發(fā)明領域

本發(fā)明的方面通常涉及嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3其作為診斷生物標志物的用途，例如用于自身免疫糖尿病。

發(fā)明背景

糖尿病(特征在于由胰島素分泌和/或作用缺陷所導致的高血糖癥)的流行，在全球已經(jīng)達到了流行病的水平(美國糖尿病協(xié)會（americandiabetesassociation）,diabetescare36suppl1:s67-74(2013))。國際糖尿病聯(lián)合會(internationaldiabetesfederation,idf)估計目前全世界有3.82億糖尿病患者，有~46%在他們發(fā)展出糖尿病并發(fā)癥之前還未得到確診。2013年在糖尿病醫(yī)療保健方面花費超過5480億美元(國際糖尿病聯(lián)合會，idfdiabetesatlas，第6版/2013更新(2013))。根據(jù)中國內地進行的最新的流行病學調查，目前有1.139億成人患有糖尿病以及4.934億成人患有前驅糖尿病(xu等人,jama310:948-959(2013))。糖尿病病例的絕大部分落入兩個廣泛發(fā)病機理類別：1型糖尿病(t1d)，特征在于胰島素缺乏(由于免疫介導的產(chǎn)胰島素胰腺β細胞的破壞)的自身免疫疾病，和2型糖尿病(t2d)，特征在于胰島素抗性并且常常與肥胖癥或較大年齡相關聯(lián)的疾病(vanbelle等人,physiologicalreviews91:79-118(2011))。雖然t1d僅占總糖尿病病例的大約5-10%，但其是兒童和青少年中最常見的慢性疾病并且是最嚴重的糖尿病類型，其導致對每日胰島素注射終生依賴和由于衰弱的微血管和大血管并發(fā)癥而增加的發(fā)病率和死亡率(maahs等人,endocrinologyandmetabolismclinicsofnorthamerica39:481-497(2010))。另外，t1d的發(fā)生率在全世界每年3%的速率在持續(xù)升高(gan等人,currentproblemsinpediatricandadolescenthealthcare42:269-291(2012))。即使是診斷為t2d的那些，也證實了大約10%的患者對至少一種胰島自身抗體是陽性的，并且該組通常被稱為是“成人隱匿性自身免疫性糖尿病(lada)”(naik等人,thejournalofclinicalendocrinologyandmetabolism94:4635-4644(2009))。這些患者與t1d有許多遺傳學和免疫學相似處但也具有t2d的特征–發(fā)作時成年以及對于口服降血糖劑的初始反應；然而，lada患者趨向于變?yōu)橐葝u素依賴并且對口服藥物無反應(guglielmi等人,diabetes/metabolismresearchandreviews28suppl2:40-46(2012))。

目前，對于針對胰腺β-細胞自身抗原的自身抗體(如胰島素自身抗體(iaa)，谷氨酸脫羧酶抗體(gada)、胰島素瘤相關蛋白2自身抗體(ia-2a)和鋅轉運蛋白8抗體(znt8a))的檢測，依然是用于區(qū)分自身免疫糖尿病和t2d以及檢測那些高風險個體的僅有的生物標志物(lebastchi和herold，coldspringharbperspectmed2:a007708(2012))。然而，這些自身抗體是通過常規(guī)的免疫熒光染色或者用特定的放射性免疫測定來進行測量(knip等人,diabetes54suppl2:s125-136(2005))，這兩者都單調冗長且耗時。放射性免疫測定具有由于使用放射性同位素而構成的健康風險以及處置問題的顧慮。另外，這些來自兒童的自身抗體在出生后6個月之前很少能檢測到(ziegler等人,diabetes48:460-468(1999))。t1d患者中單一自身抗體測量的診斷靈敏性低至59%-67%(lebastchi和herold，2012)。其它免疫學測定，包括細胞免疫印跡、t-細胞增殖測定和elispot測定，可以評估自身免疫糖尿病患者的細胞免疫應答；然而，這些測定的局限性在于需要相對較大數(shù)量的外周血單核細胞(pbmc)培養(yǎng)以及需要新鮮的細胞(lebastchi和herold，2012)。

發(fā)明概述

重要的是要開發(fā)出新的生物標志物，用于對具有發(fā)展t1d的高風險的個體進行早期檢測，以及用于對自身免疫糖尿病(t1d和lada)與t2d的區(qū)別性診斷，由此使得能夠適應對疾病的最佳預防和治療策略。因此，本發(fā)明的一個目標是鑒別能夠受益于早期診斷和治療的受試者，以降低發(fā)展出自身免疫糖尿病的風險。本發(fā)明的另一目標是提供用于評估發(fā)展出自身免疫糖尿病的傾向的組合物和方法。另一個目標是提供用于協(xié)助預測自身免疫糖尿病的組合物和方法。另一個目標是提供于協(xié)助診斷自身免疫糖尿病的組合物和方法。本發(fā)明還另一個目標是提供降低發(fā)展出自身免疫糖尿病的風險的方法。

提供了用于鑒別和治療自身免疫糖尿病的組合物和方法。本發(fā)明的一個方面提供了用于在哺乳動物受試者中評估自身免疫糖尿病的風險和進展的方法。所述方法包括在受試者中測量血清嗜中性粒細胞彈性蛋白酶(ne)和蛋白酶3(pr3)中至少一種的酶活性和/或蛋白濃度，并將所測量的這些蛋白酶的水平與各自的參考水平進行比較。血清ne和pr3的酶活性和蛋白濃度比所述各自的參考水平高，表示發(fā)展出自身免疫糖尿病的風險或傾向增加。

還另一個方面提供了用于在受試者中對自身免疫糖尿病進行診斷或輔助診斷的方法。所述方法包括從所述受試者獲得血液樣品，并測量所述血液樣品中含有的ne和pr3中至少一種的酶活性和蛋白濃度。將所測量的酶活性和蛋白濃度與各自的參考水平進行比較。在優(yōu)選的方面，如果ne和pr3中至少一種的酶活性和蛋白濃度高于各自的參考水平，則存在自身免疫糖尿病。在另一個優(yōu)選的實施方案中，血液樣品中ne和pr3中至少一種的酶活性和蛋白濃度是分別通過基于發(fā)色團的測定和酶聯(lián)免疫吸附測定分析的。

本發(fā)明另外的方面提供了方法和組合物，其用于確定受試者有發(fā)展出自身免疫糖尿病的風險。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于確定受試者是否有發(fā)展出自身免疫糖尿病的風險的方法，其包括：

從所述受試者獲得樣品;

在所述樣品中測量嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3中至少一種的酶活性和/或蛋白水平;

將嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3中至少一種的酶活性和/或蛋白水平，與酶活性和/或蛋白水平各自的參考水平進行比較，其中所述嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和/或蛋白酶3各自的參考水平得自不患有自身免疫糖尿病的一個或多個參考受試者；和

當所述樣品中所含的嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和/或蛋白酶3中至少一種的酶活性和/或蛋白水平在所述各自的參考水平之上超過大約20%時，確定所述受試者有發(fā)展出自身免疫糖尿病的風險。

本發(fā)明另外的方面提供了方法和組合物，其用于確定顯示出成人發(fā)作糖尿病跡象的受試者是否有發(fā)展出自身免疫糖尿病的風險。所述方法包括：

從所述受試者獲得樣品;

在所述樣品中測量嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3中至少一種的酶活性和/或蛋白水平;

將嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3中至少一種的酶活性和/或蛋白水平，與酶活性和/或蛋白水平各自的參考水平進行比較，其中所述各自的參考水平得自不患有自身免疫糖尿病的一個或多個參考受試者；和

當樣品中所含的所述嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3中至少一種的酶活性和/或蛋白水平在所述各自的參考水平之上超過大約20%時，確定所述受試者有發(fā)展出自身免疫糖尿病的風險。

在一些實施方案中，所述自身免疫糖尿病是1型糖尿病。在一些實施方案中，所述自身免疫糖尿病是成人隱匿性自身免疫性糖尿病。在一些實施方案中，樣品中嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3的酶活性可以通過基于發(fā)色團的測定來進行測量。在一些實施方案中，樣品中嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3的蛋白水平可以通過免疫測定來進行測量。在一些實施方案中，所述樣品選自血液、血清、血漿、尿液、唾液、腦脊液、眼淚、組織以及以及其組合。在一些實施方案中，所述方法可進一步包括對所述受試者發(fā)展出自身免疫糖尿病的風險進行溝通。

在一些實施方案中，所述自身免疫糖尿病是1型糖尿病。在一些實施方案中，所述自身免疫糖尿病是成人隱匿性自身免疫性糖尿病。在一些實施方案中，一個或多種胰島特異性自身抗體，如gada、ia2a和/或znt8a，在受試者中是不可檢測的。在其它實施方案中，一個或多種胰島特異性自身抗體，如gada、ia2a和/或znt8a，在受試者中是可檢測的。在一些實施方案中，所述受試者具有自身免疫糖尿病的一個或多個風險因素。在一些實施方案中，所述受試者是嬰兒、兒童、青少年或成人。在一些實施方案中，所述受試者被診斷為有糖尿病。

在一些實施方案中，當樣品中所含的所述嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3中至少一種的酶活性和/或蛋白水平在所述各自的參考水平之上超過大約20%時，所述方法還包括治療受試者，以降低發(fā)展出自身免疫糖尿病的風險。

在一些實施方案中，所述受試者可以使用選自以下的進行治療：胰島素脫敏、gad脫敏、熱休克蛋白60(hsp60)脫敏、拮抗ly6g(gr1嗜中性粒細胞標志物)、嗜中性粒細胞耗竭、拮抗b-細胞激活因子(baff)、糖尿病抗性mhc-ii類分子促進表達、cd3激活、抗胸腺細胞球蛋白(atg)療法、treg療法、避免環(huán)境風險因素、免疫系統(tǒng)調節(jié)、促進β-細胞再生、b-細胞抑制、ctla-4抑制、腫瘤壞死因子-α、il-1受體拮抗劑、聚乙二醇化粒細胞集落刺激因子、人重組干擾素-α、自體肝細胞移植、ne/pr3化學抑制劑或肽抑制劑的使用以及以及其組合。

在一些實施方案中，所述樣品中所含有的嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3中至少一種的酶活性和/或蛋白水平在各自的參考水平之上超過40%。在一些實施方案中，所述治療可以是：胰島素脫敏、gad脫敏(ludvigsson等人,newengljmed359:1909-1920(2008)、熱休克蛋白60(hsp60)脫敏、拮抗ly6g(gr1嗜中性粒細胞標志物)、嗜中性粒細胞耗竭、拮抗b-細胞激活因子(baff)(marino等人diabetes61(11):2893-2905(2012))、糖尿病抗性mhc-ii類分子促進表達(tian等人,j.clin.invest.114(7):969-978(2004))、cd3激活(herold等人,diabetes.62(11):3766-3774(2013)；herold等人,newengljmed346(22):1692-1698(2002)(okt3抗體))、抗胸腺細胞球蛋白(atg)療法(gitelman等人,thelancetdiabetes&endocrinology1(4):306-316(2013)；eisenbarth等人,diabetesres2:271-276(1985))、treg療法(du等人,plosone8(2):e56209(2013))、避免環(huán)境風險因素、免疫系統(tǒng)調節(jié)、促進β-細胞再生、b-細胞抑制、ctla-4抑制、腫瘤壞死因子-α(mastrandrea等人,diabetescare32:1244-1249(2009))、il-1受體拮抗劑、聚乙二醇化粒細胞集落刺激因子、人重組干擾素-α(rother等人,diabetescare32:1250-1255(2009))、自體肝細胞移植(haller等人,diabetes58(supp.1):a7(2009)(abstract)；voltarelli等人,annnyacadsci1150:220-229(2008)；voltarelli等人,jama297:1568-1576(2007)；couri等人,jama301:1573-1579(2009))、ne/pr3化學抑制劑或肽抑制劑的使用或其組合。

在一些實施方案中，所述自身免疫糖尿病選自1型糖尿病和成人隱匿性自身免疫性糖尿病。在一些實施方案中，所述樣品中嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3的酶活性是通過基于發(fā)色團的測定來進行測量的。在一些實施方案中，所述樣品中嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3的蛋白水平是通過免疫測定來進行測量的。在一些實施方案中，所述樣品選自血液、血清、血漿、尿液、唾液、腦脊液、眼淚、組織以及以及其組合。在一些實施方案中，所述自身免疫糖尿病是1型糖尿病。在一些實施方案中，所述自身免疫糖尿病是成人隱匿性自身免疫性糖尿病。在一些實施方案中，所述受試者是小于一歲的人類受試者。

在一些實施方案中，所述方法可進一步包括對所述受試者發(fā)展出自身免疫糖尿病的風險進行溝通。

在一些實施方案中，本發(fā)明中所使用的參考水平，包括從一個或多個未患有自身免疫糖尿病參考受試者所獲得的嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3中至少一種的酶活性和/或蛋白水平。

所公開的方法和組合物的另外的優(yōu)勢將部分地在下文的說明書中進行說明，以及將部分地從說明書中進行理解，或者可以通過實踐公開的方法和組合物而習得。所公開的方法和組合物的優(yōu)勢，將通過所附權利要求中具體指出的要素和組合的方式而意識到和獲取。應理解前文的概述和下文的詳述都僅僅是示例性的和說明性的，并不是要限制所要求保護的發(fā)明。

