在一些實施方式中,核酸內(nèi)切酶包含可催化或可用于催化雙鏈dna切口反應(yīng)的切口核酸內(nèi)切酶或限制性核酸內(nèi)切酶。在提供切口核酸內(nèi)切酶的實施方式中,雙鏈dna的一條鏈的磷酸二酯鍵可以被切割以在切割位點上產(chǎn)生5'側(cè)的磷酸基和3'側(cè)的羥基。切口核酸內(nèi)切酶的非限制性實例包括nb.bbvci、ntalwi、nt.bbvci、nb.bsrdi、nb.bts1、nt.bspqi、nt.bstnbi、nb.bsmi、nt.cvipii和nt.bsmai。在一些實施方式中,核酸內(nèi)切酶可以是限制性核酸內(nèi)切酶。在這些實施方式中,可以修飾限制性核酸內(nèi)切酶識別位點,使得限制性核酸內(nèi)切酶僅在雙鏈dna的一條鏈上切割磷酸二酯鍵,并在雙鏈中產(chǎn)生切口??梢允褂梅椒ɑ虿呗詠硇揎椣拗菩院怂醿?nèi)切酶的活性,例如包括未被限制酶切割的雙鏈核酸的至少一條鏈中的化學(xué)修飾。該修飾的一個非限制性實例包括將一條鏈的磷酸二酯鍵的氧原子替換為硫原子。在提供限制性核酸內(nèi)切酶的實施方式中,雙鏈dna的一條鏈的磷酸二酯鍵可以被切割以在切割位點上產(chǎn)生5'側(cè)的磷酸基和3'側(cè)的羥基。限制性核酸內(nèi)切酶的非限制性實例包括hincii、hindii、avai、fnu4hi、t1111和neil。該方法包括使樣品與聚合酶接觸。在一些實施方式中,聚合酶可以是具有鏈置換活性的dna聚合酶。在一些實施方式中,聚合酶可以是缺乏5'-3'核酸外切酶活性、缺乏3'-5'核酸外切酶活性或缺少5'-3'和3'-5'核酸外切酶活性的聚合酶。聚合酶可以來源于真核生物、原核生物或病毒,并且也可以進(jìn)行遺傳修飾。在一些實施方式中,聚合酶選自在較低溫度(包括環(huán)境溫度(例如室溫))下起作用的那些。dna聚合酶的非限制性實例包括klenow片段、衍生自大腸桿菌的dna聚合酶i、衍生自嗜熱脂肪芽孢桿菌(bacillusstearothermophilus)的5'至3'核酸外切酶缺陷型bstdna聚合酶和衍生自芽孢桿菌(bacilluscaldotenax)的5'至3'核酸外切酶缺陷型bcadna聚合酶。在圖2a和2b中示出了本文公開的方法的一個非限制性實施方式。簡言之,如圖2a所示,樣品在dna聚合酶和核酸內(nèi)切酶存在下與scdna接觸,所述核酸內(nèi)切酶能夠切割核酸內(nèi)切酶識別位點(b)的雙鏈形式(即互補(bǔ)序列)),或與核酸內(nèi)切酶識別位點(b)的雙鏈形式鄰近的位點。如果樣品中存在靶核酸(t),則靶核酸(t)的3'末端序列與scdna的序列(c)雜交,其與靶標(biāo)互補(bǔ)并引發(fā)復(fù)制(通過反應(yīng)混合物中存在的dna聚合酶),從而產(chǎn)生包含雙鏈核酸內(nèi)切酶識別位點(b)的雙鏈擴(kuò)增序列(x)。新產(chǎn)生的雙鏈核酸內(nèi)切酶識別位點(b)(通過反應(yīng)混合物中存在的核酸內(nèi)切酶)的識別和新產(chǎn)生的鏈(通過反應(yīng)混合物中存在的核酸內(nèi)切酶)隨后的切割產(chǎn)生寡核苷酸信號序列(s)和擴(kuò)增序列(x')。因為切口處的序列(x')的3'-oh作為后續(xù)的鏈置換復(fù)制的起始位點,所以寡核苷酸(s)通過在反應(yīng)混合物中繼續(xù)復(fù)制和擴(kuò)增信號dna(s)的dna聚合酶從scdna中置換寡核苷酸(s)。如圖2b中進(jìn)一步所示,由信號擴(kuò)增dna(或sadna)的存在可以進(jìn)一步擴(kuò)增由信號dna(s)的產(chǎn)生導(dǎo)致的信號。簡言之,存在于反應(yīng)中的信號dna(s)與引發(fā)或起始復(fù)制的sadna的序列(f)雜交(通過反應(yīng)混合物中存在的dna聚合酶),從而產(chǎn)生雙鏈擴(kuò)增序列(y),其包括雙鏈核酸內(nèi)切酶識別位點(e)。