專利名稱：木質(zhì)素所致失活降低的第6家族纖維素酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及經(jīng)修飾的第6家族纖維素酶(Family 6 cellulase) 0更具體地說， 本發(fā)明涉及木質(zhì)素所致失活降低的經(jīng)修飾的里氏木霉(Trichoderma reesei)第6家族 (TrCelBA)纖維素酶。本發(fā)明還涉及基因構(gòu)建物，其包含編碼經(jīng)修飾TrCel6A纖維素酶的核苷酸序列，還涉及從宿主菌株中生產(chǎn)經(jīng)修飾纖維素酶的方法和經(jīng)修飾TrCel6A纖維素酶在木質(zhì)纖維素底物水解中的用途。
背景技術(shù)：
地球上超過一半的有機碳被發(fā)現(xiàn)存在于植物的細胞壁中。植物細胞壁包括三種主要的化合物纖維素、半纖維素和木質(zhì)素。這些化合物被統(tǒng)稱為“木質(zhì)纖維素”，它們代表了用于發(fā)酵制備乙醇或其它高值產(chǎn)品的糖和其它有機分子的潛在來源。由于纖維素乙醇的環(huán)境友好性和可持續(xù)性，木質(zhì)纖維素生物質(zhì)向乙醇的轉(zhuǎn)化已成為新能源政策的關(guān)鍵特征。目前正在開發(fā)若干技術(shù)用于纖維素的轉(zhuǎn)化。值得關(guān)注的有以下方法，通過將木質(zhì)纖維素生物質(zhì)預(yù)處理，而提高其對水解酶的敏感性，而后酶促水解成糖， 這些糖再被發(fā)酵成乙醇或其它高值有機分子(例如丁醇)。常見的預(yù)處理方法包括稀酸蒸汽爆破(Dilute acid steam explosion，美國專利編號 4，461，648)、氨冷凍爆破(Ammonia freeze explosion, AFEX ；Holtzapple et al.，1991)禾口有機溶齊[J 萃取(Organosolv extraction，美國專利編號4，409，032)。水解和發(fā)酵系統(tǒng)可以是獨立的(依次水解和發(fā)酵 (Sequential hydrolysis and fermentation，SHF))，也可以是同時發(fā)生的(同時糖化和發(fā)酵(Simultaneous saccharification and fermentation, SSF))。在所有情況下，半纖維素和纖維素被分解成可發(fā)酵糖，同時木質(zhì)素被分離出來并且可以用作固體燃料或作為其它有機分子的來源。對于將經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)轉(zhuǎn)化成糖的酶的選擇在很大程度上取決于預(yù)處理的方法。稀酸蒸汽爆破引起了半纖維素的顯著化學水解，因此使得用于將半纖維素轉(zhuǎn)化為糖類的酶與此過程關(guān)系不大。相比之下，AFEX和有機溶劑萃取都保留了半纖維素和纖維素的大致完整性。與稀酸蒸汽爆破或AFEX不同，有機溶劑萃取從底物中去除了相當一部分的木質(zhì)素。在所有情況下，酶促水解的主要目標是纖維素，使用纖維素酶的組合將其轉(zhuǎn)化為糖類。纖維素酶有兩種基本類型內(nèi)切葡聚糖酶，其切割纖維素鏈中間的糖苷鍵，并且這樣做時，產(chǎn)生了新的鏈末端；纖維二糖水解酶，其從纖維素鏈的末端切下短的寡糖。葡萄糖苷酶將短的寡糖消化成單糖。因此，這三種酶組分協(xié)同作用產(chǎn)生高效的纖維素水解酶系統(tǒng)。大多數(shù)纖維素酶具有相似的模塊結(jié)構(gòu)，其由催化結(jié)構(gòu)域、連接肽和糖結(jié)合模塊 (Carbohydrate-binding module，CBM)組成。經(jīng)修飾的纖維素酶和修飾的方法已有廣泛描述。