專利名稱：：量化至少兩種核酸序列之間的比例的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域。對(duì)于許多生物學(xué)和醫(yī)學(xué)應(yīng)用來說，例如診斷學(xué)，核酸檢測(cè)是一種有價(jià)值的工具。例如，通過在來源于個(gè)體的樣品中檢測(cè)外源的病原性核酸，以證實(shí)在所述個(gè)體中存在病原體。采用這種方法，通?？梢怨烙?jì)病原體是否存在，如果存在病原體，再確定相關(guān)的病原體。該方法通常足以定性地確定特定(病原性)核酸序列的存在。但是，在其他應(yīng)用中，應(yīng)當(dāng)估計(jì)核酸的量。例如，細(xì)胞中的線粒體DNA的量指示在所述細(xì)胞中存在的線粒體的數(shù)量。如果細(xì)胞中的線粒體DNA的量持續(xù)下降，則指示線粒體減少以及所述細(xì)胞的代謝活性降低。作為另一個(gè)例子，細(xì)胞中的mRNA的量指示著所述細(xì)胞中的相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄水平。這種轉(zhuǎn)錄水平的(突然)變化指示生物體的狀態(tài)的變化，例如疾病發(fā)作。如在本發(fā)明人的專利申請(qǐng)WO0246470中所公開，可以通過在從所述生物體獲得的樣品中的第一個(gè)內(nèi)共生體細(xì)胞器核酸和/或其基因產(chǎn)物相對(duì)于第二個(gè)內(nèi)核酸和/或其基因產(chǎn)物的比例，也稱作相對(duì)比例，確定細(xì)胞生物體的功能(障礙)。(相對(duì))比例是所述第一個(gè)內(nèi)共生體細(xì)胞器核酸和/或其基因產(chǎn)物的量相對(duì)于第二個(gè)內(nèi)核酸和/或其基因產(chǎn)物的比例的平均值。所述比例例如可以通過(其中)將所述第一種核酸或其基因產(chǎn)物的量除以所述第二種核酸或其基因產(chǎn)物的量來確定，反之亦然。一種或兩種化合物的量還可以除以或減去參考值。確定細(xì)胞生物體的功能性，在此是指確定所述細(xì)胞生物體是否處于其天然健康狀態(tài)，或者所述生物體是否在某種程度上受到影響，例如是否受疾病和/或(毒性)化合物的影響。所述疾病和/或(毒性)化合物可能影響所述生物體，以致產(chǎn)生臨床癥狀?；蛘撸黾膊』?毒性)化合物可能對(duì)所述生物體產(chǎn)生影響，而臨床癥狀(還)沒有得到證實(shí)。內(nèi)共生細(xì)胞器是真核細(xì)胞的那些細(xì)胞器，一般認(rèn)為，這些真核細(xì)胞在很早之前的真核細(xì)胞的進(jìn)化中從原核細(xì)菌來源；這些細(xì)菌(如所認(rèn)為的)參與與早期的真核細(xì)胞一起共生，目前，總的來說，包含這些內(nèi)共生體細(xì)胞器的真核細(xì)胞在缺乏這些內(nèi)共生體細(xì)胞器的情況下是無法生存的；缺乏線粒體時(shí)，現(xiàn)有的真核細(xì)胞都不能正確地起作用，并且當(dāng)缺乏前質(zhì)體或其細(xì)胞器，例如葉綠體、白質(zhì)體、造粉體、造油體或者色質(zhì)體時(shí)，大部分植物細(xì)胞至少被認(rèn)為是有障礙的?？傊@些細(xì)胞器似乎至少部分地是自我復(fù)制體，雖然受某些細(xì)胞核的控制，但是仍然具有顯著的自主性。通常在至少一個(gè)處理步驟之后，例如擴(kuò)增靶核酸，核酸比例可以通過測(cè)定存在于樣品中的所述核酸的量來確定。在測(cè)定所述的量后，可以通過用一個(gè)量除以另一個(gè)量來確定所述比例?？梢酝ㄟ^酶促擴(kuò)增來測(cè)定和量化微小量的靶核酸。酶促擴(kuò)增技術(shù)的例子包括PCR1、NASBA2、SDA和TMA?？梢酝ㄟ^向反應(yīng)中加入引物序列，特異地?cái)U(kuò)增靶核酸序列。可以在擴(kuò)增反應(yīng)末期，用特異于所述擴(kuò)增區(qū)的探針檢測(cè)擴(kuò)增區(qū)域。或者，可以在所述擴(kuò)增反應(yīng)中生成所述擴(kuò)增核酸的過程中檢測(cè)擴(kuò)增區(qū)3。在后面的操作中，連接到探針上的標(biāo)記的信號(hào)在所述探針已經(jīng)雜交到互補(bǔ)核酸后變得可檢測(cè)。這種可以在擴(kuò)增反應(yīng)中進(jìn)行實(shí)時(shí)同源檢測(cè)的探針的例子為TaqMan3和MolecularBeaconprobes4；5。如在此所用，“核酸”、“核酸序列”和“核酸分子”可相互交換使用。通常通過加入競爭分子來量化靶核酸序列，競爭分子用相同的引物擴(kuò)增并含有區(qū)別競爭物和靶核酸序列的序列2；6。可以用被擴(kuò)增的競爭物和靶核酸序列之間的比例來量化所述靶核酸序列。例如，可以在擴(kuò)增反應(yīng)末期通過特異于所述競爭物或靶核酸序列的被擴(kuò)增區(qū)域的探針或者在擴(kuò)增反應(yīng)中生成所述被擴(kuò)增核酸的過程中，檢測(cè)對(duì)競爭物或靶核酸序列。在后面的操作中，在所述探針已經(jīng)雜交到互補(bǔ)的靶核酸上后和當(dāng)所述靶超過閾值水平時(shí)，結(jié)合到探針上的標(biāo)記的信號(hào)變得可檢測(cè)；達(dá)到陽性的時(shí)間或循環(huán)次數(shù)。在用于量化的其他方法中，達(dá)到陽性的時(shí)間可以被用于量化，而不加入競爭物7。因此，為了確定核酸靶序列，主要擴(kuò)增所述靶序列。采用本發(fā)明人公開的WO0246470的方法能夠獲得更加精確的結(jié)果，在該方法中，在單一擴(kuò)增反應(yīng)中，優(yōu)選在一個(gè)反應(yīng)瓶或管中，同時(shí)擴(kuò)增多種靶核酸序列。這稱作擴(kuò)增反應(yīng)的多重性或多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)。通過這種方法，至少部分地避免了由于多個(gè)獨(dú)立的量化擴(kuò)增中的變化在結(jié)果中產(chǎn)生的雙重差幅(doublespreading)。一般地，由于不同反應(yīng)混合物的條件是變化的，因此產(chǎn)生獨(dú)立擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果中的雙重差幅。例如，核酸1的反應(yīng)混合物的溫度可能稍微高于核酸2的反應(yīng)混合物的溫度。這可能導(dǎo)致產(chǎn)生較高的核酸1的產(chǎn)量，因此，產(chǎn)生核酸1的量比核酸2的比例比如果反應(yīng)混合物1的溫度與反應(yīng)混合物2的溫度十分相同測(cè)定的比例更高。如果所述反應(yīng)混合物中的所述溫度不同，測(cè)定的比例不是完全與存在于起始樣品中的兩條核酸的真正比例相同。同樣地，在其他條件下的微小變化，例如所添加的酶的量會(huì)引起所測(cè)定的核酸1和2的量改變。因此，所測(cè)定的核酸1和2的量可能會(huì)獨(dú)立地相互區(qū)別。所述確定量中的單獨(dú)改變可能會(huì)在所述測(cè)定量的計(jì)算比例中引起甚至更大的改變。這就是所述的結(jié)果中的雙重差幅。因此，雙重差幅在此是指獲得的結(jié)果中的至少一個(gè)改變，是由于至少兩個(gè)反應(yīng)混合物中的至少一個(gè)反應(yīng)條件的改變。例如，在兩個(gè)反應(yīng)混合物之間，總體積量可能稍有不同。WO0246470提供一種解決當(dāng)兩種或多種核酸靶序列被擴(kuò)增時(shí)的結(jié)果的雙重差幅的方法。在多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)中，變量數(shù)量極大降低，并獲得更精確和有效的數(shù)據(jù)。目前，至少兩種核酸的最初比例是通過測(cè)定在擴(kuò)增反應(yīng)過程中或之后產(chǎn)生的相互區(qū)別的信號(hào)來確定。在本領(lǐng)域中，多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)主要用于定量測(cè)定樣品中的核酸的存在。常常期望，可以測(cè)定核酸比例中的非常小的差別。例如，測(cè)定核酸比例中的小差別是診斷目的所期望的，因?yàn)椋诨钌矬w中，核酸的量嚴(yán)格受到調(diào)控，并且非常小的變化會(huì)產(chǎn)生巨大的生物學(xué)結(jié)果。為了獲得對(duì)個(gè)體狀態(tài)的診斷，例如，可以對(duì)在不同時(shí)間點(diǎn)從所述個(gè)體中獲取的樣品進(jìn)行研究，以確定線粒體DNA與細(xì)胞核DNA的比例。線粒體DNA的量的小改變是可檢測(cè)的。如果這種比例持續(xù)稍微降低，例如降低20％，這表明存在線粒體減少20％。線粒體減少20％已經(jīng)產(chǎn)生非常嚴(yán)重的生物學(xué)后果。作為另一個(gè)例子，如果一個(gè)個(gè)體接受針對(duì)一種疾病的治療，所存在的(線粒體)DNA和/或mRNA下降20％指示嚴(yán)重的副作用。因此，比例中的非常小的變化優(yōu)選是可檢測(cè)的。但是，采用目前的方法，常常不容易獲得所需要的辨別靈敏性。特別地，如果擴(kuò)增核酸，常常有必要獲得可檢測(cè)的量，常常不容易測(cè)定最初的核酸比例中的小差別。這是由于多種因素，這些因素影響在擴(kuò)增過程中所獲得的核酸的量。因此，優(yōu)選地目前測(cè)定不同核酸之間的顯著差別。而且，擴(kuò)增后核酸的比例通常不總是精確地反映所述核酸的最初比例。這是由于不同核酸的擴(kuò)增比例的差異。例如，短鏈的核酸通常比第二種較長的鏈更加快速地被擴(kuò)增。由于這種問題，用現(xiàn)有方法來量化核酸比例間的小差別通常是不容易的。例如，對(duì)HIV-1病毒加載的兩個(gè)評(píng)價(jià)結(jié)果相差0.3個(gè)對(duì)數(shù)值(log)(2倍)，在目前被認(rèn)為是相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果。本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)在于提供用于在樣品中量化至少兩種核酸的量的最初比例的改進(jìn)方法。采用本發(fā)明的方法，可以測(cè)定比例之間的小差別。此外，本發(fā)明還可以在所述核酸擴(kuò)增過程中和/或之后直接測(cè)定最初比例。這可以快速自動(dòng)地篩選大量樣品。本發(fā)明的方法涉及直接測(cè)定最初的核酸比例，可以與高通量的自動(dòng)化實(shí)踐操作相結(jié)合。本發(fā)明提供通過多重核酸擴(kuò)增反應(yīng)量化樣品中的至少兩種感興趣的核酸的量的最初比例的方法，包括-在所述擴(kuò)增反應(yīng)中擴(kuò)增所述感興趣的核酸；-在所述反應(yīng)中，在至少兩個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)上測(cè)定至少兩種感興趣的核酸的量；-從所述至少兩個(gè)測(cè)定值中確定所述至少兩種感興趣的核酸的擴(kuò)增比率；-將所述比率與參照值比較；和-從所述比較中確定所述樣品中的所述至少兩種感興趣的核酸的量的最初比例。