新產(chǎn)生的雙鏈核酸內(nèi)切酶識別位點(e)(通過反應(yīng)混合物中存在的核酸內(nèi)切酶)的識別和新產(chǎn)生的鏈(通過反應(yīng)混合物中存在的核酸內(nèi)切酶)隨后的切割產(chǎn)生寡核苷酸信號序列(s)和擴(kuò)增序列(y')。因為切口處的序列(y')的3'-oh作為后續(xù)的鏈置換復(fù)制的起始位點,所以寡核苷酸(s)通過在反應(yīng)混合物中繼續(xù)復(fù)制和擴(kuò)增信號dna(s)的dna聚合酶從sadna中置換寡核苷酸(s)。根據(jù)本發(fā)明的方法可用于檢測樣品中的靶核酸。特別地,本發(fā)明的方法可用于檢測樣品中的靶rna。如下所示,在核酸內(nèi)切酶識別位點(b)和與靶核酸的3'末端互補(bǔ)的序列(c)之間的多dna間隔(pds)序列的scdna中的存在增強(qiáng)了信號dna(s)的產(chǎn)生。如下文所示,pds的存在增加了核酸內(nèi)切酶切割核酸內(nèi)切酶識別位點(b)的速率。根據(jù)本發(fā)明的方法可以在等溫或基本上恒定的溫度條件下進(jìn)行。在涉及在基本上恒定的溫度下進(jìn)行該方法的實施方式中,允許溫度的一些波動。例如,在一些實施方式中,基本上恒定的溫度可以在期望的或識別的目標(biāo)溫度范圍(例如約+/-2℃或約+/-5℃)內(nèi)波動。在實施方式中,基本上恒定的溫度可以包括不包括熱循環(huán)的溫度。在一些實施方式中,該方法可以在等溫或基本上恒定的溫度下進(jìn)行,例如(1)等于或低于與scdna的序列(c)結(jié)合的靶核酸(t)的計算/預(yù)測或?qū)嶒炆洗_定的最佳雜交或退火溫度的溫度;(2)等于或低于與scdna結(jié)合的靶核酸(t)的解鏈溫度(通常雜交或退火溫度略低于解鏈溫度)的溫度;(3)低于與sadna結(jié)合的信號dna(s)的解鏈溫度的溫度;或(4)處于或約為反應(yīng)混合物中存在的聚合酶和/或核酸內(nèi)切酶的計算/預(yù)測或?qū)嶒炆洗_定的最佳反應(yīng)溫度的溫度。該方法可以包括約20℃至約70℃的反應(yīng)溫度,包括落在約20℃至約42℃范圍內(nèi)的較低溫度。在一些實施方式中,反應(yīng)溫度范圍為35℃至40℃(例如35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃)。在其它實施方式中,反應(yīng)溫度低于65℃,包括低于約55℃、約50℃、約45℃、約40℃或約30℃的較低溫度。在其它實施方式中,反應(yīng)溫度可為約20℃、約21℃、約22℃、約23℃、約24℃、約25℃、約26℃、約27℃、約28℃、約29℃、約30℃、約31℃、約32℃、約33℃、約34℃、約35℃、約36℃、約37℃、約38℃、約39℃、約40℃、約41℃、約42℃、約43℃、約44℃、約45℃、約46℃、約47℃、約49℃、約50℃、約51℃、約52℃、約53℃、約54℃、約55℃、約56℃、約57℃、約58℃、約59℃、約60℃、約61℃、約62℃、約63℃、約64℃、約65℃、約66℃、約67℃、約68℃、約69℃或約70℃。該方法可以進(jìn)行一定時間,使得足以允許在靶核酸存在下擴(kuò)增可檢測量的信號序列。在一些實施方式中,反應(yīng)時間可以為約5分鐘至16小時,或約3分鐘至16小時。在其它實施方式中,反應(yīng)時間可以為約5至120分鐘,或約15至60分鐘。在整個說明書中,寡核苷酸(s)也稱為信號dna(s)。因為信號dna僅在靶核酸(t)的存在下產(chǎn)生,所以根據(jù)本發(fā)明的方法通過檢測信號dna的存在或不存在來檢測樣品中靶核酸(t)的存在或不存在。信號dna(s)不受序列限制,可以是可檢測的任何序列。信號dna也不受長度限制。優(yōu)選地,信號dna可以是約5至約100個堿基,以及5至100之間的任何整數(shù)。在一些實施方式中,信號dna可以是約5至約30個核酸堿基,以及5和30之間的所有整數(shù)。在一些實施方式中,信號dna的長度可以為約10至約30個堿基,以及10至30之間的所有整數(shù)。在另外的實施方式中,信號dna的長度可以為約15至約30個堿基,以及15和30之間的所有整數(shù)。