例如，已有報道改善熱穩(wěn)定性的里氏木霉Cel7A和Cel6A的變體(美國專利編號7，375，197 ;W0 2005/028636，美國專利公開編號2007/0173431 ；美國專利公開編號2008/167214，WO 2006/074005 ；美國專利公開編號2006/0205042 ；美國專利編號7，348，168 ；WO 2008/025164)。特別是，在里氏木霉 Cel6A的第413位使用脯氨酸替代絲氨酸，或在其它的第6家族纖維素酶中使用脯氨酸替代等同于第413位上的氨基酸以賦予增強的熱穩(wěn)定性(W02008/025164)。已有顯示，在里氏木霉Cel6A和其它第6家族纖維素酶的催化結(jié)構(gòu)域中在等同于103、136、186、365和410 位的位置上的突變引起葡萄糖所致抑制作用的降低(美國專利公開編號2009/0186381)。 已創(chuàng)造出對用于去污劑制劑的蛋白酶和表面活性劑具有抗性的變體，以用于紡織應(yīng)用 (W099/01544, WO 94/07998 和美國專利號碼 6，114，296)。木質(zhì)素 對纖維素酶系統(tǒng)的負面影響是證據(jù)充分的。從硬木中(白楊)去除木質(zhì)素顯示出增加酶促水解的糖產(chǎn)量(Kong et al.，1992)。同樣，從軟木中(花旗松(Douglas fir))去除木質(zhì)素顯示出提高纖維素的酶促水解，此作用歸因于酶對纖維素的可接近性的提高(Mooney et al.，1998)。其它研究小組已證實，從里氏木霉中純化的纖維素酶與分離的木質(zhì)素結(jié)合(Chernoglazov et al.，1988)，并已推測了不同結(jié)合結(jié)構(gòu)域在酶-木質(zhì)素相互作用中的功能(Palonen et al.，2004)。當木質(zhì)素被加回到純化的纖維素系統(tǒng)中時， 已觀察到里氏木霉(Trichoderma reesei)纖維素酶與木質(zhì)素的結(jié)合以及失活(Escoffier et al.，1991)。僅有一例報導(dǎo)稱，木質(zhì)素對纖維素酶沒有顯著影響(Meunier-Goddik and Penner, 1999)。其它研究報告表明，一些半纖維素酶可以對木質(zhì)素和木質(zhì)素分解產(chǎn)物具有抗性，甚至可被它們激活(Kaya et al.，2000)。因此，一般認為，木質(zhì)素是纖維素的酶促水解的嚴重限制因素。據(jù)報道，CBM參與木質(zhì)素的結(jié)合。例如，從木霉屬(Trichoderma) Cel7A中去除CBM 基本上消除了其與堿提取的木質(zhì)素的結(jié)合，以及其與通過酶促水解制備的殘余木質(zhì)素的結(jié)合(Palonen et al. ，2004)。另據(jù)報道，催化結(jié)構(gòu)域也參與木質(zhì)素的結(jié)合。不具有CBM的來自腐質(zhì)霉屬 (Humicola sp.)的Cel7B與木質(zhì)素廣泛結(jié)合(Berlin et al. ,2005b) 同樣，缺乏CBM的木霉屬Cel5A核心不結(jié)合酶促木質(zhì)素(enzymic lignin)，相比于全長蛋白質(zhì)，只能較小程度地與堿提取的木質(zhì)素結(jié)合(Palonen et al.，2004)。在將纖維素轉(zhuǎn)化為包括葡萄糖在內(nèi)的可溶性糖類以用于生產(chǎn)乙醇和其它產(chǎn)品的商業(yè)化中，開發(fā)保留纖維素結(jié)合親和力和天然纖維素水解活性的抗木質(zhì)素的纖維素酶是一個重大障礙。已提出了多種方法來減少木質(zhì)素對纖維素酶系統(tǒng)的負面影響。