一種來源于丁香假單胞菌的山梨醇脫氫酶基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程和酶工程領(lǐng)域，具體涉及一種來源于丁香假單胞菌的山梨醇脫氫酶基因及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]山梨醇脫氣酶(Sorbitoldehydrogenase,簡稱 SDH, EC 1.1.1.14)廣泛存在于微生物、植物以及動(dòng)物之中，最早由Breusch, F.L.等發(fā)現(xiàn)于貓肝臟中(1942)，是生物體內(nèi)多元醇途徑中的關(guān)鍵酶。未經(jīng)細(xì)胞利用的葡萄糖進(jìn)入多元醇通路時(shí)，醛糖還原酶首先將其還原為山梨醇，同時(shí)氧化NADPH生成NADP+。繼而，SDH利用NAD+作為氫受體氧化山梨醇C2位的羥基生成果糖，果糖通過己糖激酶的磷酸化作用形成6-磷酸-果糖返回糖酵解途徑。目前，研究者已考察了數(shù)十種不同來源的山梨醇脫氫酶，研究方向涉及與植物的滯育關(guān)系、與二型糖尿病的相關(guān)性、多元醇的生物轉(zhuǎn)化等等，然而直到2003年，才由Philippsen, A.、Pauly, T.A等人相繼利用X光衍射和晶體拓?fù)鋵W(xué)分析得到首個(gè)微生物來源及人來源的SDH晶體及亞結(jié)構(gòu)，分別屬于短鏈脫氫酶家族、中鏈脫氫酶家族。
[0003]SDH大多為多聚體酶，是由相同或相似的亞基組成的二聚體、三聚體或四聚體，單亞基的分子量為25~60 kDa，能不同程度的氧化D-山梨醇，L-艾杜糖醇，D-半乳糖醇等多元醇C2位的羥基生成相對(duì)應(yīng)的酮糖。在酶法檢測方面，SDH可以用于快速、精確檢測山梨醇的含量。在食品及其他復(fù)合材料領(lǐng)域，D-山梨醇是一種重要的大噸位原料，而在臨床上，D-山梨醇則是糖尿病監(jiān)測的重要指標(biāo)。從羊肝臟、Bacillus中分離的SDH由于具有廣泛的底物特異性，很難區(qū)分樣品中的木糖醇(結(jié)構(gòu)與山梨醇類似)；Schneider等從Pseudomonas sp.分離出對(duì)木糖醇低活性(僅為山梨醇的2%)的SDH，但因產(chǎn)率低并不適合工業(yè)應(yīng)用；而后，Ikuko IaswAa等hk Pseudomonas sp.KS-E1806克隆了一條SDH基因并構(gòu)建基因工程菌用于山梨醇脫氫酶的高效生產(chǎn)，同時(shí)申請了歐洲、美國、日本的專利保護(hù)(專利號(hào):EP1262551 (A3)、US2003022336 (Al)、JP2002355046 (A))。此外，SDH 在酶法生產(chǎn)D-果糖或D-塔格糖方面，也具有潛在的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種來源于丁香假單胞菌(/keiZobffitmgs的山梨醇脫氫酶基因及其應(yīng)用，該基因編碼的山梨醇脫氫酶能催化多元醇與相應(yīng)酮糖相互轉(zhuǎn)化，至今未發(fā)現(xiàn)該山梨醇脫氫酶基因的相關(guān)研究的報(bào)道。
[0005]來源于丁香假單胞菌的山梨醇脫氫酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示，該基因序列含有774 bp堿基。
[0006]所述的山梨醇脫氫酶基因編碼的山梨醇脫氫酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示，其包含257個(gè)氨基酸。
[0007]一種表達(dá)載體，它包含所述的山梨醇脫氫酶基因。
[0008]一種重組菌，其是通過利用所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞獲得的。
[0009]用細(xì)菌DNA Kit (TIANGEN, China)提取丁香假單胞菌基因組，基于如SEQ ID NO:1所示的核酸序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增的DNA片段克隆到pET-28a載體中，將所構(gòu)建的重組質(zhì)粒pETISa-si*轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中構(gòu)建工程菌，通過適宜濃度的IPTG誘導(dǎo)基因工程菌尚效表達(dá)山梨醇脫氣酶。
[0010]應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)本發(fā)明公開的氨基酸序列，在不影響其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，得到所述蛋白的突變序列。因此，本發(fā)明的來源于丁香假單胞菌的山梨醇脫氫酶還包括由SEQ ID No:2所示的氨基酸序列中經(jīng)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有同等活性的由SEQ ID No:2所示的蛋白質(zhì)衍生的蛋白質(zhì)。例如通過在末端添加標(biāo)簽序列，如His-tag或Strep-tag而衍生的蛋白質(zhì)。
[0011]通過Blast軟件在線比較分析，發(fā)現(xiàn)來源于丁香假單胞菌的山梨醇脫氫酶基因的核苷酸序列與其它微生物的己知山梨醇脫氫酶基因的同源性差異較大。