附圖簡述

加入本說明書并構成了說明書一部分的附圖，說明了所公開方法和組合物的若干實施方案，并且與說明書一起用于解釋所公開的方法和組合物的原理。

圖1所示出的圖，其說明了在健康對照(n=77)和1型糖尿病(t1d)患者(n=149)中，ne(a)和pr3(b)的循環(huán)蛋白水平、ne/pr3酶活性(c)和a1at蛋白水平(d)。每個框中間的水平線表示中值；框的頂部和底部邊沿分別代表第75和第25個百分位數(shù)；小橫線(whisker)代表第10和第90個百分位數(shù)，而點代表離群值(outlier)。**p<0.01，***p<0.001，對比健康對照。

圖2所示出的圖，其說明了在健康對照(n=77)、診斷一年內的t1d患者(n=28)、患病期>1年且<5年的t1d患者(n=59)和患病期>5年的t1d患者(n=62)中，ne(a)和pr3(b)、ne和pr3的酶活性(c)、嗜中性粒細胞計數(shù)(d)和a1at(e)的循環(huán)蛋白水平。每個框中間的水平線表示中值；框的頂部和底部邊沿分別代表第75和第25個百分位數(shù)；小橫線代表第10和第90個百分位數(shù)，而點代表離群值。**p<0.01，***p<0.001，對比健康對照。

圖3所示出的圖，其說明了在健康對照(n=77)、診斷一年內的t1d患者(n=28)、患病期>1年且<5年的t1d患者(n=59)和患病期>5年的t1d患者(n=62)中mpo-dna復合物的循環(huán)水平(a)。循環(huán)mpo-dna復合物與循環(huán)ne(b)和pr3(c)蛋白水平以及ne和pr3的酶活性(d)顯著相關聯(lián)。**p<0.01，***p<0.001，對比健康對照。

圖4所示出的圖，其說明了在健康對照(n=77)、自身抗體陰性的t1d患者(n=54)、gada、ia2a或znt8a中一種自身抗體陽性的t1d患者(n=61)、gada、ia2a或znt8a中兩種自身抗體陽性的t1d患者(n=24)或者gada、ia2a和znt8a三種自身抗體陽性的t1d患者(n=10)中，ne(a)和pr3(b)的循環(huán)蛋白水平、ne和pr3的酶活性(c)。ne(d)和pr3(e)的循環(huán)蛋白水平以及和ne和pr3的酶活性(f)與gada陽性的t1d患者(n=73)中的gada效價顯著相關聯(lián)。***p<0.0001，對比健康對照。

圖5所示出的圖，其說明了ne(a)和pr3(b)的循環(huán)蛋白水平以及ne和pr3的酶活性(c)，其與ia2a陽性的t1d患者(n=44)中的ia2a效價顯著相關聯(lián)。

圖6所示的圖，顯示了在nod小鼠(n=7)中，小鼠pr3的循環(huán)蛋白水平以及血糖在糖尿病發(fā)展期間的動態(tài)變化。

發(fā)明詳述

對于1型糖尿病(t1d)發(fā)作的預防和延緩已經(jīng)進行了長期的探索。已經(jīng)并且持續(xù)在對實現(xiàn)此目標的策略和技術進行設計和研究，但是還沒有成功達到需求。很可能許多這些策略都應用的太晚，都是在疾病已經(jīng)發(fā)展太多以至于不能減緩或者停止之后。主要的問題是對于有風險的那些進行的鑒別都是基于標志物和癥狀，所述標志物和癥狀僅在已經(jīng)造成許多損害之后才顯現(xiàn)，使得減緩或停止疾病變得更加困難。本發(fā)明通過允許在1型糖尿病的發(fā)展中更早鑒別有風險的個體而解決這些問題。此種鑒別使得用于預防或延緩1型糖尿病發(fā)作的策略和技術成為可能并更加有效。

通過參考下文對具體實施方案的詳述和其中所包括的實施例以及參考附圖和其前后文的描述，可以更容易地理解所公開的方法和組合物。

定義

如本文所用，術語“自身免疫糖尿病”是指與自身免疫相關或者由自身免疫引起的疾病。代表性的自身免疫糖尿病疾病包括但不限于，1型糖尿病和成人隱匿性自身免疫性糖尿病。

如本文所用，術語“診斷”是指從一組風險值和/或患者癥狀中鑒別出疾病或狀況的類型。這與疾病的預測不同，預測是指在發(fā)生之前預測疾病或狀況的出現(xiàn)；與疾病風險確定不同，其是指在發(fā)生之前確定疾病或狀況出現(xiàn)的風險；以及與術語“預后”不同，其是指在之前的時間點從一個或多個指示值來預測在未來時間點疾病的進展。

如本文所用，術語“樣品”是指所獲得的生物學樣品，其用于診斷、預后或評估目的受試者如患者的目的。在某些實施方案中，獲得此樣品的目的可以是用于確定正在進行的病癥的結果或者治療方案對狀況的效果。優(yōu)選的樣品包括但不限于，血液、血清、血漿、尿液、唾液、腦脊液、眼淚或組織。此外，本領域技術人員會意識到一些樣品在經(jīng)過分級或純化程序后會更易于分析，例如，將全血分為血清或血漿組分。

如本文所用，術語“生物標志物”是指用作靶標而用于篩選得自受試者的樣品的物質，如蛋白酶或肽酶或蛋白質酶或蛋白質或多肽或其它生物學物質。

如本文所用，術語“底物”是指可以由酶進行作用的物質。例如，底物包括切割后被釋放的綴合至發(fā)色或熒光基團的化合物。有用底物的實例包括綴合至染料基團的肽，包括但不限于p-硝基苯胺，并且可以在特定的位點被蛋白酶切割。

如本文所用，術語“抗體”是指多克隆和單克隆抗體。除了完整的免疫球蛋白分子，術語“抗體”還包括那些免疫球蛋白分子的片段或聚合物，以及免疫球蛋白分子的人或人源化的版本或者包括抗原結合位點的其片段。這些包括缺乏完整抗體fc片段的fab和f(ab’)2片段。

如本文所用，術語“參考水平”是指目的生物標志物的歸一化的活性和/或水平。例如，從未患有自身免疫糖尿病的一個或多個參考受試者的群體確定的嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3的歸一化的酶活性和/或蛋白水平，分別是嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3的參考水平。

如本文所用，“陽性參考水平”是指目的生物標志物的歸一化的活性和/或水平。例如，從患有自身免疫糖尿病的一個或多個受試者的群體確定的嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3歸一化的酶活性和/或蛋白水平，分別是嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3的陽性參考水平。

如本文所用，術語“水平”是指物質或事物的量以及是指物質和事物的濃度，如上下文所指示。

如本文所用，術語“個體”、“宿主”、“受試者”和“患者”可互換使用，并且是指哺乳動物，包括但不限于，鼠類、猿類、人類、哺乳類農(nóng)畜、哺乳類運動動物和哺乳類寵物。術語“對照”當用于個體、宿主、受試者或患者的上下文時，是指來用作實驗或比較的對照的哺乳動物，包括但不限于，鼠類、猿猴類、人類、哺乳類農(nóng)畜、哺乳類運動動物和哺乳類寵物。

如本文所用，術語“指示值”是指參數(shù)如生物標志物的水平或量度，其與目的的狀態(tài)或條件相關聯(lián)或者對目的的狀態(tài)或條件是指示性的。只要參數(shù)可有助于指示狀態(tài)或條件，則并不需要單一參數(shù)的值對狀態(tài)或條件是指示性的。

應理解所公開的方法和組合物并不限于特定的合成方法、特定的分析技術或特別的試劑，除非有另外指明，且本身可有變化。還應理解本文所用的術語其目的僅僅是在于描述具體實施方案而不是要進行限制。

公開的有材料、組合物和組分，其可用于所公開的方法和組合物、可與所公開的方法和組合物結合使用、可用于制備所公開的方法和組合物或者是所公開的方法和組合物的產(chǎn)物。本文公開了這些以及其它的材料，并且應理解當公開這些材料的組合、子集、相互作用、組等的時候，雖然可能并未有明確提到公開這些化合物的每個各種個體或集體的組合及排列，但是其每個都在本文中有明確設想和描述。這些概念適用于本申請的所有方面，包括但不限于，制備和使用所公開組合物的方法中的步驟。因而，如果可以執(zhí)行許多額外的步驟，應理解這些額外的步驟的每一個都可以與所公開方法的任何具體實施方案或實施方案的組合一起執(zhí)行，并且每個此類組合都明確考慮到且應認為是已經(jīng)公開了。

用于自身免疫糖尿病的生物標志物

嗜中性粒細胞彈性蛋白酶(ne，ec編號:3.4.21.37，由ela2編碼)和蛋白酶3(pr3，ec編號:3.4.21.76，由prtn3編碼)是胰凝乳蛋白酶家族的兩種絲氨酸蛋白酶，其儲存在嗜中性粒細胞(一種多形核白細胞)的初級(也稱作嗜天青的)顆粒中(korkmaz等人,pharmacologicalreviews62:726-759(2010)；meyer-hoffert和wiedow，currentopinioninhematology18:19-24(2011))。嗜中性粒細胞是白細胞群體中最豐富的成員，在正常健康人中組成了循環(huán)白細胞的40-75%，并且是募集至感染或發(fā)炎部位的第一類白細胞，在所述部位嗜中性粒細胞可通過多種手段消除病原體(kolaczkowska和kubes,natrevimmunol13:159-175(2013)；mestas和hughes,journalofimmunology172:2731-2738(2004))。傳統(tǒng)上，嗜中性粒細胞已經(jīng)被識別為針對感染性疾病通過氧化和非氧化機制提供第一線先天免疫防護的主要角色(mantovani等人,natrevimmunol11:519-531(2011))。然而，增加的證據(jù)表明嗜中性粒細胞不僅僅是專職殺手，在感染和炎性疾病的背景下還是免疫系統(tǒng)主要的調節(jié)者(amulic等人,annualreviewofimmunology30:459-489(2012))。嗜中性粒細胞的激活和脫粒導致將絲氨酸蛋白酶釋放至細胞外介質和循環(huán)中，其中它們不僅幫助消除入侵的病原體還在急性和慢性炎癥期間用作免疫應答的體液調節(jié)劑，通過加工趨化因子和激活特定的細胞表面受體來調節(jié)細胞信號網(wǎng)絡(meyer-hoffert和wiedow，(2011)；pham,intjbiochemcellbiol40:1317-1333(2008)；wiedow和meyer-hoffert,journalofinternalmedicine257:319-328(2005))。嗜中性粒細胞絲氨酸蛋白酶活性的增加已經(jīng)與若干炎性和自身免疫疾病的發(fā)病機理有牽連，包括慢性阻塞性肺疾病、囊性纖維化、wegener肉芽腫病、papillion-lefèvre綜合征和小血管脈管炎(korkmaz等人,2010)。然而，尚未探索它們與自身免疫糖尿病的關聯(lián)。

試劑盒

上文所述的材料，以及其他材料，可以以任何適合的組合包裝在一起作為試劑盒，其可用于執(zhí)行或輔助進行所公開的方法。將試劑盒構成進行設計和調適以用于所公開的方法是有用的。例如所公開的是用于測量嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3的酶活性和/或蛋白水平的試劑盒，所述試劑盒包含用于嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3的底物。

試劑盒可包括針對嗜中性粒細胞彈性蛋白酶、蛋白酶3或者兩者的抗體。試劑盒還可以包括與ne和/或pr3抗體反應的抗體。這些二級二級抗體可以綴合至檢測酶，如辣根過氧化物酶。所述試劑盒還可以包括發(fā)色底物。例如，可包括用于二級二級抗體的發(fā)色底物。試劑盒還可包括用于測量嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3的酶活性的發(fā)色底物。

混合物

所公開的是通過執(zhí)行或準備進行所公開方法而形成的混合物。例如，所公開的是包含樣品和底物的混合物。

每當所述方法涉及將組成或組分或試劑進行混合或進行接觸時，則執(zhí)行該方法就會創(chuàng)建許多不同的混合物。例如，如果方法包括3個混合步驟，如果所述步驟是分別執(zhí)行的，那么在這些步驟的每一個之后形成獨特的混合物。此外，在所有這些步驟完成時都會形成混合物，無論如何執(zhí)行的所述步驟。本公開考慮到通過執(zhí)行所公開的方法而獲得的這些混合物，以及含有任何公開的試劑、組合物或組分(例如本文公開的)的混合物。

用于評估自身免疫糖尿病的傾向或對其進行診斷的方法

在本發(fā)明的一方面，提供了用于評估在受試者中對發(fā)展自身免疫糖尿病的風險或傾向和/或對其進展進行的方法。所述方法包括在受試者中確定嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3中至少一種的酶活性和/或蛋白濃度，并將所測量的酶活性和/或蛋白濃度與其各自的參考水平進行比較。通常從受試者取得樣品并測量酶活性和/或蛋白濃度。所述樣品可以是，例如血液、血清、血漿、尿液、唾液、腦脊液、眼淚、組織或其組合。如果所述嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3中至少一種的酶活性和/或蛋白濃度高于相應的參考水平，那么該受試者(例如患者)發(fā)展出自身免疫糖尿病的風險或傾向比具有低于相應參考水平的嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3中至少一種的酶活性和/或蛋白濃度的人更高。

