專利名稱：降低診斷雜交測(cè)定中對(duì)靶核酸的序列變異的依賴性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及設(shè)計(jì)用于克服擴(kuò)增效率差異的引物，出現(xiàn)所述擴(kuò)增效率差異的具體原因在于引物結(jié)合的易變性，靶核酸序列的非保守核苷酸，例如不同基因型之間的變異。通過缺失非保守核苷酸的互補(bǔ)堿基，引物(稱作缺失引物)對(duì)所有靶(基因型)的結(jié)合將會(huì)相同。本發(fā)明可以轉(zhuǎn)用于其它技術(shù)層面，例如在定量測(cè)定中作為內(nèi)部對(duì)照和/或檢測(cè)其它與靶競爭的核酸序列，其中在靶核酸的變體之間，通過所述缺失引物對(duì)靶、內(nèi)部對(duì)照和/或競爭性序列進(jìn)行的擴(kuò)增是可比的。
背景技術(shù)：
分子生物學(xué)的發(fā)展使得可以通過使用擴(kuò)增技術(shù)實(shí)現(xiàn)核酸的靈敏檢測(cè)。擴(kuò)增的方法已經(jīng)變成非常強(qiáng)大的工具，因?yàn)樗鼈兛梢栽谙鄬?duì)短的時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)非常少量的核酸的指數(shù)擴(kuò)增。這產(chǎn)生了能夠靈敏地檢測(cè)低至單拷貝RNA或DNA的強(qiáng)大的測(cè)定方法。已經(jīng)開發(fā)了多種的擴(kuò)增技術(shù)，例如PCR、LCR、NASBA、TMA和SDA，并為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。這些方法每個(gè)都基于不同的作用機(jī)制，但全部都依賴于一種或多種引物退火至靶核酸序列或其互補(bǔ)序列。在靶或其部分的擴(kuò)增期間或擴(kuò)增之后，要檢測(cè)產(chǎn)生的擴(kuò)增子的存在或擴(kuò)增子的量。這可以用多種已知技術(shù)進(jìn)行，例如在凝膠上分離樣品隨后進(jìn)行印跡和探針檢測(cè)。這只可以在擴(kuò)增完成后進(jìn)行。在一種均質(zhì)的方法中，擴(kuò)增和檢測(cè)不對(duì)反應(yīng)組分進(jìn)行分離。在擴(kuò)增過程中檢測(cè)擴(kuò)增子。因此，可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增子的產(chǎn)生并且因此獲得的數(shù)據(jù)可以用于確定擴(kuò)增子存在與否和/或擴(kuò)增子的量。在核酸序列的擴(kuò)增和檢測(cè)中，對(duì)用作引物和探針的寡核苷酸的選擇對(duì)于測(cè)定的靈敏度和特異性是關(guān)鍵的。待擴(kuò)增的序列通常僅以微量存在于樣品(例如獲得自懷疑被病毒感染的患者的血液樣品)中。引物應(yīng)當(dāng)與靶序列充分互補(bǔ)以使得有效擴(kuò)增存在于樣品中的病毒核酸。如果引物不恰當(dāng)?shù)赝嘶鹬涟行蛄?由于兩條鏈中核苷酸堿基的錯(cuò)配)，擴(kuò)增被嚴(yán)重阻礙。當(dāng)靶不是線性的而是具有特別的結(jié)構(gòu)，其較不易被引物接近，從而也導(dǎo)致擴(kuò)增減少。這將影響測(cè)定的靈敏度并且會(huì)造成假陰性的測(cè)試結(jié)果。引物的有效雜交一般需要至少15個(gè)連續(xù)的互補(bǔ)核苷酸。如果使用更少的核苷酸， 引物特異性和非特異性退火的比例將降低至靶核酸能發(fā)生有效擴(kuò)增的比例以下。如果靶核苷酸序列的幾個(gè)遺傳學(xué)變異是已知的，可以鑒定出保守的核苷酸區(qū)段(stretch)并用于引物設(shè)計(jì)。然而，一些物種(如RNA病毒)中的優(yōu)選的保守區(qū)段，例如人丙型肝炎病毒部分編碼區(qū)域，有時(shí)候太小而不能用于設(shè)計(jì)有效的引物。另外，甚至這些保守的片段也具有突變的傾向并不斷地產(chǎn)生未知的多態(tài)性。這在快速分裂的生物體如病毒和細(xì)菌中最為顯著，造成引物雜交的效率降低。結(jié)果是可能不發(fā)生擴(kuò)增，其在例如常規(guī)診斷中是非常不受歡迎的，因?yàn)榧訇幮越Y(jié)果可以對(duì)有關(guān)患者造成嚴(yán)重后果。同樣，在定量測(cè)定中，靶中的序列變異(多態(tài)性)可以導(dǎo)致對(duì)其定量過低(under-quantification)。另外，擴(kuò)增的靶序列和用于檢測(cè)的探針之間的序列差異還降低檢測(cè)的效率。對(duì)具有多態(tài)性的靶的檢測(cè)因此不如對(duì)與探針共有序列完全匹配的靶的檢測(cè)那樣好。
