一種新型芽孢桿菌阿拉伯糖異構(gòu)酶基因的克隆表達及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種心阿拉伯糖異構(gòu)酶基因，尤其是一種芽抱桿菌BacillusSP.SYBC hb化-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因的克隆表達及應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] k阿拉伯糖異構(gòu)酶巧C5. 3. 1. 4,kArabinoseIsomerase,kAI)，能轉(zhuǎn)化k阿拉 伯糖成k核酬糖，也能轉(zhuǎn)化D-半乳糖成D-塔格糖。k阿拉伯糖異構(gòu)酶與k核酬糖激酶 和k核酬糖5-憐酸4-差向異構(gòu)酶的共同作用，在半纖維素乙醇業(yè)中也將有重要的用途。 研究發(fā)現(xiàn)，k阿拉伯糖異構(gòu)酶廣泛存在于各種微生物中，如常溫微生物。嗜熱微生物、嗜酸 微生物、甚至一些極端微生物中。但是在天然菌株中所含的基因一般都是單拷貝、酶的產(chǎn)量 甚微，因此本發(fā)明的第二個目的是提供一種高產(chǎn)k阿拉伯糖異構(gòu)酶的重組大腸桿菌及其 構(gòu)建、表達方法，W提高k阿拉伯糖異構(gòu)酶的產(chǎn)量，實現(xiàn)其在工業(yè)中的廣泛運用。
[0003] 測定k阿拉伯糖異構(gòu)酶活力的方法主要是測定單位時間產(chǎn)物的生成量，有報道 的k阿拉伯糖異構(gòu)酶活力的測定方法主要有兩種：
[0004] (1)高效液相法。采用高效液相法測定酶反應(yīng)的產(chǎn)物塔格糖的含量，是一種準確度 很高的方法，但是分析成本較高，時間長，在需要大量數(shù)據(jù)時，運種方法不是很實用。
[O(K)日](2)比色法。比色法測定k阿拉伯糖異構(gòu)酶活力主要是根據(jù)Dische所介紹的半 脫氨酸-巧挫法，根據(jù)實際情況稍作改進。與高效液相法相比，比色法更具方便、快速、成本 低等優(yōu)點。
[0006] k阿拉伯糖異構(gòu)酶可W催化D-半乳糖成D-塔格糖，D-塔格糖是一種功能性的甜 味劑，可W減少肥胖癥的發(fā)生，具有低能量、降低血糖、改善腸道菌群、抗離齒等功能，并能 抑制可卡因等物質(zhì)對肝細胞的毒害作用。
[0007] 甜味劑是一類十分重要的食品添加劑，不同的甜味劑具有不同的甜味和功能特 性，對產(chǎn)品的色澤、香味、形態(tài)、質(zhì)構(gòu)、和保存起著極其重要的影響。隨著人們的物質(zhì)生活水 平不斷提高，由肥胖引起的生理功能障礙的人越來越多，我國2000年糖尿病患者達到1400 萬。面對運些生理功能失調(diào)的人們，只能提供給他們低熱量食品，因此開發(fā)安全、低熱量、低 吸收品種甜味劑具有較大的市場優(yōu)勢。目前應(yīng)用于市場的有低聚糖包括異構(gòu)化乳糖、低聚 果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、山梨糖、大豆低聚糖等。糖醇類主要有木糖醇、山梨糖醇、甘露 糖醇、乳糖醇等，運些物質(zhì)熱量低、不刺激膜島素分泌，緩解糖尿病，可防止肥胖、預防離齒。
[0008] 2002年世界甜味劑市場規(guī)模達到109. 2億美元，在食品添加劑市場中占有重要地 位。國際甜味劑發(fā)展趨勢，今后五年作為新甜味劑的糖醇和強力替代用甜味劑消費量將增 加15%。由于甜味劑的應(yīng)用相當廣泛，食品科學家對它進行了深入的探索，發(fā)現(xiàn)并開發(fā)新型 甜味劑是研究的重點和熱點。
