專利名稱：制作微珠的方法和微珠的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制作微珠的方法，也涉及微珠。更具體地，本發(fā)明涉及制作微珠的方法等，在制作微珠的方法中，給定類型的物質(zhì)在表面上被固相化的微珠通過光刻膠法制備于基板上。
背景技術(shù)：
在核酸、蛋白質(zhì)等的生化分析中，目前已在使用稱之為“微珠”的粒子載體。例如， 在核酸的分析中，所用的微珠中，具有與靶核酸鏈相關(guān)的互補堿基序列的探針核酸鏈被固相化于其表面上。靶核酸鏈基于靶核酸鏈和探針核酸鏈之間的相互作用而分離。在蛋白質(zhì)分析中，使用與靶蛋白相關(guān)的抗體固相化于微珠表面上的微珠按照類似的方式分離所述靶蛋白。近來，在利用這些微珠的生化分析中要求更高的處理能力，人們正就此開發(fā)實現(xiàn)高速分析的技術(shù)。在專利文獻(xiàn)1中，例如，公開了“一種檢測分析物的方法，所述分析物是樣品內(nèi)的多個分析物中的分析物，第一次提及的分析物采用各自的分析反應(yīng)物識別，所述方法包括 (a)將多個群體(population)的熒光粒子與樣品接觸，這些群體分別具有不同的熒光信號和不同的分析反應(yīng)物，其中分析反應(yīng)物特異性地結(jié)合至樣品中的一種分析物，而每一熒光粒子在其表面上具有至少一種用各個對應(yīng)熒光染料標(biāo)記的納米粒子，(b)向所述樣品中加入標(biāo)記試劑，(c)檢測標(biāo)記，從而分析指示分析反應(yīng)物與分析物的結(jié)合的熒光粒子，以及 (d)根據(jù)與各自群體相關(guān)的不同熒光信號的功能，同時確定結(jié)合至各自分析物的熒光粒子的群體”參見權(quán)利要求23。在由Luminex Trading, Inc.提供的“懸浮液陣列技術(shù)(Suspension ArrayTechnology) ”中，基于這種技術(shù)，在微珠上標(biāo)記了兩種類型的熒光染料的同時，在發(fā)光顏色上賦予了變化，由此能夠使最大100種類型的微珠相互區(qū)分開。根據(jù)“懸浮液陣列技術(shù)”，當(dāng)不同探針核酸鏈和抗體分別固相化于100種類型的微珠上時，就有可能同時通過一次分析而分離和檢測100種不同類型的核酸鏈和蛋白質(zhì)。在上述文獻(xiàn)中，其記載了“熒光粒子的群體進(jìn)一步根據(jù)其尺寸和形狀進(jìn)行檢測”(參見權(quán)利要求25)并公開了對于區(qū)別微珠的其它參數(shù)，可以采用珠粒的尺寸和性狀 (參見該文獻(xiàn)的第0037段等)。與此有關(guān)的是，在非專利文獻(xiàn)1中，還描述了在流路中根據(jù)光刻膠法制備多種不同形狀的微珠的方法。根據(jù)這種方法，制作超過1百萬種類型的微珠變成可能?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1 日本專利公開No. 3468750非專利文獻(xiàn)非專禾0 文獻(xiàn) 1 "‘Multifunctional encoded particles forhigh-throughputbiomolecule analysis" . Science, 2007, Mar. 9 ；315 (5817) :1393-6

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題在專利文獻(xiàn)1和非專利文獻(xiàn)1中公開的而具有不同熒光特性和形狀的很多類型的微珠分別用彼此不同的探針核酸鏈或抗體固相化，并混合用作珠集(bead set)。這種珠集和包含靶核酸鏈的樣品進(jìn)行混合并沖洗，接著通過光信號、磁信號或電信號檢測各微珠和其表面上捕獲的靶核酸鏈。為了獲得高分析精度，在珠集中存在的微珠數(shù)必須是清楚的。例如，對于最簡單的樣品，其中兩種類型的微珠信號強度相互進(jìn)行比較，如果珠集中所含的兩種類型的微珠數(shù)目(群體)均不清楚，則不可能對所得信號強度進(jìn)行相互比較。在這種情況下，為了精確比較分析信號強度，期望兩種類型的微珠以相同的數(shù)目存在，或者如果數(shù)目不相等，需要知道兩種類型的微珠之間數(shù)量比率。目前，在珠集中的群體通過在制備后基于重量和吸光度定量測定、并將其混合而進(jìn)行了調(diào)節(jié)。然而，采用這種方法，不可能精確調(diào)節(jié)各種類型的微珠數(shù)目，由此引起群體變化，導(dǎo)致妨礙實現(xiàn)高分析精度。因此，作為主要目的，本發(fā)明提供了一種能夠供給包含各種微珠并且其中各種類型的微珠群體清楚的珠集的制作微珠的方法。技術(shù)解決方案為了解決上述問題，本發(fā)明提供一種制作微珠的方法，其包括以下步驟在基板上形成用親水性有機材料制成的親水層，在所述親水層上層積能夠作為微珠剝離的薄膜，通過光刻膠法將薄膜形成為給定形狀，在成形后的薄膜上固相化給定類型的物質(zhì)，以及將所述物質(zhì)固相化的、成形后的薄膜從所述基板連同至少一部分所述親水層剝離而獲得微珠。 根據(jù)這種微珠的制作方法，通過設(shè)計在光刻膠法中使用的光掩模形狀，能夠各自以任意數(shù)量制作具有任意的多形態(tài)的微珠。在這種微珠制作方法中，將溶解于溶劑中的親水性有機材料涂覆于基板上并干燥而形成所述親水層。此后，在所述剝離步驟中，將溫度被設(shè)定在所述親水性有機材料能夠再溶解的溫度下的溶劑用于溶解部分親水層，或成形后的薄膜連同至少部分親水層通過超聲處理而剝離，由此獲得微珠。按照這種方式，能夠獲得微珠，所述微珠每一個都具有提供了兩個基本平行的相對面的立體形狀，而僅僅在其一個面上固相化給定物質(zhì)而另一個面在其至少一部分上賦予親水性。在這種情況下，親水層由一種或多種選自聚乙烯醇、淀粉、糊精、直鏈淀粉、明膠、 瓊脂、卡拉膠、果膠、刺槐豆膠和光敏性親水樹脂的親水性有機材料形成。微珠制作方法還可以包括在所述基板上形成犧牲層的步驟。在這種情況下，親水層層積于所述犧牲層上。在剝離步驟中，犧牲層被物理或化學(xué)侵蝕，從而所述成形后的薄膜連同所述親水層一起被剝離。按照這種方式，像上述情況一樣，能夠獲得的微珠，具有提供有兩個基本平行的相對面的立體形狀，并且其中僅僅在其一個面上固相化給定類型的物質(zhì)，而另一個面在其至少一部分上被賦予親水性。在這種情況下，所述親水層由一種或多種選自光敏性親水樹脂、聚乙烯醇、淀粉、糊精、直鏈淀粉、明膠、瓊脂、卡拉膠、果膠和刺槐豆膠的親水性有機材料形成。所述犧牲層可以用氟系有機材料或聚酰亞胺有機材料，或可以用與親水層所用的相同類型的親水性有機材料或不同類型的親水性有機材料形成。當(dāng)所述犧牲層用氟系有機材料形成的情況下，這種由氟系有機材料形成的犧牲層在剝離步驟中進(jìn)行升華或通過使用氟系溶劑溶解，從而由此容許所述成形后的薄膜從基板連同所述親水層一起剝離而獲得微珠。