文獻(xiàn)EP-A-1. 426. 448涉及一種降低序列變異在診斷雜交測(cè)定中的影響的方法， 所述診斷雜交測(cè)定使用核酸探針檢測(cè)擴(kuò)增的核酸分析物。其在于導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)的具有增加親和力的修飾的核苷酸，更具體地是在分子信標(biāo)環(huán)上導(dǎo)入。因?yàn)樘结槍?duì)多態(tài)分析物的親和力增加了，所以降低了對(duì)多態(tài)性的敏感性。盡管如此，該方法是探針專用的，并且沒有克服引物與包含至少一個(gè)核苷酸變異的靶的錯(cuò)配問題。此外，關(guān)于探針的設(shè)計(jì)，該建議的解決方案需要修飾核苷酸，昂貴并需要特別的制造過程。文獻(xiàn)ΕΡ-Β-0. 246. 864涉及用于區(qū)別可替換核苷酸序列的方法，其中使用兩個(gè)核苷酸探針并和互補(bǔ)靶序列形成分裂探針雜交物。這樣的探針使得靶序列中潛在的錯(cuò)配位于所述探針之間。如上面文獻(xiàn)所述，該方法的一個(gè)缺點(diǎn)是其僅專用于探針而不適用于引物。此外，該方法需要使用和設(shè)計(jì)兩個(gè)探針。因此，明顯地需要一種擴(kuò)增方法，其更不易于受到靶序列的雜交片段中的突變或遺傳學(xué)變異的影響。發(fā)明概述本發(fā)明提供引物和/或探針，其是在均質(zhì)測(cè)定中降低對(duì)序列變異依賴性的具有非常多用途的工具。根據(jù)第一實(shí)施方案，本發(fā)明提供設(shè)計(jì)為用于擴(kuò)增靶核酸序列的引物，該靶序列含有至少一個(gè)變異，定義為稱作基因型變異的一個(gè)非保守核苷酸，或定義為同一種基因型內(nèi)的一個(gè)核苷酸變異，其中所述引物包含與其靶序列互補(bǔ)的核酸序列，但至少一個(gè)與所述變異互補(bǔ)的堿基除外，其不存在于引物中。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，引物與含有至少兩個(gè)變異的靶互補(bǔ)，其中所述變異彼此相鄰。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，引物與含有至少兩個(gè)變異的靶序列互補(bǔ)，其中所述每個(gè)變異由至少一個(gè)保守核苷酸相互分開。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，該引物可以和另一種引物形成引物對(duì)。因此，本發(fā)明提供引物對(duì)以擴(kuò)增靶核酸序列，該靶序列含有至少一個(gè)變異，定義為稱作基因型變異的一個(gè)非保守核苷酸，或定義為同一種基因型內(nèi)的一個(gè)核苷酸變異，其中所述引物中至少一種是根據(jù)本發(fā)明設(shè)計(jì)的。因此，擴(kuò)增通過將樣品和一對(duì)引物接觸而進(jìn)行，所述引物稱作正向和反向引物，在NASBA方法中分別是Pl和P2。當(dāng)進(jìn)行NASBA時(shí)，Pl引物將雜交在感興趣的序列的下游，而P2引物將與由正向引物延伸產(chǎn)生的鏈互補(bǔ)并置于所述感興趣的序列的上游。當(dāng)進(jìn)行 PCR擴(kuò)增時(shí)，正向引物在感興趣的序列的上游而反向引物在下游。本發(fā)明的另一個(gè)目的是設(shè)計(jì)為用于檢測(cè)靶核酸序列的探針，該靶序列含有至少一個(gè)變異，定義為稱作基因型變異的一個(gè)非保守核苷酸，或定義為同一種基因型內(nèi)的一個(gè)核苷酸變異，其中探針包括與其靶序列互補(bǔ)的核酸序列，但至少一個(gè)與所述變異互補(bǔ)的堿基除外，其不存在于探針中。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，探針包括至少一種標(biāo)記物。本領(lǐng)域已知多種的標(biāo)記部分。所述標(biāo)記部分例如可以是放射性化合物、可檢測(cè)的酶(如辣根過氧化物酶(HRP))、半抗原樣生物素或能夠產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)(如比色的、熒光的、化學(xué)發(fā)光的或電化學(xué)發(fā)光的信號(hào))的任何其它部分。