根據(jù)本發(fā)明的方法可以在包含約4至約10或約7至約9的ph范圍的緩沖條件下進(jìn)行。緩沖液可以包含約10mm至約500mm或約50mm至150mm的鹽濃度。在一些實施方式中,可以使用允許在靶核酸存在下擴(kuò)增可檢測量的信號序列的量的sc和/或sadna進(jìn)行該方法。在一些實施方式中,sc和/或sadna濃度可以為約100pm至約100μm、約1nm至約1μm、約5nm至約50nm或約5nm至約25nm。信號dna(s)的存在可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法檢測。例如,可以使用凝膠電泳和用溴化乙錠染色。此外,信號dna的存在可以使用熒光偏振、免疫測定、熒光共振能量轉(zhuǎn)移、酶標(biāo)記(例如過氧化物酶或堿性磷酸酶)、熒光標(biāo)記(例如熒光素或羅丹明)、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光、表面等離子體共振(spr)或熒光團(tuán)修飾的探針dna(例如taqman探針)來檢測。擴(kuò)增產(chǎn)物也可以通過使用例如用生物素標(biāo)記的標(biāo)記核苷酸來檢測。在這種情況下,例如可以使用熒光標(biāo)記的抗生物素蛋白或酶標(biāo)記的抗生物素蛋白來檢測擴(kuò)增產(chǎn)物中的生物素。也可以通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的氧化還原嵌入劑用電極檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。也可以使用表面等離子體共振(spr)、夸克晶體微量天平(qcm)或電化學(xué)方法(包括使用納米孔傳感器的那些方法)來檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明的方法檢測樣品中靶核酸(t)的存在或不存在。根據(jù)本發(fā)明的方法還可以用于定量測量測試樣品中靶核酸的濃度。例如,根據(jù)本發(fā)明的方法可以在靶核酸的不同已知濃度范圍的存在下進(jìn)行,然后可以如本領(lǐng)域通常實踐的那樣制備和使用校準(zhǔn)曲線。靶核酸(圖2中的(t))可以包含任何核酸序列,并且可以包括dna、rna、化學(xué)修飾的核酸、非天然核酸、核酸類似物或任何雜交體或其組合。因此,在一些實施方式中,dna可以包括cdna、基因組dna和合成的dna,并且rna可以包括總rna、mrna、rrna、sirna、hnrna、pirna、arna、mirna和合成的rna。雖然一些實施方式涉及特定靶核酸序列,但任何核酸序列(包括輔核酸序列)可以是待檢測的靶核酸序列。本發(fā)明提供了即使當(dāng)核酸是短鏈核酸時也具有選擇性和靈敏性的檢測靶核酸。因此,scdna的序列(c)與靶核酸(t)之間的互補(bǔ)度允許序列之間的特異性雜交(例如序列轉(zhuǎn)換dna的序列(c)和靶核酸(t)序列中互補(bǔ)核苷酸數(shù)避免了在給定組的反應(yīng)條件下的非特異性雜交)。在實施方式中,靶核酸序列可來自或衍生自任何數(shù)量的來源,包括例如基因組dna、表達(dá)mrna、來自病原體的核酸序列(微生物、病毒)或治療性核酸。因此,sc和sadna以及本文公開的方法可用于疾病(例如由遺傳和感染源產(chǎn)生)的診斷和預(yù)后,污染物(例如食源性疾病、設(shè)備污染)的鑒定和個體化用藥(例如治療的監(jiān)測和/或預(yù)后)等。例如,可以針對以下感染性疾病進(jìn)行分子診斷測試:乙型肝炎病毒(hbv);丙型肝炎(hcv);hcv(基因型1-6);人類免疫缺陷病毒1型(hiv-1);沙眼衣原體;淋病奈瑟氏球菌;甲型流感;乙型流感;呼吸道合胞病毒(rsv);和parvo病毒。在一些實施方式中,靶核酸可以包含微rna(mirna)。微rna包括約22個核苷酸的小型非編碼rna分子。已知微rna在基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中起作用。