樣品中的至少兩種核酸的量的最初比例在此是指，所述樣品中的第一種核酸的最初量與所述樣品中的至少第二種核酸的最初量的關(guān)系。樣品中的核酸的最初量是在所述核酸被顯著擴(kuò)增之前所述核酸在所述樣品中的量。所述最初量優(yōu)選基本上等于當(dāng)所述樣品被獲得時(shí)所述樣品中存在的核酸的量。如在此所用，術(shù)語“核酸的量的比例”和“核酸比例”是等價(jià)的。令人驚奇地，采用本發(fā)明的方法，能夠測(cè)定所述核酸比例中的小改變。當(dāng)前，已經(jīng)能夠精確地、可信地測(cè)定所述核酸比例的小差別。在較早的時(shí)間點(diǎn)上檢測(cè)生物學(xué)上重要的變化是非常重要的。本領(lǐng)域人員不會(huì)預(yù)見到本發(fā)明的方法適合于精確地量化小的核酸比例的差別，這是因?yàn)楸景l(fā)明的方法包括核酸擴(kuò)增。如本領(lǐng)域通常所認(rèn)為的，由于許多因素，例如存在的酶/核苷酸/核酸的量、溫度、培養(yǎng)時(shí)間、鹽濃度、樣品的(組織)來源等，核酸擴(kuò)增的結(jié)果發(fā)生一定程度的變化。因此，包括核酸擴(kuò)增的方法并不總被認(rèn)為適合于量化核酸比例的小差別。本領(lǐng)域已經(jīng)嘗試，將兩個(gè)或多個(gè)定量擴(kuò)增反應(yīng)綜合到一個(gè)反應(yīng)瓶或管中，因此，通常被限制于將獨(dú)立量化擴(kuò)增共擴(kuò)增到一個(gè)反應(yīng)瓶或管中，每個(gè)定量擴(kuò)增具有其內(nèi)在校準(zhǔn)值(calibrator)。該方法被應(yīng)用于PCR13和NASBA14擴(kuò)增中。但是，這種方法不直接測(cè)定兩種或多種獨(dú)立核酸靶序列之間的最初比例，而是獨(dú)立的定量共擴(kuò)增，它們具有不同的效率，并要非常復(fù)雜地使用每一核酸靶序列的內(nèi)在校準(zhǔn)值。因此，并不總是很容易測(cè)定所述核酸比例的小差別。但是，本發(fā)明的方法獲得了核酸比例的小差別的精確結(jié)果。擴(kuò)增比例直接與核酸的量的最初比例相關(guān)。如果核酸以較大的不同量存在，還可以測(cè)定核酸的最初比例。采用本發(fā)明的方法，可以在3-4倍的動(dòng)力學(xué)范圍內(nèi)測(cè)定核酸的量的最初比例。這是指即使一種核酸的量超過另一種核酸的量3-4倍，仍可以測(cè)定它們之間的比例。例如，這對(duì)于測(cè)定細(xì)胞器核酸或病原體核酸與豐富的細(xì)胞核核酸之間的比例來說是非常重要的。如果不能測(cè)定顯著差別的核酸的量的比例，有時(shí)不可能檢測(cè)小量(重要)的核酸的。按照本發(fā)明，核酸擴(kuò)增比率對(duì)所述核酸的量的最初比例具有指示作用。還有一種情形，最初以較低量存在的第一種核酸比第二種核酸更快地被擴(kuò)增。由于許多不同因素可能發(fā)生這種情況，例如由于核酸長度。雖然所述第一種核酸的最初量較低，但是擴(kuò)增后，可能存在較高量的所述第一種核酸。在本領(lǐng)域，以前這有時(shí)是通過擴(kuò)增進(jìn)行量化的缺陷，特別是通過多重?cái)U(kuò)增進(jìn)行的量化。但是，采用本發(fā)明的方法，這不成為一個(gè)問題，因?yàn)闇y(cè)定的是擴(kuò)增比率，而不是擴(kuò)增核酸的生成量。可以在達(dá)到所述核酸的檢測(cè)水平后，測(cè)定核酸的擴(kuò)增比率。核酸的檢測(cè)水平是指用特定檢測(cè)方法檢測(cè)所述核酸所需的所述核酸的最小量。顯然，檢測(cè)水平依賴于所用的檢測(cè)方法。此外，核酸的擴(kuò)增比率優(yōu)選在達(dá)到所述核酸的擴(kuò)增限度和/或檢測(cè)限度之前被確定。核酸的擴(kuò)增限度是指在擴(kuò)增反應(yīng)過程中產(chǎn)生的所述核酸的最大量。限制核酸產(chǎn)生的因素包括存在的核苷酸的量。如果不存在更多的核苷酸，再也不會(huì)生成核酸。檢測(cè)限度是指可以被檢測(cè)的生成核酸的最大量。例如，如果用能夠雜交到該核酸上的探針來檢測(cè)生成的核酸，探針的量會(huì)限制可以被檢測(cè)的核酸的量。如果不能獲得更多的探針，可以繼續(xù)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，但是新生成的核酸再也不能被檢測(cè)到。在達(dá)到檢測(cè)量后并且在達(dá)到擴(kuò)增限度和/或檢測(cè)限度之前，可以通過在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)上測(cè)定所述的量，以及確定兩個(gè)獲得值之間的斜率來確定核酸的擴(kuò)增比率。但是，優(yōu)選在至少三個(gè)時(shí)間點(diǎn)上測(cè)定核酸的量?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域知曉的合適方法來確定所述至少兩個(gè)繪圖值(plottedvalue)之間的斜率。例如，可以用至少兩個(gè)值來繪制曲線，用X軸表示時(shí)間，而Y軸表示所檢測(cè)的核酸的量。接著，可以確定基本上連接所述值的曲線的斜率。當(dāng)然，采用現(xiàn)有的計(jì)算機(jī)技術(shù)，不必手工繪制所述曲線?？梢灾苯永缡褂糜?jì)算機(jī)計(jì)算特定一組值的斜率。在本領(lǐng)域，許多用于測(cè)定特定一組值之間的斜率的可替代方法是已知的。這種方法可以被用于本發(fā)明的方法中。通常，在擴(kuò)增反應(yīng)中，核酸首先被線性擴(kuò)增，而在恰達(dá)到擴(kuò)增限度時(shí)，核酸趨向非線性擴(kuò)增。對(duì)于檢測(cè)來說，這也是正確的，恰好在達(dá)到檢測(cè)限度之前非線性地增加。在核酸的擴(kuò)增和檢測(cè)中，優(yōu)選在線性增加過程中確定擴(kuò)增比率。因此，在優(yōu)選實(shí)施方案中，提供了本發(fā)明的方法，其中所述時(shí)間點(diǎn)選擇在被檢測(cè)的核酸的量呈線性增加的時(shí)間間隔內(nèi)。線性增加是指核酸的量在相同長度的時(shí)間間隔內(nèi)基本上相當(dāng)?shù)卦黾?。在本發(fā)明中，核酸的擴(kuò)增比率是指在特定時(shí)間間隔內(nèi)生成的核酸的量。例如，所述擴(kuò)增比率被表示為每秒鐘的核酸增加。應(yīng)當(dāng)測(cè)定至少兩種感興趣的核酸的擴(kuò)增比率，將所述比率與參考值比較。所述參考值是通過用不同的已知量的核酸進(jìn)行本發(fā)明的方法來獲得的。當(dāng)然，與用本發(fā)明的方法量化的核酸相同種類的核酸，優(yōu)選被用于產(chǎn)生參考值。例如，如實(shí)施例所示，優(yōu)選生成參考曲線。優(yōu)選，用包括不同最初比例的所述核酸的多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)來產(chǎn)生參考曲線。更加優(yōu)選地，所述不同最初比例實(shí)際上包括有望在樣品中被測(cè)定的相同的最初比例。按照一個(gè)實(shí)施方案，用來自與將要量化核酸的細(xì)胞相同種類的細(xì)胞的核酸來產(chǎn)生參考曲線。優(yōu)選地，所述核酸與將要量化的核酸種類相同。在產(chǎn)生參考值后，可以用本發(fā)明的方法來處理樣品。將感興趣的核酸的擴(kuò)增比率與所述參考值比較。從這種比較中，可以確定所述樣品中的所述感興趣的核酸的量的最初比例。這在擴(kuò)增核酸的比例未保持與所述核酸的起始比例相同時(shí)也是可以實(shí)施的。如果第一種核酸較第二種核酸更快地被擴(kuò)增，這也將會(huì)反映在所述核酸的參考值上。如果考慮不同核酸靶序列之間的擴(kuò)增效率的差異，將會(huì)獲得更加精確的結(jié)果。特別地，在實(shí)時(shí)監(jiān)控的多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)中，可區(qū)別的信號(hào)的增加是多種核酸靶序列競爭單個(gè)反應(yīng)和/或單個(gè)瓶或試管中的反應(yīng)試劑的結(jié)果，核酸靶序列在單個(gè)反應(yīng)和/或單個(gè)瓶或試管中被擴(kuò)增。許多因素在不同程度上影響核酸的擴(kuò)增效率。被發(fā)現(xiàn)影響核酸擴(kuò)增效率的因素為例如所述核酸序列的性質(zhì)(例如GC量以及所述核酸分子的長度)、對(duì)所述核酸的修飾(例如甲基化)，以及所述核酸的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。由于各種核酸的擴(kuò)增在不同程度上受這些因素的影響，被擴(kuò)增核酸的量常常不能精確地反映所述核酸的最初量。因此，在本領(lǐng)域的現(xiàn)有方法中，各種核酸的量通常從內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物中推導(dǎo)得出。在推定被擴(kuò)增的核酸的量后，確定量間的比例。但是，在本發(fā)明的方法中，確定擴(kuò)增比率而不是被擴(kuò)增的核酸的量。因此，在本發(fā)明的方法中，不需要用于確定被擴(kuò)增的核酸的量的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物。但是，如果與第二種核酸相比，第一種核酸被更加有效地?cái)U(kuò)增，則存在所述第一種核酸較其他核酸“過度生長”風(fēng)險(xiǎn)。在這種情況下，可能存在所述第二種核酸未能及時(shí)達(dá)到可檢測(cè)的量的風(fēng)險(xiǎn)，有時(shí)甚至根本不存在。如果所述第二種核酸根本未達(dá)到可檢測(cè)的量，不能確定核酸的量的起始比例。也可能在第一種核酸已經(jīng)達(dá)到擴(kuò)增限度或檢測(cè)限度或其非線性階段時(shí)，第二種核酸僅達(dá)到檢測(cè)水平。常常在DNA和RNA擴(kuò)增之間存在擴(kuò)增比率的顯著差別。這是由于多種原因，例如其中DNA和RNA的結(jié)構(gòu)之間的巨大差異，以及對(duì)不同種類酶的需求。但是，當(dāng)僅用DNA或僅用RNA進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，常常也存在擴(kuò)增效率的差異。因此，在優(yōu)選實(shí)施方案中，提供本發(fā)明的方法，其中所述核酸擴(kuò)增反應(yīng)中的至少一種可變因素被調(diào)節(jié)，使得在一種或多種感興趣的核酸達(dá)到擴(kuò)增和/或檢測(cè)限度或其非線性階段之前，所有感興趣的核酸都達(dá)到可檢測(cè)的水平。為了對(duì)快速擴(kuò)增核酸進(jìn)行“彌補(bǔ)”，優(yōu)選調(diào)整可變因素，該因素以不同于對(duì)另一種感興趣的核酸的擴(kuò)增效率的影響程度影響一種感興趣的核酸的擴(kuò)增效率。例如，可以被調(diào)節(jié)主要影響通常被緩慢擴(kuò)增的核酸的擴(kuò)增效率的可變因素。所述擴(kuò)增效率優(yōu)選被提高。