根據(jù)引物或探針的任何實(shí)施方案，靶序列是靶RNA。此外，根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，引物具有啟動(dòng)子序列。術(shù)語“啟動(dòng)子序列”定義了由 RNA聚合酶特異地識(shí)別的核酸序列區(qū)域，所述RNA聚合酶結(jié)合至識(shí)別的序列并起始轉(zhuǎn)錄過程，產(chǎn)生RNA轉(zhuǎn)錄本。原則上可以采用任何啟動(dòng)子序列，只要有已知的和可用的聚合酶能夠識(shí)別其起始序列即可。已知的和有用的啟動(dòng)子是那些由某些噬菌體RNA聚合酶識(shí)別的啟動(dòng)子，例如噬菌體T3、T7或SP6。連接至啟動(dòng)子序列的寡核苷酸通常稱作“啟動(dòng)子引物”。 但是，在一些基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增反應(yīng)的實(shí)施方式中，它們作為引物的功能，例如延伸反應(yīng)的起點(diǎn)，可以被阻斷(如上面已經(jīng)提及的)或不存在。本發(fā)明還提供了擴(kuò)增樣品中的核酸靶序列的方法，所述核酸靶序列含有至少一個(gè)變異，定義為稱作基因型變異的一個(gè)非保守核苷酸，或定義為同一種基因型內(nèi)的一個(gè)核苷酸變異，所述方法包括對(duì)樣品進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)放大所述靶序列的存在，所述擴(kuò)增反應(yīng)使用1)第一引物，其能夠特異地雜交至靶序列的一個(gè)區(qū)域并能夠在延伸條件下引導(dǎo)該引物向第二引物雜交區(qū)域延伸，以及2)第二引物，其能夠特異地雜交至靶序列另一個(gè)區(qū)域的互補(bǔ)序列并能夠在延伸條件下引導(dǎo)第二引物向第一引物雜交區(qū)域的互補(bǔ)序列延伸，以及其中所述至少一個(gè)變異位于所述引物中的至少一種引物的雜交區(qū)域中，以及其中所述引物中的至少一種引物包括與靶序列互補(bǔ)的核酸序列，但至少一個(gè)與所述變異互補(bǔ)的堿基除外，其不存在于引物中。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的方法可以是使用引物和探針檢測(cè)核酸分析物的任何種類的方法。這樣的測(cè)定可以基于對(duì)擴(kuò)增分析物的檢測(cè)，例如在基于PCR、TMA或NASBA 的測(cè)定中。然而，引物和探針也能夠用于微陣列中。定量和定性的診斷測(cè)定中都可以使用本發(fā)明，在這些測(cè)定中，靶的序列多態(tài)性影響測(cè)定可靠性。本發(fā)明的另一個(gè)目的是檢測(cè)樣品中核酸靶序列的方法，所述核酸靶序列含有至少一個(gè)變異，定義為稱作基因型變異的一個(gè)非保守核苷酸，或定義為同一種基因型內(nèi)的一個(gè)核苷酸變異，所述方法包括(a)對(duì)樣品進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)檢測(cè)靶序列的存在，所述擴(kuò)增反應(yīng)使用(1)第一引物，其能夠特異地雜交至靶序列的一個(gè)區(qū)域或靶序列的一個(gè)互補(bǔ)區(qū)域， 并能夠在延伸條件下引導(dǎo)第一引物向第二引物雜交區(qū)域延伸，以及(2)第二引物，其能夠特異地雜交至靶序列另一個(gè)區(qū)域或靶序列的另一個(gè)互補(bǔ)區(qū)域，并能夠在延伸條件下引導(dǎo)第二引物向所述第一引物雜交區(qū)域的互補(bǔ)序列延伸，以及(b)使用至少一種探針對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)反應(yīng)檢測(cè)所述靶序列的存在，所述探針能夠特異地雜交至靶序列的第一引物能夠雜交的區(qū)域和第二引物能夠雜交的區(qū)域之間的區(qū)域，其中所述至少一個(gè)變異位于所述引物中的至少一種引物的雜交區(qū)域中，并且其中所述引物中的至少一種引物包括與靶序列互補(bǔ)的核酸序列，但至少一個(gè)與所述變異互補(bǔ)的堿基除外，其不存在于引物中。