當(dāng)所述犧牲層用聚酰亞胺有機材料形成的情況下，將這種由所述聚酰亞胺有機材料制成的犧牲層在所述剝離步驟中溶解于非質(zhì)子溶劑中，由此容許所述成形后的薄膜從基板連同所述親水層一起剝離而獲得微珠。在用與所述親水層相同類型的親水性有機材料或不同類型的親水性有機材料形成犧牲層的情況下，用所述親水性有機材料形成的犧牲層在所述剝離步驟中于溫度設(shè)定為親水性有機材料能夠再溶解的溫度下的溶劑中溶解，或?qū)嵤┏曁幚矶纱巳菰S所述成形后的薄膜從基板連同所述親水層一起剝離而獲得微珠。在這種微珠制作方法中，固相化步驟應(yīng)該優(yōu)選通過在薄膜上化學(xué)合成所述物質(zhì)來實施。更具體地，對于這種物質(zhì)，一種或多種選自核酸或肽的給定序列和糖鏈的生物高分子進(jìn)行固相化。優(yōu)選在成形步驟之后、固相化步驟之前于所述成形后的薄膜之間的區(qū)域中進(jìn)行拒水整理。拒水整理能夠防止滴加在所述成形后的薄膜表面上的溶液發(fā)生相互混合，由此能夠使所需類型的物質(zhì)固相化于各微珠上。在微珠制作方法中，薄膜適宜通過使用光刻膠或二氧化硅形成。在本發(fā)明的實施中，固相化于薄膜，即微珠上的“物質(zhì)”，廣泛包括那些能夠與靶核酸或靶蛋白相互作用的物質(zhì)，靶核酸或靶蛋白在使用微珠的生化分析中是分析中的靶。這種物質(zhì)優(yōu)選是選自給定序列的核酸或肽和糖鏈的生物高分子，并且應(yīng)該包括能夠與靶核酸等相互作用的分子。在“生物高分子”涉及核酸的情況下，核酸應(yīng)該是具有給定堿基序列的核酸?！跋嗷プ饔谩笔侵妇哂谢パa堿基序列的核酸之間雙鏈體的形成。在“生物高分子”涉及肽的情況下，這種肽應(yīng)該是具有給定氨基酸序列的肽?！跋嗷プ饔茫?，在這種情況下，例如， 是指蛋白-蛋白結(jié)合，如受體蛋白和配體蛋白之間的結(jié)合或抗原與抗體之間的結(jié)合。此外， 如果生物高分子涉及糖鏈，糖鏈應(yīng)該是糖類結(jié)合的鏈或這種結(jié)合鏈還與脂質(zhì)或蛋白質(zhì)結(jié)合并是寡糖、糖脂質(zhì)或糖蛋白。除此之外，這種“物質(zhì)”還涵蓋各種小分子形式的化合物。這些化合物是能夠與靶核酸或靶蛋白結(jié)合的化合物，靶核酸或靶蛋白生化分析中的靶，以及是能夠促進(jìn)或抑制核酸或蛋白質(zhì)的功能的化合物和成為藥物開發(fā)領(lǐng)域的所謂“種子化合物” 的化合物。應(yīng)該注意到，本文中所用的“核酸”包括，除了 DNA和RNA以外，通過其核糖部分的結(jié)構(gòu)改性而獲得的核酸類似物(例如，LNA(加鎖核酸))。有益的效果根據(jù)本發(fā)明，提供了一種制作微珠的方法，該方法能夠提供包括各種微珠并且各微珠的群體明確的珠集。


[圖1]圖1是示出根據(jù)本發(fā)明的微珠制作方法獲得的微珠和珠集的示意圖。[圖2]圖2是示出根據(jù)本發(fā)明一個實施方式的微珠制作方法的步驟的流程圖。
[圖3]圖3是示意性示出根據(jù)本發(fā)明第一實施方式的微珠制作方法的成膜步驟S1 至成形步驟&和剝離步驟S7中基板上的構(gòu)成的透視圖。[圖4]圖4是示意性示出根據(jù)本發(fā)明第一實施方式的微珠制作方法的拒水整理步驟、中基板上的構(gòu)成的俯視圖。[圖5]圖5是示意性示出根據(jù)本發(fā)明微珠制作方法固相化步驟&中基板上的構(gòu)成的透視圖。[圖6]圖6是示意性示出根據(jù)本發(fā)明第一實施方式的微珠制作方法的成膜步驟S1 至固相化步驟&之后的基板(A)和剝離步驟S7之后的基板(B)的截面圖。[圖7]圖7是示出根據(jù)本發(fā)明第二實施方式的微珠制作方法的步驟的流程圖。[圖8]圖8是示出根據(jù)本發(fā)明第二實施方式的微珠制作方法的成膜步驟&至固相化步驟&之后的基板(A)和剝離步驟S7之后的基板(B)的截面圖。[圖9]圖9是示出固相化于實施例1和3中微珠表面上的寡DNA的和靶寡DNA的結(jié)構(gòu)的示圖，其中㈧關(guān)于寡DNA-1，⑶關(guān)于寡DNA-2而(C)關(guān)于寡DNA-3。
具體實施例方式實施本發(fā)明的優(yōu)選實施方式參照附圖進(jìn)行描述。應(yīng)該注意到，以下舉例說明的實施方式是本發(fā)明的典型實施方式的實例，本發(fā)明的范圍不應(yīng)該被解釋為狹窄地限于這些實例。1.微珠(1)構(gòu)形(configuration)和群體圖1是示出根據(jù)本發(fā)明的微珠制作方法獲得的微珠和珠集的示意圖。在圖1中，參考數(shù)字1表示的珠集由包括大致為圓柱體的微珠11和大致為立方體的微珠12的兩種類型的微珠構(gòu)成。根據(jù)本發(fā)明的微珠制作方法獲得的微珠具有提供有兩個基本平行的相對面的立體構(gòu)形。微珠11和微珠12在整體形狀上是不同的，并且能夠基于構(gòu)形上的差異通過一般的圖像區(qū)分方式就能夠相互區(qū)別開。珠集1包括給定數(shù)量的微珠11和微珠12(圖1中每組4個)。根據(jù)本發(fā)明的微珠制作方法獲得的珠集特征在于以給定數(shù)目包含構(gòu)形上不同的多種類型的微珠并且所述數(shù)目明確。在珠集1中存在的各種類型的微珠的數(shù)目(群體)可以任意設(shè)定。為了簡單起見， 圖1示出了兩種類型的微珠，基本上圓柱體和基本上立方體的(微珠)，每一種類型包含4 種微珠。在珠集1中可以包含三種以上類型的微珠，并且各種類型的微珠的數(shù)目可以相互不同。各種類型的微珠的構(gòu)形可以任意設(shè)計，只要它們通過傳統(tǒng)的成像辨別方式能夠辨別。 本文中所用的“構(gòu)形”除了包括微珠的整體構(gòu)形外，還包括在微珠表面內(nèi)或表面上的微細(xì)形狀(典型地，就是所謂的“條形碼”)。(2)探針在微珠11的表面上，存在固相化的生物高分子如核酸或肽、或糖類、或小分子(下文中稱之為“核酸等”)，在圖1中用符號P11表示。其特點是這些物質(zhì)僅僅在微珠11表面中的兩個基本平行相對面的一個面上進(jìn)行固相化。