在某些實施方案中，嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3的酶活性和/或蛋白濃度的參考水平，可以得自未患有自身免疫糖尿病的一個或多個受試者。如果樣品中所述嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3的酶活性和/或蛋白濃度的水平在統(tǒng)計學可接受的范圍內，例如參考水平加減大約10%，則表示該受試者中沒有自身免疫糖尿??；然而，如果樣品中所述嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3的酶活性和/或蛋白濃度的水平在參考水平之上超過20%，那么這表示該受試者中有自身免疫糖尿病。

基于本文所描述的發(fā)明，當樣品中所含有的嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3中至少一種的酶活性和/或蛋白水平高于從未患有自身免疫糖尿病的一個或多個參考受試者所獲得的嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3中至少一種的酶活性和/或蛋白水平的參考水平時，受試者可以被鑒別為、診斷為、分類為等等具有發(fā)展出自身免疫糖尿病的風險。例如，當樣品中所含有的嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3中至少一種的酶活性和/或蛋白水平在從未患有自身免疫糖尿病的一個或多個參考受試者所獲得的嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3中至少一種的酶活性和/或蛋白水平各自的參考水平之上超過大約20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或更多時，受試者可以被鑒別為、診斷為、分類為等等具有發(fā)展出自身免疫糖尿病的風險。

當樣品中所含有的嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3中至少一種的酶活性和/或蛋白水平在從未患有自身免疫糖尿病的一個或多個參考受試者所獲得的嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3中至少一種的酶活性和/或蛋白水平各自的參考水平之上超過至少大約20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%或70%時，受試者可以被鑒別為、診斷為、分類為等等具有發(fā)展出自身免疫糖尿病的風險。

在一些實施方案中，當樣品中所含的嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3中至少一種的酶活性在從未患有自身免疫糖尿病的參考受試者獲得的嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3中至少一種的酶活性各自的參考水平之上超過大約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%或更多時，受試者可以被鑒別為、診斷為、分類為等等具有發(fā)展出自身免疫糖尿病的風險。在一些實施方案中，當樣品中所含的嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3中至少一種的酶活性在從未患有自身免疫糖尿病的一個或多個參考受試者獲得的嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3中至少一種的酶活性各自的參考水平之上至少大約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%時，受試者可以被鑒別為、診斷為、分類為等等具有發(fā)展出自身免疫糖尿病的風險。

在一些實施方案中，當樣品中所含嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3中至少一種的蛋白水平在從未患有自身免疫糖尿病的參考受試者獲得的嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3中至少一種的蛋白水平各自的參考水平之上超過大約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%或更多時，受試者可以被鑒別為、診斷為、分類為等等具有發(fā)展出自身免疫糖尿病的風險。在一些實施方案中，當樣品中所含嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3中至少一種的蛋白水平在從未患有自身免疫糖尿病的一個或多個參考受試者獲得的嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3中至少一種的蛋白水平各自的參考水平之上至少大約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%時，受試者可以被鑒別為、診斷為、分類為等等具有發(fā)展出自身免疫糖尿病的風險。

在一些實施方案中，當樣品中所含嗜中性粒細胞彈性蛋白酶的蛋白水平在從未患有自身免疫糖尿病的一個或多個參考受試者獲得的嗜中性粒細胞彈性蛋白酶的蛋白水平的參考水平之上超過大約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%或更多時，受試者可以被鑒別為、診斷為、分類為等等具有發(fā)展出自身免疫糖尿病的風險。在一些實施方案中，當樣品中所含嗜中性粒細胞彈性蛋白酶的蛋白水平在從未患有自身免疫糖尿病的一個或多個參考受試者獲得的嗜中性粒細胞彈性蛋白酶的蛋白水平的參考水平之上至少大約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%時，受試者可以被鑒別為、診斷為、分類為等等具有發(fā)展出自身免疫糖尿病的風險。

在一些實施方案中，當樣品中所含蛋白酶3的蛋白水平在從未患有自身免疫糖尿病的一個或多個參考受試者獲得的蛋白酶3蛋白水平的參考水平之上超過大約20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或更多時，受試者可以被鑒別為、診斷為、分類為等等具有發(fā)展出自身免疫糖尿病的風險。在一些實施方案中，當樣品中所含蛋白酶3的蛋白水平在從未患有自身免疫糖尿病的一個或多個參考受試者獲得的蛋白酶3蛋白水平的參考水平之上至少大約20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%或70%時，受試者可以被鑒別為、診斷為、分類為等等具有發(fā)展出自身免疫糖尿病的風險。

在一些實施方案中，當樣品中所含嗜中性粒細胞彈性蛋白酶的酶活性水平在從未患有自身免疫糖尿病的一個或多個參考受試者獲得的嗜中性粒細胞彈性蛋白酶酶活性的參考水平之上超過大約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%或更多時，受試者可以被鑒別為、診斷為、分類為等等具有發(fā)展出自身免疫糖尿病的風險。在一些實施方案中，當樣品中所含嗜中性粒細胞彈性蛋白酶的酶活性水平在從未患有自身免疫糖尿病的一個或多個參考受試者獲得的嗜中性粒細胞彈性蛋白酶酶活性的參考水平之上至少大約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%時，受試者可以被鑒別為、診斷為、分類為等等具有發(fā)展出自身免疫糖尿病的風險。

在一些實施方案中，當樣品中所含蛋白酶3的酶活性水平在從未患有自身免疫糖尿病的一個或多個參考受試者獲得的蛋白酶3酶活性的參考水平之上超過大約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%或更多時，受試者可以被鑒別為、診斷為、分類為等等具有發(fā)展出自身免疫糖尿病的風險。在一些實施方案中，當樣品中所含蛋白酶3的酶活性水平在從未患有自身免疫糖尿病的一個或多個參考受試者獲得的蛋白酶3酶活性的參考水平至少至少大約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%時，受試者可以被鑒別為、診斷為、分類為等等具有發(fā)展出自身免疫糖尿病的風險。

從未患有自身免疫糖尿病的一個或多個參考受試者獲得的嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3的酶活性和/或蛋白水平的參考水平，可以與正在測試自身免疫糖尿病風險的受試者的評估一起來確定，或者優(yōu)選地，通過建立要用于未來測定的此類參考水平來進行確定。如本文所公開的，此類參考水平的實例有400ng/ml的嗜中性粒細胞彈性蛋白酶的蛋白水平(或者262ng/ml至469ng/ml的范圍)、100ng/ml的蛋白酶3的蛋白水平(或者92ng/ml至165ng/ml的范圍)以及0.15mu/ml的循環(huán)ne/pr3酶活性(或者0.10mu/ml至0.21mu/ml的范圍)。

所公開的方法也可以用于鑒別受試者顯示出成人發(fā)作糖尿病的跡象、診斷為有胰島素抗性或診斷為有2型糖尿病、為具有發(fā)展出自身免疫糖尿病(lada)的風險。具有發(fā)展出2型糖尿病風險的或者患有2型糖尿病的那些中的一部分，將會發(fā)展出自身免疫糖尿病。對于這些受試者，用于2型糖尿病的傳統(tǒng)治療將會無效或者會無法防止自身免疫糖尿病的發(fā)展。所公開的方法可用于鑒別此類具有發(fā)展出自身免疫糖尿病風險的受試者。一旦經(jīng)鑒別，此類受試者可基于其發(fā)展出自身免疫糖尿病的風險而接受治療。

所公開的方法對于篩選具有已知自身免疫糖尿病風險因素的受試者是特別有用的。此類風險因素包括具有近親成員被診斷為自身免疫糖尿病、具有自身免疫糖尿病的遺傳學標志物以及具有一個或多種自身免疫糖尿病相關的自身抗體。所公開的方法可以提供表明受試者有風險或正在發(fā)展自身免疫抗體的最早的指示。此類早期鑒別允許更早的以及很可能更成功的介入。

嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3的酶活性可以使用連續(xù)或非連續(xù)的測定，通過監(jiān)測從底物或產(chǎn)物吸收、發(fā)射、釋放或產(chǎn)生光、熒光或熱的變化來進行測量。在優(yōu)選的實施方案中，嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3的酶活性，可以使用連續(xù)的測定，通過監(jiān)測從底物吸收或發(fā)射光的變化來進行測量，例如使用綴合至發(fā)色或熒光基團(在切割后釋放)的合成肽底物。應理解可以使用在樣品中測量嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3的酶活性的任何方法。代表性的技術包括但不限于，在反應過程中，通過監(jiān)測從綴合至發(fā)色基團或熒光基團的合成肽底物所產(chǎn)生的顏色或熒光的連續(xù)測定，所述熒光激活細胞分選術如p-硝基苯胺，所述熒光基團如正-氨基苯甲酰。

嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3的蛋白濃度可以使用常規(guī)方法來確定，如熒光激活細胞分選術(facs)、液相層析/串聯(lián)質譜(lc/ms/ms)、表面等離子共振(spr)、電化學免疫測定、酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)、免疫組織化學或蛋白印跡。在優(yōu)選的實施方案中，嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3的蛋白濃度可以使用免疫學測定來確定，例如elisa測定或夾心測定。應理解可以使用在樣品中對嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3的蛋白濃度進行定量的任何技術。代表性的方法包括但不限于，免疫沉淀、質譜、電泳和層析包括親和性層析。

本文提供的是這樣的測定，其可以用于例如檢測嗜中性粒細胞彈性蛋白酶(ne)和蛋白酶3(pr3)以用于本文公開的方法。各種有用的免疫檢測方法的步驟已經(jīng)在科學文獻中描述，如例如maggio等人,enzyme-immunoassay,(1987)和nakamura等人，enzymeimmunoassays:heterogeneousandhomogeneoussystems,handbookofexperimentalimmunology,vol.1:immunochemistry,27.1-27.20(1986)，其每個都以其整體通過引用并入本文并且特別是其對于免疫檢測方法的教導。免疫測定，在其最簡單和直接的意義上來說，是涉及抗體和抗原之間結合的結合測定法。已知許多類型和形式的免疫測定并且全都適合用于檢測公開的生物標志物。免疫測定的實例有酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)、放射性免疫測定(ria)、放射免疫沉淀測定(ripa)、免疫珠捕獲測定、蛋白印跡、斑點印跡、凝膠遷移測定、流式細胞術、蛋白陣列、多路微珠陣列、磁力捕獲、體內成像、熒光共振能量轉移(fret)和光褪色后的熒光回收/定位(frap/flap)。

一般而言，免疫測定涉及將懷疑含有目的分子的樣品(如公開的癌癥樣品)與針對所述目的分子的抗體接觸或者將針對目的分子的抗體(如針對ne和pr3的抗體)與可被所述抗體結合的分子接觸(視情況)，其中是在有效允許免疫復合物形成的條件下。在有效條件下，將樣品與針對目的分子的抗體或與可以結合針對目的分子的抗體的分子接觸，并接觸允許形成免疫復合物（初級免疫復合物）的充足的時間段一般是僅將分子或抗體與樣品接觸并溫育所述混合物一段足以使抗體與抗體可以結合的存在的任何分子（例如，抗原）形成（即，與之結合）免疫復合物的時間段。在許多形式的免疫測定中，可繼而洗滌樣品-抗體組合物，如組織切片、elisa平板、斑點印跡或蛋白印跡，以去除任何非特異性結合的抗體種類，僅允許檢測初級免疫復合物中特異性結合的那些抗體。

免疫測定可包括用于對樣品中目的分子(如所公開的ne和pr3或者其抗體)的量進行檢測和定量的方法，所述方法一般涉及對結合過程期間形成的任何免疫復合物進行檢測或定量。一般而言，對免疫復合物形成的檢測是本領域熟知的，并且可以通過應用許多方法實現(xiàn)。這些方法一般是基于對標記或標志物的檢測，如任何的放射性、熒光、生物學或酶標簽或者任何其它已知的標記。參見例如，美國專利3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和4,366,241，所述的每一個都以其整體通過引用并入本文并且特別用于針對免疫檢測方法和標記的教導。

涉及對物質(如蛋白或針對具體蛋白的抗體)的檢測的免疫測定，包括無標記測定法、蛋白分離方法(也即，電泳)、固體支持物捕獲測定法或者體內檢測。無標記測定法一般是對樣品中特定的蛋白或針對特定蛋白的抗體的存在或缺失進行確定的診斷措施。蛋白分離方法另外可用于評估蛋白的物理性質，如大小或靜電荷。捕獲測定法一般對于樣品中特定的蛋白或針對特定蛋白的抗體的濃度的定量評估更有用。最后，體內檢測可用于評估該物質的空間表達模式，也即，在受試者、組織或細胞中的何處可以找到該物質。

