背景技術：

下一代測序技術近來的進步已經(jīng)導致研究和臨床環(huán)境中測序及制備方法的快速增加。高通量能力及高涵蓋深度使下一代測序成為分子診斷中有吸引力且有前景的方向。作為全基因組測序的替代，可以探尋(interrogate)基因的特定子集并可以將多個樣品合并(例如，多重地)入單個測序運行(例如，流動池泳道(flowcelllane))，因此減低了分析的整體成本。目前的方法仍然限速，并且對改善的方法有所需求。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一些方面涉及這樣的認識，即用于制備用于測序的核酸的現(xiàn)存方法既是勞動密集的，又經(jīng)常需要大量的起始材料。還已經(jīng)認識到，現(xiàn)存方法涉及的步驟(例如連接步驟、末端修復以及多腺苷酸加尾)既冗長又低效，使得這些方法無法用于獲取快速且精確的測序結果，而這是分子診斷背景中所需的。在一些實施方案中，本文的方法提供了在等溫條件下快速擴增模板核酸，以產(chǎn)生可直接用于標準下一代核酸測序系統(tǒng)的樣品，所述系統(tǒng)包括例如高通量基于流動池的測序系統(tǒng)。在一些實施方案中，本發(fā)明的一些方面涉及用于制備核酸的方法，該方法包括在等溫條件下指數(shù)擴增核酸以用于測序。因此，在一些實施方案中，本文所提供的方法是有優(yōu)勢的，因為其利用了等溫反應條件，規(guī)避了對專門的溫度循環(huán)機器的需求。在一些實施方案中，本文所提供的方法是有優(yōu)勢的，因為可以使用rna和/或dna作為起始材料利用所述方法。因此，在一些實施方案中，可以使用提取自多種不同類型的樣品(例如，血液以及其他組織樣品，包括獲取自病理學分析的樣品)的核酸利用所述方法，從而使得能夠對通常組織樣品進行平行診斷測試。

在一些實施方案中，已經(jīng)認識到傳統(tǒng)的制備方法經(jīng)常不僅依賴于溫度循環(huán)(例如，如用pcr)，而且依賴于不變的、已知的序列，以設計靶區(qū)域側翼的擴增引物。在一些實施方案中，這限制了使用現(xiàn)存方法所捕獲到的遺傳事件的類型，使得檢測由超突變、基因重排或者與未知遺傳伴侶融合所導致的核酸變體成為挑戰(zhàn)。因此，在一些實施方案中，本文所提供的方法可用于制備用于以檢測大范圍基因變體、重排或多態(tài)性為目的之測序的核酸。例如，在一些實施方案中所提供的方法對于擴增核酸模板是有優(yōu)勢的，所述核酸模板包含與未知序列融合的已知靶序列，以達到鑒定未知序列的目的。因此，在一些實施方案中，本文所提供的方法可用于制備由基因重排導致的核酸融合。在一些實施方案中，所述融合為已進行了染色體重排的基因中所編碼的mrna融合。在一些實施方案中，所述融合為含有由于染色體重排而已經(jīng)融合在一起的兩個基因座的染色體區(qū)段。因此，在一些實施方案中，本文所提供的制備方法可用于以對核酸進行測序為目的而擴增核酸庫以檢測基因組重排或融合。在一些實施方案中，本文所提供的方法可以用于檢測基因組重排或融合，該方法使用測序作為標準病理學測定(例如，熒光原位雜交測定)的補充診斷測試。在一些實施方案中，本文所提供的制備方法可用于新式基因組裝(例如鳥槍法測序)。在這樣的實施方案中，具有雜交序列的寡核苷酸可以用于擴增含有基因組組裝片段之間(例如，重疊群之間)連接的核酸。因此，在一些實施方案中，制備方法可以用于通過擴增含有基因組組裝片段之間連接的核酸來確認基因組組裝預期的正確性，從而確定該片段任一側的實際序列，并確認該實際序列是否符合基因組組裝預期。

本發(fā)明的一些方面涉及制備用于分析的核酸的方法。在一些實施方案中，所述方法包括(a)由核酸模板產(chǎn)生合成rna；(b)在等溫反應中指數(shù)擴增所述合成rna；以及(c)由所述指數(shù)擴增的合成rna產(chǎn)生cdna，其中所述cdna包含至少一條非靶序列。本發(fā)明另一些方面涉及確定核酸模板序列的方法。在一些實施方案中，所述方法包括(a)由核酸模板產(chǎn)生合成rna；(b)在等溫反應中，指數(shù)擴增所述合成rna；(c)由所述指數(shù)擴增的合成rna產(chǎn)生cdna；以及(d)對所述cdna進行測序。在某些實施方案中，重復步驟(b)的指數(shù)擴增。在一些實施方案中，在步驟(b)的每個連續(xù)輪(round)后純化所述擴增的合成rna，并且將所述純化的合成rna用作步驟(b)后續(xù)輪的起始材料。在某些實施方案中，重復的步驟(b)的至少兩個等溫反應包括由寡核苷酸引發(fā)(prime)的模板依賴性延伸，所述寡核苷酸具有與所述模板合成rna或第一dna鏈的嵌套序列(nestedsequence)互補的雜交序列。

在一些實施方案中，所述等溫反應包括模板依賴性延伸和rna聚合酶轉錄的兩個或更多個循環(huán)。在某些實施方案中，每個循環(huán)中的至少一次模板依賴性延伸為反轉錄。在一些實施方案中，所述等溫反應在35℃至45℃范圍的溫度下進行。在某些實施方案中，所述等溫反應所進行的持續(xù)時間為45分鐘至90分鐘。在一些實施方案中，所述等溫反應包括合成第一dna鏈的模板依賴性延伸，所述第一dna鏈與所述合成rna互補，從而導致在所述第一dna鏈和所述合成rna之間形成rna-dna雜交體。在某些實施方案中，所述等溫反應還包括所述rna-dna雜交體中所述合成rna部分的降解。在一些實施方案中，所述降解為酶促介導的降解。在某些實施方案中，所述降解由rna酶h介導。在一些實施方案中，所述等溫反應還包括合成第二dna鏈的模板依賴性延伸，所述第二dna鏈與所述第一dna互補，從而導致形成包含所述第一和第二dna鏈的雙鏈dna。在一些實施方案中，所述等溫反應還包括rna聚合酶介導的轉錄反應，所述轉錄反應由所述雙鏈dna轉錄合成的rna。

在一些實施方案中，重復的步驟(b)的至少兩個等溫反應包括由寡核苷酸引發(fā)的模板依賴性延伸，所述寡核苷酸具有與所述模板合成rna或第一dna鏈互補的雜交序列以及附加的非互補序列。在某些實施方案中，所述附加的非互補序列包含一個或更多個條形碼序列(barcodesequence)、索引序列(indexsequence)或接頭序列(adaptersequence)。

在一些實施方案中，所述方法還包括通過使用包含靶特異性雜交序列的寡核苷酸進行至少一次延伸反應產(chǎn)生所述核酸模板；以及使用多個不同的寡核苷酸進行至少一次延伸反應，所述不同的寡核苷酸共有位于不同雜交序列5’的共同序列(commonsequence)。

在某些實施方案中，所述核酸模板包含靶區(qū)域和鄰接區(qū)域(adjacentregion)。在一些實施方案中，所述靶特異性雜交序列與所述靶區(qū)域互補，并且其中所述不同雜交序列的至少一條與所述鄰接區(qū)域互補。在某些實施方案中，所述靶區(qū)域包含第一基因的序列，并且所述鄰接區(qū)域包含第二基因的序列。在一些實施方案中，所述第一基因為ret、ros1或alk。

在某些實施方案中，所述核酸模板為包含啟動子的雙鏈dna，其中通過rna聚合酶酶促產(chǎn)生所述合成rna，所述rna聚合酶特異性地與所述啟動子結合，并轉錄所述啟動子下游的dna。在一些實施方案中，所述rna聚合酶為t3、t7或sp6聚合酶。在某些實施方案中，由從所述核酸模板產(chǎn)生的中間雙鏈dna轉錄所述合成rna，其中所述核酸模板為分離的rna。在一些實施方案中，所述分離的rna為信使rna(messagerna，mrna)、微rna(microrna)、核糖體rna、轉移rna或非編碼rna。在某些實施方案中，所述mrna為由包含基因重排的染色體區(qū)段編碼的融合mrna。在一些實施方案中，所述核酸模板為包含基因重排部分的染色體區(qū)段。在某些實施方案中，所述基因重排為倒位、缺失或易位。在一些實施方案中，所述cdna包含非模板序列，其充當引發(fā)測序反應之測序引物的雜交位點。在某些實施方案中，在多重反應中對所述cdna進行測序，所述多重反應包括源自不同來源的不同核酸。在一些實施方案中，所述不同來源為從其中獲得所述核酸模板的不同對象。在某些實施方案中，所述不同來源為從其中獲得所述核酸模板的不同組織。

本發(fā)明的另一些方面涉及對核酸進行測序的方法。在一些實施方案中，所述方法包括由核酸模板產(chǎn)生合成rna，所述模板包含靶區(qū)域和鄰接區(qū)域；產(chǎn)生雙鏈核酸，所述雙鏈核酸包含使用所述合成rna作為模板通過模板依賴性延伸合成的第一鏈，以及使用所述第一鏈作為模板通過模板依賴性延伸合成的第二鏈，其中所述雙鏈核酸代表所述核酸模板的所述靶區(qū)域和所述鄰接區(qū)域；并且使用所述雙鏈核酸進行測序反應，以確定所述靶區(qū)域和所述鄰接區(qū)域的核苷酸序列。在一些實施方案中，所述方法還包括擴增所述合成rna，以及使用所述擴增的合成rna作為模板產(chǎn)生所述雙鏈核酸。在一些實施方案中，通過等溫擴增來擴增所述合成rna。在某些實施方案中，通過等溫擴增指數(shù)擴增所述合成rna。在一些實施方案中，通過聚合酶鏈式反應擴增所述合成rna。

在某些實施方案中，所述方法還包括擴增所述雙鏈核酸并且對所述擴增的雙鏈核酸進行測序。在一些實施方案中，產(chǎn)生所述雙鏈核酸的每條鏈，以使得其含有充當引發(fā)測序反應之測序引物的雜交位點的非模板序列。在某些實施方案中，在多重反應中對所述雙鏈核酸進行測序，所述多重反應包括源自不同來源的不同核酸。在一些實施方案中，所述不同核酸包含標識來源的條形碼序列。

本發(fā)明的另一些方面涉及包含可用于本文所公開方法之組分的試劑盒。在一些實施方案中，所述試劑盒包含容納凍干組合物的容器，所述組合物包含至少一個包含雜交序列和rna聚合酶啟動子序列的寡核苷酸；反轉錄酶；dna聚合酶；以及rna聚合酶。在一些實施方案中，所述組合物還包含rna酶h。在某些實施方案中，所述反轉錄酶選自：amv反轉錄酶、rsv反轉錄酶、hiv-1反轉錄酶和hiv-2反轉錄酶。在一些實施方案中，所述dna聚合酶選自：taq聚合酶、pheonixtaq聚合酶、phusion聚合酶、t4聚合酶、t7聚合酶、klenow片段、klenowexo-、phi29聚合酶、verasequltra聚合酶和enzscript。在某些實施方案中，所述rna聚合酶選自：t3聚合酶、t7聚合酶和sp6聚合酶。在一些實施方案中，所述至少一個寡核苷酸還包含至少一個條形碼序列、索引序列和接頭序列。在某些實施方案中，所述容器為多室筒(multichambercartridge)的室。