核酸等P11根據(jù)分析對象的類型可以使用給定的堿基序列或氨基酸序列。而且，核酸等P11可以使用糖鏈或各種化合物。下文中，主要描述核酸或肽用作核酸等P11的情況。例如，在核酸是分析對象的情況下，具有與其靶核酸相關(guān)的互補堿基序列的核酸鏈作為核酸等P11進(jìn)行固相化。這使得樣品中靶核酸鏈能夠通過與核酸等P11雜交(雙鏈體)形成而在微珠11上捕獲、分離。應(yīng)該注意到，核酸鏈等P11的堿基的數(shù)目(長度)是任意的，并且只要靶核酸鏈的堿基序列在其至少部分上具有互補堿基序列且雙鏈體形成是可能的，則堿基的數(shù)目并沒有嚴(yán)格限制。一般而言，核酸鏈等P11中堿基的數(shù)目是幾個到幾十個，優(yōu)選約10至30個。例如，在蛋白質(zhì)是分析對象時，能夠與靶蛋白(例如，受體蛋白)相互作用的肽 (例如，配體蛋白的部分氨基酸序列)作為核酸等P11進(jìn)行固相化。這使得樣品中靶蛋白能夠通過與核酸等P11相互作用而在微珠11上捕獲、分離。另一方面，圖1中通過符號P12表示的核酸等固相化于微珠12的表面上。核酸等 P12可以根據(jù)作為分析對象的核酸或蛋白質(zhì)的類型使用給定堿基序列或氨基酸序列，也可以使用糖鏈，或者各種化合物。在微珠12中，這些物質(zhì)固相化于基本平行而相互相對的兩個面中的一個面(上表面)上。例如，當(dāng)不同類型的物質(zhì)，如具有不同堿基序列或氨基酸序列的核酸或肽，用作將固相化于微珠11的表面上的核酸等P11和將固相化于微珠12的表面上的核酸等P12時，不同類型的靶核酸或靶蛋白能夠在各種類型的微珠上捕獲、分離。用微珠11、12捕獲和分離的靶核酸或靶蛋白采用熒光染料標(biāo)記通過例如光學(xué)檢測進(jìn)行檢測，同時微珠11、12通過圖像識別手段進(jìn)行辨別，由此使得兩種類型的靶核酸或靶蛋白能夠被同時分析。例如，對于單核苷酸多態(tài)(SNP)分析的情況，核酸等P11的堿基序列確定為對應(yīng)于一個SNP的堿基序列，而核酸等P12的堿基序列作為對應(yīng)于另一 SNP的堿基序列。這種珠集與樣品混合，并將微珠11上的信號(例如，熒光信號強度)和微珠12上的信號進(jìn)行相互比較，由此使得確定樣品中所含的核酸的SNP類型之間的比率成為可能。(3)親水性微珠11、12的兩個基本平行相對面中，沒有固相化核酸等P11和P12的面(在圖中的底面)被賦予親水性，該親水性是由于下文描述的“親水層”所產(chǎn)生。微珠通常由疏水材料形成，以便使用時保持其在水溶液中的構(gòu)形。本發(fā)明的微珠 11、12也是通過下文描述的光刻膠法由疏水性薄膜材料形成。然而，在微珠由疏水材料形成的情況下，微珠表面變得疏水，因此由于疏水性相互作用而存在微珠相互凝聚的問題。微珠的相互凝聚使核酸等pn、p12不能被固相化。另外， 當(dāng)它們用于分析時，采用圖像識別手段辨別其構(gòu)形變得不太可能，并且不能實現(xiàn)有效捕獲和分離靶核酸或靶蛋白，這樣就不能獲得精確的分析結(jié)果。這就是微珠11、12被配置為賦予其兩個基本平行的相對面中的一個面(圖中的底面)親水性的原因，由此防止微珠的相互凝聚。2.珠集按照這種方式，珠集1由具有不同構(gòu)形的多種類型的微珠構(gòu)成，所述微珠中堿基序列或氨基酸序列彼此不同的核酸鏈或肽被固相化。這使得同時分析樣品中存在的多種靶核酸或蛋白質(zhì)成為可能。如上文所述，為了獲得高分析精度，在珠集中所含的各種類型的微珠數(shù)目必須是清楚的。例如，在前述SNP分析的情況下，如果珠集1中的微珠11、12的群體是未知的，則就不可能通過比對由此獲得的信號而精確地確定樣品中核酸的SNP類型之間的比率。在這點上，對于具有不同構(gòu)形的多種類型的微珠的數(shù)目清楚的珠集1，微珠11和微珠12的數(shù)目能夠彼此完全一致，由此可設(shè)定為相同的數(shù)目。因此，對二者獲得的信號進(jìn)行相互比較，由此能夠獲得高分析精度。3.微珠制作方法I(設(shè)置親水層作為犧牲層的情況)參照圖2，下面將描述涉及微珠和珠集的制作方法的第一實施方式。圖2是示出根據(jù)第一實施方式的微珠制作方法的步驟的流程圖。(1)親水層的成膜步驟在圖2中，用符號S1表示的“親水層形成步驟”是“親水層”形成在基板上而賦予微珠底面親水性的步驟。在根據(jù)本實施方式的微珠制作方法中，親水層起到了將微珠從其剝離的所謂犧牲層的作用。所用的基板包括，例如，玻璃基板、硅基板等?；宀牧喜]有嚴(yán)格限制，而常用于光刻膠技術(shù)的那些材料都可以采用。本發(fā)明中所用的“犧牲層”是指在下文描述的剝離步驟S7中能夠進(jìn)行物理或化學(xué)侵蝕的物質(zhì)層。能夠作為微珠剝離的薄膜形成于該犧牲層上作為上層并在剝離步驟中經(jīng)受侵蝕而獲得微珠。犧牲層應(yīng)該優(yōu)選是不會出現(xiàn)在剝離步驟之前的微珠制作步驟中、尤其是固相化核酸等的步驟中由于所用的化學(xué)品而使得基板上微珠被剝離的程度的侵蝕和損壞。犧牲層應(yīng)該優(yōu)選是能夠在剝離步驟中被侵蝕而不會使微珠上固相化的核酸等變性或釋放的層。如果在微珠上的固相化的核酸等發(fā)生變性、損壞、釋放等，則靶核酸或靶蛋白就不能被捕獲在微珠上。因此，所用犧牲層應(yīng)該是可被侵蝕而同時保持與固相化于微珠上的靶核酸或靶蛋白如核酸等的相互作用性的層。在根據(jù)第一實施方式的微珠制作方法中，賦予微珠底面親水性的親水層也被用作所述犧牲層。該親水層用親水性有機材料形成。更具體地講，將溶解于溶劑中的親水性有機材料涂覆于基板上并干燥形成親水層。所述親水性有機材料可以通過旋涂、浸涂、絲網(wǎng)印刷、噴涂法、噴墨打印等進(jìn)行涂覆。由此形成的親水層可以通過使用溶劑而部分溶解，所述溶劑的溫度設(shè)定在親水性有機材料在下文描述的剝離步驟S7中能夠再溶解的溫度。因此，所用的親水性有機材料應(yīng)該優(yōu)選是，例如，在室溫(30°C)附近不會再溶解而在45°C附近或以上溫度發(fā)生再溶解的親水性有機材料。更具體而言，作為能夠再溶解于熱水或溫水中的親水性有機材料，可以使用一種或多種選自水溶性高分子如聚乙烯醇、淀粉、糊精、直鏈淀粉等的物質(zhì)。尤其是，聚乙烯醇優(yōu)選用作犧牲層，因為在溶解于加熱的溶劑后而被涂覆于基板上并干燥之后，除非再次加熱，否則是不會再溶解的。除此之外，作為親水性有機材料，可以采用的有明膠(其主要成分是膠原)、瓊脂 (其主要成分包括瓊脂糖和瓊脂膠)、卡拉膠(其主要成分包括半乳糖和脫水半乳糖)、果膠(其主要成分包括半乳糖醛酸和半乳糖醛酸甲酯)、刺槐豆膠(其主要成分是半乳甘露聚糖)、光敏性親水樹脂等。(2)形成微珠薄膜的成膜步驟 在圖2中，用符號S2表示的“微珠薄膜形成步驟”是形成層積于形成在基板上的親水層上、由用于微珠的材料制成的薄膜的成膜步驟。形成由用作微珠材料的各種高分子、二氧化硅或金屬(如鋁、鉻、金、銀等)制成的薄膜。根據(jù)用于薄膜的材料類型，可以通過迄今已知的技術(shù)如采用旋涂機或狹縫涂布機或噴吹的涂布技術(shù)、或氣相沉積如物理氣相沉積(PVD)和化學(xué)氣相沉積(CVD)進(jìn)行膜形成。根據(jù)制作的微珠的厚度，適當(dāng)設(shè)定薄膜的厚度(參見圖1中的符號h)。作為用于薄膜的材料，優(yōu)選使用包括環(huán)氧光刻膠如SU-8、聚酰亞胺光刻膠、丙烯酸光刻膠、酚醛清漆光刻膠等的光刻膠。采用高分子光刻膠薄膜，微珠能夠比采用二氧化硅薄膜或金屬薄膜的情況更加廉價地制作，并獲得低比重的微珠。在分析時，將微珠與樣品混合并分散于液相中。在此階段，當(dāng)微珠的比重較大時，液相中的分散狀態(tài)就不可能長時間保持。SU-8在這些高分子中是優(yōu)選的。SU-8是化學(xué)增幅的環(huán)氧系負(fù)性光刻膠。SU_8由美國IBM公司開發(fā)，適用于作為結(jié)合光刻膠超薄膜形成技術(shù)和光刻膠技術(shù)形成微結(jié)構(gòu)的材料。