相關(guān)申請的交叉引用本申請要求2014年11月5日提交的美國臨時申請?zhí)?2/075,798的權(quán)益，所述美國臨時申請以引用的方式整體并入本文。采用ascii文本文件進行的序列表提交采用ascii文本文件進行的以下提交的內(nèi)容以引用的方式整體并入本文：計算機可讀格式(crf)的序列表(文件名稱：146392035140seqlist.txt，記錄日期：2015年11月5日，大?。?kb)。領(lǐng)域本公開涉及產(chǎn)生重組多肽諸如抗癌免疫動員單克隆t細(xì)胞受體(immtac)蛋白的方法。更具體來說，本公開涉及通過利用優(yōu)化表達載體和培養(yǎng)方法來在細(xì)菌中產(chǎn)生異源性分泌蛋白的方法。發(fā)明背景自從在1978年在大腸桿菌(e.coli)中產(chǎn)生人胰島素以來，在原核宿主細(xì)胞中產(chǎn)生重組蛋白已成為許多重要治療劑的來源。因為分子生物學(xué)工具和知識已進展，所以重組治療劑的復(fù)雜性也已增加。產(chǎn)生這些重組蛋白要求產(chǎn)物展現(xiàn)諸如適當(dāng)翻譯、折疊、裝配、二硫鍵合以及向周質(zhì)中轉(zhuǎn)運的性質(zhì)。已知許多重組蛋白，特別是具有二硫鍵的那些(例如雙鏈蛋白質(zhì)，包括不限于抗體和抗體片段)的表達導(dǎo)致在原核宿主細(xì)胞中形成包涵體(spadiut等,trendsinbiotechnology,32:54,2014)。因此，對用于在工業(yè)規(guī)模上在原核宿主細(xì)胞中重組產(chǎn)生適當(dāng)折疊和裝配的雙鏈蛋白質(zhì)的表達系統(tǒng)和方法存在需求。單克隆抗體代表一種最快速增長類型的重組治療劑，其中眾多單克隆抗體已被核準(zhǔn)或處于審查中來用于治療各種疾病(nelson等,naturereviewdrugdiscovery,9:767,2010)。傳統(tǒng)單克隆抗體結(jié)合單一靶標(biāo)抗原。對于許多疾病，可能有利的是采用結(jié)合超過一種靶標(biāo)抗原的抗體，即多特異性抗體。此類抗體可用于針對多種治療靶標(biāo)的組合方法中(參見例如bostrom等,science323:1610,2009；以及wu等,naturebiotechnology,25:1290,2007)。舉例來說，可產(chǎn)生同時結(jié)合在癌細(xì)胞的表面上表達的表位和在t細(xì)胞上表達的表位以誘導(dǎo)t細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞殺滅的雙特異性抗體(shalaby等,clinicalimmunology,74:185,1995)。在臨床中使用雙特異性抗體要求能夠以工業(yè)相關(guān)量產(chǎn)生雙鏈蛋白質(zhì)。盡管已描述改進在原核宿主細(xì)胞中的重組蛋白產(chǎn)生的載體組分(參見例如schlapschy等,proteinengineering,designandselection,19:385,2006；以及simmons等,journalofimmunologicalmethods263:133,2002)，但本文所述的結(jié)果證明單獨修飾表達載體并不解決在制造雙鏈蛋白質(zhì)期間遭遇的所有產(chǎn)生問題。仍然需要用于在制備規(guī)模上高效產(chǎn)生重組雙鏈蛋白質(zhì)諸如抗體片段和半抗體的最優(yōu)方法。本文引用的所有參考文獻包括專利申請、專利公布和uniprotkb/swiss-prot登記號都以引用的方式整體并入本文，所述引用的程度就好像明確地和個別地指示將各個別參照文獻以引用的方式并入一樣。概述在一個方面，本文提供在原核宿主細(xì)胞中產(chǎn)生包含兩條鏈的多肽的方法，所述方法包括：(a)培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞以表達所述多肽的所述兩條鏈，借此在表達后，所述兩條鏈折疊并裝配以在所述宿主細(xì)胞中形成生物活性多肽；其中所述宿主細(xì)胞包含多核苷酸，所述多核苷酸包含(1)編碼所述多肽的第一鏈的第一翻譯單元；(2)編碼所述多肽的第二鏈的第二翻譯單元；和(3)編碼至少一種選自由肽基-脯氨?；悩?gòu)酶、蛋白質(zhì)二硫化物氧化還原酶及其組合組成的組的伴侶蛋白的第三翻譯單元；其中在培養(yǎng)基中在包括以下的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞：包括生長溫度和生長攪拌速率的生長期，和包括產(chǎn)生溫度和產(chǎn)生攪拌速率的產(chǎn)生期，其中所述生長溫度高于所述產(chǎn)生溫度2至10℃，并且所述生長攪拌速率高于所述產(chǎn)生攪拌速率50至250rpm；和(b)從所述宿主細(xì)胞回收所述生物活性多肽。也提供在原核宿主細(xì)胞中產(chǎn)生包含t細(xì)胞受體(tcr)α鏈和tcrβ鏈的抗癌免疫動員單克隆t細(xì)胞受體(immtac)的方法，所述方法包括：(a)在培養(yǎng)基中在包括以下的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞以表達所述immtac的所述tcrα鏈和所述tcrβ鏈：包括生長溫度和生長攪拌速率的生長期，和包括產(chǎn)生溫度和產(chǎn)生攪拌速率的產(chǎn)生期，借此在表達后，所述tcrα鏈和所述tcrβ鏈折疊并裝配以在所述宿主細(xì)胞中形成生物活性immtac；其中所述宿主細(xì)胞包含多核苷酸，所述多核苷酸包含(1)編碼所述immtac的所述tcrα鏈的第一翻譯單元；(2)編碼所述immtac的所述tcrβ鏈的第二翻譯單元；和(3)編碼至少一種選自由肽基-脯氨?；悩?gòu)酶、蛋白質(zhì)二硫化物氧化還原酶及其組合組成的組的伴侶蛋白的第三翻譯單元；其中所述生長溫度高于所述產(chǎn)生溫度2至10℃，并且所述生長攪拌速率高于所述產(chǎn)生攪拌速率50至250rpm；和(b)從所述宿主細(xì)胞回收所述生物活性immtac。也提供在原核宿主細(xì)胞中產(chǎn)生包含兩條鏈的多肽的方法，所述方法包括：(a)培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞以表達所述多肽的所述兩條鏈，借此在表達后，所述兩條鏈折疊并裝配以在所述宿主細(xì)胞中形成生物活性多肽；其中所述宿主細(xì)胞包含多核苷酸，所述多核苷酸包含：(1)編碼所述多肽的第一鏈的第一翻譯單元；(2)編碼所述多肽的第二鏈的第二翻譯單元；(3)編碼第一伴侶蛋白的第三翻譯單元；(4)編碼第二伴侶蛋白的第四翻譯單元；和(5)編碼第三伴侶蛋白的第五翻譯單元，其中所述第一、第二和第三伴侶蛋白選自由肽基-脯氨?；悩?gòu)酶、蛋白質(zhì)二硫化物氧化還原酶及其組合組成的組；其中在培養(yǎng)基中在包括以下的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞：包括生長溫度和生長攪拌速率的生長期，和包括產(chǎn)生溫度和產(chǎn)生攪拌速率的產(chǎn)生期，其中所述生長溫度高于所述產(chǎn)生溫度2至10℃，并且所述生長攪拌速率高于所述產(chǎn)生攪拌速率50至250rpm；和(b)從所述宿主細(xì)胞回收所述生物活性多肽。也提供在原核宿主細(xì)胞中產(chǎn)生包含t細(xì)胞受體(tcr)α鏈和tcrβ鏈的抗癌免疫動員單克隆t細(xì)胞受體(immtac)的方法，所述方法包括：(a)在培養(yǎng)基中在包括以下的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞以表達所述immtac的所述tcrα鏈和所述tcrβ鏈：包括生長溫度和生長攪拌速率的生長期，和包括產(chǎn)生溫度和產(chǎn)生攪拌速率的產(chǎn)生期，借此在表達后，所述tcrα鏈和所述tcrβ鏈折疊并裝配以在所述宿主細(xì)胞中形成生物活性immtac；其中所述宿主細(xì)胞包含多核苷酸，所述多核苷酸包含：(1)編碼所述immtac的所述tcrα鏈的第一翻譯單元；(2)編碼所述immtac的所述tcrβ鏈的第二翻譯單元；(3)編碼第一伴侶蛋白的第三翻譯單元；(4)編碼第二伴侶蛋白的第四翻譯單元；和(5)編碼第三伴侶蛋白的第五翻譯單元，其中所述第一、第二和第三伴侶蛋白選自由肽基-脯氨?；悩?gòu)酶、蛋白質(zhì)二硫化物氧化還原酶及其組合組成的組；其中所述生長溫度高于所述產(chǎn)生溫度2至10℃，并且所述生長攪拌速率高于所述產(chǎn)生攪拌速率50至250rpm；和(b)從所述宿主細(xì)胞回收所述生物活性immtac。在一些實施方案中，多肽包含三個、四個或五個鏈。在一些實施方案中，在產(chǎn)生期期間，使培養(yǎng)基的ph維持在6.7與7.3之間的范圍內(nèi)的ph下。在一些實施方案中，多核苷酸進一步包含啟動子的三個拷貝，其中第一拷貝與第一翻譯單元可操作組合，第二拷貝與第二翻譯單元可操作組合，并且第三拷貝與第三翻譯單元可操作組合以驅(qū)動第一鏈、第二鏈和伴侶蛋白的轉(zhuǎn)錄。在一些實施方案中，編碼三種伴侶蛋白中的兩種的兩個翻譯單元是單一轉(zhuǎn)錄單元(雙順反子單元)的一部分。在一些實施方案中，多核苷酸進一步包含與各翻譯單元可操作組合的啟動子。在一些實施方案中，啟動子誘導(dǎo)型啟動子。在一些實施方案中，誘導(dǎo)型啟動子是在不存在iptg誘導(dǎo)下驅(qū)動第一鏈、第二鏈和伴侶蛋白的轉(zhuǎn)錄的iptg誘導(dǎo)型啟動子。在一些實施方案中，誘導(dǎo)型啟動子是在不存在iptg誘導(dǎo)下驅(qū)動tcrα鏈、tcrβ鏈和伴侶蛋白的轉(zhuǎn)錄的iptg誘導(dǎo)型啟動子。在一些實施方案中，誘導(dǎo)型啟動子是當(dāng)培養(yǎng)基中的磷酸鹽已耗盡時驅(qū)動第一鏈、第二鏈和伴侶蛋白的轉(zhuǎn)錄的pho啟動子。在一些實施方案中，誘導(dǎo)型啟動子是當(dāng)培養(yǎng)基中的磷酸鹽已耗盡時驅(qū)動tcrα鏈、tcrβ鏈和伴侶蛋白的轉(zhuǎn)錄的pho啟動子。在一些實施方案中，多核苷酸進一步包含可選擇標(biāo)記，并且培養(yǎng)基包含由單一抗生素組成的選擇劑以致使宿主細(xì)胞維持多核苷酸。在一些實施方案中，第一翻譯單元包含第一翻譯起始區(qū)(tir)與第一鏈的編碼區(qū)可操作組合，并且第二翻譯單元包含第二翻譯起始區(qū)(tir)與第二鏈的編碼區(qū)可操作組合，其中所述第一tir和所述第二tir的相對翻譯強度是約1.0至約3.0。在一些實施方案中，第一翻譯單元包含第一翻譯起始區(qū)(tir)與tcrα鏈的編碼區(qū)可操作組合，并且第二翻譯單元包含第二翻譯起始區(qū)(tir)與tcrβ鏈的編碼區(qū)可操作組合，其中所述第一tir和所述第二tir的相對翻譯強度是約1.0至約3.0。在一些實施方案中，至少一種伴侶蛋白或第一伴侶蛋白包括肽基-脯氨酰基異構(gòu)酶。在一些實施方案中，肽基-脯氨?；悩?gòu)酶是fkpa蛋白。在一些實施方案中，fkpa是大腸桿菌fkpa。在一些實施方案中，至少一種伴侶蛋白進一步包括蛋白質(zhì)二硫化物氧化還原酶，或第二伴侶蛋白和第三伴侶蛋白中的一者或兩者包括蛋白質(zhì)二硫化物氧化還原酶。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)二硫化物氧化還原酶是dsba蛋白和dsbc蛋白中的一者或兩者。