附圖簡述

圖1a-g描繪了以rna作為模板開始的用于靶核酸序列等溫擴增的工作流程的非限制實例，該靶核酸序列側翼為3’未知融合伴侶。

圖2a-e示出以rna作為模板開始的用于靶核酸序列等溫擴增的工作流程的非限制實例，該靶核酸序列側翼為5’未知序列。

圖3a-d描繪了使用dna作為模板的用于靶核酸序列等溫擴增的工作流程的非限制實例。

圖4a-e描繪了以rna作為模板開始的用于靶核酸序列等溫擴增的工作流程的非限制實例，該靶核酸序列側翼為5’或3’未知序列。

發(fā)明詳述

本文的方法使得能夠快速制備模板核酸，以產(chǎn)生可直接用于標準核酸測序系統(tǒng)的樣品，該系統(tǒng)包括例如高通量基于流動池的測序系統(tǒng)。在一些實施方案中，提供了制備方法，該方法包括在等溫條件下指數(shù)擴增核酸以用于測序。因此，在一些實施方案中，本文所提供的方法是有優(yōu)勢的，因為其利用了等溫反應條件，規(guī)避了對專門的溫度循環(huán)機器的需求。在一些實施方案中，提供了用于制備用于測序的核酸的方法，所述方法包括在等溫條件下交替進行的模板依賴性延伸和rna轉錄反應，從而指數(shù)擴增模板核酸。此外，在一些實施方案中，本文所公開的制備方法可在約2小時至5小時內(nèi)產(chǎn)生擴增的核酸以用于測序，從而使得通過測序的相對快速分子診斷測試成為可能。此外，本文提供的方法使得在通常組織樣品上進行平行測試(例如，通過測序和基于圖像的分析)成為可能。例如，在一些實施方案中，本文公開的用于制備核酸的方法適合用于從獲得的用于病理學分析的生物樣品(例如福爾馬林固定的組織切片、血液以及其他組織)提取核酸。

應理解的是本文提供的方法具有許多應用，包括而不限于，制備用于部分或完全核苷酸測序的核酸。在一些實施方案中，本文提供的方法是有優(yōu)勢的，因為可以使用大量的不同核酸作為起始材料(包括rna或dna)利用所述方法。在一些實施方案中，本文公開的方法包括制備代表存在于基因組中的染色體區(qū)段的核酸，包括哺乳動物基因組，并且更具體為人基因組。使用本文公開的方法制備的核酸可以包括基因組的子集(subset)(如外顯子或外顯子組)、轉錄物組或其子集，或其他獲自細胞的dna或rna。

在一些實施方案中，本文公開的方法包括制備核酸，其目的為通過測序確定在樣品中的核酸是否存在。該方法可用于，例如診斷以及法庭的應用。在一些實施方案中，本文公開的方法包括制備核酸，其目的為確定核酸序列中是否包含突變或變體，例如，等位基因變體，包括單核苷酸多態(tài)性、基因重排、拷貝數(shù)量的變化等。在一些實施方案中，本文公開的方法包括制備核酸，其目的為確定樣品中存在基因修飾的生物體或基因工程化的核酸。

在一些實施方案中，本文公開的方法可用于從任何合適的樣品(例如，食物樣品、環(huán)境樣品、生物樣品(例如，血樣等))制備核酸，其目的為對存在于樣品中的核酸進行檢測和/或測序。在一些實施方案中，可以制備核酸以促進基于序列之對樣品中的病原體、感染性物質或生物體的檢測。術語“食物樣品”指任何可食用的液體、半固體、固體以及干材料，包括例如肉和肉制品、奶和基于奶的產(chǎn)品、蛋和基于蛋的產(chǎn)品、烘焙類產(chǎn)品、糖果、蔬菜、水果以及包括飲用水的飲料、等。環(huán)境樣品包括地表水、地下水、海洋水的樣品、土壤樣品以及大氣樣品等。術語“生物樣品”包括任何細胞、組織、生物學流體、器官或其部分。生物樣品可以體外獲自或來自例如細胞或組織培養(yǎng)物?；蛘撸飿悠房梢垣@自或來自生物體。例如，包括血液、痰、尿液、組織活檢物(例如腫瘤組織活檢物)以及其他在臨床實驗室中通常測試的樣品。術語生物樣品也包括已被處理以用于分析的樣品，例如固定的組織切片。

在一些實施方案中，本文公開的方法包括制備核酸，其目的為通過測序或其他檢測方法確定是否有已知的核酸已經(jīng)發(fā)生突變從而導致疾病(例如癌癥)。在一些實施方案中，本文公開的方法包括制備核酸，其目的為通過對核酸進行測序確定在對象中是否存在具體的病癥。所述病癥可以為例如：癌癥、非癌的病癥，如神經(jīng)退行性病癥，或感染。在一些實施方案中，本文公開的方法包括制備核酸，其目的為評估兩種材料之間存在的基因區(qū)別，例如，正常組織與患病組織之間。在一些實施方案中，本文公開的方法包括制備核酸，其目的為通過測序或其他方法確定個體的攜帶狀態(tài)(carrierstatus)。在一些實施方案中，本文公開的方法包括從產(chǎn)前樣品中制備核酸，其目的為產(chǎn)前基因測試。本文公開的方法可用于制備樣品以通過測序確定微生物中的抗生素抗性或涉及病毒時的免疫或抗病毒抗性的潛在原因。

此外，在該方法的某些實施方案中，可以平行地進行多個反應，其目的為處理或評估來自多個來源(例如，多個患者樣品)的多個核酸和/或樣品。例如，可以對每個樣品評估10-25、15-50、25-75、50-100、75-200、100-500、200-500、200-1000、500-1500、1000-2500、2500-5000或更多個核酸(例如，不同的基因座，例如，不同的融合斷裂點或多態(tài)性)。應當理解的是，在單個反應室或分開的反應室中可以進行多個反應。此外，來自多個不同來源的樣品可以平行處理。例如，1-25、25-50、50-100、100-500、500-1000、1000-2500、2500-5000或更多或中間數(shù)目的來源可以平行處理。

應當理解的是，本文公開的方法可以是自動化的和/或可以包括機器人技術的使用，以用于進行反應或在反應之間轉移材料。例如，在自動化的實施中，使用本文公開的制備方法制備的核酸可被轉移至測序平臺，以使用機器人技術或其他自動化組件進行測序。另外，從測序系統(tǒng)的檢測器或傳感器獲取的測序數(shù)據(jù)可被輸入電腦、移動設備，和/或在屏幕上顯示，以使得使用者可以遠程監(jiān)測測序反應的進程或獲取并分析從測序反應得到的信息。

在一些實施方案中，通過核酸測序分析通過本文公開的方法制備的核酸。在一些實施方案中，所述核酸測序為下一代測序方法。在一些實施方案中，所述下一代測序方法為通過可用于illumina下一代測序機的合成方法的測序，其中待測序的擴增dna之側翼的接頭序列包含用于該方法的合適序列。在一些實施方案中，所述測序方法使用適用于iontorrent測序平臺的離子半導體，其中待測序的擴增dna之側翼的接頭序列包含用于該方法的合適序列。另外的用于核酸分析的測序方法包括但不限于鏈終止測序(也稱為sanger測序)、通過連接的測序(也稱為solid測序)、454焦磷酸測序，以及單分子實時測序(也稱為pacificbiosciences測序)。

在一些實施方案中，通過合成的測序(例如，使用illumina系統(tǒng))包括使用接頭序列(p5、p7)，其與待分析的核酸的任一末端相連，并與在流動池內(nèi)固定的p5和p7寡核苷酸互補。在一些實施方案中，該方法包括固定的dna分子的克隆擴增，隨后添加熒光標記的核苷酸，其在合成時一個循環(huán)一次地并入互補的dna鏈中。除了p5和p7接頭序列之外，該擴增dna也可含有用于與一個或更多個測序寡核苷酸雜交的序列(例如，稱為rd1或rd2的序列)。

在一些實施方案中，離子半導體測序方法(例如，使用iontorrent系統(tǒng))包括有區(qū)別的接頭序列(a，p1)，將其連接于待分析的核酸的任一末端，并允許將該核酸分子連接于球狀顆粒。在一些實施方案中，將球狀顆粒綴合的核酸通過乳液pcr(emulsionpcr，empcr)擴增，并加樣于用于測序的芯片孔中。該離子半導體測序機基于在dna鏈聚合期間檢測所釋放的質子，所述dna鏈與顆粒綴合的模板dna互補。通過高敏感離子傳感器檢測每個釋放的氫離子。

在一些實施方案中，本文提供的方法包括通過擴增靶序列將附加序列與靶核酸連接。在一些實施方案中，寡核苷酸包含用于與模板核酸和附加序列雜交的雜交序列。在一些實施方案中，所述附加序列包含一個或更多個以下非限制實例，包括：標識符序列(例如，條形碼)、測序引物雜交序列(例如，rd1)、接頭序列，及其他。在一些實施方案中，接頭序列為涉及用下一代測序技術分析的序列。在一些實施方案中，接頭序列為用于基于illumina測序技術的p5(seqidno：62)和/或p7(seqidno：63)序列。在一些實施方案中，接頭序列為與iontorrent測序技術兼容的p1(seqidno：64)和a(seqidno：65)。

在一些實施方案中，提供的方法用于制備涵蓋基因重排事件的核酸，其已經(jīng)發(fā)生于目的基因區(qū)域和未知融合伴侶之間。因此，更一般地，本文所提供的方法用于制備及評估具有與鄰接區(qū)域相鄰之靶區(qū)域的核酸(例如，其鄰接區(qū)域待被確定的序列)。在一些情況中，所述靶區(qū)域為已知基因(例如，癌基因)的區(qū)域，其為產(chǎn)生引起疾病之融合蛋白的基因重排的熱點。因此，在一些實施方案中，本文所描述的方法可用于鑒定融合事件的位置以及未知融合伴侶序列二者。在一些實施方案中，本文所提供的方法可用于擴增已發(fā)生于已知靶序列3’的基因重排。在一些實施方案中，方法可用于擴增已發(fā)生于已知靶基因座5’的基因重排。在另一些實施方案中，該方法可用于鑒定倒位、缺失或易位事件。在一些實施方案中，靶核酸為信使rna。在一些實施方案中，靶核酸為染色體rna區(qū)段。本文所提供的方法可用于通過分離基因組dna并擴增包含與這些融合相關的斷裂點的基因座，從而在dna水平制備涵蓋這些重排的核酸。在另一些實施方案中，本文所提供的方法可用于通過分離細胞rna并擴增包含這些重排的基因座所編碼的融合mrna，從而在rna水平制備涵蓋這些重排的核酸。在一些實施方案中，該方法可用于評估與癌癥相關的ret、ros1、fgfr3以及alk融合。

以下表格提供了基因重排的另一些非限制實例列表，其可以使用本文提供的方法進行探尋。

表1：由染色體重排導致的癌基因

*該列中所列出的癌癥類型為與每種癌基因主要相關的那些類型，但此表不是完全列表。

在一些實施方案中，所提供的方法用于制備核酸，其具有位于鄰接區(qū)域(例如，未知序列內(nèi)容的鄰接區(qū)域)5’的靶區(qū)域。例如，圖1舉例說明了用于制備核酸的示例性方法，該核酸具有位于鄰接區(qū)域5’的靶區(qū)域。在步驟101中，獲得起始rna或將其作為模板分子提供。將rna模板暴露于多個寡核苷酸，其共有位于不同雜交序列5’的共同序列。在一些實施方案中，由多個寡核苷酸所共有的共同序列也包含rna聚合酶啟動子序列。在一些實施方案中，至少一個雜交序列與該rna模板的區(qū)域雜交，并且作用是引發(fā)第一反轉錄酶反應以產(chǎn)生與起始rna互補的dna分子。在步驟102中，將該起始rna模板從雜交的rna-dna分子酶促降解(例如，通過rna酶h)。應當理解的是，如本文所述，雖然在所提供的實施例中使用了rna酶h，也可使用許多具有rna酶活性的酶。