當(dāng)使用SU-8時，通過旋涂形成膜而很容易控制厚度。SU-8顯示出高光學(xué)透明度并對于各種溶劑、酸和堿具有良好耐溶性和耐高溫性。因此，使用SU-8使得具有不同厚度的微珠能夠以簡單方式制作并確保在微珠的制作工序中以及在使用微珠的分析過程中性能穩(wěn)定。(3)成形步驟圖2中用符號S3表示的“成形步驟”是在成膜步驟S2中形成的薄膜通過光刻膠法形成所需的形狀。對于光刻膠如SU-8的膜(3-1)以及對于二氧化硅或各種金屬的膜(3-2) 作為微珠的材料，該步驟通過不同工藝過程完成。(3-1)當(dāng)光刻膠如SU-8用作微珠材料進(jìn)行膜形成時在成膜步驟S2中形成的薄膜，如果必要，首先加熱并固化(預(yù)烘焙)。接著，使用具有繪制有微珠構(gòu)形的光掩模(下文中簡稱為“掩?！?進(jìn)行曝光。將曝光后的基板浸沒于液體顯影劑中以除去不必要的薄膜區(qū)域，隨后用液體沖洗劑(異丙醇IPA)沖洗而徹底除去不必要的區(qū)域。此后，進(jìn)行后烘焙而隨后留在基板上的薄膜上顯現(xiàn)微珠的構(gòu)形。當(dāng)掩模中的構(gòu)形根據(jù)要制作的微珠構(gòu)形進(jìn)行設(shè)計時，可以將具有任意構(gòu)形的微珠形成于基板上。類似地，任意設(shè)計掩模使得具有不同構(gòu)形的微珠能夠分別以任意數(shù)目形成。 采用無掩模曝光設(shè)備，同樣可以形成任意數(shù)目的具有任意構(gòu)形的微珠，而無需制作光掩模。(3-2)當(dāng)用二氧化硅或各種金屬作為微珠材料進(jìn)行膜形成時常用的光刻膠首先旋涂于薄膜表面，如果需要，也進(jìn)行預(yù)烘焙。接著，采用例如上述的掩模進(jìn)行曝光。將曝光后的基板浸沒于液體顯影劑以除去不必要的光刻膠區(qū)域，接著通過用液體沖洗劑(主要是超純水)沖洗幾次而除去不必要的區(qū)域并后烘焙。此后，薄膜通過蝕刻進(jìn)行圖案化而完全除去光刻膠。這使微珠構(gòu)形能夠在留在基板上的薄膜中顯現(xiàn)。(4)官能團(tuán)改性步驟
由圖2中符號S4表示的“官能團(tuán)改性步驟”是采用官能團(tuán)對成形步驟S3中形成的薄膜表面進(jìn)行改性的步驟。成膜步驟S2中形成于基板上的薄膜通過成形步驟S3僅僅留下一部分作為微珠，而其余部分都被除去。在官能團(tuán)改性步驟S4中，為了在下文中說明的固相化步驟的官能團(tuán)改性在用作微珠的部分的薄膜表面上進(jìn)行。改性官能團(tuán)可以是，例如，羥基、氨基、羧基、異硫氰酸酯基、環(huán)氧基、順丁烯二酰亞胺基等。在傳統(tǒng)的DNA芯片或蛋白芯片的制作中，為了在基板表面上引入用于固相化核酸鏈或肽的連接基，在基板表面上進(jìn)行官能團(tuán)改性。在本發(fā)明的實施中，可以采用類似的技術(shù)。對薄膜表面用羥基改性的具體實例進(jìn)行說明。在這種情況下，基板表面首先用氨基丙基三乙氧基硅烷處理，然后浸沒于溶解了 Y-戊內(nèi)酯的二甲基甲酰胺中而發(fā)生反應(yīng)， 完成羥基改性?；蛘?，基板表面可以用縮水甘油醚丙基三甲氧基硅烷處理并浸沒于四甘醇摻混少量濃硫酸的混合溶液中進(jìn)行反應(yīng)，完成改性。該官能團(tuán)改性步驟S4和下文中說明的拒水整理(water repellentfinishing)步驟S5也可以先進(jìn)行整理步驟S5,再進(jìn)行官能團(tuán)改性。應(yīng)該注意到，這兩個步驟并不總是必須的步驟。(5)拒水整理步驟 圖2中S5表示的“拒水整理步驟”是將成形步驟S3中形成的薄膜之間的基板區(qū)域進(jìn)行拒水整理的步驟。在成膜步驟S2中基板上形成的薄膜在成形步驟S3中的加工使得僅僅用作微珠的部分保留下來而其余部分被除去。在拒水整理步驟S5中，對薄膜被除去后的基板區(qū)域(成形后的薄膜之間的基板區(qū)域)賦予在隨后說明的固相化步驟中所必要的拒水性。對已經(jīng)除去薄膜的基板區(qū)域賦予拒水性有助于防止滴加在用作微珠的薄膜部分上的溶液彼此混合。例如，拒水整理可以按照以下方式進(jìn)行。首先，將會成為微珠的薄膜部分用常用的光刻膠臨時覆蓋，而薄膜已被除去的基板區(qū)域用三乙氧基-1H，1H，2H，2H-十三氟-正辛基硅烷處理。此后，除去光刻膠，由此對珠區(qū)域以外的基板區(qū)域賦予拒水性。或者，在用光刻膠覆蓋之后，可以旋涂氟樹脂并進(jìn)行烘焙以賦予拒水性。應(yīng)該注意到，官能團(tuán)改性步驟S4在完成拒水整理步驟S5之后進(jìn)行的情況下，在薄膜已移除的基板區(qū)域完成拒水整理之后官能團(tuán)僅僅在用作微珠的部分進(jìn)行改性。(6)固相化步驟圖2中由符號S6表示的“固相化步驟”是將核酸或肽固相化于成形步驟S3中形成的薄膜表面上的步驟。應(yīng)該注意到，進(jìn)行固相化的物質(zhì)，除了核酸或肽外，包括糖鏈和各種此前列出的化合物。在此階段，僅僅作為微珠的薄膜保留于基板上，而其它基板區(qū)域被賦予拒水性。在固相化步驟S6中，核苷溶液或氨基酸溶液(下文中總稱為“單體溶液”)滴加在作為微珠部分的薄膜表面上，核酸或肽通過在薄膜上的逐步合成(St印synthesis)而固相化。核酸或肽的逐步合成可以通過重復(fù)結(jié)合反應(yīng)的合成循環(huán)來進(jìn)行，結(jié)合反應(yīng)中根據(jù)所需的堿基序列或氨基酸序列，將含相應(yīng)堿基或氨基酸的單體溶液依次滴加在用作微珠的薄膜上。例如， 在固相化核酸的情況下，利用吸液管滴加含核苷的單體溶液，接著，通過滴加5-乙基巰基四唑而發(fā)生反應(yīng)。在沖洗和干燥之后，進(jìn)一步滴加氧化溶液并發(fā)生反應(yīng)，從而將核苷亞磷酸三酯轉(zhuǎn)化成核苷磷酸三酯。在沖洗之后，滴加乙酸酐/四氫呋喃混合溶液并發(fā)生反應(yīng)，從而封閉在官能團(tuán)改性步驟S4引入的未反應(yīng)的羥基。此外，在沖洗和干燥之后，滴加包含二氯乙酸的二氯甲烷溶液以從結(jié)合至基板的核苷的5'-羥基脫去二甲氧基三苯甲基保護(hù)基團(tuán)。此后，進(jìn)行沖洗和干燥，接著重復(fù)以上步驟(a)核苷鏈接，(b)沖洗， (c)氧化，(d)沖洗，(e)除去二甲氧基三苯甲基保護(hù)基團(tuán)和(f)沖洗，并最后進(jìn)行核酸堿基部分的去保護(hù)。這樣，具有所需堿基序列的核酸可被固相化。在固相化肽的情況下，例如，滴加含α-氨基和側(cè)鏈官能團(tuán)被適當(dāng)保護(hù)的氨基酸的單體溶液，并重復(fù)根據(jù)各種縮合方法在薄膜上進(jìn)行的縮合步驟，然后最終除去各種保護(hù)基團(tuán)。這使得具有所需氨基酸序列的肽能夠被固相化。通過將含預(yù)先合成的核酸或肽的溶液滴加在用作微珠的部分的薄膜上并與在官能團(tuán)改性步驟S4引入的官能團(tuán)結(jié)合，由此可以固相化核酸或肽?？梢酝ㄟ^用吸液管或微分散器或噴墨點樣進(jìn)行點樣來滴加單體溶液和預(yù)先合成的核酸或肽的溶液。