當(dāng)然，也可能調(diào)節(jié)主要影響(優(yōu)選降低)通常被快速擴(kuò)增的核酸的擴(kuò)增效率的可變因素?？梢哉{(diào)節(jié)許多可變因素，以影響至少一種核酸的擴(kuò)增比率。例如，可以調(diào)節(jié)擴(kuò)增子的長度。但是，優(yōu)選地調(diào)節(jié)至少一種引物和/或探針。例如，調(diào)節(jié)引物/探針序列，使得核酸可以被更加有效地?cái)U(kuò)增/檢測(cè)。引物或探針的長度也是可被改變的。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述可變因素包括至少一種引物的濃度。令人驚奇地，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，雖然核酸擴(kuò)增反應(yīng)大部分含有過量引物，但是引物的濃度顯著地影響核酸的擴(kuò)增比率。顯然，即使過量存在引物，但是引物濃度變化產(chǎn)生顯著影響。優(yōu)選地，至少一種引物的濃度顯著地不同于至少另一種引物的濃度。顯著差別是指所述濃度間的差別大于由于正常分散例如由于對(duì)試劑的(人為)處理引起的差別。優(yōu)選地，所述濃度差別到一定程度，以致一種感興趣的核酸的擴(kuò)增效率相對(duì)于另一種感興趣的核酸受到不同程度的影響。優(yōu)選地，至少一套能夠與感興趣的核酸退火的引物的濃度被調(diào)整。一套引物是指一套包括能夠與特定核酸退火的正向引物和能夠與同一(種類)的核酸的互補(bǔ)鏈退火的反向引物。更加優(yōu)選地，至少一套能夠與感興趣的核酸退火的引物的濃度顯著不同于至少另一套能夠與感興趣的核酸退火的引物的濃度。在實(shí)施例中證明當(dāng)使用不同量的引物時(shí)，核酸擴(kuò)增效率受巨大影響。例如，可以調(diào)節(jié)引物套的量，使得至少一種核酸被可選擇性擴(kuò)增。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述可變因素包含鹽濃度。令人驚異的是，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)鹽濃度的變化以不同的方式影響不同核酸的擴(kuò)增效率。因此，通過改變鹽濃度，可以影響特定的感興趣的核酸的擴(kuò)增比率。采用本發(fā)明的方法，有可能影響通常被緩慢地?cái)U(kuò)增的核酸的擴(kuò)增比率，使得所述核酸在其他核酸達(dá)到擴(kuò)增和/或檢測(cè)限度之前達(dá)到可檢測(cè)的水平?？梢蕴岣哌@種通常被緩慢擴(kuò)增的核酸的擴(kuò)增比率。還有可能降低至少一種通常被快速擴(kuò)增的核酸的擴(kuò)增效率。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法被用于量化至少兩種獨(dú)立的核酸序列的量的最初比例。獨(dú)立核酸序列在此是指所述效率用不同引物擴(kuò)增。采用與感興趣的核酸相同的引物，本發(fā)明的方法需要非內(nèi)部校準(zhǔn)值。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述感興趣的核酸中的至少一種包括RNA。特別地，mRNA的量指示特定基因轉(zhuǎn)錄效率，因而指示細(xì)胞的(轉(zhuǎn)錄)活性。在還有另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，至少感興趣的核酸之一包括DNA。如實(shí)施例中所示，采用本發(fā)明的方法，還可以精確地量化DNA和RNA的混合物的量比例。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，提供本發(fā)明的方法，其中所述多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)包括其中核酸被連續(xù)擴(kuò)增的擴(kuò)增反應(yīng)，例如NASBA。其中核酸被連續(xù)擴(kuò)增的擴(kuò)增反應(yīng)是優(yōu)選的，因?yàn)橐呀?jīng)發(fā)現(xiàn)連續(xù)擴(kuò)增核酸特別適合于檢測(cè)所述核酸的擴(kuò)增比率。連續(xù)擴(kuò)增核酸，每個(gè)時(shí)間間隔的被擴(kuò)增核酸的量指示所述核酸的擴(kuò)增比率。在采用多個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)中，例如PCR，核酸不是被連續(xù)地?cái)U(kuò)增。應(yīng)當(dāng)謹(jǐn)慎地選擇每個(gè)循環(huán)的時(shí)間(即每個(gè)循環(huán)的時(shí)間量)。如果感興趣的核酸比每個(gè)循環(huán)時(shí)間更緩慢地被擴(kuò)增，則當(dāng)另一個(gè)循環(huán)開始時(shí)，其還未被完全擴(kuò)增。為了避免核酸在循環(huán)中未被完全擴(kuò)增的風(fēng)險(xiǎn)，每個(gè)循環(huán)的時(shí)間必需相對(duì)長。在那種情況下，大部分或者全部的感興趣的核酸將較每個(gè)循環(huán)時(shí)間更快地被擴(kuò)增。然后，被擴(kuò)增的核酸不得不“等待”新循環(huán)的開始。因此，在基于循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)中，每個(gè)時(shí)間間隔中被擴(kuò)增的核酸的量不僅反映所述核酸的擴(kuò)增比率。其還反映無核酸被擴(kuò)增的循環(huán)之間的間隔。因此，對(duì)于本發(fā)明的方法來說，其中核酸被連續(xù)擴(kuò)增的核酸擴(kuò)增反應(yīng)是優(yōu)選的，例如NASBA。本發(fā)明的方法適合于確定細(xì)胞生物體的功能(障礙)。如在本發(fā)明人的專利申請(qǐng)WO0246470中所公開，可以通過測(cè)定在從所述生物體獲得的樣品中的第一種內(nèi)共生體細(xì)胞器核酸和/或其基因產(chǎn)物的量相對(duì)于第二種核酸和/或其基因產(chǎn)物的量的比例來測(cè)定細(xì)胞器的功能(障礙)。所述基因產(chǎn)物可能包括mRNA。采用本發(fā)明的方法，可以精確地測(cè)定第一種內(nèi)共生體細(xì)胞器核酸和/或其基因產(chǎn)物的量相對(duì)于第二種核酸和/或其基因產(chǎn)物的量的比例。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，提供本發(fā)明的方法，其中所述感興趣的核酸中的至少一種包括內(nèi)共生體細(xì)胞器核酸。還可以通過測(cè)定非內(nèi)共生體核酸的比例來確定細(xì)胞器的功能(障礙)。例如，mRNA的量與其對(duì)應(yīng)的基因的量的比例指示細(xì)胞中的(轉(zhuǎn)錄)活性?；蚺c其對(duì)應(yīng)的mRNA的量比例的改變指示細(xì)胞器狀態(tài)的改變。本發(fā)明還提供用于確定細(xì)胞器的功能的方法，包括確定在從所述生物體獲得的樣品中，第一種核酸的量相對(duì)于第二種核酸的量的比例，其中所述比例用按照本發(fā)明的方法來量化。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一種核酸包括內(nèi)共生體的核酸。優(yōu)選地，第一種內(nèi)共生體細(xì)胞器核酸的量的所述比例是相對(duì)于所述樣品中的可檢測(cè)的核酸的量來確定的。如果所述內(nèi)共生體核酸與細(xì)胞核的核酸之間的比例被確定，則可以檢測(cè)內(nèi)共生核酸的量中的小變化。細(xì)胞核酸比例的改變指示一種疾病的發(fā)生或發(fā)展。還可以確定疾病的階段。例如，可以有規(guī)律地獲取來自患病個(gè)體的樣品。如果一種疾病涉及特定核酸減少，可以研究所述樣品中，所述核酸的量相對(duì)于另一種核酸的(優(yōu)選相對(duì)恒定的)量的比例。如果所述比例持續(xù)下降，指示所述疾病進(jìn)一步發(fā)展。如果所述比例在隨后的時(shí)間點(diǎn)上升高，指示所述患者康復(fù)。因此，可以確定疾病階段。因此，本發(fā)明提供用確定疾病階段的方法，包括確定自患有所述疾病或者具有患所述疾病的風(fēng)險(xiǎn)的生物體中獲得的樣品中的第一種細(xì)胞器核酸的量相對(duì)于第二種核酸的量的比例，其中所述比例用本發(fā)明的方法來量化。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一種核酸包括內(nèi)共生體細(xì)胞器核酸，因?yàn)楫?dāng)個(gè)體患病時(shí)，細(xì)胞器核酸常常被影響。所述第二種核酸優(yōu)選包括細(xì)胞核核酸，例如小細(xì)胞核核蛋白核酸，因?yàn)槠涫瞧毡榇嬖诘?。?yōu)選地，所述疾病包括HIV相關(guān)疾病，腫瘤相關(guān)疾病和/或一種血管生成過程。在HIV感染后，個(gè)體通常在很長時(shí)期內(nèi)不具有臨床癥狀。在生長腫瘤的第一階段，或者在血管生成過程開始的第一階段，情況也是一樣的。這種血管生成過程通常與疾病相關(guān)，例如腫瘤相關(guān)疾病和/或心血管疾病。在這種疾病的第一階段，患者通常沒有察覺到這種疾病。但是，早期診斷對(duì)最佳治療是重要的。在這種情況下，可以使用本發(fā)明的方法，因?yàn)殡m然還未出現(xiàn)臨床癥狀，但是在疾病的早期，細(xì)胞中的核酸比例通常已經(jīng)被改變。本發(fā)明的用于對(duì)疾病進(jìn)行分期的方法可以被用于(早期)診斷。例如，可以在特定的時(shí)間間隔內(nèi)，用本發(fā)明的方法常規(guī)地對(duì)人進(jìn)行檢測(cè)?；蛘?，可以在人具有某些臨床癥狀的瞬間對(duì)人進(jìn)行檢測(cè)。特定的核酸比中的改變指示特定程度的疾病程度。這種疾病的種類不必通過本發(fā)明的方法來診斷。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供用于確定疾病的階段的本發(fā)明的方法，其中所述第一種核酸和所述第二種核酸包括細(xì)胞DNA和RNA。更加優(yōu)選地，所述RNA包括來源于所述DNA的mRNA。通過這種方式可以確定轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的水平。與轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的天然水平比較，轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的水平的改變指示生物體的被改變的功能。所述被改變的功能可能是生物體的功能障礙，因?yàn)橐环N疾病和/或因?yàn)樘囟ㄌ幚淼母弊饔谩＠?，所述功能障礙包括轉(zhuǎn)錄水平下降?；蛘?，所述被改變的機(jī)能可以是被增強(qiáng)的所述生物體的機(jī)能，例如在所述疾病的治療和/或治愈過程中。所述功能障礙還可能包括被增強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄水平。