在一些實施方案中，至少一種蛋白質(zhì)二硫化物氧化還原酶是大腸桿菌dsba和大腸桿菌dsbc中的一者或兩者。在一些實施方案中，原核宿主細(xì)胞是革蘭氏陰性細(xì)菌(gram-negativebacterium)。在一些實施方案中，革蘭氏陰性細(xì)菌是大腸桿菌。在一些實施方案中，大腸桿菌是缺乏內(nèi)源性蛋白酶活性的菌株。在一些實施方案中，大腸桿菌是具有degps210a突變的菌株。在一些實施方案中，大腸桿菌是具有w3110δfhuaδphoailvg2096(valr)δprcspr43h1δdegpδmanalaciqδomptδmenedegps210a的基因型的菌株。在一些實施方案中，多肽對于宿主細(xì)胞是異源性的。在一些實施方案中，多肽是異二聚體(例如雙特異性抗體)的單體。在一些實施方案中，tcrα鏈包含tcrα鏈可變結(jié)構(gòu)域和tcrα鏈恒定結(jié)構(gòu)域，并且tcrβ鏈包含tcrβ鏈可變結(jié)構(gòu)域和tcrβ鏈恒定結(jié)構(gòu)域。在一些實施方案中，多肽的兩條鏈由至少一個二硫鍵彼此連接。在一些實施方案中，immtac的兩條鏈由至少一個二硫鍵彼此連接。在一些實施方案中，immtac進一步包含結(jié)合t細(xì)胞，并且活化t細(xì)胞應(yīng)答的抗體片段。在一些實施方案中，抗體片段包括抗cd3單鏈抗體片段。在一些實施方案中，immtac包含經(jīng)工程化以相較于尚未經(jīng)工程化的tcr對抗原的親和力，對所述抗原具有增加的親和力的tcr。在一些實施方案中，多肽的兩條鏈由多肽接頭彼此連接。在一些實施方案中，多肽是單價抗體，其中第一鏈和第二鏈包含免疫球蛋白重鏈和免疫球蛋白輕鏈。在一些實施方案中，免疫球蛋白重鏈?zhǔn)莍gg1或igg4同種型。在一些實施方案中，單價抗體能夠特異性結(jié)合抗原。在一些實施方案中，抗原是細(xì)胞因子。在一些實施方案中，細(xì)胞因子選自由趨化因子、干擾素、白介素、淋巴因子和腫瘤壞死因子組成的組。在一些實施方案中，生長因子是血管內(nèi)皮生長因子。在一些實施方案中，抗原選自由il-4、il13、il-14、il-17、vegfa和vegfc組成的組。在一些實施方案中，多肽是從宿主細(xì)胞的周質(zhì)回收的分泌蛋白。在一些實施方案中，從宿主細(xì)胞的周質(zhì)回收immtac。在一些實施方案中，多肽是抗癌免疫動員單克隆t細(xì)胞受體(immtac)，其包含可溶性的親和力增強的t細(xì)胞受體融合于抗cd3單鏈可變片段(scfv)。在一些實施方案中，在生長期期間，生長溫度在約30℃至約34℃的范圍內(nèi)，并且在產(chǎn)生期期間，產(chǎn)生溫度在約25℃至約29℃的范圍內(nèi)。在一些實施方案中，在生長期期間，生長攪拌速率在約600至800rpm的范圍內(nèi)，并且在產(chǎn)生期期間，產(chǎn)生攪拌速率在約300至約500rpm的范圍內(nèi)。在一些實施方案中，生長攪拌速率足以實現(xiàn)在生長期期間宿主細(xì)胞中氧攝取速率高于在產(chǎn)生期期間宿主細(xì)胞中峰值氧攝取速率0.5至2.5mmol/l/min。在一些實施方案中，在生長期期間，宿主細(xì)胞的峰值氧攝取速率在3.5至4.5mmol/l/min的范圍內(nèi)，并且在產(chǎn)生期期間，宿主細(xì)胞的氧攝取速率在1.0至3.0mmol/l/min的范圍內(nèi)。在一些實施方案中，生長攪拌速率比產(chǎn)生攪拌速率高約10％至約40％(rpm/rpm)。應(yīng)了解本文所述的各種實施方案的一種、一些或所有性質(zhì)可加以組合以形成本公開的其它實施方案。本公開的這些和其它方面將變得為本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易知。本公開的這些和其它實施方案通過隨后詳細(xì)描述來進一步描述。附圖簡述圖1a-c顯示從xil13半抗體(hab)產(chǎn)生載體獲得的總體輕鏈(lc)和重鏈(hc)亞單位的產(chǎn)生。圖1a提供從tir1,1(黑色棒條)和tir2,2(條紋化棒條)產(chǎn)生載體產(chǎn)生的總體lc和hc亞單位的圖，如通過rp-hplc所測量。圖1b提供從tir1,1產(chǎn)生載體產(chǎn)生的lc和hc(黑色棒條)或可溶性lc和hc(灰色棒條)的總體亞單位的圖。圖1c提供從tir2,2產(chǎn)生載體產(chǎn)生的總體lc和hc(黑色棒條)或可溶性lc和hc(灰色棒條)的總體亞單位的圖。圖2顯示在使用tir1,1(黑色棒條)或tir2,2(條紋化棒條)hab產(chǎn)生載體的情況下的xil13hab效價，如通過雙柱rp-hplc所測量。圖3a-b說明蛋白質(zhì)在細(xì)菌宿主細(xì)胞中的折疊和裝配。圖3a是描繪細(xì)菌蛋白質(zhì)產(chǎn)生的示意圖，其說明在使用伴侶蛋白的情況下蛋白質(zhì)在周質(zhì)中的折疊和裝配。圖3b是伴侶蛋白的清單，其包括肽基-脯氨?；悩?gòu)酶(“ppi酶”)、氧化還原酶和其它伴侶蛋白。圖4a顯示用于篩選fkpa變體的可相容系統(tǒng)。圖4b顯示編碼抗體lc、hc和fkpa的單一xil13質(zhì)粒(pxil13.2.2.fkpac13)的產(chǎn)生。圖5a-b顯示在滴定fkpa表達后xvegfigg1hab的產(chǎn)生。圖5a描繪顯示在表達不同水平的fkpa后hab和可溶性單體重鏈積累的蛋白質(zhì)印跡，而考馬斯染色凝膠顯示在各條件下的總體可溶性蛋白質(zhì)產(chǎn)生。圖5b圖顯示在表達不同水平的fkpa后產(chǎn)生的hab的效價。圖6a-b顯示在表達不同水平的fkpa后xil13igg4hab的產(chǎn)生。圖6a提供顯示使用不同載體系統(tǒng)產(chǎn)生的xil13hab的效價的圖，并且伴有顯示在各條件下的hab和可溶性單體重鏈積累的蛋白質(zhì)印跡。圖6b提供顯示使用不同載體系統(tǒng)產(chǎn)生的fkpa的量的圖，并且伴有顯示在各條件下的fkpa表達的蛋白質(zhì)印跡。在兩個圖版中，“內(nèi)源性fkpa水平”是指細(xì)菌宿主細(xì)胞不含有編碼fkpa的質(zhì)粒；“可相容fkpa水平”是指從單獨(可相容)質(zhì)粒表達xil13和fkpa；并且“單一fkpa水平”是指表達xil13與fkpa兩者的單一載體。圖7a-b顯示在誘導(dǎo)型表達fkpa后xil4igg4hab的產(chǎn)生。圖7a描繪顯示hab和可溶性單體重鏈積累的蛋白質(zhì)印跡。圖7b提供顯示使用誘導(dǎo)型fkpa表達產(chǎn)生的xil4hab的效價的圖，并且伴有顯示fkpa的表達的蛋白質(zhì)印跡。在兩個圖版中，樣品1使用tir1,1載體來產(chǎn)生xil4hab，并且不過度表達fkpa；樣品2使用tir2,2載體來產(chǎn)生xil4hab，并且不過度表達fkpa；樣品3使用tir1,1來產(chǎn)生xil4hab，并且使用iptg來誘導(dǎo)fkpa表達；并且樣品4使用tir2,2來產(chǎn)生xil4hab，并且使用iptg來誘導(dǎo)fkpa表達。圖8a-c顯示在表達fkpa后xvegfcigg1hab的產(chǎn)生。圖8a提供顯示使用不同載體系統(tǒng)產(chǎn)生的xvegfchab的效價的圖。圖8b描繪顯示在兩種條件下的總體可溶性蛋白質(zhì)產(chǎn)生的凝膠，其中fkpa條帶如所標(biāo)記。圖8c描繪顯示xvegfchab和可溶性單體重鏈的積累的蛋白質(zhì)印跡。在所有圖版中，樣品1使用tir2,2載體來產(chǎn)生xvegfchab，并且不含有用于表達fkpa的質(zhì)粒；樣品2使用tir2,2載體來產(chǎn)生xil4hab，并且使用iptg來誘導(dǎo)fkpa表達。圖9顯示采用用于表達xil13hab的第一質(zhì)粒(pxil13.2.2.fkpac13)和用于表達dsba和dsbc的第二質(zhì)粒(pjj247)的可相容質(zhì)粒系統(tǒng)。圖10提供顯示使用xil13.2.2.fkpac13產(chǎn)生質(zhì)粒和用于表達dsba和dsbc的可相容質(zhì)粒在有和無iptg誘導(dǎo)下隨時間產(chǎn)生xil13hab的圖。圖11a顯示xil14hab可相容質(zhì)粒系統(tǒng)。圖11b顯示編碼xil14hablc和hc、fkpa、dsba以及dsbc的單一質(zhì)粒的產(chǎn)生。圖12a-b顯示在tir1,1或tir2,2載體的情況下在不存在fkpa、dsba和dsbc表達下(1和2，如所標(biāo)記)；在存在iptg誘導(dǎo)的fkpa表達(3和4，如所標(biāo)記)下；以及在存在具有fkpa、dsba和dsbc的質(zhì)粒下在不存在iptg下(5和6，如所標(biāo)記)的xil4hab產(chǎn)生。圖12a描繪顯示在各種條件下的xil4hab和可溶性單體重鏈的積累的蛋白質(zhì)印跡。圖12b提供顯示在各種條件下產(chǎn)生的xil4hab的效價的圖，并且伴有顯示fkpa的表達的蛋白質(zhì)印跡。圖13顯示在tir2,2載體的情況下在不存在fkpa、dsba和dsbc表達下(柱1)；在存在iptg誘導(dǎo)的fkpa表達下(柱2)；以及在具有fkpa、dsba和dsbc的質(zhì)粒存在下在不存在iptg下(柱3)的xvegfchab產(chǎn)生。圖14顯示在tir1,1或tir2,2載體的情況下在不存在fkpa、dsba和dsbc表達下(1和3，如所標(biāo)記)；以及在具有fkpa、dsba和dsbc的質(zhì)粒存在下在不存在iptg下(2和4，如所標(biāo)記)的xvegfaigg1hab產(chǎn)生。圖15顯示在tir2,2載體的情況下當(dāng)fkpa、dsba和dsbc從同一載體表達時(“單一”)以及當(dāng)fkpa、dsba和dsbc從第二可相容載體表達時(“可相容”)，連同無抗體表達載體以及無dsba、dsbc和fkpa過度表達的陰性對照(“對照”)一起的xil4hab產(chǎn)生。蛋白質(zhì)印跡顯示dsba、dsbc和fkpa的表達。圖16a顯示利用先前描述的pxil13.2.2.fkpac13產(chǎn)生質(zhì)粒和可相容氧化還原酶質(zhì)粒(pjj247)的xil13可相容質(zhì)粒系統(tǒng)。圖16b顯示并有來自pxil13.2.2.fkpac13和pjj247的開放閱讀框(orf)的單一質(zhì)粒(md157)的產(chǎn)生。圖17顯示在tir2,2載體的情況下當(dāng)fkpa、dsba和dsbc從同一載體表達時(“單一”)以及當(dāng)dsba和dsbc從可相容載體表達，并且fkpa從xil13.2.2.fkpac13載體表達時(“可相容”)xil13hab隨時間的產(chǎn)生。這些載體使用phoa啟動子來驅(qū)動fkpa表達。圖18顯示攜帶以下兩種載體的細(xì)胞在固定攪拌速率下生長的培養(yǎng)物中隨時間的平均氧攝取速率(our)：表達xil13hab和fkpa的tir2,2載體，和在iptg誘導(dǎo)型啟動子下表達dsba和dsbc的載體。顯示在存在或不存在iptg下生長的培養(yǎng)物的our。提供用于各條件的樣品數(shù)(“n”)。圖19顯示攜帶以下兩種載體的細(xì)胞在固定攪拌速率下生長的培養(yǎng)物隨時間的平均同滲重摩：表達xil13hab和fkpa的tir2,2載體，和在iptg誘導(dǎo)型啟動子下表達dsba和dsbc的載體。