(7)剝離步驟通過圖2中由符號S7表示的“剝離步驟”是從基板上剝離成形后的薄膜的步驟，核酸和肽已在成形后的薄膜上固相化。在根據(jù)第一實施方式的微珠制作方法中，親水層具有賦予微珠底面親水性的功能以及作為犧牲層的功能。在該剝離步驟S7中，部分親水層被溫度設(shè)定在親水性有機材料能夠再溶解的溫度下的溶劑溶解和侵蝕。例如，當(dāng)水溶性高分子如聚乙烯醇、淀粉、糊精、直鏈淀粉等用作親水性有機材料時，部分親水層被溫度設(shè)定于45°c附近或更高的溫度下的溶劑再溶解。親水層由于再溶解作用而被侵蝕，之后，層積于親水層上的薄膜作為微珠被剝離。 此時，部分親水層由于未溶解而被保留于薄膜表面接觸親水層的這一側(cè)，由此微珠表面通過該剩余的親水層而被賦予親水性。當(dāng)親水性有機材料被溶解于加熱的溶劑中時，部分親水層在大多數(shù)情況下都保留于薄膜表面上。為了對微珠表面賦予令人滿意的親水性，親水層的再溶解應(yīng)該優(yōu)選在使部分親水層積極地保留于薄膜表面上的條件下進(jìn)行。在本實施方式的剝離步驟S7中，作為侵蝕親水層(用作所謂犧牲層)的液體去除齊U，可以使用加熱至能夠再溶解親水性有機材料的溫度的溶劑，優(yōu)選加熱的純水。正如上文所述，犧牲層應(yīng)該優(yōu)選這樣的犧牲層能夠在所述剝離步驟中能夠被侵蝕而不會使在微珠上固相化的核酸等發(fā)生變性或釋放。在本實施方式中，純水用作液體去除劑，其使得能夠通過侵蝕犧牲層的同時、保持微珠上固相化的核酸等與靶核酸、靶蛋白等的相互活性而獲得微珠。應(yīng)該注意到，也可以通過將薄膜成形之后的基板進(jìn)行超聲處理、從而物理侵蝕親水層來剝離薄膜。這種超聲處理應(yīng)該優(yōu)選在將部分親水層保留于薄膜表面上的條件下進(jìn)行。4.微珠制作方法I的具體實例(將親水層作為犧牲層的情況)(1)親水層形成步驟至成形步驟
接著，參照圖3 圖5，對根據(jù)第一實施方式的微珠和珠集的制作方法進(jìn)行具體描述。圖3是示意性示出成膜步驟S1至成形步驟S3和剝離步驟S7中基板上的構(gòu)成的透視圖。 這里將SU-8用作微珠材料，將說明制作圖1中所示的微珠和珠集的情況下的實例。首先，在成膜步驟S1中，親水層3層積于基板2上(參見圖3的(A))。接著在成膜步驟S2中，將SU-8置于親水層3上(參見圖3的(B))，接著旋涂而形成薄膜4 (參見圖 3 的(C))。在此階段，控制SU-8的量和旋涂機的旋轉(zhuǎn)頻 率(參見圖中的箭頭)以控制薄膜4 的厚度，由此適當(dāng)設(shè)定所制作的微珠厚度(參見圖1中的符號h)。將在成膜步驟S1中形成的薄膜4進(jìn)行預(yù)烘焙，接著，通過在成形步驟S3中利用繪制有微珠構(gòu)形的掩模M來曝光(參見圖3的(D))。圖中箭頭指示來自光源的光。將曝光后的基板2浸沒于液體顯影劑中以除去其不必要的部分處的薄膜4。而且， 將基板用液體沖洗劑沖洗，使得微珠11、12以保留于基板2上的薄膜4的形式出現(xiàn)(參見圖3的(E))。當(dāng)掩模M中的構(gòu)形根據(jù)所要制作的微珠構(gòu)形設(shè)計時，可以在基板2上形成具有任意構(gòu)形的微珠。類似地，如果掩模M任意設(shè)計，則具有不同構(gòu)形的微珠就能夠分別按照任意數(shù)目形成。因此，根據(jù)本實施方式的微珠制作方法，根據(jù)構(gòu)形上的差異來辨別類型的微珠就能夠有效地以低成本進(jìn)行制作。另外，根據(jù)掩模的設(shè)計，就能夠制作多種類型的微珠的群體都清楚地設(shè)置的珠集。(2)官能團(tuán)改性步驟至拒水整理步驟在本實施方式的微珠制作方法中，在官能團(tuán)改性步驟S4中，官能團(tuán)改性在薄膜4 作為微珠11、12的部分的表面上完成。在拒水整理步驟S5中，基板2的已除去薄膜4的區(qū)域(即在作為微珠11、12的部分的薄膜4之間的基板)，進(jìn)行拒水整理。此后，核酸或肽等在固相化步驟S6中在各個薄膜表面上固相化。圖4是示意性示出拒水整理步驟S5中基板上的構(gòu)成的俯視圖。圖4的(A)示出了微珠11、12如圖3中所示形成于基板2上的情況。僅僅作為微珠11、12的部分的薄膜4根據(jù)成形步驟S3保留于基板上，而其它部分被除去(參見圖3的 (E))。在拒水整理步驟S5中，將拒水性賦予基板區(qū)域，該區(qū)域用陰影線表示并且薄膜4已從此處除去，(即，所述親水層3被曝光的區(qū)域)。例如，通過將由陰影線表示的基板區(qū)域進(jìn)行三乙氧基-1H，1H，2H，2H-十三氟-正辛基硅烷處理來進(jìn)行拒水整理。這使得能夠防止滴加在用作微珠11、12的部分的薄膜4表面的溶液發(fā)生相互混合。因此，在固相化步驟S6中，當(dāng)單體溶液或預(yù)先合成的核酸或肽溶液滴加在用作微珠的部分的薄膜表面上時，這種溶液可以很容易被點樣在目標(biāo)部位，由此，可以合成并固相化具有所需堿基序列或氨基酸序列的核酸鏈等。另外，當(dāng)固相化糖鏈和化合物時，它們沒有出現(xiàn)混合ο在圖4的(A)中，進(jìn)行拒水整理而包圍各個作為微珠的薄膜部分。在相同類型的多個微珠形成于基板上的情況下，可以進(jìn)行拒水整理以包圍其上形成相同類型的微珠的區(qū)域。例如，在兩種類型的微珠11、12分別以給定數(shù)目形成的情況下，在圖4的⑶中所示的陰影區(qū)域內(nèi)進(jìn)行拒水整理。這使得對于相同類型的微珠(微珠組)能夠集中滴下單體溶液等并且能夠防止與滴加在其它鄰近組微珠上的溶液的混合。
單體溶液等利用吸液管或微分散器點樣或者通過噴墨點樣滴加。當(dāng)使用這樣的點樣系統(tǒng)時，具有細(xì)微不同的液體物理性質(zhì)和相對高粘度的微液釋放到空氣中，并沉積于基板上。當(dāng)釋放時，產(chǎn)生噴霧樣液滴(所謂“衛(wèi)星狀”(satellite))，使得單體溶液等出現(xiàn)沉積在預(yù)定位點以外的位點。在本發(fā)明的微珠制作方法中，因為微珠最終從基板上剝離，如果這樣的單體溶液等以衛(wèi)星狀形式沉積于作為微珠的部分以外的基板區(qū)域上也不會產(chǎn)生問題。(3)固相化步驟 圖5是示意性示出固相化步驟S6中基板上的構(gòu)成的透視圖。這里說明一個實例， 其中如圖3和圖4的(A)所示，將微珠11、12形成于基板2上并進(jìn)行拒水處理，接著通過逐步合成將微珠11、12的表面上固相化核酸。在附圖中，在親水層3的上層上形成的微珠11、 12被放大顯示。首先，將含腺嘌呤“A”的單體溶液滴加于用作微珠11的部分的薄膜4表面上。在官能團(tuán)改性步驟S4中將連接基引入薄膜4的表面上。類似地，將含鳥嘌呤“G”的單體溶液滴加在作為微珠12的部分的薄膜4表面上。此后，在滴加的單體溶液中進(jìn)行與腺嘌呤或鳥嘌呤的結(jié)合反應(yīng)(參見圖5的(A))。其次，含胞嘧啶“C”的單體溶液滴加于作為微珠11的部分上，而含胸腺嘧啶“T” 的單體溶液滴加于作為微珠12的部分上，接著進(jìn)行第二階段結(jié)合反應(yīng)(參見圖5的(B))。 