根據(jù)本方法的另一個(gè)實(shí)施方案，擴(kuò)增反應(yīng)選自基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增和PCR。在本方法的一個(gè)具體的實(shí)施方案中，基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增反應(yīng)是NASBA反應(yīng)。NASBA 方法描述于歐洲專利號(hào)ΕΡ-Β-0. 329. 822。盡管該方法允許擴(kuò)增RNA，但如歐洲專利申請(qǐng)EP-A-1. 366. 179所描述，其也能用于擴(kuò)增雙鏈核酸。這些方法對(duì)PCR的主要優(yōu)勢(shì)是它們是等溫進(jìn)行的。根據(jù)本方法的另一個(gè)實(shí)施方案，靶序列是靶RNA。本發(fā)明的另一個(gè)目的是檢測(cè)樣品中核酸靶序列的方法，所述核酸靶序列含有至少一個(gè)變異，定義為稱作基因型變異的一個(gè)非保守核苷酸，或定義為同一種基因型內(nèi)的一個(gè)核苷酸變異，該方法包括(a)至少一種能夠特異地雜交至靶序列的一個(gè)區(qū)域的探針，以及(b)檢測(cè)所述靶序列的存在，其中所述至少一個(gè)變異位于所述探針中的至少一種探針的雜交區(qū)域中，以及其中所述探針中的至少一種探針包括與靶序列互補(bǔ)的核酸序列，但至少一個(gè)與所述變異互補(bǔ)的堿基除外，其不存在于探針中。根據(jù)本方法最后一個(gè)實(shí)施方案，在檢測(cè)由靶序列產(chǎn)生的擴(kuò)增子的存在的檢測(cè)反應(yīng)之前進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。根據(jù)本方法的另一個(gè)實(shí)施方案，擴(kuò)增反應(yīng)包括(a)加入第一引物，其能夠特異地雜交至靶序列的一個(gè)區(qū)域或靶序列的一個(gè)互補(bǔ)區(qū)域，并能夠在延伸條件下引導(dǎo)第一引物向靶序列中的、第二引物能夠雜交的靶互補(bǔ)序列 (稱作第二引物雜交區(qū)域)延伸，以及(b)加入第二引物，這可以在第一引物加入的同時(shí)進(jìn)行，所述第二引物能夠特異地雜交至靶序列另一個(gè)區(qū)域或靶序列的另一個(gè)互補(bǔ)區(qū)域，并能夠在延伸條件下引導(dǎo)第二引物向靶序列中的、第一引物能夠雜交的靶互補(bǔ)序列(稱作第一引物互補(bǔ)雜交區(qū)域)延伸，以及(c)將樣品置于如酶、三磷酸核苷酸等試劑中，并置于如溫度、PH等物理?xiàng)l件下， 以使得所述引物雜交和延伸并釋放因此獲得的擴(kuò)增子。根據(jù)本方法的另一個(gè)實(shí)施方案，探針的雜交區(qū)域位于以下區(qū)域之間第一引物通過該區(qū)域可以雜交至靶序列或所述靶序列的互補(bǔ)序列的區(qū)域，第二引物通過該區(qū)域可以雜交至靶序列或所述靶序列的互補(bǔ)序列的區(qū)域。根據(jù)本方法的另一個(gè)實(shí)施方案，探針包括至少一種標(biāo)記物。根據(jù)本方法的另一個(gè)實(shí)施方案，探針是在其每個(gè)末端帶有一種標(biāo)記物的核酸。本發(fā)明的探針可以是所謂的分子信標(biāo)(MB)。這些探針以比線性探針更高的特異性識(shí)別其靶序列。已經(jīng)描述了一類稱作分子信標(biāo)的寡核苷酸探針，其促進(jìn)均質(zhì)檢測(cè)特異的核酸靶序列(Piatek 等(1998)Nature Biotechnology 16 :359-363 ;Tyagi 禾口 Kramer(1996)Nature Biotechnology 14:303-308)。分子信標(biāo)是具有莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的單鏈寡核苷酸。環(huán)部分包括與擴(kuò)增子(DNA或RNA)互補(bǔ)的序列。莖是由于3’ -末端和5’ -末端的雜交而形成。莖可以與擴(kuò)增子無關(guān)并且是雙鏈的。莖的一條臂用熒光染料在其游離端標(biāo)記，而另一條臂也在其游離端偶聯(lián)至淬滅部分。在莖-環(huán)狀態(tài)下所述探針僅僅產(chǎn)生少量熒光，因?yàn)闊晒饣鶊F(tuán)的能量被轉(zhuǎn)移至淬滅分子。當(dāng)分子信標(biāo)雜交至擴(kuò)增子，失去莖-環(huán)結(jié)構(gòu)而且淬滅劑和熒光基團(tuán)分離。在該階段，熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光不再被淬滅，能夠被檢測(cè)并定量。根據(jù)本方法的另一個(gè)實(shí)施方案，檢測(cè)反應(yīng)是實(shí)時(shí)檢測(cè)。另外，本發(fā)明提供包括上述的至少一個(gè)引物對(duì)以及至少一種探針的試劑盒。定義