非特異性結(jié)合蛋白(如牛血清白蛋白，BSA)已顯示出阻斷纖維素酶和木質(zhì)素表面之間的相互作用(Yang and ffyman,2006 ；US 24185542 Al ；US 26088922 Al ；WO 05024037 A2, A3 ；WO 09429474 Al)。其它化學阻斷劑和表面活性劑已顯示出具有類似的效果(Tu et al. ,2007 ； US 7，354，743)。雖然已提出要尋找和鑒定纖維素酶的木質(zhì)素抗性變體(Berlin et al., 2005a)，但在這方面之前尚未有成功工作的記錄。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及經(jīng)修飾的纖維素酶。更具體地說，本發(fā)明涉及木質(zhì)素所致失活降低的經(jīng)修飾里氏木霉第6家族(TrCeieA)纖維素酶。本發(fā)明還涉及基因構(gòu)建物，其包含編碼經(jīng)修飾TrCel6A纖維素酶的核苷酸序列，還涉及從宿主菌株中生產(chǎn)經(jīng)修飾纖維素酶的方法和經(jīng)修飾TrCel6A纖維素酶在木質(zhì)纖維素底物的水解中的用途。
本發(fā)明的一個目的是提供經(jīng)修飾TrCel6A纖維素酶，其具有降低的木質(zhì)素所致失
活。 本發(fā)明涉及包含一個或多個氨基酸替換的經(jīng)修飾TrCel6A纖維素酶，其中氨基酸替換選自用中性或酸性氨基酸替換129和410位中一個或多個位置處的堿性氨基酸；用酸性氨基酸替換322和363位中一個或多個位置處的中性氨基酸；以及用蘇氨酸替換186位的氨基酸；所述經(jīng)修飾TrCel6A纖維素酶具有顯示與SEQ ID NO 1的83_447位氨基酸具有約 47%至約99. 9%的序列同一性的氨基酸序列。此外，經(jīng)修飾TrCel6A纖維素酶可包含一個或多個氨基酸替換，其選自K129E、S186T、A322D、Q363E、R410G和R410Q。經(jīng)修飾TrCel6A 纖維素酶能夠使用轉(zhuǎn)化機制水解多糖。上文定義的一個或多個氨基酸替換的位置可以根據(jù)親本TrCel6A纖維素酶的SEQ ID NO 1中83-447位氨基酸所對應(yīng)氨基酸與包含如SEQ ID NO 1中所定義的里氏木霉 Cel6A催化結(jié)構(gòu)域的的83-447位氨基酸的序列比對來確定。經(jīng)修飾TrCel6A纖維素酶可以來自親本TrCel6A纖維素酶，除了 129、186、322、363 或410位中的一個或多個位置上天然氨基酸的替換之外，其與經(jīng)修飾的TrCel6A纖維素酶相同。例如，本發(fā)明包括如上所述的經(jīng)修飾TrCel6A纖維素酶，其進一步包含一個或多個氨基酸替換，其中氨基酸替換選自Y103H、Y103K、Y103R、Y103A、Y103V、Y103L、Y103P、L136V、 L136I和S413P或除129、186、322、363或410位之外的位置上的任何額外突變，只要該酶顯示Cel6A纖維素酶活性。本發(fā)明還涉及經(jīng)修飾TrCe 16A纖維素酶，如上所定義，相對于衍生出經(jīng)修飾 TrCelBA纖維素酶的親本TrCel6A纖維素酶，其顯示木質(zhì)素所致失活程度降低至少15%。本發(fā)明還涉及經(jīng)修飾的第6家族纖維素酶，其選自TrCel6A-K129E-S413P(SEQ ID NO 37)；TrCel6A-S186T-S413P(SEQ ID NO 38)；TrCel6A-A322D-S413P(SEQ ID NO 39)；TrCel6A-Q363E-S413P(SEQ ID NO 40)；TrCel6A-R410G-S413P(SEQ ID NO 41)；TrCel6A-R410Q-S413P(SEQ ID NO 42)；TrCel6A-K129E-S186T-A322D-Q363E-S413P(SEQ ID NO 43)；禾口TrCel6A-K129E-S186T-A322D-Q363E-R410Q-S413P(SEQ ID NO :44)。