專利名稱：來自拓?fù)洚悩?gòu)酶基因區(qū)域的核酸探針和廣范圍引物,以及使用它們的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于鑒定細(xì)菌的種和診斷細(xì)菌感染的核酸探針和廣范圍引物。具體地，本發(fā)明涉及來源于超變區(qū)的特異探針，該超變區(qū)位于引起感染的細(xì)菌的拓?fù)洚悩?gòu)酶基因的保守序列附近。本發(fā)明也涉及來源于拓?fù)洚悩?gòu)酶基因的保守序列的廣范圍引物。此外，本發(fā)明涉及這些用于診斷細(xì)菌感染的核酸探針和廣范圍引物，以及使用這些核酸探針和廣范圍引物的診斷方法。
背景技術(shù)：
呼吸道感染是醫(yī)生診所就診的最常見原因。在芬蘭，每1000個居民中約有13例肺炎。甚至更頻繁地診斷出急性上頜竇炎和耳炎。例如，據(jù)估計在芬蘭每年約有200000例耳炎(主要是兒童)。呼吸道感染加重保健體系的負(fù)擔(dān)，并給社會帶來大量的費(fèi)用。很難計算由急性呼吸道感染引起的準(zhǔn)確費(fèi)用，因為這些主要費(fèi)用由所謂的間接費(fèi)用組成，例如缺勤(Rautakorpi等，Scandinavian Journal of InfectiousDiseases.33(12)920-6，2001，Infektiotaudit，ed.Eskola，Huovinen jaValtonen 1998)。急性呼吸道感染是造成全世界數(shù)百萬人死亡的原因，其中主要是兒童。
除了病毒之外，呼吸道感染是由多種細(xì)菌引起化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)(鏈球菌組A)是扁桃體炎的主要病原體。不治療扁桃體炎會帶來急性并發(fā)癥的風(fēng)險，例如扁桃體周圍膿腫。此外，化膿性鏈球菌引起扁桃體炎后遺癥，包括風(fēng)濕熱和腎小球腎炎都是重癥的、甚至絕癥。肺炎門診病人的最主要的病原體是肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae)、和肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae)，其中肺炎球菌是引起肺炎的最主要和最嚴(yán)重的病原體。低頻率誘發(fā)肺炎的細(xì)菌的種是嗜肺軍團(tuán)菌(Legionella pneumophila)和Coxiella bumetii。另一方面，結(jié)核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis)引起肺結(jié)核。此外，在免疫缺陷患者中診斷出由稀有的分支桿菌(Mycobacterium)和諾卡氏菌(Nocardia)種類引起的肺炎。除了肺炎鏈球菌，上頜竇炎和中耳炎癥(中耳炎)的病原體包括流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)和粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)。盡管頻率低，耳炎差異球菌(Alloiococcus otitidis)也引起耳炎。
當(dāng)時診斷細(xì)菌呼吸道感染主要基于細(xì)菌培養(yǎng)檢驗。然而細(xì)菌培養(yǎng)檢驗比較慢，并且基于培養(yǎng)的診斷方法通常是取樣后數(shù)天有時多達(dá)數(shù)周給出結(jié)果。此外，在實驗室條件下細(xì)菌培養(yǎng)不都是成功的。結(jié)果是使用培養(yǎng)方法不適合于所討論的細(xì)菌的事實，或病人在取樣前接受抗菌劑治療的事實。在診斷咽炎中，基于抗原檢驗的快速方法是對細(xì)菌培養(yǎng)檢驗的補(bǔ)充方法，但該方法僅對有限的病原體有效(鏈球菌組A)。在診斷一些細(xì)菌感染(例如，肺炎衣原體和肺炎支原體)中，也可使用血清學(xué)方法，但是這些方法從感染開始后數(shù)周才給出結(jié)果。因此，它們不能用于病人的急性治療中。
基于核酸擴(kuò)增和雜交的分子方法試圖解決上述細(xì)菌培養(yǎng)檢驗的問題。在這些方法的幫助下，病原體同時得以檢驗和鑒定，導(dǎo)致更快診斷和避免需要額外的培養(yǎng)測試?？股匾膊粫愿蓴_培養(yǎng)檢驗的程度來干擾分子方法。
細(xì)菌診斷中使用的一種分子方法是基于使用廣范圍引物的所謂的廣范圍PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))。那時最普通的廣范圍PCR方法是基于使用可識別編碼核糖體RNA(16S rDNA/rRNA或23SrDNA/rRNA)的細(xì)菌染色體基因的保守DNA序列的引物。在基于廣范圍PCR的細(xì)菌鑒定中，實際的鑒定步驟是通過克隆和對擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序而得以進(jìn)行(參見EP-B1 613502，美國專利號6,001,564，和美國專利申請?zhí)?020055101)。
廣范圍細(xì)菌PCR方法有一定范圍應(yīng)用于臨床細(xì)菌診斷中，盡管它最適合鑒定來自分離培養(yǎng)的細(xì)菌和真菌種，并且為商業(yè)化檢驗?zāi)康模鏜icroSeq(Applied Biosystems)，也已建立起來。然而，這些檢驗法并未廣泛使用，因為PCR產(chǎn)物的測序是費(fèi)時費(fèi)力。并且，分析它們和必要設(shè)備，例如測序儀器，價格昂貴，并且實施檢驗需要專門受過培訓(xùn)的人員。此外，在多種微生物感染時，需要進(jìn)行大規(guī)模的克隆實驗。
在細(xì)菌診斷中使用的另一種方法是多重PCR，其基于在一個反應(yīng)混合物中集合的多種特異性寡核苷酸。當(dāng)鑒定引起中耳炎的病原體時，Hendolin等(Journal of Clinical Microbi01-ogy，3511，1997)使用多重PCR方法。
盡管多重PCR程序相對敏感和快速，它還是有一些缺點。眾所周知較短的DNA片段擴(kuò)增效率高于較長的DAN片段。因此，如果相同樣本包括兩個不同的細(xì)菌的種，有可能較短片段的細(xì)菌DNA擴(kuò)增效率更高，影響該方法的敏感度。此外，使用多重PCR僅能同時鑒定幾個細(xì)菌的種，因為實際上它不可能涉及適應(yīng)于超過一打特異引物對的實例，以至于引物在相同PCR條件下是有功能的。因此，多重PCR不可用于，例如呼吸道感染的診斷，已知該感染包含超過十種臨床上重要的病原體。
所謂的正常菌群的細(xì)菌也帶來基于多重PCR的微生物診斷中的問題。僅僅幾打細(xì)菌的種的基因組已經(jīng)被全部測序繪圖，這些細(xì)菌的種的多數(shù)是已知疾病的病原體。因此，關(guān)于正常菌群及其DNA序列的信息非常少。這就是為什么專門基于PCR擴(kuò)增的細(xì)菌的種特異性PCR引物和細(xì)菌診斷幾乎不可能。
使用核糖體RNA有一些缺點。很難借助于rRNA分子，彼此辨別相關(guān)細(xì)菌的種，因為當(dāng)將它們彼此比較時，這些分子的序列不含有足夠的可變區(qū)。甚至在多個菌種間發(fā)現(xiàn)了差別，這些可變位點通常分布在全部rRNA分子(如16 SrRNA的長度約是1500個核苷酸)，其限制用于診斷的分子方法的用途。實踐中，僅僅通過測序全部rRNA編碼基因，相關(guān)細(xì)菌的種從而彼此得以辨別。然而，甚至這種方法不總是足以彼此辨別細(xì)菌的種。
發(fā)明簡述本發(fā)明目的是提供用于感染疾病的細(xì)菌診斷的工具和方法，尤其是引起呼吸道感染的細(xì)菌，但所述工具和方法不含有上述的細(xì)菌診斷的缺點。具體地，本發(fā)明目的是基于分子方法提供用于細(xì)菌診斷的新工具和新方法，該工具和方法是敏感的、有效的，和種特異的，以及能僅鑒定預(yù)期的種。發(fā)明的另一個目的是提供方法，通過該方法可診斷感染性細(xì)菌，具體是那些引起呼吸道感染的細(xì)菌，并且該方法明顯地快于以前的方法，借此在感染早期對患者開出正確和有效的抗菌劑治療的處方，以致于感染持續(xù)期得以縮短，以及潛在有害的風(fēng)險、甚至危險生命的并發(fā)癥得以降低。
本發(fā)明提供來源于超變區(qū)的種特異性寡核苷酸探針，所述超變區(qū)位于拓?fù)洚悩?gòu)酶的編碼基因具體是gyrB/parE基因的保守區(qū)附近，在多個細(xì)菌的種中，這些超變區(qū)在堿基序列中顯著不同。使用這些種特異性探針，可同時檢測和鑒定多個引起感染的細(xì)菌。
本發(fā)明還提供廣范圍或廣范圍引物，該引物起源于拓?fù)洚悩?gòu)酶的編碼基因具體是gyrB/parE基因的保守區(qū)，并有效擴(kuò)增引起感染的、甚至來自臨床樣本的包括大量的外源(非細(xì)菌的)DNA細(xì)菌DNA。
此外，本發(fā)明提供可克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷的簡單、快速、敏感和特異性方法。使用這些方法，臨床上重要的細(xì)菌的種可從臨床樣本或細(xì)菌培養(yǎng)中得以可靠地鑒定和診斷。
本發(fā)明涉及在常規(guī)雜交條件下，與位于細(xì)菌的拓?fù)洚悩?gòu)酶基因的保守序列附近的超變區(qū)雜交的寡核苷酸探針序列，所述細(xì)菌可引起感染，具體是呼吸道感染，并且探針序列包含SEQ.ID.NR1至69描述的任一序列，和/或其反向或互補(bǔ)序列，或其功能片段。
