本發(fā)明涉及用于選擇靶核酸序列的方法。具體地，本發(fā)明涉及利用特定核酸探針來(lái)選擇靶核酸分子中的靶目標(biāo)區(qū)域(targetregionofinterest，roi)的方法，該核酸探針包含能夠雜交至靶核酸分子并且作為引物以用于產(chǎn)生該靶roi(即，通過(guò)引物的靶模板化延伸)的互補(bǔ)序列的3’序列，以及能夠模板化該延伸的探針的環(huán)化和連接的序列，該延伸的探針包含靶roi的反向互補(bǔ)序列和該探針的一部分。因此獲得的該環(huán)化的分子含有靶roi的反向互補(bǔ)序列并且可經(jīng)歷進(jìn)一步分析和/或擴(kuò)增等。因此，本發(fā)明的選擇方法提供了不僅用于選擇性分離或分開所需的靶序列(roi)，而且還用于檢測(cè)靶核酸序列(roi)或用于擴(kuò)增靶序列(roi)的方法。
背景技術(shù)：
：存在描述用于選擇并隨后擴(kuò)增核酸的所選部分的若干方法。實(shí)例包括所謂的選擇子探針(us7883849，或在drmanac等人2010.science,327,78-81和us8518640中所描述的基因組片段的一般環(huán)化)。us7883849中所描述的選擇子探針被設(shè)計(jì)用于以序列特異性方式結(jié)合至所需靶序列，從而使得其能夠從核酸分子中或者實(shí)際上從含有核酸分子的樣品中被“選擇”出來(lái)。在us7883849的方法中，部分雙鏈選擇子探針(單個(gè)對(duì)稱分子，在其兩端均具有較長(zhǎng)的鏈懸突(overhang)，或兩個(gè)對(duì)稱分子，各自僅在一端具有單鏈懸突)以靶特異性方式通過(guò)其單鏈懸突而雜交至由于核酸樣品片段化產(chǎn)生的單鏈(變性的)靶片段的兩端。在使用對(duì)稱選擇子探針的該方法的一個(gè)特定實(shí)施方式中，僅靶片段的一端雜交至選擇子探針的一端，選擇子探針的另一端與靶核酸片段內(nèi)部雜交并且需要結(jié)構(gòu)特異性核酸內(nèi)切酶通過(guò)切掉突出超過(guò)內(nèi)部雜交區(qū)域的靶片段的部分來(lái)拆分(resolve)所得的結(jié)構(gòu)。因此，在所有的情形中，靶片段的所選部分都是通過(guò)(多個(gè))選擇子探針被設(shè)計(jì)為與之雜交的已知序列的區(qū)域(不論是末端區(qū)域，或者是一端和一個(gè)內(nèi)部區(qū)域)來(lái)描繪的。在雜交之后(以及，在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候，二級(jí)結(jié)構(gòu)的拆分)，(多個(gè))選擇子和靶核酸片段都是通過(guò)連接而結(jié)合，從而(i)在對(duì)稱選擇子探針的情形中，得到環(huán)狀核酸分子以及(ii)在兩個(gè)對(duì)稱選擇子的情形中，得到位于選擇子探針序列側(cè)翼(flank)的包含靶片段的線性分子。(多個(gè))選擇子探針的雙鏈區(qū)域含有引物對(duì)基序，其是多重檢測(cè)中使用的多個(gè)不同靶特異性選擇子共有的。因此，能夠同時(shí)實(shí)現(xiàn)多個(gè)靶片段的擴(kuò)增，同時(shí)避免由于使用多種不同引物對(duì)帶來(lái)的擴(kuò)增假象。在us7883849的選擇方法中確認(rèn)的一個(gè)特別問(wèn)題是需要在選擇之前仔細(xì)選擇用于消化靶核酸分子的限制酶，從而避免選擇能夠在待查詢(interrogate)的靶序列中切割靶核酸分子的酶。這在根據(jù)該方法可能的復(fù)用的程度上設(shè)置了限制，并且能夠?qū)е逻^(guò)長(zhǎng)的核酸片段的擴(kuò)增，從而增加分析所選靶核酸的成本。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：與現(xiàn)有技術(shù)所公開的方法相反，本發(fā)明并不需要在選擇之前進(jìn)行樣品核酸的預(yù)先切割(但并不排除)，并且尤其是不需要以在靶分子中產(chǎn)生探針的特異性結(jié)合位點(diǎn)的方式進(jìn)行切割。而是，本發(fā)明涉及產(chǎn)生單鏈靶核酸分子(通過(guò)探針的靶模板化延伸)的特定區(qū)域的互補(bǔ)序列，以及隨后切割該探針并且可選地切割靶，使所得的靶核酸分子的互補(bǔ)序列的環(huán)化模板化。因此，本發(fā)明可被看作是最低程度地需要準(zhǔn)確選擇所使用的限制酶，在一些實(shí)施方式中，避免了準(zhǔn)確選擇所使用的限制酶的需要。因此，本發(fā)明提供了用于選擇靶核酸分子的改進(jìn)方法，并且允許更準(zhǔn)確地選擇待查詢或待分析的序列，例如，通過(guò)測(cè)序，而不需要在其末端含有特異性探針結(jié)合位點(diǎn)的靶核酸分子。因此，本發(fā)明提供了一種用于選擇所需或靶核酸序列的新型探針，其提供了產(chǎn)生含有靶序列(更具體地，靶序列的互補(bǔ)序列)的環(huán)狀分子的新方式。環(huán)狀分子可容易地被分離和處理(例如，通過(guò)利用核酸外切酶來(lái)消化任意線性非環(huán)化核酸分子)并且也可以利用滾環(huán)擴(kuò)增(rca)或其它擴(kuò)增程序容易地被擴(kuò)增和/或檢測(cè)。因此，其是一種提供用于進(jìn)一步處理或加工或者分析或檢測(cè)等的所選靶序列的非常方便的方式。用于本發(fā)明的新型探針是單鏈核酸分子(即，寡核苷酸)，其能夠形成在3’末端具有單鏈區(qū)域的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。因此，該探針包括第一靶結(jié)合位點(diǎn)和莖環(huán)結(jié)構(gòu)，第一靶結(jié)合位點(diǎn)在其能夠雜交至位于roi的3’末端的側(cè)翼的靶分子的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)的3’末端，莖環(huán)結(jié)構(gòu)包含第二結(jié)合位點(diǎn)，其與所述roi的5’末端側(cè)翼的旁側(cè)序列同源并且能夠雜交至所述5’旁側(cè)序列的互補(bǔ)序列，并且在該莖環(huán)結(jié)構(gòu)中還包含位于所述第二結(jié)合位點(diǎn)的3’方向的切割位點(diǎn)，以使切割能夠打開環(huán)(例如，莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖或環(huán)中的切割位點(diǎn))。第一靶結(jié)合位點(diǎn)用來(lái)通過(guò)探針的靶模板化延伸來(lái)產(chǎn)生靶roi的互補(bǔ)序列。一旦莖環(huán)結(jié)構(gòu)已通過(guò)切割被打開，第二結(jié)合位點(diǎn)便用作延伸的探針的環(huán)化模板。序列元件(或間隔序列或元件)可位于第一靶結(jié)合位點(diǎn)和莖環(huán)結(jié)構(gòu)之間，在莖環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)(例如，在環(huán)的5’末端處)中，或莖環(huán)結(jié)構(gòu)的5’方向，以使得各種下游應(yīng)用能夠進(jìn)行或便于各種下游應(yīng)用，例如，作為標(biāo)簽的元件或者檢測(cè)或鑒定序列或者用于靶序列/roi的捕獲(例如固定化)或擴(kuò)增的序列，例如，檢測(cè)或id標(biāo)簽或基序(例如，條形碼等)，檢測(cè)探針或引物或者擴(kuò)增引物的結(jié)合位點(diǎn)，或能夠結(jié)合至互補(bǔ)序列或同源結(jié)合伴侶的捕獲(或“錨定”)序列，例如，在固體支持物上提供的。這樣的元件(或標(biāo)簽)也可以存在于莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖序列中，并且因此當(dāng)其被環(huán)化時(shí)將被結(jié)合到核酸中(例如，當(dāng)該元件或標(biāo)簽在莖環(huán)結(jié)構(gòu)中的切割位點(diǎn)的3’方向時(shí))。在探針延伸以產(chǎn)生包含roi的靶互補(bǔ)序列之后，將靶分子除去，以留下延伸的探針。盡管這可以以多種方式進(jìn)行，但探針/靶雜交體可被方便地變性?？梢?jiàn)，在這樣的實(shí)施方式中，當(dāng)探針經(jīng)歷結(jié)合于靶分子、靶分子的延伸和去除的步驟時(shí)，莖環(huán)結(jié)構(gòu)用來(lái)將探針的各特定區(qū)域(尤其是環(huán)中的第二結(jié)合位點(diǎn))結(jié)合在一起。然而，在其它實(shí)施方式中，可以以其它方式除去靶分子，例如通過(guò)酶消化(例如，利用核糖核酸酶來(lái)除去rna靶分子)并且在這樣的實(shí)施方式中，莖環(huán)結(jié)構(gòu)并不是必需的并且該探針可在與靶分子接觸之前被切割或者可替代地其可作為部分雙鏈構(gòu)建體提供。在這樣的實(shí)施方式中，可以以不涉及變性的方式，并且尤其是不涉及探針變性的方式，除去靶分子。因此，探針的第二鏈上存在的第二結(jié)合位點(diǎn)可保留在探針中。本發(fā)明的方法允許使用單鏈靶分子和靶片段，而不需要知道靶的末端序列。然而，同時(shí)避免需要?jiǎng)?chuàng)建具有靶特異性末端的片段，并且該方法不需要片段化步驟，在該方法中包括片段化步驟可以是方便的和合乎需要的。本發(fā)明以下討論的內(nèi)容將證明靶分子的互補(bǔ)序列在該方法中和本發(fā)明的探針中被環(huán)化。因此，當(dāng)提及環(huán)化的靶序列或靶roi等時(shí)，在本發(fā)明的上下文中將理解其意指靶序列或靶roi的互補(bǔ)序列。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本文所討論的上下文將理解，當(dāng)提及靶序列或靶roi的檢測(cè)、分析等時(shí)，包括其互補(bǔ)序列的檢測(cè)、分析等，其中檢測(cè)探針可需要雜交至靶序列的互補(bǔ)序列(例如，當(dāng)直接分析被捕獲或選擇的靶片段時(shí))或雜交至“原始”靶序列(例如，當(dāng)被捕獲或選擇的靶序列已被擴(kuò)增，例如通過(guò)rca，以使得該擴(kuò)增產(chǎn)物含有所捕獲的互補(bǔ)序列的互補(bǔ)序列時(shí))。由于雙鏈核酸分子是反式平行的，因此當(dāng)取向?yàn)?’至3’時(shí)，互補(bǔ)序列可以是指反向互補(bǔ)序列并且這些術(shù)語(yǔ)在本文中可互換使用。因此，本發(fā)明最寬泛地提供了在靶核酸分子中選擇靶目標(biāo)區(qū)域(roi)的方法，在靶分子中所述roi的側(cè)翼具有3’旁側(cè)序列和5’旁側(cè)序列，所述方法包括：(a)提供探針，該探針包含：(i)第一靶結(jié)合位點(diǎn)，位于所述探針的3’末端區(qū)域處，該結(jié)合位點(diǎn)能夠雜交至靶分子中的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，所述互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)是該roi的3’末端側(cè)翼的3’旁側(cè)序列，并且其能夠在靶-模板化延伸反應(yīng)中被延伸以產(chǎn)生靶分子的互補(bǔ)序列，所述靶互補(bǔ)序列包含所述3’旁側(cè)序列以及至少roi和5’旁側(cè)序列的互補(bǔ)序列；和(ii)第二結(jié)合位點(diǎn)，其與roi的5’末端的5’旁側(cè)序列同源，并且能夠雜交至所述靶互補(bǔ)序列中的所述5’旁側(cè)序列的互補(bǔ)序列；其中所述探針作為寡核苷酸提供，所述寡核苷酸包含莖環(huán)結(jié)構(gòu)，其在在該結(jié)構(gòu)的環(huán)中包含第二結(jié)合位點(diǎn)，并且進(jìn)一步包含位于所述第二結(jié)合位點(diǎn)的3’方向的切割位點(diǎn)，該切割位點(diǎn)可切割以打開所述環(huán)，從而使第二結(jié)合位點(diǎn)能用于結(jié)合，所述寡核苷酸還在3’末端包含單鏈區(qū)域，該單鏈區(qū)域包括第一結(jié)合位點(diǎn)；或其中所述探針作為部分雙鏈的構(gòu)建體提供，所述構(gòu)建體包含第一鏈和第二鏈，所述第一鏈包含在其3’末端包括第一結(jié)合位點(diǎn)的單鏈3’末端區(qū)域，且所述第二鏈在所述第一鏈的5’末端雜交并且包含包括第二結(jié)合位點(diǎn)的單鏈3’末端區(qū)域；(b)使探針與靶分子接觸，并且使得位于探針的3’末端處的第一靶結(jié)合位點(diǎn)雜交至靶分子中的其互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，其中靶分子至少部分是單鏈的，且在該單鏈區(qū)域中包括所述互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)和可選地roi和5’旁側(cè)序列；(c)利用靶分子作為延伸模板來(lái)延伸探針的雜交的3’末端，以產(chǎn)生靶分子的互補(bǔ)序列；(d)除去靶分子，留下延伸的探針，所述延伸的探針在所延伸的區(qū)域中從3'至5'包括該靶分子的5'旁側(cè)序列、roi和3'旁側(cè)序列的互補(bǔ)序列，其中第二結(jié)合位點(diǎn)保留在探針中；(e)允許延伸的探針經(jīng)歷分子內(nèi)重排，從而使第二結(jié)合位點(diǎn)雜交至靶互補(bǔ)序列中的其互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，該靶互補(bǔ)序列是靶分子的5'旁側(cè)序列的互補(bǔ)序列，其中，如果所述探針包含莖環(huán)結(jié)構(gòu)，則重排包含在探針的莖環(huán)結(jié)構(gòu)中的切割位點(diǎn)處切割延伸的探針，以釋放包含第二結(jié)合位點(diǎn)的探針的3'末端，從而產(chǎn)生包含第一延伸鏈和第二鏈的部分雙鏈的構(gòu)建體，所述第一延伸鏈包含靶互補(bǔ)序列，并且所述第二鏈雜交至在該莖中的第一鏈并且包含釋放的3’末端，所述釋放的3’末端隨后能夠雜交至第一鏈中的其互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，并且其中，如果所述5’旁側(cè)序列位于靶分子的5’末端的內(nèi)部并且第一延伸鏈的靶互補(bǔ)序列含有5’旁側(cè)序列的互補(bǔ)序列的3’方向的另外的序列，則重排包含該另外的序列中的切割或該另外的序列的切割，以釋放包含第二結(jié)合位點(diǎn)的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)的第一鏈的3’末端，以使可選地釋放的第一延伸鏈的5’末端與可選地釋放的第一延伸鏈的3’末端并置，以用于利用第二結(jié)合位點(diǎn)作為連接模板直接或間接地彼此連接；(f)將探針的延伸鏈的末端直接或間接地彼此連接，以使探針的延伸鏈環(huán)化；(g)擴(kuò)增或分離環(huán)化的延伸鏈，從而選擇roi。然而，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，探針作為包含莖環(huán)結(jié)構(gòu)的寡核苷酸提供。因此，在第一個(gè)特定方面中，本發(fā)明提供了在靶核酸分子中選擇靶目標(biāo)區(qū)域(roi)的方法，所述方法包括：(a)提供探針，所述探針包含莖環(huán)結(jié)構(gòu)和在3’末端的單鏈區(qū)域，其中所述3’末端區(qū)域包含能夠雜交至靶分子的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)的第一靶結(jié)合位點(diǎn)，所述互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)是roi的3’末端側(cè)翼的旁側(cè)序列，并且所述環(huán)包含與roi的5’末端側(cè)翼的旁側(cè)序列同源并且能夠雜交至所述5’旁側(cè)序列的互補(bǔ)序列的第二結(jié)合位點(diǎn)，并且其中所述莖環(huán)結(jié)構(gòu)進(jìn)一步包含位于所述第二結(jié)合位點(diǎn)的3’方向的切割位點(diǎn)，使得該切割能夠打開環(huán)；(b)使探針與靶分子接觸并使探針的3’末端處的第一靶結(jié)合位點(diǎn)雜交至靶分子中的其互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，其中該靶分子至少部分是單鏈的，且在該單鏈區(qū)域中包括該互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)和可選地roi和5’旁側(cè)序列；(c)利用靶分子作為延伸模板來(lái)延伸探針的雜交的3’末端，以產(chǎn)生靶分子的互補(bǔ)序列；(d)除去靶分子，留下延伸的探針，所述延伸的探針在所延伸的區(qū)域中從3'至5'包括靶分子的5'旁側(cè)序列、roi和3'旁側(cè)序列的互補(bǔ)序列；(e)允許延伸的探針經(jīng)歷分子內(nèi)重排，從而第二結(jié)合位點(diǎn)能夠雜交至靶互補(bǔ)序列中的其互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，其為靶分子的5'旁側(cè)序列的互補(bǔ)序列，其中重排包含至少在探針的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的切割位點(diǎn)處切割延伸的探針，以釋放包含第二結(jié)合位點(diǎn)的探針的3'末端，從而產(chǎn)生包含第一延伸鏈和第二鏈的部分雙鏈的構(gòu)建體，所述第一延伸鏈包含靶互補(bǔ)序列，并且所述第二鏈雜交至該莖中第一鏈并且包含釋放的3’末端，所述釋放的3’末端隨后能夠雜交至第一鏈中的其互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，并且如果所述5’旁側(cè)序列位于靶分子的5’末端的內(nèi)部并且第一延伸鏈的靶互補(bǔ)序列含有5’旁側(cè)序列的互補(bǔ)序列的另外的3’，則還有該另外的序列中的第二切割或該另外的序列的第二切割，以釋放包含第二結(jié)合位點(diǎn)的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)的第一鏈的3’末端，以使釋放的第一延伸鏈的5’末端與可選地釋放的第一延伸鏈的3’末端并置，以用于利用第二結(jié)合位點(diǎn)作為連接模板直接或間接地彼此連接；(f)將探針的延伸鏈的末端直接或間接地彼此連接，以使探針的延伸鏈環(huán)化；(g)擴(kuò)增或分離該環(huán)化的延伸鏈，從而選擇roi。在又一方面，提供了探針用于本發(fā)明的方法中。更具體地，在這一方面中，本發(fā)明提供了用于選擇靶核酸分子中的靶roi的寡核苷酸探針，所述探針包含莖環(huán)結(jié)構(gòu)和在3’末端的單鏈區(qū)域，其中所述3’末端區(qū)域包含第一靶結(jié)合位點(diǎn)，該第一靶結(jié)合位點(diǎn)能夠雜交至靶分子中的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，所述互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)是roi的3’末端側(cè)翼的旁側(cè)序列，并且所述環(huán)包含與roi的5’末端側(cè)翼的旁側(cè)序列同源的并且能夠雜交至所述5’旁側(cè)序列的互補(bǔ)序列的第二結(jié)合位點(diǎn)，并且其中所述莖環(huán)結(jié)構(gòu)進(jìn)一步包含位于所述第二結(jié)合位點(diǎn)的3’方向的切割位點(diǎn)，以使得切割能夠打開環(huán)。在替代的實(shí)施方式中，探針作為部分雙鏈構(gòu)建體提供。因此，在第二個(gè)特定方面中，本發(fā)明提供了在靶核酸分子中選擇靶目標(biāo)區(qū)域(roi)的方法，所述方法包括：(a)提供探針，其為具有第一鏈和第二鏈的部分雙鏈的構(gòu)建體，該第一鏈包含單鏈3’末端區(qū)域，該單鏈3’末端區(qū)域在其3’末端處包含第一靶結(jié)合位點(diǎn)，其中所述第一靶結(jié)合位點(diǎn)能夠雜交至靶分子中的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，所述互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)是roi的3’末端側(cè)翼的旁側(cè)序列，第二鏈在其5’末端處雜交至所述第一鏈，并且包含包括第二結(jié)合位點(diǎn)的單鏈3’末端區(qū)域，其中第二結(jié)合位點(diǎn)與roi的5’末端側(cè)翼的旁側(cè)序列同源并且能夠雜交至所述5’旁側(cè)序列的互補(bǔ)序列；(b)使探針與靶分子接觸，并且使得位于探針的第一鏈的3’末端處的第一靶結(jié)合位點(diǎn)雜交至靶分子中的其互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，其中靶分子至少部分是單鏈的，且在該單鏈區(qū)域中包括該互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)和可選地roi和5’旁側(cè)序列；(c)利用靶分子作為延伸模板來(lái)延伸探針的第一鏈的雜交的3’末端，以產(chǎn)生靶分子的互補(bǔ)序列；(d)除去靶分子而不使探針變性，留下延伸的探針，所述延伸的探針在所延伸的區(qū)域中從3'至5'包括靶分子的5'旁側(cè)序列、roi和3'旁側(cè)序列的互補(bǔ)序列，(e)允許延伸的探針經(jīng)歷分子內(nèi)重排，從而使第二鏈中的第二結(jié)合位點(diǎn)能夠雜交至延伸的第一鏈中的靶互補(bǔ)序列中的其互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，該靶互補(bǔ)序列是靶分子的5'旁側(cè)序列的互補(bǔ)序列，其中，如果所述5’旁側(cè)序列位于靶分子的5’末端的內(nèi)部并且第一延伸鏈中的靶互補(bǔ)序列含有位于所述5’旁側(cè)序列的互補(bǔ)序列的3’方向的另外的序列，則重排包含該另外的序列中的切割或該另外的序列切割，以釋放包含第二結(jié)合位點(diǎn)的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)的第一鏈的3’末端，以使第一延伸鏈的5'末端與可選地釋放的第一延伸鏈的3’末端并置，以用于利用第二結(jié)合位點(diǎn)作為連接模板直接或間接地彼此連接；(f)將探針的延伸鏈的末端直接或間接地彼此連接，以使探針的延伸鏈環(huán)化；(g)擴(kuò)增或分離環(huán)化的延伸鏈，從而選擇roi。在又一方面，提供了探針用于本發(fā)明的方法中。更具體地，在這一方面中，本發(fā)明提供了用于選擇靶核酸分子中的靶roi的寡核苷酸探針，所述探針是具有第一鏈和第二鏈的部分雙鏈構(gòu)建體，該第一鏈包含單鏈3’末端區(qū)域，該單鏈3’末端區(qū)域在其3’末端處包含第一靶結(jié)合位點(diǎn)，其中所述第一靶結(jié)合位點(diǎn)能夠雜交至靶分子中的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，所述互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)是roi的3’末端側(cè)翼的旁側(cè)序列，該第二鏈在其5’末端處雜交至所述第一鏈并且包含包括第二結(jié)合位點(diǎn)的單鏈3’末端區(qū)域，其中第二結(jié)合位點(diǎn)與roi的5’末端側(cè)翼的旁側(cè)序列同源并且能夠雜交至所述5’旁側(cè)序列的互補(bǔ)序列。從上文中應(yīng)理解，該探針不需要包含能夠雜交至roi或其互補(bǔ)序列的序列，即，第一靶結(jié)合位點(diǎn)包含能夠雜交至位于roi的3’側(cè)翼的序列的序列。然而，在一些實(shí)施方式中，第一靶結(jié)合位點(diǎn)也可含有能夠雜交至roi的3’末端的一部分的序列。然而，在其它的實(shí)施方式中，該探針(部分雙鏈的探針或莖環(huán)探針)也可含有互補(bǔ)于(或能夠雜交至)roi的互補(bǔ)序列的序列(即，同源于roi)，或其一部分，該序列能夠在探針延伸之后雜交至roi的互補(bǔ)序列。所述序列可與roi同源，或者可與roi的一部分(即5’部分)同源。所述序列可在探針中形成第二結(jié)合位點(diǎn)的一部分(或者可以形成第二結(jié)合位點(diǎn))，并因此可在延伸和分子步驟之后作為環(huán)化延伸的探針的模板。根據(jù)本發(fā)明的特定實(shí)施方式，與roi互補(bǔ)的序列可被視為形成全部第二結(jié)合位點(diǎn)或第二結(jié)合位點(diǎn)的一部分(部分雙鏈的探針或莖環(huán)探針)。在另一實(shí)施方式中，該探針可進(jìn)一步包含另外的探針序列，其位于第二結(jié)合位點(diǎn)的3’方向，該序列與3’旁側(cè)序列同源(在靶核酸分子中)并且因此與探針中的第一結(jié)合位點(diǎn)互補(bǔ)，其中當(dāng)所述探針包含莖環(huán)結(jié)構(gòu)時(shí)，所述另外的探針序列位于所述環(huán)中，或當(dāng)所述探針為雙鏈構(gòu)建體時(shí)，該另外的探針序列位于第二鏈的3’末端處。