本發(fā)明涉及基因構(gòu)建物，其包含編碼經(jīng)修飾TrCel6A纖維素酶的核酸序列，其中經(jīng)修飾TrCel6A纖維素酶包含一個或多個氨基酸替換，其選自用中性或酸性氨基酸替換129和410位中一個或多個位置處的堿性氨基酸；用酸性氨基酸替換322和363位中一個或多個位置處的中性氨基酸；以及用蘇氨酸替換186位的氨基酸；所述經(jīng)修飾TrCel6A纖維素酶具有顯示與SEQ ID NO 1的83_447位氨基酸的 47 %至99. 9 %同一性的氨基酸序列。該核酸序列可有效連接至調(diào)控其表達以及從宿主微生物中分泌的其它核酸序列。調(diào)控經(jīng)修飾TrCel6A纖維素酶表達和分泌的其它核酸序列可以來自于用于表達經(jīng)修飾TrCel6A纖維素酶的宿主微生物。該宿主微生物可以是酵母，例如酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，或絲狀真菌，如里氏木霉(Trichoderma reesei)。本發(fā)明還涉及如上所定義的基因構(gòu)建物，其中，由該基因構(gòu)建物編碼的經(jīng)修飾 TrCe 16A纖維素酶還包含一個或多個氨基酸替換，其選自Y103H、Y103K、Y103R、Y103A、 Y103V、Y103L、Y103P、L136V、L136I 和 S413P，或在除了第 129,186,322,363 或 410 位之外的位置上的任何額外突變，只要該酶具有Cel6A纖維素酶活性。本發(fā)明還涉及遺傳修飾微生物，其包含編碼經(jīng)修飾TrCel6A纖維素酶基因構(gòu)建物，并能表達和分泌包含一個或多個氨基酸替換的經(jīng)修飾TrCel6A纖維素酶，所述氨基酸替換選自用中性或酸性氨基酸替換129和410位中一個或多個位置處的堿性氨基酸；用酸性氨基酸替換322和363位中一個或多個位置處的中性氨基酸；和用蘇氨酸替換186位的氨基酸； 所述經(jīng)修飾TrCel6A纖維素酶具有顯示與SEQ ID NO 1的83_447位氨基酸的 47%至99. 9%同一性的氨基酸序列。在一個實施方案中，該遺傳修飾微生物能夠表達和分泌另外包含一個或多個氨基酸替換的經(jīng)修飾TrCel6A纖維素酶，所述氨基酸替換選自 Y103H、Y103K、Y103R、Y103A、Y103V、Y103L、Y103P、L136V、L136I 和 S413P，或除了 129、186、 322,363或410位之外的位置上的任何額外突變。該遺傳修飾微生物可以是酵母或絲狀真菌。例如，遺傳修飾微生物可以是酵母屬(Saccharomyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、漢遜酵母屬(Hansenula)、木霉屬(Trichoderma)、肉座菌屬(Hypocrea)、曲霉屬(Aspergillus)、 鐮刀菌屬(Fusarium)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)或脈孢菌屬(Neurospora)的物種。本發(fā)明還涉及在木質(zhì)素存在的條件下用經(jīng)修飾TrCel6A纖維素酶水解纖維素的方法。本發(fā)明還涉及生產(chǎn)如上所定義的經(jīng)修飾TrCel6A纖維素酶的方法，其包括使用包含編碼經(jīng)修飾TrCel6A纖維素酶之DNA序列的基因構(gòu)建物轉(zhuǎn)化酵母或真菌宿主，選擇表達經(jīng)修飾TrCel6A纖維素酶的重組酵母或真菌菌株，在誘導(dǎo)經(jīng)修飾TrCel6A纖維素酶表達的條件下在深層液體發(fā)酵中培養(yǎng)所選重組菌株，以及通過將培養(yǎng)物濾液與宿主微生物分離來回收所生產(chǎn)的經(jīng)修飾TrCel6A纖維素酶。