引起感染的細(xì)菌的種的實例，具體是呼吸道感染，包括肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、化膿性鏈球菌(Streptococcuspyogenes)、肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae)、肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae)、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)，淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)、大腸桿菌(Escherichia coli)、粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、嗜肺軍團(tuán)菌(Legionella pneumophila)、和壞死梭桿菌(Fusobacteriumnecrophorum)，編碼拓?fù)洚悩?gòu)酶的基因?qū)嵗蔷幋agyrB和parE蛋白的基因。
本發(fā)明的寡核苷酸探針序列的長度優(yōu)選是15-30核苷酸，更優(yōu)選是20至30和最優(yōu)選21至25核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述寡核苷酸探針序列在檢測、鑒定或分類細(xì)菌的種中的用途。
本發(fā)明還涉及寡核苷酸探針的混合物，其包括優(yōu)選與SEQ.ID.NR1至69相同的所有序列，和/或其反向或互補(bǔ)序列，或上述序列的功能片段的任一組合。在一個實施方案中，預(yù)期的探針混合物固定在固體支持物上。優(yōu)選地，包括SEQ.ID.NR1至69描述的所有序列、和/或其反向或互補(bǔ)序列的寡核苷酸探針混合物，固定于固體支持物上。
本發(fā)明還涉及DNA引物的新混合物，其包括與引起呼吸道感染的細(xì)菌的拓?fù)洚悩?gòu)酶編碼基因，具體是gyrB和/或parE蛋白的編碼基因，的保守區(qū)序列雜交的序列，其包括包括SEQ.ID.NR76或77描述的序列或其功能片段。
此外，本發(fā)明涉及用于在臨床樣本中檢測和鑒定引起呼吸道感染的細(xì)菌的方法，其包括a)使用上述引物混合物，擴(kuò)增分離于臨床樣本的DNA；b)在雜交條件下，將擴(kuò)增的DNA與預(yù)期的上述探針組合進(jìn)行接觸；和c)檢測可能的雜交復(fù)合體的形成。
本發(fā)明方法的一個優(yōu)選實施方案包括通過鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)，擴(kuò)增來自臨床樣本的DNA，以及將擴(kuò)增的DNA與固定于固體支持物上的細(xì)菌的種特異性寡核苷酸探針進(jìn)行接觸。
在本發(fā)明方法的一個優(yōu)選實施方案中，合適的標(biāo)記核苷酸用于擴(kuò)增分離于臨床樣本的DNA，來制備可檢測的靶鏈。
在本發(fā)明方法的另一個優(yōu)選實施方案中，擴(kuò)增的和可能的標(biāo)記靶DNA與固體支持物接觸，優(yōu)選是處理過的玻璃，其中本發(fā)明的所有種特異性寡核苷酸探針，其具有SEQ.ID.NR1至69的描述的序列和/或其反向或互補(bǔ)序列，已經(jīng)附著于固體支持物。
在本發(fā)明方法的另一個優(yōu)選實施方案中，擴(kuò)增的和可能的標(biāo)記靶DNA與固體支持物接觸，優(yōu)選是處理過的玻璃，其中引起呼吸道感染的一個或幾個指定細(xì)菌的種的本發(fā)明的特異性寡核苷酸探針固定于固體支持物，所述特異性寡核苷酸探針具有來自表4A和4B的SEQ.ID.NR.1至7、8至14、15至16、17至20、21至25、26至29、30至33、34至38、39至42、43至47、48至50、51至55、56至60、61至65，和66至69描述的對應(yīng)序列，和/或其反向或互補(bǔ)序列，或其任意合適的組合。
本發(fā)明還涉及用于診斷引起感染的、具體是引起呼吸道感染的細(xì)菌的診斷試劑盒，包括a)如上定義的本發(fā)明的引物混合物，b)如上定義的本發(fā)明的細(xì)菌的種特異性寡核苷酸探針序列混合物，任意固定于固體支持物，c)陽性和任意陰性對照探針序列，和任意的d)擴(kuò)增、雜交、純化洗滌、和/或檢測步驟中需要的試劑。
附圖簡介

圖1表示限定了保守序列的超變gyrB基因區(qū)的實例(流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)和粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catharralis)?；疑袠?biāo)明保守區(qū)，它們作為gyrB/parE廣范圍引物的退火位點。超變區(qū)，細(xì)菌的種特異探針據(jù)此設(shè)計，位于這些保守序列之間(下劃線位點)。
圖2表示在微陣列表面雜交結(jié)果的實例。分離于金黃色葡萄球菌(S.aureus)的培養(yǎng)分離物的gyrB基因的擴(kuò)增DNA，用作靶鏈(不對稱Cy-5-dCTP標(biāo)記PCR產(chǎn)物)。玻片含有四條特異性gyrB寡核苷酸探針(表4A寡核苷酸探針21至24)，所述探針全部特異性結(jié)合金黃色葡萄球菌靶鏈。此外，所有5條陽性對照寡核苷酸可給出檢測信號。在玻片上，金黃色葡萄球菌靶鏈不結(jié)合其它寡核苷酸探針。
圖3表示由實施例7的PCR擴(kuò)增結(jié)果，其中，已知為肺炎鏈球菌特異性的引物在鏈球菌屬的細(xì)菌的測試中進(jìn)行比較，而已知為粘膜炎莫拉氏菌特異性的引物在莫拉氏菌屬的細(xì)菌測試中進(jìn)行比較，然而結(jié)果顯示，所討論的引物不是細(xì)菌的種特異性，而它們也擴(kuò)增正常菌群的細(xì)菌。
發(fā)明詳述本發(fā)明基于試圖找到在引起感染的細(xì)菌的診斷中，較之核糖體RNA的應(yīng)用更具特異性的替代物的研究。該研究著力于細(xì)菌的有生活力的其他基因。拓?fù)洚悩?gòu)酶旋轉(zhuǎn)酶B(gyrB或拓?fù)洚悩?gòu)酶II)和parE蛋白(拓?fù)洚悩?gòu)酶IV的其他亞單位)是細(xì)菌中重要的分子，因為它們?yōu)镈NA包裝所必需。在進(jìn)化過程中，這些分子的某些DNA片段序列幾乎保持不變，即保守的。在本說明書中，術(shù)語“保守區(qū)”指在不同的引起呼吸道感染的細(xì)菌的種之間，拓?fù)洚悩?gòu)酶基因或蛋白質(zhì)，其核苷酸序列或等價氨基酸序列幾乎保持不變。通常保守區(qū)是蛋白質(zhì)具有功能的最重要的區(qū)域。然而，GyrB/ParE分子不如核糖體RNA分子保守。因為研究的分子是蛋白質(zhì)，編碼這些蛋白質(zhì)的基因由于遺傳密碼子的性質(zhì)在核酸水平上比起編碼結(jié)構(gòu)性RNA分子(如16SrRNA分子)的基因包含更多的差異。在進(jìn)化過程中，GyrB/ParE分子作為一個整體不如結(jié)構(gòu)性RNA分子保持不變。在GyrB/ParE分子中可以發(fā)現(xiàn)短的DNA片段，在不同的細(xì)菌的種中，其變化是如此之大，以至于這些DNA片段被認(rèn)為是種特異性的。這些序列是高度可變序列，在本說明書中指這樣的拓?fù)洚悩?gòu)酶基因，其DNA序列在不同的細(xì)菌間其核苷酸序列之不同達(dá)到了賦予細(xì)菌以種特異性的程度，而且，其位于拓?fù)洚悩?gòu)酶保守序列的附近，而且任意地由保守序列限制或標(biāo)志出。
上述特點被用于細(xì)菌菌株的種特異性寡核苷酸的設(shè)計中。在細(xì)菌的種特異性探針(寡核苷酸)的設(shè)計中，使用基于序列對比的策略。將靶細(xì)菌的種的gyrB和parE基因，與參考細(xì)菌的對應(yīng)基因進(jìn)行序列對比。這些序列獲自EMBL公開序列數(shù)據(jù)庫，在無法從公共數(shù)據(jù)庫獲得序列的情況下，通過克隆來自細(xì)菌的種的gyrB/parE基因序列片段得以生成。序列通過擴(kuò)增來自細(xì)菌培養(yǎng)分離物的合意的gyrB/parE DNA片段得以生成。然后合意的DNA序列片段被克隆和測序圖1顯示兩個細(xì)菌的種(流感嗜血桿菌和粘膜炎莫拉氏菌的超變gyrB基因區(qū)的實例，所述超變區(qū)通過保守基因區(qū)得以結(jié)合?；疑袠?biāo)明保守區(qū)，它們作為gyrB/parE廣范圍引物的退火位點。超變區(qū)，細(xì)菌的種特異性探針據(jù)此設(shè)計，位于這些保守序列之間(下劃線位點)。
使用BioEdit程序盒和ClustalW對列算法，進(jìn)行序列對比。計算對列的連續(xù)序列，手動鑒別合適的保守區(qū)。這些區(qū)域指在目的細(xì)菌的種的基因中是保守的、但在參照細(xì)菌的種的基因中至少沒有全部被找到的序列片段。具有合適長度(如21-25個核苷酸)的寡核苷酸序列選自于比較分析的區(qū)域。使用FastA算法程序，將選擇的寡核苷酸序列與EMBL原核序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較。當(dāng)與非目的細(xì)菌的種的gyrB/parE序列比較時，選出具有至少兩處不匹配的寡核苷酸序列用于進(jìn)一步分析。估算寡核苷酸的融解溫度(Tm)，并檢查發(fā)夾結(jié)構(gòu)的信息。挑選沒有明顯二級結(jié)構(gòu)和具有高于45℃的Tm的寡核苷酸，用于特異性測試。在既有分離于多個細(xì)菌的種(實施例3，表3)的純DNA樣品、又有臨床患者樣品(實施例6，表5)的實驗室條件下，測試寡核苷酸探針的特異性。
本發(fā)明的寡核苷酸探針包括SEQ.ID.NR1至69、描述的序列或其反向或互補(bǔ)序列。它們可有不同的長度，唯有這些寡核苷酸探針的合意的種的特異性和功能性確定它們在雜交反應(yīng)中的合適長度。寡核苷酸探針的長度通常是15至30，優(yōu)選20至30，最優(yōu)選21至25個核苷酸。此外，這些探針以不同方法得以修飾(如修飾核苷酸，包括例如次黃嘌呤核苷)。多種化合物或基團(tuán)(如氨基酸基團(tuán))或其它分子，例如檢測需要的標(biāo)簽，能附著于探針，或者它們完全沒有修飾。圖4A和4B顯示優(yōu)選的細(xì)菌的種特異性探針的序列及其特異性，并且它們具有與SEQ.ID.NR1至69描述的序列。對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然這些寡核苷酸序列的天然的、反向或互補(bǔ)序列是同等合適。同樣地，假如種特異性維持不變，前述寡核苷酸序列的功能片段可用作探針。