[0012]本發(fā)明中，術(shù)語“山梨醇脫氫酶基因”還包括能編碼具有與山梨醇脫氫酶相同功能的蛋白的SEQ ID NO:1的突變形式，所述突變類型包括:確實(shí)、無義、插入、錯(cuò)義。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，作為遺傳密碼簡并性的結(jié)果，許多不同的多核苷酸能夠編碼相同的多肽。另外，應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠使用常規(guī)的技術(shù)進(jìn)行核苷酸取代，所述取代不會(huì)影響本發(fā)明中所使用的多核苷酸編碼的多肽序列。另外，還可以使用本領(lǐng)域中的已知的方法對(duì)多核苷酸進(jìn)行修飾，以增強(qiáng)本發(fā)明多核苷酸在體內(nèi)的活性或者存活期。
[0013]一種含有山梨醇脫氫酶基因的重組表達(dá)載體，是將SEQ ID NO:1所示基因與表達(dá)載體pET-28a連接所構(gòu)建的重組載體。
[0014]一種含有上述重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞宿主大腸桿菌BL21 (Escherichia coliBL21)。
[0015]所述的來源于丁香假單胞菌的山梨醇脫氫酶基因在多元醇與其對(duì)應(yīng)的酮糖的轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。
[0016]將山梨醇脫氫酶基因通過構(gòu)建重組載體并在宿主細(xì)胞中克隆表達(dá)，獲得山梨醇脫氫酶，催化多元醇與其對(duì)應(yīng)的酮糖的轉(zhuǎn)化。
[0017]所述多元醇與其對(duì)應(yīng)的酮糖的轉(zhuǎn)化，例如，山梨醇轉(zhuǎn)化為D-果糖，D-半乳糖醇轉(zhuǎn)化為D-塔格糖，L-艾杜糖醇轉(zhuǎn)化為L-山梨糖等。
[0018]有益效果:
本發(fā)明基于生物信息學(xué)的分析方法和分子生物學(xué)技術(shù)所獲得的核酸序列是一種高活性、高選擇性的山梨醇脫氫酶基因，可將其與載體連接后轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)山梨醇脫氫酶，該酶能高效催化多種重要多元醇與其對(duì)應(yīng)的酮糖的轉(zhuǎn)化。本發(fā)明首次將氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的山梨醇脫氫酶應(yīng)用于D-山梨醇合成D-果糖，D-半乳糖醇合成D-塔格糖，L-艾杜糖醇合成L-山梨糖中，取得很好的效果，在添加NADH氧化酶用于輔酶原位再生的情況下，分別可以催化合成100 g/L D-果糖，50 g/L D-塔格糖及50 g/L L-山梨糖。氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的山梨醇脫氫酶對(duì)底物的轉(zhuǎn)化率高(均大于99%)，相較于傳統(tǒng)依賴異構(gòu)酶的生產(chǎn)方法，大大降低了后期分離、脫色成本，具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說明】
[0019]圖1為山梨醇脫氫酶基因表達(dá)載體的構(gòu)建圖；圖2為山梨醇脫氫酶基因誘導(dǎo)表達(dá)后的SDS-PAGE分析圖。
【具體實(shí)施方式】
[0020]本發(fā)明提供了編碼具有山梨醇脫氫酶活性的多肽的多聚核苷酸分子，該核苷酸分子是從丁香假單胞菌中克隆得到的，具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列，它編碼257個(gè)氨基酸的多肽。
[0021]本發(fā)明還涉及一種重組載體，該載體包含本發(fā)明的核苷酸序列SEQ ID NO:1，以及包含重組質(zhì)粒的宿主細(xì)胞。同時(shí)，本發(fā)明包括構(gòu)建該重組質(zhì)粒和宿主細(xì)胞的方法，以及用重組工程菌生產(chǎn)山梨醇脫氫酶的方法。
[0022]在本發(fā)明中，“山梨醇脫氫酶”是指具有山梨醇脫氫酶活性的SEQ ID NO:2序列的多肽。該術(shù)語還包括SEQ ID NO:2序列的變異體，包括(但不限于)若干個(gè)氨基酸的缺失，插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸，也可以使不影響序列的修飾形式上的差異。
[0023]本發(fā)明的山梨醇脫氫酶基因全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法，重組法，或人工合成法獲得。
[0024]本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域己知的各種載體，如質(zhì)粒，粘粒，噬菌體及反轉(zhuǎn)錄病毒等。
[0025]重組表達(dá)載體可以用本領(lǐng)域熟知的方法導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，這些方法包括:氯化鈣熱激法，電轉(zhuǎn)化法，PEG介導(dǎo)法，基因槍法等。
[0026]本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核細(xì)胞如大腸桿菌等。常用的真核細(xì)胞如酵母細(xì)胞，或各種動(dòng)植物細(xì)胞。
[0027]本發(fā)明的實(shí)施將采用本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)的化學(xué)、分子生物學(xué)等領(lǐng)域的傳統(tǒng)技術(shù)。另外，除非另有說明，在本文中，核酸以5’至3’的方向從左向右書寫，氨基酸序列則以氨基端到羧基端的方向從左向右書寫。
[0028]根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結(jié)果僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也