顯示在存在或不存在iptg下生長的培養(yǎng)物的同滲重摩。提供用于各條件的樣品數(shù)(“n”)。圖20顯示由攜帶以下兩種載體的細(xì)胞隨時間產(chǎn)生的xil13hab的平均效價：表達xil13hab和fkpa的tir2,2載體，和在iptg誘導(dǎo)型啟動子下表達dsba和dsbc的載體。顯示在存在或不存在iptg下生長的培養(yǎng)物所產(chǎn)生的抗體效價。提供用于各條件的樣品數(shù)(“n”)。圖21顯示在650rpm下的攪拌下生長26小時，接著變動至足以實現(xiàn)標(biāo)記的our設(shè)置點的較低攪拌速率的培養(yǎng)物中隨時間的平均our。細(xì)胞攜帶兩種載體：表達xil13hab和fkpa的tir2,2載體，和在不存在iptg下表達dsba和dsbc的載體。提供用于各條件的樣品數(shù)(“n”)。圖22顯示在650rpm下的攪拌下生長26小時，接著變動至足以實現(xiàn)標(biāo)記的our設(shè)置點的較低攪拌速率的培養(yǎng)物中隨時間的平均同滲重摩。細(xì)胞攜帶兩種載體：表達xil13hab和fkpa的tir2,2載體，和在不存在iptg下表達的載體。提供用于各條件的樣品數(shù)(“n”)。圖23顯示在650rpm下的攪拌下生長26小時，接著變動至足以實現(xiàn)標(biāo)記的our設(shè)置點的較低攪拌速率的培養(yǎng)物在兩個時間點(54和72小時)的平均xil13hab產(chǎn)生效價。細(xì)胞攜帶兩種載體：表達xil13hab和fkpa的tir2,2載體，和在不存在iptg下表達dsba和dsbc的載體。提供用于各條件的樣品數(shù)(“n”)。圖24顯示從也編碼由phoa啟動子驅(qū)動的fkpa以及由tacii啟動子驅(qū)動的dsba和dsbc的tir2,2載體在不存在iptg下產(chǎn)生xil13hab的培養(yǎng)物隨時間的平均細(xì)胞密度(od550nm)。對于生長與產(chǎn)生(tg/tp)兩個時期，均使培養(yǎng)物在28℃或30℃的恒定溫度下生長。在進入發(fā)酵26小時進行攪拌變動。提供用于各條件的樣品數(shù)(“n”)。圖25顯示從也編碼由phoa啟動子驅(qū)動的fkpa以及由tacii啟動子驅(qū)動的dsba和dsbc的tir2,2載體在不存在iptg下產(chǎn)生xil13hab的細(xì)胞的培養(yǎng)物隨時間的平均our。對于生長與產(chǎn)生(tg/tp)兩個時期，均使培養(yǎng)物在28℃或30℃的恒定溫度下生長。提供用于各條件的樣品數(shù)(“n”)。圖26顯示從也編碼由phoa啟動子驅(qū)動的fkpa以及由tacii啟動子驅(qū)動的dsba和dsbc的tir2,2載體在不存在iptg下產(chǎn)生xil13hab的細(xì)胞的培養(yǎng)物中隨時間的平均磷酸鹽濃度。對于生長與產(chǎn)生(tg/tp)兩個時期，均使培養(yǎng)物在28℃或30℃的恒定溫度下生長。提供用于各條件的樣品數(shù)(“n”)。圖27顯示細(xì)胞培養(yǎng)物中從也編碼由phoa啟動子驅(qū)動的fkpa以及由tacii啟動子驅(qū)動的dsba和dsbc的tir2,2載體在不存在iptg下產(chǎn)生的xil13hab的平均效價。對于生長與產(chǎn)生(tg/tp)兩個時期，均使培養(yǎng)物在28℃或30℃的恒定溫度下生長。圖28顯示從也編碼由phoa啟動子驅(qū)動的fkpa以及由tacii啟動子驅(qū)動的dsba和dsbc的tir2,2載體在不存在iptg下產(chǎn)生xil13hab的培養(yǎng)物隨時間的平均細(xì)胞密度(od550nm)。使培養(yǎng)物在28℃或30℃(分別tg/tp28℃或tg/tp30℃)的恒定溫度下生長，或在生長期期間在30℃下生長，接著對于產(chǎn)生期變動至28℃(tg30tp28)。提供用于各條件的樣品數(shù)(“n”)。圖29顯示從也編碼由phoa啟動子驅(qū)動的fkpa以及由tacii啟動子驅(qū)動的dsba和dsbc的tir2,2載體在不存在iptg下產(chǎn)生xil13hab的細(xì)胞的培養(yǎng)物中隨時間的平均磷酸鹽濃度。使培養(yǎng)物在28℃或30℃(分別tg/tp28℃或tg/tp30℃)的恒定溫度下生長，或在生長期期間在30℃下生長，接著對于產(chǎn)生期變動至28℃(tg30tp)。提供用于各條件的樣品數(shù)(“n”)。圖30顯示從也編碼由phoa啟動子驅(qū)動的fkpa以及由tacii啟動子驅(qū)動的dsba和dsbc的tir2,2載體在不存在iptg下產(chǎn)生xil13hab的細(xì)胞的培養(yǎng)物隨時間的our。使培養(yǎng)物在28℃或30℃(分別tg/tp28℃或tg/tp30℃)的恒定溫度下生長，或在生長期期間在30℃下生長，接著對于產(chǎn)生期變動至28℃(tg30tp28)。提供用于各條件的樣品數(shù)(“n”)。圖31顯示從也編碼由phoa啟動子驅(qū)動的fkpa以及由tacii啟動子驅(qū)動的dsba和dsbc的tir2,2載體在不存在iptg下隨時間產(chǎn)生的xil13hab的平均效價。使培養(yǎng)物在如所標(biāo)記的28℃或30℃(分別tg/tp28℃或tg/tp30℃)的恒定溫度下生長，或在生長期期間在30℃下生長，接著對于產(chǎn)生期變動至28℃(tg30tp28)。圖32顯示在單一質(zhì)粒(md157)的情況下，在通過附表中的樣式標(biāo)識的不同工藝條件下對xil13hab效價的部分析因?qū)嶒炘O(shè)計(doe)分析的結(jié)果。圖33顯示從也編碼由tacii啟動子驅(qū)動的fkpa、dsba和dsbc的tir2,2載體在不存在iptg下產(chǎn)生的xil4hab的效價。使培養(yǎng)物在30℃(tg/tp30℃)的恒定溫度下生長，或在生長期期間在34℃下生長，接著對于產(chǎn)生期變動至25℃(tg34tp25)。圖34顯示在單一質(zhì)粒(md341)的情況下，在通過附表中的樣式標(biāo)識的不同工藝條件下對xil17hab效價的部分析因?qū)嶒炘O(shè)計(doe)分析的結(jié)果。圖35顯示首先優(yōu)化伴侶蛋白共表達，接著優(yōu)化方法步驟(例如攪拌速率、tg和tp)對xil13hab效價的影響。圖36a顯示由在66f8和67a6宿主菌株的情況下進行的發(fā)酵獲得的可溶性xil13hab效價。圖36b顯示在66f8與67a6兩種宿主菌株的情況下在72小時的總體xil13輕鏈和重鏈濃度。對于兩種條件，n＝2。圖37a顯示由在66f8和67a6宿主菌株的情況下在恒定發(fā)酵溫度下進行的發(fā)酵獲得的可溶性xil4hab效價。圖37b顯示由在66f8和67a6宿主菌株的情況下在采用溫度變動的發(fā)酵條件下進行的發(fā)酵獲得的總體可溶性xil4hab效價。對于兩種條件，n＝2。圖38a顯示xil4輕鏈效價，并且圖38b顯示xil4重鏈效價，所述效價由在66f8和67a6宿主菌株的情況下在采用溫度變動的發(fā)酵條件下進行的發(fā)酵獲得。對于兩種條件，n＝2。圖39提供xil33hab分泌質(zhì)粒的圖譜。lc和hc開放閱讀框獨立地與tir2可操作組合加以放置。圖40說明在不存在共表達伴侶蛋白dsba、dsbc、fkpa下在30℃的恒定溫度下進行的發(fā)酵中(基礎(chǔ)情況)，以及在伴侶蛋白dsba、dsbc和fkpa共表達存在下在相同工藝條件下進行的發(fā)酵中(具有伴侶蛋白)xil33hab的積累。圖41顯示由用含有伴侶蛋白fkpa、dsba、dsbc的xil33hab單一質(zhì)粒進行的實驗設(shè)計(doe)獲得的ail33hab效價差異。doe因素包括ph、生長溫度(tg)、產(chǎn)生溫度(tp)和產(chǎn)生期目標(biāo)氧攝取速率(our)。圖42提供tir1(seqidno:1)、tir2(seqidno:2)和tir3(seqidno:3)fkpa信號序列變體的核苷酸序列。在特定密碼子的第三位置中進行單一核苷酸取代，并且代表不改變fkpa信號肽序列的氨基酸序列(seqidno:4)的同義密碼子變化。圖43顯示fkpatir變體相對于tir1fkpa變體(質(zhì)粒19)的定量強度。圖44顯示在用tir1、tir2和tir3fkpatir變體進行的發(fā)酵中xil13hab的積累。對于tir1、tir2和tir3變體，在各條件下產(chǎn)生的效價分別是1.5、2.5和4.0g/l。圖45顯示在用tir1、tir2和tir3fkpatir變體進行的發(fā)酵中xil33hab的積累。圖46顯示在用tir1、tir2和tir3fkpa變體進行的發(fā)酵中xil17hab的積累的圖。圖47a顯示在用fkpatir變體進行的發(fā)酵中xil13hab的積累的圖。圖47b顯示在發(fā)酵結(jié)束時由xil13hab方法獲得的可溶性部分中存在的fkpa的水平。圖48a顯示改變的氧轉(zhuǎn)移速率(otr)發(fā)酵條件和對照發(fā)酵條件的氧攝取速率(our)。改變的otr發(fā)酵和對照發(fā)酵實現(xiàn)約5mmol/l/min的類似峰值our和2.75mmol/l/min的類似攪拌變動后目標(biāo)our。圖48b顯示改變的otr發(fā)酵條件和對照發(fā)酵條件的生長圖譜。改變的otr發(fā)酵和對照發(fā)酵具有類似生長圖譜，并且兩者均實現(xiàn)峰值od550250。xil13hab對照(對照)最佳條件＝1巴背壓(bp)，20標(biāo)準(zhǔn)升/分鐘(slpm)，和650至475rpm的攪拌速率變動。xil13hab改變的otr條件＝0.3巴背壓，13slpm，和880至650rpm的攪拌速率變動。圖49顯示改變的otr條件和對照條件的xil13hab積累圖譜。改變的條件和對照條件在發(fā)酵期間具有類似積累圖譜，并且兩者均在72小時分別實現(xiàn)最大平均效價4.1和4.2g/l。圖50a-50b說明tir1,1immtac1產(chǎn)生質(zhì)粒的質(zhì)粒構(gòu)型(圖50a)以及對tir1,1的描繪(圖50b)。圖51說明用于產(chǎn)生immtac的原始(即未優(yōu)化)發(fā)酵方法。圖52顯示在發(fā)酵過程結(jié)束時積累的經(jīng)裝配immtac的量以及α和β亞單位的總量。圖53提供immtac產(chǎn)生質(zhì)粒和含有在tac啟動子的控制下的fkpaorf的可相容質(zhì)粒的質(zhì)粒圖譜。圖54a顯示以下條件的可溶性和可溶性還原抗α和抗β蛋白質(zhì)印跡：無伴侶蛋白(tir1,1)，具有fkpa(+fkpa)，陰性對照(-)，以及immtac1陽性對照(immtacdp)。箭號指定經(jīng)裝配immtac。圖54b顯示單獨tir1,1條件以及tir1,1與fkpa一起的條件的最終效價。圖55說明用于產(chǎn)生immtac的改進發(fā)酵工藝條件。圖56a-56b顯示以下條件的可溶性和可溶性還原抗α(圖56a)和抗β(圖56b)蛋白質(zhì)印跡：無伴侶蛋白(tir1,1)，具有fkpa(+fkpa)，具有fkpa并使用新工藝條件(新工藝條件+fkpa)，陰性對照(-)，以及immtac1陽性對照(immtacdp)。圖57顯示以下條件的最終效價：tir1,1；tir1,1與fkpa一起；以及tir1,1與fkpa一起并使用新工藝條件。