在這樣的實(shí)施方式中，該另外的探針序列可雜交至第一結(jié)合位點(diǎn)并且與第二結(jié)合位點(diǎn)一同起到連接模板的作用。圖13描繪了這樣的布置。因此，以替代方式觀察本發(fā)明的這些實(shí)施方式，在可替代的方面，靶核酸分子可以可替代地被定義為包含目標(biāo)區(qū)域和3’旁側(cè)區(qū)，其中探針被設(shè)計(jì)為雜交至目標(biāo)區(qū)域的5’末端(或目標(biāo)區(qū)域)的互補(bǔ)序列。根據(jù)上述討論，可看出roi本身，或者更有具體地其5’末端起到5’旁側(cè)區(qū)的功能或包含5’旁側(cè)區(qū)。在第三個(gè)特定方面中，本發(fā)明因此提供了在靶核酸分子中選擇靶目標(biāo)區(qū)域(roi)的方法，所述方法包括：(a)提供探針，所述探針包含：(i)第一靶結(jié)合位點(diǎn)，位于所述探針的3’末端區(qū)域處，該結(jié)合位點(diǎn)能夠雜交至靶分子中的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，所述互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)是roi的3’末端側(cè)翼的3’旁側(cè)序列，并且其能夠在靶-模板化延伸反應(yīng)中被延伸以產(chǎn)生靶分子的互補(bǔ)序列，所述靶互補(bǔ)序列包含所述3’旁側(cè)序列和roi的互補(bǔ)序列；和(ii)第二結(jié)合位點(diǎn)，其與roi同源，或與其5’末端同源，并且能夠雜交至所述靶互補(bǔ)序列中的roi或其5’末端的互補(bǔ)序列；(iii)另外的探針序列，其位于第二結(jié)合位點(diǎn)的3’，其與3’旁側(cè)序列同源并且與第一結(jié)合位點(diǎn)互補(bǔ)；其中所述探針作為寡核苷酸提供，所述寡核苷酸包含莖環(huán)結(jié)構(gòu)，其在該結(jié)構(gòu)的環(huán)中包含第二結(jié)合位點(diǎn)以及該另外的探針序列，并且在第二結(jié)合位點(diǎn)以及該另外的探針序列的3’方向進(jìn)一步包含切割位點(diǎn)，該切割位點(diǎn)可切割以打開所述環(huán)，從而使第二結(jié)合位點(diǎn)和另外的探針序列可用于結(jié)合，所述寡核苷酸還在3’末端包含單鏈區(qū)域，該單鏈區(qū)域包括第一結(jié)合位點(diǎn)；或其中所述探針作為部分雙鏈的構(gòu)建體提供，該構(gòu)建體包含第一鏈和第二鏈，第一鏈包含在其3’末端包括該第一結(jié)合位點(diǎn)的單鏈3’末端區(qū)域，且第二鏈在所述第一鏈的5’末端雜交，并且包含單鏈3’末端區(qū)域，其在該單鏈區(qū)域的3’末端包括第二結(jié)合位點(diǎn)和該另外的探針序列；(b)使探針與靶分子接觸，并且使得位于探針的3’末端處的第一靶結(jié)合位點(diǎn)雜交至靶分子中的其互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，其中該靶分子至少部分是單鏈的，且在該單鏈區(qū)域中包括該互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)和可選地roi；(c)利用靶分子作為延伸模板來(lái)延伸探針的雜交的3’末端，以產(chǎn)生靶分子的互補(bǔ)序列；(d)除去靶分子，留下延伸的探針，所述延伸的探針在所延伸的區(qū)域中從3'至5'包括該靶分子的roi以及3'旁側(cè)序列的互補(bǔ)序列，其中第二結(jié)合位點(diǎn)保留在探針中；(e)允許延伸的探針經(jīng)歷分子內(nèi)重排，從而使第二結(jié)合位點(diǎn)雜交至靶互補(bǔ)序列中的其互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，該靶互補(bǔ)序列是roi互補(bǔ)序列或roi的5'末端的互補(bǔ)序列，并且該另外的探針序列雜交至第一結(jié)合位點(diǎn)，其中，如果所述探針包含莖環(huán)結(jié)構(gòu)，則重排包含在探針的莖環(huán)結(jié)構(gòu)中的切割位點(diǎn)處切割延伸的探針，以釋放包含第二結(jié)合位點(diǎn)和該另外的探針序列的探針的3'末端，從而產(chǎn)生包含第一延伸鏈和第二鏈的部分雙鏈的構(gòu)建體，第一延伸鏈包含靶互補(bǔ)序列和釋放的5’末端，并且第二鏈雜交至該莖中的第一鏈并且包含釋放的3’末端，該釋放的3’末端隨后能夠雜交至第一鏈中的其互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，并且其中，如果所述roi位于靶分子的5’末端內(nèi)部并且第一延伸鏈中的靶互補(bǔ)序列含有roi的3’方向的另外的序列，則重排包含該另外的序列中的切割或該另外的序列的切割以釋放第一鏈的3’末端，該第一鏈的3’末端包含第二結(jié)合位點(diǎn)的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，以使可選地釋放的第一延伸鏈的5’末端與可選地釋放的第一延伸鏈的3’末端并置，以用于利用第二結(jié)合位點(diǎn)和該另外的探針序列作為連接模板直接或間接地彼此連接；(f)將探針的延伸鏈的末端直接或間接地彼此連接，以使探針的延伸鏈環(huán)化；(g)擴(kuò)增或分離該環(huán)化的延伸鏈，從而選擇roi?？蓞⒁?jiàn)圖13中描繪了這種方法。在更具體的實(shí)施方式中，該方法包括：(a)提供探針，所述探針是具有第一鏈和第二鏈的部分雙鏈構(gòu)建體，第一鏈包含在其3’末端包含第一靶結(jié)合位點(diǎn)的單鏈3’末端區(qū)域，其中所述第一靶結(jié)合位點(diǎn)能夠雜交至靶分子中的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，所述互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)是roi的3’末端側(cè)翼的旁側(cè)序列，并且第二鏈在其5’末端雜交至所述第一鏈并且包含單鏈3’末端區(qū)域，該單鏈3’末端區(qū)域包含第二結(jié)合位點(diǎn)和3’方向至第二結(jié)合位點(diǎn)以及在該單鏈區(qū)域的3’末端處的另外的探針序列，其中該第二結(jié)合位點(diǎn)與roi同源，或與其5’末端同源，并且能夠雜交至所述roi的互補(bǔ)序列或其5’末端的互補(bǔ)序列，并且所述另外的探針序列與3’旁側(cè)序列同源并且與第一結(jié)合位點(diǎn)互補(bǔ)；(b)使探針與靶分子接觸，并使得探針的第一鏈的3’末端處的第一靶結(jié)合位點(diǎn)雜交至靶分子中的其互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，其中靶分子至少部分是單鏈的，且在該單鏈區(qū)域中包括該互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)和可選地roi；(c)利用靶分子作為延伸模板延伸探針的第一鏈的雜交的3’末端，以產(chǎn)生靶分子的互補(bǔ)序列；(d)除去靶分子而不使探針變性，留下延伸的探針，所述延伸的探針在所延伸的區(qū)域中從3'至5'包括靶分子的roi以及3'旁側(cè)序列的互補(bǔ)序列；(e)允許第二鏈中的第二結(jié)合位點(diǎn)和另外的探針序列雜交至延伸的第一鏈中的靶互補(bǔ)序列中的它們的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，以使第一延伸鏈的5’末端與3’末端并置，以用于利用第二結(jié)合位點(diǎn)和另外的探針作為連接模板直接或間接地彼此連接，其中，如果所述roi位于靶分子的5’末端內(nèi)部并且第一延伸鏈中的靶互補(bǔ)序列在roi的互補(bǔ)序列的3’方向含有另外的序列，則重排包含該另外的序列中的切割或該述另外的序列的切割，以釋放包含第二結(jié)合位點(diǎn)的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)的第一鏈的3’末端；(f)將探針的延伸鏈的末端直接或間接地彼此連接，以使探針的延伸鏈環(huán)化；(g)擴(kuò)增或分離環(huán)化的延伸鏈，從而選擇roi。在另一實(shí)施方式中，該方法包括：(a)提供探針，所述探針包含莖環(huán)結(jié)構(gòu)和在3’末端的單鏈區(qū)域，其中所述3’末端區(qū)域包含能夠雜交至靶分子的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)的第一靶結(jié)合位點(diǎn)，所述互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)是roi的3’末端側(cè)翼的3’旁側(cè)序列，并且所述環(huán)包含第二結(jié)合位點(diǎn)(其與roi同源，或與其5’末端同源，并且能夠雜交至roi的互補(bǔ)序列、或其5’末端的互補(bǔ)序列)以及3’方向至第二結(jié)合位點(diǎn)(另外的探針序列，其與3’旁側(cè)序列同源并且與第一結(jié)合位點(diǎn)互補(bǔ))，并且其中所述莖環(huán)結(jié)構(gòu)在第二結(jié)合位點(diǎn)和另外的探針序列的3’方向進(jìn)一步包含切割位點(diǎn)，以使所述切割能夠打開所述環(huán)；(b)使探針與靶分子接觸并允許探針的3’末端處的第一靶結(jié)合位點(diǎn)雜交至靶分子中的其互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，其中靶分子至少部分是單鏈的，且在該單鏈區(qū)域中包括該互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)的和可選地roi；(c)利用靶分子作為延伸模板來(lái)延伸探針的雜交的3’末端，以產(chǎn)生靶分子的互補(bǔ)序列；(d)除去靶分子，留下延伸的探針，所述延伸的探針在所延伸的區(qū)域中從3'至5'包括靶分子的roi以及3'旁側(cè)序列的互補(bǔ)序列，其中第二結(jié)合位點(diǎn)保留在探針中；(e)允許延伸的探針經(jīng)歷分子內(nèi)重排，以使得第二結(jié)合位點(diǎn)雜交至roi的互補(bǔ)序列，或雜交至其5’末端，并且該另外的探針序列雜交至第一結(jié)合位點(diǎn)，其中重排包含探針的莖環(huán)結(jié)構(gòu)中的切割位點(diǎn)處的延伸的探針的切割，該探針包含第二結(jié)合位點(diǎn)和另外的探針序列，從而產(chǎn)生包含第一延伸鏈和第二鏈的部分雙鏈構(gòu)建體，該第一延伸鏈包含靶互補(bǔ)序列和釋放的5’末端，并且該第二鏈在雜交至莖中的第一鏈并且包含釋放的3’末端，該3’末端隨后能夠雜交至第一鏈中的其互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，以使釋放的第一延伸鏈的5’末端與可選的釋放的第一延伸鏈的3’末端并置，以用于利用第二結(jié)合位點(diǎn)和另外的探針序列作為連接模板直接或間接地彼此連接；(f)將探針的延伸鏈的末端直接或間接地彼此連接，以使探針的延伸鏈環(huán)化；(g)擴(kuò)增或分離環(huán)化的延伸鏈，從而選擇roi。在本發(fā)明方面中，其中探針包含與roi同源的序列，roi可位于靶分子的5’末端，或可位于靶分子的5’末端的內(nèi)部。如果roi位于靶分子的5’末端的內(nèi)部并且第一延伸鏈中的靶互補(bǔ)序列在roi的互補(bǔ)序列的3’方向含有另外的序列，則重排包括該另外的序列中的切割或該另外的序列的切割，以釋放包含第二結(jié)合位點(diǎn)的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)的第一鏈的3’末端(即，roi的互補(bǔ)序列)。然而，在一個(gè)具體的方面，roi可位于靶核酸分子的5’末端并且步驟(e)包括允許第二鏈中的第二結(jié)合位點(diǎn)雜交至延伸的第一鏈中的靶互補(bǔ)序列中的其互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，以使第一延伸鏈的5’末端與3’末端并置，以用于利用第二結(jié)合位點(diǎn)作為連接模板直接或間接地彼此連接。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，探針可為具有第一鏈和第二鏈的部分雙鏈構(gòu)建體，該第一鏈包含在其3’末端處包含第一靶結(jié)合位點(diǎn)的單鏈3’末端區(qū)域，其中所述第一靶結(jié)合位點(diǎn)能夠雜交至靶分子中的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，所述互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)為roi的3’末端側(cè)翼的旁側(cè)序列，并且第二鏈在其5’末端雜交至所述第一鏈并且包含單鏈3’末端區(qū)域，所述單鏈3’末端區(qū)域包括第二結(jié)合位點(diǎn)和3’方向至第二結(jié)合位點(diǎn)以及在單鏈區(qū)域的3’末端的另外的探針序列，其中第二結(jié)合位點(diǎn)與roi的5’末端同源，或與roi同源，并且能夠雜交至所述roi的互補(bǔ)序列或其5’末端的互補(bǔ)序列，并且所述另外的探針序列與3’旁側(cè)序列同源并且與第一結(jié)合位點(diǎn)互補(bǔ)。在另一實(shí)施方式中，探針可包含莖環(huán)結(jié)構(gòu)和在3’末端的單鏈區(qū)域，其中所述3’末端區(qū)域包含第一靶結(jié)合位點(diǎn)，其能夠雜交至靶分子中的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，所述互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)為roi的3’末端側(cè)翼的3’旁側(cè)序列，并且所述環(huán)包含第二結(jié)合位點(diǎn)(其與roi的5’末端同源或與roi同源，并且能夠雜交至roi的互補(bǔ)序列或其5’末端的互補(bǔ)序列)以及3’方向至第二結(jié)合位點(diǎn)(另外的探針序列，其與3’旁側(cè)序列同源并且與第一結(jié)合位點(diǎn)互補(bǔ))，并且其中所述莖環(huán)結(jié)構(gòu)在第二結(jié)合位點(diǎn)和另外的探針序列的3’方向進(jìn)一步包含切割位點(diǎn)，以使得切割能夠打開環(huán)。探針以選擇的方式通過(guò)其，末端結(jié)合至靶核酸分子中的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，其中該互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)為roi的3’末端側(cè)翼的旁側(cè)序列。探針的靶模板化延伸允許產(chǎn)生包含roi和旁側(cè)序列的“所選的”靶序列的互補(bǔ)序列。隨后至少在探針的莖環(huán)結(jié)構(gòu)中的切割位點(diǎn)處(例如，在探針的莖或環(huán)中)切割延伸的探針，并且通過(guò)在探針-模板化連接中的延伸的鏈末端的連接來(lái)進(jìn)行環(huán)化。通過(guò)提供具有第一靶結(jié)合位點(diǎn)的探針來(lái)選擇靶roi，第一靶結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合至(即，能夠雜交至)靶roi側(cè)翼的區(qū)域(3’旁側(cè)序列或“互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)”)，這有利于產(chǎn)生靶核酸分子的互補(bǔ)序列鏈，即，該靶roi和旁側(cè)序列(roi每一側(cè)的序列)。為了使延伸的探針(含有roi的互補(bǔ)序列)能夠被環(huán)化，通過(guò)莖環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)中或雙鏈探針的第二鏈中的核苷酸序列來(lái)提供同源于靶roi側(cè)翼的5’旁側(cè)序列(或“同源序列”)的第二結(jié)合位點(diǎn)，其結(jié)合至(即，能夠雜交至)5’旁側(cè)序列的互補(bǔ)序列。因此，探針的第一靶結(jié)合位點(diǎn)的互補(bǔ)序列以及探針中的第二結(jié)合位點(diǎn)的序列定義了被“選擇的”靶核酸分子的區(qū)域，并且靶roi是兩個(gè)旁側(cè)序列之間的序列?；蛘呖烧J(rèn)為，靶核酸分子的區(qū)域的互補(bǔ)序列被“選擇”，其通過(guò)第一靶結(jié)合位點(diǎn)和第二結(jié)合位點(diǎn)的互補(bǔ)序列的序列來(lái)定義。因此，探針的第一靶結(jié)合位點(diǎn)和第二結(jié)合位點(diǎn)的序列確定了靶核酸分子的區(qū)域，其“被選擇”并且結(jié)合至環(huán)化的核酸分子中。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，5’旁側(cè)區(qū)可與roi或其部分重疊，或者包含roi或其部分(即，roi的5’部分)。換言之，roi或其5’部分可包含或含有該旁側(cè)區(qū)(全部或部分)。換句話說(shuō)，roi可被看作本文中所定義的5’旁側(cè)區(qū)或者可以起到本文中所定義的5’旁側(cè)區(qū)的作用，即，roi的互補(bǔ)序列可雜交至第二結(jié)合位點(diǎn)從而形成可環(huán)化的結(jié)構(gòu)以用于連接。因此，在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，5’旁側(cè)區(qū)可被看作位于roi內(nèi)，尤其是位于roi的5’末端處，以使roi的互補(bǔ)序列在其3’末端包含互補(bǔ)于5’旁側(cè)區(qū)(因此互補(bǔ)于roi的5’末端)的序列，該序列可雜交至探針的第二結(jié)合位點(diǎn)中的其互補(bǔ)序列。因此，roi的互補(bǔ)序列，或其一部分可雜交至第二結(jié)合位點(diǎn)，以使探針的第一延伸鏈的3’末端與5’末端并置以用于連接。為了進(jìn)行探針的環(huán)化，必須除去靶核酸分子(即，必須破壞探針和靶之間的相互作用，例如，變性)以留下延伸的探針，所述延伸的探針包含靶核酸的互補(bǔ)序列和自由3’末端。此外，當(dāng)探針包含莖環(huán)結(jié)構(gòu)時(shí)，莖環(huán)結(jié)構(gòu)3’方向至第二結(jié)合位點(diǎn)被切割，其打開了莖環(huán)結(jié)構(gòu)并導(dǎo)致形成包含第一延伸鏈(其也被看作“可環(huán)化的鏈”)和第二鏈(其可被看作“連接模板鏈”)的部分雙鏈構(gòu)建體，其中第一延伸鏈包含靶互補(bǔ)序列(即，互補(bǔ)于靶核酸的序列)，且第二鏈通過(guò)“莖”區(qū)雜交至第一鏈并且包含釋放的3’末端(其包含第二結(jié)合位點(diǎn)或同源序列)。莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖區(qū)可被定義為具有第一(即，3’)鏈和第二(即，5’)鏈，或者“莖序列”，其雜交以形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖。第一延伸(可環(huán)化的)鏈還包含5’末端，其通過(guò)切割而被釋放(“釋放的5’末端”)。該末端在切割后保留的莖結(jié)構(gòu)中方便地雜交。因此，術(shù)語(yǔ)“釋放的5’末端”并不意味5’末端是自由的；其可被雜交至構(gòu)建體中的第二鏈。術(shù)語(yǔ)“釋放的”僅表達(dá)該5’末端是切割后的探針/鏈的5’末端。探針的釋放的3’末端(尤其是構(gòu)建體中的第二鏈的)是釋放的自由3’末端。因此，在切割探針的莖環(huán)結(jié)構(gòu)時(shí)，第一莖序列形成可環(huán)化的鏈的部分并且第二莖序列形成連接模板鏈的部分。該部分雙鏈構(gòu)建體中的每條鏈(即，打開的莖環(huán)結(jié)構(gòu))包含3’懸突，并且該鏈通過(guò)來(lái)自莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖的第一莖序列和第二莖序列(即，在切割前形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖的序列)雜交。該“莖結(jié)構(gòu)”(即，部分雙鏈的構(gòu)建體)的第一鏈(即，延伸的鏈或可環(huán)化的鏈)的3’懸突包含靶分子的互補(bǔ)序列(包括位于靶roi的側(cè)翼的5’旁側(cè)序列的互補(bǔ)序列)。該“莖結(jié)構(gòu)”的第二鏈(即，連接模板鏈)的3’懸突包含第二結(jié)合位點(diǎn)(或同源序列)，其能夠雜交至位于靶roi的側(cè)翼的5’旁側(cè)序列的互補(bǔ)序列。因此，該部分雙鏈核酸構(gòu)建體的3’懸突區(qū)包含彼此互補(bǔ)的序列的區(qū)域并且允許該構(gòu)建體經(jīng)歷分子內(nèi)重排，以使該部分雙鏈構(gòu)建體的第一鏈(即，可環(huán)化的鏈)的3’末端與5’末端并置以用于(直接或間接)連接，其通過(guò)該部分雙鏈構(gòu)建體的第二鏈(連接模板鏈)來(lái)模板化。更具體地，第一鏈(可環(huán)化的鏈)的分子內(nèi)連接通過(guò)探針的第二結(jié)合位點(diǎn)(或同源序列)被模板化，其形成部分雙鏈構(gòu)建體的第二鏈(連接模板鏈)的部分。圖1中描繪了本發(fā)明探針的機(jī)制的一個(gè)實(shí)例。當(dāng)探針為部分雙鏈構(gòu)建體時(shí)，顯然延伸的探針(即，包含第一延伸鏈和第二鏈，其中第一延伸鏈包含至少roi的互補(bǔ)序列，且第二鏈包含至少第二結(jié)合位點(diǎn)，所述第一鏈和第二鏈通過(guò)互補(bǔ)序列的區(qū)域雜交)類似于包含如上所述已在莖環(huán)結(jié)構(gòu)的3’方向至第二結(jié)合位點(diǎn)被切割以釋放第一鏈的3’末端的延伸的探針。因此，該部分雙鏈核酸構(gòu)建體的3’懸突區(qū)包含彼此互補(bǔ)的序列的區(qū)域并且允許該構(gòu)建體經(jīng)歷分子內(nèi)重排以使該部分雙鏈構(gòu)建體的第一鏈的3’末端與5’末端并置以用于連接，通過(guò)該部分雙鏈構(gòu)建體的第二鏈被模板化。因此，當(dāng)延伸的(可環(huán)化的)鏈的3’末端被雜交至連接模板鏈的第二結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，可發(fā)生探針的延伸(可環(huán)化的)鏈的末端的直接或間接連接。然而，在一些實(shí)施方式中，靶roi側(cè)翼的5’旁側(cè)序列可位于靶核酸分子的5’末端的內(nèi)部，這意味著在探針結(jié)合和延伸后形成的延伸產(chǎn)物將包含在其3’末端的不與莖環(huán)結(jié)構(gòu)內(nèi)的第二結(jié)合位點(diǎn)或第二探針鏈互補(bǔ)的區(qū)域(即，延伸的探針將含有與5’旁側(cè)序列之外的區(qū)域互補(bǔ)的區(qū)域)。因此，當(dāng)靶核酸分子包含位于其5’末端內(nèi)部的5’旁側(cè)序列時(shí)，為了使連接發(fā)生，有必要除去與5’旁側(cè)序列之外的區(qū)域互補(bǔ)的序列(例如，通過(guò)切割，如利用3’核酸外切酶)(參見(jiàn)圖5)。因此，探針的延伸產(chǎn)生了分子內(nèi)互補(bǔ)序列的區(qū)域，即，在延伸的探針的3’末端處或朝向延伸的探針的3’末端的區(qū)域，其互補(bǔ)于第二結(jié)合位點(diǎn)(同源序列)。然而，這些互補(bǔ)區(qū)域不能發(fā)生相互作用，直至將靶核酸除去并且已經(jīng)通過(guò)切割打開莖環(huán)結(jié)構(gòu)(如果存在的話)，從而減少發(fā)生非特異性連接的機(jī)會(huì)。因此，在最寬泛的意義上，本發(fā)明的探針包含如上文所定義的第一靶結(jié)合位點(diǎn)和第二結(jié)合位點(diǎn)，但可以可選地包含另外的位點(diǎn)或區(qū)域，例如，能夠結(jié)合至靶核酸分子的區(qū)域或與靶核酸分子同源的區(qū)域，和/或使各種下游應(yīng)用能夠進(jìn)行或有助于各種下游應(yīng)用的另外的序列元件。然而，其中基于其3’和5’旁側(cè)序列選擇靶roi的本發(fā)明的方法并不依賴于任何另外的元件的存在，提供另外的元件是為了有助于本發(fā)明方法的一個(gè)或多個(gè)方面，并且將在下文中更加詳細(xì)地討論。圖1-5和圖10-13中示出了代表性的探針結(jié)構(gòu)(design)及其作用方式。