為了設(shè)計PCR引物，使用ClustalW隊列算法，通過BioEdit程序，將選自不同fylogenetic組(表2)的細(xì)菌的種gyrB蛋白的氨基酸序列進(jìn)行序列對比。在對比研究中，找到一些保守區(qū)，并作為用于廣范圍引物設(shè)計的起始點。parE蛋白與gyrB蛋白相關(guān)，并且在某些細(xì)菌的種(革蘭氏陽性菌)的這兩個基因中找到上述的保守區(qū)。將保守氨基酸序列反向翻譯為對應(yīng)的核酸序列。依賴于自然的遺傳密碼，在引物序列中存在幾個簡并區(qū)?；诒Ｊ匦蛄?，在實驗室中設(shè)計并測試幾條引物對(特異性和敏感度測試)。基于實驗室測試，可以總結(jié)出使用一些引物對可成功擴(kuò)增純細(xì)菌DNA，并且使用這些引物可擴(kuò)增所有細(xì)菌的gyrB/parE基因。因此所討論的引物作為用于細(xì)菌的通用或廣范圍引物。
已證實與其他引物對相比，一條引物對具有更高的敏感度，并且可用該引物對測試臨床樣本。然而，發(fā)現(xiàn)無法使用該引物對進(jìn)行擴(kuò)增來自含有大量的人DNA的臨床樣本的細(xì)菌DNA。由此重新設(shè)計引物對，根據(jù)簡并性探尋可選擇的新引物，該引物一方面擴(kuò)增來自臨床樣本的DNA，另一方面還具有高特異性以致于能擴(kuò)增引起呼吸道感染的所有細(xì)菌的gyrB/parE蛋白。表1顯示功能型引物對。使用這些引物對，彼此在種系發(fā)生上遠(yuǎn)緣的細(xì)菌的所有g(shù)yrB/parE基因(表3)，甚至在大量的人DNA存在下，得以擴(kuò)增。
表1.gyrB/parE廣范圍引物
在引物序列中W代表堿基A或T，K代表堿基G或T，Y代表堿基C或T，H代表堿基A或C或T，R代表堿基A或G，和D代表堿基A或G或T。
引物混合物包含由幾個不同引物選擇方案組成的混合物。例如，關(guān)于gB1F引物，其混合物包括W代表堿基A(腺嘌呤)或T(胸腺嘧啶)的引物。
根據(jù)本發(fā)明，通過能證明雜交的任一合適的方法，將特異性探針用于鑒定引起感染的病原體，具體是引起呼吸道感染的細(xì)菌。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員，這些方法是眾所周知的，這些方法可在溶液中和在結(jié)合DNA的固體支持物上進(jìn)行，例如在硝酸纖維素膜或尼龍膜，或玻璃上。
本發(fā)明方法的一個優(yōu)選實施方案中，使用DNA微陣列技術(shù)進(jìn)行細(xì)菌鑒定。在說明書中，DNA微陣列或DNA芯片指已知的核酸序列以預(yù)先確定的順序固定在上面的基片。如果固定在微陣列的核酸片段短于100堿基對(通常大約20-30堿基對)，微陣列被稱為寡核苷酸陣列。
在本發(fā)明方法中，用于分析的樣品可以是從懷疑患有感染疾病的患者中得到的細(xì)菌培養(yǎng)物、組織片段、例如唾液或呼吸道纖毛樣品的分泌物樣品、血樣，或其他合適的樣品。具體是用于分析的樣品是適于臨床診斷應(yīng)用的分泌物樣品。
使用任何常規(guī)方法，例如使用商業(yè)化DNA分離試劑盒(如HighPure PCR Template Preparation Kit，Roche；NucleoSpin，BDBiosciencesClontech；或QlAamp DNA迷你試劑盒，Qiagen)或使用傳統(tǒng)的酚仿或相當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑抽提法，通過手動或使用適于進(jìn)行DNA分離的特殊設(shè)備，從樣品中分離用于分析的DNA。因為可靠、快速和可重復(fù)性，優(yōu)選使用商業(yè)化試劑盒。
本發(fā)明方法的DNA擴(kuò)增中使用的試劑是常規(guī)用于DNA擴(kuò)增的任何試劑，這在本領(lǐng)域技術(shù)人員之中也是眾所周知的。合適的和節(jié)省成本的試劑，其是商業(yè)上可利用的，包括不同類型的Taq DNA聚合酶及其緩沖液(如AmpliTaqGOLD、AmpliTaqLD、DyNAzyme、TaqPlusPrecision，和HotStartTaq)、核苷酸或預(yù)先制備的核苷酸混合物(如Sigma、Applied Bio-systems、Amersham Biosystems)、MgCl2(通常使用來自Taq聚合酶生產(chǎn)商的產(chǎn)品)，和Cy5-dCTP(如NENLifeSciences、Amersham Biosciences)。
本發(fā)明方法中，使用任意常規(guī)已知方法進(jìn)行克隆，例如使用商業(yè)化克隆試劑盒(如Qiagen PCR克隆試劑盒、QIAGEN或TOPO TA克隆試劑盒，Invitrogen)。使用任何適于本目的的測序儀(如AppliedBiosystems，model 373A，377，或3100，或Bio-Rad Sequi-Gen GT)對克隆產(chǎn)物進(jìn)行測序，或者對產(chǎn)物手動測序。手動或使用為本目的設(shè)計的測序分析程序(Applied Biosystems Sequencer或Vector NTI SuiteVersion 7，InforMax)來分析序列。
擴(kuò)增用到的設(shè)備可以是任何合適的裝置(如T1Thermocycler，Biometra，或GenAmp PCR system 2700，Applied Biosystems)。實際上，適于DNA擴(kuò)增的所有裝置和設(shè)備都可以使用，也可通過將反應(yīng)試管從一個溫度轉(zhuǎn)至另一個溫度來進(jìn)行手動擴(kuò)增。此外，也可以在DNA微陣列上直接進(jìn)行擴(kuò)增。
使用任何商業(yè)化方法(High Pure Produet Purification Kit，Roche；MicroSpin S-400，或S-300 HR柱，Amersham Biosciences；或QlAquickPCR純化試劑盒，Qiagen)，或使用有機(jī)溶劑抽提法進(jìn)行純化PCR產(chǎn)物。擴(kuò)增產(chǎn)物也可用于雜交反應(yīng)，而不需要任何額外的純化或抽提步驟。
為了形成單鏈靶鏈，使用任何已知的消化方法。這些方法包括，如不對稱PCR、核酸外切酶處理，或直接將單鏈靶鏈合成于微陣列表面(如matriXarray，Roche Applied Science)。本發(fā)明也包括在雜交反應(yīng)中使用雙鏈PCR產(chǎn)物中的應(yīng)用。在本發(fā)明的這方面，不對稱PCR是生成單鏈靶鏈的優(yōu)選方法。
本發(fā)明方法中，為了生成標(biāo)記的靶鏈，可使用任何合適的標(biāo)記物。合適的標(biāo)記法包括熒光標(biāo)記(如Cy5、Cy3、Cy2、TexasRed、FITC、Alexa 488、TMR、FluorX、ROX、TET、HEX)、放射性標(biāo)記(如32p、33p、33S)、和化學(xué)發(fā)光標(biāo)記(如HiLight Single-Color Kit)。本發(fā)明中，優(yōu)選Cy5-dCTP熒光標(biāo)記(Amersham Biosciences)。本發(fā)明也包括不需要標(biāo)記中的應(yīng)用，例如基于電脈沖(如MotorolaeSensor)的核酸檢測的那些應(yīng)用。
當(dāng)在固體支持物上進(jìn)行雜交時，用于雜交的探針通過共價或非共價結(jié)合固定在固體支持物的表面?；蛘?，使用其他化學(xué)、電子化學(xué)或類似的固定方法。探針固定在上面的基片或支持物，可選自玻璃、塑料、金屬、尼龍、硝酸纖維素、聚丙烯酰胺、硅、或這些材料的復(fù)合物得以制備，基片的大小在幾個毫米到幾個分米中變化。對用到的基片表面進(jìn)行氨基硅烷處理或任何其他的表面處理，例如環(huán)氧硅烷，或者使用不需要任何單獨表面處理的基片。用于寡核苷酸探針的優(yōu)選基片是氨基硅烷處理的顯微鏡載玻片(如Genorama，Asper Biotech Ltd.，Estonia)。
使用任何適于本目的的商業(yè)化陣列儀(如Qarray-mini陣列系統(tǒng)，Lucidea陣列點樣儀，OmniGrid，或GeneMachines陣列儀)將探針點樣固定(print)在微陣列支持物的表面上，或用移液槍將它們手動點樣在支持物表面上?；蛘?，使用照相平板印刷術(shù)在表面上直接合成探針。
雜交中用到的雜交混合物的組分可以不同于工作實施例中顯示的組分，例如，可改變鹽組分和/或濃度(如2-4×SSC或SSPE)，或使用商業(yè)化雜交液(如ArrayHyb，Sigma)。此外，在雜交混合物中，使用變性或穩(wěn)定添加劑(如甲酰胺，DMSO，即二甲基亞砜)或降低非特異性結(jié)合的物質(zhì)(如BSA，即牛血清蛋白，或ssDNA，即鮭精DNA)?？稍诙喾N雜交溫度下進(jìn)行雜交(通常在40-70℃)，進(jìn)行雜交需要的時間取決于應(yīng)用從幾分鐘到一天而變化。在恒溫箱或特殊雜交裝置(如GeneTAC HybStation或Lucidea Slidepro Hybridizer)中以代替水浴，進(jìn)行雜交。雜交后洗滌步驟在它們的持續(xù)時間、體積、溫度、和洗液組分方面變化，因此不同于作為例證的方法。也可使用單獨裝置實施微陣列載玻片的洗滌步驟。有時不需要洗滌步驟，因為微陣列載玻片在雜交后立即得以分析。在一優(yōu)選的方法中，57℃水溶是合適的雜交條件。在這些條件下將載玻片雜交12-16小時。
使用可應(yīng)用于本目的的任何設(shè)備或閱讀器(如GeneTAC UC4，GenePix Personal 4100A，或Agilent DNA Microarray Scanner)，分析微陣列或芯片。如果使用熒光標(biāo)簽標(biāo)記靶鏈，例如使用熒光顯微鏡，分析可得以進(jìn)行。如果使用放射性標(biāo)簽，通過放射自顯影術(shù)分析芯片或膜。如果在電子微陣列的表面進(jìn)行雜交以及分析因此基于電子檢測，使用為本目的設(shè)計的特殊設(shè)備分析微陣列。