[0009] 塔格糖作為甜味劑具有獨特的理化特性和生理功能，其甜度是薦糖的92%，而產(chǎn) 熱量只有薦糖的1/3 ;不能被空腔內(nèi)細菌利用，不會引起離齒；在不同食品系統(tǒng)中中高劑量 使用時具有健康促進功能，低劑量使用則具有增加和改善風味的功能；不具有肝抗膜島素 物質(zhì)反應(yīng)，抑制糖尿病人血液內(nèi)葡萄糖濃度；作為醫(yī)藥和醫(yī)藥合成中間體可W用來治療貧 血和血友病，促進哺乳動物生殖和胎兒發(fā)育；具有良好的腸道耐受性，而其它單糖醇吃多了 會導致腸鳴和腹瀉；可W有選擇的被腸道內(nèi)的下酸和乳酸菌利用；可W單獨使用，和其他 甜味劑復合使用具有相互促進作用；同時具有良好的理化性質(zhì)（如耐熱、耐酸、耐堿、保濕 性好等）。因此適用于賠烤食品、飲料糖果和醫(yī)藥制劑（如糖漿劑、巧嚼片等）中作為天然 甜昧劑。
[0010] 2000年美國食品與藥物管理局（抑A)已正式批準塔格糖作為甜味劑用于食品飲 料業(yè)W及醫(yī)藥制劑中；巧CFA第57次會議批準塔格糖作為食品添加劑，推薦ADI值O-SOmg/ kg;歐盟也于去年批準塔格糖在歐洲上市；目前塔格糖在美國已被大量用于健康飲料W及 酸奶、果汁等產(chǎn)品中作為白糖的代用品。塔格糖產(chǎn)品目前已獲得美國、澳大利亞、日本、韓國 等食品衛(wèi)生部口批準使用，在我國仍未獲得批準使用。
[0011] 在我國對稀少糖的研究主要集中在赤薛糖醇、木糖醇等成熟的產(chǎn)品，而對阿洛糖、 阿洛酬糖、塔格糖的研究幾乎為空白。因此緊跟世界食品工業(yè)的發(fā)展，在我國開展上述稀少 糖的研究，開發(fā)擁有自主產(chǎn)權(quán)的生產(chǎn)技術(shù)顯得尤為重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明的第一個目的在于提供一種新的芽抱桿菌BacillusSP.SYBChb化-阿拉 伯糖異構(gòu)酶L-AI，其特征在于其核巧酸序列如W下1)或2)所示：
[0013] 1)其核巧酸序列所示核巧酸序列；
[0014] 2)在1)限定的核巧酸序列基礎(chǔ)上經(jīng)堿基的缺失、取代、插入或突變而成且具有編 碼有活性的k阿拉伯糖異構(gòu)酶的核巧酸序列。
[0015] 本專利W2015年1月7日保存于武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、的保藏編號 為：CCTCCM2015018的Bacillussp.SYBChb4的高地芽抱桿菌為發(fā)酵菌株。
[0016] 所述基因編碼的蛋白質(zhì)及含有所述基因的轉(zhuǎn)基因細胞系、基因工程菌、表達載體 或克隆載體均屬于本發(fā)明保護的范圍。
[0017] 本發(fā)明的第二個目地是提供一種高產(chǎn)k阿拉伯糖異構(gòu)酶的重組大腸桿菌及其構(gòu) 建、表達方法。
[0018] 所述高產(chǎn)k阿拉伯糖異構(gòu)酶的重組大腸桿菌的構(gòu)建方法為選取大腸桿菌冷誘導 表達載體pColdII，構(gòu)建重組表達載體pColdIl-ai，w大腸桿菌E.COliBL2UDE3)為宿 主進行表達，具體步驟如下：
[0019] (1)提取芽抱桿菌BacillusSP.SYBChb4的總基因DNA，W其為模版，利用引物hi 和h2通過PCR擴增得到1446bp的k阿拉伯糖異構(gòu)酶kAI;
[0020] 似設(shè)計引物h3和h4,利用PCR向Bacillussp.SYBChb化-阿拉伯糖異構(gòu)酶的 DNA編碼框5'和3'兩側(cè)分別引入EcoRI和甜aI限制酶切位點（下劃線顯示）；
[0021] (3)選取大腸桿菌冷誘導表達載體pColdII，構(gòu)建重組表達載體pColdIl-ai，將 重組表達質(zhì)粒pColdIl-ai轉(zhuǎn)化大腸桿菌化21 0E3)，通過氨節(jié)抗生素平板篩選陽性轉(zhuǎn)化 了并測序驗證；