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在129、322、363或410位的堿性或中性氨基酸的替換或由蘇氨酸替換186位的氨基酸，使得相對于衍生出經(jīng)修飾TrCel6A纖維素酶的親本TrCel6A纖維素酶，經(jīng)修飾TrCel6A纖維素酶的木質(zhì)素所致失活程度降低。如圖8所示，所有這些氨基酸都位于TrCel6A纖維素酶的表面。相對于衍生出經(jīng)修飾TrCel6A纖維素酶的親本TrCel6A纖維素酶，本發(fā)明的經(jīng)修飾TrCel6A纖維素酶可顯示出木質(zhì)素所致失活程度降低至少15%。相對于衍生出經(jīng)修飾TrCel6A纖維素酶的親本TrCel6A纖維素酶，該降低的木質(zhì)素失活有助于在含有經(jīng)修飾 TrCel6A纖維素酶、纖維素和木質(zhì)素的水解反應(yīng)中增加纖維素底物水解的活性。此類TrCel6A纖維素酶在多種下述工業(yè)應(yīng)用中具有用途，即要求在木質(zhì)素存在時的高纖維素水解活性。例如，如本文所述，經(jīng)修飾TrCel6A纖維素酶可以用于工業(yè)過程，其中木質(zhì)纖維素底物轉(zhuǎn)化為用于燃料酒精、糖醇類或其它產(chǎn)品生產(chǎn)的可發(fā)酵糖。


通過參考附圖的下述說明，本發(fā)明的這些和其它特征將更加明顯，所述附圖中圖1顯示了來自糖基水解酶第6家族的所選真菌纖維素酶的氨基酸序列與共有的第6家族纖維素酶序列的比對。在比對的序列下顯示了在36種真菌第6家族纖維素酶中， 氨基酸在共有第6家族纖維素酶的各個位置上出現(xiàn)頻率的圖示。用箭頭表示了 TrCel6A中等同175和221位上的催化性天冬氨酸殘基。用星號表示了 TrCel6A中等同129、186、363、 322和410位上的高度保守氨基 酸。對于具有纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的纖維素酶，僅給出了催化核心序列。圖 2 描述了質(zhì)粒 YEp352/PGK91_l Δ NheI- α ss-TrCel6A_S413P，其指導(dǎo)重組釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中天然和經(jīng)修飾TrCel6A的表達和分泌。圖3含有兩個散點圖。A圖是高通量檢測1(實施例6)中經(jīng)BSA處理的木質(zhì)素(+BSA)存在時的酶活性與未經(jīng)處理木質(zhì)素(-BSA)存在時的酶活性的散點圖。該數(shù)據(jù)涉及一個96孔培養(yǎng)板的篩選，其中96孔培養(yǎng)板中含有親本(TrCel6A-S413P)和經(jīng)修飾 TrCel6A纖維素酶或來自空載體轉(zhuǎn)化體的過濾物(陰性對照)。B圖是高通量檢測2(實施例7)中在經(jīng)BSA處理的木質(zhì)素(+BSA)存在時的酶活性與未經(jīng)處理木質(zhì)素(-BSA)存在時的酶活性的散點圖。該數(shù)據(jù)涉及一個96孔培養(yǎng)板的篩選，其中96孔培養(yǎng)板中含有親本 (TrCel6A-S413P)和經(jīng)修飾TrCel6A纖維素酶或來自空載體轉(zhuǎn)化體的過濾物(陰性對照)。圖4是柱狀圖，其顯示了由高通量檢測1(實施例6)所測定的相對于親本 TrCel6A-S413P纖維素酶的士BSA木質(zhì)素比值進行歸一化的經(jīng)修飾TrCel6A纖維素酶的士 BSA木質(zhì)素比值。圖5含有兩個散點圖。A圖是高通量檢測1(實施例6)中經(jīng)BSA處理的木質(zhì)素(+BSA)存在時的酶活性與未經(jīng)處理木質(zhì)素(-BSA)存在時的酶活性的散點圖。