僅僅幾打細(xì)菌的種的基因組已經(jīng)被全部測序繪圖，這些細(xì)菌的種的多數(shù)是已知的病原體。因此，關(guān)于正常菌群及及其DNA序列的信息非常少。所以，專門基于PCR擴(kuò)增的細(xì)菌的種特異性PCR引物和細(xì)菌診斷幾乎不可能。
本發(fā)明方法不會遇上現(xiàn)有技術(shù)的問題。本發(fā)明方法的擴(kuò)增步驟是非常敏感，并且不管細(xì)菌的種是革蘭氏陰性或是革蘭氏陽性(表3)，使用本發(fā)明的廣范圍引物，有效擴(kuò)增來自不同種系發(fā)生的細(xì)菌的種的某個基因區(qū)(gyrB/parE)。此外，PCR產(chǎn)物長度短(約300堿基對)，其促進(jìn)了擴(kuò)增反應(yīng)的效率。
設(shè)計用于gyrB/parE基因區(qū)的細(xì)菌的種特異性探針，該基因區(qū)的可變性顯著地高于例如16SrRNA基因區(qū)，后者以前已用于細(xì)菌診斷中。盡管使用本方法的廣范圍引物還可有效地擴(kuò)增正常菌群的細(xì)菌的種，也不會出現(xiàn)假陽性反應(yīng)，因為本發(fā)明的探針是高度種特異性，僅僅鑒別它們被設(shè)計用于檢測的那些細(xì)菌。當(dāng)將來自肺炎鏈球菌的培養(yǎng)分離物擴(kuò)增的靶鏈雜交到載玻片上，靶鏈僅僅和肺炎鏈球菌的特異探針以及陽性對照進(jìn)行雜交。另一方面，雜交來自正常菌群擴(kuò)增的靶鏈，例如輕鏈球菌(Streptococcus mitis)，產(chǎn)物將不會結(jié)合任何病原體探針；在這方面，僅僅陽性對照探針將發(fā)出信號(實施例7，表6)。本發(fā)明的所有寡核苷酸特異探針與多種菌種交叉測試，包括一些屬于正常菌群的細(xì)菌的種，并且發(fā)現(xiàn)沒有交叉反應(yīng)出現(xiàn)(圖2，表6)。因此，本發(fā)明的方法比相似類型的前述方法更加敏感和特異性。
本發(fā)明的診斷試劑盒可用于診斷引起感染的細(xì)菌，具體是引起呼吸道感染的那些細(xì)菌。試劑盒包括如上詳細(xì)說明的本發(fā)明的DNA引物混合物，和如上詳細(xì)說明的本發(fā)明的細(xì)菌的種特異性寡核苷酸探針序列的任何合適的和理想的混合物，所述序列任意地結(jié)合固定于支持物，和合適的陽性和任意陰性對照的探針序列，以及在擴(kuò)增、雜交、純化、洗滌和/或以上詳細(xì)討論的檢測步驟中需要的任何試劑。本發(fā)明優(yōu)選的診斷試劑盒含有DNA引物混合物，其包括具有與SEQ.ID.NR76和77描述的序列，含有在表面附著SEQ.ID.NR1至69描述的寡核苷酸探針序列的芯片，陽性和任意陰性對照，和實施本發(fā)明方法需要的任意試劑。下文中，本發(fā)明通過實施例得以更準(zhǔn)確地闡述。當(dāng)描述方法時，涉及不同的設(shè)備、材料、溫度、化學(xué)品或本申請中使用的等價物。在本發(fā)明的不同應(yīng)用中，這些因素以合適的方式自然地變化。因此，本發(fā)明及其實施方案不限于以下描述的實施例。
實施例1.根據(jù)本發(fā)明設(shè)計PCR引物為了設(shè)計PCR引物，使用ClustalW隊列算法，通過BioEdit程序，對來自不同種系發(fā)生群(表2)的多種細(xì)菌的種的gyrB蛋白(GyrB)和相關(guān)蛋白ParE的氨基酸序列進(jìn)行序列對比。在GyrB的對比序列中找到幾個保守基因區(qū)。從所研究的革蘭氏陽性菌的種的parE基因中也找到相同的保守區(qū)。
這些保守氨基酸序列用作廣范圍引物設(shè)計的起始位點。首先將它們反向翻譯為對應(yīng)的核酸序列。由于遺傳密碼的簡并性，在這些核酸序列中觀測到幾個簡并性位點。此后，基于保守序列，合成多種引物對(定購于Sigma-Genosys，England，www.siama-aienosys.co.uk)并對特異性和敏感度進(jìn)行測定。使用以下實施例4中描述的方法，通過擴(kuò)增分離于表4所示細(xì)菌的種的DNA，進(jìn)行測定特異性。通過分析分離于流感嗜血桿菌分離培養(yǎng)物中的DNA的最低濃度，確定引物對的敏感度，其中使用以下實施例4中描述擴(kuò)增和鑒定方法，用不同的引物對進(jìn)行擴(kuò)增和測定。
基于這些測定結(jié)果，應(yīng)該指出一些引物對可成功擴(kuò)增純細(xì)菌DNA，并且使用這些引物，可擴(kuò)增所有研究的細(xì)菌的種的gyrB/parE基因。因此這些引物作為細(xì)菌的廣范圍引物而起作用。引物的敏感度有變化，具有最高敏感度的引物對用于研究臨床樣本(耳炎基質(zhì)樣品)。然而，發(fā)現(xiàn)引物對不足夠敏感，因為它不能擴(kuò)增來自于含有大量的人DNA的臨床樣本的細(xì)菌DNA。
為此，根據(jù)簡并性而變化的新引物對得以合成(定購于Sigma-Genosys，England，www.sigma-genosys.co.uk)。使用純細(xì)菌DNA和使用分離于臨床樣本的DNA(表5)，通過前述的方法研究特異性和敏感度。功能引物對是引物混合物，其含有序列CGTCCWGGKATGTAYATHGG(SEQ.ID.NR77)和CCHACRCCRTGWAAWCCDCC(SEQ.ID.NR78)，其分別命名為gB1F(正向引物混合物)和gB2R(反向引物混合物)(表1)，其中W代表堿基A或T，K代表堿基G或T，Y代表堿基C或T，H代表堿基A或C或T，R代表堿基A或G，和D代表堿基A或G或T。
使用這種引物混合物，鑒定所有研究的細(xì)菌的種的gyrB和/或parE基因的第一部分的保守序列。它擴(kuò)增了來自于臨床樣本的DNA，保持了充分廣范圍的特異性，因此允許擴(kuò)增來自引起呼吸道感染(參見實施例6和7)的所有菌種的gyrB/parE基因。具體地，引物混合物能用于擴(kuò)增種系發(fā)生上遠(yuǎn)緣的細(xì)菌的gyrB/parE基因，甚至在樣品包括大量的人DNA的情況下。
表2.用于序列對比的gyrB蛋白的氨基酸序列的細(xì)菌。
表3.測試引物和探針的敏感度和特異性中用到的菌株。
ATCC＝美國典型培養(yǎng)物保藏中心
DSM＝德意志微生物保藏中心實施例2.如本發(fā)明定義，通過克隆生成設(shè)計寡核苷酸探針需要的新序列為了設(shè)計本發(fā)明的寡核苷酸探針，細(xì)菌的種粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)、壞死梭桿菌(Fusobacterium necrophorum)、嗜肺軍團(tuán)菌(Legionella pneumophila)、輕鏈球菌(Streptococcusmitis)、口腔鏈球菌(Streptococcus oralis)、和副流感嗜血桿菌(Haemophilus parainfluenzae)的GyrB序列，其是公開序列數(shù)據(jù)庫中無法利用的，按照下述的常規(guī)方法得以合成。
使用QlAamp DNA迷你試劑盒(Qiagen，Germany)，從細(xì)菌分離培養(yǎng)物分離的第一種DNA。當(dāng)DNA得以分離時，使用對稱(常規(guī)的)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增用于克隆的所需的靶鏈。在擴(kuò)增的第一步驟中，通過混和分離于樣品的DNA、廣范圍細(xì)菌引物(實施例1)、以及擴(kuò)增步驟中需要的其他成分來制備反應(yīng)混和液。因此，用于克隆PCR的反應(yīng)液(25μl)含有20pmol的引物混合物gB2R，20pmol引物混合物gB1F，各為200μM的dATP、dGTP、dTTP和dCTP(Sigma，USA)，1×Hot Start Taq PCR緩沖液(Qiagen，Germany)，該緩沖液包含用于實現(xiàn)終濃度為2.8mM的MgCl2、7.5％的DMSO(AmershamPharmacia Biotech，USA)、2.5單位的Hot Start Taq DNA聚合酶(Qiagen，Germany)、和2.5μl分離的DNA。
在GenAmp PCR系統(tǒng)2700熱循環(huán)儀(Applied Biosystems)中，使用以下程序進(jìn)行克隆PCR變性步驟是95℃15分鐘，40循環(huán)的95℃1分鐘、50℃1分鐘、72℃1分鐘，最后延伸步驟是72℃10分鐘。完成PCR后，使用含有溴化乙錠的2％瓊脂糖凝膠，通過凝膠電泳檢驗成功的擴(kuò)增。
PCR后，使用TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen，USA)立即進(jìn)行克隆。用于克隆的混和液含有4μl的PCR產(chǎn)物、1μl的鹽溶液(1.2MNaCl、0.06M MgCl2)、和1μl的TOPO載體(pCR 4-TOPO)，將它們在EP管中一起混勻?；旌鸵河谑覝販赜?分鐘，此后溶液轉(zhuǎn)至冰上。進(jìn)行化學(xué)轉(zhuǎn)化之后，2μl冷卻的克隆混和液轉(zhuǎn)入50μl的TOPO10 E.coli感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化細(xì)胞冰上溫育10分鐘。在下一階段中，進(jìn)行熱激處理。含有細(xì)胞的試管轉(zhuǎn)入42℃水浴中熱激30秒。該試管立即轉(zhuǎn)至冰上之后，加入室溫下的250μl SOC培養(yǎng)基(2％蛋白胨、0.5％酵母提取物、10mMNaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl2、10mM MgSO4、20mM葡萄糖)。37℃水平振蕩(200rpm)試管1小時。在預(yù)熱的選擇LB平板(Luria-Bertani、10％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1.0％NaCl、稀釋于水的1.5％L-瓊脂，pH 7)上涂布20μl克隆混合物，所述平板含有50g/ml的氨芐青霉素。平板于37℃過夜溫育。第二天，從平板中挑選10個克隆并進(jìn)行測序PCR。