[0022] 所述Bacillussp.SYBChb4是從實驗室保存蜂蜜中篩選出的，現(xiàn)保存于中國典 型培養(yǎng)物保藏中屯、，地址為武漢市武昌塔挪山武漢大學，于2015年1月7日保藏，編號為 CCTCCNO:M2015018,命名為Bacillussp.SYBC化4。
[0023]所述PCR弓I物hi:5' -ATGTTAACAAGTCAGAAG-3'，h2 : 5' -TCACAGTAGAATGCATTTC-3'h3 :5' -GCCGGAATTCATGTTAACAAGTCAGAAG-3'，h4 ：5^-GCCGTC TAGATCACAGTAGAATGCATTTC-3'〇
[0024] 所述重組菌生產(chǎn)k阿拉伯糖異構(gòu)酶的步驟為：利用IPTG對重組菌產(chǎn)k阿拉伯糖 異構(gòu)酶進行誘導表達，誘導表達后，超聲破碎菌體，利用Ni+柱親和層析法純化得到可溶性 k阿拉伯糖異構(gòu)酶，咪挫洗脫濃度為500ml;所述誘導表達條件為將含重組表達質(zhì)粒pCold Il-ai的大腸桿菌化21值E3)在37°C、200巧m條件下培養(yǎng)至0D600 = 0. 4,隨后轉(zhuǎn)入15°C培養(yǎng)至加入終濃度為0. 5mM的IPTG，誘導表達2地，轉(zhuǎn)速20化pm;培養(yǎng)基成分為：膜蛋白腺 lOg/l、酵母提取液5g/L、氯化鋼lOg/l，抑7. 4。
[00巧]本發(fā)明首次從Bacillus sp. SYBC hb4中分離、鑒定了k阿拉伯糖異構(gòu)酶基因，由 于Bacillus SP. SYBC hb4野生菌株的k阿拉伯糖異構(gòu)酶蛋白只表達于芽抱壁上而不分泌 到胞外，且表達水平一般很低，遠遠達不到工業(yè)化應(yīng)用要求，因此選用大腸桿菌重組表達系 統(tǒng)生產(chǎn)k阿拉伯糖異構(gòu)酶能大幅提高其產(chǎn)量，使更易達到工業(yè)化應(yīng)用要求，本發(fā)明利用大 腸桿菌化21〇)E3)成功高可溶性表達獲得了Bacillus SP. SYBC hb化-阿拉伯糖異構(gòu)酶蛋 白，并對表達的k阿拉伯糖異構(gòu)酶進行了純化。
[00%] 本發(fā)明的第S個目的在于提供上述重組k阿拉伯糖異構(gòu)酶在工業(yè)中精制乳糖廢 水中的利用。
[0027] 所述重組菌產(chǎn)k阿拉伯糖異構(gòu)酶酶活測定方法為：用抑6. 8濃度為0.2mol/L的 憐酸鹽緩沖液溶解D-半乳糖作為酶反應(yīng)底物。取0. 5ml酶反應(yīng)底物加入0. 5ml粗酶液，于 37°C反應(yīng)比后加入9倍體積的稀鹽酸（0.Imol/L化1)終止反應(yīng)。將上述溶液稀釋10倍作 為反應(yīng)液；取上述反應(yīng)液1ml，加入0. 2ml半脫氨酸鹽酸鹽，6ml硫酸溶液，混勻加入0. 2ml 巧挫酒精溶液，混勻，37°ClOmin，水浴lOmin，W蒸饋水作為空白對照，在560am波長下測 定其OD值。
【具體實施方式】
[0028]在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非有另外說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常 理解的含義。
[0029] 下面結(jié)合具體的制備實施例和應(yīng)用實施例，并參照數(shù)據(jù)進一步詳細地描述本發(fā) 明。應(yīng)理解，運些實施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非W任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0030] 在W下的實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。
[0031] 一般性說明：實施例