已知微rna通過與信使rna(mrna)的互補(bǔ)區(qū)域的堿基配對而起作用,通過翻譯抑制或靶標(biāo)降解導(dǎo)致基因沉默??梢园泻怂岬娜魏晤愋偷臉悠房捎糜诒疚墓_的方法中。因此,含有或懷疑含有靶核酸的樣品沒有特別限制,例如包括來自生命體的生物樣品,例如全血、血清、血沉棕黃層、尿液、糞便、腦脊髓液、精液、唾液、組織(例如癌組織或淋巴結(jié))、細(xì)胞培養(yǎng)物(例如哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)菌培養(yǎng)物);含有核酸的樣品,例如類病毒、病毒、細(xì)菌、真菌、酵母、植物和動物;可能含有或被微生物例如病毒或細(xì)菌感染的樣品(例如食品和生物制劑);以及可能含有生物物質(zhì)的樣品,例如土壤、工業(yè)過程和制造設(shè)備以及廢水;和來自各種水源(例如飲用水)的樣品。此外,可以通過任何已知方法處理樣品以制備本文公開的方法中使用的含有核酸的組合物。這種制劑的實例可以包括細(xì)胞破裂(例如細(xì)胞裂解物和提取物)、樣品餾分、樣品中的核酸和特異性核酸分子基團(tuán)例如富含mrna的樣品。用于檢測本發(fā)明的靶核酸的方法中的樣品不限于如上所述的衍生自生物和天然產(chǎn)物的樣品,并且可以是含有合成寡核苷酸的樣品。根據(jù)本發(fā)明的方法可以與abbottm2000sp樣品制備系統(tǒng)結(jié)合進(jìn)行。m2000sp使用磁粉技術(shù)捕獲核酸并洗滌顆粒以除去未結(jié)合的樣品組分。將結(jié)合的核酸洗脫并轉(zhuǎn)移到96深孔板中。abottm2000sp還可以將轉(zhuǎn)移到96深孔板的洗滌后的核酸與根據(jù)本技術(shù)進(jìn)行方法所需的任何試劑結(jié)合。例如,可以根據(jù)需要或期望添加sc和sadna、聚合酶、核酸內(nèi)切酶、分子信標(biāo)和任何其它試劑(例如dntp)。根據(jù)本發(fā)明的方法也可以與即時平臺接合。例如,將三磷酸脫氧核糖核苷酸(dntp)并入生長的dna鏈中涉及共價鍵的形成和焦磷酸鹽的釋放以及影響反應(yīng)ph的帶正電荷的氫離子。因此,根據(jù)本發(fā)明的方法的信號dna的合成可以通過使用例如即時微量ph計跟蹤ph的變化來檢測。例如,abotti-stat即時系統(tǒng)可以提供一次性的一次性藥筒,其中包含微型制造的傳感器、校準(zhǔn)溶液、流體系統(tǒng)和用于ph分析的廢物室。本文公開的方法可以包含另外的試劑??捎糜诤怂釘U(kuò)增反應(yīng)的其它試劑的一些非限制性實例包括金屬鹽例如氯化鈉、氯化鎂、乙酸鎂和硫酸鎂;底物例如dntp混合物;和緩沖液例如tris-hcl緩沖液、三氯緩沖液、磷酸鈉緩沖液和磷酸鉀緩沖液。同樣,洗滌劑、氧化劑和還原劑也可用于本文公開的方法的實踐中。此外,可以使用例如二甲基亞砜和甜菜堿(n,n,n-三甲基甘氨酸);國際公開號wo99/54455中描述的酸性物質(zhì);和陽離子絡(luò)合物的試劑。本文提供的方法和核酸結(jié)構(gòu)可以與其它方法組合使用,以在靶核酸存在下提供信號dna的指數(shù)擴(kuò)增。例如,根據(jù)本發(fā)明的方法和組合物可以與覆蓋序列轉(zhuǎn)換dna組合使用,如名稱為“覆蓋序列轉(zhuǎn)換dna和檢測方法”的美國臨時申請61/927710中所述,其通過引用并入本文。術(shù)語“約”通常是指本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)為等同于所引用的值(即具有相同的功能或結(jié)果)的數(shù)量范圍。如本文所用,術(shù)語“約”旨在表示大于或小于參考值的約10-20%的范圍。在某些情況下,本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到,由于參考值的性質(zhì),術(shù)語“約”可以意味著與該值的偏差大于或小于10-20%。以下實施例旨在說明上述方面和實施方式。