圖58說明并有immtacα鏈和β鏈orf以及在phoa啟動子的控制下的fkpaorf的單一質(zhì)粒的構(gòu)建。圖59a顯示并有fkpaorf的tir1,1；tir1,2；和tir2,3單一質(zhì)粒的最終immtac1效價。圖59b顯示并有fkpaorf的tir1,1；tir1,2；和tir2,3單一質(zhì)粒的αimmtac鏈與βimmtac鏈兩者的最終亞單位積累。圖60a顯示針對由用immtactir1,1產(chǎn)生質(zhì)粒和可相容fkpa質(zhì)粒以及含有fkpaorf的單一tir1,1質(zhì)粒進行的發(fā)酵獲得的fkpa加以探測的蛋白質(zhì)印跡。圖60b顯示以下條件的最終效價：僅tir1,1；tir1,1與fkpa一起；tir1,1fkpa可相容質(zhì)粒系統(tǒng)；以及tir1,1fkpa單一質(zhì)粒系統(tǒng)。圖61提供含有fkpa、α鏈和β鏈orf的immtac產(chǎn)生質(zhì)粒和含有在tac啟動子的控制下的氧化還原酶(例如dsbc)的可相容質(zhì)粒的質(zhì)粒圖譜。圖62顯示由用并有fkpaorf的tir1,1單一質(zhì)粒與含有單獨dsba、單獨dsbc、或組合dsba和dsbc的orf的可相容質(zhì)粒一起進行的發(fā)酵獲得的最終效價。圖63顯示由用單獨tir1,1單一質(zhì)粒；tir1,1單一質(zhì)粒與dsbc可相容質(zhì)粒一起；以及tir2,3單一質(zhì)粒與dsbc可相容質(zhì)粒一起進行的發(fā)酵獲得的最終效價。圖64顯示使用以上優(yōu)化，從初始tir1,1產(chǎn)生質(zhì)粒至tir2,3單一質(zhì)粒與dsbc可相容質(zhì)粒一起在最終效價方面的累積增加。圖65a-65b顯示在tir2,3產(chǎn)生質(zhì)粒與以及不與可相容fkpa質(zhì)粒一起的情況下；以并有fkpaorf的單一tir1,1和tir2,3質(zhì)粒形式；以及以并有fkpaorf的單一tir1,1和tir2,3質(zhì)粒與可相容dsbc質(zhì)粒一起的形式測試的immtac2分子。提供顯示α(圖65a)和β(圖65b)鏈的產(chǎn)生的蛋白質(zhì)印跡。詳細(xì)描述本文提供的實施例證明與編碼多鏈蛋白質(zhì)的各鏈(例如半抗體的輕鏈和重鏈)的翻譯單元組合共表達一種或多種特異性伴侶蛋白使原核宿主細(xì)胞系統(tǒng)中經(jīng)裝配多鏈蛋白質(zhì)的產(chǎn)生增加。實施例進一步證明隨后方法改進諸如用于某些發(fā)酵時期的特定溫度和攪拌速率導(dǎo)致超過表達載體改進的在產(chǎn)生和穩(wěn)健性方面的顯著增強?？傊?，本文所述的方法實現(xiàn)示例性雙鏈多肽(例如半抗體)的產(chǎn)生增加至少10倍。在一個方面，本文提供通過以下方式來在原核宿主細(xì)胞中產(chǎn)生含有兩條鏈的多肽的方法：培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞以表達所述多肽的所述兩條鏈，其中在表達后，所述兩條鏈折疊并裝配以在所述宿主細(xì)胞中形成生物活性多肽；其中所述宿主細(xì)胞含有多核苷酸，其包括(1)編碼所述多肽的第一鏈的第一翻譯單元；(2)編碼所述多肽的第二鏈的第二翻譯單元；和(3)編碼至少一種選自肽基-脯氨?；悩?gòu)酶、蛋白質(zhì)二硫化物氧化還原酶及其組合的伴侶蛋白的第三翻譯單元；其中在培養(yǎng)基中在包括以下的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞：包括生長溫度和生長攪拌速率的生長期，和包括產(chǎn)生溫度和產(chǎn)生攪拌速率的產(chǎn)生期，其中所述生長溫度高于所述產(chǎn)生溫度2至10℃，并且所述生長攪拌速率高于所述產(chǎn)生攪拌速率50至250rpm；和(b)從所述宿主細(xì)胞回收所述生物活性多肽。在一個方面，多肽由兩條鏈組成，而在另一方面，多肽包含三個、四個、五個或更多個鏈。在另一方面，本文提供通過以下方式來在原核宿主細(xì)胞中產(chǎn)生含有兩條鏈的多肽的方法：培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞以表達所述多肽的所述兩條鏈，其中在表達后，所述兩條鏈折疊并裝配以在所述宿主細(xì)胞中形成生物活性多肽；其中所述宿主細(xì)胞含有多核苷酸，其包括(1)編碼所述多肽的第一鏈的第一翻譯單元；(2)編碼所述多肽的第二鏈的第二翻譯單元；(3)編碼第一伴侶蛋白的第三翻譯單元；(4)編碼第二伴侶蛋白的第四翻譯單元；和(5)編碼第三伴侶蛋白的第五翻譯單元，其中所述第一、第二和第三伴侶蛋白選自肽基-脯氨?；悩?gòu)酶、蛋白質(zhì)二硫化物氧化還原酶及其組合；其中在培養(yǎng)基中在包括以下的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞：包括生長溫度和生長攪拌速率的生長期，和包括產(chǎn)生溫度和產(chǎn)生攪拌速率的產(chǎn)生期，其中所述生長溫度高于所述產(chǎn)生溫度2至10℃，并且所述生長攪拌速率高于所述產(chǎn)生攪拌速率50至250rpm；和(b)從所述宿主細(xì)胞回收所述生物活性多肽。在一個方面，多肽由兩條鏈組成，而在另一方面，多肽包含三個、四個、五個或更多個鏈。i.定義在詳細(xì)描述本公開之前，應(yīng)了解本公開不限于可當(dāng)然變化的特定組合物或生物系統(tǒng)。也應(yīng)了解本文所用的術(shù)語僅出于描述特定實施方案的目的，并且不意圖具有限制性。除非內(nèi)容另外明確指示，否則如本說明書和隨附權(quán)利要求中所用，單數(shù)形式“一”和“所述”包括復(fù)數(shù)個指示物。因此，舉例來說，提及“一分子”任選包括兩種或更多種所述分子的組合等。如本文所用的術(shù)語“約”是指相應(yīng)值的易于為本
技術(shù)領(lǐng)域：
中的熟練人士所知的通常誤差范圍。在本文中提及“約”某一值或參數(shù)包括(并且描述)有關(guān)那個值或參數(shù)本身的實施方案。在最大限度下，如本文關(guān)于某一值所用的術(shù)語“約”涵蓋那個值的90％至110％(例如第一tir和第二tir的約1.0至約3.0的相對翻譯強度是指相對翻譯強度在0.9與3.3之間的范圍內(nèi))。應(yīng)了解本文所述的本公開的方面和實施方案包括“包含”方面和實施方案，“由方面和實施方案組成”，以及“基本上由方面和實施方案組成”。如本文所用的術(shù)語“包含兩條鏈的多肽”(術(shù)語“雙鏈蛋白質(zhì)”和“雙鏈多肽”也可在本文中可互換使用)意指含有超過一個不同多肽鏈的任何多肽。在一些實施方案中，雙鏈蛋白質(zhì)可包括兩個或更多個多肽通過一個或多個分子間鍵包括不限于二硫鍵連接在一起的大分子復(fù)合物。在一些實施方案中，雙鏈蛋白質(zhì)可包括具有屬于兩個不同多肽鏈(例如抗體重鏈和抗體輕鏈)的由多肽接頭連接的氨基酸序列的單一多肽。在這個情況下，雙鏈蛋白質(zhì)可在實體上代表單鏈，但所述單鏈的兩個或更多個部分可在功能上表現(xiàn)得好像它們是兩個單獨蛋白質(zhì)鏈一樣。舉例來說，單鏈抗體可包括功能性重鏈和功能性輕鏈，其盡管由多肽接頭接合，但折疊和裝配得好像它們是僅由分子間鍵(例如一個或多個二硫鍵)締合的單獨多肽一樣。如本文所用的術(shù)語“載體”意指能夠轉(zhuǎn)運它已與其連接的另一核酸的核酸分子。一種類型的載體是“質(zhì)粒”，其是指可將額外dna區(qū)段連接至其中的環(huán)狀雙鏈dna環(huán)。另一類型的載體是噬菌體載體。另一類型的載體是病毒載體，其中可將額外dna區(qū)段連接至病毒基因組中。某些載體能夠在它們所引入的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(例如具有細(xì)菌復(fù)制起點的細(xì)菌載體和游離型哺乳動物載體)。其它載體(例如非游離型哺乳動物載體)可在引入宿主細(xì)胞中后被整合至所述宿主細(xì)胞的基因組中，并且由此連同宿主基因組一起復(fù)制。此外，某些載體能夠指導(dǎo)它們所操作性地連接的基因的表達。所述載體在本文中稱為“重組表達載體”(或簡稱為“重組載體”)。一般來說，在重組dna技術(shù)方面具有效用的表達載體常呈質(zhì)粒形式。在本說明書中，“質(zhì)粒”和“載體”可互換使用，因為質(zhì)粒是最通常使用的載體形式。如本文所用的術(shù)語“順反子”意指大致等效于翻譯單元的遺傳元件，其包含編碼多肽鏈和鄰近控制區(qū)的核苷酸序列?！绊樂醋印笨砂ɡ缫粋€或多個開放閱讀框、翻譯起始區(qū)(tir；如下文所定義)、信號序列和終止區(qū)?！岸囗樂醋印北磉_載體是指含有和表達在一個單一啟動子的調(diào)控控制下的多個順反子的單一載體。多順反子載體的一常見實例是“雙順反子”載體，其含有和表達在一個啟動子的控制下的兩種不同多肽。在表達雙順反子或多順反子載體后，多個基因首先被轉(zhuǎn)錄成單一轉(zhuǎn)錄單元，接著分開翻譯?！稗D(zhuǎn)錄單元”是指被轉(zhuǎn)錄成單一rna轉(zhuǎn)錄物的多核苷酸?！胺g單元”是指多核苷酸的編碼以及在翻譯時產(chǎn)生多肽的區(qū)段。如上所述，多順反子多核苷酸可含有具有多個翻譯單元的單一轉(zhuǎn)錄單元。本公開的“單獨順反子”表達載體是指包含至少兩對單獨啟動子-順反子的單一載體，其中各順反子在它的自身啟動子的控制下。在表達單獨順反子表達載體后，不同基因的轉(zhuǎn)錄過程與翻譯過程兩者均是分開的和獨立的。如本文所用的“伴侶蛋白”是指有助于其它大分子包括不限于雙鏈蛋白質(zhì)的折疊或裝配的任何蛋白質(zhì)。通常，伴侶蛋白可通過許多不同機理來起促進蛋白質(zhì)折疊或裝配的作用。舉例來說，伴侶蛋白可促進蛋白質(zhì)折疊和/或裝配，催化鏈內(nèi)二硫鍵的形成，促進蛋白質(zhì)展開和/或解散(例如聚集或錯誤折疊的蛋白質(zhì)或多蛋白復(fù)合物的展開和/或解散)，防止聚集，有助于蛋白質(zhì)降解等。如本文所用的“翻譯起始區(qū)(translationinitiationregion)”或tir或翻譯起始區(qū)(translationalinitiationregion)或翻譯起始序列是指提供目標(biāo)基因的翻譯起始的效率的核酸區(qū)域。一般來說，特定順反子內(nèi)的tir涵蓋核糖體結(jié)合位點(rbs)和在rbs的5'和3'的序列。rbs被定義為至少含有shine-dalgarno區(qū)域和起始密碼子(aug)。因此，tir也包括至少一部分待翻譯的核酸序列。優(yōu)選地，本公開的tir包括順反子內(nèi)編碼信號肽的在編碼輕鏈或重鏈的序列之前的分泌信號序列。tir變體含有tir區(qū)域內(nèi)的改變tir的性質(zhì)諸如如下文定義的它的翻譯強度的序列變體(特別是取代)。優(yōu)選地，本公開的tir變體含有順反子內(nèi)分泌信號序列的前2至約14個，優(yōu)選約4至12個，更優(yōu)選約6個密碼子內(nèi)的序列取代，所述分泌信號序列在編碼輕鏈或重鏈的序列之前。如本文所用的術(shù)語“翻譯強度”是指在控制系統(tǒng)中對分泌多肽的測量結(jié)果，其中tir的一種或多種變體用于指導(dǎo)多肽的分泌，并且將結(jié)果與在相同培養(yǎng)和測定條件下的野生型tir或某一其它對照進行比較。