在步驟103中，存留的dna分子被一個或更多個靶特異性寡核苷酸接觸，以使得靶特異性寡核苷酸與該dna的區(qū)域雜交并延伸以合成互補的dna鏈。在一些實施方案中，此反應由phoenixdna聚合酶進行。在一些實施方案中，此反應由也具有dna聚合酶活性的雙功能反轉錄酶(例如，amv反轉錄酶)進行。然而，應當理解的是，如本文所描述，可以使用其他合適的聚合酶。在步驟104中，使用在共同序列中包含的rna聚合酶啟動子，rna聚合酶轉錄與dna模板互補的rna分子。在一些實施方案中，可以將步驟101至步驟104重復多個循環(huán)，每個循環(huán)以從步驟104產(chǎn)生的互補rna分子開始，其充當步驟101的模板。轉錄的rna可接著在步驟105中純化。

在步驟106中，含有5’共同序列的純化rna隨后與一個或更多個靶特異性寡核苷酸接觸。靶特異性寡核苷酸#1與互補rna在靶序列處雜交，并引發(fā)模板依賴性反轉錄酶反應以產(chǎn)生互補的dna鏈。在步驟107中，將rna模板從互補的雜交rna-dna分子中由rna酶h酶促降解(例如通過rna酶活性)。在步驟108中，存留的dna分子與寡核苷酸接觸，所述寡核苷酸包含編碼rna聚合酶啟動子的序列，該序列位于與存在于所述dna分子3’末端上的共同序列互補的序列5’端。所述寡核苷酸在反應中通過dna聚合酶的活性延伸以產(chǎn)生互補的dna鏈。在步驟109中，rna聚合酶利用該rna聚合酶啟動子轉錄互補的rna分子。將步驟106至步驟109重復多個循環(huán)，每個循環(huán)從步驟109產(chǎn)生的互補的rna分子開始，所述rna分子充當步驟106的模板，從而擴增步驟109的rna。

應當理解的是，在一些實施方案中，從106至109的循環(huán)數(shù)至少部分地受到等溫反應持續(xù)時間的影響。此外，在一些實施方案中，當該過程通過步驟109循環(huán)時，所產(chǎn)生的dna模板累積，以使得最后的循環(huán)導致rna分子庫相對于起始材料的指數(shù)擴增。來自反應109的rna分子也可在步驟110中純化，為后續(xù)步驟做準備。在一些實施方案中，步驟101至步驟109在單個反應管中連續(xù)進行。在一些實施方案中，所有涉及步驟101至步驟109的組分在開始時并貫穿整個反應存在。在一些實施方案中，步驟101至步驟109以等溫反應進行。

任選地，可以進行擴增的第二個循環(huán)，其中在步驟110中純化的rna分子與一個或更多個靶特異性寡核苷酸接觸。在步驟111中，所述靶特異性寡核苷酸與互補rna在靶序列處雜交，并引發(fā)模板依賴性反轉錄酶反應，產(chǎn)生互補的dna鏈。在步驟112中，將rna模板從互補的dna鏈酶促降解(例如，由rna酶h)。在步驟113中，存留的dna分子與寡核苷酸接觸，所述寡核苷酸包含編碼rna聚合酶啟動子的序列，該序列位于與存在于所述dna分子3’末端上的共同序列互補的序列5’端。該寡核苷酸通過dna聚合酶的活性延伸以產(chǎn)生互補的dna鏈。在步驟114中，rna聚合酶利用所述rna聚合酶啟動子以轉錄互補的rna分子。將步驟111至步驟114重復多個循環(huán)，每個循環(huán)從步驟114產(chǎn)生的互補的rna分子開始，其充當步驟111的模板。來自步驟114的rna分子也可在步驟115中純化，為后續(xù)步驟做準備。在一些實施方案中，如果需要，也可進行另外的擴增循環(huán)。

在步驟116中，純化的rna與一個或更多個靶特異性寡核苷酸#2接觸，所述寡核苷酸包含靶特異性序列和位于所述靶特異性序列5’的附加序列，所述附加序列可包含共同序列、條形碼、索引或接頭序列。所述靶特異性寡核苷酸與互補rna在靶序列處雜交，并引發(fā)反轉錄酶反應，產(chǎn)生互補的dna鏈，其也包含由靶特異性寡核苷酸#2提供的5’附加序列。在一些實施方案中，靶特異性寡核苷酸#1與靶特異性寡核苷酸#2包含有區(qū)別的序列。在一些實施方案中，靶特異性寡核苷酸#2的序列存在于模板dna分子3’內(nèi)/靶特異性寡核苷酸#1序列下游，以使得反應嵌套。

在步驟117中，將rna模板鏈酶促降解(例如通過rna酶h)。在步驟118中，存留的dna分子與寡核苷酸接觸，所述寡核苷酸包含與存在于所述dna分子3’末端上的共同序列互補的序列以及附加序列，所述附加序列可包含任何一個或更多個序列，其包括條形碼、索引和接頭序列。所述寡核苷酸雜交并延伸以產(chǎn)生互補的dna鏈。所得的dna分子是雙鏈的，并且包含靶序列及其鄰接序列，其側翼為附加序列，所述附加序列包含用于合適的測序平臺的接頭序列。在反應119中將產(chǎn)物純化并準備用于分析。任選地，在步驟118的寡核苷酸上提供的附加序列可包含位于互補的共同序列5’的rna聚合酶啟動子。在此情況下，在步驟118的延伸反應之后，在步驟120中，rna聚合酶利用所述rna聚合酶啟動子以轉錄互補的rna分子。將步驟116至步驟118重復多個循環(huán)，每個循環(huán)從步驟118產(chǎn)生的互補的rna分子開始，其充當步驟116的模板。來自步驟120的rna分子也可在步驟121中純化，為后續(xù)步驟做準備。

可以進行另外的擴增循環(huán)以在核酸的一端或兩端添加附加序列。在步驟122中，具有與rna分子3’末端互補的序列的寡核苷酸與該rna雜交，并引發(fā)模板依賴性反轉錄酶反應，產(chǎn)生互補的dna鏈。在一些實施方案中，步驟122的寡核苷酸包含附加序列。在一些實施方案中，所述附加序列包含條形碼、索引和/或接頭序列。在步驟123中，將rna模板從互補dna鏈酶促降解(例如，通過rna酶h)。在步驟124中，存留的dna分子與寡核苷酸接觸，所述寡核苷酸包含與存在于所述dna分子3’末端上的共同序列互補的序列以及附加序列，所述附加序列可包含任何一個或更多個序列，其包括條形碼、索引和接頭序列。在一些實施方案中，所述寡核苷酸雜交并延伸以產(chǎn)生互補的dna鏈，其在步驟125中純化。在一些實施方案中，所得的dna分子為雙鏈的，并且包含靶序列及其鄰接區(qū)域，其側翼為附加序列，所述附加序列包含用于合適的測序平臺的接頭序列。

在一些實施方案中，提供的方法用于制備核酸，所述核酸具有位于鄰接區(qū)域(例如，未知序列內(nèi)容的鄰接區(qū)域)3’的靶區(qū)域。例如，圖2舉例說明了用于制備具有位于鄰接區(qū)域3’之靶區(qū)域的核酸的示例性方法。獲取起始rna或將其作為模板分子提供。在步驟201中，該rna模板暴露于一個或更多個靶特異性寡核苷酸，指的是靶特異性寡核苷酸#1，其與起始rna的靶區(qū)域互補。靶特異性寡核苷酸#1雜交并引發(fā)第一反轉錄酶反應以產(chǎn)生與起始rna互補的dna分子。在步驟202中，將所述起始rna模板從互補的雜交rna-dna分子酶促降解(例如，通過rna酶h)。在步驟203中，存留的dna分子與多個寡核苷酸接觸，所述寡核苷酸共有位于不同雜交序列5’的共同序列(例如，隨機或偽隨機序列、不同的預定序列組等)。在一些實施方案中，被多個寡核苷酸共有的共同序列還含有rna聚合酶啟動子序列。在一些實施方案中，至少一個雜交序列與dna的區(qū)域雜交并延伸以合成第二互補dna鏈。在步驟204中，使用rna聚合酶啟動子序列，rna聚合酶轉錄與dna模板互補的rna分子。該經(jīng)轉錄的rna接著在步驟205中純化。

在步驟206中，含有5’共同序列的純化的rna隨后與一個或更多個靶特異性寡核苷酸#1接觸。靶特異性寡核苷酸與互補rna在靶序列處雜交并引發(fā)模板依賴性反轉錄酶反應，產(chǎn)生互補的dna鏈。在反應207中，將該rna模板從互補的雜交rna-dna分子酶促降解(例如，rna酶h活性)。在步驟208中，存留的dna分子與寡核苷酸接觸，所述寡核苷酸包含編碼rna聚合酶啟動子的序列，所述啟動子序列位于與存在于所述dna分子3’末端上的共同序列互補的序列5’端。所述寡核苷酸延伸以產(chǎn)生互補的dna鏈。在步驟209中，rna聚合酶利用所述rna聚合酶啟動子轉錄互補的rna分子。將步驟206至步驟209重復多個循環(huán)，每個循環(huán)從步驟209產(chǎn)生的互補的rna分子開始，其充當步驟206的模板。來自反應209的rna分子也可在步驟210中純化，為后續(xù)步驟做準備。在一些實施方案中，步驟201至步驟209在單個反應管中連續(xù)進行。在一些實施方案中，步驟201至步驟209以等溫反應進行。

任選地，可以進行擴增的第二個循環(huán)，其中在步驟210中純化的rna分子與一個或更多個靶特異性寡核苷酸#2接觸。在一些實施方案中，一個或更多個靶特異性寡核苷酸的使用增添了特異性，并且還富集了包含靶序列的核酸。在步驟211中，該靶特異性寡核苷酸#2與互補rna在靶序列處雜交，并引發(fā)模板依賴性反轉錄酶反應，產(chǎn)生互補的dna鏈。在步驟212中，將rna模板酶促降解(例如，rna酶h)。在步驟213中，存留的dna分子與寡核苷酸接觸，所述寡核苷酸包含編碼rna聚合酶啟動子的序列，所述啟動子序列位于與存在于所述dna分子3’末端上的共同序列互補的序列5’端。所述寡核苷酸通過dna聚合酶的活性延伸以產(chǎn)生互補的dna鏈。在一些實施方案中，dna活性由雙功能酶(例如，amv反轉錄酶)提供。在步驟214中，rna聚合酶轉錄互補的rna分子。將步驟211至步驟214重復多個循環(huán)，每個循環(huán)從步驟214產(chǎn)生的互補的rna分子開始，其充當步驟211的模板。步驟214產(chǎn)生的rna分子也可在步驟215中純化。在一些實施方案中，如果需要，也可進行另外的擴增循環(huán)。

在步驟216中，純化的rna與一個或更多個靶特異性寡核苷酸#2接觸，所述寡核苷酸包含靶特異性序列及5’附加序列，所述附加序列可包含共同區(qū)域、條形碼、索引和/或接頭序列。然而，應當理解的是，在該過程中可以使用相似的方法將附加序列在其他點處并入。所述靶特異性寡核苷酸與互補rna在靶序列處雜交，并引發(fā)反轉錄酶反應，產(chǎn)生互補的dna鏈，所述dna鏈也包含由靶特異性寡核苷酸#2提供的5’附加序列。在一些實施方案中，靶特異性寡核苷酸#1與靶特異性寡核苷酸#2包含有區(qū)別的序列。在一些實施方案中，靶特異性寡核苷酸#2的序列存在于模板dna分子3’內(nèi)/靶特異性寡核苷酸#1序列下游，以使得反應嵌套進行。