條件是濃度足夠，通過抗體-抗原相互作用而生成的分子復合物([ab-ag]n)是裸眼可見的，但是較小的量也是可以檢測和測量的（由于其對光束的散射能力）。復合物的形成表明兩種反應物都存在，而且在免疫沉淀測定中使用恒定濃度的試劑抗體；來測量特異性的抗原([ab-ag]n)，而試劑抗原則用于檢測特異性的抗體([ab-ag]n)。如果試劑種類已經(jīng)提前包被至細胞上(如在紅血球凝聚測定中)或很小的顆粒上(如乳膠凝集測定中)，經(jīng)包被顆粒的“簇集(clumping)”在低很多的濃度都是可見的?；谶@些基本原理的許多測定法都是通常使用的，包括ouchterlony免疫擴散測定、火箭免疫電泳和免疫比濁測定和濁度測定。此類測定法的主要限制是與利用標記的測定法相比有限的靈敏性(較低的檢出限)，以及在一些情況下很高濃度的分析物實際上可以抑制復合物的形成，必需有防護措施從而使過程更復雜。這些組1測定法回溯至抗體的發(fā)現(xiàn)并且它們都不具有真正的“標記”(例如ag-enz)。其它種類的無標記免疫測定依賴于免疫傳感器，并且許多能夠直接檢測抗體-抗原相互作用的儀器為商業(yè)可獲得的。大多數(shù)都依賴于在固定有配體的傳感器表面生成倏逝波(evanescentwave)，其使得可以持續(xù)監(jiān)測對配體的結合。免疫傳感器使得可以容易地對動力學相互作用進行研究，并且隨著成本更低的專門儀器的出現(xiàn)，未來在免疫分析領域有著更廣闊的應用。

使用免疫測定來檢測特定蛋白可以涉及通過電泳分離蛋白。電泳是帶電分子在溶液中響應電場而進行的遷移。其遷移速率取決于場的強度，取決于分子的電荷、大小和形狀，以及還取決于分子在其中移動的介質的離子強度、粘度和溫度。作為分析工具，電泳簡單、快速且高度靈敏。其分析性地用于研究單一帶電種類的性質以及用作分離技術。

使用可以與所公開的方法一起進行的電泳的免疫測定是蛋白印跡分析。蛋白印跡或免疫印跡允許確定蛋白的分子量以及測量不同樣品中存在的蛋白的相對量。檢測方法包括化學發(fā)光和發(fā)色檢測。用于蛋白印跡分析的標準方法可以例如在d.m.bollag等人,proteinmethods(2dedition1996)和e.harlow&d.lane.antibodies,alaboratorymanual(1988),美國專利4,452,901中找到，對于蛋白印跡方法的教導其各自以其整體通過引用并入本文。一般而言，蛋白通過凝膠電泳進行分離，常常是sds-page。將蛋白轉移至一層特殊的印跡紙，例如硝化纖維素，但也可以使用其它類型的紙或膜。蛋白保持其在凝膠上同樣的分離模式。將印跡與一般的蛋白(如乳蛋白)進行溫育以將硝化纖維素上的余下的粘性位置都結合。繼而將抗體添加至溶液，其能夠結合至其特異性的蛋白。

可以通過間接的酶免疫測定技術容易地使特異性抗體附著至特異性固定的抗原可視化，其通常使用發(fā)色底物(例如堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶)或化學發(fā)光底物。探測的其它可能性包括使用熒光或者放射性同位素標記(例如熒光素，¹²⁵i)。用于檢測抗體結合的探針可以是綴合的抗-免疫球蛋白、綴合的葡萄球菌蛋白a(結合igg)或者針對生物素化的初級抗體的探針(例如綴合的抗生物素蛋白/鏈酶親和素)。

所述技術的效力在于同時通過其抗原性的措施以及其分子量來同時檢測特定的蛋白。蛋白首先在sds-page中通過質量進行分離，繼而在免疫測定步驟中特異性地進行檢測。因而，可以同時運行蛋白標準品(梯度標準)以估算異質樣品中目的蛋白的分子量。

放射免疫沉淀測定(ripa)是使用放射標記的抗原來檢測血清中特異性抗體的靈敏測定。使抗原與血清反應，并繼而使用特殊的試劑來使其沉淀，如例如，蛋白a瓊脂糖珠。通常接著將結合的放射標記免疫沉淀物用凝膠電泳進行分析。放射免疫沉淀測定(ripa)通常用作診斷hiv抗體存在的確認性測試。ripa在本領域中也稱作farr測定、沉淀素測定、放射免疫沉淀素測定；放射免疫沉淀分析；放射免疫沉淀分析和放射免疫沉淀分析。

還考慮到這樣的免疫測定，其中將蛋白或特異于蛋白的抗體結合至固體支持物(例如管、孔、珠或細胞)來分別從樣品中捕獲目的的抗體或蛋白，與用于檢測支持物上蛋白或特異于該蛋白的抗體的方法進行組合。此類免疫測定的實例包括放射免疫測定(ria)、酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)、流式細胞術、蛋白陣列、多路微珠測定和磁力捕獲。

放射免疫測定(ria)是用于檢測抗原-抗體反應的經(jīng)典定量測定，其直接或間接地使用放射性標記的物質(放射性配體)，以測量未標記物質對于特異性抗體或其它受體體系的結合。放射免疫測定用于例如測試血液中的激素水平，而無需使用生物測定。非免疫原性物質(例如半抗原)如果偶合至能夠誘導抗體形成的較大的載體蛋白(例如牛γ-球蛋白或人血清白蛋白)則也可以進行測量。ria涉及將放射性抗原(因為將碘原子引入至蛋白中酪氨酸的簡便性，所以經(jīng)常使用放射性同位素¹²⁵i或¹³¹i)與針對該抗原的抗體進行混合。所述抗體一般被連接至固體支持物，如管或珠。繼而以已知的量來添加未標記的或者“冷”抗原并測量被替換的標記抗原的量。初始，放射性抗原結合至抗體。當添加冷抗原時，二者競爭抗體結合位點-而較高濃度的冷抗原更多的結合至抗體，替換掉放射性變體。將結合的抗原與溶液中未結合的那些分離，并將每個的放射性用于結合曲線作圖。該技術是極為靈敏和特異的。

酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)，或者更常見地稱作eia(酶免疫測定)，是能夠對特異于蛋白的抗體進行檢測的免疫測定。在此種測定中，結合至抗體結合試劑或抗原結合試劑的可檢測標記是酶。當暴露于其底物時，此酶以產(chǎn)生可檢測(例如通過分光光度計、熒光計或可視的措施)化學部分的方式進行反應?？捎糜跈z測的能用于可檢測地標記試劑的酶包括但不限于，辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、過氧化氫酶、蘋果酸脫氫酶、葡萄球菌核酸酶、天冬酰胺酶、酵母乙醇脫氫酶、α-甘油磷酸脫氫酶、磷酸丙糖異構酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡糖淀粉酶和乙酰膽堿酯酶。對于elisa程序的描述，參見voller,a.等人,j.clin.pathol.31:507-520(1978);butler,j.e.,meth.enzymol.73:482-523(1981);maggio,e.(ed.),enzymeimmunoassay,crcpress,bocaraton,1980;butler,j.e.,in:structureofantigens,vol.1(vanregenmortel,m.,crcpress,bocaraton,1992,pp.209-259;butler,j.e.,in:vanoss,c.j.等人,(eds),immunochemistry,marceldekker,inc.,newyork,1994,pp.759-803;butler,j.e.(ed.),immunochemistryofsolid-phaseimmunoassay,crcpress,bocaraton,1991);crowther,“elisa:theoryandpractice,”in:methodsinmoleculebiology,vol.42,humanapress;newjersey,1995;美國專利4,376,110，其各自都以其整體通過引用并入本文及特別用于對elisa方法的教導。

elisa技術的變化是本領域技術人員已知的。在一種變化中，可將能結合蛋白的抗體固定至展示蛋白親和性的選定表面上，如聚苯乙烯微量滴定板中的孔。隨后，可以將懷疑含有標志物抗原的測試組合物添加至所述孔。在結合以及洗滌以去除非特異性結合的免疫復合物之后，可以檢測到結合的抗原?？梢酝ㄟ^添加對靶蛋白特異的二級二級抗體（其連接至可檢測標記）來實現(xiàn)檢測。此種類型的elisa是簡單的“夾心elisa”。也可以通過添加二級二級抗體、隨后添加對二級二級抗體有結合親和力的三級抗體(其中三級抗體連接至可檢測標記)來實現(xiàn)檢測。

另一種變化是競爭性elisa。在競爭性elisa中，測試樣品競爭結合已知量的經(jīng)標記抗原或抗體?？梢酝ㄟ^在與經(jīng)包被的孔溫育之前或期間將樣品與已知的經(jīng)標記種類混合，來確定所述樣品中反應性種類的量。樣品中反應性種類的存在會發(fā)揮作用以減少可用于結合至孔的經(jīng)標記種類的量，并因而減少最終的信號。

無論使用的是何種形式，elisa都有一些共通的特征，如包被、溫育或結合、洗滌以去除非特異性結合的種類以及檢測結合的免疫復合物。抗原或抗體可以連接至固體支持物，如以平板、珠、量油計(dipstick)、膜或柱基質的形式，以及將待分析樣品應用于固定的抗原或抗體。在用抗原或抗體包被平板時，一般會將平板的孔與抗原或抗體的溶液溫育(過夜或者指定的小時時間段)。繼而可以洗滌平板的孔，以去除非完全吸附的材料。所述孔的任何剩余可用表面可以繼而用非特異性蛋白(其對于測試抗血清而言在抗原地為中性)“包被”。這些包括牛血清白蛋白(bsa)、酪蛋白以及奶粉溶液。該包被使得將固定表面上的非特異性吸附位點封閉，并因而減少了由抗血清非特異性結合至表面上而引起的背景。

在elisa中，也可以使用二級甚至是三級的檢測措施而不是直接的程序。因而，在蛋白或抗體結合至少是孔之后，用非反應性的材料包被來減少背景，以及洗滌來去除未結合的材料，在使免疫復合物(抗原/抗體)有效形成的條件下將固定表面與待測對照臨床或生物學樣品進行接觸。免疫復合物的檢測隨后需要經(jīng)標記的二級結合劑或者綴合了經(jīng)標記的三級結合物質的二級結合物質。

使免疫復合物(抗原/抗體)有效形成的條件是指這樣的條件，其包括，例如，用諸如bsa、牛γ-球蛋白(bgg)和磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)/tween來稀釋抗原和抗體，以便減少非特異性結合以及促進合理的信噪比。

有效或適合的條件一般還包括在足以使得可以有效結合的溫度和時間段來進行溫育。溫育步驟可通常為大約1分鐘至12小時，溫度為大約20o至30oc，或者可以在大約0oc至大約10oc溫育過夜。

在elisa中所有的溫育步驟之后，可以洗滌接觸表面，以便去除未復合的材料。洗滌程序可包括用諸如pbs/tween或硼酸鹽緩沖液的溶液來進行的洗滌。在測試樣品與最初結合的材料形成特異性的免疫復合物，并隨后洗滌之后，可以確定免疫復合物即使是分鐘量的出現(xiàn)。

為了提供檢測措施，二級二級或三級抗體可以具有相關標記以允許檢測，如上文所述。這可以是酶，所述酶在與適合的發(fā)色底物溫育后能夠產(chǎn)生顏色顯影物。因而，例如，可以在有利于進一步免疫復合物顯影的條件下，將初級和二級免疫復合物與經(jīng)標記的抗體接觸和溫育一段時間(例如在室溫下于含pbs的溶液如pbs-tween中溫育2小時)。

在與標記的抗體溫育以及隨后洗滌以去除未結合的材料之后，可以將標記的量進行定量，例如在過氧化物酶作為酶標記的情況下，通過與發(fā)色底物如尿素和溴甲酚紫或2,2’-疊氮-二-(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸[abts]和h2o2溫育。繼而可以通過測量顏色生成的程度來實現(xiàn)定量，例如使用可見光分光光度計。

蛋白陣列是固相配體結合測定系統(tǒng)，其使用在表面上固定的蛋白，所述表面包括玻璃、膜、微滴定孔、質譜平板以及珠或其它顆粒。該測定是高度并行的(多路的)并且常常是微型化的(微陣列、蛋白芯片)。它們的優(yōu)勢包括快速且可自動化、能夠高度靈敏、試劑經(jīng)濟、并且在單一實驗中給出豐富的數(shù)據(jù)。生物信息學支持是重要的；數(shù)據(jù)處理需要精密的軟件和數(shù)據(jù)比較分析。然而，軟件可以從用于dna陣列的軟件調整過來，許多硬件和檢測系統(tǒng)也是如此。

一種主要的形式是捕獲陣列，其中配體結合試劑(其通常為抗體但也可以是可選的蛋白支架、肽或核酸適體)可用于在混合物如血漿或組織提取物中檢測靶標分子。在診斷學中，捕獲陣列可用于并行實施多路免疫測定，都例如在個體血清中測試若干分析物以及同時測試許多血清樣品。在蛋白質組學中，捕獲陣列可用于定量和比較健康和疾病的不同樣品中蛋白的水平，也即蛋白表達譜。蛋白之外的特異性配體結合劑可以以陣列的形式用于體外功能性相互作用篩選如蛋白-蛋白、蛋白-dna、蛋白-藥物、受體-配體、酶-底物等。捕獲試劑本身可以經(jīng)過選擇并針對多種蛋白進行篩選，這也可以在多路陣列形式中針對多個蛋白靶標來完成。