在不受限于任一理論下，如本文所用的“翻譯強度”可包括例如且不限于對mrna穩(wěn)定性、核糖體結(jié)合核糖體結(jié)合位點的效率等的測量結(jié)果。“分泌信號序列”或“信號序列”是指編碼短信號肽的核酸序列，所述短信號肽可用于指導(dǎo)新合成的目標(biāo)蛋白質(zhì)穿過細(xì)胞膜，通常是原核生物的內(nèi)膜或內(nèi)膜與外膜兩者。因此，目標(biāo)蛋白質(zhì)諸如免疫球蛋白輕鏈或重鏈多肽被分泌至原核宿主細(xì)胞的周質(zhì)中或培養(yǎng)基中。由分泌信號序列編碼的信號肽對于宿主細(xì)胞可為內(nèi)源性的，或它們可為外源性的，包括對于待表達的多肽是天然的信號肽。分泌信號序列通常存在于待表達的多肽的氨基末端，并且通常在生物合成與從細(xì)胞質(zhì)分泌多肽之間被酶促移除。因此，信號肽通常不存在于成熟蛋白質(zhì)產(chǎn)物中?！翱刹僮鞯剡B接”是指兩個或更多個組分的毗鄰，其中如此描述的組分處于容許它們以它們的預(yù)定方式起作用的關(guān)系。舉例來說，如果啟動子以順式起控制或調(diào)節(jié)編碼序列的轉(zhuǎn)錄的作用，那么它可操作地連接于所連接序列。通常而非必定，“可操作地連接的”dna序列是連續(xù)的，并且當(dāng)為接合兩個蛋白質(zhì)編碼區(qū)所必需時或在分泌前導(dǎo)物的情況下，是連續(xù)的并處于閱讀框中。然而，盡管可操作地連接的啟動子通常位于編碼序列的上游，但它未必與它連續(xù)?？刹僮鞯剡B接的增強子可位于編碼序列的上游、編碼序列內(nèi)或編碼序列的下游，并且處于與啟動子的可觀距離下。連接通過本領(lǐng)域中已知的重組方法來實現(xiàn)，例如使用pcr方法，通過退火，或通過在適宜限制位點處進行連接。如果適宜限制位點不存在，那么依照常規(guī)規(guī)范使用合成寡核苷酸銜接頭或接頭。如本文所用的“調(diào)控元件”是指以順式存在，為將編碼異源性多肽的多核苷酸轉(zhuǎn)錄和翻譯成多肽所必需的核苷酸序列。轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件通常包括在待表達的基因序列的5'的啟動子、轉(zhuǎn)錄起始和終止位點、以及多聚腺苷酸化信號序列。術(shù)語“轉(zhuǎn)錄起始位點”是指構(gòu)建體中對應(yīng)于并入初級轉(zhuǎn)錄物即mrna前體中的第一核酸的核酸；轉(zhuǎn)錄起始位點可與啟動子序列重疊。“啟動子”是指控制它所可操作地連接的基因或序列的轉(zhuǎn)錄的多核苷酸序列。啟動子包括用于rna聚合酶結(jié)合和轉(zhuǎn)錄起始的信號。所用啟動子將在宿主細(xì)胞的細(xì)胞類型中具有功能性，其中涵蓋表達所選序列。來自多種不同來源的許多啟動子包括組成型、誘導(dǎo)型和阻遏型啟動子在本領(lǐng)域中是熟知的(并且在諸如genbank的數(shù)據(jù)庫中加以標(biāo)識)，并且可以經(jīng)克隆多核苷酸形式或在經(jīng)克隆多核苷酸內(nèi)獲得(從例如諸如atcc的寄存處以及其它商業(yè)或個體來源)。在誘導(dǎo)型啟動子的情況下，啟動子的活性響應(yīng)于信號例如存在iptg或磷酸鹽耗盡而增加或降低。如本文所用的術(shù)語“宿主細(xì)胞”(或“重組宿主細(xì)胞”)意指通過引入外源性多核苷酸諸如重組質(zhì)粒或載體而已被遺傳改變，或能夠被遺傳改變的細(xì)胞。應(yīng)了解所述術(shù)語意圖不僅指代特定主題細(xì)胞，而且指代這種細(xì)胞的子代。因為某些修飾可由于突變或環(huán)境影響而發(fā)生在繼代中，所以所述子代可能實際上不與親本細(xì)胞相同，但仍然被包括在如本文所用的術(shù)語“宿主細(xì)胞”的范圍內(nèi)。術(shù)語“藥物制劑”是指以下制劑：其呈使得容許活性成分的生物活性有效的形式，并且其不含有對制劑所將施用的受試者具有不可接受的毒性的額外組分。所述制劑是無菌的。“藥學(xué)上可接受的”賦形劑(媒介物、添加劑)是可合理地向主題哺乳動物施用以提供采用的活性成分的有效劑量的那些?！笆茉囌摺被颉皞€體”出于治療的目的是指分類為哺乳動物的任何動物，包括人、家養(yǎng)動物和農(nóng)場動物、以及動物園動物、運動動物或玩賞動物，諸如狗、馬、貓、母牛等。優(yōu)選地，哺乳動物是人。術(shù)語“抗體”在本文中在最廣泛意義上使用，并且明確涵蓋單克隆抗體(包括全長單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)和抗體片段，只要它們展現(xiàn)所需生物活性即可?！敖?jīng)分離”抗體是已被鑒定并與它的天然環(huán)境的組分分離和/或從所述組分回收的抗體。它的天然環(huán)境的污染物組分是將干擾抗體的研究、診斷或治療用途的物質(zhì)，并且可包括酶、激素和其它蛋白質(zhì)或非蛋白質(zhì)溶質(zhì)。在一些實施方案中，抗體被純化(1)以獲得大于95重量％的抗體，如通過例如洛利(lowry)方法所測定，并且在一些實施方案中，以獲得大于99重量％；(2)以達到足以通過使用例如旋轉(zhuǎn)杯測序儀獲得n末端或內(nèi)部氨基酸序列的至少15個殘基的程度，或(3)以達到使用例如考馬斯(coomassie)藍或銀染色在還原性或非還原性條件下通過sds-page確定的均質(zhì)性。經(jīng)分離抗體包括重組細(xì)胞內(nèi)原位抗體，因為將不存在抗體的天然環(huán)境的至少一種組分。然而，通常，將通過至少一個純化步驟來制備經(jīng)分離抗體?！疤烊豢贵w”通常是具有約150,000道爾頓(dalton)，由兩個相同輕(l)鏈和兩個相同重(h)鏈組成的異四聚糖蛋白。各輕鏈通過一個共價二硫鍵連接于重鏈，而在不同免疫球蛋白同種型的重鏈之間，二硫鍵的數(shù)目有變化。各重鏈和輕鏈也具有規(guī)則間隔的鏈內(nèi)二硫橋。各重鏈在一端具有可變結(jié)構(gòu)域(vh)，繼之以許多恒定結(jié)構(gòu)域。各輕鏈具有在一端的可變結(jié)構(gòu)域(vl)和在它的另一端的恒定結(jié)構(gòu)域；輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域與重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域?qū)?zhǔn)，而輕鏈可變結(jié)構(gòu)域與重鏈的可變結(jié)構(gòu)域?qū)?zhǔn)。據(jù)信特定氨基酸殘基形成輕鏈可變結(jié)構(gòu)域與重鏈可變結(jié)構(gòu)域之間的界面。術(shù)語“恒定結(jié)構(gòu)域”是指免疫球蛋白分子的相對于免疫球蛋白的含有抗原結(jié)合位點的其它部分即可變結(jié)構(gòu)域具有更保守氨基酸序列的部分。恒定結(jié)構(gòu)域含有重鏈的ch1、ch2和ch3結(jié)構(gòu)域(總稱為ch)和輕鏈的chl(或cl)結(jié)構(gòu)域?？贵w的“可變區(qū)”或“可變結(jié)構(gòu)域”是指所述抗體的重鏈或輕鏈的氨基末端結(jié)構(gòu)域。重鏈的可變結(jié)構(gòu)域可被稱為“vh”。輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域可被稱為“vl”。這些結(jié)構(gòu)域通常是抗體的最可變部分，并且含有抗原結(jié)合位點。術(shù)語“可變”是指以下事實：在抗體之間可變結(jié)構(gòu)域的某些部分在序列方面廣泛不同，并且被用于各特定抗體對它的特定抗原的結(jié)合性和特異性方面。然而，可變性并非均勻分布在抗體的整個可變結(jié)構(gòu)域中。在輕鏈可變結(jié)構(gòu)域與重鏈可變結(jié)構(gòu)域兩者中，它均集中在三個稱為高變區(qū)(hvr)的區(qū)段中?？勺兘Y(jié)構(gòu)域的更高度保守部分被稱為框架區(qū)(fr)。天然重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域各自包含四個主要采用β折疊片構(gòu)型，由三個hvr連接的fr區(qū)，所述hvr形成連接β折疊片結(jié)構(gòu)，以及在一些情況下形成β折疊片結(jié)構(gòu)的一部分的環(huán)。各鏈中的hvr通過fr區(qū)緊密鄰近固持在一起，并且與來自另一鏈的hvr一起促進形成抗體的抗原結(jié)合位點(參見kabat等,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第5版,nationalinstituteofhealth,bethesda,md.(1991))。恒定結(jié)構(gòu)域不直接涉及抗體結(jié)合抗原，但展現(xiàn)各種效應(yīng)物功能，諸如抗體參與抗體依賴性細(xì)胞毒性。來自任何哺乳動物物種的抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”都可基于它們的恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列來被指定為兩種稱為kappa(“κ”)和lambda(“λ”)的明確不同類型中的一種。如本文所用的術(shù)語igg“同種型”或“子類”意指免疫球蛋白的根據(jù)它們的恒定區(qū)的化學(xué)和抗原特征來定義的任何子類。視抗體(免疫球蛋白)的重鏈的恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列而定，抗體(免疫球蛋白)可被指定為不同類別。存在五種主要類別的免疫球蛋白：iga、igd、ige、igg和igm，并且這些類別中的若干可進一步分成子類(同種型)，例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2。對應(yīng)于免疫球蛋白的不同類別的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域被分別稱為α、γ、ε、γ和μ。不同類別的免疫球蛋白的亞單位結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是熟知的，并且一般地描述于例如abbas等cellularandmol.immunology,第4版(w.b.saunders,co.,2000)中?？贵w可為通過所述抗體與一種或多種其它蛋白質(zhì)或肽的共價或非共價締合形成的較大融合分子的一部分。術(shù)語“全長抗體”、“完整抗體”和“完全抗體”在本文中可互換用于指代呈它的大致上完整形式的抗體，而非如下定義的抗體片段。所述術(shù)語特別是指具有含有fc區(qū)的重鏈的抗體?！奥憧贵w”出于本文目的是未綴合于細(xì)胞毒性部分或放射性標(biāo)記的抗體?！翱贵w片段”包含完整抗體的一部分，優(yōu)選包含其抗原結(jié)合區(qū)。在一些實施方案中，本文所述的抗體片段是抗原結(jié)合片段。抗體片段的實例包括fab、fab'、f(ab')2和fv片段；微型雙功能抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；以及由抗體片段形成的多特異性抗體。木瓜蛋白酶消化抗體會產(chǎn)生兩個相同抗原結(jié)合片段，稱為“fab”片段，各自具有單一抗原結(jié)合位點；以及殘余“fc”片段，其名稱反映它能夠易于結(jié)晶。胃蛋白酶處理會產(chǎn)生具有兩個抗原結(jié)合位點，并且仍然能夠交聯(lián)抗原的f(ab')2片段。