如上文中所提到的，當(dāng)延伸鏈(即，可環(huán)化的鏈，其為部分雙鏈“開放”構(gòu)建體的第一鏈)的3’末端和5’末端直接連接在一起時(shí)，探針的分子內(nèi)連接可以是直接的，或者當(dāng)延伸的(可環(huán)化的)鏈的3’末端雜交至具有間隔(space)(即，空位(gap))或在其與延伸鏈的5’末端之間具有間插序列的探針中的第二結(jié)合位點(diǎn)(連接模板鏈中)時(shí)，可以是間接的。如在下文中將要更詳細(xì)描述的，這可在當(dāng)另外的序列元件(或“間隔序列”)被引入探針中時(shí)發(fā)生。在這樣構(gòu)造中，延伸鏈末端之間的空位將通過(guò)“空位”寡核苷酸或者通過(guò)片段的3’末端的雜交被填充，其中“空位”寡核苷酸雜交至位于探針中的第二結(jié)合位點(diǎn)與第二莖序列(即，模板連接鏈的莖序列，其為部分雙鏈“開放”構(gòu)建體的第二鏈)之間的間隔序列(即，間插序列)。可提供空位寡核苷酸預(yù)雜交至探針中的間插序列或間隔序列，或者分別加入，例如，在本方法過(guò)程后期。也可以在一個(gè)或多個(gè)部分中提供。所選的靶roi可以是靶核酸分子中的任何所需的序列或子序列。因此，可替代地，roi可被稱作靶核酸分子中的"靶序列"。例如，其可以是需要擴(kuò)增的樣品中的核酸的一個(gè)區(qū)域。術(shù)語(yǔ)"選擇"在本文中廣泛被使用，并且包括例如從含有其它核酸分子尤其是其它dna或rna的核酸樣品，除了靶核酸分子之外或確實(shí)從含有靶roi的較長(zhǎng)核酸分子中選擇、分離和/或分開目標(biāo)核酸序列的任何含義。因此，靶核酸分子為含有靶roi的任何核酸分子。如在下文中將更詳細(xì)討論的，其因此可以是基因組分子或其片段，或任意類型的合成或人工核酸分子。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，該核酸分子為rna分子或其片段。因此，如果不是實(shí)際物理上的，“選擇”涵蓋事實(shí)上從樣品中存在的其它核酸，和/或從其余靶分子中“分離”靶roi(或者更具體地，其互補(bǔ)序列)任何含義。環(huán)化的探針中所含有的所選roi的互補(bǔ)序列可經(jīng)歷擴(kuò)增，例如，通過(guò)眾多已知的核酸擴(kuò)增方法之一，來(lái)擴(kuò)增roi，例如用于檢測(cè)該roi或使得能夠進(jìn)行進(jìn)一步分析，例如，通過(guò)測(cè)序或通過(guò)物理分離，如捕獲，例如通過(guò)固定于固相體，可選地隨后通過(guò)擴(kuò)增。因此，本發(fā)明的方法可以包括分析roi(即，包含在環(huán)化探針或其擴(kuò)增子中的所選的roi的互補(bǔ)序列)的另外步驟。如將在下文中更詳細(xì)討論的，這可以通過(guò)測(cè)序，或通過(guò)序列分析方法(例如，檢測(cè)roi中是否存在序列變體或特定的(多種)核苷酸)，或通過(guò)檢測(cè)探針至roi的雜交，可選地具有進(jìn)一步檢測(cè)和/或信號(hào)擴(kuò)增步驟來(lái)進(jìn)行。這樣的分析步驟將使靶roi得以被檢測(cè)，例如在含有核酸的樣品中。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，該靶roi可以是靶分析物。因此，從又一個(gè)方面能夠看出，本發(fā)明提供了檢測(cè)靶roi的方法，例如利用本發(fā)明的探針來(lái)結(jié)合至含有roi的靶核酸分子并如前文所述選擇該靶roi。術(shù)語(yǔ)“檢測(cè)”在本文中也被廣泛使用，并且包括鑒定、檢測(cè)或確定或分析靶roi的存在的任何含義，或者包括分析該靶roi的任何含義。術(shù)語(yǔ)“檢測(cè)”涵蓋靶roi的直接分析(即，靶roi的全部或任意部分的測(cè)序)。本發(fā)明的方法可以以“單一(simplex)”形式實(shí)施，以富集(enrich)單個(gè)靶roi(即，單一種類的靶roi，其通常存在于許多復(fù)制中)或用于多個(gè)靶roi，其在序列中十分類似，或者充分類似或完全相同地位于序列側(cè)翼，從而可以利用相同的探針對(duì)它們進(jìn)行選擇。在本文上下中，可以看出，如與探針有關(guān)的所使用的術(shù)語(yǔ)“單一(single)”意指特定靶roi的語(yǔ)境中的單一，即，每個(gè)靶roi(即，單個(gè)探針/靶roi)使用一種探針(或者更具體地為一種或一類探針)。根據(jù)上文描述，顯然“單一”探針意指單一種類的探針，而不是指對(duì)所使用的探針?lè)肿拥膶?shí)際數(shù)量的任何限制?；蛘撸喾N(即，多種類型的)探針可以以“多倍”形式同時(shí)用于富集多種靶roi，其可以是相同的，或者通常是不同的靶分子。因此，上文所定義的本發(fā)明后一方面是用于選擇多種靶roi，其中提供了多種探針，每一種被設(shè)計(jì)為選擇不同的靶roi在。在這樣的實(shí)施方式中，每一種探針可具有不同的第一靶結(jié)合位點(diǎn)和/或第二結(jié)合位點(diǎn)，例如，在其莖環(huán)中或在第一鏈和第二鏈的3’末端區(qū)域處的單鏈區(qū)域中，即，探針具有不同的靶特異性。在這樣的多倍方法中，對(duì)于多種靶roi的每一種(即，每種不同類型或種類的靶roi)，可以使用單一(即，意指單一種類的)探針。因此，可以使用多種探針，對(duì)于每一個(gè)靶roi都具有(不同的)探針。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，每一探針具有不同的第一靶結(jié)合位點(diǎn)和/或第二結(jié)合位點(diǎn)，從而可以選擇多種不同的靶核酸分子(以及因此多個(gè)不同的靶roi)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，可以選擇相同靶分子(例如，其中靶分子來(lái)源于多種來(lái)源)中的不同roi。在又一個(gè)實(shí)施方式中，可以使用相同的探針(即，包含單一組的第一和第二結(jié)合位點(diǎn))來(lái)檢測(cè)可能存在于來(lái)源于多種(各種)不同來(lái)源的相同靶核酸分子中的多種不同靶roi。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“多種”意指2種或更多種(或至少2種)，更具體地指3種或更多種(或至少3種)，或4、5、6、8、10、15、20、30、50、70或100或更多種，等。在某些實(shí)施方式中，甚至可以使用更大數(shù)量的探針并且可以檢測(cè)非常多個(gè)不同的靶roi，例如，500、1,000、2,000、5,000或10,000或更多個(gè)。例如，可同時(shí)使用10、100、1,000或10,000種不同的探針，來(lái)分別檢測(cè)或富集10、100、1,000或10,00種不同的靶roi。靶roi可以是期望被檢測(cè)、分析或擴(kuò)增的任意序列，例如核苷酸序列或核酸序列或核酸分子或核苷酸序列池中的其所選部分，例如基因組核酸(人或任意來(lái)源)，來(lái)自于轉(zhuǎn)錄組或任意其它核酸(例如，細(xì)胞器核酸，即，線粒體或質(zhì)體核酸)，天然存在的或合成的。因此，靶核酸分子可以是任意種類的核酸分子。因此其可以是dna或rna，或其修飾的變體。因此該核酸可由核糖核苷和/或脫氧核糖核苷以及能夠參與沃森-克里克(watson-crick)型或類似堿基對(duì)相互作用的合成核苷酸組成。因此，該核酸可以是或可以包含，例如，亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的dna、lna、pna或含有非核苷酸骨架的任意其它衍生物。因此，該靶分子或roi可以是編碼或非編碼dna，例如基因組dna或其子部分，或者可以來(lái)源于基因組dna，例如，其復(fù)制或擴(kuò)增子，或其可以是cdna或其子部分，或其擴(kuò)增子或其復(fù)制等等?；蛘?，該roi或靶分子可以是或可以來(lái)自于編碼(即，前體mrna(pre-mrna)或mrna)或非編碼rna序列(例如trna、rrna、snorna、mirna、sirna、snrna、exrna、pirna和長(zhǎng)ncrna)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，該靶核酸分子為rna分子。在尤其優(yōu)選的實(shí)施方式中，該靶核酸分子為微小rna(mirna)。在某些實(shí)施方式中，定義了靶分子的5’末端。因此，期望該靶分子的5’末端是已知的和/或包含roi的5’末端以用于檢測(cè)。在這種情況下，5’旁側(cè)序列可以是(即，可形成或提供)該分子的5’末端。在其它的實(shí)施方式中或在其它的方面，roi的5’末端可以是(即，可形成或提供)該分子的5’末端。這樣的靶分子尤其包括rna分子，例如，mirna分子或轉(zhuǎn)錄本或mrna分子。因此，該定義端可以是mirna分子的5’末端或轉(zhuǎn)錄本的5’末端。探針可類似地由上文中詳細(xì)描述的任意核酸組成，或可以包含上文中所述的任意核酸。靶roi的序列可以是未知的，條件是靶roi側(cè)翼區(qū)域的序列已知，從而便于設(shè)計(jì)探針，該探針必須能夠雜交至3’旁側(cè)序列以及5’旁側(cè)序列的互補(bǔ)序列，如上文所定義和解釋的。然而，在某些實(shí)施方式中，靶roi的序列可以是已知的，例如，當(dāng)探針含有與roi同源的第二結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，或者該roi包含5’旁側(cè)序列時(shí)。因此，為了設(shè)計(jì)在本發(fā)明方法中使用的探針，位于第一結(jié)合位點(diǎn)的互補(bǔ)序列5’的序列必須是已知的。這可以是5’旁側(cè)區(qū)，或roi或其一部分。本發(fā)明的方法要求核酸探針是延伸的從而“選擇”靶目標(biāo)區(qū)域，由此靶核酸分子起到延伸模板的作用以產(chǎn)生靶核酸分子的互補(bǔ)序列(即，所見(jiàn)的5’至3’反向互補(bǔ)序列)。任何適合的聚合酶都可用于本發(fā)明的方法中，例如rna聚合酶(dna→rna)、dna聚合酶(dna→dna)或逆轉(zhuǎn)錄酶(rna→dna)。然而，探針的3’末端的延伸所需的特異性核酸聚合酶可取決于靶核酸分子的性質(zhì)、靶roi的大小、以及在所選靶roi上將要實(shí)施的分析的性質(zhì)。靶roi的大小不是關(guān)鍵性的且可以在寬范圍內(nèi)變化。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，靶roi的長(zhǎng)度可為至少10個(gè)核苷酸，并且優(yōu)選為至少15個(gè)核苷酸。因此，靶roi的長(zhǎng)度可為至少20、25、30、40、50、60、70、80或90個(gè)核苷酸。也可以預(yù)見(jiàn)可用本發(fā)明的方法來(lái)選擇較長(zhǎng)的靶roi，例如靶roi的長(zhǎng)度為至少100、150、200、300或400個(gè)核苷酸，或者長(zhǎng)度長(zhǎng)達(dá)500、1,000、1,500、2,000、2,500、3,000、5,000、10,000、25,000、50,000或100,000個(gè)核苷酸。盡管核酸環(huán)的rca可隨著環(huán)尺寸的增加(例如，5,000或10,000個(gè)核苷酸以上)而效率下降，但其仍是可行的。因此，roi長(zhǎng)度的代表性范圍包括從10、12或15中的任一個(gè)至高達(dá)100,000、50,000、25,000、10,000、5,000、2,000、1,000、800、750、700、600或500中的任一個(gè)數(shù)量的核苷酸。在特定的實(shí)施方式中，該尺寸范圍可以是從10、12或15中的任一個(gè)至500、400、300、200、100或50中的任一個(gè)數(shù)量的核苷酸。靶核酸分子可存在于樣品中。期望從其中選擇靶roi的樣品可以是含有任意數(shù)量核酸、來(lái)自于任意來(lái)源或用任意起源的任何樣品。因此，樣品可以是臨床或非臨床樣品，并且可以是其中可存在靶核酸分子的生物學(xué)的、臨床的或環(huán)境樣品。更具體地，該樣品可以是含有核酸的任何樣品。該靶核酸分子可以以單鏈或部分單鏈或以雙鏈形式存在。然而，如上文所述，為了實(shí)施該方法，需要該靶分子至少在探針雜交的區(qū)域中是單鏈的。因此，如下文中進(jìn)一步討論的，在必要時(shí)，該方法可包括使靶核酸至少部分是單鏈的步驟。如上文所述，通過(guò)本文所述的方法來(lái)選擇靶roi需要除去靶核酸分子，之后延伸探針的雜交的3’末端從而得到靶核酸分子單鏈的互補(bǔ)序列?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的任何適合的方法來(lái)除去靶核酸分子，這取決于靶核酸的類型、大小和性質(zhì)。例如，可以通過(guò)變性(例如，通過(guò)改變樣品或測(cè)定中的條件，例如通過(guò)加熱，或者改變組分(例如鹽)的濃度，或者通過(guò)加入變性物質(zhì)或變性劑，例如脲，或者任何其它的變性劑或促溶劑)和/或通過(guò)靶核酸分子的鏈特異性化學(xué)或酶促降解來(lái)除去靶核酸分子。如上文所述，當(dāng)探針作為部分雙鏈構(gòu)建體提供，或者當(dāng)在與靶分子接觸之前切割探針時(shí)，以這樣的方式進(jìn)行或?qū)嵤┏グ蟹肿拥牟襟E以使得探針中保留第二結(jié)合位點(diǎn)。因此，在這種情形下，不使用將會(huì)導(dǎo)致探針變性的方法。在實(shí)踐中，這意味著不使用變性方法，尤其是不使用熱變性。因此，對(duì)于rna靶分子來(lái)說(shuō)，利用部分雙鏈探針或在靶接觸之前切割探針的方法是尤其有用的，因?yàn)殡s交的rna分子可被容易地除去，同時(shí)保留延伸的探針完好無(wú)損。因此，當(dāng)不需要或不使用變性來(lái)除去靶分子時(shí)，包含莖環(huán)結(jié)構(gòu)的探針可被切割以在該方法開始時(shí)打開環(huán)，例如，在與靶接觸之前，或者更一般地，在接觸步驟、延伸步驟或去除步驟之前、期間或之后。例如，可利用堿法水解或rna酶消化來(lái)降解rna靶核酸分子，或者可利用綠豆核酸酶來(lái)降解單鏈dna靶分子。在靶核酸分子為rna的實(shí)施方式中，發(fā)現(xiàn)任何適合的rna酶都可用于本文所述的方法。在尤其優(yōu)選的實(shí)施方式中，靶核酸分子包含rna且除去靶分子的步驟包含堿法水解，例如，使樣品或測(cè)定與堿(例如naoh或koh)接觸，其可使靶核酸與延伸的探針之間的雙鏈體變性并且還可降解靶核酸。除了變性步驟之外(即，之前，與之同時(shí)或之后)，也會(huì)發(fā)生靶核酸分子的降解。因此在一些實(shí)施方式中，除去靶核酸分子的步驟可以包括使靶核酸與延伸的探針之間的雙鏈體變性的第一步，以及隨后的降解(即，選擇性降解)靶核酸分子的第二步。分離步驟可以可選地在除去靶核酸分子之后，或者作為除去靶核酸分子的一部分采用，以確保在繼續(xù)本發(fā)明方法之前樣品中不存在靶核酸分子。分離可以包括明確除去不想要的靶核酸分子或分離延伸的探針的任意方法，例如通過(guò)將探針固定在固相體上，用合適的緩沖液洗滌樣品，凝膠電泳，高效液相色譜法(hplc)或優(yōu)先沉淀靶核酸分子或延伸的探針。因此在一些實(shí)施方式中，除去靶核酸分子的步驟可以包括將延伸的探針從樣品中的其它核酸分子分離?？商娲貋?lái)看，該方法可包括從樣品中的其它組分(例如，其它核酸分子，尤其是靶核酸分子)分離或純化(部分或全部地)延伸的探針的步驟。在上述方法的一個(gè)實(shí)施方式中，可原位檢測(cè)靶roi，因?yàn)槠涮烊淮嬖谟跇悠分械暮怂岱肿又?。在這樣的實(shí)施方式中，靶核酸分子可在樣品中的固定的、可檢測(cè)的或可見(jiàn)的位置處存在于樣品中。因此，樣品可以是反映了靶核酸分子的正?；蛱烊?“原位”)定位的任何樣品，即，正?；蛱烊淮嬖诘娜魏螛悠?。這樣的樣品有利地為細(xì)胞或組織樣品。尤其優(yōu)選的是例如其中可檢測(cè)靶roi以展現(xiàn)靶roi相對(duì)于樣品的其它特征的定位的經(jīng)培養(yǎng)或收獲的或活檢的細(xì)胞或組織樣品。還有細(xì)胞或組織制備，這樣的樣品還可以包括，例如，脫水的或固定的生物學(xué)流體，以及核質(zhì)(例如染色體/染色質(zhì)制備)，例如，在顯微鏡載玻片上。樣品可以是新鮮制備的，或者它們可以是以任何方便的方式預(yù)先處理的，例如通過(guò)固定或冷凍。因此，可使用新鮮的、冷凍的或固定的細(xì)胞或組織，例如，ffpe組織(福爾馬林固定石蠟包埋)。因此，代表性的樣品可以包括可含有靶核酸分子的任何材料，包括例如食品或類似產(chǎn)品、臨床和環(huán)境樣品等。該樣品可以是生物學(xué)樣品，其可含有任何病毒或細(xì)胞材料，包括所有的原核或真核細(xì)胞、病毒、噬菌體、支原體、原生質(zhì)體和細(xì)胞器。因此，這樣的生物學(xué)材料可以包含所有類型的哺乳動(dòng)物和非哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、藻類(包括藍(lán)綠藻)、真菌、細(xì)菌、原生動(dòng)物等。因此，代表性的樣品包括臨床樣品，例如，全血和血源產(chǎn)品例如血漿、血清和白細(xì)胞層、血細(xì)胞、其它循環(huán)細(xì)胞(例如，循環(huán)腫瘤細(xì)胞)、尿液、糞便、腦脊髓液或任何其它體液(例如，呼吸道分泌物、唾液、乳汁等)、組織、活檢以及其它樣品例如細(xì)胞培養(yǎng)物、細(xì)胞懸液、條件培養(yǎng)基或細(xì)胞培養(yǎng)物構(gòu)成的其它樣品等。盡管本發(fā)明的方法可用于在原位(即，天然的)環(huán)境中來(lái)選擇靶核酸分子中的靶roi，但也考慮了該方法可被用于在體外檢測(cè)系統(tǒng)中選擇靶核酸分子中的靶roi，即，當(dāng)靶核酸分子已從其天然環(huán)境中被分離或純化時(shí)。因此，該樣品可以是核酸分離過(guò)程或細(xì)胞裂解過(guò)程的直接產(chǎn)物，或者可以以一些方式將其進(jìn)一步分解或純化，例如，其可以含有已經(jīng)從其天然環(huán)境中被部分或全部分離的核酸。也可以用任意方式處理樣品，(例如)以產(chǎn)生rna分子的cdna逆轉(zhuǎn)錄本。盡管片段化步驟不是必需的，但在某些靶核酸分子或某些樣品中，例如在基因dna的環(huán)境中，在該方法中包括片段化步驟是合乎需要的或者方便的，這樣使得該樣品或靶分子中的核酸在探針雜交之前被片段化。這可以在樣品或靶核酸分子與探針接觸之前、同時(shí)或基本同時(shí)發(fā)生。如上文中所提到的，當(dāng)靶分子為雙鏈時(shí)，需要使分子至少部分為單鏈的步驟。該步驟可與片段化步驟分開，例如，在片段化之后，但也可以作為片段化步驟的一部分發(fā)生。片段化可以是需要的或者有幫助的，以允許制備至少部分單鏈的核酸。在本文中廣泛使用的術(shù)語(yǔ)“片段化”包括樣品中的核酸或者更具體地靶分子可被片段化或切割的任何方法。因此，片段化可以以酶解法進(jìn)行，例如，利用限制性或其它核酸內(nèi)切酶或核酸酶(例如dna酶)，和/或物理法進(jìn)行，例如，通過(guò)霧化或超聲或基于剪切的方法。這樣的物理方法會(huì)導(dǎo)致不可預(yù)期的非序列特異性片段化，就像用某些(非限制性)核酸內(nèi)切酶的那樣。因此，隨機(jī)的和預(yù)定的(或位置特異性)片段化均包括在內(nèi)，但后者不是必需的?！捌位边€包括固有地作為樣品老化的結(jié)果存在的核酸樣品的片段化，其儲(chǔ)存的條件和樣品任意處理(例如，固定，如在福爾馬林固定的石蠟包埋的樣品中)以及降解這些因素所造成的。可以使用任意合適種類的限制性核酸內(nèi)切酶，包括一種或多種ii型酶?；蛘?，可利用瓣?duì)詈怂醿?nèi)切酶(flapendonuclease，fen)來(lái)實(shí)現(xiàn)片段化，其中利用添加的核酸或寡核苷酸來(lái)產(chǎn)生用于例如結(jié)構(gòu)特異性核酸內(nèi)切酶的底物的結(jié)構(gòu)，即，具有突出的非雜交的5’末端區(qū)域的結(jié)構(gòu)。片段化方式可以組合使用，例如，兩種或更多種核酸內(nèi)切酶一起使用，更具體地兩種或更多種限制性核酸內(nèi)切酶一起使用，或者酶促方式和物理方式一起使用。此外，核酸樣品在單個(gè)等分試樣中可以是不同片段化的，然后該等分試樣被合并并且一起經(jīng)歷本發(fā)明方法的其余步驟。在某些情形下，利用單一限制性核酸內(nèi)切酶進(jìn)行片段化是適當(dāng)且足夠的，但在其它情形下，可優(yōu)選使用另外的限制性核酸內(nèi)切酶。因此，可通過(guò)將核酸樣品分離成多個(gè)等分試樣并且用不同的方式或不同方式的組合來(lái)片段化各等分試樣來(lái)實(shí)現(xiàn)片段化，這樣的方式例如是限制性酶。樣品的任意數(shù)量的等分試樣可被不同地處理，例如，2種或更多種，或3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或20或更多種等。然后，使等分試樣經(jīng)歷該方法的其余步驟并且可將其合并，例如在步驟(b)之前。在靶分子可與探針雜交之前，其必須是至少部分單鏈的。如果有必要，這可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方式實(shí)現(xiàn)，例如變性，例如，通過(guò)熱或ph，或通過(guò)使用化學(xué)試劑，例如堿。優(yōu)選熱變性。因此，如果有必要，在任意片段化步驟之后或者與其同時(shí)，可以使樣品中的核酸(包括靶核酸分子)為至少部分單鏈的，以允許探針在步驟(b)中發(fā)生雜交。當(dāng)核酸分子不被制成全部是單鏈時(shí)，則需要其至少在包含(多個(gè))探針互補(bǔ)部分的(多個(gè))部分中是單鏈的(從而允許結(jié)合至探針)，即，靶核酸分子的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)是單鏈的以允許探針的第一靶結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，尤其優(yōu)選起到探針延伸模板的作用的5’方向至探針結(jié)合位點(diǎn)(互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn))的區(qū)域是單鏈的。然而，在一些實(shí)施方式中，5’方向至探針結(jié)合位點(diǎn)(互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn))的區(qū)域可以是雙鏈的，例如，當(dāng)使用鏈置換聚合酶，例如phi29(即，具有鏈置換活性的聚合酶)來(lái)延伸探針時(shí)。具有鏈置換活性的聚合酶是本領(lǐng)域中已知的并且發(fā)現(xiàn)任何適合的鏈置換聚合酶均可用于本發(fā)明的方法中。此外，通過(guò)變性，至少部分單鏈化可通過(guò)利用適當(dāng)?shù)?'或5'核酸外切酶來(lái)進(jìn)行3'或5'核酸外切酶降解來(lái)實(shí)現(xiàn)。在自由雙鏈片段端處開始，這樣的酶逐漸降解或消化雙鏈核酸的一條鏈，剩下互補(bǔ)鏈并使得該核酸單鏈沿著酶作用的長(zhǎng)度。核酸外切酶降解的程度(即所得單鏈區(qū)域的長(zhǎng)度)可通過(guò)反應(yīng)的時(shí)長(zhǎng)來(lái)控制。選擇核酸外切酶反應(yīng)的時(shí)長(zhǎng)以使得片段的鏈的一端的適當(dāng)長(zhǎng)度被除去。消化的程度必須足以允許與探針雜交。適合的核酸外切酶是本領(lǐng)域已知的，并且包括例如，核酸外切酶iii(3')和λ核酸外切酶(5')。此外，在某些應(yīng)用中，例如原位過(guò)程，靶核酸分子的雙鏈體可以被打開以允許探針雜交，而不使核酸完全變性。出于這種目的的過(guò)程是本領(lǐng)域中已知的。在一些實(shí)施方式中，可以通過(guò)rca來(lái)檢測(cè)環(huán)化的鏈，其中其可用于促進(jìn)rca產(chǎn)物向其天然位置的定位，例如，使得rca產(chǎn)物在樣品中起到靶核酸分子的定位標(biāo)志物的功能。例如，rca產(chǎn)物可通過(guò)將rca產(chǎn)物固定至靶核酸或在靶核酸附近而固定至樣品。下文中進(jìn)一步描述了固定rca產(chǎn)物的方法。然而，在一個(gè)代表性實(shí)例中，探針可以包含間隔(間插)序列，其起到錨定或捕獲序列的功能。在一些實(shí)施方式中，捕獲序列可以形成探針的連接模板鏈的一部分并且可包含能夠直接或間接結(jié)合至靶核酸分子或其互補(bǔ)序列的序列。更具體地，捕獲序列可在遠(yuǎn)離roi和旁側(cè)序列的位點(diǎn)處結(jié)合至靶分子，例如，捕獲序列可互補(bǔ)于靶核酸或其互補(bǔ)序列(例如，如果靶核酸是雙鏈分子，例如dna，例如，基因組dna)，例如，互補(bǔ)于roi的側(cè)翼區(qū)域或roi旁側(cè)序列之一的序列(例如，roi的3’末端側(cè)翼的旁側(cè)序列側(cè)翼的序列)。因此，在除去靶分子的步驟之后(即，在上述方法的步驟(d)之后)，捕獲序列可雜交至靶分子從而將連接模板鏈直接固定至roi位點(diǎn)處的位置或其附近。