用于構建陣列的蛋白來源包括基于細胞的用于重組蛋白的表達系統(tǒng)、從天然來源純化、通過無細胞翻譯系統(tǒng)體外產(chǎn)生以及肽的合成方法。這些方法中的很多可以進行自動化以用于高通量生產(chǎn)。對于捕獲陣列和蛋白功能分析，重要的是蛋白需要正確地折疊并發(fā)揮功能；這并不總是如此，例如在變性條件下從細菌提取重組蛋白。但是，變性蛋白的陣列可用于篩選交叉反應性的抗體、鑒別自身抗體和選擇配體結合蛋白。

蛋白陣列已經(jīng)被設計為熟悉的免疫測定方法如elisa和斑點印跡的微型化，常用熒光讀數(shù)，并且由機器人和高通量檢測系統(tǒng)輔助，來使得多個測定并行實施。通常使用的物理支持物包括載玻片、硅、微孔、硝化纖維素或pvdf膜以及磁力和其他微珠。雖然遞送至平面上的蛋白微滴是最熟悉的形式，但可選的結構包括在微流體的開發(fā)基礎上的cd離心裝置(gyros，monmouthjunction，nj)和專門的芯片設計，如平板中經(jīng)工程改造的微通道(例如thelivingchip?，biotrove，woburn，ma)和硅表面上的微小3d支柱(zyomyx，haywardca)。懸液中的顆粒也可以用作陣列的基礎，條件是它們經(jīng)編碼而用于鑒別；系統(tǒng)包括對微珠(luminex，austin，tx；bio-radlaboratories)和半導體納米晶體(例如qdots?，quantumdot，hayward，ca)的顏色編碼，以及對珠的(ultraplex?，smartbeadtechnologiesltd，babraham，cambridge，uk)和多金屬微棒(例如nanobarcodes?particles，nanoplextechnologies，mountainview，ca)條形編碼。也可以將珠組裝至半導體芯片上的平整陣列中(leapstechnology，bioarraysolutions，warren，nj)。

熒光標記和檢測方法被廣泛使用，并且可以用于所公開的方法。用于讀取dna微陣列的相同儀器設施也適用于蛋白陣列。為了區(qū)分展示，可以用來自兩種不同的細胞狀態(tài)的熒光標記的蛋白探測捕獲(例如抗體)陣列，其中細胞裂解物直接與不同的熒光團(例如cy-3、cy-5)綴合并混合，使得顏色作用為靶標豐度變化的讀數(shù)。可以通過酪胺信號放大(tsa)將熒光讀數(shù)靈敏性放大10-100倍(perkinelmerlifesciences)。平面波導技術(zeptosens)能夠進行超靈敏熒光檢測，具有無介入的洗滌程序的優(yōu)勢。高靈敏性也可以用懸浮珠和顆粒來實現(xiàn)，使用藻紅蛋白作為標記(luminex)，或者通過半導體納米晶體的性質來實現(xiàn)(quantumdot)。已經(jīng)開發(fā)出許多新的可選讀數(shù)，特別是在商業(yè)生物技術領域。這些包括對以下的適應：表面等離子共振(htsbiosystems，intrinsicbioprobes，tempe，az)、滾環(huán)dna擴增(molecularstaging，newhavenct)、質譜(intrinsicbioprobes；ciphergen，fremont，ca)、共振光散射(geniconsciences，sandiego，ca)和原子力顯微法[bioforcelaboratories]。

捕獲陣列形成了用于表達譜的診斷芯片和陣列的基礎。它們利用高親和性捕獲試劑，如常規(guī)抗體、單一結構域、工程化的支架、肽或核酸適體，來以高通量的方式結合并檢測特異性的靶標配體。

抗體陣列具有所需的特異性的性質以及可接受的背景，并且有些也是商業(yè)可獲得的(bdbiosciences,sanjose,ca;clontech,mountainview,ca;biorad;sigma,st.louis,mo)。用于捕獲陣列的抗體是通過常規(guī)的免疫來制備(多克隆血清和雜交瘤)，或作為重組片段制備，通常在大腸桿菌（e.coli）中表達(在從噬菌體或核糖體展示文庫中選擇之后)(cambridgeantibodytechnology,cambridge,uk;bioinvent,lund,sweden;affitech,walnutcreek,ca;biosite,sandiego,ca)。在常規(guī)抗體之外，fab和scfv片段、來自駱駝的單一v-結構域或者工程改造的人類等價物(domantis，waltham，ma)也可用于陣列。

術語“支架”是指蛋白質的配體結合結構域，其經(jīng)工程改造為能夠結合多樣的靶標分子的多個變體(具有抗體樣性能的特異性和親和性)。所述變體可以以遺傳文庫的形式來產(chǎn)生，并通過噬菌體、細菌或核糖體展示來針對單獨的靶標進行選擇。此類配體結合支架或框架包括基于金黃色葡萄球菌(staph.aureus)蛋白a的‘親和體(affibodies)’(affibody,bromma,sweden)、基于纖連蛋白的‘三活菌素(trinectins)’(phylos,lexington,ma)和基于脂質運載蛋白結構的‘a(chǎn)nticalins’(pierisproteolab,freising-weihenstephan,germany)。這些可以以類似于抗體的方式用于捕獲陣列，并且可具有穩(wěn)健性和易于生產(chǎn)的優(yōu)勢。

非蛋白捕獲分子，尤其是以高特異性和親和性結合蛋白配體的單鏈核酸適體，也可以用于陣列(somalogic,boulder,co)。適體通過selex?程序而選自寡核苷酸文庫，并且其與蛋白的相互作用可以通過以下來增強：供價附著、通過摻入溴化脫氧尿苷和uv-激活的交聯(lián)(光適體)。對配體的光交聯(lián)由于特定空間要求而降低了適體交叉反應性。適體具有這樣的優(yōu)勢：通過自動化的寡核苷酸合成而易于生產(chǎn)，和dna的穩(wěn)定性和穩(wěn)健性；在光適體陣列上，可以使用通用熒光蛋白染色對結合進行檢測。

結合至抗體陣列的蛋白分析物可以直接或者經(jīng)二級二級抗體在夾心測定中檢測。直接標記用于比較具有不同顏色的不同樣品。當有針對相同蛋白配體的抗體對可用時，夾心免疫測定可提供高特異性和靈敏性并且因此是對于低豐度蛋白如細胞因子所選擇的方法；它們還提供了檢測蛋白修飾的可能性。

無標記檢測方法，包括質譜、表面等離子共振和原子力顯微法，避免了配體的變更。任何方法所需要的是最佳的靈敏性和特異性，具有低背景以給出高信噪比。由于分析物濃度涵蓋了廣泛地范圍，靈敏性必需經(jīng)過適當?shù)恼{適；樣品的系列稀釋或不同親和性的抗體的使用是此問題的解決方案。目的蛋白經(jīng)常是體液和提取物中低濃度的那些，需要在pg范圍或者更低進行檢測，如細胞因子或者細胞中的低表達產(chǎn)物。

捕獲分子陣列的替代是通過‘分子印跡’技術制備的，其中肽(例如從蛋白的c-末端區(qū)域)被用作模板來在可聚合基質中生成結構上互補的、序列特異的腔室；所述腔室繼而可以特異性的捕獲(使之變性)具有適合的初級氨基酸序列的蛋白(proteinprint?，aspirabiosystems，burlingame，ca)。

還描述了用于確定嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3的酶活性的測定。優(yōu)選發(fā)色測定。發(fā)色酶測定使用所要測定的酶的發(fā)色底物。此類發(fā)色底物經(jīng)過切割或者通過酶反應來產(chǎn)生可檢測的產(chǎn)物。所述可檢測產(chǎn)物可以是帶顏色的，可具有特異性的吸收或發(fā)射光譜，可以是熒光的、發(fā)光的，又或者產(chǎn)生可檢測的電磁信號。ne/pr3活性測量的可用發(fā)色底物的實例有meosuc-ala-ala-pro-val-pna(從該底物切割p-硝基苯胺(pna)提高了405nm處的吸光度)。

本發(fā)明用于在受試者中診斷或輔助診斷自身免疫糖尿病的診斷的另一個方法方面包括從所述受試者獲得樣品(優(yōu)選血液樣品)，和確定樣品中所含的嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3的酶活性和/或蛋白濃度。將確定的水平與參考水平進行比較。在優(yōu)選的實施方案中，如果嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3的酶活性和/或蛋白濃度高于參考水平，則存在自身免疫糖尿病。在另一個優(yōu)選的實施方案中，使用連續(xù)測定測量血液樣品中的嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3的酶活性，其通過在反應過程期間監(jiān)測顏色或熒光的生成，優(yōu)選在反應過程期間監(jiān)測合成肽底物(綴合至p-硝基苯胺)的顏色生成。血液樣品中嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3的蛋白濃度使用免疫測定優(yōu)選夾心免疫測定確定。這些方法的結果可用于與其它測試組合以在受試者中診斷自身免疫糖尿病。例如，可以測量血糖、糖化血紅蛋白、c-肽的水平或者胰島特異性自身抗體的而存在。所述數(shù)據(jù)與嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3的酶活性和/或蛋白濃度的確定組合，可用于評估發(fā)展出自身免疫糖尿病或者診斷出其存在的風險。

治療以降低發(fā)展出自身免疫糖尿病的風險

在本發(fā)明的各方面，降低自身免疫糖尿病的風險或者預防其出現(xiàn)，可以通過設計用于治療或預防1型糖尿病的任何策略和技術來實現(xiàn)。大多數(shù)策略涉及影響免疫系統(tǒng)以減少或者預防1型糖尿病的進一步發(fā)展。例如，可以避免胰島自身免疫的環(huán)境誘發(fā)劑如牛奶或者麩質。乳糜瀉病提供了可以通過此方式預防自身免疫疾病的令人鼓舞的實例?？蛇x地，食物可以補充有營養(yǎng)物(其缺乏據(jù)推測會促進胰島自身免疫)，例如n-3脂肪酸或維生素d。使用胰島自身抗原(例如完整胰島素)進行的抗原特異性的“疫苗接種”，改變了胰島素或胰島素原肽，gad65，或者熱休克蛋白60(hsp60)肽。(ludvigsson等人,newengljmed359:1909-1920(2008)。目的是通過調節(jié)性t-細胞(其下調對特異性自身抗原的免疫性以及促進對另外的自身抗原的耐受)的誘導而誘導自身抗原特異性的耐受。也可以非抗原特異性的全身療法，其范圍從口服煙酰胺或者卡介苗(bcg)疫苗接種的溫和調節(jié)到免疫阻抑和細胞療法。另一個可使用的策略是刺激β-細胞再生連同對凋亡(在胰島自身免疫中有提高)的阻抑，以克服糖尿病前期的復發(fā)-緩和進程。代謝的改變，如體重減輕和保持、提高的物理活性和β-細胞休息(rest)是其它的實例。

其它的實例包括拮抗b-細胞激活因子(baff)(marino等人diabetes61(11):2893-2905(2012))，促進糖尿病抗性mhc-ii類分子的表達(tian等人,j.clin.invest.114(7):969-978(2004))，cd3激活(herold等人,diabetes.62(11):3766-3774(2013)；herold等人,newengljmed346(22):1692-1698(2002)(okt3抗體))，抗胸腺細胞球蛋白(atg)療法(gitelman等人,thelancetdiabetes&endocrinology1(4):306-316(2013)；eisenbarth等人,diabetesres2:271-276(1985))，treg療法(du等人,plosone8(2):e56209(2013))，ctla-4抑制，腫瘤壞死因子-α(mastrandrea等人,diabetescare32:1244-1249(2009))，il-1受體拮抗劑，聚乙二醇化的粒細胞集落刺激因子，人重組干擾素-α(rother等人,diabetescare32:1250-1255(2009))，自體肝細胞移植(haller等人,diabetes58(supp.1):a7(2009)(abstract)；voltarelli等人,annnyacadsci1150:220-229(2008)；voltarelli等人,jama297:1568-1576(2007)；couri等人,jama301:1573-1579(2009))。因為嗜中性粒細胞在對β-細胞的攻擊中發(fā)揮作用，因而可以使用嗜中性粒細胞耗竭和/或抑制。可以通過使用ly6g-特異性抗體來耗竭嗜中性粒細胞。daley等人,j.leukocytebiol.83:64-69(2008)?？梢酝ㄟ^阻斷或拮抗ly6g來降低嗜中性粒細胞活性。wang等人,blood120(7):1489-1498(2012)。

用于降低自身免疫糖尿病風險或預防其發(fā)作的這些和其它技術在以下中有描述：美國專利申請公開號2014/0045923、2013/0345257、2013/0338039、2013/0280208、2013/0164302、2013/0109107、2012/0225131、2012/0003240、2012/0003239、2012/0003238、2011/0236370、2011/0200610、2011/0124609、2011/0111023、2010/0166669、2010/0143374、2010/0047273、2010/0028450、2009/0305340、2009/0252753、2009/0226440、2009/0092637、2008/0248055、2008/0187522、2006/0240032、2006/0115899和2005/0271641。