“fv”是含有完全抗原結(jié)合位點的最小抗體片段。在一個實施方案中，雙鏈fv種類由一個重鏈可變結(jié)構(gòu)域和一個輕鏈可變結(jié)構(gòu)域呈緊密非共價締合的二聚體組成。在單鏈fv(scfv)種類中，一個重鏈可變結(jié)構(gòu)域和一個輕鏈可變結(jié)構(gòu)域可由柔性肽接頭共價連接以使輕鏈和重鏈可以與在雙鏈fv種類的情況下的結(jié)構(gòu)類似的“二聚”結(jié)構(gòu)締合。就是在這個構(gòu)型的情況下，各可變結(jié)構(gòu)域的三個hvr相互作用以在vh-vl二聚體的表面上界定抗原結(jié)合位點?？傊?，六個hvr對抗體賦予抗原結(jié)合特異性。然而，即使單一可變結(jié)構(gòu)域(或僅包含三個對抗原具有特異性的hvr的半個fv)也能夠識別和結(jié)合抗原，但親和力低于整個結(jié)合位點。fab片段含有重鏈可變結(jié)構(gòu)域和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，并且也含有輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域和重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域(ch1)。fab'片段與fab片段因在重鏈ch1結(jié)構(gòu)域的羧基末端添加有少許殘基而不同，所述殘基包括一個或多個來自抗體鉸鏈區(qū)的半胱氨酸。fab'-sh是在本文中對fab'的標(biāo)號，其中恒定結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸殘基攜帶游離硫醇基團。f(ab')2抗體片段最初以在它們之間具有鉸鏈半胱氨酸的各對fab'片段形式產(chǎn)生?？贵w片段的其它化學(xué)偶聯(lián)也是已知的?！皢捂渇v”或“scfv”抗體片段包含抗體的vh結(jié)構(gòu)域和vl結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于單一多肽鏈中。通常，scfv多肽進一步包含在vh結(jié)構(gòu)域與vl結(jié)構(gòu)域之間的使得scfv能夠形成為抗原結(jié)合所需的結(jié)構(gòu)的多肽接頭。對于scfv的綜述，參見例如pluckthün,thepharmacologyofmonoclonalantibodies,第113卷,rosenburg和moore編,(springer-verlag,newyork,1994),第269-315頁。術(shù)語“微型雙功能抗體”是指具有兩個抗原結(jié)合位點的抗體片段，所述片段包含在同一多肽鏈(vh-vl)中重鏈可變結(jié)構(gòu)域(vh)連接于輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(vl)。通過使用太短以致不允許在同一鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域之間配對的接頭，結(jié)構(gòu)域被迫與另一鏈的互補結(jié)構(gòu)域配對，并且產(chǎn)生兩個抗原結(jié)合位點。微型雙功能抗體可為二價的或雙特異性的。微型雙功能抗體更充分描述于例如ep404,097；wo1993/01161；hudson等,nat.med.9:129-134(2003)；以及hollinger等,proc.natl.acad.sci.usa90:6444-6448(1993)中。微型三功能抗體和微型四功能抗體也描述于hudson等,nat.med.9:129-134(2003)中。如本文所用的術(shù)語“單克隆抗體”是指從大致上同質(zhì)抗體群體獲得的抗體，例如構(gòu)成所述群體的個別抗體是相同的，例外之處是可少量存在的可能突變，例如天然存在的突變。因此，修飾語“單克隆”將抗體的特性指示為不是個別抗體的混合物。在某些實施方案中，這種單克隆抗體通常包括包含結(jié)合靶標(biāo)的多肽序列的抗體，其中靶標(biāo)結(jié)合性多肽序列通過包括從多種多肽序列選擇單一靶標(biāo)結(jié)合性多肽序列的方法來獲得。舉例來說，選擇方法可為從多種克隆諸如一池雜交瘤克隆、噬菌體克隆或重組dna克隆選擇獨特克隆。應(yīng)了解可進一步改變所選靶標(biāo)結(jié)合性序列例如以改進對靶標(biāo)的親和力，使靶標(biāo)結(jié)合性序列人源化，改進它在細(xì)胞培養(yǎng)物中的產(chǎn)生，降低它的體內(nèi)免疫原性，產(chǎn)生多特異性抗體等，并且包含改變的靶標(biāo)結(jié)合性序列的抗體也是本公開的單克隆抗體。不同于通常包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制劑，單克隆抗體制劑的各單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。除它們的特異性之外，單克隆抗體制劑在它們通常未受其它免疫球蛋白污染方面也是有利的。修飾語“單克隆”將抗體的特性指示為從大致上同質(zhì)抗體群體獲得，并且不應(yīng)解釋為需要通過任何特定方法來產(chǎn)生抗體。舉例來說，待根據(jù)本公開使用的單克隆抗體可通過多種技術(shù)制備，包括例如在原核宿主細(xì)胞中表達，雜交瘤方法(例如kohler和milstein,nature,256:495-97(1975)；hongo等,hybridoma,14(3):253-260(1995)，harlow等,antibodies:alaboratorymanual,(coldspringharborlaboratorypress,第2版1988)；hammerling等,monoclonalantibodiesandt-cellhybridomas563-681(elsevier,n.y.,1981))，重組dna方法(參見例如美國專利號4,816,567)，噬菌體展示技術(shù)(參見例如clackson等,nature,352:624-628(1991)；marks等,j.mol.biol.222:581-597(1992)；sidhu等,j.mol.biol.338(2):299-310(2004)；lee等,j.mol.biol.340(5):1073-1093(2004)；fellouse,proc.natl.acad.sci.usa101(34):12467-12472(2004)；以及l(fā)ee等,j.immunol.methods284(1-2):119-132(2004)，以及用于在具有編碼人免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因座或基因的部分或全部的動物中產(chǎn)生人抗體或人樣抗體的技術(shù)(參見例如wo1998/24893；wo1996/34096；wo1996/33735；wo1991/10741；jakobovits等,proc.natl.acad.sci.usa90:2551(1993)；jakobovits等,nature362:255-258(1993)；bruggemann等,yearinimmunol.7:33(1993)；美國專利號5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；和5,661,016；marks等,bio/technology10:779-783(1992)；lonberg等,nature368:856-859(1994)；morrison,nature368:812-813(1994)；fishwild等,naturebiotechnol.14:845-851(1996)；neuberger,naturebiotechnol.14:826(1996)；以及l(fā)onberg和huszar,intern.rev.immunol.13:65-93(1995)。本文單克隆抗體明確包括“嵌合”抗體，其中一部分重鏈和/或輕鏈與源于特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或子類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的其余部分與源于另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或子類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，以及所述抗體的片段，只要它們展現(xiàn)所需生物活性即可(參見例如美國專利號4,816,567；以及morrison等,proc.natl.acad.sci.usa81:6851-6855(1984))。嵌合抗體包括抗體，其中抗體的抗原結(jié)合區(qū)源于通過例如用目標(biāo)抗原使獼猴免疫所產(chǎn)生的抗體。非人(例如鼠類)抗體的“人源化”形式是含有源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗體。在一個實施方案中，人源化抗體是人免疫球蛋白(接受者抗體)，其中來自接受者的hvr的殘基被來自非人物種(供者抗體)諸如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類動物的hvr的具有所需特異性、親和力和/或能力的殘基替換。在一些情況下，人免疫球蛋白的fr殘基被相應(yīng)非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含不見于接受者抗體中或供者抗體中的殘基?？蛇M行這些修飾以進一步改善抗體性能。一般來說，人源化抗體將包含大致上全部至少一個，并且通常兩個可變結(jié)構(gòu)域，其中全部或大致上全部高變環(huán)對應(yīng)于非人免疫球蛋白的那些，并且全部或大致上全部fr是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗體任選也將包含至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)(fc)，通常是人免疫球蛋白的至少一部分恒定區(qū)。對于進一步細(xì)節(jié)，參見例如jones等,nature321:522-525(1986)；riechmann等,nature332:323-329(1988)；以及presta,curr.op.struct.biol.2:593-596(1992)。也參見例如vaswani和hamilton,ann.allergy,asthma&immunol.1:105-115(1998)；harris,biochem.soc.transactions23:1035-1038(1995)；hurle和gross,curr.op.biotech.5:428-433(1994)；以及美國專利號6,982,321和7,087,409?！叭丝贵w”是具有對應(yīng)于由人產(chǎn)生和/或已使用如本文公開的用于制備人抗體的任何技術(shù)制備的抗體的氨基酸序列的氨基酸序列的抗體。對人抗體的這個定義明確排除包含非人抗原結(jié)合殘基的人源化抗體?？墒褂帽绢I(lǐng)域中已知的各種技術(shù)包括噬菌體展示文庫來產(chǎn)生人抗體。