一種疾病或疾病的治療可能包括細(xì)胞DNA的量的消耗。但是，所述消耗至少部分地通過增強(qiáng)所述DNA的轉(zhuǎn)錄來補(bǔ)償，至少在所述疾病的第一階段。通過這種方式，與所述DNA的量比較，來源于所述細(xì)胞DNA的RNA的量根本不會(huì)減少，或者相對(duì)較少地減少。然后，所述疾病或治療的征候性副作用還未被(完全)感覺到。但是，在所述DNA的量進(jìn)一步消耗時(shí)，來源于所述DNA的RNA量最終也將顯著地下降。然后發(fā)生副作用。通常，在出現(xiàn)副作用時(shí)，進(jìn)行疾病治療或者減少或停止治療。但是，通過這種常規(guī)方式，患者已經(jīng)受到所述副作用。但是，采用本發(fā)明的方法，可以預(yù)測(cè)包括臨床癥狀的副作用。例如，細(xì)胞核酸的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯水平改變指示改變的細(xì)胞生物體的機(jī)能，例如所述生物體的功能障礙包括(將出現(xiàn)的)副作用。第一種細(xì)胞DNA和/或其基因產(chǎn)物相對(duì)于第二種細(xì)胞核酸或其基因產(chǎn)物的量的比例的變化也指示改變的細(xì)胞生物體的機(jī)能。本發(fā)明的其他可能用途在于候選藥物的檢測(cè)，可能的藥劑或藥物組合物的有益活性和/或副作用，候選藥物例如候選的抗寄生蟲化合物、抗生素化合物、抑制細(xì)胞生長化合物等。例如，本發(fā)明提供一種用于確定候選化合物的治療活性和/或可能的副作用的方法，例如確定其用于治療細(xì)胞生物體的功能障礙的有用性，包括用本發(fā)明的方法，在從所述生物體獲得的樣品中，確定第一種核酸的量，優(yōu)選內(nèi)共生體細(xì)胞器核酸，相對(duì)于第二種核酸的量的比例。所述第二種核酸優(yōu)選包括細(xì)胞核酸例如核小核糖核蛋白核酸，因?yàn)槠淦毡榇嬖凇?yōu)選地，所述生物體或基本上相關(guān)的生物體，例如屬于同一物種或種屬，產(chǎn)生所述化合物。如果在所述候選化合物被施用給所述生物體后，所述比例被改變，這指示當(dāng)所述化合物被施用給所述生物體時(shí)與所述化合物相關(guān)的治療活性和/或副作用。此外，這還指示與所述化合物在基本上相關(guān)的生物體中相關(guān)的治療活性和/或副作用。因此，對(duì)于確定候選化合物在細(xì)胞生物體的功能障礙治療中的治療性活和/或副作用，在本發(fā)明的方法沒有必要嚴(yán)格地使用同一中生物體。也可以使用基本上相關(guān)的生物體。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于確定一種藥劑的治療活性和/或可能的副作用，包括采用本發(fā)明的方法，確定在自生物體獲得的樣品中，第一種核酸優(yōu)選內(nèi)共生體細(xì)胞器核酸的量相對(duì)于第二種核酸的量的比例。所述第二種核酸優(yōu)選包括細(xì)胞核酸。優(yōu)選所述生物體被提供了所述藥劑。按照本發(fā)明，治療活性是指至少部分地治療一種疾病的性能?；衔锏母弊饔迷诖耸侵噶硪环N作用，而不是所述化合物的用途。所述副作用可能是不需要的作用。例如，治療性化合物可能消除一種疾病，并且同時(shí)降低生物體的代謝。然后，所述代謝的所述降低被稱作(負(fù)面的)副作用。或者，化合物的副作用可以是一種有益作用，例如針對(duì)另一種疾病的瞬時(shí)免疫。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述治療活性包括針對(duì)HIV相關(guān)疾病和/或腫瘤相關(guān)疾病的治療活性。例如，所述藥劑包括細(xì)胞生長抑制劑(cytostaticum)，可選擇地結(jié)合其他治療劑，例如抗逆轉(zhuǎn)錄病毒的治療劑。根據(jù)在荷蘭的ATHENA研究，由于不利的副作用，40％進(jìn)行抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的患者需要變換抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療。因此，由于本發(fā)明的方法能夠在基本上出現(xiàn)(嚴(yán)重的)臨床癥狀之前檢測(cè)副作用，在這種治療中，該方法是非常被期望的。然后，在基本上出現(xiàn)所述臨床作用之前，所述治療已經(jīng)被停止和/或被改變。在那種情況下，可能不會(huì)出現(xiàn)或者在較小程度上出現(xiàn)所述臨床癥狀。這可以防止許多痛苦。因此，在優(yōu)選方面，本發(fā)明的方法被提供，其中在實(shí)施本發(fā)明的方法時(shí)，基本上不會(huì)出現(xiàn)所述副作用。按照本發(fā)明，“基本上不出現(xiàn)”是指副作用不(尚未)或者僅部分地通過臨床癥狀表現(xiàn)出來。在一個(gè)方面提供本發(fā)明的方法，其中所述化合物或者藥劑包括細(xì)胞生長抑制劑。例如，通常使用的細(xì)胞生長抑制劑包括烷基化化合物、抗有絲分裂細(xì)胞生長抑制劑、抗腫瘤抗生素和拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑。其非限制性例子包括苯丁酸氮芥、環(huán)磷酰胺、雌莫司汀、異環(huán)磷酰胺、左旋苯丙氨酸氮芥、塞替派、白消安、曲奧舒凡、carmustne、洛莫司汀、順鉑、卡鉑、oxaliplatine、氮烯咪胺、甲基芐肼、替莫唑胺、長春花堿、長春新堿、長春地辛、多烯紫杉醇、紫杉醇、柔紅霉素、阿霉素、表阿霉素、idarubicine、米托蒽醌、博萊霉素、更生霉素、絲裂霉素、伊立替康、拓?fù)涮婵?、足葉乙甙、鬼臼甲叉苷、安吖啶、天冬酰胺酶、克拉屈濱、羥基尿素、pentostatine、methotrexaat和/或雷替曲塞(raltitrexed)。在抗逆轉(zhuǎn)錄病毒的治療和/或腫瘤相關(guān)疾病的治療過程中，通常使用核苷和/或核苷類似物。因?yàn)檫@些類似物干擾生物體中的復(fù)制和/或轉(zhuǎn)錄過程，包括巨大的副作用的風(fēng)險(xiǎn)。然后，內(nèi)共生體細(xì)胞器核酸的量通常也被改變。因此，當(dāng)生物體用包括核苷和/或核苷類似物的藥劑處理時(shí)，本發(fā)明的方法非常適合。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種本發(fā)明的方法，其中所述化合物或藥劑包括核苷和/或核苷類似物。這種類似物的非限制性例子為氟達(dá)拉濱、巰嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、氟尿嘧啶和/或吉西他濱。在另一個(gè)方面，本發(fā)明的方法被提供，其中所述化合物或藥劑包括AZT、ddI、ddC、d4T、3TC、替諾福韋和/或阿巴卡韋。在本發(fā)明的方法中，所述生物體或者基本上相關(guān)的生物體優(yōu)選被提供了所述化合物或藥劑。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述治療活性包括針對(duì)涉及血管生成、維持和/或崩解過程(生血管過程或血管生成)的治療活性。血管生成是不同方面的指示物。例如，血管生成水平升高，指示出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞依賴于新血管生長，以維持治療質(zhì)量的擴(kuò)張。一個(gè)方面，需要血管將營養(yǎng)攜帶到腫瘤部位，而另一方面，需要將廢棄物質(zhì)從腫瘤中運(yùn)送出。因此，可以用抗血管生成的藥物間接地治療腫瘤。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了本發(fā)明的方法，用于候選化合物或藥劑的治療活性和/或可能的副作用，其中所述化合物或藥劑包括至少如下抗生血管藥的一種2ME2、制管張素(Angiostatin)、Angiozyme、抗-VEGFRhuMAb、Apra(CT-2584)、Avicine、氟草胺(Benefin)、BMS275291、羧基酰氨基三唑(Carboxyamidotriazole)、CC4047、CC5013、CC7085、CDC801、CGP-41251(PKC412)、CM101、CombretastatinA-4藥物前體、EMD121974、血管內(nèi)皮抑素(Endostatin)、Flavopiridol、金雀異黃素(GCP)、綠茶提取物、IM-862、ImmTher、干擾素α、白細(xì)胞介素-12、易瑞沙(Iressa，ZD1839)、馬立馬司他(Marimastat)、Metastat(Col-3)、Neovastat、奧曲肽(Octreotide)、紫杉醇、青霉胺、Photofrin、Photopoint、PI-88、Prinomastat(AG-3340)、PTK787(ZK22584)、R0317453、Solimastat、Squalamine、SU101、SU5416、SU-6668、Suradista(FCE26644)、蘇拉明(Suramin)(Metaret)、四硫鉬酸鹽(Tetrathiomolybdate)、沙利度胺(Thalidomide)、TNP-470、Vitaxin。但是，技術(shù)人員能夠想起更多可被用于抗血管生成的藥物。本發(fā)明的方法還可以被用于(選擇性的)毒性檢測(cè)。例如，可以通過確定化合物是否能夠改變生物體中的細(xì)胞核酸的比例，檢測(cè)除草劑、殺蟲劑、抗寄生蟲化合物和/或抗生素化合物的毒性活性。因此，本發(fā)明提供一種方法，用于確定候選化合物引起細(xì)胞生物體的功能障礙的毒性，包括用本發(fā)明的方法確定從生物體中獲得的樣品中的第一種核酸的量相對(duì)于第二種核酸的量的比例。優(yōu)選地，所述生物體或相關(guān)生物體已經(jīng)被提供所述化合物。所述第一種核酸優(yōu)選包括內(nèi)共生體細(xì)胞器核酸。所述第二種核酸優(yōu)選包括(遍在的)細(xì)胞核核酸。采用本發(fā)明的方法，例如，有可能檢測(cè)候選化合物通過例如起抑制細(xì)胞生長的或甚至是細(xì)胞毒性作用引起細(xì)胞生物體功能障礙的能力。在優(yōu)選實(shí)施方案中，還檢測(cè)選擇性，使用或者將在此(優(yōu)選在平行試驗(yàn)中)提供的方法應(yīng)用到第一種生物體上。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法還進(jìn)一步被應(yīng)用于基本上不相關(guān)的第二種生物體上。所述不相關(guān)的第二種生物體優(yōu)選屬于不同的科或目。更加優(yōu)選地，所述不相關(guān)的第二種生物體屬于至少一種不同的綱或門，最優(yōu)選地屬于不同界的生物體。例如，可以通過在第一種目標(biāo)生物體中或者僅在所述第一種生物體的細(xì)胞中檢測(cè)候選化合物，來檢測(cè)選擇性。所述第一種生物體可以例如是細(xì)菌或寄生蟲。宿主或其細(xì)胞也被檢測(cè)。這種宿主優(yōu)選是一種基本上不相關(guān)的第二種生物體，例如一種哺乳動(dòng)物或植物。