由本發(fā)明的方面提供的，用于預防或降低自身免疫糖尿病風險的另外的方法，包括使用ne和/或pr3的化學或肽抑制劑，用于阻斷酶活性(groutas等人,expertopinionontherapeuticpatents21(3):339-354(2011)；crocetti等人,j.med.chem.56(15):6259-6272(2013))，或者使用任何能夠阻斷嗜中性粒細胞激活的化合物。實例包括α1-蛋白酶抑制劑、3,4-二氯異香豆素、大豆胰蛋白酶抑制劑、彈性蛋白酶抑制劑、n-(甲基琥珀?；?-ala-ala-pro-val-氯甲基酮、西維來司他、ssr69071、azd9668、ono-6818、抑彈性蛋白酶蛋白、抗嗜中性粒細胞胞質抗體(anca)、針對ne的抗體和針對pr3的抗體。

基于鑒別的行動

本發(fā)明方法的實施方案包括基于測量、檢測、比較、分析、測定、篩選等，而對于受試者、疾病、狀況、狀態(tài)等進行確定、鑒別、指示、關聯(lián)、診斷、預后等(其可以統(tǒng)稱為“鑒別”)。例如，受試者可以被鑒別為有發(fā)展出自身免疫糖尿病的風險。此類鑒別由于許多原因而有用。例如，且特別是，此類鑒別使得可以基于所進行的具體的鑒別(或與之相關)，而采取特定的行動。例如，在具體受試者中對于具體疾病或狀況的診斷(以及其它受試者中缺乏對于該疾病和狀況的診斷)，具有非常有用的作用，基于診斷鑒別出將會受益于治療、行動、行為等的受試者。例如，在經(jīng)鑒別的受試者中對于具體疾病或狀況的治療與未經(jīng)此種鑒別(或未留意此鑒別)的所有受試者的治療有顯著不同。需要所述治療(或者會受益于所述治療)的受試者，將會接受該治療，而不需要所述治療(或不會收益于所述治療)的受試者，將不會接受該治療。

因此，所提供的方法的實施方案包括在所公開的鑒別之后(并在其基礎上)，而采取特定的行動。例如，所提供的是包括創(chuàng)建鑒別記錄的方法(例如以物理的形式—如紙面的、電子的或其它形式)。因而，例如，基于所提供方法而創(chuàng)建鑒別的記錄，與僅僅進行測量、檢測、比較、分析、測定、篩選等有著物理上的、有形的差別。此種記錄特別重要且有意義是在于，其允許將鑒別固定為有形的形式，其例如可以與他人進行溝通(如基于該鑒別而可能對所述受試者進行治療、監(jiān)測、隨訪、建議等等的那些人)；保留用于日后使用或參閱；用作數(shù)據(jù)來評估成組的受試者、治療效力、基于不同測量的鑒別的準確性、檢測、比較、分析、測定、篩選等。例如，鑒別記錄的此類用途，可以例如由與制定該鑒別記錄的個體或實體相同的個體或實體來進行、由與之不同的個體或實體來進行或者由與之相同的個體或實體和與之不同的個體或實體的組合來進行。創(chuàng)建記錄的方法可以與提供的任何一個或多個其它方法進行組合，并且特別是與鑒別方法的任何一個或多個步驟組合。

作為另一實例，本發(fā)明的方法包括基于一個或多個其它的鑒別而進行一個或多個額外的鑒別。例如，可以基于其它鑒別來鑒別具體的治療、監(jiān)測、隨訪、建議等。例如，將受試者鑒別為患有疾病或者狀況(具有高水平的具體組分或特征)，可以進一步將該受試者鑒別為可以或者應當使用基于或針對所述高水平的組分或特征的療法進行的治療?？梢詣?chuàng)建此種進一步鑒別的記錄(例如如上文所述)，并且可以以任何適合的方式使用。此類進一步的額鑒別可以直接基于，例如其它的鑒別、此類其它鑒別的記錄或者組合。此類進一步鑒別，可以例如由與制定所述另外的鑒別的個體或實體相同的個體或實體來進行、由與之不同的個體或實體來進行或者由與之相同的個體或實體和與之不同的個體或實體的組合來進行。進行進一步鑒別的方法可以與本文所公開的任何一個或多個其它方法進行組合，并且特別是與鑒別方法的任何一個或多個步驟組合。

作為另一實例，提供了用于治療、監(jiān)測、隨訪、建議等本發(fā)明所提供的任何方法中鑒別的受試者的方法，。還提供了包括治療、監(jiān)測、隨訪、建議等已經(jīng)從任何提供的方法中制定了鑒別記錄的受試者的方法。例如，可以基于鑒別和/或基于鑒別的記錄，來使用具體的治療、監(jiān)測、隨訪、建議等。例如，可以用基于或針對于所述高水平組分或特征的療法治療經(jīng)鑒別患有疾病或狀況(具有高水平的具體組分和特征)的受試者(和/或已經(jīng)對此種鑒別進行了記錄的受試者)。此類治療、監(jiān)測、隨訪、建議等可以直接基于例如鑒別、此類鑒別的記錄或者組合。此類治療、監(jiān)測、隨訪、建議等，可以例如由與制定所述鑒別和/或鑒別記錄的個體或實體相同的個體或實體來進行、由與之不同的個體或實體來進行或者由與之相同的個體或實體和與之不同的個體或實體的組合來進行。治療、監(jiān)測、隨訪、建議等的方法可以與本文提供的任何一個或多個其它方法進行組合，并且特別地與鑒別方法的任何一個或多個步驟組合。

所述測量、檢測、比較、分析、測定、篩選等可以用于與本文所提供的那些不同的方式或者不同的目的。例如，對于患有糖尿病的受試者鑒別出其不具有高水平的嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3，可用于通過排除該受試者可發(fā)展出成人隱匿性自身免疫性糖尿病的可能性，從而確信地治療該受試者的2型糖尿病。因而，所提供的測量、檢測、比較、分析、測定、篩選等，并未涵蓋此類測量、檢測、比較、分析、測定、篩選等的所有用途。

術語“命中(hit)”是指測試化合物在測定中顯示出期望的性質。術語“測試化合物”是指要作為假定的調節(jié)劑通過一個或多種篩選方法進行測試的化學品。測試化學品可以是任何化學品，如無機化學品、有機化學品、蛋白、肽、碳水化合物、脂質或其組合。通常，使用各種預先確定的濃度的測試化學品進行篩選，如0.01微摩爾、1微摩爾和10微摩爾。測試化合物對照可包括在不存在所述測試化合物時測量信號，或者與已知調節(jié)靶標的化合物進行比較。

術語“高”、“較高”、“增加”、“升高”或“增高”是指在基礎水平之上提高，例如與對照比較。術語“低”、“較低”、“降低”或“下降”是指在基礎水平指向減少，例如與對照比較。

如本文所用的術語“調節(jié)”是指與適當對照相比化合物以某些可測量的的方式改變活性的能力。作為測定中存在化合物的結果，活性可以在不存在這些化合物下，相較于對照增加或者降低。優(yōu)選地，與不存在所述化合物的活性水平相比，活性增加至少25%、更優(yōu)選至少50%、最優(yōu)選至少100%。類似地，與不存在所述化合物的活性水平相比，活性優(yōu)選降低至少25%、更優(yōu)選至少50%、最優(yōu)選至少100%。增加已知活性的化合物是“激動劑”。降低或者防止已知活性的化合物是“拮抗劑”。

如本文所用術語“抑制”意指減少或降低活性或者表達。這可以是對活性或表達的完全抑制，或者部分抑制。抑制可以與對照或者與標準水平進行比較。抑制可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64,65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%。

如本文所用術語“監(jiān)測”是指可以測量活性的本領域的任何方法。

如本文所用術語“提供”是指向本領域抑制的某事物添加化合物或分子。提供的實例可以包括例如，使用移液管、移液器(pipettemen)、注射器、針、管、槍等。這可以是手動的或自動的。其可以包括通過任何措施的轉染或者向皿、細胞、組織、無細胞系統(tǒng)提供核酸的任何其它措施并且可以是體外的或體內的。

如本文所用術語“預防”是指在疾病或狀況的臨床癥狀發(fā)作之前施用化合物，以便防止與所述疾病或狀況相關的偏差的物理表現(xiàn)。

如本文所用術語“需要治療”是指由護理者(例如對于人類的情況醫(yī)師、護士、護理師或個體；對于動物的情況獸醫(yī)，包括非人哺乳動物)進行的判斷，其中受試者需要治療或者會從中受益。此判斷是基于許多種因素(在護理提供者的專業(yè)領域之內)而做出的，但是其中包括知曉所述受試者患病或將會患病(作為可用本發(fā)明化合物治療的狀況的結果)。

對于"治療"，是指意圖治愈、緩解、穩(wěn)定或防止疾病、病理狀況或病癥對受試者進行的醫(yī)學管理。此術語包括積極治療，即特別針對疾病、病理狀況或病癥的改善的治療，以及也包括病因療法，即目的在于去除與疾病、病理狀況或病癥相關的起因的療法。此外，此術語包括姑息療法，即設計用于緩解癥狀而不是治愈疾病、病理狀況或病癥；預防性治療，即目的在于使疾病、病理狀況或病癥的發(fā)展最小化或者部分地或完全地抑制其發(fā)展的治療；和支持性治療，即利用治療來作為另一具體療法的補充，目的在于改善相關的疾病、病理狀況或病癥。應理解當治療是意圖治愈、緩解、穩(wěn)定或防止疾病、病理狀況或病癥時，并不必需要實際上導致治愈、緩解、穩(wěn)定或防止。治療的效果可以如本文所描述進行測量或評估(并且如本領域中所知適合用于所涉及的疾病、病理狀況或病癥)。此種測量和評估可以定性的和/或定量的術語來進行。因而，例如，疾病、病理狀況或病癥和/或疾病、病理狀況或病癥的癥狀的特征和特性可以降低到任何效果或者降低至任何量。

對于如本文所提供的化合物的術語“有效量”，是指該化合物提供期望的結果的非毒性但足夠的量。如下文所指出的，所需的確切量在受試者與受試者之間會有變化，這取決于受試者的種類、年齡和整體狀況，所治療疾病的嚴重性，所使用的額特定化合物，其施用模式，等等。因而，不可能明確給出確切的“有效量”。然而，本領域技術人員可以僅施用常規(guī)的實驗來確定適合的有效量。

對于術語“嬰兒”，是指年幼的嬰孩，年齡為出生至12個月。對于術語“兒童”是指還未到青春期的人。對于術語“青少年”是指在青春期開始與成年之間的人。對于術語“成人”是指達到完全成熟的人(一般認為是年齡18歲)。

本文所述化合物的劑量或者量足夠大，以在遞送發(fā)生的方法中產(chǎn)生期望的效果。劑量不應當大到引起不良的副作用，如不期望的交叉反應、過敏反應等等。一般而言，劑量會隨著年齡、狀況、性別和受試者中疾病的程度而變化，并且可以由本領域技術人員來確定。劑量可由個體醫(yī)師根據(jù)所涉及受試者的臨床狀況來進行調整。劑量、給藥時間表和施用途徑可以變化。

根據(jù)本文所述方法施用具體劑量的化合物或組合物的效力，可以通過已知的病歷、體征、癥狀和客觀實驗室測試的具體方面進行評估來確定，其中已知所述病歷、跡象、癥狀和客觀實驗室測試可用于評估需要針對自身免疫糖尿病或其他疾病和/或狀況進行治療的受試者的狀態(tài)。這些跡象、癥狀以及客觀實驗室測試，會根據(jù)所治療或預防的特定疾病或狀況而變化，這將會是治療這樣的患者的臨床醫(yī)生或者在此領域內進行實驗的研究者所知曉的。例如，如果基于與適合對照組的比較和/或基于該疾病在一般群體或特定個體中正常進展的知識：(1)受試者的身體狀況顯示改善(例如腫瘤部分或完全消退)，(2)疾病或狀況的進展顯示為穩(wěn)定或減慢或逆轉，或者(3)對于治療疾病或狀況的其它藥物的需求得以減少或避免，則具體的治療方案被認為是有效的。

對于“藥物可接受的”是指不是生物學地或者其它方面不期望的材料，即該材料可以與選定的化合物一起施用至受試者，而不會引起任何不期望的生物學效應或者不會以有害的方式與包含其的藥物組合物中任何其它成分相互作用。

用于治療受試者的化合物可以方便地配制為藥物組合物，其由一個或多種化合物與藥物可接受的載體結合構成。參見例如remington'spharmaceuticalsciences，latestedition,bye.w.martinmackpub.co.,easton,pa，其公開了通常的載體以及制備藥物組合物的常規(guī)方法，其可連同本文所述化合物制劑的制備來使用，并且其通過引用并入本文。這些是用于將組合物施用給人類或非人類的最通常的標準載體，其包括溶液如生理ph下的無菌水、鹽水和緩沖溶液。其它化合物將根據(jù)本領域技術人員使用的標準程序來施用。