由于連接模板鏈也可以起到rca引物的作用，因此隨后的rca產(chǎn)物可被定位在roi位點(diǎn)處或其附近。或者，捕獲序列可以互補(bǔ)于捕獲寡核苷酸，該捕獲寡核苷酸含有互補(bǔ)于靶核酸或其互補(bǔ)序列的序列區(qū)域并且因此能夠?qū)⑻结樄潭ㄔ诎泻怂岱肿由?，并且因此將rca產(chǎn)物間接固定在靶核酸分子上。應(yīng)該理解，當(dāng)存在第二切割(即，當(dāng)5’旁側(cè)序列(或roi)位于靶分子的5’末端內(nèi)部時(shí))時(shí)，捕獲序列將位于探針中的第二切割位點(diǎn)的內(nèi)部的位點(diǎn)或位置處(參見(jiàn)下文進(jìn)一步描述)。這樣的捕獲序列可被看作是錨定序列。具體地，這樣的捕獲序列起到捕獲或錨定延伸的探針的作用，或者更具體地捕獲或錨定延伸的探針的擴(kuò)增產(chǎn)物。因此，這可看作是定位序列，尤其是用于延伸的探針的擴(kuò)增產(chǎn)物的定位序列。在另一代表性實(shí)施方式中，rca的引物可以單獨(dú)提供，其中該引物含有能夠雜交至探針的環(huán)化鏈的序列和能夠雜交至靶核酸或其互補(bǔ)序列的序列，例如，互補(bǔ)于roi的側(cè)翼區(qū)域或roi旁側(cè)序列之一的序列。因此，在rca時(shí)，rca產(chǎn)物將被固定在靶分子上，例如在roi處或其附近，例如靠近roi。在一些實(shí)施方式中，不必積極固定該rca產(chǎn)物(例如)至靶核酸分子，從而產(chǎn)生原位定位的信號(hào)(參見(jiàn)例如，實(shí)施例2和圖8)。在這一方面，不想受到理論的束縛，假設(shè)rca產(chǎn)物迅速變得過(guò)大從而容易遠(yuǎn)離其來(lái)源分散，即，rca產(chǎn)物被定位在其細(xì)胞來(lái)源但其并不會(huì)直接或間接固定(例如)于靶核酸或靶核酸附近。本發(fā)明的探針可以采用許多不同的設(shè)計(jì)。作為最簡(jiǎn)化的方式，如圖1中所示，探針為在3’末端包含單鏈區(qū)域的發(fā)夾或莖環(huán)探針，其中第一靶結(jié)合位點(diǎn)和第二結(jié)合位點(diǎn)通過(guò)莖環(huán)的莖分離。因此，該探針包含至少一個(gè)第一3’靶結(jié)合位點(diǎn)、莖環(huán)結(jié)構(gòu)、第二結(jié)合位點(diǎn)的3’端，其中第一3’靶結(jié)合位點(diǎn)能夠雜交至靶roi的3’末端側(cè)翼的旁側(cè)序列，莖環(huán)結(jié)構(gòu)包含與靶roi的5’末端側(cè)翼的旁側(cè)序列同源的第二結(jié)合位點(diǎn)和莖環(huán)結(jié)構(gòu)內(nèi)(例如，在莖或環(huán)內(nèi))的切割位點(diǎn)。然而，可采用探針的進(jìn)一步設(shè)計(jì)，其可包含一個(gè)或多個(gè)另外的靶結(jié)合位點(diǎn)、同源于靶分子的部分的另外區(qū)域、和/或可起到間隔子的作用或者能夠或促進(jìn)選擇靶roi的一個(gè)或多個(gè)另外的序列元件。顯然，在與靶核酸分子相互作用之前，探針的3’末端的單鏈區(qū)域不必完全是單鏈。例如，探針的3’末端可以包含二級(jí)結(jié)構(gòu)的區(qū)域，例如在3’末端處或其附近的發(fā)夾。探針的3’末端必須是僅能夠特異性雜交至靶roi的3’末端側(cè)翼的旁側(cè)序列并且起到用于利用靶核酸分子作為延伸模板來(lái)延伸探針的引物的作用。因此，例如，如果探針的3’末端包含發(fā)夾區(qū)域，則第一結(jié)合位點(diǎn)與靶roi的3’末端側(cè)翼的旁側(cè)序列之間的相互作用比在探針的3’末端處的分子內(nèi)雜交更加穩(wěn)定(即，熱力學(xué)上更加有利)，使得在靶核酸分子的存在下，探針的3’末端展開以允許探針與靶核酸之間發(fā)生相互作用。這對(duì)于減少非靶特異性結(jié)合和延伸可以是尤其有利的。在第一種變化實(shí)施方式中，如圖2中所示，探針可包含莖環(huán)結(jié)構(gòu)的5’方向的第三結(jié)合位點(diǎn)，所述結(jié)合位點(diǎn)具有同源于緊鄰靶分子中5’旁側(cè)序列的5’端序列，并且能夠雜交至所述序列的互補(bǔ)序列。更具體地，第三結(jié)合區(qū)域可位于探針的5’單鏈序列(即，5’單鏈端或區(qū)域)中。因此，延伸的探針能夠經(jīng)歷分子內(nèi)雜交，其中第三結(jié)合位點(diǎn)雜交至靶互補(bǔ)序列中的其互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，從而產(chǎn)生延伸的探針中的第二雙鏈區(qū)域。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，當(dāng)雜交至其互補(bǔ)序列時(shí)，第三結(jié)合位點(diǎn)可包含能夠形成第二切割位點(diǎn)的序列。因此，這樣的實(shí)施方式能夠用于靶分子(或roi)中的5’旁側(cè)序列不是位于靶分子5’末端處，而是位于該分子5’末端內(nèi)部的情形。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，切割位點(diǎn)為限制酶識(shí)別序列。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，切割位點(diǎn)為切口酶識(shí)別序列，其將第二雙鏈區(qū)域的3’鏈中的延伸的探針的單鏈切割模板化。在一些實(shí)施方式中，能夠形成切割位點(diǎn)(更具體地第二切割位點(diǎn))的序列可位于第三結(jié)合位點(diǎn)的3’末端的末端處或朝向第三結(jié)合位點(diǎn)的3’末端的末端?；蛘撸軌蛐纬汕懈钗稽c(diǎn)的序列可位于遠(yuǎn)離第三結(jié)合位點(diǎn)3’末端(即，位于第三結(jié)合位點(diǎn)的5’末端處或朝向第三結(jié)合位點(diǎn)的5’末端)，以使在切割后與第三結(jié)合位點(diǎn)互補(bǔ)的序列的部分保留在探針的第一鏈的3’末端處(即，部分雙鏈的“開放”探針和可環(huán)化鏈的第一鏈)(參見(jiàn)圖3)。在一些實(shí)施方式中，當(dāng)能夠形成第二切割位點(diǎn)的序列位于遠(yuǎn)離第三結(jié)合位點(diǎn)的3’末端時(shí)，莖環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)可包含另外的序列(即，位于環(huán)的5’末端或朝向環(huán)的5’末端)，其互補(bǔ)于靶互補(bǔ)序列中的至少一部分序列，其形成第三結(jié)合位點(diǎn)的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，即，莖環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)包含與在第二切割位點(diǎn)處切割之后保留在探針的第一鏈(可環(huán)化的鏈)的3’末端處的序列互補(bǔ)的序列。或者，可以看到，莖環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)在環(huán)的5’末端處或朝向環(huán)的5’末端處包含另外的序列，其同源于鄰近于(優(yōu)選直接鄰近于)roi的5’末端側(cè)翼的旁側(cè)序列的序列的至少一部分。因此，在一些實(shí)施方式中，其中當(dāng)5'旁側(cè)序列位于靶核酸分子的5’末端的內(nèi)部時(shí)，探針在5’末端處進(jìn)一步包含單鏈區(qū)域，其包含同源于靶分子中5’旁側(cè)序列的5’端(例如，緊鄰5’)的切割序列的第三結(jié)合位點(diǎn)，并且其能夠雜交至所述切割序列的互補(bǔ)序列，其中所述第三結(jié)合位點(diǎn)可選地通過(guò)間隔序列從莖的5’末端分離并且其中上述方法的步驟(e)包括：(i)允許延伸的探針經(jīng)歷分子內(nèi)雜交，其中第三結(jié)合位點(diǎn)雜交至靶互補(bǔ)序列中的其互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，從而產(chǎn)生第二切割位點(diǎn)；(ii)在第二切割位點(diǎn)處和莖環(huán)結(jié)構(gòu)中的切割位點(diǎn)處(例如，在莖或環(huán)中3’方向至第二結(jié)合位點(diǎn))切割雜交的探針，從而產(chǎn)生部分雙鏈的構(gòu)建體，其包含在莖處雜交的兩條鏈，第一鏈包含靶互補(bǔ)序列，并且第二鏈包含第二結(jié)合位點(diǎn)；(iii)允許第二結(jié)合位點(diǎn)雜交至第一鏈中的靶互補(bǔ)序列中其互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，以使第一延伸鏈的5’與3’末端并置，以用于利用第二結(jié)合位點(diǎn)作為連接模板直接或間接地彼此連接。在又一個(gè)實(shí)施方式中，探針中的環(huán)在第二結(jié)合位點(diǎn)的5’方向序列進(jìn)一步包含與針對(duì)第三結(jié)合位點(diǎn)的靶互補(bǔ)序列中的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)的序列互補(bǔ)的序列，該序列在第二切割位點(diǎn)處切割之后保留在探針的第一鏈的3’末端處。然而，第三結(jié)合位點(diǎn)不需位于探針的5’單鏈區(qū)域中，并且可存在于可替代的位置。因此，在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，其在5’旁側(cè)區(qū)位于靶分子5’末端內(nèi)部的情形下使用，第三結(jié)合位點(diǎn)可位于莖環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)中。這在圖10中示出。因此，在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，其中當(dāng)5'旁側(cè)序列位于靶核酸分子的5’末端內(nèi)部時(shí)，探針進(jìn)一步包含第三結(jié)合位點(diǎn)，該第三結(jié)合位點(diǎn)同源于位于靶分子中5’旁側(cè)序列的5’端(例如，緊鄰5’端)的切割序列，并且能夠雜交至所述切割序列的互補(bǔ)序列，其中所述第三結(jié)合位點(diǎn)位于莖環(huán)結(jié)構(gòu)中，優(yōu)選位于莖環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)中，并且在第二結(jié)合位點(diǎn)的3’方向，并且其中上述方法的步驟(e)包括：(i)允許延伸的探針經(jīng)歷分子內(nèi)雜交，其中第三結(jié)合位點(diǎn)雜交至靶互補(bǔ)序列中的其互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，從而產(chǎn)生第二切割位點(diǎn)；(ii)在第二切割位點(diǎn)處以及莖環(huán)結(jié)構(gòu)中的切割位點(diǎn)處(即，第一切割位點(diǎn)，例如，在莖或環(huán)中3’方向至第二結(jié)合位點(diǎn))切割雜交的探針，從而產(chǎn)生部分雙鏈的構(gòu)建體，該構(gòu)建體包含在莖處雜交的兩條鏈，第一鏈包含靶互補(bǔ)序列且第二鏈包含第二結(jié)合位點(diǎn)；(iii)允許第二結(jié)合位點(diǎn)雜交至第一鏈中的靶互補(bǔ)序列中的其互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，以使第一延伸鏈的5’與3’末端并置，以用于利用第二結(jié)合位點(diǎn)作為連接模板直接或間接地彼此連接。能夠看出，在該實(shí)施方式中，第三結(jié)合位點(diǎn)(其產(chǎn)生第二切割位點(diǎn),)位于第二結(jié)合位點(diǎn)與莖環(huán)結(jié)構(gòu)中的切割位點(diǎn)(即第一切割位點(diǎn))之間的環(huán)中。因此，第三結(jié)合位點(diǎn)在莖環(huán)結(jié)構(gòu)中的切割位點(diǎn)的5’方向。當(dāng)切割位點(diǎn)(即，第一切割位點(diǎn))位于環(huán)中時(shí)，第三結(jié)合位點(diǎn)在切割位點(diǎn)的5’方向。當(dāng)?shù)谌Y(jié)合位點(diǎn)(其用于模板化延伸產(chǎn)物的切割)位于環(huán)中時(shí)，平衡雜交強(qiáng)度可非常重要。在其它變化的實(shí)施方式中，探針可包含至少一個(gè)(即，一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè))另外的序列元件(間隔子或間插序列)。例如，一個(gè)或多個(gè)間插序列或間隔子可存在于第一靶結(jié)合位點(diǎn)與莖環(huán)結(jié)構(gòu)之間，在莖環(huán)結(jié)構(gòu)中，或莖環(huán)結(jié)構(gòu)的5’方向，其包括在探針的可選單鏈5’方向的區(qū)域中。間插序列或間隔子也可存在于莖環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)和/或莖序列中。例如，間插序列能夠在莖結(jié)構(gòu)的莖中形成單鏈環(huán)，例如，第一莖序列可包含不與第二莖序列互補(bǔ)的區(qū)域，從而當(dāng)?shù)谝缓偷诙o序列彼此雜交時(shí)在莖中形成環(huán)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，莖環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)中的間隔子位于第二結(jié)合位點(diǎn)的5’方向，即，第二結(jié)合位點(diǎn)與莖環(huán)結(jié)構(gòu)第二莖序列之間。因此，探針中可存在多個(gè)間插序列或間隔子，散布在本文中所定義的探針的各個(gè)區(qū)域之間。如上文所述，這些間插序列或間隔子可用于引入可用于或有助于下游處理或操作的元件，例如引入允許探針和/或環(huán)化片段(即，roi的環(huán)化互補(bǔ)序列)被捕獲的標(biāo)簽或檢測(cè)序列或元件，例如用于固定至固相體。在一個(gè)實(shí)施方式中，其可以是捕獲或者錨定序列，其被設(shè)計(jì)為將環(huán)化鏈的擴(kuò)增產(chǎn)物(例如，原位rca產(chǎn)物)(例如)以從其來(lái)源固定至靶分子。因此，探針可包含在第一靶結(jié)合位點(diǎn)與莖環(huán)結(jié)構(gòu)之間的間插序列或間隔子，和/或莖環(huán)結(jié)構(gòu)的5’方向的間隔子(即，第二莖序列的5’方向，例如上文所述在第二莖序列與探針的單鏈5’末端區(qū)域中的第三結(jié)合位點(diǎn)之間，或第二莖序列的5’方向與第三結(jié)合位點(diǎn)之間，如果存在的話)，和/或莖環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)中的間插序列或間隔子。例如，當(dāng)?shù)谌Y(jié)合位點(diǎn)位于環(huán)中時(shí)，間插序列可以位于第三結(jié)合序列的3’方向。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，探針可以在第一靶結(jié)合位點(diǎn)與莖環(huán)結(jié)構(gòu)之間以及在第一靶結(jié)合位點(diǎn)與莖環(huán)結(jié)構(gòu)的5’方向之間包含間插序列或間隔子。當(dāng)探針包含第三結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，第三結(jié)合位點(diǎn)的3’或5’方向可以存在一個(gè)或多個(gè)間插序列或間隔子。因此，間隔子可以位于第三結(jié)合位點(diǎn)的5’末端處、第三結(jié)合位點(diǎn)的3’末端處(例如，在第三結(jié)合位點(diǎn)與莖環(huán)結(jié)構(gòu)之間)，或間隔子可以存在于第三結(jié)合位點(diǎn)的5’和3’末端處。在一些實(shí)施方式中，間插序列或間隔子可以位于第三結(jié)合位點(diǎn)和莖環(huán)結(jié)構(gòu)之間(即，第三結(jié)合位點(diǎn)的3’方向和第二莖序列的5’方向)，并且有利地可以包含第四靶結(jié)合位點(diǎn)，第四靶結(jié)合位點(diǎn)能夠雜交至靶分子中的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，其位于靶分子的3’旁側(cè)序列的3’方向，優(yōu)選緊鄰3’)參見(jiàn)圖4)。第四結(jié)合位點(diǎn)的存在可以使探針和靶核酸分子之間的相互作用穩(wěn)定，例如，可以改善探針的選擇性和特異性。因此，在一些實(shí)施方式中，間隔序列包含第四靶結(jié)合位點(diǎn)，其能夠雜交至靶分子中的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，其位于靶分子的3’旁側(cè)序列的3’方向，優(yōu)選緊鄰3’，并且上述方法的步驟(b)進(jìn)一步包括允許第四靶結(jié)合位點(diǎn)雜交至靶分子中的其互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)。顯然，位于第二結(jié)合位點(diǎn)和莖環(huán)結(jié)構(gòu)的第二莖序列(即，位于莖環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)的5’末端處或朝向莖環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)的5’末端)之間的間插序列或間隔子可導(dǎo)致探針的延伸鏈(可環(huán)化的鏈)的雜交端之間存在空位。例如，如果在延伸的探針的3’末端，5’旁側(cè)區(qū)的3’方向的互補(bǔ)序列(其互補(bǔ)于間插序列或間隔子)處沒(méi)有另外的序列，這就會(huì)發(fā)生。這種另外的序列可(例如)由通過(guò)第三結(jié)合位點(diǎn)產(chǎn)生的切割位點(diǎn)的切割產(chǎn)生；如上文所述，來(lái)自第三結(jié)合位點(diǎn)的延伸探針中的靶互補(bǔ)序列中的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)的序列可在第二切割位點(diǎn)處切割后保留在探針的(延伸)第一鏈的3’末端處。如果存在這種另外的序列，并且其互補(bǔ)于環(huán)中的第二結(jié)合位點(diǎn)的5’方向的另外的(例如，間插)序列，則將不存在空位。因此，環(huán)中的該另外的或間插序列可被設(shè)計(jì)為與第三結(jié)合位點(diǎn)中的序列同源(例如與其完全相同)，其切割位點(diǎn)的3’方向并且其在切割后保留在第二鏈的5’末端處。圖11和圖12中示出了這樣的構(gòu)造。然而，可替代地，即使是在這樣的實(shí)施方式中，探針也可以被設(shè)計(jì)成存在空位。如上文所述，任意這樣的空位需要被填充，從而用于進(jìn)行末端的連接。因此，這樣的間插序列或間隔子可用于將序列引入到環(huán)化的靶分子中，例如標(biāo)簽或檢測(cè)序列，例如，條形碼或鑒別(identificatory)基序，或用于檢測(cè)探針或引物的結(jié)合位點(diǎn)。事實(shí)上，形成探針的可環(huán)化的鏈的任何間插序列或間隔子都可以被用于向環(huán)化的靶分子中引入序列，例如上文中所述的標(biāo)簽或檢測(cè)序列。可出于不同需要/目的來(lái)設(shè)計(jì)標(biāo)簽(例如條形碼/基序或探針/引物結(jié)合位點(diǎn))，例如用于引入通用或共有序列，從而使不同的環(huán)化靶分子能夠以多倍方式一起處理，例如引入用于通用或共有擴(kuò)增引物的結(jié)合位點(diǎn)。這將使不同的環(huán)化靶序列能夠被一起擴(kuò)增，例如，通過(guò)pcr或rca以文庫(kù)擴(kuò)增的方式?？商娲鼗蛄硗猓瑯?biāo)簽/條形碼序列可用于“標(biāo)記”不同的環(huán)化片段，使得它們可被容易地彼此(即，“靶”標(biāo)簽或標(biāo)志物)區(qū)分，或給不同的樣品加標(biāo)簽等，從而可將它們合并，之后一起進(jìn)行共有/通用擴(kuò)增(即，“樣品”標(biāo)簽或標(biāo)志物)。因此，在多倍設(shè)定中，不同探針(即，不同靶roi的探針)可以具有不同的標(biāo)簽序列(例如，不同的標(biāo)志物或檢測(cè)序列)和/或它們可以具有相同的(多個(gè))標(biāo)簽序列，例如，用于引入共有或通用序列。這樣的標(biāo)簽也可以通過(guò)設(shè)計(jì)莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖序列以包含能夠用作標(biāo)簽或檢測(cè)序列的序列而被結(jié)合到環(huán)化的鏈中。如上文所述，在一些實(shí)施方式中，可以僅將標(biāo)簽結(jié)合到第一莖序列中。如上文中所提到的，空位填充可通過(guò)延伸靶片段的雜交的3’末端，或更常用地通過(guò)使一個(gè)或多個(gè)空位寡核苷酸雜交到空位中來(lái)進(jìn)行。空位寡核苷酸可以作為探針的一部分提供，例如，預(yù)雜交至探針，之后與靶核酸接觸，或其可以在探針與靶核酸接觸的同時(shí)或基本同時(shí)提供，或其可以在之后的任意時(shí)間加入，例如，在探針雜交之后，或在切割之后。因此，空位寡核苷酸可以被視為檢測(cè)、標(biāo)簽、條形碼或id基序寡核苷酸等。如在下文中將要具體描述的，空位寡核苷酸可包含不與間插序列或間隔子互補(bǔ)或者不與間插序列或間隔子雜交的區(qū)域，使得當(dāng)其雜交時(shí)，其含有其中引入了標(biāo)簽、條形碼、或id基序序列等的非雜交的環(huán)。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，引入到本發(fā)明探針中的間插或間隔序列可包含捕獲或“錨定”序列元件。這樣的元件可以在任意位點(diǎn)之間與檢測(cè)/id元件組合。例如，捕獲元件可存在于第一靶結(jié)合位點(diǎn)和莖環(huán)結(jié)構(gòu)之間，位于莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖或環(huán)中，和/或莖環(huán)結(jié)構(gòu)的5’方向(即，在5’單鏈區(qū)域中)。這樣的捕獲元件可以與莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖或環(huán)中的檢測(cè)/id元件組合。在一些實(shí)施方式中，這樣的捕獲元件將位于第一靶結(jié)合位點(diǎn)和莖環(huán)結(jié)構(gòu)之間。在一個(gè)替代的實(shí)施方式中，這樣的捕獲元件將位于莖環(huán)結(jié)構(gòu)的5’方向。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，當(dāng)探針包含莖環(huán)結(jié)構(gòu)的5’方向的第三結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，通過(guò)間隔序列將其從莖的5’末端隔離，間隔序列可以是捕獲序列元件。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，捕獲元件可以位于第三結(jié)合位點(diǎn)的5’方向或莖序列的5’方向(如果不存在第三結(jié)合位點(diǎn))。這樣的捕獲或錨定元件可被設(shè)計(jì)為雜交至同源互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)(即，“誘餌(bait)”序列)，例如在固相支持物上提供的或原位固定的(例如，如上文所述固定在靶核酸上)，以使探針和/或靶片段能夠被固定。因此，這可使該方法能夠以一個(gè)或多個(gè)步驟在固相體上進(jìn)行，例如探針可在在雜交至靶分子之前或之后，或者在切割步驟之前或之后被固定。有利地，捕獲或錨定元件可用于原位實(shí)施方式，例如，用于靶核酸分子的定位檢測(cè)。在一些實(shí)施方式中，捕獲或錨定元件可以位于第三結(jié)合位點(diǎn)中。換言之，第三結(jié)合位點(diǎn)可以包含捕獲序列。在這種情形下，捕獲/錨定序列可在切割位點(diǎn)(即，其可以在切割位點(diǎn)的3’方向)內(nèi)部，以使其在切割(例如，在第二鏈的5’末端處)后保留在探針中。如上文所述，當(dāng)捕獲或錨定序列用于定位環(huán)化鏈的rca擴(kuò)增的rca產(chǎn)物時(shí)，這可以是有用的，其中第二鏈作為擴(kuò)增引物。這也示于圖11和圖12，其中示出了探針的單鏈5’區(qū)域中的捕獲序列，其位于切割位點(diǎn)的內(nèi)部(3’)。因此，(多個(gè))間插或間隔序列可以含有或攜帶元件，通過(guò)該元件靶片段可被檢測(cè)或分離，例如，鑒定或擴(kuò)增或捕獲?！