作為另一種可能，可以通過本發(fā)明的方法檢測(cè)候選化合物在農(nóng)作物或其細(xì)胞中的活性，以及所述候選化合物在基本上不相關(guān)的雜草植物或其細(xì)胞中的活性。通過這種方式，可以發(fā)現(xiàn)一種化合物具有選擇性的毒性作用或選擇性的治療作用。如果候選化合物似乎能夠引起所述雜草植物發(fā)生功能障礙，但是不會(huì)引起所述農(nóng)作物發(fā)生功能障礙，所述化合物可能是潛在的除草劑。還有可能平行地檢測(cè)來源于個(gè)體的正常細(xì)胞，或者與異常細(xì)胞比較，例如來源于同一個(gè)體的腫瘤細(xì)胞。通過這種方式，有可能檢測(cè)和篩選腫瘤特異性的化合物或至少選擇性抑制細(xì)胞生長的化合物或細(xì)胞毒性化合物。這種化合物可以被用于治療所述個(gè)體或具有相似或相關(guān)疾病其他個(gè)體。在一個(gè)方面，提供本發(fā)明的方法，其中所述第一種核酸和所述第二種核酸從外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)和/或成纖維細(xì)胞獲得。特別地，使用PBMC是優(yōu)選的，因而可以使用例子生物體的血液樣品。血液樣品容易獲得，并且通常可以獲得相對(duì)大的量。因此，在優(yōu)選實(shí)施方案中，提供本發(fā)明的方法，其中所述樣品包括血液樣品。此外，本發(fā)明提供一種診斷試劑盒，包括至少一種用于實(shí)施按照本發(fā)明的方法的工具。優(yōu)選地，所述試劑盒包括至少一種引物和/或探針套，其適合于多重?cái)U(kuò)增和/或檢測(cè)與內(nèi)共生體細(xì)胞器相關(guān)或來源于內(nèi)共生體細(xì)胞器核酸，當(dāng)需要時(shí)，包括必需的擴(kuò)增試劑，例如那些在此詳細(xì)描述的說明書中例舉的或者本領(lǐng)域另外知曉的。特別地，本發(fā)明提供一種診斷試劑盒，其中所述試劑盒包括一種以上用于擴(kuò)增與細(xì)胞器相關(guān)的核酸序列的引物或探針套，優(yōu)選添加了一種用于擴(kuò)增與染色體相關(guān)的核酸的引物或探針套，例如snRNP的特異性引物或探針。特別地，本發(fā)明提供一種包括至少一種來自表1的引物或探針的試劑盒，用于多重?cái)U(kuò)增于細(xì)胞器相關(guān)的核酸序列。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的試劑盒包括至少一種與至少一種其他引物的量相比量顯著不同的引物。這種試劑盒特別適合用于實(shí)施本發(fā)明的方法，其中引物的濃度被調(diào)節(jié)，使得在一種或多種感興趣的核酸達(dá)到擴(kuò)增和/或檢測(cè)限度或其非線性階段之前，所有感興趣的核酸達(dá)到了可檢測(cè)水平。更加優(yōu)選地，本發(fā)明的試劑盒包括一種與至少一套其他能夠與感興趣的核酸退火的引物的含相比量顯著不同的至少一套能夠與感興趣的核酸退火的引物。優(yōu)選地，選擇引物(套)量中的所述差別，使得可以采用該引物濃度，影響一種感興趣的核酸的擴(kuò)增效率的程度不同于另一種感興趣的核酸。最優(yōu)選地，所述的量上的差別使得可以使用“彌補(bǔ)”快速擴(kuò)增的核酸的引物(套)的濃度，例如通過提高一種通常被緩慢擴(kuò)增的核酸的擴(kuò)增效率，或者通過降低通常被快速擴(kuò)增的核酸的擴(kuò)增效率。當(dāng)然，優(yōu)選地，當(dāng)用試劑盒提供時(shí)，所述擴(kuò)增試劑包括具有反轉(zhuǎn)錄酶活性的酶，例如PCR或NASBA擴(kuò)增所需的那些。本發(fā)明還提供通過按照本發(fā)明的方法可獲得的或可選擇的化合物在制備藥劑、除草劑、殺蟲劑、抗寄生蟲劑、細(xì)胞生長抑制劑等中的用途。優(yōu)選地，所述藥劑包括針對(duì)相關(guān)疾病、腫瘤相關(guān)疾病和/或血管生成過程的藥劑。因此，還提供一種通過本發(fā)明的方法獲得的或選擇的藥劑、除草劑、殺蟲劑、抗寄生蟲劑等。如下的實(shí)施例是用于更好地解釋和闡明本發(fā)明。而不是以任何方式限制本發(fā)明的保護(hù)范圍?？梢詫?shí)施許多可替換的實(shí)施方案，這些方案在本申請(qǐng)的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)施例所用的成分和一般方法學(xué)在表1中，總結(jié)實(shí)施例中使用的引物和探針。在20μl的反應(yīng)體積中進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的NASBA核酸擴(kuò)增反應(yīng)，其中含有40mMTris-pH8.5，70-90mMKCl、12mMMgCl2、5mM二硫蘇糖醇、1mM(各種)dNTP、2mM(各種)rNTP、375mM山梨糖醇、O.105μg/μl牛血清白蛋白、6.4單位AMVRT、32單位T7RNA聚合酶、0.08單位的RNAseH、在特定實(shí)施例中指出的濃度的引物和探針以及輸入的核酸。反應(yīng)中的KCl的量在70mM-90mM之間，取決于被擴(kuò)增的目標(biāo)。除了酶、山梨糖醇和/或牛血清白蛋白，完全混合物在加入到酶混合物之前，當(dāng)擴(kuò)增RNA時(shí)，加熱到65℃，3分鐘，而如果擴(kuò)增RNA+DNA或DNA時(shí)，加熱到95℃，3分鐘。在將混合物冷卻到41℃時(shí)，加入酶。將酶施加到小(200μl)微量離心管的蓋子上，蓋緊蓋子后，同時(shí)旋轉(zhuǎn)96根試管數(shù)秒鐘，以混合酶混合物與試管底部的其他試劑。旋轉(zhuǎn)后，將試管放置在41℃下，通過拍打試管再次混合物試劑。在41℃下放置3-5分鐘，再旋轉(zhuǎn)試管數(shù)秒鐘，收集試管底部的所有液體，放置到熒光計(jì)中。在熒光計(jì)(RetinaTMReader，CytoFluor4000)中，41℃下進(jìn)行擴(kuò)增90分鐘，每分鐘測(cè)定熒光信號(hào)(使用特異于熒光素和6-羅丹明的過濾裝置(filterset))。在標(biāo)準(zhǔn)條件下，在本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞(成纖維細(xì)胞和PBMC)，培養(yǎng)基中添加了實(shí)施例中定義的藥物或者假定的毒性或刺激性化合物。用Boom等16描述的方法或者用從Qiagen購實(shí)的專門的分離試劑盒(QiagenGmbH，MaxVolmerStrasse4，40724Hilden，Germany)按照生產(chǎn)商的方案使用，從細(xì)胞中分離核酸。將分離的核酸存儲(chǔ)在-80℃下直到進(jìn)一步的分析。通常用水稀釋核酸10倍，通常5μl被稀釋的核酸被用作NASBA擴(kuò)增反應(yīng)中的輸入物。實(shí)施例1在該實(shí)施例中，分析質(zhì)體中的不同比例的線粒體和染色體DNA靶包括2×103U1aDNA/8×103MtDNA、2×103U1aDNA/2×104MtDNA、2×103U1aDNA/4×104MtDNA、2×103U1aDNA/105MtDNA、2×103U1aDNA/2×105MtDNA分子。如上面的“所用的成分和樣品方法學(xué)”所述，制備反應(yīng)混合物，除了采用64單位的T7RNA聚合酶以及9.6單位的AMVRT，添加了2單位的限制性酶MspI。在該試驗(yàn)中所用的KCl濃度為90mM。在添加到酶混合物之前，除了擴(kuò)增酶、山梨糖醇和牛血清白蛋白之外，具有MspI的完全混合物在37℃下孵育12分鐘，使MspI剪切DNA，隨后加熱到95℃，3分鐘，來滅活DNA，使引物退火。在將混合物冷卻到41℃后，加入擴(kuò)增酶混合物。反應(yīng)混合物(雙混合物)含有兩套引物和信標(biāo)SnrpDp1和SnrpDp2(第一引物套，各0.2μM)以及MtDp1和MtDp2(第二引物套，各0.3μM)具有信標(biāo)SnrpDmb_2(ROX標(biāo)記)和MtDmb_2(FAM標(biāo)記)(各0.05μM)。參見表1中的引物和探針序列。調(diào)整熒光計(jì)(Retina讀出器或CytoFluor4000或EasyQ分析儀)的過濾裝置，來同時(shí)測(cè)量FAM和ROX標(biāo)記(FAM為485/20和530/25；ROX為590/20和645/40)。在具有兩個(gè)競爭擴(kuò)增的雙反應(yīng)中，時(shí)間上熒光性曲線的斜率與各種被擴(kuò)增物種的分子量的比例成正比。該結(jié)果顯示在圖1中。FAM和ROX的斜率之間的關(guān)系與輸入物中的線粒體DNA和染色體DNA的比例成線性關(guān)系。該結(jié)果可以被用于生成校準(zhǔn)曲線，而可以從該標(biāo)準(zhǔn)的校準(zhǔn)曲線中計(jì)算出每個(gè)細(xì)胞的線粒體DNA的拷貝數(shù)。實(shí)施例2兩位HIV-1感染的患者用抗病毒混合物治療，測(cè)定其血細(xì)胞中的線粒體DNA，作為對(duì)線粒體毒性的預(yù)測(cè)。在開始治療后的第0、4、8、12、16、24、36和48周采集血液。通過Ficoll-Isopaque純化，用該血液來制備外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。將PBMC存活地冷凍在添加了5％DMSO的培養(yǎng)基中，存儲(chǔ)在液氮中或者-150℃下直到使用。采用Boom的方法16，從105PBMC中提取核酸。1,000PBMC的核酸等價(jià)物被用作單管實(shí)時(shí)雙NASBA的輸入物，如實(shí)施例1所述，雙NASBA測(cè)量線粒體DNA和染色體DNA。反應(yīng)混合物(雙混合物)含有兩套引物和信標(biāo)SnrpDp1和SnrpD2p2(第一引物套，各0.2μM)以及MtDp12和MtDp2_2(第二引物套，各0.2μM)，具有信標(biāo)SnrpDmb_2(FAM標(biāo)記)和MtDmb_2(ROX標(biāo)記)(各0.05μM)。參見表1中的引物和探針序列。該分析的結(jié)果被表示為線粒體DNA的量/患者樣品的細(xì)胞(即PBMC)。該結(jié)果被總結(jié)在表2中。重復(fù)測(cè)定的分析清楚地顯示了，確定線粒體DNA和染色體DNA之間的比例的雙重檢測(cè)的可重復(fù)性和精確性，這是由于在多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)中優(yōu)化了引物的序列和濃度。與實(shí)施例1比較，在實(shí)施例2中，其他引物被用于擴(kuò)增，使得不僅可以使用更加平均的引物濃度，同時(shí)可以檢測(cè)400倍以上的比例。這是通過效率不均衡實(shí)現(xiàn)的，有利于染色體DNA，使得超過400倍比例的線粒體DNA競爭不過染色體DNA的擴(kuò)增。本發(fā)明的方法避免使用內(nèi)部校準(zhǔn)值和/或分開量化核酸靶序列，因而可以設(shè)計(jì)高通量檢測(cè)。實(shí)施例3在本實(shí)施例中，可以確定用于測(cè)定線粒體RNA和染色體DNA之間的比例的最佳引物濃度。在該實(shí)施例中，分析兩個(gè)健康個(gè)體中的線粒體RNA靶和染色體DNA靶的比例。