無需進一步詳細闡述，相信本領域技術人員能夠使用前文的描述，在完全的程度上利用本發(fā)明。以下的實施例是以解釋說明的方式來提供的，而并不是要進行限制。雖然提供了具體的實施例，但是上文的描述是說明性的而不是限定性的。前文所述實施方案的任何一個或多個特征可以以任何方式與本發(fā)明中任何其它實施方案的一個或多個特征進行組合。另外，在看到本說明書之后，本發(fā)明的許多變化對于本領域技術人員而言將會是顯而易見的。

本申請中引用的所有出版物和專利文獻通過引用并入相關部分以用于所有的目的，其程度就如同每個出版物或專利文獻都是單獨標注。在此文中通過引用各種參考文獻，申請人并非承認任何具體的文獻相對于本發(fā)明而言是"現(xiàn)有技術"。

實施例

本文所描述的方法、化合物和組合物在以下實施例中進行進一步的說明，其是以說明的方式提供的而并不是要進行限制。應理解所示組分比例的改變和要素的替換對于本領域技術人員是明顯的，并且在本發(fā)明實施方案之內。理論方面的提供應理解為申請人不是要被現(xiàn)有理論所束縛。所有的部分或量，都是重量計，除非另有說明。

實施例1:抗體的產(chǎn)生以及用于確定人和鼠嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3的蛋白水平的夾心elisa的開發(fā)

針對重組人和鼠嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3的多克隆抗體在newzealand雌性兔中產(chǎn)生，如此前所述(xu等人,proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica102:6086-6091(2005))。使用蛋白a/g珠從經(jīng)免疫的兔血清中純化針對人和鼠嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3的抗體，隨后使用其各自抗原作為配體的親和層析。用來自pierce的試劑盒將親和純化的針對人和鼠嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3的抗體生物素化，并用作檢測抗體。未經(jīng)標記的抗人和抗-鼠嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3被用于在4oc包被96-孔微滴定平板過夜。

人或鼠血清被稀釋(1:100)至1x測定稀釋液(1%bsa在1xpbs中)中，且將100μl的經(jīng)稀釋樣品或重組標準品施用于每個孔，并在37oc溫育1小時。將平板洗滌三次并隨后與100μl的所述檢測抗體在37oc溫育1小時。在使用1xpbst(1xpbs，含有0.5%tween-20)再洗滌三次之后，將孔與鏈酶親和素-綴合的辣根過氧化物酶一起溫育20分鐘，并隨后與四甲基聯(lián)苯胺試劑反應15分鐘。將總共100μl的2mh2so4添加至每個孔以停止反應。

對于人和鼠嗜中性粒細胞彈性蛋白酶elisa以及人蛋白酶3elisa，檢出限為0.156ng/ml，由0標準(添加有其三個標準偏差)的20個重復的平均o.d值所確定。這些測定分別高度特異于人和鼠嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3，與其它人和鼠蛋白沒有可檢測的交叉反應性。測定內和測定間的變異系數(shù)分別為3.9-4.5%和4.3-5.1%，這是通過在總共6個獨立測定中以一式兩份的測定測量5個血清樣品來確定的。

實施例2:用于測量人嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3的酶活性的基于發(fā)色團的測定的開發(fā)

使用了合成發(fā)色底物甲氧基琥珀?；?ala-ala-pro-val-p-硝基苯胺(km=0.28mm，kcat/km=33915m^-1s^-1，對于人嗜中性粒細胞彈性蛋白酶；km=1.2mm，kcat/km=499m^-1s^-1，對于人蛋白酶3)，如此前所述(wiesner等人,febslett579:5305-5312(2005))。將所述底物溶于n,n-二甲基甲酰胺以制備10mmol/l原液(10x)，并用100mmol/ltris-hcl緩沖液(ph8.0，含有500mmol/lnacl)稀釋，當使用時作為底物工作溶液。將p-硝基苯胺標準品溶解于n,n-二甲基甲酰胺以制備100mmol/l原液，并用100mmol/ltris-hcl緩沖液(ph8.0，含有500mmol/lnacl)稀釋，以制備0、100、200、300、400和500μmol/l用于在使用時生成標準曲線。

將人血清(20μl)與180μl的底物工作溶液在37°c溫育24小時。將釋放的p-硝基苯胺和稀釋的p-硝基苯胺標準物經(jīng)分光光度計在405nm處進行了測量。嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3的酶活性，在與底物溫育之前和之后24小時根據(jù)δod值進行計算，并表示為mu/ml血清，其中一個單位定義為在37°c水解底物每分鐘產(chǎn)生1.0μmol的p-硝基苯胺的嗜中性粒細胞和蛋白酶3的量。

實施例3:在患有1型糖尿病的受試者中的人嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3的循環(huán)蛋白水平和酶活性的評估

人類受試者-征集了149個患有1型糖尿病的受試者(平均年齡，14.2±4.8歲；中位年齡，14.0歲；年齡范圍，4–29歲；61.7%女性)用于研究。t1d患者根據(jù)美國糖尿病協(xié)會標準診斷(美國糖尿病協(xié)會，2013)如下：空腹血糖≥7.0mmol/l和/或hba1c≥6.5%，空腹c-肽水平<200pmol/l，酮癥或酮酸中毒發(fā)作或者存在至少一種胰島特異性自身抗體(gada、ia2a或znt8a)。所有患者在進行胰島素治療。8人患有甲狀腺自身免疫病癥。t1d的病程為4.2(1.7-7.1)[中位(四分位差)]。

包括了77位年齡和性別匹配的健康受試者的對照組(平均年齡，13.2±5.4歲；中位年齡，15.0歲；年齡范圍，2–21歲；44.2%女性)使用以下包含標準：(1)空腹血糖低于5.6mmol/l以及2-h血糖低于7.8mmol/l；(2)無糖尿病家族史、及其它自身免疫或慢性疾病。

臨床和生物化學評估-在過夜禁食之后，在早上(大約0800am)收集靜脈血樣本，以用于分析各種生化參數(shù)。在hitachi7170分析儀(boehringermannheim，mannheim，germany)上對血糖進行了酶測量。通過自動化的液相層析(bio-radvariantiihemoglobintestingsystem，hercules，ca，usa)對hba1c進行測量。分別使用化學發(fā)光免疫測定在bayer180se自動化的化學發(fā)光系統(tǒng)(bayeragleverkusen，germany)上，以及疫比濁測定(oriondiagnostica，espoo，finland)，對c-肽和c-反應蛋白的血清水平進行定量。gada、ia2a和znt8a的效價通過之前描述過的測定進行確定(xiao等人,thejournalofclinicalendocrinologyandmetabolism97:e54-58(2012)；yang等人,diabetes/metabolismresearchandreviews26:579-584(2010))。

通過對循環(huán)mpo-dna復合物(得到確認的net形成的標志物)的量進行定量，測量嗜中性粒細胞netosis的水平(kessenbrock等人,natmed15:623-625(2009))。簡言之，將5μg/ml的小鼠抗-mpo單克隆抗體(abdserotec，germany)包被至96-孔微滴定平板在4°c過夜。在用1%bsa封閉后，將血清樣品與過氧化物酶標記的抗-dna單克隆抗體(celldeathdetectionelisaplus試劑盒的組分no.2,rochediagnostics,usa)根據(jù)廠商說明組合添加至每個孔。在室溫下在搖動裝置(300rpm)溫育兩小時后，添加樣品和過氧化物酶底物。在405nm使用μquant酶標儀(biotek，usa)測量吸光度。

統(tǒng)計學分析-所有分析都是使用社會科學統(tǒng)計軟件包版本16.0(spss,chicago.il)執(zhí)行。使用kolmogorov-smirnov檢驗測試正態(tài)性。非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)在分析之前進行了對數(shù)變換。通過χ²或未配對t檢驗評估了組之間的差異。使用單因素anova和獨立t-檢驗進行了組之間的比較。適當?shù)赜胮earson相關或部分相關分析相關性。數(shù)據(jù)適當?shù)乇硎緸槠骄怠纒d或者中位數(shù)(四分位差)。在所有的統(tǒng)計學比較中，使用了p值<0.05來表示統(tǒng)計學顯著差異。

結果-t1d患者和其健康對照的臨床特征在表1中描述。與健康受試者相比，t1d患者具有較高的空腹葡萄糖和hba1c，但是具有較低的空腹c-肽水平。在兩組之間沒有發(fā)現(xiàn)c-反應蛋白的顯著差異(表1)。與此前的報道一致(harsunen等人,hormoneandmetabolicresearch=hormon-undstoffwechselforschung=hormonesetmetabolisme45:467-470(2013)；valle等人,diabetes62:2072-2077(2013))，循環(huán)嗜中性粒細胞在t1d患者中相較于健康對照有適度降低[中位數(shù)(四分位差)(x10⁶/ml)，3.26(2.54-4.13)vs3.63(3.02-4.15)，p<0.05](表1)。

對來自這些受試者的血清樣品中嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3的蛋白水平和酶活性進行了測量，其如實施例1提供的使用內部開發(fā)的基于發(fā)色團的測定，，以及如實施例2提供的夾心elisa試劑盒。與外周嗜中性粒細胞的輕微降低不同，結果顯示ne和pr3的循環(huán)蛋白水平在t1d患者中相比健康對照有顯著增加[ne:1594.7(988.4-2284.6)vs397.0(262.2-468.8)ng/ml，p<0.001；pr3:295.3(206.0-430.4)vs107.4(92.5-165.0)ng/ml，p<0.001](圖1(a和b))。t1d患者中的循環(huán)ne/pr3酶活性也基本上比健康個體中高[0.69(0.41-1.03)vs0.14(0.10-0.21)mu/ml，p<0.001](圖1(c))。ne/pr3酶活性和循環(huán)蛋白水平之間的相關系數(shù)為ne是0.915(p<0.001)和pr3是0.874(p<0.001)。在患者或對照中，男人和女人之間的ne和pr3的循環(huán)蛋白水平和酶活性沒有差異。

表1.本研究征集的健康對照和t1d患者的特征

數(shù)據(jù)適合地表示為均值±sd或者中位數(shù)(四分位差)

*p<0.05與健康對照相比

^§分析前進行對數(shù)變換。

為了進一步分析循環(huán)ne和pr3在自身免疫糖尿病進展期間的變化，根據(jù)其病程將t1d患者分為三組，包括診斷一年內的患者(n=28)、病程>1年的患者且<5年的患者(n=59)和病程>5年的患者(n=62)。值得注意的的是，ne和pr3的蛋白水平和酶活性提高的幅度，在診斷一年內的t1d患者中與另外兩組病程更長患者相比要顯著更高(圖2(a-c))。另一方面，僅在診斷一年內的t1d患者中觀察到循環(huán)嗜中性粒細胞的顯著降低，而另外兩組中的減退并未達到統(tǒng)計學的顯著性(圖2(d))。

血漿ne和pr3的活性受到與其相關的內源抑制物的緊密控制，特別是a1at，絲氨酸蛋白酶抑制劑(serpin)超家族的原型成員。與提升的ne和pr3水平不同，t1d患者中a1at的循環(huán)濃度與健康受試者相比顯著降低[1.61(1.37-1.93)相比1.80(1.57-2.07)mg/ml，p<0.01](圖1(d))。進一步分析顯示a1at水平在診斷一年內的患者中的減退要分別大于病程1-5年和>5年的那些(圖2(e))。

為了探索造成顯著提升的循環(huán)ne和pr3水平的基礎機制，通過對循環(huán)mpo-dna復合物(得到確認的net形成的標志物)的量進行定量，測量嗜中性粒細胞netosis的水平(kessenbrock等人,2009)。與提升的ne和pr3水平一致，相較于健康個體在t1d患者中觀測到循環(huán)mpo-dna復合物的顯著提升，特別是在病程少于一年的t1d患者中[0.197(0.049-0.412)相比0.026(0.011-0.058)(平均od405)，p<0.001](圖3(a))。另外，血清中mpo-dna復合物的量與ne(r=0.554，p<0.001)和pr3(r=0.575，p<0.001)的循環(huán)蛋白水平，以及與ne/pr3酶活性(r=0.527，p<0.001)顯著相關，(圖3(b-d))，表明t1d患者中增加的循環(huán)ne和pr3蛋白水平至少部分歸因于增強的嗜中性粒細胞netosis。

另外，在研究組中研究了t1d患者中循環(huán)嗜中性粒細胞絲氨酸蛋白酶與三種與β-細胞自身免疫相關的自身抗體(包括gada、ia2a和znt8a)之間的關系。在149位t1d患者中，54位(36%)為自身抗體-陰性，61位(41%)、24位(16%)和10位(7%)分別具有一個、兩個和三個自身抗體陽性。值得注意的是，ne和pr3蛋白的循環(huán)水平以及其酶活性隨著這些患者中檢測到的自身抗體的數(shù)目的增加而有進行性地增加(圖4(a-c))。即使是對于自身抗體-陰性的t1d患者，ne和pr3的循環(huán)蛋白水平和酶活性也要比健康對照高很多[蛋白水平:ne:1154.90(770.8-1749.5)相比397.0(262.2-468.8)ng/ml，p<0·0001；pr3:237.4(154.3-307.1)相比107.4(92.5-165.0)ng/ml，p<0·0001；酶活性:0.53(0.37-0.79)相比0.14(0.10-0.21)mu/ml，p<0.001](圖4(a-c))。另外，在gada陽性t1d患者(n=73)中，檢測到了gada的效價與ne(r=0.296，p=0.011)和pr3(r=0.270，p=0.021)的循環(huán)蛋白水平以及ne/pr3的酶活性(r=0.275，p=0.019)之間有強關聯(lián)(圖4(d-f))。同樣的，t1d患者中的ia2a效價也與ne、pr3的蛋白水平以及其酶活性正相關(圖5(a-c))。相反，在本研究組中，沒有觀察到空腹血糖與ne(r=-0.103，p=0.211)或pr3(r=-0.097，p=0.237)的循環(huán)蛋白水平或者ne/pr3酶活性(r=-0.078，p=0.342)有顯著關聯(lián)。綜合考慮，這些數(shù)據(jù)表明提升的ne和pr3可與β-細胞自身免疫之間有因果關聯(lián)，但是t1d患者中的血糖狀態(tài)卻并非如此。