用于測序PCR的反應(yīng)液(50μl)，其含有0.4pmol的M13反向(5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′)和M13正向(5′-GTAAACGACGGCCAG)引物(由試劑盒提供)，各為150μM的dATP、dGTP、dTTP和dCTP(Sigma，USA)，1×Hot Start Taq PCR緩沖液(Qiagen，Germany)，1單位的Hot Start Taq DNA聚合酶(Qiagen，Germany)。為了進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，借助于樣品簽(sample stick)將一小部分細(xì)菌菌落轉(zhuǎn)移至PCR反應(yīng)管。
依下列程序，在GenAmp PCR系統(tǒng)2700熱循環(huán)儀(AppliedBiosystems)中進(jìn)行測序PCR變性步驟是95℃15分鐘，30循環(huán)的94℃1分鐘、55℃1分鐘、72℃1分鐘，最后延伸步驟是72℃10分鐘。完成PCR后，使用含有溴化乙錠的2％瓊脂糖凝膠，通過凝膠電泳檢驗成功的擴(kuò)增。此后，使用QlA快速PCR純化試劑盒(Qiagen，Germany)通過除去多余的引物、核苷酸、緩沖液和聚合酶，純化PCR產(chǎn)物。
純化步驟之后，將插入載體的片段進(jìn)行測序。用于測序步驟的12μl反應(yīng)混和液含有100ng PCR產(chǎn)物和5pmol M13反向或M13正向引物。通過BigDye Terminator Version 3.0試劑盒和ABI-PRISM 3100遺傳分析器(Applied Biosystems，USA)進(jìn)行測序。使用Vector NTISuite Version 7程序(InforMax，USA)分析序列。
使用上述常規(guī)方法，生產(chǎn)用于下列細(xì)菌的種的gyrB序列粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)、壞死梭桿菌(Fusobacteriumnecrophorum)、嗜肺軍團(tuán)菌(Legionella pneumophila)、輕鏈球菌(Streptococcus mitis)、口腔鏈球菌(Streptococcus oralis)、和副流感嗜血桿菌(Haemophilus parainfluenzae)(SEQ.IDNR70至75)。
實施例3.設(shè)計細(xì)菌的種特異探針在細(xì)菌的種特異性寡核苷酸，如探針，的設(shè)計中，使用基于序列對比的策略。將目的菌種的gyrB和parE基因，與幾個參考細(xì)菌(近緣菌種)的對應(yīng)基因進(jìn)行序列對比。例如，肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)的gyrb基因，與化膿性鏈球菌(Streptococcuspyogenes)、輕鏈球菌(Streptococcus mitis)、口腔鏈球菌(Streptococcus oralis)、Mycoplasma hominis、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，、和壞死梭桿菌(Fusobacteriumnecrophorum)的gyrB基因進(jìn)行序列對比。S.oralis和S.mitis是S.pneumoniae的近緣種。因此，設(shè)計作為S.pneumoniae的寡核苷酸必須不與這些正常菌群發(fā)生反應(yīng)。從EMBL公開序列數(shù)據(jù)庫中獲得序列，或通過實施例2中描述的克隆生成序列使用ClustalW隊列算法，通過BioEdit程序進(jìn)行序列對比。計算對比的共有序列，手動鑒定合適的保守區(qū)域。這些區(qū)域指在目的菌種的基因中是保守的和至少沒有全部發(fā)現(xiàn)于來自參考細(xì)菌的基因的序列片段。具有合適長度(21-25個核苷酸)的寡核苷酸序列選自于用于比較分析的區(qū)域。使用FastA算法程序，將挑選的寡核苷酸序列與EMBL原核序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較。挑選出與非目的細(xì)菌的gyrB/parE序列進(jìn)行比較時，有至少兩處錯配的寡核苷酸序列用于進(jìn)一步分析。確定用于寡核苷酸的理論融解溫度(Tm)，并研究二級結(jié)構(gòu)信息。使用方程式81.5+16.6log[Na]+0.41(％GC)-0.61(％for)500/N計算Tm(C)，其中Na是一價陽離子的濃度(計算中使用50M)，％GC是鳥嘌呤核胞嘧啶的比例，％for是甲酰胺的濃度(計算中使用0％)和N是寡核苷酸的長度。使用Sigma-Genosys提供的程序研究二級結(jié)構(gòu)信息。在網(wǎng)絡(luò)瀏覽器的幫助下，在互聯(lián)網(wǎng)地址//www.sigma-genosys.co.uk/oligos/frameset.html(計算機(jī)/基礎(chǔ)計算機(jī))可使用該程序。選擇不能形成明顯的二級結(jié)構(gòu)的和Tm溫度至少是45℃的寡核苷酸，用于實驗特異性測試。
合成寡核苷酸探針，同時從5’末端(NH2-修飾核苷酸)(Sigma-Genosys，England)進(jìn)行修飾。如實施例4和5中描述，使用分離于不同菌種(表3)和病人樣品(表5)的DNA樣品，在實驗室中測試探針的特異性。所測試的探針中，挑選功能性最好的和具有最高特異性的那些探針。表4A和4B顯示細(xì)菌的種特異探針的序列和特異性。
表4A.GyrB寡核苷酸序列寡核苷酸/SEQ.IDNR 特異性(gyrB基因) 序列(5′-3′)1/1 肺炎鏈球菌 CTCAAAAGAAGGTCTTCACCATC2/2 肺炎鏈球菌 GCCATATTCAAGTTTTTATTGAG3/3 肺炎鏈球菌 AGCCAGATGATTCGATTACTGTT4/4 肺炎鏈球菌 TTGAGACCGTCTTTACAGTCCTT5/5 化膿性鏈球菌 GTTTTGCCTCTCATATTAAAGTC
6/6 化膿性鏈球菌 TCTTTATTGAAGCAGATAATTCC7/7 化膿性鏈球菌 CGTTGAAACAGTTTTTACAGTCT8/8 肺炎衣原體GGTCTTCATCATCTAGTCTATGA9/9 肺炎衣原體GGTTGTAGACWACAGCATTGACG10/10肺炎衣原體AGCCATGGCAGSTTATTGCTCTA11/11肺炎衣原體GGATTGATGTTSGCATTTTAGAG12/12肺炎衣原體GGGTATTGTCWTCGTAGATAATG13/13肺炎衣原體TTATTGCTCTAGGATTGATGTT14/14肺炎衣原體GCATTTTAGAGSACGGGGGTATT15/15肺炎支原體TCAAACTAACCCTTAAAGACAACT16/16肺炎支原體TGAAACAGTGTTTACGGTACTCC17/17流感嗜血桿菌 ATGATAATTCTGTATCGGTGCAA18/18流感嗜血桿菌 AGCAGAAGTTATTATGACTGTGC19/19流感嗜血桿菌 GACGATAACTCTTATAAAGTATC20/20流感嗜血桿菌 GATACCGATGACGGTACTGGTTTG21/21金黃色葡萄球菌AGTGTGGGAAATTGTCGATAATA22/22金黃色葡萄球菌TGAAGTTGTTATTGAAAAAGATAAC23/23金黃色葡萄球菌GGATTAAAGTAACGGATAACGGA24/24金黃色葡萄球菌CTGTCGAAGTTATTTTAACTGTTT25/25金黃色葡萄球菌CGACTTCAGAGAGAGGTTTGCAC26/26綠膿桿菌 GAAATCAGCATCACCATCCATAC27/27綠膿桿菌 ATACGGATGAGTCGATCACTGTC28/28綠膿桿菌 GACGACAACACCTACAAGGTGTC29/29綠膿桿菌 GACACCGACGATGGCACCGGTCTG30/30淋病奈瑟氏球菌TTCGACAACAACAGCTACAAAAT31/31淋病奈瑟氏球菌ATATGGTGTTTGAAGTATTGGAC32/32淋病奈瑟氏球菌GACAAAATCACGGTAACGATACA33/33淋病奈瑟氏球菌GACAACAACAGCTACAAAATCTC
34/34大腸桿菌TATTCGAGGTGGTAGATAACGCT35/35大腸桿菌TTCACGCCGATAACTCTGTCTCT36/36大腸桿菌CGCCGATAACTCTGTCTCTGTAC37/37大腸桿菌GACGATAACTCCTATAAAGTGTC38/38大腸桿菌GACACGGATGACGGCACCGGTCTG39/39粘膜炎莫拉氏菌 AGCTGCCGAGGTTATTATGACGG40/40粘膜炎莫拉氏菌 GATGATAATTCATACAAAGTATC41/41粘膜炎莫拉氏菌 TGTGGATATCCACCCTGAAGAAG42/42粘膜炎莫拉氏菌 ATACCGATGATGGTACAGGCTTG43/43嗜肺軍團(tuán)菌 GATGATAATTCCTACAAGGTATC44/44嗜肺軍團(tuán)菌 AGCAGCCGAAGTCATCATGACAG45/45嗜肺軍團(tuán)菌 TGTAGATATTCATAAAGAAGAAG46/46嗜肺軍團(tuán)菌 ATACAGATGATGGAACCGGTTTG47/47嗜肺軍團(tuán)菌 CAGATGATGGAACCGGTTTGCAT48/48壞死梭桿菌 CAACATCAGCCAGGGGATTACAT4g/49壞死梭桿菌 GGAATTCCAGTAGACATACATCC50/50壞死梭桿菌 TGAAAATGATAACTATAAAGTGTC表4B.ParE寡核苷酸序列寡核苷酸/SEQ.IDNR，特異性(parE基因)序列(5′-3′)1/51 金黃色葡萄球菌 CGGTAACGAAATAGATGTAACAA2/52 金黃色葡萄球菌 AGAAGATAATGGACGTGGTATGC3/53 金黃色葡萄球菌 GTAAACCGACAGTCGAAGTTATC4/54 金黃色葡萄球菌 CAACTGATAAACGGGGATTACATC5/55 金黃色葡萄球菌 GGACAAGGCGGCTATAAAACTTC6/56 化膿性鏈球菌TGGAGATGATATTAAGGTTGTTA7/57 化膿性鏈球菌GTCAGTGTGGCAGATAGCGGACG8/58 化膿性鏈球菌GGATTCCCACCGTTCAAGTTATT9/59 化膿性鏈球菌CAACAGATGCTACGGGATTGCAC