昂谢驍y帶”意指這樣的元件可以被包含在寡核苷酸的核苷酸序列中，例如，序列標(biāo)簽(例如，其可用于鑒定靶片段)或者基于探針或引物結(jié)合位點(diǎn)或其它核酸的親和結(jié)合位點(diǎn)(例如，雜交探針或dna結(jié)合蛋白等的結(jié)合位點(diǎn)，該結(jié)合位點(diǎn)可被視為捕獲或檢測(cè)元件(這取決于探針和親和結(jié)合元件的性質(zhì))，或者測(cè)序引物的結(jié)合位點(diǎn)，該測(cè)序引物的結(jié)合位點(diǎn)因此可被視為檢測(cè)元件，或擴(kuò)增引物的結(jié)合位點(diǎn)，該擴(kuò)增引物結(jié)合位點(diǎn)因此可被視為擴(kuò)增元件)可被包含在寡核苷酸的核苷酸序列中?；蛘?，其可以以任何與間插序列或間隔子連接或偶合或共軛的方式來(lái)附接或聯(lián)合。例如，它可以是功能性部分(例如，化學(xué)基團(tuán)或分子)，其附接(等)至寡核苷酸，例如固定部分或檢測(cè)部分(例如，報(bào)告子或標(biāo)記物)。例如，固定部分可以是親和結(jié)合部分或基團(tuán)，例如，親和結(jié)合對(duì)的一個(gè)成員(即，親和配體，例如，生物素或半抗原)，其附接或共軛(等)至所述寡核苷酸，并且能夠結(jié)合至親和結(jié)合對(duì)的其它成員(即，其同源結(jié)合伴侶，例如，鏈霉親和素或抗體)，目的是捕獲或分離，例如，當(dāng)同源結(jié)合伴侶附接至固相體時(shí)。如上所述這樣的附接或共軛部分(即，用于捕獲和/或檢測(cè)的功能性部分)不一定需要附接至間插序列或間隔子，但是可以在探針的不同部分中提供(即，附接或共軛于探針的不同部分)，例如，結(jié)合位點(diǎn)。具體地，功能性部分(例如，親和配體或結(jié)合伴侶)可以被提供附接至探針的第二鏈，或?qū)?huì)形成第二鏈的探針的一部分。在一個(gè)實(shí)施方式中，該功能性部分可以在探針(或探針的第二鏈)的5’末端處附接，例如其可以在或在第三結(jié)合位點(diǎn)處附接或附接至第三結(jié)合位點(diǎn)，并且尤其是附接至具有包含第三結(jié)合位點(diǎn)的單鏈5’區(qū)的探針的5’末端。這樣的安排可以方便地用來(lái)除去未反應(yīng)的探針，例如，如圖11和12中所示。除去未反應(yīng)的探針以減少或防止(例如，最小化)背景是合乎需要的。例如，未反應(yīng)的探針(如果存在的話)可反應(yīng)以引起(prime)不希望的反應(yīng)，例如它們會(huì)雜交至rca產(chǎn)物或者會(huì)在rca產(chǎn)物上引起延伸，該rca產(chǎn)物是由環(huán)化的延伸鏈的rca擴(kuò)增(例如，潛在地導(dǎo)致超支化反應(yīng)產(chǎn)物)產(chǎn)生的。為了除去未反應(yīng)的探針，在探針的5’末端，尤其是在包含第三結(jié)合位點(diǎn)的5’單鏈區(qū)域的5’末端處，提供親和結(jié)合伴侶或配體(例如，生物素)，其能夠結(jié)合至同源結(jié)合伴侶(例如，鏈霉親和素)。因此，親和結(jié)合伴侶為由第三結(jié)合位點(diǎn)產(chǎn)生的切割位點(diǎn)的5’方向，并且可以通過(guò)在第三結(jié)合位點(diǎn)處的切割從探針中除去或分離。因此，尚未結(jié)合至靶分子且尚未延伸和切割的任意探針將保留親和基團(tuán)。已結(jié)合至靶且已經(jīng)延伸的探針(即，反應(yīng)的探針)將通過(guò)在(由第三結(jié)合位點(diǎn)產(chǎn)生的)第二切割位點(diǎn)處的切割被切割，并且因此不保留親和基團(tuán)(換言之，親和基團(tuán)將通過(guò)第二切割被除去或者從反應(yīng)的探針中失去)。因此，未反應(yīng)的探針可通過(guò)親和基團(tuán)從反應(yīng)的探針中選擇性分離，親和基團(tuán)僅被保留在未反應(yīng)的探針上，但其通過(guò)反應(yīng)的探針中的切割被除去。因此，為了分離未反應(yīng)的探針(例如，未結(jié)合的探針，從未結(jié)合至靶的意義上來(lái)說(shuō))，探針可通過(guò)探針與同源親和基團(tuán)(例如，鏈霉親和素)的結(jié)合而被分離，其允許同源親和基團(tuán)結(jié)合的探針與已喪失親和基團(tuán)的未反應(yīng)的探針?lè)蛛x。方便地，這可以通過(guò)在固相支持物上提供同源親和基團(tuán)來(lái)實(shí)現(xiàn)。因此，探針中提供的親和基團(tuán)(即，親和結(jié)合伴侶或配體)可以是可固定化的基團(tuán)，即，“固定元件”，并且尤其是可固定化的基團(tuán)，其能夠結(jié)合至固相支持物上提供的同源親和基團(tuán)。以這種方式除去未反應(yīng)探針的步驟可在該方法中以不同方式、或在不同的時(shí)間或點(diǎn)進(jìn)行。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，可在步驟(e)之后，例如在探針的切割和重排之后，或者在連接至環(huán)化重排的探針之后(例如，在步驟(f)之后)，通過(guò)與同源親和基團(tuán)(例如，在固相支持物上)接觸來(lái)除去未反應(yīng)的探針?；蛘撸稍诓襟E(e)之前進(jìn)行，以使反應(yīng)的和未反應(yīng)的探針均結(jié)合至同源親和基團(tuán)(例如，通過(guò)結(jié)合至固相支持物上的同源親和基團(tuán)從溶液中除去，或者更簡(jiǎn)化地，將探針結(jié)合至固相支持物)，并且在步驟(e)中通過(guò)在第二切割位點(diǎn)處切割延伸的探針從同源親和基團(tuán)中釋放反應(yīng)的探針(例如，釋放到溶液中，或者從固相支持物中釋放)。在某些實(shí)施方式中，如上文所述，用于除去未反應(yīng)探針的這樣的捕獲部分可與另外的單獨(dú)的用于擴(kuò)增產(chǎn)物定位的錨定序列組合。例如這樣的捕獲部分和錨定序列可在第三結(jié)合位點(diǎn)中提供，其中錨定序列位于由第三結(jié)合位點(diǎn)提供的切割位點(diǎn)的內(nèi)部(例如，該切割位點(diǎn)內(nèi)部或切割位點(diǎn)的’方向)。更具體地，第三結(jié)合位點(diǎn)可在探針的5’單鏈區(qū)域中，例如在圖11和圖12中所示出的。如上文所討論的，以該方式在探針中提供的親和基團(tuán)可以是(例如)生物素或者能夠結(jié)合至同源親和基團(tuán)的任何配體，例如抗體的半抗原等。檢測(cè)元件可以(例如)包括鑒定元件，即允許或準(zhǔn)許鑒定(例如)特定的靶roi或樣品(例如當(dāng)樣品被合并時(shí))，或者鑒定實(shí)際上為樣品中的靶核酸分子的元件。這樣的鑒定元件或id標(biāo)簽或基序可簡(jiǎn)單地為序列標(biāo)簽或基序，例如，特定的或唯一的核苷酸序列。因此，其可被視為序列標(biāo)志物。這種序列標(biāo)簽/基序或標(biāo)志物的設(shè)計(jì)是本領(lǐng)域中眾所周知的。例如用作標(biāo)簽的條形碼序列/基序在本領(lǐng)域中被廣泛使用和熟知，用于標(biāo)識(shí)樣品或分子等。降解序列可被用作這種標(biāo)簽的基礎(chǔ)，并且以這種方式使用降解序列基序也是本領(lǐng)域中已知的?？梢园ù罅坎煌臉?biāo)簽來(lái)標(biāo)記或標(biāo)識(shí)靶核酸分子或roi的不同方面。例如，可以包括標(biāo)簽(例如條形碼基序)作為樣品標(biāo)簽，連同用于特定靶roi的標(biāo)簽，探針被設(shè)計(jì)成選擇性用于該特定靶roi的標(biāo)簽。有利地，“分子”標(biāo)簽可被用于標(biāo)記或標(biāo)識(shí)(即，鑒定)樣品中的單個(gè)分子，例如，樣品的原始分子的初始互補(bǔ)序列。這在測(cè)序情況下，并且尤其是在ngs技術(shù)中，是特別有利的，其中追蹤回到用于測(cè)序的擴(kuò)增的原始分子的序列讀取是有價(jià)值的。因此可見(jiàn)，各種類型的鑒定元件或標(biāo)簽可以單獨(dú)使用或組合使用。序列標(biāo)簽或條形碼可以在長(zhǎng)度為20個(gè)核苷酸的區(qū)域中，例如7至30個(gè)核苷酸，例如，7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個(gè)核苷酸。序列標(biāo)簽或條形碼可隨機(jī)產(chǎn)生，例如一組序列標(biāo)簽可包含具有標(biāo)簽序列中核苷酸總數(shù)的所有可能的序列組合的標(biāo)簽。因此，探針可含有樣品序列標(biāo)簽，例如，允許用于在特定樣品中實(shí)施的本發(fā)明方法中的探針與在不同樣品上實(shí)施的該方法中使用的探針區(qū)別開并且從而允許鑒定從其中給定靶片段(即，靶序列的互補(bǔ)序列)已被環(huán)化的樣品的特征。標(biāo)簽樣品允許鑒定樣品，特定靶片段及因此roi來(lái)源于該樣品。例如，樣品可以對(duì)應(yīng)于患者樣品。如果以多倍形式進(jìn)行該方法以用于檢測(cè)來(lái)自不同樣品的許多不同靶roi，則每個(gè)探針中可以包括單獨(dú)的樣品和“靶”標(biāo)簽。利用本發(fā)明的方法和探針，這種特征有利地允許合并樣品，例如在與探針接觸以及探針與標(biāo)識(shí)的每個(gè)樣品連接之后，可將不同的樣品合并。如上文所述，檢測(cè)元件也可以是包含在寡核苷酸序列中的結(jié)合位點(diǎn)(例如，檢測(cè)探針或部分的結(jié)合位點(diǎn)，或者在檢測(cè)反應(yīng)中使用的引物的結(jié)合位點(diǎn)，例如測(cè)序引物)或者其可以是通過(guò)寡核苷酸以任何方式攜帶的檢測(cè)部分，例如報(bào)告子基團(tuán)或部分或標(biāo)記物，其可以直接或間接發(fā)出信號(hào)。例如，其可以是可見(jiàn)的標(biāo)記物，例如彩色的或熒光的或顆粒狀標(biāo)記物，或者可以是促使或參與信號(hào)發(fā)出反應(yīng)的部分，例如親和結(jié)合伴侶或配體或者酶的底物或輔因子。捕獲元件可以是用于擴(kuò)增和/或捕獲環(huán)化靶片段的任意元件。"擴(kuò)增元件"可用于擴(kuò)增環(huán)化靶片段(即，含有靶roi的互補(bǔ)序列的探針的環(huán)化鏈)。其通常為擴(kuò)增引物結(jié)合位點(diǎn)。其也可以是許多擴(kuò)增因素或一組(例如一對(duì))擴(kuò)增引物之一的結(jié)合位點(diǎn)，例如以允許指數(shù)擴(kuò)增，例如pcr引物或用于基于pcr程序的引物。該引物結(jié)合位點(diǎn)也可以用于測(cè)序引物的結(jié)合。"捕獲元件"可以是探針?biāo)鶖y帶(例如附接或共軛于)的任何部分，或者探針的序列的任何特征(例如，結(jié)合位點(diǎn)、間隔序列)，其可以潛在地用于將延伸的探針(例如，含有靶片段的互補(bǔ)序列的環(huán)化探針)選擇性附接至固相體或支持物，包括例如顆粒(例如磁珠)，和/或原位。因此，捕獲元件可以被看作是"固定元件"。延伸的探針，例如，由本發(fā)明方法產(chǎn)生的探針的環(huán)化鏈可被直接固定或捕獲，例如，通過(guò)雜交至環(huán)化鏈中的序列的捕獲元件，例如固定的引物或可被固定的連接模板鏈，即，在一些實(shí)施方式中，連接模板鏈含有捕獲元件。或者，延伸的探針可被直接固定或捕獲，例如，通過(guò)結(jié)合至連接模板鏈中的結(jié)合位點(diǎn)的捕獲元件，其中該連接模板鏈結(jié)合至環(huán)化鏈。這樣的元件的大量實(shí)例是本領(lǐng)域中已知的，并且包括(例如)能夠結(jié)合至其結(jié)合伴侶(即，同源結(jié)合伴侶，例如，鏈霉親和素或抗生物素蛋白，或抗體，在固相體或支持物上提供)的親和結(jié)合伴侶(例如，生物素或半抗原)。捕獲元件可以是在固相支持物上提供的具有互補(bǔ)于相應(yīng)的“結(jié)合”或“報(bào)告子”寡核苷酸或核苷酸序列的核苷酸序列，或者可以是附接(等)至寡核苷酸的功能性部分(例如，化學(xué)基團(tuán)或分子)，例如，生物素或半抗原。探針和固相體之間的相互作用(例如，通過(guò)固定結(jié)合或報(bào)告子寡核苷酸，或結(jié)合伴侶例如鏈霉親和素或抗體)可以尤其通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)(clickchemistry)來(lái)介導(dǎo)(kolbhc等人,angewchemintedengl.2001年6月1日；40(11):2004-2021)。如上文中所討論的，除了用于捕獲延伸的探針的捕獲元件，該探針也可替代地或另外地具有用于捕獲和選擇性除去未反應(yīng)的探針的(獨(dú)立)捕獲元件。該固相體可以是目前被廣泛使用或建議用于固定、分離等的公知的支持物或基質(zhì)。這些固相體可為顆粒(例如，可為磁珠、順磁珠或非磁珠)、片、凝膠、過(guò)濾器、膜、纖維、毛細(xì)管或微孔板、管、板或孔等的形式。該支持物可由玻璃、二氧化硅、膠乳和聚合物材料制成。適合的材料表現(xiàn)出用于結(jié)合分析物的較大表面積。這樣的支持物具有不規(guī)則的表明，并且可以(例如)是多孔的或顆粒狀的，例如，顆粒、纖維、網(wǎng)狀物、熔結(jié)物或篩網(wǎng)。可以使用顆粒狀材料(例如微珠(bead))因?yàn)槠渚哂休^大的結(jié)合能力，尤其是聚合物微珠。方便地，根據(jù)本發(fā)明使用的顆粒狀固相支持物將包含球形微珠。微珠的尺寸不是關(guān)鍵因素，但其可(例如)大約是直徑為至少1μm且優(yōu)選至少2μm，并且具有優(yōu)選不超過(guò)10μm，并且例如不超過(guò)6μm的最大直徑。單分散性顆粒的尺寸基本上是均勻的(例如尺寸的直徑標(biāo)準(zhǔn)差小于5％)，具有這樣的優(yōu)點(diǎn)：其提供非常均勻的反應(yīng)再現(xiàn)性。例如，為了輔助操作和分離，磁珠或順磁珠是有利的。其它固相支持物包括非常小的顆粒，其能夠有效地接觸大比例的可固定化的寡核苷酸。這樣的顆?？蛇M(jìn)一步通過(guò)阻礙顆粒附接的靶片段(即，靶片段互補(bǔ)序列)通過(guò)凝膠的運(yùn)動(dòng)來(lái)使用，以允許從游離的非顆粒附接的(非靶)片段分離。或者，還優(yōu)選使用由可與探針中的捕獲元件共價(jià)地反應(yīng)或非共價(jià)地反應(yīng)的基團(tuán)修飾的色譜基質(zhì)。如上文所述，可被雜交至位于莖環(huán)結(jié)構(gòu)的第二結(jié)合位點(diǎn)與第二莖序列之間的間插序列或間隔子的“空位”寡核苷酸含有互補(bǔ)于間插序列或間隔子的的序列的區(qū)域，該區(qū)域可被不與該間插序列或間隔子互補(bǔ)的序列隔離。因此，互補(bǔ)于間插序列或間隔子的序列的兩個(gè)區(qū)域位于互補(bǔ)寡核苷酸的兩端，和位于不與間插序列互補(bǔ)的寡核苷酸中的區(qū)域旁側(cè)。因此，不與該將插序列互補(bǔ)的序列形成環(huán)或凸出，并且可包含標(biāo)簽，例如條形碼序列等，例如，用于鑒定所選的靶roi。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的探針包含發(fā)夾結(jié)構(gòu)，即，莖環(huán)結(jié)構(gòu)，其包含第二結(jié)合位點(diǎn)。有必要使探針展開以打開環(huán)，這可在延伸步驟之前、期間或之后，在第二結(jié)合位點(diǎn)可成為可用并且模板化探針的延伸鏈的連接之前進(jìn)行。因此，發(fā)夾的環(huán)可以含有結(jié)合位點(diǎn)，以使直到探針已經(jīng)被打開以釋放該第二結(jié)合位點(diǎn)，其才可用于在探針的延伸鏈(可環(huán)化的鏈)的3’末端處或朝向3’末端雜交至其互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)。發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可被稱為發(fā)夾環(huán)或莖環(huán)，并且這些術(shù)語(yǔ)在本文中可以互換使用。發(fā)夾是一種分子內(nèi)堿基配對(duì)的模式，其能夠在單鏈dna或rna分子中出現(xiàn)。當(dāng)同一鏈的兩個(gè)區(qū)域，通常在以相反方向讀取時(shí)在核苷酸序列中互補(bǔ)的堿基對(duì)形成終止于未配對(duì)的(即單鏈)環(huán)的雙螺旋(雙鏈體)時(shí)出現(xiàn)發(fā)夾。所得到的結(jié)構(gòu)可被描述為棒棒糖形。發(fā)夾可通過(guò)切割被展開或者“打開”，例如，在環(huán)中或者環(huán)附近，例如在莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖或環(huán)中，其中切割發(fā)生在第二結(jié)合位點(diǎn)的3’方向。如上文所述，當(dāng)發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖或環(huán)被切割時(shí)，在(至少部分的)打開的結(jié)構(gòu)中保留了探針的雙鏈元件，即，莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖，從而第一鏈包含延伸的鏈(即，可環(huán)化的鏈，含有靶核酸分子的互補(bǔ)序列和任意可選的間插序列或間隔子)，且打開的發(fā)夾的第二鏈(連接模板鏈)包含第二結(jié)合位點(diǎn)和任意可選的另外的間插序列或間隔子元件。因此，切割位點(diǎn)必須位于探針中以使當(dāng)發(fā)生切割時(shí)發(fā)夾能夠打開同時(shí)保留足夠量的莖結(jié)構(gòu)是顯而易見(jiàn)的，足夠量的莖結(jié)構(gòu)允許延伸的(可環(huán)化的)鏈在本發(fā)明的條件下保持其與連接模板鏈的相互作用，即，切割位點(diǎn)的位置必須使發(fā)夾能夠打開并且使探針形成部分雙鏈分子。wo2012/152942中提供了可用于展開發(fā)夾結(jié)構(gòu)的技術(shù)的討論，其全部?jī)?nèi)容以引用方式并入本文中。如下文所討論的，切割優(yōu)選為酶切。在一些實(shí)施方式中，發(fā)夾(莖環(huán))結(jié)構(gòu)的莖包含切割位點(diǎn)(參見(jiàn)，例如，分別記載于實(shí)施例1～3中的探針excirc_2(seqidno:2)、excirc_htert(seqidno:7)和excirc_mir208(seqidno:11))。優(yōu)選地，發(fā)夾的莖中的切割位點(diǎn)(例如，切割識(shí)別位點(diǎn))位于莖序列(第一莖序列)的第一鏈的5’末端處或朝向5’末端，并且優(yōu)選地切割將發(fā)生在莖序列的第一鏈的5’末端處或朝向5’末端。因此，在一些實(shí)施方式中，莖中的切割位點(diǎn)鄰近環(huán)。因此，在切割之后，只有部分的或者一部分原始莖序列將被保留在雙鏈體中，即，在雙鏈體中必須保留足夠量的莖序列以使延伸的(可環(huán)化的)鏈和連接模板鏈能夠形成部分雙鏈的分子。在其中切割位點(diǎn)位于莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖中的實(shí)施方式中，切割必須僅在莖的單鏈中發(fā)生，即，莖的第一鏈(將形成可環(huán)化的鏈的部分的莖的部分)。因此，在一些實(shí)施方式中，莖中的切割位點(diǎn)為切口酶切割位點(diǎn)，即，由下文所討論的切口酶識(shí)別的切割位點(diǎn)，其中該切口酶切割莖環(huán)結(jié)構(gòu)的第一莖序列。在一些實(shí)施方式中，當(dāng)切割位點(diǎn)位于莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖中時(shí)，莖(第一莖序列)的切割可不會(huì)直接或立即導(dǎo)致發(fā)夾展開，例如，甚至是在單鏈切割時(shí)，雙鏈體在反應(yīng)的條件下也可以是穩(wěn)定的。然而，在探針的分子內(nèi)重排時(shí)，發(fā)夾可展開，其中延伸鏈的3’末端和第二結(jié)合位點(diǎn)之間的相互作用比莖序列在莖的“環(huán)端”處的相互作用更加穩(wěn)定(即，熱力學(xué)上更加有利)。換言之，延伸鏈的3’末端可被視為置換了切割的第一莖鏈的3’末端。在一些實(shí)施方式中，發(fā)夾(莖環(huán))結(jié)構(gòu)的環(huán)包含切割位點(diǎn)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，環(huán)中的切割位點(diǎn)緊鄰于莖。在一些實(shí)施方式中，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的環(huán)可以包含分子內(nèi)互補(bǔ)序列的區(qū)域，以使其能夠在環(huán)中形成雙鏈體，即，該環(huán)含有由該環(huán)形成突出的雙鏈區(qū)域(雙鏈體)并且因此區(qū)別于發(fā)夾結(jié)構(gòu)的“莖”。環(huán)的內(nèi)部雙鏈體可以包含切割位點(diǎn)，例如，限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，其中在環(huán)中切割雙鏈體導(dǎo)致發(fā)夾結(jié)構(gòu)的展開(參見(jiàn)，例如，實(shí)施例1中的探針excirc_1(seqidno:1))。因此，在一些實(shí)施方式中，位于第二結(jié)合位點(diǎn)3’的間插序列或間隔子(更具體地在第一莖序列和第二結(jié)合位點(diǎn)之間)可以含有分子內(nèi)互補(bǔ)序列的區(qū)域。在環(huán)的內(nèi)部雙鏈體中具有切割位點(diǎn)的這種實(shí)施方式中，內(nèi)部雙鏈體的兩條鏈都可被切割。在一些實(shí)施方式中，環(huán)中的內(nèi)部雙鏈體含有mlyi切割位點(diǎn)。該切割位點(diǎn)(例如，mlyi切割位點(diǎn))可被設(shè)置以允許以這種方式切割除去內(nèi)部環(huán)。這在圖12中示出。切割可留下在莖中雜交的延伸的第一鏈的5’末端，其通過(guò)切割被釋放。在本文中被廣義定義的"切割"包括破壞或破除核苷酸鏈(即，核苷酸序列)的任何方式。因此，切割可包括破壞共價(jià)鍵。通常，切割包括核苷酸鏈的切割(即，鏈切割或鏈切斷)，例如通過(guò)切割磷酸二酯鍵。如下文所述，探針的莖環(huán)結(jié)構(gòu)中切割位點(diǎn)的切割(例如，在莖或環(huán)中)可以通過(guò)任意常規(guī)手段來(lái)實(shí)現(xiàn)，但優(yōu)選酶切。例如，發(fā)夾結(jié)構(gòu)可包含或者可被設(shè)計(jì)或修飾為包含限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，例如，當(dāng)發(fā)夾結(jié)構(gòu)包含限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)時(shí)，該限制性核酸內(nèi)切酶將僅切割發(fā)夾結(jié)構(gòu)的雙鏈體部分的單鏈。例如，這可以通過(guò)使寡核苷酸(在本文中被稱為“限制性寡核苷酸”)雜交至發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈環(huán)從而在環(huán)中包含雙鏈體來(lái)實(shí)現(xiàn)。至少部分所形成的雙鏈體將包含限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，其可被切割導(dǎo)致發(fā)夾結(jié)構(gòu)展開?？梢允褂萌魏魏线m的限制性核酸內(nèi)切酶來(lái)展開發(fā)夾結(jié)構(gòu)。在其它的實(shí)施方式中，切割可包括破壞核酸序列中的一個(gè)或多個(gè)核苷酸中的共價(jià)鍵。在一些實(shí)施方式中，可以通過(guò)將一個(gè)或多個(gè)尿嘧啶殘基結(jié)合到莖和/或環(huán)序列中來(lái)創(chuàng)建切割位點(diǎn)。在尤其優(yōu)選的實(shí)施方式中，可通過(guò)用尿嘧啶dna糖基化酶(ung)與核酸內(nèi)切酶組合進(jìn)行處理來(lái)展開發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其中核酸內(nèi)切酶能夠識(shí)別dsdna的無(wú)嘌呤/無(wú)嘧啶(ap)位點(diǎn)，例如，核酸內(nèi)切酶iv。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，可以利用切口酶來(lái)切割，并且從而展開發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其中該切口酶僅切割發(fā)夾結(jié)構(gòu)的雙鏈體中的一條鏈。切口酶是僅切割dna雙鏈體的單鏈的核酸內(nèi)切酶。