此后，重復(fù)合成步驟直至獲得所需的堿基序列。在拒水整理步驟&中，在圖中陰影部分所示的區(qū)域進(jìn)行拒水整理，由此，滴加于作為微珠11的部分上的單體溶液和滴加于作為微珠12的部分上的單體溶液不會發(fā)生相互混合。因此，能夠精確合成具有所需堿基序列的核酸鏈并被固相化在各個微珠11、12的表面上。利用基于諸如用于已知DNA芯片的光化學(xué)反應(yīng)的固相化，對于一個階段的反應(yīng)， 不得不進(jìn)行對各個堿基(A、G、T和C)采用四個光掩模的四個結(jié)合反應(yīng)。與之相反，根據(jù)本發(fā)明，含有各個堿基的單體溶液分別滴加于被拒水整理區(qū)域分隔的微珠上，由此同時進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)。因此，核酸鏈的合成和固相化能夠以低成本實現(xiàn)。(4)剝離步驟圖6是示意性示出(A)成膜步驟S1至固相化步驟S6完成之后獲得的基板和(B) 進(jìn)一步完成剝離步驟S7之后獲得的基板的截面視圖。該圖示出了基板2上已經(jīng)形成了微珠11的區(qū)域的截面。在成膜步驟S1至固相化步驟S6完成之后的基板2上，經(jīng)由親水層3，通過光刻膠法層積有用核酸等P11在其表面上固相化的薄膜4 (微珠11)。在所述剝離步驟S7中，起到所述犧牲層作用的親水層3部分溶解于溫度設(shè)定于可發(fā)生再溶解的溫度下的溶劑中，或?qū)⒒?進(jìn)行超聲處理，由此容許微珠11 (薄膜4)從基板2剝離(參見圖6的(B))。這樣，能夠獲得微珠11、12及由其構(gòu)成的珠集，如圖3的(F) 所示。由于上述制作方法，由此獲得的微珠11具有包含兩個基本平行的相對面的立體構(gòu)形。更具體而言，兩個基本平行的相對面由于薄膜4的成膜步驟S2而形成。兩個面之間的距離對應(yīng)于微珠的厚度(參見圖1中的符號
h)并能夠通過控制膜厚度而進(jìn)行任意控制。

核酸等P11固相化于微珠11的兩個基本平行的相對面之一上。另一個面(接觸親水層3的那一側(cè)的表面)由于剩下部分未溶解的親水層3而被賦予親水性。5.微珠制作方法II(提供獨立于親水層的犧牲層的情況)圖7是示出根據(jù)第二實施方式的微珠制作方法的步驟的流程圖。在有關(guān)第一實施方式的微珠制作方法中，步驟S1中形成的親水層具有作為所謂犧牲層的功能。在剝離步驟S7中通過侵蝕親水層的同時在薄膜表面上保留一部分，微珠被剝離，同時其表面被賦予親水性。在這種情況下，有必要在使薄膜表面上保留部分親水層而對微珠表面賦予令人滿意的親水性的條件下侵蝕親水層。根據(jù)此處說明的第二實施方式的微珠制作方法的特征在于，在形成親水層之前， 獨立地形成容許微珠從其剝離的“犧牲層”。因此，在此第二實施方式的微珠制作方法中，親水層的作用是僅僅在微珠的底面上賦予親水性。(1)犧牲層的形成步驟在圖7中用符號Stl表示的“犧牲層形成步驟”中，通過使用氟系有機材料或聚酰亞胺有機材料，或與親水層犧牲層相同或不同類型的親水性有機材料，而在基板上形成犧牲層。(1-1)利用氟系有機材料形成犧牲層的情況在犧牲層由氟系有機材料形成的情況下，作為低分子量材料，使用三嗪的氟衍生物、稠合芳族的氟衍生物或金剛烷的氟衍生物等。作為高分子材料的氟系有機材料，可以由如全氟樹脂、部分氟樹脂、含氟光固化樹脂等的氟樹脂制成。氟系有機材料溶解于溶劑中并通過旋涂形成膜，干燥或光固化而提供膜。因為氟系有機材料的氟化程度越高，越難溶于水或有機溶劑，其僅僅可溶于氟系溶劑。因此，如果犧牲層由氟系有機材料構(gòu)成，則這種犧牲層在剝離步驟和固相化核酸等的步驟之前不會被微珠制作步驟中采用的化學(xué)品侵蝕或損壞。另外，氟系溶劑不太可能與帶電荷的高分子混合并具有難以溶解除氟系高分子之外的高分子的性能。在這個意義上，當(dāng)氟系有機材料的層作為犧牲層提供而在剝離步驟S7 中用氟系溶劑進(jìn)行侵蝕時，固相化于微珠上的核酸等并不會發(fā)生變性、損毀、釋放等。而且， 當(dāng)?shù)头肿恿课镔|(zhì)特別是如三嗪的氟衍生物用作氟系有機材料，微珠能夠在剝離步驟S7中通過犧牲層發(fā)生升華而剝離，確保更可靠地保持核酸等與靶核酸或靶蛋白的相互活性。氟系有機材料的優(yōu)選氟化度至少不低于約30原子％。設(shè)置在該數(shù)值范圍的氟化度使得犧牲層能夠?qū)υ诶绯赡げ襟ES2中所用的溶劑如環(huán)戊酮、1-甲氧基-2-丙基乙酸酯等具有耐溶性。(1-2)使用聚酰亞胺有機材料形成犧牲層的情況犧牲層由聚酰亞胺有機材料形成的情況下，使用了通用的聚酰亞胺樹脂。如果犧牲層由聚酰亞胺有機材料形成，則犧牲層在剝離步驟之前以及在核酸等的固相化步驟中不會受到微珠制作步驟中采用的化學(xué)品的侵蝕和損壞。此外，如果用非質(zhì)子溶劑、如N-甲基-2-吡咯烷酮等在所述剝離步驟S7中侵蝕該層，則固相化于微珠上的核酸等并不會發(fā)生變性、損壞、釋放等。應(yīng)該注意到，犧牲層可以用酚醛清漆樹脂代替聚酰亞胺樹脂形成。
(1-3)用親水性有機材料形成犧牲層的情況在犧牲層用親水性有機材料形成的情況下，使用了與此后描述的親水層所用的相同或不同類型的親水性有機材料。在根據(jù)此第二實施方式的微珠制作方法中，親水層所用的材料是一種或多種選自光敏性親水樹脂、聚乙烯醇、淀粉、糊精、直鏈淀粉、明膠、瓊脂、卡拉膠、果膠和刺槐豆膠的親水性有機材料。盡管犧牲層可以通過使用與那些親水層材料相同的親水性有機材料形成，但是優(yōu)選使用與親水層的親水性有機材料類型不同且可再溶解性高的材料。其理由如下。即，由親水性有機材料形成的犧牲層通過使用溫度設(shè)定于在剝離步驟S7中犧牲層的親水性有機材料能夠再溶解的溫度(例如約45°C或更高)下的溶劑而被溶解。此時，為了在成膜步驟S1中形成的親水層并不發(fā)生溶解，犧牲層優(yōu)選由比親水層更易于再溶解的材料形成。更具體而言，優(yōu)選光敏性親水樹脂或聚乙烯醇用作親水層的材料，而犧牲層的材料利用第一次提及的材料以外的親水性有機材料。光敏性親水樹脂在光敏化時發(fā)生凝膠而變得不溶于冷水。當(dāng)聚乙烯醇溶解于加熱溶劑中，涂覆于基板上并干燥后，除非再次加熱， 否則不會發(fā)生再溶解。因此，如果親水層由光敏性親水樹脂或聚乙烯醇形成且犧牲層由其它類型的親水性有機材料形成時，在親水層保留的情況下僅僅侵蝕犧牲層。應(yīng)該注意到，在親水層通過超聲處理被物理侵蝕來剝離薄膜的情況下，因為相同的理由，優(yōu)選犧牲層由不同于親水層的類型的親水性有機材料形成而更易于由于超聲處理而被侵蝕。(2)親水層的成膜步驟至固相化步驟圖7中符號S1表示的“親水層形成步驟”是在形成在基板上的犧牲層上層積親水層的步驟。除了親水層層積于犧牲層上之外，該步驟S1可以按照根據(jù)第一實施方式的微珠制作方法的相同方式進(jìn)行。然而，關(guān)于這一點，應(yīng)該注意以下事實第二實施方式的步驟S1中形成的親水層并沒有用作犧牲層，而僅僅賦予微珠表面親水性。