在步驟217中，將rna模板鏈酶促降解(例如rna酶h)。在反應218中，存留的dna分子與寡核苷酸接觸，所述寡核苷酸包含與存在于所述dna分子3’末端上的共同序列互補的序列以及附加序列，所述附加序列可包含條形碼、索引和/或接頭序列。所述寡核苷酸雜交并延伸以產(chǎn)生互補的dna鏈。所得的dna分子是雙鏈的，并且包含靶序列及其鄰接序列，其側翼為附加序列，所述附加序列包含用于合適的測序平臺的接頭序列。在步驟219中將產(chǎn)物純化并準備用于分析。

在一些實施方案中，圖1和圖2中描述的方法也可在相同反應容器(例如，管、筒孔(cartridgewell))中平行進行，例如以類似于圖4的方式進行。

在一些實施方案中，提供的方法用于使用dna模板制備包含靶基因座和鄰接區(qū)域的核酸。例如，圖3描繪了用于使用dna模板擴增包含靶基因座和鄰接區(qū)域的核酸的示例性方法。獲取起始dna或將其作為模板分子提供。在步驟301中，該dna分解成片段(例如，具有適合長度以用于測序的片段，例如，片段長度范圍為100-600、100-1000、100-1500或更多堿基對)。在步驟302中，片段化dna的末端被修復，并且將末端磷酸基團添加于每個5’末端。在步驟302中，還通過末端轉移酶的活性在每個3’末端產(chǎn)生單個腺苷突出端。使用該末端磷酸基團和腺苷突出端，在步驟303中將雙鏈接頭連接于dna片段的任一末端上。在一些實施方案中，該接頭分子可包含共同序列。在一些實施方案中，該接頭分子還包含rna聚合酶啟動子序列，以使得連接反應產(chǎn)生在兩端側翼為共同序列和rna聚合酶啟動子序列的雙鏈dna分子。

在一些實施方案中，寡核苷酸(例如，充當接頭分子的寡核苷酸)可包含一個或更多個修飾以加強其穩(wěn)定性和/或并入該寡核苷酸的反應產(chǎn)物的穩(wěn)定性。這樣的修飾的非限制實例包括堿基修飾和骨架修飾。在一些實施方案中，磷硫酰鍵的存在或其他在3’胸腺嘧啶突出端中的骨架修飾阻止了3’核酸外切酶將寡核苷酸平末端化的活性。在一些實施方案中，寡核苷酸接頭分子的底鏈(bottomstand)可具有反向的脫氧胸腺嘧啶，其阻止了pcr/amp在后續(xù)步驟中產(chǎn)生非基因特異性的產(chǎn)物。

在步驟304中，rna聚合酶使用側翼rna聚合酶啟動子序列的一個或兩個轉錄，以在一個或兩個方向都產(chǎn)生互補的rna分子。在一些實施方案中，rna從dna分子的正鏈和負鏈兩者合成。在一些實施方案中，從這兩條鏈合成是有優(yōu)勢的，因為可以使用靶特異性寡核苷酸，根據(jù)合成rna分子所來源的鏈沿著單個dna鏈在5’或3’方向延伸，從而延伸所合成的rna。因此，在一些實施方案中，從模板分子的正鏈和負鏈兩者產(chǎn)生rna促進了在靶序列任意方向上鄰接的未知序列的擴增及鑒定。

在步驟305中，將該rna分子與包含與rna分子上的共同序列互補之序列的寡核苷酸接觸。在一些實施方案中，所述寡核苷酸還包含rna聚合酶啟動子序列。在步驟305中，所述寡核苷酸雜交并引發(fā)反轉錄酶反應，產(chǎn)生互補的dna分子。在步驟306中，將該rna模板從互補的雜交rna-dna分子酶促降解(例如，rna酶h)。在步驟307中，存留的dna分子與一個或更多個靶特異性寡核苷酸接觸。在一些實施方案中，所述靶特異性寡核苷酸包含附加序列，所述附加序列可包含條形碼、索引和/或接頭序列。所述靶特異性寡核苷酸與dna的靶區(qū)域雜交并延伸，產(chǎn)生互補的dna鏈。在步驟308中，rna聚合酶轉錄與dna模板互補的rna分子。將步驟305至步驟308重復多個循環(huán)，每個循環(huán)從步驟308產(chǎn)生的互補的rna分子開始，其充當步驟305的模板。來自步驟308的rna分子也可在步驟309中純化，為后續(xù)步驟做準備。在一些實施方案中，步驟301至步驟309在單個反應管中連續(xù)進行。在一些實施方案中，步驟301至步驟309以等溫反應進行。

在步驟310中，純化的rna分子與一個或更多個靶特異性寡核苷酸#2接觸。在一些實施方案中，所述靶特異性寡核苷酸包含附加序列，所述附加序列包含條形碼、索引和接頭序列。所述靶特異性寡核苷酸#2雜交，并引發(fā)反轉錄酶反應，產(chǎn)生互補的dna分子。在一些實施方案中，靶特異性寡核苷酸#1與靶特異性寡核苷酸#2包含相同的序列。在一些實施方案中，靶特異性寡核苷酸#1與靶特異性寡核苷酸#2包含不同的序列。在一些實施方案中，靶特異性寡核苷酸#2的序列存在于模板dna分子3’內(nèi)/靶特異性寡核苷酸#1序列下游，以使得反應嵌套進行。

由步驟310所得到的dna分子可包含在靶特異性寡核苷酸#2上提供的附加序列。在步驟311中，將rna模板酶促降解(例如rna酶h)。存留的dna分子與寡核苷酸接觸，所述寡核苷酸包含與存在于所述dna分子3’末端上的共同序列互補的序列。在一些實施方案中，所述寡核苷酸包含任何一個或更多個附加序列，所述附加序列包含條形碼、索引和接頭序列。在步驟312中，所述寡核苷酸與dna分子的共同序列雜交并延伸以產(chǎn)生互補的dna鏈。步驟312的dna產(chǎn)物是雙鏈的，并且包含靶區(qū)域和鄰接區(qū)域，其側翼為附加序列，所述附加序列包含用于合適的測序平臺的接頭序列。在步驟313中將產(chǎn)物純化并準備用于分析。

在一些實施方案中，提供的方法用于制備核酸，所述核酸具有在其5’和/或3’端上側翼為鄰接區(qū)域(例如，未知序列內(nèi)容的鄰接區(qū)域)的靶區(qū)域。例如，圖4舉例說明了用于制備具有靶區(qū)域以及5’和/或3’鄰接區(qū)域的核酸的示例性方法。在步驟401中，獲取起始rna或將其作為模板分子提供。將rna模板暴露于多個寡核苷酸，所述寡核苷酸共有位于不同雜交序列5’的共同序列(共同序列#1)。在一些實施方案中，由多個寡核苷酸所共有的共同序列也包含rna聚合酶啟動子序列。在一些實施方案中，至少一個雜交序列與該rna模板的區(qū)域雜交，并且作用為引發(fā)第一反轉錄酶反應以產(chǎn)生與起始rna互補的dna分子。在步驟402中，將該起始rna模板從雜交的rna-dna分子酶促降解(例如，通過rna酶h)。應當理解的是，如本文所述，雖然在所提供的實例中使用了rna酶h，也可使用許多具有rna酶活性的酶。

在步驟403中，存留的dna分子與多個寡核苷酸接觸，所述寡核苷酸共有位于不同雜交序列5’的共同序列(例如，隨機或偽隨機序列、不同的預定序列組等)。在一些實施方案中，多個寡核苷酸共有的共同序列也包含rna聚合酶啟動子序列。在一些實施方案中，至少一個雜交序列與dna的區(qū)域雜交并延伸以合成第二互補dna鏈。在步驟404中，rna聚合酶使用rna聚合酶啟動子序列轉錄與dna模板互補的rna分子。在一些實施方案中，rna聚合酶啟動子存在于dna模板的兩端上。在一些實施方案中，這兩個rna聚合酶啟動子都可被rna聚合酶利用以產(chǎn)生互補rna的兩條鏈。該經(jīng)轉錄的rna接著在步驟405中純化。

在步驟406中，合成自一條或兩條模板鏈的經(jīng)純化rna與一個或更多個靶特異性寡核苷酸#1接觸。靶特異性寡核苷酸與互補rna在靶序列處(例如，在共同序列處)雜交并引發(fā)模板依賴性反轉錄酶反應，產(chǎn)生互補的dna鏈。在反應407中，將該rna模板從互補的雜交rna-dna分子酶促降解(例如，rna酶h活性)。在步驟408中，存留的dna分子與寡核苷酸接觸，所述寡核苷酸包含編碼rna聚合酶啟動子的序列，其位于與存在于所述dna分子3’末端上的共同序列互補的序列5’端。所述寡核苷酸延伸以產(chǎn)生互補的dna鏈。在步驟409中，rna聚合酶利用所述rna聚合酶啟動子轉錄互補的rna分子。將步驟406至步驟409重復多個循環(huán)，每個循環(huán)從步驟409產(chǎn)生的互補的rna分子開始，其充當步驟406的模板。來自反應409的rna分子也可在步驟410中純化，為后續(xù)步驟做準備。在一些實施方案中，步驟401至步驟409在單個反應管中連續(xù)進行。在一些實施方案中，步驟401至步驟409以等溫反應進行。

在步驟411中，純化的rna與一個或更多個靶特異性寡核苷酸接觸，所述寡核苷酸包含位于靶特異性序列5’的附加序列。在一些實施方案中，附加序列包括但不限于條形碼、索引和/或接頭序列。所述靶特異性寡核苷酸與互補rna在靶序列處雜交，并引發(fā)模板依賴性反轉錄酶反應，產(chǎn)生互補的dna鏈。在反應412中，將該rna模板從互補的雜交rna-dna分子酶促降解(例如，rna酶h活性)。在步驟413中，存留的dna分子與寡核苷酸接觸，所述寡核苷酸包含與存在于所述dna分子3’末端上的共同序列互補的序列。在一些實施方案中，步驟413的寡核苷酸包含附加序列，所述附加序列包括但不限于條形碼、索引和/或接頭序列。所述寡核苷酸延伸以產(chǎn)生互補的dna鏈，其在步驟414中被純化。在一些實施方案中，所得的dna分子是雙鏈的，并且包含靶序列及其鄰接區(qū)域，其側翼為附加序列，所述附加序列包含用于合適的測序平臺(例如，illumina平臺、iontorrent平臺，等)的接頭序列。

