一種2?取代芳乙烯基?n?甲基化喹啉衍生物在制備抗腫瘤藥物中的應用
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種2?取代芳乙烯基?N?甲基化喹啉衍生物在制備抗腫瘤藥物中的應用，所述衍生物結構式如式I所示；其中，R為氫、五元或六元含氮雜環(huán)基；所述R中任意一個或多個氫被取代，取代基選自烷基、羥基、胺基。本發(fā)明所述2?取代芳乙烯基?N?甲基化喹啉衍生物是一種新型的Top II催化型抑制劑，具有更低的毒副作用，其對抗腫瘤具有普適性。本發(fā)明所述衍生物對多種癌細胞株，具有顯著的抑制作用，抑制活性在0.2?16μM，絕大部分化合物的活性優(yōu)于陽性對照VP?16，在制備新型的抗腫瘤藥物方面具有良好的應用前景。式I。
【專利說明】
一種2-取代芳乙烯基-N-甲基化喹啉衍生物在制備抗腫瘤藥 物中的應用
技術領域
[0001 ]本發(fā)明屬于藥物與有機合成技術領域，更具體地，涉及一種2-取代芳乙烯基-N-甲 基化喹啉衍生物在制備抗腫瘤藥物中的應用。
【背景技術】
[0002] 拓撲異構酶(Topisomerase，Top)II是一類在細胞內(nèi)普遍存在，解決DNA在復制、轉 錄、和染色體分離中產(chǎn)生的拓撲問題的酶，其作為一個重要的藥物靶點在抗腫瘤藥物研發(fā) 中被廣泛關注。
[0003] 據(jù)研究，喹啉類生物堿具有多種生理活性。包括抗微生物、抗腫瘤、抗氧化等。二苯 乙烯類化合物也同樣具有良好的生物活性和低毒性，例如白藜蘆醇就是這樣一個例子，有 鑒于此，我們喹啉環(huán)的2-位引入芳乙烯基，并在4-位引入不同的胺鏈考察對抗腫瘤活性的 影響，研究他們在抗腫瘤方面的應用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明根據(jù)現(xiàn)有技術中的不足，提供了一種2-取代芳乙烯基-N-甲基化喹啉衍生 物在制備抗腫瘤藥物中的應用。
[0005] 本發(fā)明的技術目的通過以下技術方案實現(xiàn)：
[0006] 本發(fā)明提供了一種2-取代芳乙烯基-N-甲基化喹啉衍生物在制備抗腫瘤藥物中的 應用，所述衍生物結構式如式I所示，
[0007]
式I;
[0008] 其中，R為氫、五元或六元含氮雜環(huán)基；
[0009]所述R中任意一個或多個氫被取代，取代基選自烷基、羥基、胺基。
[0010] 本發(fā)明在喹啉環(huán)的2-位引入芳乙烯基，并在4-位引入不同的胺鏈，同時發(fā)現(xiàn)當2-位引入N-乙基咔唑基，喹啉N季銨化后抗腫瘤活性得到大幅提高，因此作為一類活性較高的 抗腫瘤物質。
[0011] 優(yōu)選地，R為氫、六元含氮雜環(huán)基或六元含氮氧雜環(huán)基;所述R中任意一個或多個氫 被取代，取代基選自Cp5烷基、羥基、胺基。
[0012] 優(yōu)選地，R為氫、甲基哌嗪基、哌啶基、嗎啉基、羥乙基哌嗪基、二甲氨基乙基哌嗪基 或二甲氨基丙基哌嗪基。
[0013] 優(yōu)選地，所述抗腫瘤藥物為抗宮頸癌、乳腺癌、肝癌或淋巴癌的藥物。
[0014] 優(yōu)選地，所述藥物劑型為注射劑、片劑、丸劑、膠囊劑、懸浮劑或乳劑。
[0015]本發(fā)明同時提供一種2-取代芳乙烯基-N-甲基化喹啉衍生物在制備抑制拓撲異構 酶II活性的藥物中的應用，所述衍生物結構式如式I所示，
[0016]
式I;
[0017]其中，R為氫、五元或六元含氮雜環(huán)基；
[0018] 所述R中任意一個或多個氫被取代，取代基選自烷基、羥基、胺基。
[0019] 優(yōu)選地，R為氫、六元含氮雜環(huán)基或六元含氮氧雜環(huán)基；
[0020] 所述R中任意一個或多個氫被取代，取代基選自烷基、羥基、胺基。
[0021] 優(yōu)選地，R為氫、甲基哌嗪基、哌啶基、嗎啉基、羥乙基哌嗪基、二甲氨基乙基哌嗪基 或二甲氨基丙基哌嗪基。
[0022]本發(fā)明在喹啉環(huán)的2-位引入芳乙烯基，并在4-位引入不同的胺鏈，同時發(fā)現(xiàn)當2-位引入咔唑基是必不可少的，當咔唑基換成苯基或取代苯基，對Top II的抑制活性將降低。 [0023]本發(fā)明所述化合物對多種細胞株，具有顯著的抑制作用，抑制活性在0.2_16μΜ，絕 大部分化合物的活性優(yōu)于陽性對照VP-16。