10/60化膿性鏈球菌GGTCAGGGTGGCTACAAAACGTC11/61肺炎鏈球菌 TGGTGATCGTATTGATGTAACTA12/62肺炎鏈球菌 CTAACGGTTCAAGACCATGGACG13/63肺炎鏈球菌 GAATTCCAACTGTTGAGGTTATC14/64肺炎鏈球菌 CGACCGATGGCGCTGGTCTTCAT15/65肺炎鏈球菌 GGTCAAGGTGGCTATAAGACATC16/66肺炎支原體 TGCTAATACTATTGCCGTTGTTT17/67肺炎支原體 ATAACTGTTAGTGACAACGGTCG18/68肺炎支原體 AGATTTCTACGATTGACACCGTC19/69肺炎支原GATAACGATTCTTATAAGATTGC實施例4.擴(kuò)增分離于病人樣品的DNA使用下列所述的常規(guī)方法，對分離于細(xì)菌培養(yǎng)分離物或臨床病人樣品的DNA進(jìn)行擴(kuò)增。
使用QlAamp DNA迷你試劑盒(Qiagen，Germany)，從樣品(細(xì)菌培養(yǎng)物或臨床病人樣品)中分離用于分析的DNA。當(dāng)分離了DNA時，使用不對稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增需要的靶鏈。在擴(kuò)增的第一時期中，將分離于樣品的DNA、廣范圍gB1F和gB2R引物混合物(實施例1)和擴(kuò)增中需要的其他組分一起混和，來制備反應(yīng)液。
PCR反應(yīng)混和液含有32pmol的gB2R引物混合物，8pmol的gB1F引物混合物，各為200μM的dATP、dGTP、和dTTP以及140μM的dCTP(Sigma，USA)，1×Hot Start Taq PCR緩沖液(Qiagen，Germany)，其中添加MgCl2直至終濃度為2.8mM，25nmol的Cy5-AP3-dCTP(Amersham Pharmacia Biotech，USA)，7.5％DMSO(Amersham Pharmacia Biotech，USA)，2.5單位的Hot Start Taq DNA聚合酶(Qiagen，Germany)，和2.5μl分離的DNA，總體積為25μl。
使用GenAmp PCR系統(tǒng)2700熱循環(huán)儀(Applied Biosystems，USA)進(jìn)行PCR。使用下列PCR程序變性步驟是95℃15分鐘，40循環(huán)的94℃1分鐘、50℃1分鐘、72℃1分鐘，最后延伸步驟是72℃10分鐘。完成PCR后，使用含有溴化乙錠的2％瓊脂糖凝膠，通過凝膠電泳檢驗成功的擴(kuò)增。此后，使用QlA快速PCR純化試劑盒(Qiagen，Germany)通過除去多余的引物、核苷酸、緩沖液和聚合酶，純化Cy5標(biāo)記的PCR產(chǎn)物。
實施例5.樣品微陣列的設(shè)計和功能在5’末端氨化的寡核苷酸探針(根據(jù)實施例3設(shè)計)溶于400mM碳酸鈉緩沖液(pH 9.0)，直至終濃度50μM。探針共價結(jié)合到氨基硅烷包埋的顯微鏡載玻片(Genorama，Asper Biotech Ltd.，Estonia)上。使用為本目的研制的自動裝置(OmniGrid，GeneMachines，USA)和定位針(Telechem SMP3，USA)，將探針轉(zhuǎn)移至載玻片上。印刻探針的面積的平均大小是120μm。此外，將5’末端氨化的陽性對照引物印刻到載玻片上。印刻后，為了將探針吸附于載玻片，將微陣列載玻片在氨蒸汽中保存1小時。在氨處理后，使用無菌水將載玻片洗滌三次并干燥。
其次，將Cy-5標(biāo)記的靶鏈(根據(jù)實施例4制備)雜交到吸附探針的微陣列載玻片上。雜交反應(yīng)混和液含有約200-300ng靶鏈、20×SSC(1μl的20×SSC含有175.3g NaCl和88.2g檸檬酸鈉，使用HCl調(diào)節(jié)pH至7.0；終濃度是3.4×)、20％十二烷基硫酸鈉(SDS)(終濃度0.3％)、和無菌水，直至反應(yīng)混和液體積為37μl。首先在95℃將混和液變性3分鐘。此后立刻將試管置于冰上?；旌鸵豪鋮s后，用移液槍將混和液吸取至蓋玻片上，所述蓋玻片相對吸附探針的載玻片而放置。微陣列玻片放在雜交盒(Arraylt，TeleChem International，USA)中，并緊閉雜交盒。最后，雜交盒浸入水浴中。微陣列玻片于57℃雜交12-16小時。
雜交后，為了除去非雜交的DNA，在三次不同的洗液中洗滌微陣列玻片。如下列進(jìn)行洗滌步驟在0.1％SDS溶液中57℃5分鐘，在0.1％SDS、0.5×SSC的洗液中室溫5分鐘，并在0.06×SSC中室溫5分鐘。
在玻片干燥后，使用微陣列掃描儀(Agilent DNA MicroarrayScanner，Agilent，USA)分析它們。如果Cy5-標(biāo)記的靶鏈結(jié)合一個或幾個探針，這些位點發(fā)出熒光信號。此外，陽性對照探針也發(fā)出熒光信號。
圖2顯示雜交結(jié)果的實例。分離于金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的培養(yǎng)分離物的gyrB DNA片段(不對稱Cy5標(biāo)記的PCR產(chǎn)物)作為靶鏈。玻片實例包括特異于金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(表4B寡核苷酸22-25)的四條gyrB寡核苷酸。它們?nèi)刻禺惤Y(jié)合金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的靶鏈并且發(fā)出熒光信號。此外，五種陽性對照寡核苷酸發(fā)出熒光信號。
實施例6.病人樣品的分析從患有呼吸道感染的病人中獲得的臨床樣品中分離DNA，并使用實施例4描述的方法進(jìn)行擴(kuò)增。使用附著了探針和陽性對照寡核苷酸(表4A和4B所列的)的微陣列玻片(實施例5中描述的)測試樣品。如Nikkkari等(Emerging Infectious Diseases，vol 8，nro 2，2002，s.188-194)和Kotilainen等(Journal of Clinical Microbiology，vol 36，nro8，1998，s.2205-2209)以前描述，也可使用基于廣范圍PCR的方法分析相同的樣品，在廣范圍細(xì)菌PCR方法中使用起源于16SrRNA基因區(qū)的廣范圍引物。在先前的出版物中，它們被命名為fD1mod和16S1RR-B引物?？寺〔y序PCR產(chǎn)物。將DNA序列與公開序列數(shù)據(jù)庫(GenBank)進(jìn)行比較，從而鑒定該細(xì)菌的種。表5顯示該結(jié)果。
從表5可以得知，當(dāng)與常規(guī)廣范圍PCR方法進(jìn)行比較時，使用本發(fā)明的方法獲得的結(jié)果完全相同。實施本發(fā)明限定的方法更加快速，因此約一天內(nèi)能得到結(jié)果。另一方面，實施廣范圍細(xì)菌PCR，包括耗時的克隆和測序步驟，平均需要約一周。與培養(yǎng)測試比較，本發(fā)明的方法和廣范圍細(xì)菌PCR與培養(yǎng)法一樣靈敏，甚至在一些情形中更加靈敏。
表5.在使用病人樣品的不同方法中的比較
F.N.＝壞死梭桿菌(Fusobacterium necrophorum)S.P.＝肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)H.I.＝流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)M.C.＝粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)1)分離于患有肺炎的病人的樣品，未進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)和廣范圍PCR，只有本發(fā)明的方法得以實施。使用該方法，從樣品中可發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)。該結(jié)果與臨床圖片一致，因為該細(xì)菌的種是一種最普通的肺炎病原體。
實施例7.本發(fā)明的方法與基于特異寡核苷酸的已知方法的比較正常菌群的細(xì)菌會干擾多種細(xì)菌病原體的鑒定。細(xì)菌的存在對于人生物體的健康是必要的，據(jù)估計有幾百種不同的細(xì)菌屬于人正常菌群。因此，在一些情況中普通細(xì)菌叢能干擾細(xì)菌的診斷。
本發(fā)明方法的特異性，其中用到特異性gyrB/parE寡核苷酸探針，相對于正常菌群得以研究。同時，該方法與廣范圍和種特異性引物的混合物用于擴(kuò)增的多重PCR方法進(jìn)行比較。
從正常菌群輕鏈球菌(Streptococcus mitis)、口腔鏈球菌(Streptococcus oralis)、豬莫拉氏菌(Moraxella caviae)、和Moraxellacuniculi的培養(yǎng)分離物中分離DNA。此后，使用實施例4中描述的方法擴(kuò)增分離的DNA，并使用附著特異性探針(表4A和4B)的微陣列玻片(實施例5中描述的)測試分離的DNA。作為對比，在Hendolin等(Journal of Clinical Microbiology，35；11，1997)的出版物中描述的特異性PCR引物得以合成，并使用該出版物中描述的方法進(jìn)行多重PCR的變體。在常規(guī)多重PCR方法的變體中，起源于l6SrRNA的共有基因區(qū)的廣范圍引物用作一個PCR引物，由四條不同細(xì)菌的種特異引物組成的引物混和物用作另一條PCR引物。用于診斷引物對的細(xì)菌的種是Alloiococcus otitidis、流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)、粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)、和肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)。設(shè)計細(xì)菌的種特異引物以致于擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物長度取決于其從中分離的細(xì)菌的種不同。表6顯示該結(jié)果。