親水層的材料包括一種或多種選自光敏性親水樹脂、聚乙烯醇、淀粉、糊精、直鏈淀粉、明膠、瓊脂、卡拉膠、果膠和刺槐豆膠的親水性有機材料。其中，優(yōu)選親水層由光敏性親水樹脂或聚乙烯醇形成，對于在剝離步驟S7中僅僅侵蝕犧牲層而同時保留親水層的目的而言，它們的可再溶解性較低。對于光敏性親水樹脂，例如，可以使用疊氮基光敏基團(tuán)側(cè)鏈接于(pendant)聚乙烯醇的水溶性光敏樹脂。通過將溶解于溶劑中的樹脂利用旋涂等涂覆于基板上后進(jìn)行光敏化作用來實現(xiàn)光敏性親水樹脂的膜形成。光敏性親水樹脂的光敏化作用按照，與用于隨后的微珠薄膜的成膜步驟S2中進(jìn)行膜形成的薄膜材料相同的光敏波長區(qū)域和曝光能量進(jìn)行，由此可以使用其正負(fù)屬性都相同的光敏性親水樹脂。在這種情況下，當(dāng)形成的薄膜通過光刻膠法在成形步驟S3中按照所需的構(gòu)形形成時，親水層能夠通過使用相同的掩模而被光敏化。因此，通過將由光敏性親水樹脂制成的親水層和微珠薄膜通過使用相同掩模同時曝光而能夠提高工作效率。僅僅與作為微珠的薄膜接觸的親水層部分能夠進(jìn)行交聯(lián)，使得親水層對用作微珠的薄膜的附著力提高。應(yīng)該注意到，當(dāng)然，也可以使用獨立的掩模進(jìn)行親水層和微珠薄膜的曝光。光敏化的光敏性親水樹脂由于凝膠作用而在冷水中變得不溶。未固化的光敏樹脂能夠通過在設(shè)定于35°C或更高的熱水中溶解而被除去。除了這里說明的步驟之外的步驟，包括微珠薄膜形成步驟&、成形步驟&、官能團(tuán)改性步驟、、拒水整理步驟&和固相化步驟&，可以按照根據(jù)第一實施方式的微珠制作方法中相同的方式進(jìn)行。因此，這些步驟的說明在這里被省略。(3)剝離步驟(3-1)犧牲層的侵蝕圖7中符號S7表示的“剝離步驟”是將用核酸或肽固相化的成形后的薄膜從基板上剝離的步驟。圖8是示意性示出(A)在成膜步驟&至固相化步驟&實施之后獲得的基板和(B) 在進(jìn)一步進(jìn)行剝離步驟S7之后獲得的基板。這些圖分別示出了基板2上形成微珠11的區(qū)域的截面。如圖8的(A)所示，在本實施方式的微珠制作方法中，犧牲層5作為犧牲層形成 (步驟Stl)，其上層積親水層(步驟S1)和微珠薄膜(步驟S2)。在此剝離步驟S7中，犧牲層 5被物理或化學(xué)侵蝕而連同親水層3 —起剝離所述薄膜4而獲得微珠11。更具體而言，在犧牲層5由氟系有機材料形成的情況下，氟系溶劑用作液體去除劑而侵蝕犧牲層5，或氟系有機材料發(fā)生升華而侵蝕掉犧牲層5。氟系溶劑不太可能與帶電荷的高分子混合，并且具有難溶解高分子的性質(zhì)。因此，如果氟系溶劑用于侵蝕犧牲層5 時，僅僅犧牲層5能夠被侵蝕掉而不會再溶解親水層3。在將低分子量物質(zhì)、特別是三嗪的氟衍生物用作氟系有機材料層時，在100°C或更低的低溫下就能夠完成升華和去除，而不會損壞親水層。在犧牲層5由聚酰亞胺有機材料形成的情況下，非質(zhì)子溶劑用作液體去除劑以侵蝕犧牲層5。一旦侵蝕掉由氟系有機材料或聚酰亞胺有機材料形成的犧牲層5，該層就通過完全溶解或升華被除去，而不會容許其保留于被剝離的微珠11的表面上。如果犧牲層5保留于微珠表面上，則存在所得微珠由于氟系有機材料或聚酰亞胺有機材料的疏水性而相互凝聚的可能性。在犧牲層5由親水性有機材料形成的情況下，犧牲層5用溫度設(shè)定于親水性有機材料能夠再溶解的溫度下的溶劑或通過超聲處理而被侵蝕掉。在這種情況下，犧牲層5應(yīng)該優(yōu)選由不同于親水層3的親水性有機材料的類型的并且更易于被侵蝕的親水性有機材料形成。這使得能夠通過超聲處理或熱水處理而單獨侵蝕掉犧牲層并同時原樣保留親水層。在犧牲層5由親水性有機材料形成的情況下，即使被侵蝕的犧牲層5未被完全溶解而殘留于微珠11的表面上，在基于親水層3的微珠表面上的親水性也不會降低。(3-2)親水層的蝕刻在犧牲層5的侵蝕之前，優(yōu)選蝕刻親水層3。在成膜步驟&中于基板上形成的薄膜4，在成形步驟&中按照僅僅將作為微珠11的部分保留下來而除去其余部分的方式進(jìn)行加工。在薄膜4已經(jīng)從其移除的基板區(qū)域(在成形后的薄膜之間的基板區(qū)域)暴露的親水層3通過蝕刻而被移除。這有利于位于親水層3之下的犧牲層5的溶解或升華。蝕刻通過使用溫度設(shè)定于親水性有機材料能夠再溶解的溫度下的作為液體去除劑的溶劑進(jìn)行，并且在這種條件下進(jìn)行，使得成形后的薄膜4(微珠11)之間暴露的親水層3 能夠被溶解和去除。蝕刻條件應(yīng)該是這樣的條件，在該條件下過度溶解親水層3也不會使微珠11剝離。
關(guān)于這一點，在親水層3由光敏性親水樹脂形成的情況下，僅僅在成形后的薄膜 4(微珠11)之間暴露的未固化光敏親水性樹脂能夠被選擇性除去，使得能夠有效地防止微珠的剝離。在第二實施方式的微珠制作方法中，犧牲層5在剝離步驟S7中被侵蝕掉，其結(jié)果是大部分親水層3被保留于薄膜4的接觸親水層3的那一側(cè)的表面上，而同時能夠剝離成形后的薄膜4 (微珠11)。特別地，如上文所述，在親水層3由其正負(fù)屬性在相同光敏波長區(qū)域和曝光能量下都與薄膜4相同的光敏性親水樹脂形成，并且使用相同的掩模曝光薄膜4和親水層的情況下，成形后的薄膜4(微珠11)和與之接觸的親水層之間的附著力增強。因此，微珠能夠以使所有親水層3原樣保留的狀態(tài)被剝離。按照這種方式，與前面說明的第二實施方式的方法相比，本實施方式的微珠制作方法能夠賦予微珠表面更好的親水性。實施例11.在親水層(PVA)用作犧牲層時的微珠的制作在本實施例中，在基板上形成為膜的SU-8通過光刻膠法成形并進(jìn)行核酸鏈的固相化，接著進(jìn)行剝離而獲得微珠。這里通過使用聚乙烯醇(PVA)形成親水層，其起到所謂的犧牲層的作用，由此容許SU-8薄膜被剝離。(1)親水層形成步驟將PVA(全皂化型，具有的聚合度為 500，由 Wako Pure Chemicallndustries, Ltd. 生產(chǎn)，而在熱溶解調(diào)節(jié)至IOwt %之后使用)旋涂(首先在500r.p.m.保持5s，然后在2500r. P. m下保持30s)于硅基板上，進(jìn)行O2等離子體處理(直接等離子體，氣體類型02，功率 100W，流速30sCCm，時間10s)，接著在85°C下干燥120min。采用接觸膜厚度儀的PVA膜厚度測定表明厚度約600nm。(2)微珠薄膜形成步驟為了確保PVA和SU-8之間的附著力，涂布PVA的基板進(jìn)行O2等離子體處理(直接等離子體，氣體類型02，功率100W，流速30SCCm，時間10s)而活化，接著將用甲苯稀釋至2-(3，4_環(huán)氧環(huán)己基)乙基三甲氧基硅烷(Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.生產(chǎn))旋涂(首先在500r. p. m保持5s.，隨后在5000r. p. m下保持30s)，并在100°C 下干燥90s。