[0024] Top II抑制劑分為Top II毒劑和催化型抑制劑，前者抑制酶的活性通過與酶形成 酶-藥物-DNA三元復合物，促進DNA往形成斷裂中間體的方向進行，由于斷裂DNA會誘導機體 對DNA進行修復和重組，可能會產(chǎn)生耐藥性和基因毒性，因此Top II毒劑往往具有較大的毒 性和副作用，代表性藥物如VP-16。而Top II催化型抑制劑由于不形成斷裂DNA因此具有更 低的毒性和副作用，為目前Top II抑制劑研究的熱點方向。我們的實驗證明，本發(fā)明所公開 的新型2-取代芳乙烯基-N-甲基化喹啉衍生物在體外實驗中，SPS-L3在10μΜ時可以完全抑 制Top II對超螺旋DNA的解旋作用，遠高于陽性對照VP16(et〇p〇Side)的抑制濃度（50μΜ)。 而且與傳統(tǒng)的Top II毒劑不同，2-取代芳乙烯基-N-甲基化喹啉衍生物不會形成酶-DNA-藥 物三元復合物，不會產(chǎn)生斷裂DNA。
[0025] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
[0026] (1)所合成的系列化合物證明咔唑基是必不可少的，當咔唑基換成苯基或取代苯 基，對Top II的抑制活性將降低。
[0027] (2)本發(fā)明提供的化合物對多種細胞株，具有顯著的抑制作用，抑制活性在0.2-16 μΜ，絕大部分化合物的活性優(yōu)于陽性對照VP-16。在制備新型的抗腫瘤藥物方面具有良好的 應用前景。因此本發(fā)明所述的2-取代芳乙烯基-N-甲基化喹啉衍生物可用于制備抗癌的藥 物。
[0028] (3)本發(fā)明2-取代芳乙烯基-N-甲基化喹啉衍生物是一種新型的Top II催化型抑 制劑，具有更低的毒副作用。另外，Top II在腫瘤細胞中普遍高表達，已成為腫瘤治療的重 要靶標，我們的化合物證明對Top II有效，說明其抗腫瘤具有普適性。
【附圖說明】
[0029] 圖1.SPS-L3抑制Top II對pBR322超螺旋質粒DNA的解旋實驗圖。
[0030] 圖2.SPS-L3對Top II的斷裂DNA實驗影響圖。
【具體實施方式】
[0031] 下面通過說明書附圖和實施例對本發(fā)明進行具體描述，有必要在此指出的是本實 施例只用于對本發(fā)明進行進一步說明，但不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制，該領域的 技術熟練人員可以根據(jù)上述本發(fā)明的內(nèi)容作出一些非本質的改進和調(diào)整。
[0032] 除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設備為本技術領域常規(guī)試劑、方法和設 備。
[0033]化合物的合成，參照專利黃志紓，古練權，劉真權等，一種2-取代芳乙烯基-N-甲基 化喹啉衍生物的制備及其在抗阿爾茲海默癥藥物中的應用，申請?zhí)?013102680611。
[0034] 實施例1:本專利所述2-取代芳乙烯基-N-甲基化喹啉衍生物對Top II ATPase抑 制作用
[0035]因為我們目標是為了獲得Top II的催化型抑制劑，如果用全酶篩選，無法區(qū)分所 得到的化合物是催化型抑制劑還是毒劑，所以我們在篩選時采用重組的酶，僅僅是Top II 的ATPase部分，去掉了和DNA結合的C端和中間的催化區(qū)，這樣可以有效的排除形成酶-藥 物-DNA三元復合物機制的影響，篩選所得到的化合物再進行其他實驗的驗證和確證。
[0036] 孔雀綠-磷鉬酸銨比色法檢測化合物對Top II ATPase抑制活性，選用384孔板直 接配制15yL的篩選體系，依次加入ddH2〇，5 X ATPase reaction buffer，ATPase，待測化合 物，ATP。振蕩器上震蕩30s，轉移至37°C烘箱孵育一定時間（Top II ATPase孵育時間為 45min)，每孔加入40yL現(xiàn)配的孔雀綠試劑和5yL34%檸檬酸鈉，混勻，靜置15min后使用酶標 儀測定樣品在620nm下的紫外吸光度（0D值），根據(jù)OD值的變化計算得到待測化合物的 ATPase抑制活性。其中，每次加入Iyg的Top II ATPase，被測試化合物終濃度為100μΜ，ΑΤΡ 的終濃度為ImM。陽性對照為I，4_萘醌