如上文所述，可將切割位點(diǎn)引入到發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈環(huán)中，例如，通過(guò)退火(雜交)寡核苷酸至所述環(huán)。在一些實(shí)施方式中，莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖包含切口酶切割位點(diǎn)。一些切口酶通過(guò)結(jié)合至并識(shí)別特定的核苷酸識(shí)別序列而僅在dna分子上的特定位點(diǎn)處引入單鏈切口(nick)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量天然存在的切口酶，根據(jù)存在的序列識(shí)別性質(zhì)，將其確定為至少四類。美國(guó)專利6,867,028中描述了切口酶，其全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用并入本文中，并且任何適合的切口酶都可用于本發(fā)明的方法中。在使用切口酶的一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，在探針展開之后從測(cè)定除去切口酶或使切口酶失活，以防止產(chǎn)生連接產(chǎn)物的不希望的切割。如上文所討論的，本發(fā)明的方法中使用的探針至少包含第一靶結(jié)合位點(diǎn)，其互補(bǔ)于靶核酸分子中的靶roi側(cè)翼的3’旁側(cè)序列。本文中使用的“互補(bǔ)”是指功能性互補(bǔ)(即，能夠介導(dǎo)雜交)，而不需指代兩個(gè)核酸分子之間的100％互補(bǔ)。根據(jù)本發(fā)明的雜交包括通過(guò)沃森-克里克型堿基配對(duì)或通過(guò)任何類似的堿基配對(duì)在彼此充分互補(bǔ)的核苷酸序列之間形成形成雙鏈體。雜交是富有成效的(productive)雜交，即雜交對(duì)于能夠?qū)嵤┢涔δ艿奶结樖亲銐蚍€(wěn)定的或者足夠堅(jiān)固的，例如，對(duì)于待從樣品中分離的探針/靶分子雜交體，或者對(duì)于創(chuàng)建待切割的切割位點(diǎn)，以及對(duì)于能夠通過(guò)連接而環(huán)化的靶片段。因此，在適當(dāng)?shù)碾s交條件下，互補(bǔ)核苷酸序列將與特異性組合以形成穩(wěn)定的雙鏈體。例如，當(dāng)?shù)谝恍蛄械囊徊糠挚稍诜聪蚱叫械囊饬x上結(jié)合至第二序列的一部分時(shí)，兩條序列是互補(bǔ)的，其中每個(gè)序列的3'-端結(jié)合至另一序列的5'-端，并且隨后每條序列的每個(gè)a、t(u)、g和c分別與另一條序列的t(u)、a、c和g對(duì)齊。rna序列也可以包括互補(bǔ)g＝u或u＝g堿基對(duì)。因此，在本發(fā)明中，兩條序列不需要具有成為"互補(bǔ)"的完美同源性。通常，當(dāng)至少約85％(優(yōu)選至少約90％，并且最優(yōu)選至少約95％)的核苷酸在分子的既定長(zhǎng)度上共有堿基對(duì)結(jié)構(gòu)，兩個(gè)序列就是充分互補(bǔ)的。如上文所討論的，探針包含至少一個(gè)與靶核酸分子的區(qū)域同源并且能夠雜交至這樣的序列的互補(bǔ)序列的結(jié)合位點(diǎn)。顯然，與靶核酸分子的區(qū)域具有同源性的探針的結(jié)合位點(diǎn)的序列不需要為了能夠雜交至其互補(bǔ)序列而與該靶核酸分子的序列完全相同。因此，當(dāng)實(shí)際上相同時(shí)，結(jié)合位點(diǎn)可被視為同源于靶分子中的相應(yīng)區(qū)域。例如，結(jié)合位點(diǎn)可與靶核酸分子的區(qū)域共有至少75％的序列同一性，或至少80％、85％或90％的同一性。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，結(jié)合位點(diǎn)與靶核酸分子的區(qū)域具有至少95％的同一性，例如96％、97％、98％或99％的同一性。在又一實(shí)施方式中，結(jié)合位點(diǎn)與靶核酸分子的區(qū)域具有100％的同一性。尤其是，第二結(jié)合位點(diǎn)的序列可以不與5’旁側(cè)序列完全相同，只要其能夠結(jié)合至5’旁側(cè)序列的互補(bǔ)序列即可。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，單個(gè)探針可以能夠從多個(gè)靶分子中選擇靶roi，其中靶分子在位于靶roi側(cè)翼的5’旁側(cè)序列中具有一定程度的序列可變性，或者其中5’旁側(cè)序列的序列并不是完全已知的。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在探針中適當(dāng)?shù)卦O(shè)計(jì)靶結(jié)合位點(diǎn)是常規(guī)事項(xiàng)，例如，考慮位點(diǎn)的長(zhǎng)度、g/c含量和tm等。通常，靶結(jié)合位點(diǎn)的長(zhǎng)度為至少5個(gè)核苷酸長(zhǎng)，更典型地長(zhǎng)度為至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40或50個(gè)核苷酸或任意這些數(shù)值之間或多達(dá)或高于任意這些數(shù)值的任何整數(shù)。為了使延伸鏈在本發(fā)明方法的(f)部分中經(jīng)歷直接或間接連接，延伸鏈(即，含有5’旁側(cè)序列的互補(bǔ)序列的可環(huán)化的鏈)的3’末端必須能夠雜交至第二結(jié)合位點(diǎn)。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，當(dāng)靶roi側(cè)翼的5’旁側(cè)序列位于靶核酸分子的5’末端時(shí)，例如當(dāng)靶核酸分子為mirna或轉(zhuǎn)錄本時(shí)，延伸的探針的3’末端可在第二結(jié)合位點(diǎn)中完全雜交至其互補(bǔ)序列。然而，在一些實(shí)施方式中，靶roi的5’旁側(cè)序列可位于靶核酸分子的5’末端的內(nèi)部，并且可因此有必要在發(fā)生連接之前除去探針的延伸鏈的區(qū)域，該探針的延伸鏈的區(qū)域互補(bǔ)于緊鄰5’旁側(cè)序列的5’方向的區(qū)域(即，不互補(bǔ)于第二結(jié)合位點(diǎn)的延伸的探針的3’末端處的區(qū)域)?？赏ㄟ^(guò)任何適合的方式除去該序列，例如，利用3’核酸外切酶降解。因此，在當(dāng)5’旁側(cè)序列位于靶分子的5’末端內(nèi)部的實(shí)施方式中，上文所述的本發(fā)明的步驟(e)可包括：(i)在探針的莖環(huán)結(jié)構(gòu)中的切割位點(diǎn)處切割延伸的探針，以釋放包含第二結(jié)合位點(diǎn)的探針的3’末端，從而產(chǎn)生部分雙鏈的構(gòu)建體，其包含靶互補(bǔ)序列的第一延伸鏈和雜交至莖中的第一鏈且包含釋放的3’末端的的第二鏈；以及(ii)允許第二鏈中的釋放的3’末端中的第二結(jié)合位點(diǎn)雜交至第一鏈中的靶互補(bǔ)序列中的其互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，以使第一延伸鏈的5’末端與3’末端并置，其中第一鏈的3’末端處的另外的序列不發(fā)生雜交并且形成突出單鏈端；(iii)切割該突出單鏈端，以留下所述第一鏈的3’末端，其雜交至第二鏈的第二結(jié)合位點(diǎn)，以使第一延伸鏈的5’末端與3’末端并置，以用于利用第二結(jié)合位點(diǎn)作為連接模板直接或間接地彼此連接。如上文所討論的，本發(fā)明的探針可以包含另外的序列，其同源于靶分子中序列緊鄰5’旁側(cè)序列的5’方向并且包含在雜交至延伸的探針時(shí)能夠形成第二切割位點(diǎn)的序列。在探針?lè)肿友由熘?，延伸的探針可?jīng)歷分子內(nèi)雜交，其中第三結(jié)合位點(diǎn)雜交至靶互補(bǔ)序列中的其互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，從而產(chǎn)生第二切割位點(diǎn)。該切割位點(diǎn)這樣定位，以使5’旁側(cè)序列的3’方向的互補(bǔ)序列的序列在切割后被除去。如上文所討論的，該切割位點(diǎn)可以位于第三結(jié)合位點(diǎn)的3’末端處，或者可以位于第三結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)(即，位于不會(huì)除去互補(bǔ)于第三結(jié)合位點(diǎn)的序列整體的位置中)。在這種情況下，莖環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)可以包含這樣的序列：針對(duì)第三結(jié)合位點(diǎn)互補(bǔ)于來(lái)自靶互補(bǔ)序列中的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)的序列，該序列在第二結(jié)合位點(diǎn)處切割之后保留在探針的第一鏈的3’末端處。如上文所述，第二切割位點(diǎn)的切割(例如，在延伸的探針的3’末端處或朝向3’末端由第三結(jié)合位點(diǎn)和其互補(bǔ)區(qū)域的相互作用產(chǎn)生的)可通過(guò)任何常規(guī)方式實(shí)現(xiàn)，但優(yōu)選酶切。該切割也可以在切割莖環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)之前、同時(shí)或之后發(fā)生。因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，由延伸的探針的分子內(nèi)重排創(chuàng)建的第二切割位點(diǎn)(在靶核酸除去之后)代表切割識(shí)別位點(diǎn)，例如，被一種或多種能夠切割核酸分子的酶識(shí)別的序列。重排的探針中的該切割位點(diǎn)可以相同或者不同。任意適合的切割酶都可以用于切割第二切割位點(diǎn)以釋放包含第二結(jié)合位點(diǎn)的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)的第一鏈(可環(huán)化的鏈)的3’末端。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，第二切割位點(diǎn)是限制性位點(diǎn)。在該優(yōu)選的實(shí)施方式中，限制性核酸內(nèi)切酶將切割第二切割位點(diǎn)的兩條鏈。該核酸內(nèi)切酶可以可替代地切割單鏈，即延伸的鏈(可環(huán)化的鏈)。在又一優(yōu)選的實(shí)施方式中，第二切割位點(diǎn)為切口酶識(shí)別序列，其將第二雙鏈區(qū)域的延伸鏈的單鏈切割模板化。因此，延伸的探針鏈中的特異性位點(diǎn)處的酶切可釋放延伸鏈的3’末端，其互補(bǔ)于第二結(jié)合位點(diǎn)。在本發(fā)明的又一實(shí)施方式中，當(dāng)通過(guò)多種不同探針來(lái)選擇多種不同靶roi時(shí)，可以使用單一切割酶，或者多種不同的切割酶。在一個(gè)可替代的實(shí)施方式中，當(dāng)5’旁側(cè)序列位于靶核酸的5’末端內(nèi)部時(shí)，互補(bǔ)于第二結(jié)合位點(diǎn)的延伸的探針的區(qū)域可雜交至第二結(jié)合位點(diǎn)，以形成具有突出3’末端的環(huán)狀核酸構(gòu)建體(即，互補(bǔ)于5’旁側(cè)序列的5’方向的序列的序列)。具有3’→5’核酸外切酶活性的酶(例如，具有3’→5’核酸外切酶“校正(proofreading)”活性的聚合酶)可用于降解突出的3’末端，從而釋放延伸的探針的3’末端。在本發(fā)明實(shí)施方式中，其中探針具有部分雙鏈構(gòu)建體，該部分雙鏈構(gòu)建體包含第一鏈和第二鏈，第一鏈包含在其3’末端包括第一結(jié)合位點(diǎn)的單鏈3’末端區(qū)域，且第二鏈在第一鏈的5’末端處雜交并且包含包括第二結(jié)合位點(diǎn)的單鏈3’末端區(qū)域(或者，其中莖環(huán)探針在與靶分子接觸之前就被切割)，顯然并不需要在探針的延伸之后進(jìn)行切割以釋放第二結(jié)合位點(diǎn)。在這樣的實(shí)施方式中，一旦發(fā)生延伸，第二結(jié)合位點(diǎn)(即，第二鏈的3’末端)就可用于雜交至靶互補(bǔ)序列中的其互補(bǔ)序列(即，5’旁側(cè)序列的互補(bǔ)序列)。因此，在本發(fā)明某些實(shí)施方式中，其中5’旁側(cè)序列位于靶核酸分子的5’末端處，步驟(e)包括允許第二鏈中的第二結(jié)合位點(diǎn)雜交至延伸的第一鏈中的靶互補(bǔ)序列中的其互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，以使得第一延伸鏈的5’末端與3’末端并置，以用于利用第二鏈作為連接模板直接或間接地彼此連接。在本發(fā)明另外的實(shí)施方式中，其中5’旁側(cè)序列位于靶核酸分子的5’末端內(nèi)部，有必要在可發(fā)生連接之前除去探針的延伸鏈的區(qū)域，其互補(bǔ)于緊鄰5’旁側(cè)序列的5’方向的區(qū)域(即，不與第二結(jié)合位點(diǎn)互補(bǔ)的延伸的探針的3’末端處的區(qū)域)?？赏ㄟ^(guò)任何適合的方式除去該序列?？赏ㄟ^(guò)產(chǎn)生切割位點(diǎn)來(lái)實(shí)施除去互補(bǔ)于緊鄰5’旁側(cè)序列的5’方向的區(qū)域的延伸鏈區(qū)域，例如，通過(guò)使互補(bǔ)核酸分子雜交至緊鄰5’旁側(cè)序列的5’方向的切割序列。這可以作為獨(dú)立核酸分子(即，同源于靶核酸分子的一部分的分子)提供，或者可以作為探針中的另外序列提供。因此，在一個(gè)方面，探針的第二鏈可以進(jìn)一步包含第三結(jié)合位點(diǎn)，該第三結(jié)合位點(diǎn)同源于靶分子中緊鄰5’旁側(cè)序列的5’方向的切割序列并且能夠雜交至第一延伸鏈中的靶互補(bǔ)序列中的另外的序列中的所述切割序列，其為至5’旁側(cè)序列的3’方向的互補(bǔ)序列。第三結(jié)合位點(diǎn)可以位于第二結(jié)合位點(diǎn)的3’方向的第二鏈的單鏈3’區(qū)域中，或者可以位于第二鏈的另外的單鏈5’區(qū)域中，即，雙鏈區(qū)域的5’方向。因此，本發(fā)明方法的步驟(e)可以包括以下步驟：(i)允許延伸的探針經(jīng)歷分子內(nèi)雜交，其中第三結(jié)合位點(diǎn)雜交至靶互補(bǔ)序列中的其互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，從而產(chǎn)生切割位點(diǎn)；(ii)在該切割位點(diǎn)處切割所述雜交的探針，從而產(chǎn)生釋放的第一延伸鏈的3’末端；(iii)允許第二結(jié)合位點(diǎn)雜交至第一鏈中的靶互補(bǔ)序列中的其互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，以使第一延伸鏈的5’末端與釋放的3’末端并置，以用于利用第二結(jié)合位點(diǎn)作為連接模板直接或間接地彼此連接。在另一方面，探針可以包含第二結(jié)合位點(diǎn)的3’方向的另外的探針序列，其同源于靶核酸分子的3’旁側(cè)序列并且因此互補(bǔ)于第一結(jié)合位點(diǎn)。這樣的序列可以雜交至第一結(jié)合位點(diǎn)(或其一部分)之后延伸該探針，并且可被用于模板化延伸的探針與第二結(jié)合位點(diǎn)(其分別雜交至3’旁側(cè)序列和5’旁側(cè)序列)組合的環(huán)化。該另外的探針序列可以與第二結(jié)合位點(diǎn)部分重疊，或者換言之，第二結(jié)合位點(diǎn)可以包含同源于5’旁側(cè)序列的區(qū)域(其可以是roi的一部分)和同源于3’旁側(cè)序列的區(qū)域。當(dāng)?shù)诙Y(jié)合位點(diǎn)同源于roi(或roi的5’末端)時(shí)，并且能夠雜交至roi的互補(bǔ)序列時(shí)，這樣的探針可具有特定用途。因此，第二結(jié)合位點(diǎn)和另外的探針序列可形成互補(bǔ)于延伸的探針(靶互補(bǔ)序列)的3’末端的延伸區(qū)域。然而，當(dāng)?shù)诙Y(jié)合位點(diǎn)同源于靶核酸分子中的5’旁側(cè)序列時(shí)(即，當(dāng)?shù)诙Y(jié)合位點(diǎn)不與roi同源)時(shí)，上述探針也是有用的。3’和5’旁側(cè)序列的互補(bǔ)序列可以雜交至第二結(jié)合位點(diǎn)和另外的探針序列，其具有在3’和5’旁側(cè)區(qū)(即，roi)之間形成環(huán)的序列。因此，在本發(fā)明的又一實(shí)施方式中，探針可以包含位于第二結(jié)合位點(diǎn)的3’方向并且同源于3’旁側(cè)序列且互補(bǔ)于第一結(jié)合位點(diǎn)的另外的探針序列，其中當(dāng)所述探針包含莖環(huán)結(jié)構(gòu)時(shí)，所述另外的探針序列位于環(huán)中，或者當(dāng)所述探針為雙鏈構(gòu)建體時(shí)，該另外的探針序列位于第二鏈的3’末端處；并且其中在本發(fā)明方法的步驟(e)中，該另外的探針序列雜交至第一結(jié)合位點(diǎn)并且與第二結(jié)合位點(diǎn)一起作為連接模板。如上文所討論的，第二結(jié)合位點(diǎn)模板化所述連接以及由此的延伸的鏈(可環(huán)化的鏈)的環(huán)化，從而第二靶結(jié)合位點(diǎn)可以雜交至延伸鏈中的其互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，因此使延伸鏈的末端并置以用于連接。如上文所討論的，延伸的鏈(可環(huán)化的鏈))的末端的位置可以是彼此直接鄰近，并且因此可在延伸鏈的末端之間直接發(fā)生連接?；蛘?，延伸的鏈的末端不是彼此直接鄰近的，即，在探針的第二結(jié)合位點(diǎn)的5’末端和第二莖序列之間存在間插序列或間隔子。在這種情況下，延伸鏈的末端可以間接連接，例如，通過(guò)一個(gè)或多個(gè)空位寡核苷酸或在寡核苷酸的3’末端的"空位填充"延伸之后?？瘴还押塑账釋⒒パa(bǔ)于第二結(jié)合位點(diǎn)和第二莖序列之間的間插序列，并且可將其單獨(dú)針對(duì)探針加入到樣品中，或者可在選擇靶roi之前使其雜交至探針。連接步驟可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的程序來(lái)進(jìn)行。適合用于連接步驟的酶是本領(lǐng)域中已知的，并且包括例如，tthdna連接酶、taqdna連接酶、嗜熱古菌(thermococcussp.)(9°n株)dna連接酶(9°ntmdna連接酶,newenglandbiolabs)、ampligasetm(epicentrebiotechnologies)和t4dna連接酶。根據(jù)本文中的方法環(huán)化的靶roi(即，靶roi的互補(bǔ)序列)可被直接分離、分析或檢測(cè)，或者可以首先被擴(kuò)增。事實(shí)上，可以通過(guò)擴(kuò)增的方式對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。靶roi的擴(kuò)增可通過(guò)用于擴(kuò)增核酸并且尤其是環(huán)狀核酸的任意合適的方式來(lái)進(jìn)行。根據(jù)需要，擴(kuò)增可以是線性擴(kuò)增或指數(shù)擴(kuò)增，其中代表性的目標(biāo)擴(kuò)增方案包括，但不限于：聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)；等溫?cái)U(kuò)增、滾環(huán)擴(kuò)增(rca)、以及它們的公知變形方式，例如超支化rca等。其它核酸擴(kuò)增方法可以包括環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(lamp)、智能擴(kuò)增方法(smap)、基于核酸序列的擴(kuò)增(nasba)或連接酶鏈反應(yīng)(lcr)。其中該檢測(cè)步驟包括擴(kuò)增，可以檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，以檢測(cè)靶roi?；趓ca的擴(kuò)增方法代表了一種優(yōu)選的實(shí)施方式，并且在一個(gè)特定的方面，該擴(kuò)增可以包括第二輪rca，例如在wo2014/076209中描述的超級(jí)rca(srca)反應(yīng)，其通過(guò)引用并入本文。在這樣的srca反應(yīng)中，利用另外的rca模板環(huán)來(lái)進(jìn)行二級(jí)rca反應(yīng)，并且該rca由雜交至初始rca產(chǎn)物的引物開始(此處為第一rca步驟的擴(kuò)增子，其利用含有靶片段的互補(bǔ)序列的環(huán)化探針作為模板)。以這樣的方式提供該引物，以使其在整個(gè)二級(jí)rca中仍雜交至第一rca產(chǎn)物，從而使二級(jí)rca產(chǎn)物被局限于初始rca產(chǎn)物。在局限化的超級(jí)rca反應(yīng)的進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，二級(jí)rca反應(yīng)可以通過(guò)鎖式(padlock)探針而被模板化，該鎖式探針與初級(jí)rca產(chǎn)物雜交并且連接以形成環(huán)，之后該環(huán)經(jīng)歷二級(jí)rca反應(yīng)(所謂的"鎖式srca"，其在我們的共同未決gb專利申請(qǐng)第1320145.4號(hào)中描述)。在這樣的srca反應(yīng)中，二級(jí)rca產(chǎn)物與初級(jí)rca模板(即，該第一環(huán))無(wú)關(guān)，即，在這種情況下，第一環(huán)為環(huán)化的靶片段(更具體地，為環(huán)化的靶片段互補(bǔ)序列)。因此，srca被用作信號(hào)擴(kuò)增的手段(例如，在檢測(cè)方法中)，而不是作為擴(kuò)增靶roi的手段(例如，在制備性方法中)。出于這樣的目的，環(huán)至環(huán)rca反應(yīng)(如wo/2003/012119中所描述的)可用于增加由rca產(chǎn)生的產(chǎn)物的量，其基本上為線性擴(kuò)增過(guò)程或超支化rca?；蛘撸梢允褂弥笖?shù)擴(kuò)增反應(yīng)，例如pcr。通過(guò)pcr擴(kuò)增環(huán)化的片段(即，環(huán)化的靶片段互補(bǔ)序列)代表了另一優(yōu)選實(shí)施方式。如上文所討論的，pcr引物的結(jié)合位點(diǎn)可以通過(guò)結(jié)合到環(huán)化分子中的空位寡核苷酸方便地提供?；蛘?，擴(kuò)增引物可以被設(shè)計(jì)成結(jié)合至靶片段中的其它位置。在多倍實(shí)施方式中，可以引入通用或常用pcr引物結(jié)合位點(diǎn)并且利用單引物對(duì)將其用于平行擴(kuò)增不同的環(huán)化靶片段。單引物對(duì)的這種用途已在其它情況和應(yīng)用中得到證實(shí)，例如，上文所述的us7883849中公開的用于選擇子探針。顯然，模板化靶roi的連接的探針的部分(即，第二結(jié)合位點(diǎn)和第二莖序列)在連接和環(huán)化已經(jīng)發(fā)生之后仍然可結(jié)合至可環(huán)化的鏈(例如，結(jié)合至靶roi的互補(bǔ)序列)。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，探針的第二結(jié)合位點(diǎn)可以作為引物來(lái)啟功滾環(huán)擴(kuò)增。在一個(gè)替代的實(shí)施方式中，可將引物加入到樣品中以起動(dòng)滾環(huán)擴(kuò)增。盡管環(huán)化的靶片段的擴(kuò)增是方便的，并且在該方法的許多應(yīng)用中其也是優(yōu)選的，但也可以以其它方式分離環(huán)化的靶片段(即，含有靶roi的互補(bǔ)序列的環(huán)化鏈)，例如通過(guò)利用核酸外切酶來(lái)消化存在的線性分子，從而富集環(huán)狀核酸，或者通過(guò)本領(lǐng)域已知的其它核酸分離或分餾程序進(jìn)行。上文所述的方法可用于產(chǎn)生在溶液中包含靶roi的互補(bǔ)序列的環(huán)化分子也是顯而易見(jiàn)的，因此，該方法可以以均質(zhì)的方式(homogenousformat)進(jìn)行。然而，在一個(gè)可替代的實(shí)施方式中，可在雜交至靶核酸分子之前或之后或者事實(shí)上在該方法的任何階段，將探針固定在固相支持物上。如上文所述，固定探針或靶片段的手段可以是通過(guò)在探針中引入間插序列或間隔子元件的方式。間插序列或間隔子元件可以在第一靶結(jié)合位點(diǎn)與莖環(huán)結(jié)構(gòu)、莖環(huán)結(jié)構(gòu)的5’之間，或者位于莖環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)中，在第二結(jié)合位點(diǎn)的5’末端與第二莖序列之間，并且可被雜交至互補(bǔ)核酸分子，從而形成部分雙鏈核酸探針。在第一實(shí)施方式中，間插序列或間隔子元件可被附接至固相載體。在第二實(shí)施方式中，該互補(bǔ)核酸分子可被附接至固相支持物。