用Boom方法16從PBMC分離的核酸被用作單管實(shí)時(shí)雙NASBA的輸入物，雙NASBA測(cè)定線粒體RNA和染色體DNA。反應(yīng)混合物(雙混合物)含有在兩種不同濃度下被檢測(cè)的兩套引物和信標(biāo)SnrpDp1和SnrpD2p2(用于染色體DNA的第一引物套)以及MtRp1_4和MtRp2_2(用于線粒體RNA的第二引物套)，具有信標(biāo)SnrpDmb_2(FAM標(biāo)記)和MtRmb(ROX標(biāo)記)(各0.05μM)。參見表1中的引物和探針序列。在該試驗(yàn)中，用于線粒體RNA擴(kuò)增的引物以0.4μM和0.2μM使用，分別結(jié)合0.05μM和0.2μM的引物濃度用于染色體DNA靶序列擴(kuò)增。如實(shí)施例1所述進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè)。調(diào)整熒光計(jì)的過濾裝置，以同時(shí)測(cè)量FAM和ROX標(biāo)記(FAM為485/20和530/25；ROX為590/20和645/40)。在具有兩個(gè)競爭擴(kuò)增的雙反應(yīng)中，時(shí)間上熒光性曲線的斜率與各種被擴(kuò)增物種的分子量的比例成正比。該結(jié)果顯示在圖2中。從該結(jié)果可以清楚看出，應(yīng)用被用于圖2的左邊兩組中的引物濃度，得到能夠說明的結(jié)果，并使得檢測(cè)的動(dòng)力學(xué)范圍置于恰在健康個(gè)體所期望的值之處。用于圖2的右邊兩組中的引物濃度產(chǎn)生不可解釋的結(jié)果，因?yàn)榫€粒體RNA靶序列未被擴(kuò)增到可檢測(cè)的水平。實(shí)施例4在本實(shí)施例中，確定用于測(cè)量線粒體RNA和染色體DNA之間的比例的最佳引物濃度。在本實(shí)施例中，分析兩個(gè)健康個(gè)體中的線粒體RNA靶和染色體DNA靶之間的比例。用Boom方法16從PBMC分離的核酸用作單管實(shí)時(shí)雙NASBA的輸入物，雙NASBA測(cè)定線粒體RNA和染色體DNA。反應(yīng)混合物(雙混合物)含有在兩種不同濃度下被檢測(cè)的兩套引物和信標(biāo)SnrpDp1和SnrpD2p2(用于染色體DNA的第一引物套)以及MtRp1_4和MtRp2_2(用于線粒體RNA的第二引物套)，具有信標(biāo)SnrpDmb_2(FAM標(biāo)記)和MtRmb(ROX標(biāo)記)(各0.05μM)。參見表1中的引物和探針序列。在該試驗(yàn)中，用于線粒體RNA擴(kuò)增的引物以0.4μM和0.3μM使用，分別結(jié)合0.2μM的引物濃度用于染色體DNA靶序列擴(kuò)增。重復(fù)進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè)，并如實(shí)施例3進(jìn)行實(shí)施。調(diào)整熒光計(jì)的過濾裝置，以同時(shí)測(cè)量FAM和ROX標(biāo)記(FAM為485/20和530/25；ROX為590/20和645/40)。在具有兩個(gè)競爭擴(kuò)增的雙反應(yīng)中，時(shí)間上熒光性曲線的斜率與各種被擴(kuò)增物種的分子量的比例成正比。該結(jié)果顯示在圖3中。從該結(jié)果可以清楚看出，應(yīng)用如在圖3的上面兩組中使用的引物濃度，得到能夠說明的結(jié)果，并使得檢測(cè)的動(dòng)力學(xué)范圍置于恰在健康個(gè)體所期望的值之處。用于圖3的下方兩組中的引物濃度產(chǎn)生較為不好的結(jié)果，特別地，下方左邊組為線粒體RNA信號(hào)，變平，變得接近不可分析。實(shí)施例5兩位HIV-1感染的患者用抗病毒藥物混合物治療，測(cè)定其血細(xì)胞中的線粒體RNA和DNA，作為對(duì)線粒體毒性的預(yù)測(cè)。在開始治療后的第0、4、8、12、16、24、36和48周采集血液。通過Ficoll-Isopaque純化，用該血液來制備外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。將PBMC存活地冷凍在添加了5％DMSO的培養(yǎng)基中，存儲(chǔ)在液氮中或者-150℃下直到使用。采用Boom的方法16，從105PBMC中提取核酸。1,000PBMC的核酸等價(jià)物被用作單管實(shí)時(shí)雙NASBA的輸入物，如實(shí)施例4所述，雙NASBA測(cè)量線粒體DNA和染色體DNA之間的比例，并且如實(shí)施例2所述，NASBA測(cè)量線粒體DNA和染色體DNA之間的比例。用于線粒體RNA的反應(yīng)混合物(雙混合物)含有兩套引物和信標(biāo)SnrpDp1和SnrpD2p2(用于染色體DNA的第一引物套)以及MtRp1_4和MtRp2_2(用于線粒體RNA的第二引物套)，具有信標(biāo)SnrpDmb_2(FAM標(biāo)記)和MtRmb(ROX標(biāo)記)(各0.05μM)。參見表1中的引物和探針序列。在該試驗(yàn)中，用于線粒體RNA擴(kuò)增的引物以0.4μM使用，結(jié)合0.2μM的引物濃度用于染色體DNA靶序列擴(kuò)增。重復(fù)擴(kuò)增和檢測(cè)，如實(shí)施例3中進(jìn)行。該分析的結(jié)果表示為線粒體RNA濃度/患者樣品的細(xì)胞(即PBMC)。結(jié)果總結(jié)在表3中。用于線粒體DNA的反應(yīng)混合物(雙混合物)含有兩套引物和信標(biāo)SnrpDp1和SnrpD2p2(第一引物套，各0.02μM)，以及MtDp1_2和MtDp2_2(第二引物套，各0.02μM)，具有信標(biāo)SnrpDmb_2(FAM標(biāo)記)和MtDmb(ROX標(biāo)記)(各0.05μM)。參見表1中的引物和探針序列。重復(fù)擴(kuò)增和檢測(cè)，如實(shí)施例2中進(jìn)行。該分析的結(jié)果表示為線粒體DNA濃度/患者樣品的細(xì)胞(即PBMC)。結(jié)果總結(jié)在表3中。重復(fù)測(cè)定的分析清楚地顯示了，確定線粒體RNA和染色體DNA之間的比例的雙重檢測(cè)的可重復(fù)性和精確性，這是由于在多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)中優(yōu)化了引物的序列和濃度。本發(fā)明的方法避免使用內(nèi)部校準(zhǔn)值和/或分開量化核酸靶序列，因而可以設(shè)計(jì)高通量檢測(cè)。實(shí)施例6在本實(shí)施例中，確定用來測(cè)定TIE-1mRNA和染色體DNA之間的比例的最佳引物濃度。在本實(shí)施例中，分析體外生成的RNA和質(zhì)體的模型系統(tǒng)中的TIE-1mRNA靶和染色體DNA靶之間的比例。TIE-1mRNA的體外生成部分和含有染色體靶序列的質(zhì)體的核酸組合被用作單管實(shí)時(shí)雙NASBA的輸入物，雙NASBA檢測(cè)TIE-1mRNA和染色體DNA。反應(yīng)混合物(雙混合物)含有以兩種不同濃度被檢測(cè)的兩套引物和信標(biāo)SnrpDp1和SnrpD2p2(用于染色體DNA的第一引物套)以及TIEp1和TIEp2(用于TIE-1mRNA的第二引物套)，具有信標(biāo)SnrpDmb_2(FAM標(biāo)記)和TIEmb(ROX標(biāo)記)(各0.05μM)。參見表1中的引物和探針序列。在該試驗(yàn)中，用于TIE-1mRNA擴(kuò)增的引物以0.4μM和0.3μM被使用，結(jié)合0.2μM的引物濃度用于染色體DNA靶序列擴(kuò)增。重復(fù)進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè)，如實(shí)施例4中進(jìn)行。調(diào)整熒光計(jì)的過濾裝置，以同時(shí)測(cè)量FAM和ROX標(biāo)記(FAM為485/20和530/25；ROX為590/20和645/40)。在具有兩個(gè)競爭擴(kuò)增的雙反應(yīng)中，時(shí)間上熒光性曲線的斜率與各種被擴(kuò)增物種的分子量的比例成正比。該結(jié)果顯示在圖4中。從該結(jié)果可以清楚看出，應(yīng)用如在圖4的右邊組中使用的引物濃度，得到可清楚說明的結(jié)果，并使得檢測(cè)的動(dòng)力學(xué)范圍置于恰在健康個(gè)體所期望的值之處。特別地，在上面的3個(gè)組中，右邊的組在探針信號(hào)斜率中，給出了對(duì)最初輸入比例更好的反映。實(shí)施例7在本實(shí)施例中，確定用以測(cè)定Siglec-1mRNA和染色體DNA之間的比例的最佳引物濃度。在本實(shí)施例中，分析體外生成的RNA和質(zhì)體的模型系統(tǒng)中的Siglec-1mRNA靶和染色體DNA靶之間的比例。Siglec-1mRNA的體外生成部分和含有染色體靶序列的質(zhì)體的核酸組合被用作單管實(shí)時(shí)雙NASBA的輸入物，雙NASBA檢測(cè)Siglec-1mRNA和染色體DNA。反應(yīng)混合物(雙混合物)含有以兩種不同濃度被檢測(cè)的兩套引物和信標(biāo)SnrpDp1和SnrpD2p2(用于染色體DNA的第一引物套)以及Sigp1和Sigp2(用于Sig1ec-1mRNA的第二引物套)，具有信標(biāo)SnrpDmb_2(FAM標(biāo)記)和Sigmb(ROX標(biāo)記)(各0.05μM)。參見表1中的引物和探針序列。在該試驗(yàn)中，用于Siglec-1mRNA擴(kuò)增的引物以0.4μM和0.3μM被使用，結(jié)合0.2μM的引物濃度用于染色體DNA靶序列擴(kuò)增。重復(fù)進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè)，如實(shí)施例4中進(jìn)行。調(diào)整熒光計(jì)的過濾裝置，以同時(shí)測(cè)量FAM和ROX標(biāo)記(FAM為485/20和530/25；ROX為590/20和645/40)。在具有兩個(gè)競爭擴(kuò)增的雙反應(yīng)中，時(shí)間上熒光性曲線的斜率與各種被擴(kuò)增物種的分子量的比例成正比。該結(jié)果顯示在圖5中。從該結(jié)果可以清楚看出，應(yīng)用如在圖5的左邊組中使用的引物濃度，得到可清楚說明的結(jié)果，并使得檢測(cè)的動(dòng)力學(xué)范圍置于恰在健康個(gè)體所期望的值之處。左邊組的結(jié)果是不可解釋的。其他數(shù)據(jù)已經(jīng)說明，如用于左邊組中的引物濃度是最佳的引物濃度，產(chǎn)生最大的動(dòng)力學(xué)范圍和靈敏性。實(shí)施例8在本實(shí)施例中，確定了用于測(cè)定線粒體RNA和染色體DNA之間的比例的最佳鹽濃度。在兩種鹽(KCI)濃度下，建立線粒體RNA和染色體DNA的比例升高的校準(zhǔn)曲線。此外，在本實(shí)施例中，通過在不同鹽濃度下擴(kuò)增，分析在健康個(gè)體中線粒體RNA靶與染色體DNA靶的比例。用Boom方法16從PBMC分離的核酸被用作單管實(shí)時(shí)雙NASBA的輸入物，雙NASBA檢測(cè)線粒體RNA和染色體DNA。