上述公開和以下實施例都不應(yīng)視為限制所附權(quán)利要求的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解,本發(fā)明不受用于描述和示出本發(fā)明的各個方面的特定術(shù)語的限制。實施例1以下實施例證明位于scdna的內(nèi)切核酸酶識別位點(b)和序列(c)之間的pds序列的存在加速了信號dna的擴(kuò)增。使用scdna1:5'-agccctgtacaatgccctcagcctgttcctgctgaactgagcca-tamra-3'(序列號1),和在scdna的內(nèi)切核酸酶識別位點(b)和序列(c)之間具有不同pds序列的多個其它scdna進(jìn)行反應(yīng)。這些scdna包括:在37℃下在含有終濃度為10mmtris-hcl、50mmnacl、10mmmgcl2、1mmdtt、ph7.9的紐英倫生物技術(shù)(neb)緩沖液2的25μl反應(yīng)體積中進(jìn)行反應(yīng)。在反應(yīng)中使用的切口內(nèi)切核酸酶是nb.bbvci,其以0.1單位/μl的濃度存在。用于反應(yīng)的聚合酶是bstdna聚合酶大片段,其以0.08單位/μl的濃度存在。dntp的終濃度各為200μm。scdna以200nm的終濃度存在于反應(yīng)中。靶核酸是人微rna24-3p(序列號5),并且以1nm或100pm的濃度存在。以100nm的終濃度存在的分子信標(biāo)探針用于檢測信號dna的產(chǎn)生。使用bio-rad實時pcr系統(tǒng)cfx96進(jìn)行熒光測量,結(jié)果示于圖3中。如圖所示,位于scdna的內(nèi)切核酸酶識別位點(b)和序列(c)之間的pds序列存在加速了信號dna的擴(kuò)增。實施例2以下實施例證明位于scdna內(nèi)的內(nèi)切核酸酶識別位點(b)和與靶核酸互補(bǔ)的序列(c)之間的pds序列的存在加速了內(nèi)切核酸酶識別位點(b)的核酸內(nèi)切酶切割。使用以下scdna:5'-agccctgtacaatgccctcagcctgttcctgctgaactgagcca-idt-idt'(序列號6)進(jìn)行反應(yīng)。使用許多不同的靶核酸,其包括以下:核酸序列號序列dna#1875'tggctcagttcagcaggaacagrna#655'uggcucaguucagcaggaacagrna#785'uggcucaguucagcaggaarna#895'uggcucaguucagcag在37℃下在含有終濃度為10mmtris-hcl、50mmnacl、10mmmgcl2、1mmdtt、ph7.9的紐英倫生物技術(shù)(neb)緩沖液2的50μl反應(yīng)體積中進(jìn)行第一聚合反應(yīng)。用于反應(yīng)的聚合酶是bstdna聚合酶大片段,其以0.08單位/μl的濃度存在。dntp的終濃度各為200μm。序列轉(zhuǎn)換dna以200nm存在。靶核酸(dna#18、rna#6、7或8)以200nm存在。將聚合反應(yīng)在37℃下保溫10分鐘,然后在80℃溫育20分鐘,然后將反應(yīng)物移至4℃。然后將12.5μl上述聚合反應(yīng)轉(zhuǎn)移到內(nèi)切核酸酶反應(yīng)中。在37℃下在含有終濃度為10mmtris-hcl、50mmnacl、10mmmgcl2、1mmdtt、ph7.9的紐英倫生物技術(shù)(neb)緩沖液2的25μl反應(yīng)體積中進(jìn)行核酸內(nèi)切酶反應(yīng)。在反應(yīng)中使用的切口內(nèi)切核酸酶是nb.bbvci,其以0.1單位/μl的濃度存在。將反應(yīng)物在37℃下培養(yǎng)0和5分鐘。通過加入5μm的0.5medta終止反應(yīng),然后在95℃下培養(yǎng)。使用分子信標(biāo)探針檢測信號dna的產(chǎn)生,并在12%tbe-page上顯現(xiàn)反應(yīng)產(chǎn)物。(參見圖4(箭頭表示由nb.bbvci內(nèi)切核酸切割產(chǎn)生的小片段的位置))。