結(jié)果表明使用本發(fā)明的方法，其中用到特異寡核苷酸探針，只有合意的細(xì)菌的種得以特異性鑒定。相反，已知方法和多重PCR方法定義的特異引物不能從所研究的普通細(xì)菌叢中辨別合意的細(xì)菌，因此特異性不足(圖3)。
表6.本發(fā)明的方法與多重PCR方法的比較
*)4A表示表4A和4B表4B。數(shù)字(如10至14)指在前文提及的表中的寡核苷酸編號。特異性指寡核苷酸探針為何種細(xì)菌的種設(shè)計。
序列表<110>MoBiDiag Oy<120>來自拓?fù)洚悩?gòu)酶基因區(qū)域的核酸探針和廣范圍引物，以及使用它們的方法<130>2022264PC continuation<160>77<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>23<212>DNA<213>肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)<400>1ctcaaaagaa ggtcttcacc atc 23<210>2<211>23<212>DNA<213>肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)<400>2gccatattca agtttttatt gag 23<210>3<211>23<212>DNA<213>肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)<400>3agccagatga ttcgattact gtt 23<210>4<211>23<212>DNA<213>肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400>4ttgagaccgt ctttacagtc ctt 23<210>5<211>23<212>DNA<213>化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)<400>5gttttgcctc tcatattaaa gtc 23<210>6<211>2<212>DNA<213>化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)<400>6tctttattga agcagataat tcc 23<210>7<211>23<212>DNA<213>化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)<400>7cgttgaaaca gtttttacag tct 23<210>8<211>23<212>DNA<213>肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae)<400>8ggtcttcatc atctagtcta tga 23<210>9<211>23<212>DNA<213>肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae)
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<400>64cgaccgatgg cgctggtctt cat 23<210>65<211>23<212>DNA<213>肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)<400>65ggtcaaggtg gctataagac atc 23<210>66<211>23<212>DNA<213>肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae)<400>66tgctaatact attgccgttg ttt 23<210>67<211>23<212>DNA<213>肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae)<400>67ataactgtta gtgacaacgg tcg 23<210>68<211>23<212>DNA<213>肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae)<400>68agatttctac gattgacacc gtc 23<210>69<211>23<212>DNA<213>肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae)
<400>69gataacgatt cttataagat tgc 23<210>70<211>294<212>DNA<213>粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)<400>70cgaccaggga tgtatattgg tgataccgat gatggtacag gcttgcacca tatggtgttt 60gaggtggtgg ataatgccat tgatgaggca ttggcaggtc actgtgatga gattaatatt 120atcgtccatg acgatgaatc tgtttcggtg atggactatg ggcgtggtat tcctgtggat 180atccaccctg aagaaggtgt atcagctgcc gaggttatta tgacggtgct tcatgcaggc 240ggtaaatttg atgataattc atacaaagta tctgggggcc tgcacggcgt agga294<210>71<211>257<212>DNA<213>嗜肺軍團(tuán)菌(Legionella pneumophila)<400>71ggggatacag atgatggaac cggtttgcat cacatggttt ttgaggttgt agataattca 60atagatgagt ctctggcagg atattgcaag gaaatttttg ttaccatcca tagcgatgag 120tcaattacag ttaaggacga tggccgtggt attcctgtag atattcataa agaagaaggc 180aaatcagcag ccgaagtcat catgacagtc ctacatgctg gaggtaaatt tgatgataat 240tcctacaagg tatctgg 257<210>72<211>290<212>DNA<213>壞死梭桿菌(Fusobacterium necrophorum)
<400>72cgcccaggga tgtacatcgg aacaacatca gccaggggat tacatcattt agtatgggaa 60gtggtagata attctgtgga tgaagcattt gctgggtatt gtaataggat tactgtaagt 120attttgcctg ataacattat tcaagtagag gataatggaa gaggaattcc agtagacata 180catccaaaat atggaaaatc cgctttggaa attgtattga cggtattaca tgctggggga 240aaatttgaaa atgataacta taaagtgtca ggtggactgc acggagttgg 290<210>73<211>291<212>DNA<213>輕鏈球菌(Streptococcus mitis)<220>
<221>misc_feature<222>(18)..(18)<223>n是a，t，c，或g<220>
<221>misc_feature<222>(288)..(288)<223>n是a，t，c，或g<400>73agtcccggga tgtacatngg gtcaacttca aaagaaggtc ttcaccatct agtctgggaa 60attgttgata actcaattga cgaggccttg gcaggatttg ctagccatat tcaagtcttt 120attgagccag ataattcgat tacagttgtt gatgatggac gtggtatccc agtcgatatt 180caggaaaaaa caggtcgacc tgccgttgag actgtcttta ctgttcttca cgctggagga 240aagtttggcg gtggcggata taaggtctca gacggtcttc atggcgtngg a 291<210>74<211>288<212>DNA<213>口腔鏈球菌(Streptococcus oralis)