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“核酸”(NA)指的是在任何可能的構(gòu)象(即是核酸的雙鏈(ds) 形式或核酸的單鏈(ss)形式或其組合)的DNA和RNA。這樣的核酸對(duì)應(yīng)于至少連續(xù)兩個(gè)脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，可以包括至少一個(gè)修飾的核苷酸。該多核苷酸可以在核苷酸間鍵的水平(例如，硫代磷酸酯、H-磷酸酯、烷基磷酸酯)和主鏈的水平(α-寡核苷酸(FR-A-2 607 507)或 PNA (Μ. Egholm et al.，J.Am· Chem. Soc.，114，1895-1897，1992)或2' _0_烷基核糖)進(jìn)行修飾。這些修飾的每一種都可以組合進(jìn)行，條件是所述核酸中存在至少一個(gè)磷酸酯。核酸可以是天然的或合成的、寡核苷酸、多核苷酸、核酸片段、核糖體RNAjfH RNA、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA、通過酶學(xué)擴(kuò)增技術(shù)獲得的核酸，所述酶學(xué)擴(kuò)增技術(shù)例如_PCR(聚合酶鏈反應(yīng))，描述于美國專利號(hào)4683195、美國專利號(hào)4683202和美國專利號(hào)4800159，以及其RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄PCR)衍生技術(shù)，尤其是如專利EP-B-0569272中描述的一步形式的RT-PCR，-RCR (修復(fù)鏈反應(yīng))，描述于專利申請(qǐng)W0-A-90/01069，-3SR (自主序列復(fù)制)，專利申請(qǐng)W0-A-90/06995,-NASBA (基于核酸序列的擴(kuò)增)，專利申請(qǐng)W0-A-91/02818，和-TMA (轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增)，美國專利號(hào)5399491.。這樣的“核酸”可以用作靶、引物或探針?！鞍行蛄小倍x為核酸分子的待檢測(cè)的部分。通過引物和擴(kuò)增相關(guān)的酶對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增導(dǎo)致形成“擴(kuò)增子”，其是通過雜交至探針而被物理檢測(cè)的核酸分子。靶序列的長度長達(dá)30個(gè)核苷酸并且優(yōu)選在100和300個(gè)核苷酸之間，但是可以考慮更長的多核苷酸 (長達(dá)1500個(gè)核苷酸)。本文所用的術(shù)語“引物”指的是天然出現(xiàn)的(如限制性酶切片段)或合成產(chǎn)生的寡核苷酸，當(dāng)置于合適的條件(如緩沖液、鹽、溫度和PH)下，存在核苷酸和用于核酸聚合的試劑(如酶，如DNA依賴或RNA依賴聚合酶)時(shí)，其能夠作為引物延伸產(chǎn)物的合成起始點(diǎn)， 所述引物延伸產(chǎn)物與核酸鏈(模板或靶序列)的部分互補(bǔ)。通常一組引物將由至少兩種引物組成，一種“上游”引物和一種“下游”引物，其一起限定擴(kuò)增子(使用所述引物擴(kuò)增的序列并且是靶序列的部分或與靶序列的部分互補(bǔ))。其中一種引物雜交至(+)鏈，而第二種引物雜交至靶的(_)鏈。引物的長度應(yīng)當(dāng)在10和50個(gè)核苷酸之間，優(yōu)選在10和30個(gè)核苷酸之間。引物可以額外地與啟動(dòng)子序列例如T7啟動(dòng)子連接。如本文所用，術(shù)語“探針”意思是其包括能夠雜交至擴(kuò)增子的一段核苷酸。優(yōu)選雜交部分是10-50，更優(yōu)選15-35，最優(yōu)選15-30個(gè)核苷酸的區(qū)段。