hoogenboom和winter,j.mol.biol.,227:381(1991)；marks等,j.mol.biol.,222:581(1991)。也可用于制備人單克隆抗體的是cole等,monoclonalantibodiesandcancertherapy,alanr.liss,第77頁(1985)；boerner等,j.immunol.,147(1):86-95(1991)中所述的方法。也參見vandijk和vandewinkel,curr.opin.pharmacol.,5:368-74(2001)?？赏ㄟ^向轉(zhuǎn)基因動物施用抗原來制備人抗體，所述轉(zhuǎn)基因動物已被修飾來應(yīng)答于抗原激發(fā)產(chǎn)生所述抗體，但其內(nèi)源性基因座已被失能，例如經(jīng)免疫異種小鼠(關(guān)于xenomousetm技術(shù)，參見例如美國專利號6,075,181和6,150,584)。關(guān)于通過人b細(xì)胞雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的人抗體，也參見例如li等,proc.natl.acad.sci.usa,103:3557-3562(2006)?！拔锓N依賴性抗體”是對來自第一哺乳動物物種的抗原具有的結(jié)合親和力比它對那個抗原的來自第二哺乳動物物種的同源物具有的結(jié)合親和力強烈的抗體。通常，物種依賴性抗體“特異性結(jié)合”人抗原(例如具有至多約1x10-7m，優(yōu)選至多約1x10-8m，并且優(yōu)選至多約1x10-9m的結(jié)合親和力(kd)值)，但對所述抗原的來自第二非人哺乳動物物種的同源物具有比它對所述人抗原的結(jié)合親和力弱至少約50倍，或至少約500倍，或至少約1000倍的結(jié)合親和力。物種依賴性抗體可為如上定義的各種類型的抗體中的任一種，但優(yōu)選是人源化抗體或人抗體。術(shù)語“高變區(qū)”、“hvr”或“hv”當(dāng)在本文中使用時是指抗體可變結(jié)構(gòu)域的在序列方面高度可變和/或形成結(jié)構(gòu)確定的環(huán)的區(qū)域。通常，抗體包含六個hvr；三個在vh中(h1、h2、h3)，并且三個在vl中(l1、l2、l3)。在天然抗體中，h3和l3顯示六個hvr的最大多樣性，并且特定來說據(jù)信h3在對抗體賦予精細(xì)特異性方面起獨特作用。參見例如xu等,immunity13:37-45(2000)；johnson和wu,methodsinmolecularbiology248:1-25(lo編,humanpress,totowa,n.j.,2003)。實際上，天然存在的僅由重鏈組成的駱駝科動物抗體在不存在輕鏈下具有功能性和穩(wěn)定性。參見例如hamers-casterman等,nature363:446-448(1993)；sheriff等,naturestruct.biol.3:733-736(1996)。許多hvr描繪處于使用中，并且涵蓋在本文中。kabat互補決定區(qū)(cdr)基于序列可變性，并且被最通常使用(kabat等,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第5版publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1991))。chothia改為涉及結(jié)構(gòu)環(huán)的位置(chothia和leskj.mol.biol.196:901-917(1987))。abmhvr代表kabathvr與chothia結(jié)構(gòu)環(huán)之間的折中，并且由oxfordmolecular的abm抗體建模軟件使用?！敖佑|”hvr基于對可用復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)的分析。以下指示來自這些hvr各自的殘基。表1a.抗體高變區(qū)hvr可包括如下“延伸hvr”：vl中的24-36或24-34(l1)、46-56或50-56(l2)和89-97或89-96(l3)，以及vh中的26-35(h1)、50-65或49-65(h2)和93-102、94-102或95-102(h3)。對于這些定義各自，可變結(jié)構(gòu)域殘基根據(jù)kabat等(上文)加以編號?！翱蚣堋被颉癴r”殘基是除如本文定義的hvr殘基以外的那些可變結(jié)構(gòu)域殘基。術(shù)語“如按照kabat的可變結(jié)構(gòu)域殘基編號”或“如按照kabat的氨基酸位置編號”及其變化形式是指kabat等(上文)中匯編抗體時用于重鏈可變結(jié)構(gòu)域或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的編號系統(tǒng)。使用這個編號系統(tǒng)，實際線性氨基酸序列可含有對應(yīng)于可變結(jié)構(gòu)域的fr或hvr的縮短或向其中的插入的較少或額外氨基酸。舉例來說，重鏈可變結(jié)構(gòu)域可包括在h2的殘基52之后的單一氨基酸插入物(根據(jù)kabat的殘基52a)和在重鏈fr殘基82之后的插入殘基(例如根據(jù)kabat的殘基82a、82b和82c等)。對于給定抗體，可通過在具有同源性的區(qū)域處將抗體序列與“標(biāo)準(zhǔn)”kabat編號序列進行比對來確定殘基的kabat編號。kabat編號系統(tǒng)通常在涉及可變結(jié)構(gòu)域中的殘基(近似是輕鏈的殘基1-107和重鏈的殘基1-113)時使用(例如kabat等,sequencesofimmunologicalinterest.第5版publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1991))?！癳u編號系統(tǒng)”或“eu索引”通常在涉及免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)中的殘基時使用(例如kabat等(上文)中報道的eu索引)?！叭绨凑誯abat的eu索引”是指對人igg1eu抗體的殘基編號。表述“線性抗體”是指zapata等(1995proteineng,8(10):1057-1062)中所述的抗體。簡要來說，這些抗體包含一對串聯(lián)fd區(qū)段(vh-ch1-vh-ch1)，其連同互補輕鏈多肽一起形成一對抗原結(jié)合區(qū)。線性抗體可為雙特異性的或單特異性的。ii.分子優(yōu)化本文提供通過以下方式來在原核宿主細(xì)胞中產(chǎn)生含有兩條鏈的多肽的方法：培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞以表達所述多肽的所述兩條鏈，其中在表達后，所述兩條鏈折疊并裝配以在所述宿主細(xì)胞中形成生物活性多肽；其中所述宿主細(xì)胞含有多核苷酸，其包括(1)編碼所述多肽的第一鏈的第一翻譯單元；(2)編碼所述多肽的第二鏈的第二翻譯單元；和(3)編碼至少一種選自肽基-脯氨?；悩?gòu)酶、蛋白質(zhì)二硫化物氧化還原酶及其組合的伴侶蛋白的第三翻譯單元。本文也提供通過以下方式來在原核宿主細(xì)胞中產(chǎn)生含有兩條鏈的多肽的方法：培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞以表達所述多肽的所述兩條鏈，其中在表達后，所述兩條鏈折疊并裝配以在所述宿主細(xì)胞中形成生物活性多肽；其中所述宿主細(xì)胞含有多核苷酸，其包括(1)編碼所述多肽的第一鏈的第一翻譯單元；(2)編碼所述多肽的第二鏈的第二翻譯單元；(3)編碼第一伴侶蛋白的第三翻譯單元；(4)編碼第二伴侶蛋白的第四翻譯單元；和(5)編碼第三伴侶蛋白的第五翻譯單元，其中所述第一、第二和第三伴侶蛋白選自肽基-脯氨?；悩?gòu)酶、蛋白質(zhì)二硫化物氧化還原酶及其組合。在一些實施方案中，培養(yǎng)宿主細(xì)胞以表達多肽的兩條鏈，其中在表達后，兩條鏈折疊并裝配以在所述宿主細(xì)胞中形成生物活性多肽。如本文所用，雙鏈折疊和裝配可指促進最終采用適當(dāng)三維雙鏈蛋白質(zhì)構(gòu)象、雙鏈蛋白質(zhì)裝配或兩者的任何或所有步驟。折疊和裝配可指各鏈折疊和裝配成它的適當(dāng)構(gòu)象和折疊，或它可指兩個蛋白質(zhì)鏈通過分子間鍵聯(lián)所產(chǎn)生的復(fù)合物的折疊和裝配。類似地，各鏈可折疊并裝配以形成生物活性多肽，或兩個蛋白質(zhì)鏈通過分子間鍵聯(lián)所產(chǎn)生的復(fù)合物可折疊并裝配以整體形成生物活性多肽。生物活性多肽可指能夠執(zhí)行歸于所述多肽的功能的任何多肽。生物活性多肽的功能可包括不限于適當(dāng)折疊或裝配，與另一大分子結(jié)合或其它相互作用，以及酶活性。作為說明，生物活性抗體可指能夠執(zhí)行至少一種歸于抗體的功能的抗體，所述功能包括不限于結(jié)合表位或具有抗體fc區(qū)的性質(zhì)，如以下進一步詳細(xì)所述。伴侶蛋白在一些實施方案中，本公開的多核苷酸含有編碼至少一種伴侶蛋白的翻譯單元。如上所述，伴侶蛋白可指有助于其它大分子包括不限于雙鏈蛋白質(zhì)的折疊或裝配的任何蛋白質(zhì)。伴侶蛋白的實例可包括不限于肽基-脯氨酰基異構(gòu)酶、蛋白質(zhì)二硫化物氧化還原酶和熱休克蛋白(諸如hsp60、hsp70、hsp90和hsp100蛋白)。伴侶蛋白也可有助于跨膜轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)，例如使多肽鏈跨越質(zhì)膜或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜進行易位。在一些實施方案中，伴侶蛋白可為肽基-脯氨?；悩?gòu)酶。肽基-脯氨?；悩?gòu)酶(術(shù)語“脯氨酰基異構(gòu)酶”、“旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶”和“ppi酶”可在本文中可互換使用)可指催化脯氨酸或脯氨酰基-亞氨基肽鍵的順式和反式異構(gòu)體的相互轉(zhuǎn)化的任何酶。這個反應(yīng)的ec編號是ec5.2.1.8。已知或預(yù)測會催化由這個ec編號描述的反應(yīng)的任何蛋白質(zhì)都可為本公開的肽基-脯氨?；悩?gòu)酶。肽基-脯氨?；悩?gòu)酶活性也可由go術(shù)語標(biāo)識符go:0003755描述。已知或預(yù)測會具有由這個go術(shù)語標(biāo)識符描述的分子功能的任何蛋白質(zhì)都可為本公開的肽基-脯氨?；悩?gòu)酶。在本領(lǐng)域中已知用以促進蛋白質(zhì)折疊和裝配的肽基-脯氨酰基異構(gòu)酶活性。在一些實施方案中，對于其適當(dāng)折疊結(jié)構(gòu)包括順式脯氨?；I的蛋白質(zhì)，肽基-脯氨酰基異構(gòu)酶可通過使反式脯氨?；I轉(zhuǎn)化成順式脯氨酰基鍵來有助于蛋白質(zhì)折疊和裝配。也已知一些肽基-脯氨?；悩?gòu)酶會增強缺乏順式脯氨?；I的蛋白質(zhì)的折疊和裝配(bothmannh和pluckthuna2000j.biol.chem.275:17100)。在一些實施方案中，肽基-脯氨?；悩?gòu)酶可有助于缺乏順式脯氨?；I的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)折疊和裝配。因此，盡管肽基-脯氨?；悩?gòu)酶活性可充當(dāng)用以鑒定適用于本文所述的方法的伴侶蛋白的功能特征，但肽基-脯氨?