反應(yīng)混合物(雙混合物)含有以兩種不同濃度被檢測(cè)的兩套引物和信標(biāo)SnrpDp1和SnrpD2p2(用于染色體DNA的第一引物套)，以及MtRp1_4和MtRp2_2(用于線粒體RNA的第二引物套)，具有信標(biāo)SnrpDmb_2(FAM標(biāo)記)和MtRmb(ROX標(biāo)記)(各0.05μM)。參見表1中的引物和探針序列。在該試驗(yàn)中，用于線粒體RNA擴(kuò)增的引物以0.4μM和0.2μM被使用，分別結(jié)合0.5μM和0.2μM的引物濃度用于染色體DNA靶序列擴(kuò)增。如實(shí)施例1進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè)，不同的是KCl的濃度，在擴(kuò)增反應(yīng)中分別為70或90mM。調(diào)整熒光計(jì)的過濾裝置，以同時(shí)測(cè)量FAM和ROX標(biāo)記(FAM為485/20和530/25；ROX為590/20和645/40)。在具有兩個(gè)競爭擴(kuò)增的雙反應(yīng)中，時(shí)間上熒光性曲線的斜率與各種被擴(kuò)增物種的分子量的比例成正比。用分別為70和90mMKCl的不同鹽濃度制備的校準(zhǔn)曲線被示于圖6中。為校準(zhǔn)曲線定量測(cè)定的R2在用70mM(R2為0.9693)和90mM(R2為0.9961)進(jìn)行的反應(yīng)中明顯不同，表明用90mM進(jìn)行的反應(yīng)得到較好的和更加可靠的校準(zhǔn)曲線。在70和90mM的鹽濃度下，在擴(kuò)增反應(yīng)中，來自健康個(gè)體的PBMC中的線粒體RNA與染色體DNA的比例的測(cè)定值被顯示在圖7中。從該圖，可以清楚地?cái)喽?，在擴(kuò)增反應(yīng)中，用90mMKCl測(cè)量的比例更加精確(圖7的右邊組)，這表現(xiàn)在信號(hào)生成的陡然升高和絕對(duì)較高的信號(hào)(注意Y軸刻度的不同)。表格表1.在實(shí)施例中所用的引物和探針的序列1.引物p1序列的T7啟動(dòng)子部分以斜體字顯示，分子信標(biāo)探針的莖干序列以粗體表示。分子信標(biāo)序列在其3′端用DABCYL(猝滅劑)標(biāo)記，在5′端用FAM或ROX(熒光標(biāo)記)標(biāo)記。表2.在開始治療后的不同時(shí)間點(diǎn)上測(cè)定的進(jìn)行抗病毒治療的HIV-1感染個(gè)體的PBMC中的線粒體DNA和染色體DNA之間的比例表3.在開始治療后的不同時(shí)間點(diǎn)上測(cè)定的進(jìn)行抗病毒治療的HIV-1感染個(gè)體的PBMC中的線粒體RNA和染色體DNA之間、線粒體DNA和染色體DNA之間比例。圖1.采用不同比例的線粒體DNA與染色體DNA作為輸入物時(shí)，ROX(染色體DNA，灰線(圓形))和FAM(線粒體DNA，黑線(三角形))熒光信號(hào)的隨時(shí)間的熒光強(qiáng)度。下方顯示了信號(hào)比例與DNA比例之間的線性關(guān)系。圖2.采用不同濃度的引物時(shí)，F(xiàn)AM(染色體DNA，斷線(右軸))和ROX(線粒體RNA，連續(xù)線(左軸))熒光信號(hào)的隨時(shí)間的熒光強(qiáng)度。左邊兩組用0.4μM線粒體RNA引物和0.05μM染色體DNA引物進(jìn)行。右邊兩組用0.2μM線粒體RNA引物和0.2μM染色體DNA引物進(jìn)行。圖3.使用不同濃度的引物時(shí)，F(xiàn)AM(染色體DNA，斷線)和ROX(線粒體RNA，連續(xù)線)熒光信號(hào)的隨時(shí)間的熒光強(qiáng)度。上方兩組用0.4μM線粒體RNA引物和0.2μM染色體DNA引物進(jìn)行。下方兩組用0.3μM線粒體RNA引物和0.2μM染色體DNA引物進(jìn)行。圖4.使用不同濃度的引物，F(xiàn)AM(染色體DNA，連續(xù)線(右軸))和ROX(TIE-1mRNA，斷線(左軸))熒光信號(hào)的隨時(shí)間的熒光強(qiáng)度。左邊組用0.4μMTIE-1mRNA引物和0.1μM染色體DNA引物進(jìn)行。右邊組用0.6μMTIE-1mRNA引物和0.1μM染色體DNA引物進(jìn)行。在各組的下方給出TIE-1的體外生成的RNA和含有染色體DNA靶的質(zhì)體的量。NT是指無模板。圖5.使用不同濃度引物，F(xiàn)AM(染色體DNA，連續(xù)線(右軸))和ROX(Siglec-1mRNA，斷線(左軸))熒光信號(hào)的隨時(shí)間的熒光強(qiáng)度。左邊組用0.6μMSiglec-1mRNA引物和0.1pM染色體DNA引物進(jìn)行。右邊組用0.4μMSiglec-1mRNA引物和0.1μM染色體DNA引物進(jìn)行。在各組的下方給出Siglec-1的體外生成的RNA和含有染色體DNA靶的質(zhì)體的量。NT是指無模板。圖6.在擴(kuò)增反應(yīng)中，在70mMKCl(左邊組)和90mMKCl(右邊組)下，線粒體RNA與染色體DNA比例升高的兩條校準(zhǔn)曲線。圖7.在擴(kuò)增反應(yīng)中，用70mMKCl(左邊組)或90mMKCl(右邊組)進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)定的健康個(gè)體中的線粒體RNA與染色體DNA比例。參考文獻(xiàn)1.SaikiRK，GelfandDH，StoSelS，ScharfSJ，HiguchiR，HornGT，MullisKB，ErlichHAPrimer-directedenzymaticamplificationofDNAwithathermostableDNApolymerase.Science239487-491，19882.VanGemenB，VanBeuningenR，NabbeA，VanStrijpD，JurriaansS，LensP，KievitsTAone-tubequantitativeHIV-1RNANASBAnucleicacidamplificationassayusingelectrochemiluminescent(ECL)labelledprobes.J.Virol.Methods49157-167，19943.HeidCA，StevensJ，LivakKJ，WilliamsPMRealtimequantitativePCR.GenomeRes.6986-994，19964.TyagiS，KramerFRMolecularbeaconsprobesthatfluoresceuponhybridization.Nat.Biotechnol.14303-308，19965.LeoneG，VanSchijndelH，VanGemenB，KramerFR，SchoenCDMolecularbeaconprobescombinedwithamplificationbyNASBAenablehomogeneous，real-timedetectionofRNA.NucleicAcidsRes.262150-2155，19986.PiatakM，LukKC，WilliamsB，LifsonJDQuantitativecompetitivepolymerasechainreactionforaccuratequantitationofHIVDNAandRNAspecies.Biotechniques1470-81，19937.DeBaar，MP，VanDooren，MW，DeRooij，E，Bakker，M，VanGemen，B，Goudsmit，J，DeRonde，A.Singlerapidreal-timemonitoredisothermalRNAamplificationassayforquantificationofHIV-lisolatesfromgroupM，N，andO.J.Clin.Microbiol.39(4)1378-1384，20018.RichtzenhainLJ，CortezA，HeinemannMB，SoaresRM，SakamotoSM，VasconcellosSA，HigaZM，ScarcelliE，GenovezME.AmultiplexPCRforthedetectionofBrucellaspp.andLeptospiraspp.DNAfromabortedbovinefetuses.VetMicrobiol.2002Jun20；87(2)139-47.9.LeeJH，TennessenK，LilleyBG，UnnaschTR.Simultaneousdetectionofthreemosquito-borneencephalitisviruses(easternequine，LaCrosse，andSt.Louis)withasingle-tubemultiplexreversetranscriptasepolymerasechainreactionassay.JAmMosqControlAssoc.2002Mar；18(1)26-31.10.CrawfordEL，WarnerKA，KhuderSA，ZahorchakRJ，WilleyJC.MultiplexstandardizedRT-PCRforexpressionanalysisofmanygenesinsmallsamples.BiochemBiophysResCommun.2002Apr26；293(1)509-16.11.MoutouC，GardersN，VivilleS.MultiplexPCRcombiningdeltaF508mutationandintragenicmicrosatelitteoftheCFTRgeneforpre-implantationgeneticdiagnosis(PGD)ofcysticfibrosis.EurJHumGen2002Apr；10(4)231-812.JothikumarN，GriffithsMW.RapidDetectionofEscherichiacoliO157H7withMultiplexReal-TimePCRAssays.ApplEnvironMicrobiol.2002Jun；68(6)3169-71.13.LoitschSM，KippenbergerS，DauletbaevN，WagnerTO，BargonJ.Reversetranscription-competitivemultiplexPCRimprovesquantificationofmRNAinclinicalsamples--applicationtothelowaburdanceCFTRmRNA.ClinChem.1999May；45(5)619-24.14.DeursenPBVan，AWGunther，CCvanRiel，MMvanderEijnden，HLVos，BvanGemen，DAvanStrijp，NMTackentandRMBertinaAnovelquantitativemultiplexNASBAmethodapplicationtomeasuringtissuefactorandCD14mRNAlevelsinhumanmonocytesNucl.Acids.Res.199927el5i-vi15.MeijerinkJ，MandigersC，vandeLochtL，TonnissenE，GoodsaidF，RaemaekersJ.AnovelmethodtocompensatefordifferentamplificationefficienciesbetweenpatientDNAsamplesinquantitativereal-timePCR.JMolDiagn.2001May；3(2)55-61.16.BoomR，SolCJ，SalimansMM，JansenCL，Wertheim-vanDillenPM，VanderNoordaaJRapidandsimplemethodforpurificationofnucleicacids.J.Clin.Microbiol.28495-503，1990權(quán)利要求1.