一種基于酶促異構(gòu)化反應和連續(xù)色譜分離原位耦合的d-塔格糖生產(chǎn)方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物和化工領域，特別公開了一種基于酶促異構(gòu)化反應和色譜分離原位耦合技術，以D-半乳糖為原料連續(xù)生產(chǎn)D-塔格糖的方法，包括以下步驟：配置緩沖溶液；將嗜熱的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶在水中充分溶解，作為酶溶液；將D-半乳糖在水中充分溶解，作為原料液；將原料液、緩沖溶液、酶溶液經(jīng)混合預熱后，作為模擬移動床反應器（SMBR）的進料液；進料液進入模擬移動床反應器，經(jīng)原位反應和分離后，得到D-塔格糖產(chǎn)品溶液。本發(fā)明確立了SMBR適宜的操作條件，D-半乳糖轉(zhuǎn)化率達到80%以上，D-塔格糖純度達到95%以上，收率超過80%。本發(fā)明公布的方法成本低、污染少、轉(zhuǎn)化率高，且可實現(xiàn)連續(xù)生產(chǎn)，有利于保證產(chǎn)品質(zhì)量的均一性，具有良好的商業(yè)化應用前景。
【專利說明】一種基于酶促異構(gòu)化反應和連續(xù)色譜分離原位耦合的D-塔格糖生產(chǎn)方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物化工領域，具體涉及一種基于酶促異構(gòu)化反應和連續(xù)色譜分離原位耦合的D-塔格糖生產(chǎn)方法。
【背景技術】
[0002]塔格糖是一種六碳酮糖，分子式為C6H12O6，是果糖的差向異構(gòu)體，也是半乳糖的醛酮同分異構(gòu)體。塔格糖分子量180g/mol，常態(tài)下為白色晶體，熔點和玻璃化溫度分別為134 1:和15 °C，溶于水，微溶于乙醇，酸穩(wěn)定性良好。D-塔格糖與木糖醇等甜味劑相比，具有口味更好、加工性更強、保健作用更多和安全性更高的特點，是一種優(yōu)良的食品甜味劑。D-塔格糖2001年被美國食品藥物管理局(US FDA)正式批準為普遍公認安全食品(GRAS)，2005年被歐盟批準在歐洲上市。D-塔格糖已在食品、飲料、護齒產(chǎn)品等領域獲得了廣泛的應用(Kruger et al., Regul.Toxicol.Pharmacol., 1999 29(2)，pS29_35; Levin, J.Medc.Food, 2002 5(1)，p23_26)。
[0003]D-塔格糖屬于稀有糖類，很難直接從自然界中大量獲取，只能通過人工手段制備。目前工業(yè)化的D-塔格糖生產(chǎn)主要采用化學法，在水溶液中將半乳糖轉(zhuǎn)化成塔格糖，隨后經(jīng)分離步驟進行提純(Beadle et al., US Patent, 5002612, 1991;Fabrice, WO Patent,066192，2005)。化學法的主要問題是使用堿金屬鹽或堿土金屬鹽催化劑，副產(chǎn)物眾多，給后續(xù)的提純過程造成困難，同時也會造成較為嚴重的環(huán)境污染。 [0004]D-塔格糖生產(chǎn)的發(fā)展趨勢是使用生物法，途徑主要有兩種。一種是利用微生物所產(chǎn)生的脫氫酶將半乳糖醇氧化成塔格糖，Izumori等、Munimzzaman等和Manzoni等分別發(fā)現(xiàn)了不同的菌株可以將半乳糖醇氧化成塔格糖(Appl.Environ.Microbiol, 198446: pl055_1057; ProcessBiochem., 2001，36 p971_977; Ferment Bioeng.，1995 79P620-622)。然而作為原料的半乳糖醇價格過高，這種方法的商業(yè)應用價值并不大。另一種途徑則是利用異構(gòu)酶將低廉的半乳糖異構(gòu)成塔格糖。