如本文所使用的，術語“核酸”指包含通過核苷酸間鍵共價連接在一起的多個核苷酸的聚合分子。在一些實施方案中，核酸為通過核苷酸間鍵共價連接在一起的多個核糖核苷酸形成的核糖核酸(ribonucleicacid，rna)。在一些實施方案中，核酸為通過核苷酸間鍵共價連接在一起的多個脫氧核糖核苷酸形成的脫氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid，dna)。在一些實施方案中，核酸包括一個或更多個核苷酸類似物(例如橋聯(lián)的核苷酸)或經(jīng)修飾的核苷酸，包括有標簽的或被標記的核苷酸。在一些實施方案中，核酸僅包括天然存在的核苷酸。在一些實施方案中，核酸僅包括非天然存在的核苷酸。在一些實施方案中，核酸包括天然存在的核苷酸與非天然存在的核苷酸的組合。在一些實施方案中，核酸為單鏈。在一些實施方案中，核酸為雙鏈。在一些實施方案中，核酸具有單鏈及雙鏈區(qū)域的組合。術語核酸還涵蓋具有核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸、核苷酸類似物(如橋聯(lián)的核苷酸)和/或經(jīng)修飾的核苷酸(包括有標簽的或被標記的核苷酸)之混合物的雜交分子。在一些方面，對核酸的破壞可有利于產(chǎn)生更小的核酸片段。在一些實施方案中，通過以下任何方式進行破壞：超聲(即，流體動力學剪切)、聲學剪切、針頭剪切(needleshearing)、弗氏壓碎器(frenchpressurecell)，或酶促(例如，限制性)消化。如本文所使用的術語“啟動子”指通過rna聚合酶開始核酸模板轉錄的核酸區(qū)域。

如本文所使用的，術語“寡核苷酸”指短核酸。在一些實施方案中，寡核苷酸長度為2至250個核苷酸、長度為2至100個核苷酸、長度為10至100個核苷酸、長度為10至50個核苷酸、或長度為10至30個核苷酸。在一些實施方案中，寡核苷酸長度達2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200或250個核苷酸。在一些實施方案中，寡核苷酸為單鏈。在一些實施方案中，寡核苷酸為雙鏈。在一些實施方案中，寡核苷酸包含雜交序列，其通過與至少部分的靶核酸形成互補堿基對與靶核酸雜交。

在一些實施方案中，寡核苷酸具有能夠引發(fā)延伸反應的3’末端。在一些實施方案中，雜交序列長度可以為6至50個核苷酸、長度為6至35個核苷酸、長度為6至20個核苷酸、長度為10至25個核苷酸。在合適的溫度及溶液離子強度條件下，當單鏈形式的核酸分子或其雜交序列可退火于其他核酸分子時，寡核苷酸能夠與另一核酸“雜交”，如cdna、基因組dna或rna。當兩個核酸包含足夠的互補序列時發(fā)生雜交，并且依賴于雜交的嚴格性，堿基之間的錯配是可能的。在一些實施方案中，核酸雜交的合適的嚴格性依賴于核酸的長度以及互補程度、gc含量，以及其他參數(shù)。在一些實施方案中，兩個核苷酸序列之間的相似性或同源性程度越大，則具有那些序列的核酸的雜交體的tm值就越大。核酸雜交的相對穩(wěn)定性(對應于更高的tm)按如下順序降低：rna：rna、dna：rna、dna：dna。術語“互補”描述了能夠彼此雜交的核苷酸破基之間的關系。例如，對于dna而言，腺苷與胸腺嘧啶互補，而胞嘧啶與鳥嘌呤互補。

在一些實施方案中，寡核苷酸中的gc含量約為20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或更高。在一些實施方案中，寡核苷酸中的gc含量的范圍為20％至80％、20％至70％、35％至65％、40％至60％、或45％至55％。在一些實施方案中，寡核苷酸在3’末端上包含多個(例如，2-3、2-4、2-5個或更多個)鳥嘌呤或胞嘧啶核苷酸(例如，gc夾)。

在一些實施方案中，本文所公開的寡核苷酸包含一個或更多個經(jīng)修飾的核苷酸。在一些實施方案中，修飾寡核苷酸的5’和/或3’末端。在一些實施方案中，修飾一個或更多個內(nèi)部的核苷酸。寡核苷酸可以在堿基部分、糖部分或磷酸骨架上進行修飾，以例如改善該分子的穩(wěn)定性、對核酸酶介導的降解的抗性、其雜交參數(shù)等。在一些實施方案中，寡核苷酸可以包含的經(jīng)修飾堿基部分選自：5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羥基甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β-d-半乳糖基q核苷(beta-d-galactosylqueosine)、肌苷、n6-異戊烯腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、n6-腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-d-甘露糖基q核苷、5′-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-n6-異戊烯腺嘌呤、懷丁氧苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、q核苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸，以及2，6-二氨基嘌呤。另外修飾的實例包括甲基化、加“帽”、一個或更多天然存在的核苷酸替換為類似物，以及核苷酸間修飾，例如具有無電荷的連接(例如，膦酸甲基酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)和具有帶電荷的連接(硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些、及其組合。此外，在一些實施方案中本文的寡核苷酸也可用能夠提供直接或非直接的可檢測信號的標記修飾。示例性的標記包括放射性同位素、熒光分子、生物素等。在一些實施方案中，本文公開的寡核苷酸包含5’生物素連接基團(linker)或其他合適的連接基團。在一些實施方案中，寡核苷酸包含限制性消化序列，以使得以合適的限制性消化酶進行的切割導致去除該連接基團。在另一些實施方案中，寡核苷酸的5’末端包含核酸序列，其與結合于珠或其他支持物(例如，流動池基底)的核酸互補。

在一些實施方案中，其中多個寡核苷酸組合于共同反應中，設計寡核苷酸以最小化或防止同源或異源多聚體(例如，同源或異源二聚體)的形成。

在一些實施方案中，寡核苷酸包含與核酸的靶序列互補的雜交序列，其中所述靶序列在距離核酸的已知序列與鄰接序列之間的連接的預定距離內(nèi)。在一些實施方案中，所述連接為基因組組裝中片段之間的連接。在一些實施方案中，所述連接為導致兩個核酸之間融合的斷裂點(例如，由基因組重排導致的斷裂點)。在一些實施方案中，靶序列的末端在核酸的已知序列與鄰接序列(例如，未知序列)之間的連接的10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300或更多個核苷酸之內(nèi)。

在一些實施方案中，靶特異性寡核苷酸在本文公開的制備方法中的使用促進了擴增本來難以用相對引物靶向的模板，所述靶特異性寡核苷酸具有與在模板上的不同的靶序列(例如，靶序列#1和靶序列#2)在相同方向或取向上互補的雜交序列。在該實施方案中，使用具有與不同靶序列在相同方向或取向上互補的雜交序列的靶特異性寡核苷酸，提供了與模板已知區(qū)域互補的兩條雜交序列的特異性益處，而不必利用具有與靶序列在相反方向互補的雜交序列的靶特異性寡核苷酸以覆蓋靶區(qū)域。因此，在一些實施方案中，使用與靶序列在相同方向或取向上互補的寡核苷酸促進了在通常反應中的跨長模板區(qū)域的嵌合(tile)。

在一些實施方案中，寡核苷酸(例如，靶寡核苷酸，具有不同雜交序列的寡核苷酸)也可包含附加的功能性序列。在一些實施方案中，通過使用在其5’末端含有附加序列的寡核苷酸擴增靶序列從而將附加序列并入核酸中。在一些實施方案中，包含共同序列的寡核苷酸也含有附加序列。在一些實施方案中，靶特異性寡核苷酸也含有附加序列。在一些實施方案中，附加序列包含一個或更多個以下非限制實例：標識符序列(例如，條形碼，索引)、測序引物雜交序列(例如，rd1)和接頭序列。在一些實施方案中，接頭序列為用于下一代測序系統(tǒng)的序列。在一些實施方案中，接頭序列為用于基于illumina測序技術的p5(seqidno：62)和p7(seqidno：63)序列。在一些實施方案中，接頭序列為與iontorrent測序技術兼容的p1(seqidno：64)和a(seqidno：65)。

如本文所使用的，“條形碼”或“索引”序列為充當核酸來源或位置識別符的核苷酸序列。例如，條形碼或索引序列可以用于鑒定患者，從其所獲得的核酸模板待用于處理和測序。在一些實施方案中，并入dna片段中的條形碼或索引序列使得能夠在單個流動池上對多個不同樣品進行測序。在一些實施方案中，可使用索引序列以定向序列成像器(sequenceimager)，其目的在于檢測單個測序反應。在一些實施方案中，條形碼或索引序列的長度可以為2至25個核苷酸、2至15個核苷酸、2至10個核苷酸、2至6個核苷酸。

如本文所使用的，“接頭”序列指用于將核酸(例如，擴增的dna產(chǎn)物)與下一代測序平臺或其他物質相連，以用于固定核酸的序列。在一些實施方案中，接頭序列包含測序引物雜交序列。在一些實施方案中，接頭序列包含用于基于illumina測序的p5(seqidno：62)和/或p7(seqidno：63)序列。在一些實施方案中，接頭序列包含與iontorrent測序技術兼容的p1(seqidno：64)和/或a(seqidno：65)序列。在一些實施方案中，接頭序列的長度可以為4至50個核苷酸、4至30個核苷酸、4至20個核苷酸、15至30個核苷酸。

如本文所使用的，術語“擴增”指增加核酸模板拷貝數(shù)的過程。在一些實施方案中，擴增包括使用一種或更多種由模板合成核酸的聚合酶。在一些實施方案中，擴增在等溫反應下完成。在一些實施方案中，擴增在包括多個溫度循環(huán)(如在聚合酶鏈式反應中)的條件下完成。在一些實施方案中，擴增包括一個或更多個模板依賴性延伸，其由在其3’末端與模板雜交的寡核苷酸引發(fā)。在一些實施方案中，模板依賴性延伸通過反轉錄酶進行。在一些實施方案中，模板依賴性延伸通過dna聚合酶進行。在一些實施方案中，模板依賴性延伸通過還含有dna聚合酶活性的反轉錄酶進行。模板依賴性延伸反應可使用任何合適的核酸作為模板來進行。在一些實施方案中，模板依賴性延伸在dna模板上進行。在一些實施方案中，模板依賴性延伸在rna模板上進行。在一些實施方案中，擴增包括一個或更多個轉錄反應。在一些實施方案中，擴增包括一個或更多個模板依賴性延伸與一個或更多個轉錄反應的組合。在一些實施方案中，擴增導致核酸模板拷貝數(shù)的線性增加。在一些實施方案中，在線性擴增中，核酸的一個或更多個拷貝由單獨一組的一個或更多個核酸模板產(chǎn)生。在一些實施方案中，擴增導致核酸模板拷貝數(shù)的指數(shù)增加。在一些實施方案中，在指數(shù)擴增中，新形成的核酸拷貝充當用于產(chǎn)生其他模板拷貝的模板，從而導致核酸庫的指數(shù)擴增。

如本文所使用的，術語“模板”指雙鏈或單鏈核酸，其充當核酸合成的底物，例如用于模板依賴性延伸或轉錄反應。在雙鏈dna分子的情況中，其兩條鏈的至少一部分的變性可在核酸合成之前或與其相結合地進行。在一些實施方案中，模板為單鏈，并且不需要在核酸合成之前或與其相結合地進行變性。在一些實施方案中，當與核酸模板的一部分互補的寡核苷酸通過雜交序列與模板雜交時，合適的聚合酶隨后可合成與該模板互補的核酸。在一些實施方案中，rna聚合酶可從啟動子區(qū)合成與模板的反義鏈互補的核酸。在一些實施方案中，模板為具有長度達10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、1000、2000、3000或更多個核苷酸的核酸。

如本文所使用的，術語“模板依賴性延伸”指這樣的過程，其中寡核苷酸通過雜交序列在其3’末端與單鏈核酸模板的互補序列雜交，所述寡核苷酸通過互補核苷酸與該寡核苷酸3’末端的順序共價鍵合酶促延伸，從而形成與模板互補的新核酸。在一些實施方案中，模板依賴性延伸產(chǎn)生部分或完全的帶有與模板雜交之延伸產(chǎn)物的雙鏈核酸。