在一些實(shí)施方式中，第二莖序列可被直接或間接附接至固相支持物。在又一實(shí)施方式中，間插序列或間隔子元件可以是第三結(jié)合位點(diǎn)的5’方向，并且可被雜交至互補(bǔ)核酸分子，從而形成部分雙鏈核酸探針，并且探針或其互補(bǔ)核酸分子可被附接至固相支持物。在一些實(shí)施方式中，一個(gè)或多個(gè)間隔序列可以位于莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖的3’方向。以此類推，當(dāng)探針是部分雙鏈時(shí)，間插序列或間隔子元件可以位于第一靶結(jié)合位點(diǎn)和探針的雙鏈區(qū)域之間，在雙鏈區(qū)域的第二鏈5’方向，或者位于雙鏈區(qū)域的第一鏈5’方向，并且可被雜交至互補(bǔ)核酸分子，從而形成包含超過(guò)一個(gè)雙鏈區(qū)域的部分雙鏈核酸探針。如上所述，間插序列或其互補(bǔ)序列可以類似地被附接至固相支持物。在有一個(gè)具體實(shí)施方式中，本發(fā)明還提供了選擇靶核酸分子中的靶目標(biāo)區(qū)域(roi)的方法，其中所述roi位于靶分子的5’末端，所述方法包括：(a)提供探針，該探針包含：(i)第一靶結(jié)合位點(diǎn)，位于探針的3’末端區(qū)域處，該結(jié)合位點(diǎn)能夠雜交至該靶分子中的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，所述互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)是roi的3’末端側(cè)翼的3’旁側(cè)序列，并且能夠在靶-模板化延伸反應(yīng)中被延伸以產(chǎn)生靶分子的互補(bǔ)序列，所述靶互補(bǔ)序列包含所述3’旁側(cè)序列以及roi的互補(bǔ)序列；和(ii)第二結(jié)合位點(diǎn)，其與roi或與其5’末端同源，并且能夠雜交至所述靶互補(bǔ)序列中的roi或與其5’末端的互補(bǔ)序列；中(iii)另外的探針序列，其位于第二結(jié)合位點(diǎn)的3’方向，其與3’旁側(cè)序列同源并且與第一結(jié)合位點(diǎn)互補(bǔ)；其中所述探針作為寡核苷酸提供，所述寡核苷酸包含莖環(huán)結(jié)構(gòu)，其在該結(jié)構(gòu)的環(huán)中包含第二結(jié)合位點(diǎn)和該另外的探針序列，并且在第二結(jié)合位點(diǎn)和該另外的探針序列的3’方向進(jìn)一步包含切割位點(diǎn)，該切割位點(diǎn)可切割以打開所述環(huán)，從而使第二結(jié)合位點(diǎn)和另外的探針序列可用于結(jié)合，所述寡核苷酸還在所述探針的3’末端包括單鏈區(qū)域，該單鏈區(qū)域在其3’末端包含第一結(jié)合位點(diǎn)；或其中所述探針作為部分雙鏈的構(gòu)建體提供，該構(gòu)建體包含第一鏈和第二鏈，第一鏈包含在其3’末端包括第一結(jié)合位點(diǎn)的單鏈3’末端區(qū)域，且第二鏈在所述第一鏈的5’末端雜交，并且包含單鏈3’末端區(qū)域，其在該單鏈區(qū)域的3’末端包括第二結(jié)合位點(diǎn)和該另外的探針序列；(b)使探針與靶分子接觸，并且允許位于探針的3’末端處的第一靶結(jié)合位點(diǎn)雜交至靶分子中的其互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，其中該靶分子至少部分是單鏈的，且在該單鏈區(qū)域中包括該互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)和可選地roi；(c)利用靶分子作為延伸模板來(lái)延伸探針的雜交的3’末端，以產(chǎn)生靶分子的互補(bǔ)序列；(d)除去靶分子，留下延伸的探針，所述延伸的探針在所延伸的區(qū)域中從3'至5'包括靶分子的roi以及3'旁側(cè)序列的互補(bǔ)序列，其中第二結(jié)合位點(diǎn)保留在探針中；(e)允許延伸的探針經(jīng)歷分子內(nèi)重排，以使第二結(jié)合位點(diǎn)雜交至靶互補(bǔ)序列中的其互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，該靶互補(bǔ)序列是roi或roi的5'端的互補(bǔ)序列，并且該另外的探針序列雜交至第一結(jié)合位點(diǎn)，其中，如果所述探針包含莖環(huán)結(jié)構(gòu)，則重排包括在探針的莖環(huán)結(jié)構(gòu)中的切割位點(diǎn)處切割延伸的探針，以釋放包含第二結(jié)合位點(diǎn)的和該另外的探針序列的探針的3'端，從而產(chǎn)生包含第一延伸鏈和第二鏈的部分雙鏈的構(gòu)建體，第一延伸鏈包含靶互補(bǔ)序列和釋放的5’末端，并且第二鏈雜交至莖中的第一鏈并且包含釋放的3’末端，該釋放的3’末端隨后能夠雜交至第一鏈中的其互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，以使可選地第一延伸鏈的釋放的5'端與第一延伸鏈的釋放的3'端并置，以用于利用第二結(jié)合位點(diǎn)和該另外的探針序列作為連接模板直接或間接地彼此連接；(f)將探針的延伸鏈的端直接或間接地彼此連接，以使探針的延伸鏈環(huán)化；(g)擴(kuò)增或分離環(huán)化的延伸鏈，從而選擇roi。在一個(gè)具體的方面，第二結(jié)合位點(diǎn)同源于roi的5’末端，并且能夠雜交至roi的5’末端的互補(bǔ)序列。本文還提供了探針用于本發(fā)明的方法中的，所述探針包含：(i)第一靶結(jié)合位點(diǎn)，位于所述探針的3’末端區(qū)域，該結(jié)合位點(diǎn)能夠雜交至靶分子中的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，所述互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)是roi的3’末端側(cè)翼的旁側(cè)序列，并且能夠在靶-模板化延伸反應(yīng)中被延伸以產(chǎn)生靶分子的互補(bǔ)序列，所述靶互補(bǔ)序列包含所述3’旁側(cè)序列和roi的互補(bǔ)序列；以及(ii)第二結(jié)合位點(diǎn)，其與roi或與其5’末端同源，并且能夠在所述靶互補(bǔ)序列中雜交至roi或其5’末端的互補(bǔ)序列；(iii)另外的探針序列，位于第二結(jié)合位點(diǎn)的3’方向，其與所述3’旁側(cè)序列同源并且與第一結(jié)合位點(diǎn)互補(bǔ)。在一個(gè)方面，探針可作為寡核苷酸提供，所述寡核苷酸包含莖環(huán)結(jié)構(gòu)，其在該結(jié)構(gòu)的環(huán)中包含第二結(jié)合位點(diǎn)和另外的探針序列，并且在第二結(jié)合位點(diǎn)和另外的探針序列的3’方向進(jìn)一步包含切割位點(diǎn)，該切割位點(diǎn)可切割以打開所述環(huán)，以使第二結(jié)合位點(diǎn)和另外的探針序列可用于結(jié)合，所述寡核苷酸還在探針的3’末端包括單鏈區(qū)域，該單鏈區(qū)域在其3’末端處包含第一結(jié)合位點(diǎn)。在又一個(gè)方面，探針作為部分雙鏈的構(gòu)建體提供，該部分雙鏈構(gòu)建體包含第一鏈和第二鏈，第一鏈包含在其3’末端包括第一結(jié)合位點(diǎn)的單鏈3’末端區(qū)域，第二鏈在所述第一鏈的5’末端雜交，并且包含在該單鏈區(qū)域的3’末端處包括第二結(jié)合位點(diǎn)和該另外的探針序列的單鏈3’末端區(qū)域?？梢詫?duì)根據(jù)本發(fā)明的方法選擇的環(huán)化的靶片段互補(bǔ)序列或其擴(kuò)增子進(jìn)行檢測(cè)。該檢測(cè)可通過(guò)核酸讀出平臺(tái)來(lái)進(jìn)行，包括測(cè)序或任何測(cè)序或任何序列分析程序、實(shí)時(shí)pcr和srca。可利用大量的已知手段對(duì)所選的和擴(kuò)增的靶roi進(jìn)行檢測(cè)和分析，例如，通過(guò)將檢測(cè)探針雜交至可被標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物，或者其可以參與進(jìn)一步的信號(hào)產(chǎn)生或信號(hào)擴(kuò)增反應(yīng)，例如，基于連接的反應(yīng)，例如，鎖式探針，或用于ola測(cè)定的探針。鎖式探針可在進(jìn)一步的擴(kuò)增反應(yīng)中進(jìn)行檢測(cè)，例如，在srca反應(yīng)中。因此，可以利用任意常規(guī)的方案來(lái)檢測(cè)擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物，其可以非特異性地或特異性地檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，如下文中更具體描述的。代表性的目標(biāo)非特異性檢測(cè)方案包括采用信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的方案，其選擇性檢測(cè)雙鏈dna產(chǎn)物，例如通過(guò)嵌插(intercalation)。發(fā)現(xiàn)用于這種實(shí)施方式中的代表性的可檢測(cè)分子包括熒光核酸染色劑，例如菲啶鎓染料，包括單體或者其同二聚體或異二聚體，當(dāng)其與核酸絡(luò)合時(shí)顯示增強(qiáng)的熒光。菲啶鎓染料的實(shí)例包括乙啶同二聚體、溴化乙啶、碘化丙啶和其它烷基取代的菲啶鎓染料。在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，核酸染色劑為吖啶染料或結(jié)合吖啶染料，或者其同二聚體或異二聚體，例如吖啶橙、吖啶同二聚體、乙啶-吖啶異二聚體,或9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶。在本發(fā)明的又一實(shí)施方式中，核酸染色劑為吲哚或咪唑染料，例如hoechst33258、hoechst33342、hoechst34580(bioprobes34,molecularprobes,inc.eugene,oreg.,(2000年5月))dapi(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)或dipi(4',6-(二咪唑啉基-2-基)-2-苯基吲哚)。其它允許使用的核酸染色劑包括，但不限于，7-氨基放線菌素d、羥芪巴脒、lds751、所選的補(bǔ)骨脂素(呋喃香豆素)、苯乙烯染料、金屬絡(luò)合物(例如釕絡(luò)合物)和過(guò)渡金屬絡(luò)合物(例如，結(jié)合tb3+和eu3+)。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，核酸染色劑可以是花青染料或者花青染料的同二聚體或異二聚體，當(dāng)其與核酸結(jié)合時(shí)顯示增強(qiáng)的熒光。可以使用在授予lee的u.s.專利第4,883,867號(hào)(1989)、授予yue等人的u.s.專利第5,582,977號(hào)(1996)、授予yue等人的u.s.專利第5,321,130號(hào)(1994)、和授予yue等人的u.s.專利第5,410,030號(hào)(1995)(全部四項(xiàng)專利通過(guò)引用并入本文)中描述的任何染料，包括以商標(biāo)名toto、bobo、popo、yoyo、to-pro、bo-pro、po-pro和yo-pro出售的來(lái)自molecularprobes,inc.,eugene,oreg的可商購(gòu)的核酸染色劑。在授予haugland等人的u.s.專利第5,436,134號(hào)(1995)、授予yue等人的u.s.專利第5,658,751號(hào)(1997)和授予haugland等人的u.s.專利第5,863,753號(hào)(1999)(全部三項(xiàng)專利通過(guò)引用并入本文)中描述的的任何染料，包括以商標(biāo)名sybrgreen,evagreen,syto,sytox,picogreen、oligreen和ribogreen出售的來(lái)自molecularprobes,inc.,eugene,oreg的可商購(gòu)的核酸染色劑。在本發(fā)明的其它實(shí)施方式中，核酸染色劑是單體的、同二聚體的或異二聚體的花青染料，其結(jié)合氮雜苯并唑鎓雜環(huán)或聚氮雜苯并唑鎓雜環(huán)，例如氮雜苯并噁唑、氮雜苯并咪唑或氮雜苯并噻唑，當(dāng)其與核酸結(jié)合時(shí)產(chǎn)生增強(qiáng)的熒光，包括以商標(biāo)名syto、sytox、jojo、jo-pro、lolo、lo-pro出售的來(lái)自molecularprobes,inc.,eugene,oreg的核酸染色劑。在其它的實(shí)施方式中，通常與雙鏈分子相反，特異性用于擴(kuò)增產(chǎn)物的信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)可被用于檢測(cè)擴(kuò)增。在這些實(shí)施方式中，信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)可以包括特異性結(jié)合至在擴(kuò)增產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的序列的檢測(cè)探針，其中可用直接或間接可檢測(cè)的標(biāo)記物標(biāo)記該檢測(cè)探針。直接可檢測(cè)的標(biāo)記物是可被直接檢測(cè)而不需要使用另外的試劑的標(biāo)記物，而間接可檢測(cè)的標(biāo)記物是可通過(guò)采用一種或多種另外的試劑檢測(cè)的標(biāo)記物，例如其中該標(biāo)記物為由兩種或更多種組分構(gòu)成的信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的成員。在許多實(shí)施方式中，該標(biāo)記物是直接可檢測(cè)的標(biāo)記物，其中直接可檢測(cè)的目標(biāo)標(biāo)記包括，但不限于：熒光標(biāo)記物、放射性同位素標(biāo)記物、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物等。在許多實(shí)施方式中，該標(biāo)記物為熒光標(biāo)記物，其中在該實(shí)施方式中所采用的標(biāo)記試劑為熒光標(biāo)識(shí)的(多種)核苷酸，例如，熒光標(biāo)識(shí)的ctp(例如cy3-ctp、cy5-ctp)等?？捎糜跇?biāo)識(shí)用于產(chǎn)生標(biāo)記的探針的核苷酸的熒光部分包括，但不限于：熒光素、花青染料，例如cy3、cy5、alexa555、bodipy630/650等。也可以使用如本領(lǐng)域中已知的那些其它標(biāo)記物，例如上文中所描述的那些。在某些實(shí)施方式中，用“能量轉(zhuǎn)移”標(biāo)記物來(lái)標(biāo)記特異性標(biāo)記的檢測(cè)探針。如本文中使用的，“能量轉(zhuǎn)移”是指這樣的過(guò)程：通過(guò)該過(guò)程，熒光基團(tuán)的熒光發(fā)射通過(guò)熒光修飾基團(tuán)被改變。如果該熒光修飾基團(tuán)是淬滅基團(tuán)，則來(lái)自該熒光基團(tuán)的熒光發(fā)射減弱(淬滅)。能量轉(zhuǎn)移可通過(guò)熒光共振能量轉(zhuǎn)移或者通過(guò)直接能量轉(zhuǎn)移而發(fā)生。在這兩種情況中精確的能量轉(zhuǎn)移機(jī)制是不同的。應(yīng)該理解，在本申請(qǐng)中提及能量轉(zhuǎn)移時(shí)均涵蓋所有這些機(jī)制性差異現(xiàn)象。如本文中所使用的“能量轉(zhuǎn)移對(duì)”是指參與能量轉(zhuǎn)移的任意兩個(gè)分子。通常，該分子中的一個(gè)起到熒光基團(tuán)的作用，而另一個(gè)起到熒光修飾基團(tuán)的作用。使用“能量轉(zhuǎn)移對(duì)”來(lái)指代形成在其中發(fā)生能量轉(zhuǎn)移的單個(gè)絡(luò)合物的一組分子。這樣的絡(luò)合物可以包含，例如，可以是彼此不同的兩個(gè)熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅基團(tuán)，兩個(gè)淬滅基團(tuán)和一個(gè)熒光基團(tuán)，或者多個(gè)熒光基團(tuán)和多個(gè)淬滅基團(tuán)。在其中有多個(gè)熒光基團(tuán)和/或多個(gè)淬滅基團(tuán)的情況下，單個(gè)基團(tuán)可以是彼此不同的。如本文中所使用的，“熒光能量共振轉(zhuǎn)移”或“fret”是指其中由受激熒光基團(tuán)發(fā)射的光至少部分地被熒光修飾基團(tuán)吸收的一種能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。如果該熒光修飾基團(tuán)為淬滅基團(tuán)，則該基團(tuán)可作為不同波長(zhǎng)的光輻射所吸收的光，或者可將其作為熱耗散。fret取決于熒光基團(tuán)的發(fā)射光譜和淬滅基團(tuán)的吸收光譜之間的重疊。fret還取決于淬滅基團(tuán)和熒光基團(tuán)之間的距離。高于某一臨界距離，淬滅基團(tuán)就不能吸收由熒光基團(tuán)發(fā)射的光，或者僅能夠吸收少量。如本文中所使用的，“直接能量轉(zhuǎn)移”是指其中熒光基團(tuán)和熒光修飾基團(tuán)之間的光子的通道不存在的一種能量轉(zhuǎn)移機(jī)制。在不受單一理論的束縛的情況下，據(jù)信在直接能量轉(zhuǎn)移中，熒光基團(tuán)和熒光修飾基團(tuán)干擾彼此的電子結(jié)構(gòu)。如果熒光修飾基團(tuán)為淬滅基團(tuán)，那么這會(huì)導(dǎo)致該淬滅基團(tuán)阻止熒光基團(tuán)甚至發(fā)射光。能量轉(zhuǎn)移標(biāo)記的檢測(cè)探針(例如，寡核苷酸)可以以各種不同的方式來(lái)排布，只要其包括供體、受體和靶核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域即可。這樣，在本發(fā)明方法的這些實(shí)施方式中采用的能量轉(zhuǎn)移標(biāo)記的寡核苷酸為包括熒光團(tuán)結(jié)構(gòu)域(其中熒光能量供體(即供體)是被定位的)和受體結(jié)構(gòu)域(其中熒光能量受體(即受體)是被定位的)的核酸檢測(cè)器。如上文中所提到的，供體結(jié)構(gòu)域包括供體熒光團(tuán)。供體熒光團(tuán)可以位于核酸檢測(cè)器的任何位置，但其通常存在于檢測(cè)器的5'終端處。受體結(jié)構(gòu)域包括熒光能量受體。受體可以位于受體結(jié)構(gòu)域的任何位置，但其通常存在于核酸檢測(cè)器或探針的3'終端處。除了熒光團(tuán)和受體結(jié)構(gòu)域之外，能量轉(zhuǎn)移標(biāo)記的探針寡核苷酸還包括靶核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其結(jié)合于在目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物(如上文所述)中發(fā)現(xiàn)的靶核酸序列(例如，標(biāo)簽(例如條形碼序列))。這樣標(biāo)記的寡核苷酸探針的具體實(shí)例包括型探針，如在美國(guó)專利第6,248,526號(hào)中描述的，其公開內(nèi)容通過(guò)引用并入本文(以及held等人,genomeres.(1996)6:986-994；holland等人,proc.natlacad.sci.usa(1991)88:7276-7280；和lee等人,nuc.acidsres.(1993)21:3761-3766)。其它類型的探針結(jié)構(gòu)的實(shí)例包括：scorpion探針(如在whitcombe等人,naturebiotechnology(1999)17:804-807；美國(guó)專利第6,326,145號(hào)中所描述的，其公開內(nèi)容通過(guò)引用并入本文)、sunrise探針(如在nazarenko等人,nuc.acidsres.(1997)25:2516-2521；美國(guó)專利第6,117,635號(hào)中所描述的，其公開內(nèi)容通過(guò)引用并入本文)、molecularbeacons(tyagi等人,naturebiotechnology(1996)14:303-308；u.s.專利第5,989,823號(hào),其公開內(nèi)容通過(guò)引用并入本文)，以及構(gòu)象輔助的探針。所述方法中的下一步是從標(biāo)記的目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物中檢測(cè)信號(hào)，信號(hào)檢測(cè)可根據(jù)所采用的特定信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)而變化。在某些實(shí)施方式中，在所述測(cè)定中僅可確定和使用存在或者不存在可檢測(cè)信號(hào)(例如熒光)，(例如)以確定或鑒定儲(chǔ)存在或不存在靶roi(或者更具體地是roi的互補(bǔ)序列)。根據(jù)所采用的特定標(biāo)記，信號(hào)的檢測(cè)可以指示存在或不存在靶roi。在在信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)為熒光信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的那些實(shí)施方式中，信號(hào)檢測(cè)通常包括從反應(yīng)混合物檢測(cè)熒光信號(hào)中的變化以獲得測(cè)定結(jié)果。換言之，由反應(yīng)混合物產(chǎn)生的熒光信號(hào)中的任何調(diào)整都會(huì)被評(píng)估。該變化可以是熒光的增加或減少，這取決于所采用的標(biāo)記物的性質(zhì)，但在某些實(shí)施方式中為熒光增加?？刹捎萌我獬Ｒ?guī)方式(例如適合的熒光計(jì)，例如耐熱玻璃管或讀板器熒光計(jì))來(lái)篩選樣品以用于增加熒光，或者其中樣品可以為顯微鏡載玻片上的組織樣品，可以利用熒光顯微鏡來(lái)檢測(cè)熒光。利用已知的熒光計(jì)來(lái)適當(dāng)?shù)乇O(jiān)測(cè)熒光。來(lái)自這些設(shè)備的信號(hào)(例如以光電倍增管電壓的形式)被發(fā)送至數(shù)據(jù)處理器主板并被轉(zhuǎn)化為與每個(gè)樣品管相關(guān)的光譜。能夠同時(shí)評(píng)價(jià)多個(gè)管(例如96個(gè)管)。因此，在一些實(shí)施方式中，可以平行檢測(cè)多個(gè)靶，而在其它實(shí)施方式中，可以順序檢測(cè)多個(gè)靶。當(dāng)檢測(cè)方案為實(shí)時(shí)方案時(shí)，例如在實(shí)時(shí)pcr反應(yīng)方案中采用的，可在整個(gè)反應(yīng)中以頻繁的時(shí)間間隔(例如每3分鐘一次)以這樣的方式來(lái)收集數(shù)據(jù)。通過(guò)在每一循環(huán)過(guò)程中監(jiān)測(cè)來(lái)自樣品的反應(yīng)性分子的熒光，能夠以各種方式來(lái)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)程。例如，可對(duì)由熔融峰提供的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，例如，通過(guò)計(jì)算熔融峰下面積并且將這些數(shù)據(jù)對(duì)循環(huán)數(shù)作圖。以這種方式產(chǎn)生的光譜可被分解，例如，利用預(yù)先選擇的熒光部分(例如染料)的“擬合(fits)”，以形成代表每個(gè)信號(hào)部分(即，熒光團(tuán))的峰。能夠確定代表每個(gè)信號(hào)的強(qiáng)度值的峰下面積，并且如果需要的話，表示為彼此的商。信號(hào)強(qiáng)度和/或比值的微分將允許通過(guò)反應(yīng)或者在不同反應(yīng)條件(例如溫度)下使待記錄的標(biāo)記的探針發(fā)生變化。這些變化與檢測(cè)探針和靶序列之間的結(jié)合現(xiàn)象或者結(jié)合至靶序列的檢測(cè)探針的降解有關(guān)。微分峰下面積的積分將允許計(jì)算針對(duì)標(biāo)記物影響的強(qiáng)度值。針對(duì)熒光變化來(lái)篩選混合物提供了一個(gè)或多個(gè)測(cè)定結(jié)果，這取決于在引物延伸反應(yīng)結(jié)束時(shí)樣品是否被篩選過(guò)一次，或多次，例如在擴(kuò)增反應(yīng)的每一次循環(huán)之后(例如，如在實(shí)時(shí)pcr監(jiān)測(cè)中進(jìn)行的)。如上文所述產(chǎn)生的數(shù)據(jù)能夠以各種方式被解釋。