在本申請(qǐng)中術(shù)語“分析物”、“擴(kuò)增子”和“靶”或“靶序列，，可以互換使用。分析物是待檢測(cè)的原始核酸分子。靶序列是通過引物擴(kuò)增的分析物的部分。擴(kuò)增導(dǎo)致形成擴(kuò)增子， 其是通過雜交至探針而被物理檢測(cè)的核酸分子。擴(kuò)增子的序列與分析物內(nèi)的靶序列相同或互補(bǔ)。術(shù)語“非保守核苷酸”或“基因型變異”或“一個(gè)核苷酸變異”或“變異”指的是任何單或多核苷酸置換、缺失或插入。這些核苷酸變異可以是突變體或多態(tài)性等位基因變異。如本文所用，術(shù)語“多態(tài)性”指的是兩個(gè)或更多個(gè)不同的核苷酸序列可以存在于 DNA或RNA的特別位點(diǎn)。
本發(fā)明將在下面的實(shí)施例中進(jìn)一步闡述，所述實(shí)施例并不旨在以任何方式限制本發(fā)明。附圖簡述

圖1顯示使用缺失pi引物對(duì)HCV的NASBA擴(kuò)增對(duì)應(yīng)于通過正常pla/p2b引物對(duì) (圖1A)和根據(jù)本發(fā)明的pld/p2b引物對(duì)(圖1B)進(jìn)行的擴(kuò)增的兩個(gè)曲線圖的比較，其中 Pld包含一個(gè)缺失。圖2顯示使用不同的缺失pi引物對(duì)HCV的NASBA擴(kuò)增對(duì)應(yīng)于通過正常p2引物 (HCV-E2 p2b)和引物對(duì)中的pi引物進(jìn)行的擴(kuò)增的四個(gè)曲線圖的比較，其中所述Pl是 含有一個(gè)缺失的缺失引物HCV-E2_pld，如圖2A所顯示， 含有兩個(gè)缺失的缺失引物HCV-E2-ple，如圖2B所顯示， 含有兩個(gè)缺失的缺失引物HCV-E2_plf，如圖2C所顯示，和 含有三個(gè)缺失的缺失引物HCV-E2_plg，如圖2D所顯示。圖3顯示使用不同缺失pi引物對(duì)HIV RNA的擴(kuò)增對(duì)應(yīng)于通過正常p2引物 (HIV-E2 p2b)和引物對(duì)中的pi引物進(jìn)行的擴(kuò)增的四個(gè)曲線圖的比較，其中所述pi是 不含有缺失的正常引物HIV. 27，如圖3A所顯示， 含有一個(gè)缺失的缺失引物HIV. 55，如圖:3B所顯示， 含有一個(gè)缺失的缺失引物HIV. 56，如圖3C所顯示，和 含有兩個(gè)缺失的缺失引物HIV. 57，如圖3D所顯示。圖4相關(guān)的兩個(gè)圖顯示使用缺失pi和缺失p2引物對(duì)HIV RNA的NASBA擴(kuò)增。HIV擴(kuò)增使用缺失引物組HIV缺失pi (HIV. 57)和HIV缺失p2(表1)進(jìn)行，所述引物都包括兩個(gè)缺失(圖4b)。使用的參照引物組是HIV參照pi (HIV. 27)和HIV參照p2 (表 1)，所述引物都沒有缺失(圖如)。擴(kuò)增在HIV特異的分子信標(biāo)(HIV WT MB,Me23)存在下進(jìn)行。使用5000、500、50和5個(gè)拷貝的體外轉(zhuǎn)錄的HIV B亞型RNA作為擴(kuò)增的輸入材料。 沒有模板的樣品(NT)用作陰性對(duì)照。圖5相關(guān)的兩個(gè)圖說明在缺失分子信標(biāo)存在下對(duì)HIV RNA的NASBA擴(kuò)增。使用參照引物組(HIV參照pi (HIV. 27)和HIV參照p2)的HIV擴(kuò)增在HIV特異的分子信標(biāo)(HIV WT MB，0TMB8472，表1)或在包括兩個(gè)缺失的HIV缺失信標(biāo)(HIV WT deletion MB，表1)存在下進(jìn)行。所述HIV特異的分子信標(biāo)標(biāo)為“HIV WT參照信標(biāo)”(圖fe)，所述HIV缺失信標(biāo)標(biāo)為“HIV WT缺失信標(biāo)”(圖5b)。使用5000、500、50和5個(gè)拷貝的體外轉(zhuǎn)錄的HIV B亞型 RNA作為擴(kuò)增的輸入材料。沒有模板的樣品(NT)用作陰性對(duì)照。圖6顯示使用缺失引物的對(duì)HIV DNA的PCR擴(kuò)增。HIV PCR擴(kuò)增在HIV特異的分子信標(biāo)(HIV WT MB(MB41，表1))存在下，使用有或沒有缺失的不同的引物組合進(jìn)行。使用了兩種缺失引物，HIV PCR缺失pi和HIV缺失p2，都包括兩個(gè)缺失。測(cè)試了引物的四種不同組合圖6a 參照引物組，HIV PCR參照pi和HIV參照p2，圖 6b :HIV PCR 缺失 pi 和 HIV 參照 p2,圖 6c :HIV PCR 參照 pi 和 HIV 缺失 p2 和圖 6d :HIV PCR 缺失 pi 和 HIV 缺失 p2。使用含有部分HIV B亞型序列的質(zhì)粒DNA大約106、IO4和100個(gè)拷貝的稀釋系列作為擴(kuò)增的輸入材料。沒有模板的樣品(NT)用作陰性對(duì)照。在下面顯示的實(shí)施例1-6中所使用的pi弓丨物、p2引物和分子信標(biāo)的序列是用于 NASBA擴(kuò)增的，并總結(jié)于表1。