如圖所示,當(dāng)使用rna#6時,不產(chǎn)生短片段,表明在scdna的內(nèi)切核酸酶識別位點(b)和與靶核酸互補(bǔ)的序列(c)中存在pds序列加速了核酸內(nèi)切酶識別位點(b)的核酸內(nèi)切酶切割。雖然已經(jīng)參考某些方面和實施方式描述了應(yīng)用,但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解,可以對本文提供的公開內(nèi)容進(jìn)行改變,并且可以替換等同,而不脫離本發(fā)明的范圍。因此,本申請不應(yīng)該限于所公開的特定方面和實施方式,而應(yīng)理解和意識為包括落在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)的所有方面和實施方式。對說明書的修改在第1頁在標(biāo)題之后,請插入以下段落:本申請要求于2014年10月14日提交的美國臨時申請62/063,666的優(yōu)先權(quán)以及于2014年12月30日提交的美國臨時申請62/098,066的優(yōu)先權(quán)。該美國臨時申請均通過引用將其其全部并入本文。序列表<110>kenkomiyamakotokomoritoruyoshimura<120>具有多dna間隔序列的序列轉(zhuǎn)換和信號擴(kuò)增dna及使用其的檢測方法<130>28298us01<160>9<170>patentin版本3.5<210>1<211>44<212>dna<213>人工序列<220><223>序列轉(zhuǎn)換dna(scdna1)<220><221>尚未歸類的特征<222>(44)..(44)<223>3'-末端修飾:tamra<400>1agccctgtacaatgccctcagcctgttcctgctgaactgagcca44<210>2<211>47<212>dna<213>人工序列<220><223>序列轉(zhuǎn)換dna(具有t3間隔的scdna)<220><221>尚未歸類的特征<222>(47)..(47)<223>3'-末端修飾:tamra<400>2agccctgtacaatgccctcagctttctgttcctgctgaactgagcca47<210>3<211>48<212>dna<213>人工序列<220><223>序列轉(zhuǎn)換dna(具有t4間隔的scdna)<220><221>尚未歸類的特征<223>3'-末端修飾:tamra<400>3agccctgtacaatgccctcagcttttctgttcctgctgaactgagcca48<210>4<211>49<212>dna<213>人工序列<220><223>序列轉(zhuǎn)換dna(具有t5間隔的scdna)<220><221>尚未歸類的特征<222>(49)..(49)<223>3'-末端修飾:tamra<400>4agccctgtacaatgccctcagctttttctgttcctgctgaactgagcca49<210>5<211>22<212>rna<213>人工序列<220><223>人微rna24-3p<400>5uggcucaguucagcaggaacag22<210>6<211>44<212>dna<213>人工序列<220><223>序列轉(zhuǎn)換dna<220><221>尚未歸類的特征<223>3'-末端修飾:兩個倒置的胸腺嘧啶<400>6agccctgtacaatgccctcagcctgttcctgctgaactgagcca44<210>7<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>用于人微rna24-3p的dna序列<400>7tggctcagttcagcaggaacag22<210>8<211>19<212>rna<213>人工序列<220><223>人微rna24-3p<400>8uggcucaguucagcaggaa19<210>9<211>16<212>rna<213>人工序列<220><223>人微rna24-3p<400>9uggcucaguucagcag16當(dāng)前第1頁12