該數(shù)據(jù)涉及經(jīng)修飾纖維素酶TrCel6A-K129E-S186T-A322D-Q363E-S413P與親本纖維素酶 TrCel6A-S413P的篩選。B圖是高通量檢測2 (實施例7)中經(jīng)BSA處理的木質(zhì)素(+BSA)存在時的酶活性與未經(jīng)處理木質(zhì)素(-BSA)存在時的酶活性的散點圖。該數(shù)據(jù)涉及經(jīng)修飾的纖維素酶 TrCel6A-K129E-S186T-A322D-Q363E-S413P、TrCel6A-K129E-S186T-A322D-Q363E -R410Q-S413P與親本纖維素酶TrCel6A_S413P的篩選。圖 6 顯示了 TrCel6A-S413P 和 TrCel6A-K129E-S 186T-A322D-Q363E-R410Q-S413P 的木質(zhì)素失活時間過程結(jié)果。如實施例9所述，測量木質(zhì)素漿液中殘余TrCel6A活性相對于時間的函數(shù)，并進行分析。圖7是在木質(zhì)素失活作用時間過程檢測中所測定的經(jīng)修飾TrCel6A纖維素酶和 TrCel6A-S413P的相對KL和相對比活性的散點圖。圖8使用來自PDB文件1CB2的坐標顯示了里氏木霉Cel6A晶體結(jié)構(gòu)的空間填充模型(CPK)。右側(cè)圖是左側(cè)圖圍繞其中心垂直軸旋轉(zhuǎn)180度。圖9顯示了用于36種第6家族纖維素酶氨基酸序列中對應(yīng)于SEQ ID NO :1中 83-447位氨基酸的氨基酸之間相互比對的同一性矩陣。圖10顯示了純化的親本和經(jīng)修飾TrCel6A酶的10% SDS-PAGE凝膠。通過10% 的SDS-PAGE分離純化的TrCel6A纖維素酶(各5 μ g)，用考馬斯亮藍R250對凝膠進行染色。在此圖中，TrCel6A聚集體1(泳道10)和TrCel6A聚集體2 (泳道11)分別指TrCel6A-K129E-S186T-A322D-Q363E-S413P 和 TrCel6A-K129E-S186T_A322D-Q363E-R410Q-S413P。 顯示了從木霉中純化的TrCel6A(泳道2)和分子質(zhì)量標準品(泳道1)用于參考。
具體實施例方式本發(fā)明涉及經(jīng)修飾的纖維素酶。更具體地說，本發(fā)明涉及木質(zhì)素所致失活降低的經(jīng)修飾里氏木霉第6家族(TrCel6A)纖維素酶。本發(fā)明還涉及基因構(gòu)建物，其包含編碼經(jīng)修飾TrCel6A纖維素酶的核酸序列，還涉及從宿主菌株中生產(chǎn)經(jīng)修飾纖維素酶的方法和經(jīng)修飾TrCel6A纖維素酶在木質(zhì)素存在時的纖維素水解中的用途。本發(fā)明提供了木質(zhì)素所致失活降低的經(jīng)修飾TrCel6A纖維素酶，從而在包含經(jīng)修飾TrCel6A纖維素酶、纖維素和木質(zhì)素的水解反應(yīng)中，提供了與等同組成的水解反應(yīng)中衍生出經(jīng)修飾TrCel6A纖維素酶的親本TrCel6A纖維素酶相比，增強的纖維素水解活性。下面描述了優(yōu)選實施方案，其僅為舉例而不作為對實施本發(fā)明所必須的特征組合的限制。經(jīng)修飾TrCel6A纖維素酶 如果纖維素酶在它的蛋白質(zhì)一級、二級和三級結(jié)構(gòu)中與其它第6家族纖維素酶表現(xiàn)出相似性，則將其歸為第6家族纖維素酶。例如，所有第6家族纖維素酶包含兩個可作為催化殘基的天冬氨酸(D)殘基。發(fā)現(xiàn)這些天冬氨酸殘基位于175和221位(見圖1 ；基于 TrCel6A, Trichoderma reesei Cel6A，氨基酸編號)。