權(quán)利要求
1.設(shè)計(jì)為用于擴(kuò)增靶核酸序列的引物，所述靶序列含有至少一個(gè)變異，定義為稱作基因型變異的一個(gè)非保守核苷酸，或定義為同一種基因型內(nèi)的一個(gè)核苷酸變異，其中所述引物包含與所述靶序列互補(bǔ)的核酸序列，但至少一個(gè)與所述變異互補(bǔ)的堿基除外，其不存在于所述引物中。
2.權(quán)利要求1的引物，其中所述引物與含有至少兩個(gè)變異的靶序列互補(bǔ)，每個(gè)變異由至少一個(gè)保守核苷酸相互分開。
3.擴(kuò)增靶核酸序列的引物對(duì)，所述靶序列含有至少一個(gè)變異，定義為稱作基因型變異的一個(gè)非保守核苷酸，或定義為同一種基因型內(nèi)的一個(gè)核苷酸變異，其中所述引物中的至少一種是根據(jù)權(quán)利要求1或2設(shè)計(jì)的。
4.設(shè)計(jì)為用于檢測(cè)靶核酸序列的探針，所述靶序列含有至少一個(gè)變異，定義為稱作基因型變異的一個(gè)非保守核苷酸，或定義為同一種基因型內(nèi)的一個(gè)核苷酸變異，其中所述探針包含與所述靶序列互補(bǔ)的核酸序列，但至少一個(gè)與所述變異互補(bǔ)的堿基除外，其不存在于所述探針中。
5.權(quán)利要求4的探針，其中所述探針包含至少一種標(biāo)記物。
6.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的引物或引物對(duì)或探針，其中所述靶序列是靶RNA。
7.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的引物或引物對(duì)，其中一種引物具有啟動(dòng)子序列。
8.一種擴(kuò)增樣品中的核酸靶序列的方法，所述核酸靶序列含有至少一個(gè)變異，定義為稱作基因型變異的一個(gè)非保守核苷酸，或定義為同一種基因型內(nèi)的一個(gè)核苷酸變異，所述方法包括對(duì)樣品進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)放大所述靶序列的存在，所述擴(kuò)增反應(yīng)使用1)第一引物，其能夠特異地雜交至靶序列的一個(gè)區(qū)域并能夠在延伸條件下引導(dǎo)第一引物向第二引物雜交區(qū)域延伸，以及2)第二引物，其能夠特異地雜交至靶序列另一個(gè)區(qū)域的互補(bǔ)序列并能夠在延伸條件下引導(dǎo)第二引物向所述第一引物雜交區(qū)域的互補(bǔ)序列延伸，以及其中所述至少一個(gè)變異位于所述引物中的至少一種引物的雜交區(qū)域中，以及其中所述引物中的至少一種引物包含與所述靶序列互補(bǔ)的核酸序列，但至少一個(gè)與所述變異互補(bǔ)的堿基除外，其不存在于所述引物中。
9.一種檢測(cè)樣品中核酸靶序列的方法，所述核酸靶序列含有至少一個(gè)變異，定義為稱作基因型變異的一個(gè)非保守核苷酸，或定義為同一種基因型內(nèi)的一個(gè)核苷酸變異，所述方法包括(a)對(duì)所述樣品進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)檢測(cè)靶序列的存在，所述擴(kuò)增反應(yīng)使用(1)第一引物，其能夠特異地雜交至靶序列的一個(gè)區(qū)域或靶序列的一個(gè)互補(bǔ)區(qū)域，并能夠在延伸條件下引導(dǎo)第一引物向第二引物雜交區(qū)域延伸，以及(2)第二引物，其能夠特異地雜交至靶序列另一個(gè)區(qū)域或靶序列的另一個(gè)互補(bǔ)區(qū)域，并能夠在延伸條件下引導(dǎo)第二引物向所述第一引物雜交區(qū)域的互補(bǔ)序列延伸，以及(b)使用至少一種探針對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)反應(yīng)檢測(cè)所述靶序列的存在，所述探針能夠特異地雜交至靶序列中位于第一引物能夠雜交的區(qū)域和第二引物能夠雜交的區(qū)域之間的區(qū)域，其中所述至少一個(gè)變異位于所述引物中的至少一種引物的雜交區(qū)域中，并且其中所述引物中的至少一種引物包含與靶序列互補(bǔ)的核酸序列，但至少一個(gè)與所述變異互補(bǔ)的堿基除外，其不存在于所述引物中。