實施例4:在非肥胖糖尿病(nod)小鼠中對鼠蛋白酶3的循環(huán)蛋白水平的評估

動物研究-非肥胖糖尿病(nod)小鼠(thejacksonlaboratory)，一種得到確認的t1d動物模型，其易于自發(fā)發(fā)展自身免疫胰島素依賴性糖尿病(iddm)，其被用于嗜中性粒細胞彈性蛋白酶、蛋白酶3和t1d發(fā)展之間相互關系的動態(tài)的、一致的和慢性研究。nod小鼠中t1d的發(fā)作特征在于非空腹血糖水平高于13.9mmol/l。由于雌性nod小鼠展現(xiàn)出比雄性(20-30%)更高的t1d發(fā)生率(60%-80%)，本研究主要聚焦于雌性個體。從3周齡時起，每周監(jiān)測雌性nod小鼠(n=7)的體重、血糖測量和血清收集。將小鼠在22-24°c保持在12小時光-暗周期下，可隨意獲得水和標準飼料(picolabrodentdiet20，labdiet)。所有動物實驗程序都得到了香港大學committeeontheuseofliveanimalsforteachingandresearch的許可，并且根據(jù)guideforthecareanduseoflaboratoryanimals來進行。

結果-使用內部開發(fā)的如實施例2所示的夾心elisa試劑盒測量循環(huán)小鼠蛋白酶3蛋白水平。顯示直到nod小鼠16周齡之前沒有觀測到明顯得高血糖癥，而循環(huán)中蛋白酶3的蛋白水平在很早期就開始增加(3-周：6.71(5.70-7.19)ng/ml對比4-周:14.309(7.28-25.75)ng/ml，p<0.05)以及在大約6-周達到峰值(3-周:6.71(5.70，7.19)ng/ml對比6-周:22.61(15.15-31.174)ng/ml，p<0.001，(圖6))，表明循環(huán)pr3可以用作用于t1d發(fā)展的靈敏的預測性生物標志物。

討論

t1d的當前診斷嚴重依賴于檢測針對若干β-細胞-特異性抗原的自身抗體。然而，在兒童中很少能在6月齡前檢測到這些自身抗體(ziegler等人,1999)。另外，在t1d患者中單一自身抗體測量的診斷靈敏度低至59%-67%(lebastchi和herold，2012)。為了把握對于此疾病的治療窗口，非常重要的是要鑒別用于影響胰島的早期免疫學事件的檢測的新的生物標志物。

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在t1d患者中嗜中性粒細胞計數(shù)的適度降低，伴隨有兩種主要嗜中性粒細胞絲氨酸蛋白酶ne和pr3的蛋白水平和酶活性的顯著提升。另外，t1d患者中的這些改變與嗜中性粒細胞netosis的增加緊密相關，如通過循環(huán)中mpo-dna復合物的定量確定的。這些發(fā)現(xiàn)表明，t1d患者中嗜中性粒細胞計數(shù)的減少部分是由于增加的netosis，其繼而導致增加的net形成以及ne和pr3釋放至血流中。

在病程低于一年的患者中，循環(huán)ne/pr3酶活性和net形成的提升幅度基本上比病程超過一年的那些患者高。僅僅在病程低于一年的t1d患者中，觀察到嗜中性粒細胞計數(shù)的顯著降低。與我們的發(fā)現(xiàn)一致，此前在意大利的研究也發(fā)現(xiàn)，在具有發(fā)展出t1d最高風險的個體中，嗜中性粒細胞的減少是最大的(valle等人,2013)。在疾病發(fā)作之后，輕微嗜中性粒細胞減少癥持續(xù)幾年并在診斷后5年得以解決(由縱向分析確定)。在具有自發(fā)發(fā)展的自身免疫糖尿病的nod小鼠中，早在出生后兩周就檢測到了胰島中嗜中性粒細胞浸潤和net形成，比明顯得糖尿病發(fā)作要早得多(diana等人,natmed19:65-73(2013))。另外，在早期的嗜中性粒細胞耗竭防止了nod小鼠中糖尿病的進一步發(fā)展(diana等人,2013)。綜合考慮，這些數(shù)據(jù)支持嗜中性粒細胞netosis、net形成和增加的嗜中性粒細胞絲氨酸蛋白酶釋放在t1d中β-細胞自身免疫發(fā)作中的成因作用。實際上，增加的嗜中性粒細胞netosis和net形成已經(jīng)與許多的自身免疫疾病有牽連，包括小血管脈管炎(svv)、全身性紅斑狼瘡(sle)和多發(fā)性硬化(kessenbrock等人,2009；naegele等人,journalofneuroimmunology242:60-71(2012)；villanueva等人,journalofimmunology187:538-552(2011))。

另外，增加的ne和pr3與t1d患者中檢測到的自身抗體的陽性數(shù)目和效價顯著相關。即使在那些自身抗體陰性患者中，ne和pr3的循環(huán)酶活性依然要比健康對照高得多，表明血清ne和pr3可用作用于具有發(fā)展出t1d的高風險的那些個體的早期檢測的靈敏的生物標志物。另一方面，我們發(fā)現(xiàn)在t1d患者中ne和pr3增加的血清水平與高血糖癥的嚴重性之間沒有顯著關聯(lián)。實際上，雖然高血糖癥隨著t1d的進展而變得更加嚴重，但是ne和pr3的血清水平展現(xiàn)出相反的變化，表明增加的嗜中性粒細胞netosis以及ne和pr3增加的釋放并不是受損的血糖控制的結果，而與β-細胞自身免疫有關聯(lián)。與此概念一致，在具有t1d的患者的非糖尿病一級親屬中，已經(jīng)觀察到降低的嗜中性粒細胞計數(shù)(valle等人,2013)。

除了其針對感染的宿主防御的典型作用之外，嗜中性粒細胞絲氨酸蛋白酶是炎癥和先天免疫的重要調節(jié)劑(meyer-hoffert，frontbiosci(landmarked)14:3409-3418(2009)；meyer-hoffert和wiedow,2011；pham,natrevimmunol6:541-550(2006)；wiedow和meyer-hoffert,2005)。ne和pr3二者都參與促炎性細胞因子如tnfα、il-1β和il-18的成熟和釋放，并且還誘導toll樣受體的表達和激活(coeshott等人,proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica96:6261-6266(1999)；devaney等人,febslett544:129-132(2003)；devaney等人,febslett544:129-132(2003)；walsh等人,jbiolchem276:35494-35499(2001))，其全都是胰島炎和β-細胞破壞的重要調節(jié)物(grieco等人,seminimmunopathol33:57-66(2011)；padgett等人,annalsofthenewyorkacademyofsciences1281:16-35(2013))。另外，ne和pr3在將嗜中性粒細胞募集至炎癥位點中發(fā)揮了不可缺少的作用。值得注意的是，嗜中性粒細胞絲氨酸蛋白酶近來在小鼠中已經(jīng)與高脂肪飲食誘導的肥胖、炎癥和脂肪組織中的巨噬細胞浸潤產(chǎn)生了牽連(talukdar等人,natmed18:1407-1412(2012))。僅單獨注射重組pr3就足以在小鼠中誘導高血糖癥(bae等人,endocrres37:35-45(2012))。相比之下，用a1at(主要的ne和pr3內源抑制物)治療，在t1d的嚙齒動物模型中，降低了胰島中淋巴細胞的浸潤，并防止了β-細胞損失和糖尿病(lu等人,humangenetherapy17:625-634(2006)；song等人,genetherapy11:181-186(2004))。這些動物研究，與本臨床發(fā)現(xiàn)相結合，表明提升的ne和pr3可以是自身免疫糖尿病發(fā)病機理的直接貢獻者，通過在胰島中起始和/或保持自身免疫炎癥反應。

a1at(從肝細胞分泌的最豐富的循環(huán)絲氨酸蛋白酶抑制劑)，通過供價結合至酶抑制嗜中性粒細胞絲氨酸蛋白酶(janciauskiene等人,respiratorymedicine105:1129-1139(2011))。a1at的缺陷已經(jīng)與許多炎性狀況如慢性阻塞性肺病產(chǎn)生了牽連(stoller和aboussouan，lancet365:2225-2236(2005))。本研究觀察到了t1d患者中循環(huán)a1at適度但是卻顯著的降低，表明增加的循環(huán)ne和pr3活性可緣于這兩種酶從嗜中性粒細胞netosis的釋放提高以及與其內源抑制劑a1at生產(chǎn)的降低的組合。

綜上，本文提供的數(shù)據(jù)已經(jīng)提供了第一個證據(jù)，其支持增加的循環(huán)ne和pr3活性可緣于在t1d中這兩種酶從嗜中性粒細胞netosis的釋放提高和它們的內源抑制物a1at降低的產(chǎn)生的組合，并且提升的ne和pr3可以是自身免疫糖尿病發(fā)病機理的直接貢獻者(其通過在胰島中起始和/或使自身免疫炎癥反應)。這些結果共同證明，ne和pr3是用于t1d預測和早期診斷以及用于區(qū)分診斷t1d和其它類型糖尿病的潛在生物標志物。

應理解所公開的方法和組合物并不局限于所描述的具體方法、方案和試劑，因為這些可以變化。還應理解本文所用的術語僅僅是用于描述具體實施方案的目的，限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍將僅由所附的權利要求來限定。

必需要注意的是，如本文所用以及在所附的權利要求中，單數(shù)形式的"一個/種"和"所述"包括了復數(shù)的提及，除非上下文另有明確的指示。因而，例如，提及"底物"包括了多種這樣的底物；提到"所述底物"是指一種或多種底物及本領域技術人員已知的其等價物等等。

在遍及本說明書的說明和權利要求中，詞語“包含”以及該詞語的變體，意指“包括但不限于”，并且并意圖排除，例如其它添加物、組分、整數(shù)或步驟。

“任選的”或“任選地”意指其所描述的事件、情況或材料可以出現(xiàn)或不出現(xiàn)或者可以存在或不存在，并且說明書中包括了所述事件、情況或材料出此案或存在的情形，也包括了所述事件、情況或材料不出現(xiàn)或不存在的情形。

范圍在本文中可以表示為從"大約"一個特別的值，和/或至"大約"另一個特別的值。當表示此種范圍時，也明確設想并認為是公開了從所述一個特定值和/或至另一個特定值的范圍，除非上下文另有明確指示。類似地，當數(shù)值表示為大約時，通過在之前使用“大約”，應理解為特別的的值形成了另一個，明確設想的實施方案，其應理解為已公開，除非上下文另有明確指示。還應理解的是每個范圍的終末點既相對于另一終末點而產(chǎn)生意義，且獨立于另一終末點，除非上下文另有明確指示。最后，應理解明確公開的范圍之內的所有的單獨的值和值的子范圍也明確地經(jīng)過設想并且應理解為已經(jīng)公開，除非上下文另有明確指示。無論在特定的情況中一些或者全部的這些實施方案是否已經(jīng)明確公開，前述表述都適用。

除非另有說明，本文所使用的所有技術和科學術語都具有所公開的方法和組合物所屬領域技術人員通常所理解的相同含義。雖然類似于或等價于本文所述那些的方法和材料也可以用于實踐或者測試本方法和組合物，但是特別有用的方法、裝置和材料是如所述的。本文所引用的出版物以及它們所引用的材料明確地通過引用并入本文。本文任何內容都不應理解為承認本發(fā)明不能夠作為在先發(fā)明而早于此類公開。并未承認任何參考文獻構成現(xiàn)有技術。對于參考文獻的討論描述了其作者所聲稱的內容，而申請人保留對所引用文獻的準確性和針對性進行質疑的權利。應當清楚地理解，雖然本文提到了許多出版物，但此類參考并不導致承認任何這些文獻形成了一部分的本領域一般常識。

雖然對于材料、組合物、組分、步驟、技術等的描述可包括許多選擇和替代，但是這不應理解為(并且也并非是承認)，此類選擇和替代彼此等價，或者具體而言是顯而易見的替代。因而，例如，不同的糖尿病預防治療的列表并不表明所列出的糖尿病預防療法彼此是顯而易見的，這也并不是承認其等價性或顯而易見性。

本領域技術人員使用不超過常規(guī)實驗就會認識到或者能夠確定，本文所述的方法和組合物具體實施方案的許多等同物。此類等同物意圖由以下權利要求涵蓋。