Cheetham等利用Lactobacillusgayonii代謝產(chǎn)生的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶成功轉(zhuǎn)化半乳糖生成塔格糖，首次提出利用乳酸菌生產(chǎn)塔格糖的設想(Enzyme Micr0.Technol., 1993 15 pl05_108)。張華等人從泡菜中獲得高產(chǎn)塔格糖的乳酸菌SK1.002 (食品與發(fā)酵工業(yè)，2006 32出):5-7)。翁瑋慧等從篩選的乳酸菌中得到L-阿拉伯糖異構(gòu)酶(食品工業(yè)科技，2006 (1):158-162)。目前，D-半乳糖異構(gòu)生成D-塔格糖所需的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶已經(jīng)得到了較為充分的研究和開發(fā)。
[0005]D-半乳糖異構(gòu)化生成D-塔格糖為可逆反應，可以表述為:
其中A為反應物D-半乳糖，B為異構(gòu)酶催化劑，C為產(chǎn)物D-塔格糖。轉(zhuǎn)化率、產(chǎn)品溶液純度和收率的定義為:
【權利要求】
1.一種基于酶促異構(gòu)化反應和連續(xù)色譜分離原位耦合的D-塔格糖生產(chǎn)方法，包括以下步驟: (1)配置PH值6~7.4的緩沖溶液； (2)將嗜熱的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶在部分緩沖溶液中充分溶解，作為酶溶液； (3)將D-半乳糖在水中充分溶解，作為原料液； (4)將步驟(1)、(2)、(3)中分別得到的緩沖溶液、酶溶液和原料液經(jīng)混合預熱后，作為進料液，所述的進料液中不含目標產(chǎn)物D-塔格糖； (5)將步驟(4)中得到的進料液進入模擬移動床反應器，經(jīng)原位反應和分離后，直接得到D-塔格糖產(chǎn)品溶液。
2.根據(jù)權利要求1所述的D-塔格糖生產(chǎn)方法，其特征在于:步驟(1)中所配置的緩沖溶液每升中含有氯化鈉8~8.5g、磷酸氫鈉30~50g和磷酸二氫鈉0.2~0.5g，調(diào)節(jié)pH值至6~7.4。
3.根據(jù)權利要求1所述的D-塔格糖生產(chǎn)方法，其特征在于:步驟(2)中L-阿拉伯糖異構(gòu)酶為從大腸桿菌K12基因組中通過克隆方法表達阿拉伯糖異構(gòu)酶制得的粗酶液。
4.根據(jù)權利要求1所述的D-塔格糖生產(chǎn)方法，其特征在于:步驟(4)中所配進料液中D-半乳糖濃度為10~150 g/1，酶活力單位為0.1~0.28 U/ml，pH值為6~7.4。
5.根據(jù)權利要求1所述的D-塔格糖生產(chǎn)方法，其特征在于:步驟(4)中混合預熱過程在緩沖罐中進行。
6.根據(jù)權利要求1所述的D-塔格糖生產(chǎn)方法，其特征在于:步驟(4)中混合預熱溫度為 60 ~80°C。
7.根據(jù)權利要求1所述的D-塔格糖生產(chǎn)方法，其特征在于:步驟(5)中的模擬移動床反應器為四區(qū)模擬移動床反應器，每區(qū)由1~6根色譜柱組成。
8.根據(jù)權利要求1所述的D-塔格糖生產(chǎn)方法，其特征在于:步驟(5)中模擬移動床反應器中的色譜柱填料為Sugar SP0810。
9.根據(jù)權利要求1所述的D-塔格糖生產(chǎn)方法，其特征在于:步驟(5)中模擬移動床反應器為等溫操作，柱溫60~80°C。
10.根據(jù)權利要求7所述的D-塔格糖生產(chǎn)方法，其特征在于:步驟(5)中四區(qū)模擬移動床反應器的操作條件為:切換時間60~80 min, I區(qū)流率1.35~1.4，II區(qū)流率0.4~.0.8，III區(qū)流率0.6~0.93，IV區(qū)流率≤0.4。
【文檔編號】C12P19/24GK103923959SQ201410177891
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年4月29日 優(yōu)先權日:2014年4月29日
【發(fā)明者】徐進, 余衛(wèi)芳, 周慧君 申請人:溫州大學