在一些實施方案中，延伸反應包括與模板核酸的互補區(qū)域雜交的寡核苷酸，并且作用是引發(fā)延伸反應以產(chǎn)生互補dna鏈。在一些實施方案中，由模板合成互補dna鏈可通過dna聚合酶進行。在一些實施方案中，在酶進行模板依賴性延伸的條件下使用dna聚合酶i。也能夠執(zhí)行該功能的dna聚合酶的非限制實例包括：taq聚合酶、pheonixtaq聚合酶、phusion聚合酶、t4聚合酶、t7聚合酶、klenow片段、klenowexo-、phi29聚合酶、amv反轉錄酶、m-mulv反轉錄酶、hiv-1反轉錄酶、verasequltra聚合酶和enzscript。在一些實施方案中，dna聚合酶不是反轉錄酶。在一些實施方案中，dna聚合酶作用于dna模板。在一些實施方案中，dna聚合酶作用于rna模板。

在一些實施方案中，延伸反應包括在rna上進行的反轉錄，以產(chǎn)生互補的dna分子(依賴rna的dna聚合酶活性)。在一些實施方案中，可以使用來自小鼠莫洛尼鼠白血病病毒(molonymurineleukemiavirus，m-mlv)的反轉錄酶。應當理解的是，可以使用許多其他反轉錄酶，包括但不限于：amv反轉錄酶、rsv反轉錄酶、hiv-1反轉錄酶、hiv-2反轉錄酶或者其他本文所公開的酶。

如本文所使用的，術語“延伸產(chǎn)物”指與核酸模板互補并且由模板依賴性延伸形成的核酸。在一些實施方案中，與核酸模板雜交的寡核苷酸的雜交序列的3’末端充當引物以用于模板依賴性延伸，這產(chǎn)生與所述核酸模板互補的新核酸。延伸產(chǎn)物可以完全或部分地與其所產(chǎn)自的核酸模板互補。

在一些實施方案中，使用具有雜交序列和附加序列的寡核苷酸產(chǎn)生延伸產(chǎn)物，所述雜交序列與靶核酸互補，所述附加序列位于雜交序列的5’端，其不與模板互補，并且并入延伸產(chǎn)物的5’末端。該附加序列可包含標簽、條形碼、索引、接頭或其他序列以用于將期望的特征并入延伸產(chǎn)物中。在一些實施方案中，當延伸反應并未延伸至模板全長時，產(chǎn)生部分互補的延伸產(chǎn)物。

在一些實施方案中，部分互補的延伸產(chǎn)物在模板內(nèi)部序列上引發(fā)。在一些實施方案中，部分互補的延伸產(chǎn)物具有與模板序列完全互補的3’區(qū)域以及非互補的5’區(qū)域，其中非互補的5’區(qū)域為引發(fā)產(chǎn)生延伸產(chǎn)物之延伸反應的寡核苷酸的附加序列。

如本文所使用的，術語“等溫反應”指這樣的反應，其包括一種或更多種作用于核酸模板的酶，以在相對均一的溫度條件下產(chǎn)生模板或部分模板的拷貝。在一些實施方案中，等溫反應包括在相對均一的溫度條件下指數(shù)擴增dna和/或rna分子，為測序做準備。在一些實施方案中，等溫反應在相對均一的溫度條件下，在穩(wěn)定的狀態(tài)反應條件下進行。在一些實施方案中，等溫反應包括在相對均一的溫度條件下進行一輪或更多輪的擴增。在一些實施方案中，等溫反應在以下范圍中進行：35℃至50℃、38℃至42℃、39℃至42℃或35℃至45℃(例如，約41℃)。在一些實施方案中，等溫反應在約35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃或50℃下進行。

如本文所使用的，術語“聚合酶”指合成核酸的酶。該術語涵蓋dna聚合酶、rna聚合酶以及反轉錄酶等。在一些實施方案中，聚合酶通過由在其3’末端與模板雜交的寡核苷酸引發(fā)的模板依賴性延伸合成核酸。在一些實施方案中，聚合酶通過轉錄反應合成核酸。在一些實施方案中，聚合酶在合適的緩沖液條件下以及在以下溫度范圍中優(yōu)化地合成核酸：35℃至80℃或35℃至75℃或35℃至70℃或35℃至70℃或35℃至65℃或35℃至60℃或35℃至55℃或35℃至50℃或35℃至45℃或40℃至70℃或50℃至60℃或55℃至65℃。

在一些實施方案中，聚合酶為熱穩(wěn)定的聚合酶。在一些實施方案中，所述熱穩(wěn)定的聚合酶為來自于例如水生棲熱菌(thermusaquaticus)、嗜熱棲熱菌(t.thermophilus)、t.bockianus、黃棲熱菌(t.flavus)、紅色棲熱菌(t.rubber)、thermococcuslitoralis、激烈火球菌(pyroccocusfuriousus)、沃氏火球菌(p.wosei)、pyrococcusspec.、海棲熱袍菌(thermatogamaritime)、嗜酸熱源體(thermoplasmaacidophilus)或sulfolobusspec.之嗜熱的真細菌(eubacteria)或古細菌(archaebacteria)聚合酶。

在一些實施方案中，本文所公開的方法包括rna的降解。這種酶的一個非限制性實例為rna酶h，其降解rna-dna雜交體中的rna鏈。另外的核糖核酸酶的實例包括rna酶a、rna酶i、rna酶iii和rna酶l。在一些實施方案中，使用非酶促方法降解rna。應當理解的是，存在許多方法及試劑在反應中降解rna，包括但不限于提高溶液的ph(其可以通過許多方法完成，包括但不限于添加naoh)，以及提高反應溫度。在一些實施方案中，該反應的ph通過添加naoh提高至ph為10.0。

在一些實施方案中，本文公開的方法包括去除或降解反應中過量的寡核苷酸和其他核酸。在一些實施方案中，將核酸酶促降解。在一些實施方案中，在存在允許酶執(zhí)行指定活性的緩沖液和條件的情況下，大腸桿菌(e.coli)核酸外切酶i被用于降解單鏈核酸。

在一些實施方案中，本文公開的方法包括將雙鏈接頭與dna片段的任一末端相連。在此情景下，連接指兩個核酸之間的共價磷酸二酯鍵。在一些實施方案中，連接會在兩條雙鏈dna分子之間發(fā)生，例如在雙鏈接頭與雙鏈dna片段之間，以使得在dna的兩條鏈之間形成共價磷酸二酯鍵。在一些實施方案中，連接活性通過連接酶酶促執(zhí)行。任何下述非限制列表中的具有連接酶活性的酶可用于進行該反應：大腸桿菌dna連接酶、t4dna連接酶、tawdna連接酶、t3dna連接酶。

在一些實施方案中，本文公開的方法包括將rna聚合酶啟動子序列與核酸相連。添加rna聚合酶啟動子允許rna聚合酶的識別，這將會執(zhí)行依賴于dna的rna聚合酶活性，產(chǎn)生互補的rna鏈。該啟動子的實例包括但不限于t7、t3和sp6啟動子。

在一些實施方案中，本文公開的方法包括從反應混合物純化核酸，為后續(xù)的步驟或分析做準備。在一些實施方案中，進行rna純化。在一些實施方案中，可以使用任何合適的純化方法。在一些實施方案中，可以使用ampure試劑盒，其使用了基于珠的固相提取。在一些實施方案中，另外的方法包括但不限于其他固相提取方法(例如，基于柱的方法)及液體-液體提取方法(例如，酚-氯仿)。

在一些實施方案中，所提供的試劑盒包含多種對于進行制備和/或測序反應必要的試劑以及根據(jù)本文所述方法使用的說明書。本文所公開的任何酶、寡核苷酸、核酸或試劑可以以任何組合配制于試劑盒中。在試劑盒的一些實施方案中，至少一個容器為可重復使用的容器。在試劑盒的一些實施方案中，至少一個容器為一次性使用的容器。在試劑盒的一些實施方案中，至少一個容器為管、瓶或筒(例如，多孔筒)。在一些實施方案中，配置試劑盒以使得在筒的不同位置處進行一個或更多個過程。在一些實施方案中，筒可裝有或含有用于制備核酸的每組步驟或過程的干燥或凍干的組分。在一些實施方案中，本文所提供的試劑盒包含管，例如扣蓋管或旋蓋管。在試劑盒的一些實施方案中，瓶為扣蓋瓶或旋蓋瓶。在一些實施方案中，至少一個容器為玻璃小瓶。在一些實施方案中，將容器一起放置于盒子或包裝中。在一些實施方案中，試劑盒還包含用于制備核酸的說明書(例如，根據(jù)實施例1至實施例3所概述的一個或更多個步驟)。在一些實施方案中，試劑盒還包含用于在特定的溫度下(例如，低于0℃，室溫等)儲存至少一個容器的說明書。在一些實施方案中，試劑盒還包含使用該試劑盒中所提供的試劑進行任何本文公開方法的說明書。

雖然在一些實施方案中，本文公開的試劑盒可用于研究目的，但在另一些實施方案中，本文公開的試劑盒可用于診斷目的。因此，在一些實施方案中，所述試劑盒包含一種或更多種試劑或組分，其可用于在患有病癥(例如，癌癥)的個體中診斷或輔助診斷的方法。

通過以下實施例將更加詳細地描述本發(fā)明的示例性實施方案。這些實施方案為本發(fā)明的示例，本領域技術人員將認識到本發(fā)明不限于這些示例性實施方案。

實施例

實施例1：使用反轉錄酶與標簽隨機寡核苷酸(randomer)和靶向第二鏈寡核苷酸擴增3’融合事件的等溫方法

擴增#1

作為向擴增帶有未知融合伴侶的3’融合事件的第一步，使用從福爾馬林固定的組織樣品獲得的rna進行第一擴增反應。

在室溫下，用反應緩沖液將下列反應物集合：

●1μl純化的rna(50ng)

●1μl3μmv3-fgfrgsp1

●1μl5μmt7-n9隨機寡核苷酸

●2μldh2o

將反應物溫和混合，離心若干秒并轉移至熱循環(huán)儀，在那里將其在65℃孵育2分鐘，隨后41℃孵育11.5分鐘。

在一些實施方案中，使用酶混合物。在一些實施方案中，在使用前，將所述酶混合物凍干并重構。在一些實施方案中，所述酶混合物包含2種、3種或更多種酶。在一些實施方案中，所述酶混合物還包含高分子量的糖混合物(例如，葡聚糖)。在一些實施方案中，所述酶混合物為用于等溫rna擴增的酶混合物。在一些實施方案中，所述酶混合物包含反轉錄酶(例如，禽類成髓細胞性白血病病毒反轉錄酶)、rna酶h和rna聚合酶(例如，t7rna聚合酶)。在一些實施方案中，所述酶混合物包含4單位至10單位的反轉錄酶、0.01單位至0.1單位的rna酶h，以及10單位至40單位的rna聚合酶。

在上述的寡核苷酸-rna退火反應過程中，制備所述酶混合物。解凍用于該凍干酶混合物的稀釋劑，之后將30μl的冷稀釋劑添加至該凍干的酶混合物，并孵育6分鐘。緊接著上述退火反應，將5μl酶混合物添加至每個退火的rna-寡核苷酸混合物，并在41℃下孵育45分鐘至90分鐘。

使用rnaxpampure珠進行rna純化

將下列物質添加至上述反應，

●36μlampure珠

將混懸液充分混合并在室溫下孵育5分鐘。使用磁體經(jīng)2至4分鐘收集珠，并且溶液表現(xiàn)為澄清。棄去上清液，并用200μl的70％乙醇在磁體上洗滌珠三次。在第二次洗滌后，將珠在室溫下干燥10分鐘。最后，通過從磁體移除管并將珠重懸在15μl10mm的tris-hclph8.3洗脫緩沖液中洗脫rna，該洗脫緩沖液包含于ampure試劑盒中。將該rna-珠溶液置于磁體上2分鐘，之后將rna溶液轉移至新的pcr管中，確保避免將珠轉移到新管中。