10.權(quán)利要求8或9的方法，其中所述擴(kuò)增反應(yīng)選自基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增和PCR。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增是NASBA。
12.權(quán)利要求8或9的方法，其中所述靶序列是靶RNA。
13.—種檢測(cè)樣品中核酸靶序列的方法，所述核酸靶序列含有至少一個(gè)變異，定義為稱作基因型變異的一個(gè)非保守核苷酸，或定義為同一種基因型內(nèi)的一個(gè)核苷酸變異，所述方法包括(a)至少一種能夠特異地雜交至靶序列的一個(gè)區(qū)域的探針，以及(b)檢測(cè)所述靶序列的存在，其中所述至少一個(gè)變異位于所述探針中的至少一種探針的雜交區(qū)域中，以及其中所述探針中的至少一種探針包含與靶序列互補(bǔ)的核酸序列，但至少一個(gè)與所述變異互補(bǔ)的堿基除外，其不存在于所述探針中。
14.權(quán)利要求13的檢測(cè)方法，其中在檢測(cè)由所述靶序列產(chǎn)生的擴(kuò)增子的存在的檢測(cè)反應(yīng)之前進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。
15.權(quán)利要求14的檢測(cè)方法，其中所述擴(kuò)增反應(yīng)包括(a)加入第一引物，其能夠特異地雜交至靶序列的一個(gè)區(qū)域或靶序列的一個(gè)互補(bǔ)區(qū)域， 并能夠在延伸條件下引導(dǎo)第一引物向第二引物雜交區(qū)域延伸，以及(b)加入第二引物，這可以在第一引物加入的同時(shí)進(jìn)行，所述第二引物能夠特異地雜交至靶序列另一個(gè)區(qū)域或靶序列的另一個(gè)互補(bǔ)區(qū)域，并能夠在延伸條件下引導(dǎo)第二引物向所述第一引物雜交區(qū)域的互補(bǔ)序列延伸，以及(c)將樣品置于如酶、三磷酸核苷酸等試劑中，并置于如溫度、PH等物理?xiàng)l件下，以使得所述引物雜交和延伸并釋放因此獲得的擴(kuò)增子。
16.權(quán)利要求13-15任一項(xiàng)的檢測(cè)方法，其中所述探針的雜交區(qū)域位于以下區(qū)域之間 第一引物可以通過該區(qū)域雜交至靶序列或所述靶序列的互補(bǔ)序列的區(qū)域，第二引物可以通過該區(qū)域雜交至靶序列或所述靶序列的互補(bǔ)序列的區(qū)域。
17.權(quán)利要求13-16任一項(xiàng)的檢測(cè)方法，其中所述探針含有至少一種標(biāo)記物。
18.權(quán)利要求17的檢測(cè)方法，其中所述探針是在其每個(gè)末端帶有一種標(biāo)記物的核酸。
19.權(quán)利要求13和15-18任一項(xiàng)的檢測(cè)方法，其中所述檢測(cè)反應(yīng)是實(shí)時(shí)檢測(cè)。
20.試劑盒，其含有權(quán)利要求3的至少一種引物對(duì)和權(quán)利要求4或5的至少一種探針。
全文摘要
本發(fā)明提供引物或/和探針，其靶序列含有至少一個(gè)變異，定義為稱作基因型變異的一個(gè)非保守核苷酸，或定義為同一種基因型內(nèi)的一個(gè)核苷酸變異，其中所述引物或/和探針包含與其靶序列互補(bǔ)的核酸序列，但至少一個(gè)與所述變異互補(bǔ)的堿基除外，其不存在于引物或/和探針中。本發(fā)明在用于診斷、預(yù)防和治療用途的方法中特別有用。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102165077SQ200980137630
公開日2011年8月24日 申請(qǐng)日期2009年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月24日
發(fā)明者B·戴曼, D·范斯特里普 申請(qǐng)人:生物梅里埃公司