<400>74agaccgggga tgtatattgg atcgaccgac ggtgctggtc tccatcatct agtctgggaa 60atcgtggata atgcggttga cgaagccttg tctggatttg gtgatcgcat cgatgtgacg 120attaataagg acgggagttt aacggttcaa gaccacggac gtgggatgcc aacgggaatg 180cacgccatgg gaattccaac tgttgaagtt atctttacca ttctccacgc tggagggaaa 240ttcggtcaag gtggctataa gacatctggt ggtctgcatg gggttgga 288<210>75<211>294<212>DNA<213>副流感嗜血菌(Haemophilus parainfluenzae)<400>75agaccgggga tgtatatcgg ggataccgat gatggaacag gcctacacca tatggtgttt 60gaggtggtgg ataacgctat cgatgaagcg cttgctggct attgttccga tattatcgtc 120actattcatg atgataattc tgtttccgta caagatgacg gccgcggtat tccggtagat 180attcacccag aagaaggggt ttctgcggca gaagcaatca tgacagtact tcacgcaggt 240ggtaaattcg atgataactc ttataaagta tcagggggac tacacggcgt tgga294<210>76<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<220>
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<223>引物<220>
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權(quán)利要求
1.用于檢測和鑒定臨床樣品中引起感染的細(xì)菌的種的診斷方法，其特征在于a)使用DNA引物的混合物，對分離于所述臨床樣品的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，其中所述混合物包含與來源于引起所述感染的細(xì)菌的種的拓?fù)洚悩?gòu)酶編碼基因，具體是gyrB/parE基因，的保守區(qū)的序列進(jìn)行雜交的序列，所述序列包含SEQ.ID.NR76和77描述的序列或其反向和/或其互補(bǔ)序列或其功能片段，b)將擴(kuò)增的DNA與合意的寡核苷酸探針序列組合進(jìn)行接觸，所述序列在常規(guī)雜交條件下，與位于所述的引起所述感染的細(xì)菌的種的拓?fù)洚悩?gòu)酶編碼基因，具體是gyrB/pare基因，的保守區(qū)附近的超變區(qū)雜交，該序列在該雜交條件下具有細(xì)菌的種特異性，和c)檢測可能的雜交復(fù)合物的信息。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的診斷方法，其特征在于所述引起感染的細(xì)菌的種是引起呼吸道感染的細(xì)菌的種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的診斷方法，其特征在于所述的超變區(qū)是選自于肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)、肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae)、肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae)、流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)、大腸桿菌(Escherichia coli)、粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)、嗜肺軍團(tuán)菌(Legionella pneumophila)、和壞死梭桿菌(Fusobacteriumnecrophorum)的細(xì)菌的種的gyrB和/或parE蛋白的編碼基因的超變區(qū)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項的診斷方法，其特征在于步驟b)中使用的寡核苷酸探針序列的長度是15-30，更優(yōu)選20-30，以及最優(yōu)選21-25核苷酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項的診斷方法，其特征在于所述寡核苷酸探針序列的組合包括SEQ.ID.NR1至69描述的序列，和/或反向或其互補(bǔ)序列，或其功能片段的全部或其部分。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的診斷方法，其特征在于所述寡核苷酸探針序列的組合包含SEQ.ID.NR1至69描述的所有序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項的診斷方法，其特征在于所述寡核苷酸探針序列的組合附著于固體支持物之上。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的診斷方法，其特征在于步驟a)中從臨床樣品分離的DNA通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)進(jìn)行擴(kuò)增，以及步驟b)中擴(kuò)增的DNA與附著于固體支持物之上的細(xì)菌的種特異性寡核苷酸探針進(jìn)行接觸。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8的診斷方法，其特征在于所述固體支持物是處理過的玻璃。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的診斷方法，其特征在于使用合適的標(biāo)記核苷酸用于擴(kuò)增步驟a)中從臨床樣品中分離的DNA，從而制備可檢測的靶鏈。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的診斷方法，其特征在于步驟b)中擴(kuò)增的和任選的標(biāo)記目的DNA與固體支持物接觸，所述支持物附著有所有SEQ.ID.NR1至69描述的序列和/或反向或其互補(bǔ)序列的細(xì)菌的種特異性寡核苷酸探針。
12.根據(jù)權(quán)利要求10的診斷方法，其特征在于步驟b)中擴(kuò)增的和任選的標(biāo)記目的DNA與固體支持物接觸，所述支持物附著用于檢測引起感染的一種特異細(xì)菌的種或幾種特異細(xì)菌的種特異性寡核苷酸探針序列，所述序列是選自于表4A和4B顯示的序列和/或反向或其互補(bǔ)序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12任一項的診斷方法，其特征在于步驟c)中使用微陣列技術(shù)。
14.DNA引物混合物，其特征在于包含與引起所述感染的細(xì)菌的種的拓?fù)洚悩?gòu)酶具體是gyrB和/或parE蛋白的編碼基因的保守區(qū)的序列雜交的序列，所述細(xì)菌的種具體是引起呼吸道感染的細(xì)菌的種，所述混合物包含SEQ.ID.NR76和77描述的序列和/或反向或其互補(bǔ)序列或其功能片段。
15.用于診斷引起感染的細(xì)菌的種的寡核苷酸序列，其特征在于在常規(guī)雜交條件下它與超變區(qū)的序列雜交，所述超變區(qū)是細(xì)菌的種特異性的、并位于拓?fù)洚悩?gòu)酶，具體是gyrB和/或parE蛋白，的編碼基因的保守區(qū)附近，所述寡核苷酸序列是與SEQ ID.NR1至69描述的一種序列和/或其反向、其互補(bǔ)序列或其功能片段。
16.用于診斷引起感染的細(xì)菌的種的寡核苷酸探針序列的組合，其特征在于包括SEQ ID.NR1至69描述的序列和/或反向或其互補(bǔ)序列或其功能片段的任意組合。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的寡核苷酸探針的組合，其特征在于包括SEQ ID.NR1至69描述的所有序列。
18.根據(jù)權(quán)利要求16或17的寡核苷酸探針的組合用于檢測、鑒定或分類引起感染的細(xì)菌的種的用途。
19.位于那些引起感染的細(xì)菌的種的拓?fù)洚悩?gòu)酶基因，具體是gyrB和/或parE蛋白的編碼基因的保守區(qū)附近的超變序列的作為細(xì)菌的種特異雜交探針的用途。
20.權(quán)利要求19的用途，其特征在于所述引起感染的細(xì)菌的種是引起呼吸道感染的細(xì)菌的種。
21.用于診斷細(xì)菌引起的感染特別細(xì)菌引起呼吸道感染的診斷試劑盒，其特征在于包括a)DNA引物混合物，其包含與引起感染的細(xì)菌的種具體是引起呼吸道感染的細(xì)菌的種的拓?fù)洚悩?gòu)酶，具體是gyrB和/或parE蛋白，的編碼基因的保守區(qū)的序列雜交的序列，所述混合物包含SEQ.ID.NR76和77描述的序列和/或反向或其互補(bǔ)序列或其功能片段，如本發(fā)明以上定義，b)細(xì)菌的種特異性寡核苷酸探針序列的復(fù)合物，任選附著在固體支持物之上，包括SEQ.ID.NR1至69描述的序列和/或反向或其互補(bǔ)序列或其功能片段的任意組合，c)陽性和任選的陰性對照探針序列，和任選的d)擴(kuò)增、雜交、純化洗滌，和/或檢測步驟中需要的試劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于鑒定細(xì)菌的種和診斷細(xì)菌感染的核酸探針和廣范圍引物。具體地，本發(fā)明涉及來源于位于引起感染的細(xì)菌的拓?fù)洚悩?gòu)酶基因的保守序列附近的超變區(qū)的特異核酸探針。本發(fā)明還涉及來源于拓?fù)洚悩?gòu)酶基因的保守區(qū)的廣范圍引物。具體地，該引物來源于gyrB和/或parE蛋白的編碼基因的保守區(qū)。此外，本發(fā)明涉及這些核酸探針和廣范圍引物用于診斷細(xì)菌感染的用途以及使用這些核酸探針和廣范圍引物的診斷方法。
文檔編號C12N15/11GK1735694SQ200380108410
公開日2006年2月15日 申請日期2003年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月19日
發(fā)明者斯蒂納·羅特, 雅里·雅拉瓦, 西莫·尼卡里 申請人:莫比迪亞格公司