[0037] 結果如表1所示，只有芳基為N-乙基取代咔唑基的化合物（SPS-L1~L7)才顯示明 顯的Top II ATPase抑制活性，100μΜ下，抑制活性66-86%，比陽性對照1，4-萘醌（100μΜ， 62%抑制率)還要高。苯環(huán)或取代苯環(huán)，吲哚基的活性不佳，而喹啉環(huán)的4位氨基取代則有很 大的基團寬容度，受取代胺基種類影響較小。
[0038] 表1. 2-取代芳乙烯基-N-甲基化喹啉衍生物對TopII ATPase抑制活性



[0043] 實施例2:本專利所述2-取代芳乙烯基-N-甲基化喹啉衍生物對Hela，MCF_7，HepG2 實體瘤腫瘤細胞株(貼壁細胞)的的抑制作用
[0044] 我們將初篩中對Top II ATPase抑制活性大于50%的化合物(SPS-Ll~L7)進行細 胞水平的活性驗證，以MTT法測試化合物的抗腫瘤活性，選取的細胞株包括Hela，MCF-7， HepG2實體瘤細胞株。取對數(shù)生長期的相應細胞株的細胞懸液(經(jīng)0.25 %胰蛋白酶消化使細 胞脫落)〇. 5-1.0 X 105/ml，分裝于96孔培養(yǎng)板中，150yL/孔，培養(yǎng)24小時，待細胞貼壁后，分 別加入50yL相應不同濃度的藥物或試液，實驗設陰性對照組（生理鹽水）、陽性對照組 (VP16)和6個不同濃度給藥組。每組設4個平行孔。置恒溫5 % C〇2培養(yǎng)箱37 °C培養(yǎng)48小時，在 實驗結束前4小時每孔加入20yL MTT液（5mg/ml)，4小時后吸棄培養(yǎng)液，每孔加入0.1ml DMSO，平板搖床震搖。5分鐘待結晶溶解后置酶聯(lián)檢測儀，于570nm波長測各孔的OD值，按下 列公式求生長抑制率，并用Bliss法求出半數(shù)抑制濃度IC 50。
[0045] 藥物對腫瘤細胞抑制率=(1-用藥組平均OD值/對照組平均OD值）X 100%。
[0046]結果如表2所示。所有化合物對三株腫瘤細胞Hela，MCF-7，HepG2顯示很強的抗腫 瘤活性，優(yōu)于陽性對照VP16。
[0047]表2 ·化合物SPS-Ll ~L7對He la ,MCF-7，HepG2和CA-46腫瘤細胞的 IC5Q (MTT，μΜ)
[0049]實施例3:本專利所述2-取代芳乙烯基-N-甲基化喹啉衍生物對CA-46腫瘤細胞株 (懸浮細胞)的的抑制作用
[0050]取對數(shù)生長期的相應細胞株的細胞懸液0.5-1 .OX 105/ml，分裝于96孔培養(yǎng)板中， 150μ!7孔，培養(yǎng)24小時，分別加入50yL相應不同濃度的藥物或試液，實驗設陰性對照組(培 養(yǎng)基）、陽性對照組(VP16)和6個不同濃度給藥組。每組設3個平行孔。置恒溫5%⑶ 2培養(yǎng)箱 37°C培養(yǎng)48小時，在實驗結束前4小時每孔加入20yL MTT液(2.5mg/ml)，4小時后每孔加入 0.1ml三聯(lián)液，平板搖床震搖。5分鐘待結晶溶解后置酶聯(lián)檢測儀，于570nm波長測各孔的OD 值，按下列公式求生長抑制率，并用Bliss法求出半數(shù)抑制濃度IC50。
[0051 ] 藥物對腫瘤細胞抑制率=(1-用藥組平均OD值/對照組平均OD值）X 100%。
[0052]通過對體外細胞毒實驗測試了化合物的抗腫瘤活性，結果如表2所示本專利所述 化合物在體外對腫瘤細胞株CA-46具有較強的抑制作用。
[0053]實施例4:本專利所述2-取代芳乙烯基-N-甲基化喹啉衍生物對Top II抑制作用 [0054] 在上述實施例2和3初步酶學水平和細胞水平篩選的基礎上，選擇對Top II ATPase有抑制活性的化合物對Top II全酶進行抑制活性實驗，以確證化合物的對Top II的 抑制活性。采用PBR322質粒松散法進行細胞體系外拓撲異構酶活性測定。其中重組人拓撲 異構酶II購于TopoGEN公司。將IU的拓撲異構酶與待測藥物（終濃度20，10，5，2.5，1.25， 0.625μΜ)以及0.2yg超螺旋pBR322質?；旌霞尤胪負洚悩嬅妇彌_液中，37°C水浴孵育30分 鐘后進行瓊脂糖凝膠電泳，GelRed染色后利用凝膠成像儀進行檢測。結果如圖1所示，本專 利所述的化合物在濃度為1 〇μΜ時可以完全抑制Top 11的活性，遠高于陽性對照VP16 (etoposide)的抑制濃度(50μΜ)。因此，本專利所述2-取代芳乙烯基-N-甲基化喹啉衍生物 可用于制備以拓撲異構酶為靶點的抗癌藥物。