在其最簡(jiǎn)單的方式中，在擴(kuò)增反應(yīng)過(guò)程中或結(jié)束時(shí)來(lái)自樣品的熒光增加或減少是樣品中存在的靶數(shù)量增加的指征，例如，與在反應(yīng)混合物中檢測(cè)到的擴(kuò)增產(chǎn)物的量有關(guān)，提示擴(kuò)增反應(yīng)已經(jīng)開始進(jìn)行并且因此在初始樣品中實(shí)際上存在靶標(biāo)的事實(shí)。通過(guò)在整個(gè)擴(kuò)增過(guò)程中監(jiān)測(cè)擴(kuò)增反應(yīng)也可以進(jìn)行定量化。如上文所述，定量分析還可以包括測(cè)定反應(yīng)混合物中的一個(gè)或多個(gè)核酸對(duì)照。本發(fā)明的方法可以具有多種用途和應(yīng)用。一種這樣的用途可為制備用于測(cè)序或其它序列分析的底物或模板。如上文所述，該方法也可以用于檢測(cè)，例如用于鑒別靶roi或用于檢測(cè)給定樣品中特定靶roi的存在或不存在，或者量或水平。因此，該方法可用于檢測(cè)靶生物體，例如樣品中的病原體，其可用于臨床或用于研究或其它目的，例如流行病學(xué)研究或用于研究微生物耐受性等等。此外，該方法可以發(fā)現(xiàn)篩選或檢測(cè)罕見(jiàn)突變的效用，例如，當(dāng)篩選癌癥中(例如在循環(huán)腫瘤細(xì)胞中)的微小殘留病(minimalresidualdisease)時(shí)，尤其是當(dāng)與敏感性檢測(cè)策略例如srca組合使用時(shí)。如上所述，本發(fā)明的方法具有許多益處，包括用于這樣的應(yīng)用中。例如，其不要求存在探針的正確5’和3’末端從而用于發(fā)生選擇，條件是第一靶結(jié)合區(qū)域能夠結(jié)合至其互補(bǔ)序列。n-1和n-2缺失在合成核酸中是經(jīng)常存在的，尤其是當(dāng)使用較長(zhǎng)的寡核苷酸時(shí)。對(duì)于環(huán)化，其也要求待環(huán)化的寡核苷酸的5’末端為磷酸化的。如果使用大量的探針，則探針的5'磷酸化是一種技術(shù)障礙并且成本高昂。合成的核酸探針可在其5’末端經(jīng)常缺少磷酸基團(tuán)，一旦其被選擇后便能夠阻止靶核酸分子的連接和環(huán)化，例如在選擇子探針的情形中。因此，本發(fā)明繞過(guò)了這兩個(gè)障礙來(lái)選擇靶核酸序列，減少了與保證使用高度同源的磷酸化核酸探針有關(guān)的成本。有利地，如上文提到的，本發(fā)明可以是均質(zhì)(非固相體)或基于固相體的形式。因此，所選的靶核酸可被原位鑒定或者在基于陣列的測(cè)定中利用一些本領(lǐng)域中已知的技術(shù)來(lái)鑒定。使用固相體可以使洗滌步驟能夠被包括或有助于洗滌步驟被包括。探針以及可選的用于實(shí)施本發(fā)明方法的其它組分可以方便地以試劑盒的形式提供。因此，在本發(fā)明的又一個(gè)方面，提供了一種試劑盒，更具體的提供了用于選擇靶核酸分子中的靶roi的試劑盒，所述試劑盒包含：(a)本發(fā)明前文中所定義的探針；以及可選地一個(gè)或多個(gè)選自下列的的另外組分：(b)用于切割探針的莖環(huán)結(jié)構(gòu)中的切割位點(diǎn)的工具，例如一種或多種限制性酶或切口酶；(c)用于切割第二切割位點(diǎn)的工具，如果存在的話，例如一種或多種如上文所述的切割酶；(d)當(dāng)5’旁側(cè)序列位于靶分子的5’末端內(nèi)部時(shí)，用于降解延伸的探針的3’末端的工具，例如3’→5’核酸外切酶；(e)用于延伸探針的工具，例如，聚合酶，其可具有鏈置換活性；(f)連接酶；(g)一個(gè)或多個(gè)空位寡核苷酸；(h)用于擴(kuò)增包含靶片段的互補(bǔ)序列的環(huán)化的延伸鏈的工具，例如，一個(gè)或多個(gè)擴(kuò)增引物(例如，pcr引物)和/或擴(kuò)增酶(例如，聚合酶，例如phi29或用于rca的另一鏈置換聚合酶、或適用于pcr的聚合酶，如本領(lǐng)域中已知的)；(i)用于檢測(cè)環(huán)化的延伸鏈(包含靶片段互補(bǔ)序列)或其擴(kuò)增子的工具，例如，一個(gè)或多個(gè)檢測(cè)探針，或標(biāo)記物，或用于進(jìn)一步檢測(cè)反應(yīng)的工具，例如，用于實(shí)施srca反應(yīng)的工具，例如用于srca反應(yīng)的引物，用于srca反應(yīng)的模板，或鎖式探針等，如上文所述。該試劑盒組分可以存在于單獨(dú)容器中，或一個(gè)或多個(gè)組分可以存在于同一容器中，其中該容器可以是貯存容器和/或在試劑盒為其而設(shè)計(jì)的測(cè)定中采用的容器。除了上述組分之外，所述的試劑盒還可以進(jìn)一步包括用于實(shí)施所述方法的說(shuō)明。這些說(shuō)明可以以各種形式存在于所述試劑盒中，在該試劑盒中可以存在一個(gè)或多個(gè)。這些說(shuō)明可存在的一種形式可以是印刷在合適的介質(zhì)或基材上的信息，例如在試劑盒包裝中、藥品說(shuō)明書等中印刷有信息的一張或多張紙。其它方式可以是計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，例如其中已經(jīng)錄制了信息的磁盤、cd、閃存驅(qū)動(dòng)器等等。可存在的其它方式可以是網(wǎng)絡(luò)地址，其可以在刪除站點(diǎn)通過(guò)互聯(lián)網(wǎng)登錄信息來(lái)使用。任何常規(guī)形式都可以存在于試劑盒中。附圖說(shuō)明在以下的非限制性實(shí)施例中將參照附圖進(jìn)一步描述本發(fā)明，其中：圖1示出了本發(fā)明的針對(duì)靶核酸分子的方法，其中位于靶roi側(cè)翼的5’旁側(cè)序列處于靶分子的末端。本發(fā)明的探針結(jié)合至位于靶roi側(cè)翼的3’旁側(cè)序列，并且被延伸以產(chǎn)生靶分子的互補(bǔ)序列。靶分子隨后被除去。切割莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖或環(huán)，釋放包含第二結(jié)合位點(diǎn)的探針的3’末端，并使其雜交至延伸鏈中的其互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)。然后連接延伸鏈的末端，并且可擴(kuò)增或分離環(huán)化的延伸鏈。虛線表示與靶roi具有相同取向(5’→3’)的序列。圖2示出了針對(duì)靶核酸分子的方法，其中位于靶roi側(cè)翼的5’旁側(cè)序列位在靶分子的5’末端的內(nèi)部。該探針可包含與鄰近于5’旁側(cè)序列的5’的切割序列同源的第三結(jié)合位點(diǎn)。5’旁側(cè)區(qū)的互補(bǔ)序列能夠雜交至第三結(jié)合位點(diǎn)，產(chǎn)生第二切割位點(diǎn)。在第二切割位點(diǎn)和莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖或環(huán)中的切割位點(diǎn)處切割雜交的探針，釋放延伸鏈的3’末端，其可如圖1中所示被環(huán)化。虛線表示與靶roi具有相同取向(5’→3’)的序列。圖3示出了本發(fā)明的方法，其中第二切割位點(diǎn)不是位于第三結(jié)合位點(diǎn)的3’末端，并且序列的一部分保留在切割后的第一鏈的3’末端。該探針在第二結(jié)合位點(diǎn)的5’方向包含，與靶互補(bǔ)序列中的序列互補(bǔ)的序列，該序列互補(bǔ)于第三結(jié)合位點(diǎn)(用*標(biāo)記)。如圖2中所示發(fā)生第二切割位點(diǎn)和莖或環(huán)的切割。虛線表示與靶roi具有相同取向(5’→3’)的序列。圖4示出了本發(fā)明的方法，其中探針包含莖環(huán)結(jié)構(gòu)的的5’方向的第四靶結(jié)合序列，其與緊鄰于位于靶roi側(cè)翼的3’旁側(cè)序列的3’方向的區(qū)域互補(bǔ)。圖5示出了本發(fā)明的針對(duì)靶核酸分子的方法，其中位于靶roi側(cè)翼的5’旁側(cè)序列在靶分子的5’末端內(nèi)部，并且探針不包含第三結(jié)合位點(diǎn)。如圖1中所示進(jìn)行莖環(huán)結(jié)構(gòu)中的莖或環(huán)的切割，并且5’旁側(cè)序列的互補(bǔ)序列雜交至第二結(jié)合位點(diǎn)，形成具有突出的3’懸突的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。該懸突可通過(guò)具有3’→5’核酸外切酶活性的任何酶被消化。虛線表示與靶roi具有相同取向(5’→3’)的序列。圖6示出了利用具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)內(nèi)的限制酶切割位點(diǎn)的探針通過(guò)本發(fā)明的方法檢測(cè)基因組dna的結(jié)果。a)僅在存在靶、限制酶和連接酶時(shí)觀察到陽(yáng)性信號(hào)。與具有rca擴(kuò)增的反應(yīng)相比，無(wú)rca擴(kuò)增(-phi29)的反應(yīng)的信號(hào)減少表示在rca后的酶切后延伸的探針的成功環(huán)化。重復(fù)測(cè)量的計(jì)算結(jié)果為cv～18.5％。b)用4％瓊脂糖凝膠來(lái)證實(shí)pcr產(chǎn)物。圖7示出了利用具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖內(nèi)的切口酶切割位點(diǎn)的探針通過(guò)本發(fā)明的方法檢測(cè)基因組dna的結(jié)果。a)僅在存在靶、限制酶和連接酶時(shí)觀察到陽(yáng)性信號(hào)。與具有rca擴(kuò)增的反應(yīng)相比，無(wú)rca擴(kuò)增(-phi29)的反應(yīng)的信號(hào)減少表示在rca后的酶切后延伸的探針的成功環(huán)化。重復(fù)測(cè)量的計(jì)算結(jié)果為cv～10.3％。用4％瓊脂糖凝膠(b)和sanger測(cè)序(c)來(lái)證實(shí)pcr產(chǎn)物。圖8示出了通過(guò)本發(fā)明的方法原位檢測(cè)htertmrna的結(jié)果。用兩種不同的熒光團(tuán)來(lái)標(biāo)記rca產(chǎn)物；一種被設(shè)計(jì)為特異性用于標(biāo)記正確選擇的靶序列，而另一種被設(shè)計(jì)為用于標(biāo)記探針中的嵌入序列。預(yù)期正確的信號(hào)含有兩種顏色并且僅當(dāng)存在所有酶時(shí)可觀察到。圖9示出了利用以其5’末端固定在固相支持物上的探針通過(guò)本發(fā)明的方法檢測(cè)微rna(微rna)的結(jié)果。僅當(dāng)存在靶時(shí)觀察到陽(yáng)性信號(hào)。圖10示出了本發(fā)明的方法，其中探針包含莖環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)中的第三結(jié)合位點(diǎn)，在莖環(huán)結(jié)構(gòu)中的第二結(jié)合位點(diǎn)和切割位點(diǎn)之間。因此該第三結(jié)合位點(diǎn)在莖環(huán)結(jié)構(gòu)中的切割位點(diǎn)的5’方向。該第三結(jié)合位點(diǎn)使靶互補(bǔ)序列的3’方向的多余序列的切割模板化，釋放靶互補(bǔ)序列的3’末端用于連接。圖11示出了本發(fā)明的針對(duì)靶核酸分子的方法，其中位于靶roi側(cè)翼的5’旁側(cè)序列在靶分子的5’末端的內(nèi)部。該探針在其5’末端包含生物素部分(其可用于從樣品中選擇性除去未切割的探針)以及切割位點(diǎn)的3’方向的另外的序列(其可用于固定切割的和延伸的探針)(例如，用于原位檢測(cè))。圖12示出了圖11的本發(fā)明的方法，其中探針在莖環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)中包含另外的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其可被限制酶(在本例中為mlyi)切割。圖13示出了本發(fā)明的方法，其中探針在其環(huán)中包含另外的探針序列，其與靶核酸分子的3’旁側(cè)區(qū)同源(并且互補(bǔ)于第一結(jié)合位點(diǎn))。該探針進(jìn)一步包含(另外的結(jié)合位點(diǎn)的5’方向)第二結(jié)合位點(diǎn)，其與roi同源。同時(shí)，第二結(jié)合位點(diǎn)和另外的探針序列能夠雜交至靶核酸分子的互補(bǔ)序列(即，3’旁側(cè)區(qū)的互補(bǔ)序列和roi的互補(bǔ)序列)以模板化探針的第一延伸鏈的環(huán)化。具體實(shí)施方式實(shí)施例1-基因組dna的檢測(cè)。利用本發(fā)明的方法來(lái)檢測(cè)基因組dna的一部分中的靶roi。靶核酸分子包含位于靶roi側(cè)翼的5’旁側(cè)序列的haeiii切割位點(diǎn)5’方向，并且利用包含與該區(qū)域同源的第三結(jié)合位點(diǎn)的探針來(lái)進(jìn)行該檢測(cè)。在莖環(huán)結(jié)構(gòu)中具有限制酶切割位點(diǎn)(excirc_1)和切口酶切割位點(diǎn)(excirc_2)的探針被用于選擇靶roi。表1中示出了用于檢測(cè)kras靶目標(biāo)區(qū)域的探針的序列。莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖以斜體示出。excirc_1探針被設(shè)計(jì)為結(jié)合至kras_1靶序列的一部分，且excirc_2探針被設(shè)計(jì)為結(jié)合至kras_2靶序列的一部分。表2中示出了靶序列。將大約1e5的人類基因組(promega)和本發(fā)明的100nm的探針在20μl延伸混合物中混合，該延伸混合物由1xeinar緩沖液(50mmkac,20mmtris-hacph7.6,3mmmgac2)、0.06u/μlplatinumtaqdna聚合酶(invitrogen)、0.2mmd(a,t,g,c)tp(thermoscientific)組成。延伸在95℃下進(jìn)行5分鐘并且在60℃下進(jìn)行1分鐘。在每一反應(yīng)中加入1μl的蛋白酶k(thermoscientific)，隨后在37℃下孵育30分鐘并在95℃下孵育20分鐘。在表1中定義了excirc_1(包含限制酶切割位點(diǎn))和excirc_2(包含切口酶切割位點(diǎn))。探針中的切割位點(diǎn)以粗體表示。表1.用于選擇kras靶roi的探針的列表表2.kras靶序列的列表對(duì)于excirc_1探針，向每一延伸反應(yīng)加入5μl的切割和連接混合物，隨后在37℃下孵育30分鐘并在55℃下孵育20分鐘，該切割和連接混合物由1xeinar緩沖液、1u/μl的每一種限制酶(haeiii(neb)和mlyi(neb))、2.5mmnad(sigma-aldrich)、0.1u/μlampligase連接酶(epicenterbiotechnology)組成。對(duì)于excirc_2探針，向每一延伸反應(yīng)加入5μl的切割混合物，隨后在37℃下孵育30分鐘并在85℃下孵育20分鐘，該切割混合物由1xeinar緩沖液、1u/μlhaeiii和1u/μlnb.btsi(neb)組成。向每一切割產(chǎn)物加入5μl的連接混合物，接著在55℃下孵育15分鐘，該連接混合物由1xeinar緩沖液、3mmnad、0.12u/μlampligase連接酶組成。在環(huán)化之后，將10μl的rca混合物加入至10μl的連接產(chǎn)物，隨后在37℃下孵育60分鐘并在65℃下孵育15分鐘，該rca混合物由1xeinar緩沖液、0.4μg/μlbsa(neb)、0.5mmd(a,t,g,c)tp、0.04u/μlphi29dna聚合酶(thermoscientific)組成。在rca之后，將10μl的pcr混合物加入至10μl的rca產(chǎn)物，該pcr混合物由1xeinar緩沖液,200nmclr_kras正向和反向引物(參見(jiàn)表3)、1xsybr(分子探針)、0.12u/μlplatinumtaqdna聚合酶、0.4mmd(a,u,g,c)tp(thermoscientific)、0.004u/μlung(thermoscientific)組成。在stralabelenemx3005pcr儀(agilenttechnologies)中進(jìn)行實(shí)時(shí)pcr，利用如下溫度曲線(thermalprofile)進(jìn)行：開始在95℃下進(jìn)行2分鐘，隨后以95℃持續(xù)15秒和60℃持續(xù)1分鐘進(jìn)行45次循環(huán)。表3.用于檢測(cè)kras靶roi的pcr引物的列表seqidno:引物名稱序列5clr_kras_1cgtgccttgacgatacagctaa6clr_kras_2caaggcactcttgcctacg在圖6和圖7中分別示出了利用在莖環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)中包含限制酶和切口酶切割位點(diǎn)的探針進(jìn)行的基因組dna的檢測(cè)的結(jié)果。這兩幅圖的部分(a)示出了當(dāng)在該檢測(cè)方法中使用靶核酸以及第一和第二切割酶時(shí)僅檢測(cè)到陽(yáng)性信號(hào)。這兩幅圖的部分(b)指示了在兩種情況下選擇靶roi，以及當(dāng)不存在靶核酸分子、haeiii或ampligase(dna連接酶)時(shí)不發(fā)生選擇。圖7的部分(c)指示了選擇了正確的序列，并且其是用或不用環(huán)化的延伸鏈滾環(huán)擴(kuò)增可檢測(cè)的。實(shí)施例2-原位mrna的檢測(cè)使bjhtert細(xì)胞在超級(jí)防脫金印載玻片(superfrostplusgoldslides，thermoscientific)上生長(zhǎng)，并在3％(w/v)多聚甲醛(sigma-aldrich)于1xpbs中的溶液中在室溫下固定30分鐘。在固定之后，將細(xì)胞在depc處理的1xpbs中洗滌兩次并用乙醇系列脫水。在風(fēng)干之后，將載玻片在-80℃下儲(chǔ)存。在研究前，使用secure-sealtmspacers(d＝8mm)(lifetechnologies)在載玻片上制造50μl反應(yīng)室。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)方案中，在每次孵育和加入新的反應(yīng)混合物之間用depc處理的1xpbs、0.05％tween-20進(jìn)行兩次洗滌。首先，用封閉緩沖液在37℃下孵育細(xì)胞1小時(shí)，該封閉緩沖液由2xssc、1u/μlribolockrna酶抑制劑(thermoscientific)、1μg/μlbsa、1μg/μl鮭魚精dna(invitrogen)、1μg/μle.colitrna(sigma-aldrich)組成。將封閉緩沖液中的50μl的100nm的excirc_htert探針加入到細(xì)胞中，隨后在37℃下孵育1小時(shí)。該探針包含莖環(huán)結(jié)構(gòu)的第四結(jié)合位點(diǎn)5’方向。表4中示出了所使用的探針的序列–以粗體表示切割位點(diǎn)。以斜體示出莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖。表5中示出了htert靶序列的序列。接著，將50μl的延伸混合物加入至細(xì)胞，隨后在55℃下孵育60分鐘，該延伸混合物由1xrt緩沖液(thermoscientific)、0.2μg/μlbsa(neb)、0.5mmd(a,t,g,c)tp(thermoscientific)、10u/μlrevertaidhminus逆轉(zhuǎn)錄酶(thermoscientific)、1u/μlribolockrna酶抑制劑組成。表4.用于檢測(cè)htertmrna的探針的序列表5.htert靶序列的序列在用3.7％(w/v)多聚甲醛在室溫下后固定5分鐘之后，將50μl的切割混合物加入至細(xì)胞，接著在37℃下孵育30分鐘，該切割混合物由1xcutsmart緩沖液(neb)、0.5u/μlnb.btsi、0.1u/μlrna酶h(thermoscientific)、0.5u/μlalui和1u/μlribolockrna酶抑制劑組成。切割后，向細(xì)胞加入50μl的連接混合物，隨后在37℃下孵育30分鐘，該連接混合物由1xcutsmart緩沖液、0.3u/μlt4dna連接酶和0.5mmatp組成。接著，向細(xì)胞加入50μl的rca混合物，隨后在37℃下孵育60分鐘，該rca混合物由1xphi29緩沖液(thermoscientific)、0.2μg/μlbsa、0.25mmd(a,t,g,c)tp、2.5％甘油(sigma-aldrich)和0.5u/μlphi29dna聚合酶組成。通過(guò)將50μl檢測(cè)混合物(含有100nm檢測(cè)寡核苷酸在2xssc中的溶液、20％甲酰胺(sigma-aldrich))在37℃下孵育20分鐘來(lái)使rca產(chǎn)物可視化。用含有100ng/mldapi(olink)的抗熒光淬滅劑(anti-fademedium)封固載玻片，并用40倍油性物鏡的axioplanii落射熒光顯微鏡(zeiss)來(lái)成像，其分別具有cy3和cy5的激發(fā)和發(fā)射濾波器且暴露時(shí)間為2000ms和8000ms。檢測(cè)寡核苷酸被設(shè)計(jì)為檢測(cè)靶roi中的特異性序列(excirc_htert_檢測(cè)1)(參見(jiàn)表5，加下劃線的序列)或引入到探針中的序列元件(excirc_htert_檢測(cè)2)(參見(jiàn)表4，加下劃線的序列)，并且在表6中示出。表6.用于檢測(cè)htert靶roi的檢測(cè)寡核苷酸seqidno:寡核苷酸名稱序列9excirc_htert_檢測(cè)1cy3-cagcccgtcccgccg10excirc_htert_檢測(cè)2cy5-tgcgagtccgtctuuu探針的非特異性連接導(dǎo)致形成環(huán)狀核酸分子，該環(huán)狀核酸分子包含引入到探針(但不是靶roi)中的序列元件，并且僅在cy5通道中檢測(cè)到擴(kuò)增產(chǎn)物。特異性連接(即，根據(jù)本發(fā)明的方法)導(dǎo)致包含引入到探針中的序列元件和靶roi序列的核酸分子的形成和擴(kuò)增。在cy3和cy5通道中均檢測(cè)到擴(kuò)增產(chǎn)物(參見(jiàn)圖8)。實(shí)施例3–合成微rna的檢測(cè)在37℃下將本發(fā)明的1pm50μl的5’生物素標(biāo)記的探針(excirc_mir208b，參見(jiàn)表7)固定在1xpbs中的涂布有鏈霉親和素的codelink載玻片(surmodics)上60分鐘。莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖以斜體表示。使用secure-sealtmspacer(d＝8mm)在載玻片上制造50μl反應(yīng)室。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)方案中，在每次孵育和添加新的反應(yīng)混合物之間用1xpbs、0.05％tween20進(jìn)行兩次洗滌。表7.用于檢測(cè)mirna的探針的序列將100nm的合成微rna(合成_rna_mir208b–參見(jiàn)表8)施加于載玻片并在37℃下孵育60分鐘以允許雜交。接著，向載玻片加入50μl的延伸混合物，隨后在37℃下孵育30分鐘，該延伸混合物由1xrt緩沖液、0.2μg/μlbsa、0.5mmd(a,t,g,c)tp、10u/μlrevertaidhminus逆轉(zhuǎn)錄酶組成。表8.在本發(fā)明的方法中檢測(cè)的mirnaseqidno:mirna名稱序列12合成_rna_mir208bauaagacgaacaaaagguuugu將50μl切割混合物加入至載玻片，之后在37℃下孵育30分鐘，該切割混合物由1xnebuffer4(neb)、0.5μg/μlbsa、0.5u/μlnb.btsi組成。將50μl的連接混合物加入至載玻片，之后在37℃下孵育30分鐘，該連接混合物由1xnebuffer4、0.5μg/μlbsa、0.3u/μlt4dna連接酶、0.5u/μlrna酶h、0.5mmatp組成。接著，將50μl的rca混合物加入至載玻片，之后在37℃下孵育30分鐘，該rca混合物由1xphi29緩沖液、0.25mmd(a,t,g,c)tp和0.5u/μlphi29dna聚合酶組成。通過(guò)將50μl檢測(cè)混合物(含有100nm檢測(cè)寡核苷酸(excirc_mir208b_檢測(cè)–參見(jiàn)表9)在2xssc中的溶液、20％甲酰胺)在37℃下孵育20分鐘來(lái)使rca產(chǎn)物可視化。用抗熒光淬滅劑(olink)封固載玻片，并用20倍物鏡的axioplanii落射熒光顯微鏡(zeiss)來(lái)成像，其具有cy3的激發(fā)和發(fā)射濾波器且暴露時(shí)間為800ms。表9.用于檢測(cè)mir208mirna的檢測(cè)寡核苷酸seqidno:寡核苷酸名稱序列13excirc_mir208b_檢測(cè)cy3-cagtgaatgcgagtccgtct僅在其中靶mirna已被加入到固定的寡核苷酸的載玻片上檢測(cè)到擴(kuò)增產(chǎn)物(參見(jiàn)圖9)。當(dāng)前第1頁(yè)12