通過多重核酸擴(kuò)增反應(yīng)量化樣品中的至少兩種感興趣的核酸的最初比例的方法，包括在所述擴(kuò)增反應(yīng)中擴(kuò)增所述感興趣的核酸；在所述反應(yīng)中，在至少兩個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)上測(cè)定至少兩種感興趣的核酸的量；從至少兩個(gè)所述測(cè)定值中確定所述至少兩種感興趣的核酸的擴(kuò)增比率；將所述比率與參照值比較；和從所述比較中確定所述樣品中的所述至少兩種感興趣的核酸的量的最初比例。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述核酸擴(kuò)增反應(yīng)中的至少一種可變因素被調(diào)節(jié)，以使得在一種或多種感興趣的核酸達(dá)到擴(kuò)增和/或檢測(cè)限度前，所有感興趣的核酸達(dá)到可檢測(cè)的水平。3.權(quán)利要求2的方法，其中所述可變因素對(duì)一種感興趣的核酸的擴(kuò)增效率的影響程度不同于對(duì)另一種感興趣的核酸的擴(kuò)增效率的影響程度。4.權(quán)利要求2或3的方法，其中所述可變因素包括至少一種引物的濃度。5.權(quán)利要求2-4中任一項(xiàng)的方法，其中至少一種引物的濃度顯著不同于至少另一種引物的濃度。6.權(quán)利要求2-5中任一項(xiàng)的方法，其中所述可變因素包括至少一套能夠與感興趣的核酸退火的引物的濃度。7.權(quán)利要求2-6中任一項(xiàng)的方法，其中至少一套能夠與感興趣的核酸退火的引物的濃度顯著不同于至少另一套能夠與感興趣的核酸退火的引物的濃度。8.權(quán)利要求2-7中任一項(xiàng)的方法，其中所述可變因素包括鹽濃度。9.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的方法，其中所述感興趣的核酸包括獨(dú)立的感興趣的核酸。10.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的方法，其中所述感興趣的核酸中的至少一種包括RNA。11.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的方法，其中所述感興趣的核酸中的至少一種包括DNA。12.權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的方法，其中所述多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)包括NASBA。13.一種用于確定細(xì)胞生物體的機(jī)能的方法，包括確定從所述生物體獲得的樣品中的第一種核酸的量相對(duì)于第二種核酸的量的比例，其中所述比例用權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的方法量化。14.權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的方法，其中所述感興趣的核酸中的至少一種包括內(nèi)共生體細(xì)胞器核酸。15.權(quán)利要求14的方法，其中所述比例包括內(nèi)共生體細(xì)胞器核酸的量相對(duì)于所述樣品中的細(xì)胞核核酸的量的比例。16.用于確定疾病分期的方法，包括確定自患有所述疾病或具有患所述疾病的危險(xiǎn)的生物體獲得的樣品中的第一種核酸的量相對(duì)于第二種核酸的量的比例，其中所述比例用權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的方法量化。17.權(quán)利要求16的方法，其中所述疾病包括HIV相關(guān)疾病、腫瘤相關(guān)疾病和/或血管發(fā)生過程。18.權(quán)利要求16或17的方法，其中所述第一種細(xì)胞器核酸和所述第二種核酸包括DNA和RNA。19.用于確定一種候選化合物的治療活性和/或可能的副作用的方法，包括用權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的方法確定自生物體獲得的樣品中的第一種核酸的量相對(duì)于第二種核酸的量的比例。20.用于確定一種藥劑的治療活性和/或可能的副作用的方法，包括用權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的方法確定自生物體獲得的樣品中的第一種核酸的量相對(duì)于第二種核酸的量的比例。21.權(quán)利要求19或20的方法，其中所述治療活性包括針對(duì)HIV相關(guān)疾病和/或腫瘤相關(guān)疾病的治療活性。22.權(quán)利要求19-21中任一項(xiàng)的方法，其中所述化合物或藥劑包括核苷類似物和/或核苷酸類似物。23.權(quán)利要求22的方法，其中所述核苷類似物和/或核苷酸類似物包括氟達(dá)拉濱、巰嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、氟尿嘧啶和/或吉西他濱。24.權(quán)利要求19-23中任一項(xiàng)的方法，其中所述化合物或藥劑包括AZT、ddI、ddC、d4T、3TC和/或替諾福韋和/或阿巴卡韋。25.權(quán)利要求19或20的方法，其中所述治療活性包括針對(duì)血管發(fā)生過程的治療活性。26.權(quán)利要求25的方法，其中所述化合物或藥劑包括以下藥物中的至少一種2ME2、制管張素、Angiozyme、抗VEGFRhuMAb、Apra(CT-2584)、Avicine、氟草胺、BMS275291、羧基酰氨基三唑、CC4047、CC5013、CC7085、CDC801、CGP-41251(PKC412)、CM101、CombretastatinA-4藥物前體、EMD121974、血管內(nèi)皮抑素、Flavopiridol、金雀異黃素(GCP)、綠茶提取物、IM-862、ImmTher、干擾素α、白細(xì)胞介素-12、易瑞沙(ZD1839)、馬立馬司他、Metastat(Col-3)、Neovastat、奧曲肽、紫杉醇、青霉胺、Photofrin、Photopoint、PI-88、Prinomastat(AG-3340)、PTK787(ZK22584)、RO317453、Solimastat、Squalamine、SU101、SU5416、SU-6668、Suradista(FCE26644)、蘇拉明(Metaret)、四硫鉬酸鹽、沙利度胺、TNP-470、Vitaxin。27.用于確定候選化合物引起細(xì)胞生物體的功能障礙的毒性活性的方法，包括用權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的方法確定自生物體獲得的樣品中的第一種核酸的量相對(duì)于第二種核酸的量的比例。28.權(quán)利要求19-27中任一項(xiàng)的方法，其中所述生物體或基本上相關(guān)的生物體已經(jīng)被提供了所述化合物或藥劑。29.用于確定候選化合物針對(duì)第一種生物體的選擇性活性的方法，包括用權(quán)利要求19或20的方法確定候選化合物的治療活性和/或可能的副作用和/或用權(quán)利要求27的方法確定毒性活性。30.權(quán)利要求29的方法，還包括給基本上不相關(guān)的第二種生物體提供所述化合物。31.權(quán)利要求30的方法，其中所述第一種生物體包括病原體，而所述第二種生物體包括所述病原體的宿主。32.權(quán)利要求13-31中任一項(xiàng)的方法，其中所述第一種核酸包括內(nèi)共生體細(xì)胞器核酸。33.權(quán)利要求13-32中任一項(xiàng)的方法，其中所述第二種核酸包括細(xì)胞核核酸。34.權(quán)利要求13-33中任一項(xiàng)的方法，其中所述第一種核酸和/或所述第二種核酸從外周血單個(gè)核細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞中獲得。35.一種診斷試劑盒，包括至少一種用于實(shí)施權(quán)利要求1-34中任一項(xiàng)的方法的工具。36.權(quán)利要求35的試劑盒，包括至少一種用于選擇性擴(kuò)增和/或檢測(cè)與內(nèi)共生體細(xì)胞器相關(guān)的核酸或來源于內(nèi)共生體細(xì)胞器的核酸的引物或探針。37.權(quán)利要求35或36的試劑盒，包括與至少另一種引物的量相比量顯著不同的至少一種引物。38.權(quán)利要求35-37中任一項(xiàng)的試劑盒，包括與至少另一套能夠與感興趣的核酸退火的引物的量相比量顯著不同的至少一套能夠與感興趣的核酸退火的引物。39.權(quán)利要求36-38中任一項(xiàng)的試劑盒，其中所述至少一種引物或探針列于表1中。40.通過權(quán)利要求19-34中任一項(xiàng)的方法獲得的或選擇的化合物在制備藥劑、除草劑、殺蟲劑、抗寄生蟲劑、細(xì)胞生長抑制劑或細(xì)胞毒性劑中的用途。41.通過權(quán)利要求19-34中任一項(xiàng)的方法獲得的或選擇的藥劑、除草劑、殺蟲劑、抗寄生蟲劑、細(xì)胞生長抑制劑或細(xì)胞毒性劑。全文摘要本發(fā)明提供一種用于通過多重核酸擴(kuò)增反應(yīng)量化樣品中的至少兩種感興趣的核酸的量的最初比例的方法，包括在所述擴(kuò)增反應(yīng)中擴(kuò)增所述感興趣核酸；在所述反應(yīng)的至少兩個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)上測(cè)定至少兩種感興趣的核酸的量；從所述測(cè)定值中的至少兩個(gè)確定所述至少兩種感興趣的核酸的擴(kuò)增比率；將所述比率與參照比較；和從所述比較中確定所述樣品中的至少兩種感興趣的核酸的所述最初比例。優(yōu)選地，調(diào)整所述核酸擴(kuò)增反應(yīng)中的至少一種可變因素，以便使得在一種或多種感興趣的核酸達(dá)到擴(kuò)增和/或檢測(cè)極限之前，所有感興趣的核酸達(dá)到可檢測(cè)的水平。采用本發(fā)明的方法，可以測(cè)定比例間的小差別。此外，可以確定最初核酸比例的直接測(cè)定值。例如，本發(fā)明的方法適合用于確定細(xì)胞生物體的功能，適合用于確定疾病發(fā)展階段，以及適合用于確定一種藥劑或候選化合物的治療活性和/或可能的副作用。文檔編號(hào)C12Q1/68GK1735695SQ200380108470公開日2006年2月15日申請(qǐng)日期2003年11月7日優(yōu)先權(quán)日2002年11月8日發(fā)明者伊夫琳·卡特琳娜·安娜·克拉西娜·蒂默曼斯,鮑勃·范格門申請(qǐng)人:普里馬根控股公司