擴增#2

在室溫下，用反應緩沖液將下列反應物集合：

●2μl來自上述擴增反應#1的物質

●1μl3μmv3-fgfrgsp1

●1μl5μmt7-crnar2p

●1μldh2o

將反應物溫和混合，離心若干秒并轉移至熱循環(huán)儀，在那里將其在65℃孵育2分鐘，隨后41℃孵育11.5分鐘。

在上述的寡核苷酸-rna退火反應過程中，制備酶混合物。解凍用于該凍干的酶混合物的稀釋劑，之后將30μl的冷稀釋劑添加至所述凍干的酶混合物，并孵育6分鐘。緊接著上述退火反應，將5μl酶混合物添加至每個退火的rna-寡核苷酸混合物，并在41℃下孵育45分鐘至90分鐘。

使用rnaxpampure珠進行rna純化

如上所述進行rna純化，在15μl10mm的tris-hclph8.0洗脫緩沖液中洗脫該rna。

擴增#3

在室溫下，用反應緩沖液將下列反應物集合：

●1μl來自上述擴增反應#2的物質

●1μl3μmv3-fgfrgsp2

●1μl5μmt7-crnar2p

●2μldh2o

將反應物溫和混合，離心若干秒并轉移至熱循環(huán)儀，在那里將其在65℃孵育2分鐘，隨后41℃孵育11.5分鐘。

在上述的寡核苷酸-rna退火反應過程中，制備酶混合物。解凍用于該凍干的酶混合物的稀釋劑，之后將30μl的冷稀釋劑添加至所述凍干的酶混合物，并孵育6分鐘。緊接著上述退火反應，將5μl酶混合物添加至每個退火的rna-寡核苷酸混合物，并在41℃下孵育45分鐘至90分鐘。

使用rnaxpampure珠進行rna純化

如上所述進行rna純化，此時在6μl10mm的tris-hclph8.3洗脫緩沖液中洗脫該rna。

擴增#4

在室溫下，用反應緩沖液將下列反應物集合：

●5μl來自上述擴增#3的物質

●1μl10μmp5

●1μl10μmp7

將反應物溫和混合，離心若干秒并轉移至熱循環(huán)儀，在那里將其在65℃孵育2分鐘，隨后41℃孵育11.5分鐘。

在上述的寡核苷酸-rna退火反應過程中，制備酶混合物。解凍用于該凍干的酶混合物的稀釋劑，之后將30μl的冷稀釋劑添加至所述凍干的酶混合物中，并孵育6分鐘。緊接著上述退火反應，將5μl酶混合物添加至每個退火的rna-寡核苷酸混合物，并在41℃下孵育45分鐘至90分鐘。

使用dnaxpampure珠進行dna純化

將下列物質添加至上述反應，

●36μlampure珠

將混懸液充分混合并在室溫下孵育5分鐘。使用磁體經(jīng)2至4分鐘收集珠，并且溶液表現(xiàn)為澄清。棄去上清液，并用200μl的70％乙醇在磁體上洗滌珠三次。在第二次洗滌后，將珠在室溫下干燥5分鐘。最后，通過從磁體移除管并將珠重懸在15μl10mm的tris-hclph8.3洗脫緩沖液中洗脫dna，該洗脫緩沖液包含于ampure試劑盒中。將該rna-珠溶液置于磁體上2分鐘，之后將dna溶液轉移至新的pcr管中，確保避免將珠轉移到新管中。隨后該最終的dna產(chǎn)物準備進行測序。

實施例2：使用反轉錄酶與標簽隨機寡核苷酸及靶向第二鏈寡核苷酸擴增5’融合事件的等溫方法

擴增#1

朝向擴增包含帶有未知融合伴侶之5’融合事件的基因座的第一步，為使用靶/基因特異性引物在所獲得的樣品rna上進行反轉錄酶事件。

在室溫下，用反應緩沖液將下列反應物集合：

●1μl純化的rna(50ng)

●1μl3μmv3-fgfrgsp1

●1μl5μmt7-n9隨機寡核苷酸

●2μldh2o

將反應物溫和混合，離心若干秒并轉移至熱循環(huán)儀，在那里將其在65℃孵育2分鐘，隨后41℃孵育11.5分鐘。

在上述的寡核苷酸-rna退火反應過程中，制備酶混合物。解凍用于該凍干的酶混合物的稀釋劑，之后將30μl的冷稀釋劑添加至所述凍干的酶混合物，并孵育6分鐘。緊接著上述退火反應，將5μl酶混合物添加至每個退火的rna-寡核苷酸混合物，并在41℃下孵育45分鐘至90分鐘。

使用rnaxpampure珠進行rna純化

將下列物質添加至上述反應，

●36μlampure珠

將混懸液充分混合并在室溫下孵育5分鐘。使用磁體經(jīng)2至4分鐘收集珠，并且溶液表現(xiàn)為澄清。棄去上清液，并用200μl的70％乙醇在磁體上洗滌珠三次。在第二次洗滌后，將珠在室溫下干燥10分鐘。最后，通過從磁體移除管并將小珠重懸在15μl10mm的tris-hclph8.3洗脫緩沖液中洗脫rna，該洗脫緩沖液包含于ampure試劑盒中。將該rna-珠溶液置于磁體上2分鐘，之后將rna溶液轉移至新的pcr管中，確保避免將珠轉移到新管中。

擴增#2

在室溫下，用反應緩沖液將下列反應物集合：

●2μl來自上述擴增#1的物質

●1μl3μmv3-fgfrgsp1

●1μl5μmt7-crnar2p

●1μldh2o

將反應物溫和混合，離心若干秒并轉移至熱循環(huán)儀，在那里將其在65℃孵育2分鐘，隨后41℃孵育11.5分鐘。

在上述的寡核苷酸-rna退火反應過程中，制備酶混合物。解凍用于該凍干的酶混合物的稀釋劑，之后將30μl的冷稀釋劑添加至所述凍干的酶混合物中，并孵育6分鐘。緊接著上述退火反應，將5μl酶混合物添加至每個退火的rna-寡核苷酸混合物，并在41℃下孵育45分鐘至90分鐘。

使用rnaxpampure珠進行rna純化

如上所述進行rna純化，在15μl10mm的tris-hclph8.0洗脫緩沖液中洗脫該rna。

擴增#3

在室溫下，用反應緩沖液將下列反應物集合：

●1μl來自上述擴增#2的物質

●1μl3μmv3-fgfrgsp2

●1μl5μmt7-crnar2p

●2μldh2o

將反應物溫和混合，離心若干秒并轉移至熱循環(huán)儀，在那里將其在65℃孵育2分鐘，隨后41℃孵育11.5分鐘。

在上述的寡核苷酸-rna退火反應過程中，制備酶混合物。解凍用于該凍干的酶混合物的稀釋劑，之后將30μl的冷稀釋劑添加至所述凍干的酶混合物中，并孵育6分鐘。緊接著上述退火反應，將5μl酶混合物添加至每個退火的rna-寡核苷酸混合物，并在41℃下孵育45分鐘至90分鐘。

使用rnaxpampure珠進行rna純化

如上所述進行rna純化，此時在6μl10mm的tris-hclph8.3洗脫緩沖液中洗脫該rna。

擴增#4

在室溫下，用反應緩沖液將下列反應物集合：

●5μl來自上述擴增#3的物質

●1μl10μmp5

●1μl10μmp7

將反應物溫和混合，離心若干秒并轉移至熱循環(huán)儀，在那里將其在65℃孵育2分鐘，隨后41℃孵育11.5分鐘。

在上述的寡核苷酸-rna退火反應過程中，制備酶混合物。解凍用于該凍干的酶混合物的稀釋劑，之后將30μl的冷稀釋劑添加至所述凍干的酶混合物，并孵育6分鐘。緊接著上述退火反應，將5μl酶混合物添加至每個退火的rna-寡核苷酸混合物，并在41℃下孵育45分鐘至90分鐘。

使用dnaxpampure珠進行dna純化

將下列物質添加至上述反應，

●36μlampure珠

將混懸液充分混合并在室溫下孵育5分鐘。使用磁體經(jīng)2至4分鐘收集珠，并且溶液表現(xiàn)為澄清。棄去上清液，并用200μl的70％乙醇在磁體上洗滌珠三次。在第二次洗滌后，將珠在室溫下干燥5分鐘。最后，通過從磁體移除管并將珠重懸在15μl10mm的tris-hclph8.3洗脫緩沖液中洗脫dna，該洗脫緩沖液包含于ampure試劑盒中。將該rna-珠溶液置于磁體上2分鐘，之后將dna溶液轉移至新的pcr管中，確保避免將珠轉移到新管中。隨后該最終的dna產(chǎn)物準備進行測序。

實施例3：以基因組dna開始的指數(shù)擴增靶序列的等溫方法

為了制備雙鏈基因組dna的靶區(qū)域以用于分析，首先將dna片段化成大小為100bp至600bp。

為了修復片段的末端，之后將相對的末端進行磷酸化和腺苷酸化，制備如下反應物：

●10μl片段化dna(50-250ng)

●4μl末端修復緩沖液

●1μl末端修復混合物

●1μltaq聚合酶(a加尾)

●1μl2mmdntp

將反應物溫和混合，并在12℃下在熱循環(huán)儀中孵育15分鐘，37℃孵育15分鐘，之后72℃孵育15分鐘，隨后在4℃直到進行下面的步驟。

在上述反應過程中，通過將每個寡核苷酸等體積混合、加熱至95℃并使其冷卻至室溫，將含有5’rna聚合酶啟動子序列的寡核苷酸接頭序列退火。

在室溫下，將下列連接反應物集合：

●40μl上述制備的dna

●1μlmiseq索引2接頭

●4.9μl連接緩沖液

●2μldna連接酶

之后使反應在16℃下進行30分鐘，之后在22℃進行30分鐘，隨后4℃。

以1.8×反應體積用ampurexp珠純化。

擴增#1

在室溫下，用反應緩沖液將下列反應物集合：

●2μl來自上述連接反應的純化的dna

●1μl引物t7-r2pcrna5μm

●1μlgsp13μm

●1μldh2o

將反應物溫和混合，離心若干秒并轉移至熱循環(huán)儀，在那里將其在65℃孵育2分鐘，隨后41℃孵育11.5分鐘。

在上述的寡核苷酸-rna退火反應過程中，制備酶混合物。解凍用于該凍干的酶混合物的稀釋劑，之后將30μl的冷稀釋劑添加至所述凍干的酶混合物，并孵育6分鐘。緊接著上述退火反應，將5μl酶混合物添加至每個退火的rna-寡核苷酸混合物，并在41℃下孵育45分鐘至90分鐘。

使用rnaxpampure珠進行rna純化

將下列物質添加至上述反應，

●36μlampure珠

將混懸液充分混合并在室溫下孵育5分鐘。使用磁體經(jīng)2至4分鐘收集珠，并且溶液表現(xiàn)為澄清。棄去上清液，并用200μl的70％乙醇在磁體上洗滌珠三次。在第二次洗滌后，將珠在室溫下干燥10分鐘。最后，通過從磁體移除管并將小珠重懸在15μl10mm的tris-hclph8.3洗脫緩沖液中洗脫rna，該洗脫緩沖液包含于ampure試劑盒中。將該rna-珠溶液置于磁體上2分鐘，之后將rna溶液轉移至新的pcr管中，確保避免將珠轉移到新管中。