迄今為止，大部分所鑒定的第6家族纖維素酶是嗜中溫的，然而，該家族還包括來自嗜熱放線菌(Thermobifida fusca)的熱穩(wěn)定性纖維素酶(TfCel6A和TfCel6B)和來自特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)的嗜堿性纖維素酶(HiCel6A和HiCel6B)。第6家族纖維素酶也共有類似的三維結(jié)構(gòu)α / β -桶和中央β-桶，其含有通過五個α-螺旋相連的七個平行的β-鏈。有幾種第6家族纖維素酶的三維結(jié)構(gòu)是已知的，如 TrCel6A(Rouvinen，J.，et al.，1990)、嗜熱放線菌(Thermobifida fusca)內(nèi)切-β -1，4-葡聚糖酶 Cel6A(TfCel6A, Spezio, Μ.，et al.，1993)、特異腐質(zhì)霉 (Humicola insolens)纖維二糖水解酶 Cel6A (HiCel6A，Varrot，A.，et al.，1999)、特異腐質(zhì)霉內(nèi)切-β-1，4_ 葡聚糖酶 Cel6B(HiCel6B，Davies，G.J.，et al.，2000)和結(jié)核分支桿胃(Mycobacterium tuberculosis)H37Rv Cel6A(MtCeI6A, Varrat, Α. ，et al. ，2005)。表1 真菌第6家族纖維素酶與TrCel6A的氨基酸序列同一性百分比
權(quán)利要求
1.經(jīng)修飾的里氏木霉(Trichodermareesei)第6家族(TrCel6A)纖維素酶，其包含一個或多個選自下列的氨基酸替換用中性或酸性氨基酸替換1 和410位中一個或多個位置的堿性氨基酸；用酸性氨基酸替換322和363位中一個或多個位置的中性氨基酸；和用蘇氨酸替換186位的氨基酸；其中，所述經(jīng)修飾iTrCeieA的83-447位氨基酸與SEQ ID NO 1的83-447位氨基酸具有約47%至約99. 9%的同一性。
2.權(quán)利要求1的經(jīng)修飾TrCel6A纖維素酶，其中所述經(jīng)修飾TrCel6A纖維素酶的 83-447位氨基酸與SEQ ID NO :1的83-447位氨基酸具有約70%至約99. 9%的同一性，并且其中與親本TrCel6A纖維素酶相比，所述經(jīng)修飾TrCel6A纖維素酶顯示出木質(zhì)素所致失活程度減少至少15%。
3.權(quán)利要求2的經(jīng)修飾TrCel6A纖維素酶，其中所述經(jīng)修飾TrCel6A纖維素酶的 83-447位氨基酸與SEQ ID NO 1的83-447位氨基酸具有約90%至約99. 9%的同一性。
4.權(quán)利要求1至3任何一項的經(jīng)修飾TrCel6A纖維素酶，其中所述氨基酸替換選自 K129E、S186T、A322D、Q363E、R410G 和 R410Q。
5.權(quán)利要求1至4任何一項的經(jīng)修飾TrCel6A纖維素酶，其還包含選自下列的一個或多個氨基酸替換:Y103H、Y103K、Y103R、Y103A、Y103V、Y103L、Y103P、L136V、L136I 和 S413P。
6.分離的基因構(gòu)建物，其包含編碼權(quán)利要求1至5任何一項所述經(jīng)修飾TrCel6A纖維素酶的核酸序列。
7.分離的遺傳修飾微生物，其含有權(quán)利要求6的基因構(gòu)建物。
8.權(quán)利要求7的分離的遺傳修飾微生物，其中所述微生物是酵母或絲狀真菌的物種。
9.權(quán)利要求8的分離的遺傳修飾微生物，其中所述微生物是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或里氏木毒(Trichoderma reesei) 0