[0055] 實施例5:本專利所述2-取代芳乙烯基-N-甲基化喹啉衍生物對Top II介導的DNA 斷裂實驗
[0056]該實驗可以檢測化合物抑制酶的活性過程是否有斷裂DNA產(chǎn)生，是屬于毒劑還是 催化型抑制劑。
[0057] 1.配制1 %的瓊脂糖凝膠及5 X Top II buffer，隨后使用ddH20稀釋化合物及配置 0 · 1μg/μL的pBR322DNA溶液。
[0058] 2.迅速從-80°C冰箱中取出購買回來的Topo II(濃度為20U/yL)并用CldH2O稀釋得 到濃度為5U/yL的Topo II溶液，置于冰上待用。
[0059] 3.在20yL的反應體系中分別加入2yL的pBR322DNA溶液，2yL的Topo II溶液，2yL的 化合物溶液，4yL的5XTopo II buffer，并用CldH2O補全體積。
[0060] 4.配制好樣品后，立即放入37 °C水浴中孵育6min。
[0061 ] 5.依次加入IyL 10%SDS，2yL 250mM NaEDTA(pH8.0)以及2yL 0.8mg/mL的蛋白酶 1(。45°(：水浴中孵育3〇1^11。
[0062] 6.樣品與5yL 6Xloading buffer混合后70°C水浴孵育2min。取12yL加入瓊脂糖 凝膠的樣品孔中，65V電壓下進行電泳lh。
[0063] 7.電泳完畢后，將瓊脂糖凝膠放入含有Gel-Red的I XTAE染色液中染色0.5h，再在 65V電壓下進行電泳lh，凝膠成像儀中拍照。
[0064] 實驗結果如圖2顯示，陽性對照VP16產(chǎn)生明顯的缺口DNA(N)及線性DNA(L)，這都是 DNA斷裂的條帶，而我們的化合物SPS-L3不僅無斷裂條帶的產(chǎn)生，而且還會減少VP16斷裂條 帶的產(chǎn)生，本發(fā)明同時在除SPS-L3其他化合物中均發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象，說明該系列化合物是一典 型的Top II催化型抑制劑。
【主權項】
1. 一種2-取代芳乙締基-N-甲基化哇嘟衍生物在制備抗腫瘤藥物中的應用，其特征在 于，所述衍生物結構式如式I所示，式I; 其中，R為氨、五元或六元含氮雜環(huán)基； 所述R中任意一個或多個氨被取代，取代基選自烷基、徑基、胺基。2. 根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于，R為氨、六元含氮雜環(huán)基或六元含氮氧雜環(huán) 基;所述R中任意一個或多個氨被取代，取代基選自Cl-5烷基、徑基、胺基。3. 根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于，R為氨、甲基贓嗦基、贓晚基、嗎嘟基、徑乙 基贓嗦基、二甲氨基乙基贓嗦基或二甲氨基丙基贓嗦基。4. 根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于，所述抗腫瘤藥物為抗宮頸癌、乳腺癌、肝癌 或淋己癌的藥物。5. 根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于，所述藥物劑型為注射劑、片劑、丸劑、膠囊 劑、懸浮劑或乳劑。6. -種2-取代芳乙締基-N-甲基化哇嘟衍生物在制備抑制拓撲異構酶II活性的藥物 中的應用，其特征在于，所述衍生物結構式如式I所示，式I; 其中，R為氨、五元或六元含氮雜環(huán)基； 所述R中任意一個或多個氨被取代，取代基選自烷基、徑基、胺基。7. 根據(jù)權利要求6所述的應用，其特征在于，R為氨、六元含氮雜環(huán)基或六元含氮氧雜環(huán) 基； 所述R中任意一個或多個氨被取代，取代基選自Cl-5烷基、徑基、胺基。8. 根據(jù)權利要求6所述的應用，其特征在于，R為氨、甲基贓嗦基、贓晚基、嗎嘟基、徑乙 基贓嗦基、二甲氨基乙基贓嗦基或二甲氨基丙基贓嗦基。
【文檔編號】A61K31/4709GK106074551SQ201610480497
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月23日
【發(fā)明人】黃世亮, 黃志紓, 古練權, 麥燕雯, 劉真權
【申請人】中山大學