擴增#2

在室溫下，用反應緩沖液將下列反應物集合：

●2μl來自上述擴增#1的rna

●1μlt7-r2p-crna5μm

●1μlgsp23μm

●1μldh2o

將反應物溫和混合，離心若干秒并轉移至熱循環(huán)儀，在那里將其在65℃孵育2分鐘，隨后41℃孵育11.5分鐘。

在上述的寡核苷酸-rna退火反應過程中，制備酶混合物。解凍用于該凍干的酶混合物的稀釋劑，之后將30μl的冷稀釋劑添加至所述凍干的酶混合物，并孵育6分鐘。緊接著上述退火反應，將5μl酶混合物添加至每個退火的rna-寡核苷酸混合物，并在41℃下孵育45分鐘至90分鐘。

擴增#4

在室溫下，用反應緩沖液將下列反應物集合：

●5μl來自上述擴增#3的物質

●1μl10μmp5

●1μl10μmp7

將反應物溫和混合，離心若干秒并轉移至熱循環(huán)儀，在那里將其在65℃孵育2分鐘，隨后41℃孵育11.5分鐘。

在上述的寡核苷酸-rna退火反應過程中，制備酶混合物。解凍用于該凍干的酶混合物的稀釋劑，之后將30μl的冷稀釋劑添加至所述凍干的酶混合物，并孵育6分鐘。緊接著上述退火反應，將5μl酶混合物添加至每個退火的rna-寡核苷酸混合物，并在41℃下孵育45分鐘至90分鐘。

使用dnaxpampure珠進行dna純化

將下列物質添加至上述反應，

●36μlampure珠

將混懸液充分混合并在室溫下孵育5分鐘。使用磁體經(jīng)2至4分鐘收集珠，并且溶液表現(xiàn)為澄清。棄去上清液，并用200μl的70％乙醇在磁體上洗滌珠三次。在第二次洗滌后，將珠在室溫下干燥10分鐘。最后，通過從磁體移除管并將珠重懸在15μl10mm的tris-hclph8.3洗脫緩沖液中洗脫dna，該洗脫緩沖液包含于ampure試劑盒中。將該dna-珠溶液置于磁體上2分鐘，之后將dna溶液轉移至新的pcr管中，確保避免將珠轉移到新管中。隨后該最終的dna產(chǎn)物準備進行測序。

實施例4：使用反轉錄酶與標簽隨機寡核苷酸及隨機第二鏈寡核苷酸擴增未知5’和/或3’融合事件的等溫方法

擴增#1

作為向擴增帶有未知融合伴侶的3’融合事件的第一步，使用從福爾馬林固定的組織樣品獲得的rna進行第一擴增反應。

在室溫下，用反應緩沖液將下列反應物集合：

●1μl純化的rna(50ng)

●1μl5μmt7-n9隨機寡核苷酸

●3μldh2o

將反應物溫和混合，離心若干秒并轉移至熱循環(huán)儀，在那里將其在65℃孵育2分鐘，隨后41℃孵育11.5分鐘。

在上述的寡核苷酸-rna退火反應過程中，制備酶混合物。解凍用于該凍干的酶混合物的稀釋劑，之后將30μl的冷稀釋劑添加至所述凍干的酶混合物，并孵育6分鐘。緊接著上述退火反應，將5μl酶混合物添加至每個退火的rna-寡核苷酸混合物，并在41℃下孵育45分鐘至90分鐘。

使用rnaxpampure珠進行rna純化

將下列物質添加至上述反應，

●36μlampure珠

將混懸液充分混合并在室溫下孵育5分鐘。使用磁體經(jīng)2至4分鐘收集珠，并且溶液表現(xiàn)為澄清。棄去上清液，并用200μl的70％乙醇在磁體上洗滌珠三次。在第二次洗滌后，將珠在室溫下干燥10分鐘。最后，通過從磁體移除管并將珠重懸在15μl10mm的tris-hclph8.3洗脫緩沖液中洗脫rna，該洗脫緩沖液包含于ampure試劑盒中。將該rna-珠溶液置于磁體上2分鐘，之后將rna溶液轉移至新的pcr管中，確保避免將珠轉移到新管中。

擴增#2

在室溫下，用反應緩沖液將下列反應物集合：

●2μl來自上述擴增反應#1的物質

●1μl3μmgsp1(5’或3’定向引物)

●1μl5μmr2p

●1μldh2o

將反應物溫和混合，離心若干秒并轉移至熱循環(huán)儀，在那里將其在65℃孵育2分鐘，隨后41℃孵育11.5分鐘。

在上述的寡核苷酸-rna退火反應過程中，制備酶混合物。解凍用于該凍干的酶混合物的稀釋劑，之后將30μl的冷稀釋劑添加至所述凍干的酶混合物，并孵育6分鐘。緊接著上述退火反應，將5μl酶混合物添加至每個退火的rna-寡核苷酸混合物，并在41℃下孵育45分鐘至90分鐘。

使用rnaxpampure珠進行rna純化

如上所述進行rna純化，在15μl10mm的tris-hclph8.0洗脫緩沖液中洗脫該rna。

擴增#3

在室溫下，用反應緩沖液將下列反應物集合：

●5μl來自上述擴增#2的物質

●1μl10μmp5

●1μl10μmp7

反應物溫和混合，離心若干秒并轉移至熱循環(huán)儀，在那里將其在65℃孵育2分鐘，隨后41℃孵育11.5分鐘。

在上述的寡核苷酸-rna退火反應過程中，制備酶混合物。解凍用于該凍干的酶混合物的稀釋劑，之后將30μl的冷稀釋劑添加至所述凍干的酶混合物，并孵育6分鐘。緊接著上述退火反應，將5μl酶混合物添加至每個退火的rna-寡核苷酸混合物，并在41℃下孵育45分鐘至90分鐘。

使用dnaxpampure珠進行dna純化

將下列物質添加至上述反應，

●36μlampure珠

將混懸液充分混合并在室溫下孵育5分鐘。使用磁體經(jīng)2至4分鐘收集珠，并且溶液表現(xiàn)為澄清。棄去上清液，并用200μl的70％乙醇在磁體上洗滌珠三次。在第二次洗滌后，將珠在室溫下干燥5分鐘。最后，通過從磁體移除管并將珠重懸在15μl10mm的tris-hclph8.3洗脫緩沖液中洗脫dna，該洗脫緩沖液包含于ampure試劑盒中。將該rna-珠溶液置于磁體上2分鐘。之后將dna溶液轉移至新的pcr管中，確保避免將珠轉移到新管中。隨后該最終的dna產(chǎn)物準備進行測序。

實施例5：寡核苷酸

下面的表格提供了用于擴增核酸為測序分析做準備的示例性寡核苷酸序列，例如，如實施例1至實施例3所述。

雖然本文描述并舉例說明了本發(fā)明的幾個實施方案，但本領域普通技術人員將容易預見到用于執(zhí)行本文所述的功能和/或獲得結果和/或一種或更多種優(yōu)勢的多種其他手段和/或結構，并且每種這樣的改變和/或修改都被認為在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。更一般地，本領域技術人員將容易理解，本文所描述的所有參數(shù)、尺寸、材料和構造都意在為示例性的，并且實際的參數(shù)、尺寸、材料和/或構造將根據(jù)使用本發(fā)明教導的具體應用。本領域技術人員將認識到，或能夠僅使用常規(guī)實驗確定本文所描述的本發(fā)明具體實施方案的許多等效方案。因此，應當理解的是，前面的實施方案僅僅通過實例的方式展示，并且除非特別描述并要求，本發(fā)明可以在所附權利要求范圍及其等同的范圍內(nèi)實施。本發(fā)明涉及本文所描述的每個單獨的特征、系統(tǒng)、制品、材料和/或方法。此外，如果該特征、系統(tǒng)、制品、材料和/或方法并非互不相同，則任何兩個或更多個該特征、系統(tǒng)、制品、材料和/或方法的組合也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

除非明確相反指明，否則本文在說明書和權利要求中所使用的不定冠詞“一個/種”應理解為意指“至少一個/種”。

本文在說明書和權利要求中使用的短語“和/或”應理解為意指相關聯(lián)的要素(即在某些情況下相關聯(lián)存在，而在其他情況下不相關聯(lián)地存在的要素)中的“任意一個或兩者”。除非明確相反指明，否則除了被“和/或”分句特別地確定的要素之外，其他要素可以任選地存在，無論其與特別確定的那些要素是否相關。因此，作為一個非限制實例，提及“a和/或b”，當與開放性語句如“包含”結合使用時，在一個實施方案中，可指有a而沒有b(任選地，包括除了b之外的要素)；在另一個實施方案中，指有b而沒有a(任選地，包括除了a之外的要素)；在另一個實施方案中，指a與b兩者(任選地，包括其他要素)；等。

本文在說明書和權利要求中使用的“或”應該理解為與上文定義的“和/或”具有相同含義。例如，當分離列表中的項時，“或”或者“和/或”應被解釋為包括性的，即在許多要素或要素列表中，以及任選地另外的未列出的項中，包括至少一個/種，但也包括多于一個/種的要素。僅當術語明確相反指明，例如“只有其中之一”或“恰好其中之一”，或者當在權利要求中使用“由...組成”時，將指包含許多要素或要素列表中的恰好一個/種要素。一般而言，當前面是排他性術語如“任一”、“其中之一”、“僅其中之一”或“恰好其中之一”時，本文所使用的術語“或”應當僅被解釋為排除性的選擇(即，“一個或另一個，但并非兩者全部”)。當在權利要求中使用“基本上由...組成”時，應當具有其用于專利法領域中的通常含義。

本文在說明書和權利要求中使用的短語“至少一個/種”涉及一系列的一個/種或更多個/種要素，應當被理解為意指在要素列表中，選自任何一個/種或更多個/種要素的至少一個/種要素，但未必包括該要素列表中具體列出的各個/種和每個/種要素中的至少一個/種，并且不排除該要素列表中的任何要素的組合。該定義也允許除了在要素列表中被具體確定的、短語“至少一個/種”所指的要素以外，其他要素可任選的存在，無論是否與具體確定的那些要素相關。因此，作為一個非限制性實例，“a和b中的至少一個/種”(或等同的，“a或b中的至少一個/種”，或等同的，“a和/或b中的至少一個/種”)在一個實施方案中可指至少一個/種(任選地包括多于一個/種)a，而不存在b(且任選地包括除b之外的要素)；在另一個實施方案中，指至少一個/種(任選地包括多于一個/種)b，而不存在a(且任選地包括除a之外的要素)；在另一個實施方案中，指至少一個/種(任選地包括多于一個/種)a，和至少一個/種(任選地包括多于一個/種)b(并且任選地包括其他要素)；等。

在權利要求以及在上述的說明書中，所有的過渡短語如“包含”、“包括”、“帶有”、“具有”、“含有”、“涉及”、“保持”等應理解為開放式的，即意為包括但不限于。如美國專利局的專利審查程序手冊(theunitedstatespatentofficemanualofpatentexaminingprocedures)，2111.03章所述，只有過渡短語“由...組成”和“基本上由...組成”應分別為封閉式或半封閉式過渡短語。

在權利要求中使用序數(shù)詞如“第一”、“第二”、“第三”等修飾權利要求要素自身不意味著任何優(yōu)先、在先、或一項權利要求要素與另一項的順序或進行方法動作的時間順序，而僅僅是用作標記以區(qū)分一項具有特定名稱的權利要求要素與另一項具有相同名稱的權利要求要素(除了序數(shù)詞的使用外)，從而區(qū)分所述權利要求要素。