SU-8 (SU-8-3035-N-02，由 Kayaku Microchem Corporation 生產(chǎn)，并在用環(huán)戊酮兩倍稀釋之后使用)進(jìn)行旋涂(首先在500r. p. m保持15s，然后在1500r. p. m下保持30s)， 并在100°C下干燥2min。(3)成形步驟采用在其中繪制有微珠圖案的鉻掩模，用接觸光刻機(contact aligner)進(jìn)行i-射線曝光(170mJ/cm2)，接著在100°C下干燥3min。采用SU-8顯影劑(Kayaku Microchem Corporation生產(chǎn))進(jìn)行顯影，并在用IPA沖洗之后，在150°C下硬烘焙(hardbaking) lOmin，從而在基板上獲得成列的珠圖案。采用接觸膜厚度儀的SU-8膜厚度測定表明厚度約3 μ m。(4)官能團(tuán)改性步驟將含SU-8珠圖案的基板進(jìn)行O2等離子體處理(直接等離子體，氣體類型02，功率100W，流速30SCCm，時間10s)而被活化，接著用2-(3，4-環(huán)氧環(huán)己基)乙基三甲氧基硅烷進(jìn)行處理(1201，1011，氣相反應(yīng))。(5)固相化步驟圖9的㈧中所示的寡DNA-I (參見表1中的序列No. 1)溶解于2 X SSC緩沖液中而制成其 ο μ M溶液并在攪拌下浸潤載有硅烷偶聯(lián)珠的基板12h。取出基板，并在攪拌下于含0. 2M的SDS的2 X SSC緩沖液中沖洗15min。接著，在攪拌下于新的含0. 2M的SDS的 2 X SSC緩沖液中沖洗5min，同時加熱至90°C。將基板用流水沖洗!Min并干燥。[表 1]
權(quán)利要求
1.一種制作微珠的方法，包括在基板上形成用親水性有機材料制成的親水層的步驟，在所述親水層上層積能夠作為微珠剝離的薄膜的步驟，將由此形成的薄膜通過光刻膠法成形為給定構(gòu)形的成形步驟，在成形后的薄膜上固相化給定物質(zhì)的固相化步驟，以及將固相化有所述物質(zhì)的成形后的薄膜從所述基板連同至少一部分所述親水層一起剝離而獲得微珠的剝離步驟。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制作微珠的方法，其中，將溶解于溶劑中的親水性有機材料涂覆到所述基板上并干燥以形成所述親水層，此后在所述剝離步驟中，使用溫度被設(shè)置在所述親水性有機材料能夠再溶解于其中的溫度下的溶劑來溶解部分所述親水層，或者實施超聲處理，從而容許所述成形后的薄膜連同至少一部分的所述親水層一起被剝離而獲得微珠。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制作微珠的方法，其中，所述親水層通過使用一種或多種選自聚乙烯醇、淀粉、糊精、直鏈淀粉、明膠、瓊脂、卡拉膠、果膠、刺槐豆膠和光敏性親水樹脂的親水性有機材料而形成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制作微珠的方法，還包括在所述基板上形成犧牲層的步驟， 所述親水層層積于所述犧牲層上，此后所述犧牲層在所述剝離步驟中被物理或化學(xué)侵蝕以<容許所述成形后的薄膜連同所述親水層一起被剝離而獲得微珠。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制作微珠的方法，其中，所述親水層通過使用一種或多種選自光敏性親水樹脂、聚乙烯醇、淀粉、糊精、直鏈淀粉、明膠、瓊脂、卡拉膠、果膠和刺槐豆膠的親水性有機材料而形成。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制作微珠的方法，其中，所述犧牲層通過使用氟系有機材料形成，并且用所述氟系有機材料形成的所述犧牲層在所述剝離步驟中發(fā)生升華或者通過使用氟系溶劑而被溶解，由此容許所述成形后的薄膜從所述基板連同所述親水層一起剝離而獲得微珠。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制作微珠的方法，其中，所述犧牲層通過使用聚酰亞胺有機材料而形成，并且在所述剝離步驟中，用所述聚酰亞胺有機材料形成的所述犧牲層通過使用非質(zhì)子溶劑溶解，從而容許所述成形后的薄膜從所述基板連同所述親水層一起剝離而獲得微珠。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制作微珠的方法，其中，所述犧牲層通過使用與所述親水層類型相同或不同的親水性有機材料形成，并且用所述親水性有機材料形成的所述犧牲層在所述剝離步驟中通過使用溫度被設(shè)定在所述親水性有機材料能夠再溶解于其中的溫度下的溶劑溶解或者進(jìn)行超聲處理，從而容許所述成形后的薄膜從所述基板連同所述親水層一起剝離而獲得微珠。
9.根據(jù)權(quán)利要求3以及6至8中任一項所述的制作微珠的方法，其中，所述固相化步驟通過在所述薄膜上化學(xué)合成所述物質(zhì)來實現(xiàn)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的制作微珠的方法，其中，一種或多種選自具有給定序列的核酸或肽、以及糖鏈的生物高分子作為所述物質(zhì)進(jìn)行固相化。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的制作微珠的方法，其中，所述成形后的薄膜之間的區(qū)域在所述成形步驟之后所述固相化步驟之前進(jìn)行拒水整理。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的制作微珠的方法，其中，所述薄膜用光刻膠或二氧化硅形成。
13.根據(jù)權(quán)利要求3以及6至8中任一項所述的制作微珠的方法獲得的微珠。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的微珠，其中所述微珠每一個都具有提供了兩個基本平行的相對面的立體構(gòu)形，并且僅僅在其一個面上固相化給定物質(zhì)，而另一個面在其至少一部分上被賦予親水性。
全文摘要
本發(fā)明提供一種制作微珠的方法，這種方法能夠提供包含各種類型的微珠并具有各類型的微珠的明確的群體的珠集。本發(fā)明也提供一種制作微珠的方法，這種方法包括在基板上形成親水性有機材料制成的親水層的步驟S1，在所述親水層上層積能夠以微珠形式剝離的薄膜的步驟S2，通過光刻膠法使所述薄膜成形為給定形狀的成形步驟S3，在成形后的薄膜上固相化給定物質(zhì)的固相化步驟S6，以及將所述用所述物質(zhì)固相化的成形后的薄膜從所述基板連同至少一部分所述親水層剝離而獲得微珠的剝離步驟S7。
文檔編號C12N15/09GK102165317SQ20098013731
公開日2011年8月24日 申請日期2009年9月4日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月30日
發(fā)明者岸井典之, 市村真理, 田中正信, 町田賢三 申請人:索尼公司