10.生產(chǎn)經(jīng)修飾TrCel6A纖維素酶的方法，其包括下列步驟在誘導(dǎo)經(jīng)修飾TrCel6A纖維素酶表達和分泌的條件下，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求7的遺傳修飾微生物，以及從所述培養(yǎng)基中回收經(jīng)修飾TrCel6A纖維素酶。
11.水解纖維素底物的方法，其包括在木質(zhì)素存在下將底物與權(quán)利要求1至5任何一項的經(jīng)修飾TrCel6A纖維素酶相接觸。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述纖維素底物是經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素原料，其中酶促水解產(chǎn)生可發(fā)酵的糖。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素原料選自玉米秸稈、小麥秸稈、大麥秸稈、稻秸稈、燕麥秸稈、油菜秸稈、大豆秸稈、玉米纖維、甜菜漿、紙漿廠細屑和廢渣、甘蔗渣、硬木、軟木、木屑、柳枝稷、芒草、網(wǎng)茅草和草蘆。
14.生產(chǎn)經(jīng)修飾TrCel6A纖維素酶的方法，其包括以下步驟(i)用權(quán)利要求6定義的基因構(gòu)建物轉(zhuǎn)化真菌宿主細胞以產(chǎn)生重組真菌菌株；(ii)選擇表達經(jīng)修飾TrCel6A纖維素酶的重組真菌菌株；以及(iii)在誘導(dǎo)經(jīng)修飾TrCel6A纖維素酶表達的條件下在深層液體發(fā)酵中來培養(yǎng)步驟(ii)中選擇的重組真菌菌株。
15.經(jīng)修飾的第6家族糖苷酶，其選自下列TrCel6A-K129E-S413P(SEQ ID NO :37)；TrCel6A-S186T-S413P(SEQ ID NO :38)； TrCel6A-A322D-S413P(SEQ ID NO :39)； TrCel6A-Q363E-S413P(SEQ ID NO :40)； TrCel6A-R410G-S413P(SEQ ID NO :41)； TrCel6A-R410Q-S413P(SEQ ID NO :42)；TrCe16A-K129E-S186T-A322D-Q363E-S413P(SEQ ID NO :43)；禾口 TrCe16A-K129E-S186T-A322D-Q363E-R410Q-S413P(SEQ ID NO :44)。
全文摘要
本發(fā)明提供了經(jīng)修飾的里氏木霉(Trichoderma reesei)第6家族(TrCel6A)纖維素酶，其包含選自SEQ ID NO1的129、322、363和410位中一個或多個位置處的氨基酸替換。本發(fā)明還提供了基因構(gòu)建物和遺傳修飾微生物，其包含編碼經(jīng)修飾TrCel6A纖維素酶的核酸序列。相對于衍生出經(jīng)修飾TrCel6A的纖維素酶的親本TrCel6A纖維素酶，本發(fā)明的經(jīng)修飾TrCel6A纖維素酶顯示木質(zhì)素所致失活降低至少15％。此類纖維素酶在多種下述工業(yè)應(yīng)用中具有用途，即要求在木質(zhì)素存在時的纖維素酶促水解活性，例如，用于生產(chǎn)可發(fā)酵糖、糖醇類、燃料酒精的經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素原料的水解。
文檔編號C12P21/02GK102159707SQ200980137069
公開日2011年8月17日 申請日期2009年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月1日
發(fā)明者布賴恩·斯克特, 約翰·托馬舍克, 詹姆斯·拉維涅, 馬丁內(nèi)·惠塞爾 申請人:艾歐基能源公司