；悩?gòu)酶的效用未必限于它的催化活性本身。在一些實施方案中，肽基-脯氨酰基異構(gòu)酶是fkpa蛋白。在一些實施方案中，fkpa蛋白是大腸桿菌fkpa。大腸桿菌fkpa可指由屬于大腸桿菌物種的細(xì)菌的任何菌株或分離株中的fkpa基因編碼的任何多肽。在一些實施方案中，大腸桿菌fkpa是指由用ecogene登記號eg12900描述的fkpa基因編碼的蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，大腸桿菌fkpa是指具有由ncbirefseq登記號np_417806描述的序列的蛋白質(zhì)。其它fkpa蛋白在本領(lǐng)域中是已知的。fkpa蛋白的實例可包括不限于鮑氏志賀菌(s.boydii)肽基-脯氨?；悩?gòu)酶(ncbirefseq編號wp_000838252)、楊氏檸檬酸桿菌(c.youngae)肽基-脯氨酰基異構(gòu)酶(ncbirefseq編號wp_006687366)、奧克西托克雷白桿菌(k.oxytoca)肽基-脯氨?；悩?gòu)酶(ncbirefseq編號wp_004125943)、腸道沙門菌(s.enterica)肽基-脯氨酰基異構(gòu)酶(ncbirefseq編號wp_000838233)、肺炎克雷伯氏菌(k.pneumoniae)肽基-脯氨?；悩?gòu)酶(ncbirefseq編號wp_019704642)、釀酒酵母(s.cerevisiae)fpr3p(ncbirefseq編號np_013637)、小家鼠(m.musculus)fkpb1a(ncbirefseq編號np_032045)、小家鼠fkpb2(ncbirefseq編號np_032046)、智人(h.sapiens)fkbp2(ncbirefseq編號np_001128680)和黑腹果蠅(d.melanogaster)cg14715(ncbirefseq編號np_650101)。在一些實施方案中，本公開的fkpa蛋白與大腸桿菌fkpa具有至少約80％、至少約81％、至少約82％、至少約83％、至少約84％、至少約85％、至少約86％、至少約87％、至少約88％、至少約89％、至少約90％、至少約91％、至少約92％、至少約93％、至少約94％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％或至少約99％同一性。在一些實施方案中，伴侶蛋白可為蛋白質(zhì)二硫化物氧化還原酶。蛋白質(zhì)二硫化物氧化還原酶(術(shù)語“蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶”和“硫醇-二硫化物異構(gòu)酶”可在本文中可互換使用)可指催化蛋白質(zhì)中二硫鍵的重排的任何酶。舉例來說，蛋白質(zhì)二硫化物氧化還原酶可催化半胱氨酸的氧化以在蛋白質(zhì)中形成二硫鍵。蛋白質(zhì)二硫化物氧化還原酶也可催化蛋白質(zhì)中錯誤配對的二硫鍵的異構(gòu)化。這個反應(yīng)的ec編號是ec5.3.4.1。已知或預(yù)測會催化由這個ec編號描述的反應(yīng)的任何蛋白質(zhì)都可為本公開的蛋白質(zhì)二硫化物氧化還原酶。蛋白質(zhì)二硫化物氧化還原酶活性也可由go術(shù)語標(biāo)識符go:0015035描述。已知或預(yù)測會具有由這個go術(shù)語標(biāo)識符描述的分子功能的任何蛋白質(zhì)都可為本公開的蛋白質(zhì)二硫化物氧化還原酶。在本領(lǐng)域中已知用以促進蛋白質(zhì)折疊和裝配的蛋白質(zhì)二硫化物氧化還原酶活性。舉例來說，蛋白質(zhì)二硫化物氧化還原酶活性促進在蛋白質(zhì)折疊和裝配期間形成適當(dāng)分子內(nèi)和分子間二硫鍵。特定來說，蛋白質(zhì)二硫化物氧化還原酶活性對于在原核細(xì)胞的周質(zhì)中表達的具有二硫鍵的蛋白質(zhì)是重要的。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)二硫化物氧化還原酶是dsba蛋白。在一些實施方案中，dsba蛋白是大腸桿菌dsba。大腸桿菌dsba可指由屬于大腸桿菌物種的細(xì)菌的任何菌株或分離株中的dsba基因編碼的任何多肽。在一些實施方案中，大腸桿菌dsba是指由用ecogene登記號eg11297描述的dsba基因編碼的蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，大腸桿菌dsba是指具有由ncbirefseq登記號np_418297描述的序列的蛋白質(zhì)。其它dsba蛋白在本領(lǐng)域中是已知的。dsba蛋白的實例可包括不限于福氏志賀菌(s.flexneri)硫醇-二硫化物異構(gòu)酶(ncbirefseq編號wp_000725335)、痢疾志賀菌(s.dysenteriae)硫醇-二硫化物異構(gòu)酶(ncbirefseq編號wp_000725348)、楊氏檸檬酸桿菌硫醇-二硫化物異構(gòu)酶(ncbirefseq編號wp_006686108)和腸道沙門菌硫醇-二硫化物異構(gòu)酶(ncbirefseq編號wp_023240584)。在一些實施方案中，本公開的dsba蛋白與大腸桿菌dsba具有至少約80％、至少約81％、至少約82％、至少約83％、至少約84％、至少約85％、至少約86％、至少約87％、至少約88％、至少約89％、至少約90％、至少約91％、至少約92％、至少約93％、至少約94％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％或至少約99％同一性。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)二硫化物氧化還原酶是dsbc蛋白。在一些實施方案中，dsbc蛋白是大腸桿菌dsbc。大腸桿菌dsbc可指由屬于大腸桿菌物種的細(xì)菌的任何菌株或分離株中的dsbc基因編碼的任何多肽。在一些實施方案中，大腸桿菌dsbc是指由用ecogene登記號eg11070描述的dsbc基因編碼的蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，大腸桿菌dsbc是指具有由ncbirefseq登記號np_417369描述的序列的蛋白質(zhì)。其它dsbc蛋白在本領(lǐng)域中是已知的。dsbc蛋白的實例可包括不限于宋內(nèi)志賀菌(s.sonnei)蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶(ncbirefseq編號wp_000715206)、痢疾志賀菌蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶(ncbirefseq編號wp_000715209)、費格森埃希氏菌(e.fergusonii)蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶(ncbirefseq編號wp_000715225)、邦戈沙門菌(s.bongori)硫醇:二硫化物互換蛋白質(zhì)dsbc(ncbirefseq編號wp_020845161)和腸道沙門菌蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶dsbc(ncbirefseq編號wp_023183515)。在一些實施方案中，本公開的dsbc蛋白與大腸桿菌dsbc具有至少約80％、至少約81％、至少約82％、至少約83％、至少約84％、至少約85％、至少約86％、至少約87％、至少約88％、至少約89％、至少約90％、至少約91％、至少約92％、至少約93％、至少約94％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％或至少約99％同一性。為確定兩個氨基酸序列或兩個核酸序列的同一性百分比，出于最優(yōu)比較目的來比對序列(例如可在第一和第二氨基酸或核酸序列中的一者或兩者中引入空位以達成最優(yōu)比對，并且可出于比較目的來忽視非同源性序列)。在一個實施方案中，參照序列的出于比較目的加以比對的長度是所述參照序列的長度的至少50％，通常是至少75％，并且甚至更通常是至少80％、85％、90％、95％或100％。接著比較在相應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置處的氨基酸殘基或核苷酸。當(dāng)?shù)谝恍蛄兄械奈恢糜膳c第二序列中的相應(yīng)位置相同的氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)時，那么分子在那個位置處是同一的(如本文所用，氨基酸或核酸“同一性”等效于氨基酸或核酸“同源性”)。兩個序列之間的同一性百分比是在考慮需要被引入以達成兩個序列的最優(yōu)比對的空位的數(shù)目和各空位的長度的情況下，由序列共有的同一位置的數(shù)目的函數(shù)。對于序列比較，通常一個序列充當(dāng)測試序列與其進行比較的參照序列。當(dāng)使用序列比較算法時，將測試序列和參照序列輸入計算機中，必要時指定子序列坐標(biāo)，并且指定序列算法程序參數(shù)?？墒褂萌笔〕绦騾?shù)，或可指定替代性參數(shù)。序列比較算法接著基于程序參數(shù)計算測試序列相對于參照序列的序列同一性百分比。當(dāng)比較兩個序列以獲得同一性時，并不需要序列是連續(xù)的，但任何空位都將攜帶與它相伴的將降低總體同一性百分比的罰分。對于blastn，缺省參數(shù)是空位開放罰分＝5以及空位延伸罰分＝2。對于blastp，缺省參數(shù)是空位開放罰分＝11以及空位延伸罰分＝1。如本文所用的“比較窗”包括提及具有選自由20至600、通常約50至約200、更通常約100至約150組成的組的任一數(shù)目的連續(xù)位置的區(qū)段，其中在最優(yōu)對準(zhǔn)兩個序列之后，可將序列與具有相同數(shù)目的連續(xù)位置的參照序列進行比較。比對供比較的序列的方法在本領(lǐng)域中是熟知的?？墒褂靡阎惴ㄟM行供比較的序列的最優(yōu)比對(例如通過smith和waterman,advapplmath,2:482,1981的局部同源性算法；通過needleman和wunsch,jmolbiol,48:443,1970的同源性比對算法；通過pearson和lipman,procnatlacadsciusa,85:2444,1988的類似性搜索方法；通過wisconsingenetics軟件包(geneticscomputergroup,madison,wi)中這些算法的計算機化執(zhí)行程序fastdb(intelligenetics)、blast(nationalcenterforbiomedicalinformation)、gap、bestfit、fasta和tfasta，或通過手動比對和目視檢查)。適于確定序列同一性百分比和序列類似性百分比的的算法的一優(yōu)選實例是fasta算法(pearson和lipman,procnatlacadsciusa,85:2444,1988；以及pearson,methodsenzymol,266:227-258,1996)。在dna序列的fasta比對中用于計算同一性百分比的優(yōu)選參數(shù)是優(yōu)化的，bl50矩陣15:-5，k元組＝2；接合罰分＝40，優(yōu)化＝28；空位罰分-12，空位長度罰分＝-2；以及寬度＝16。適于確定序列同一性百分比和序列類似性百分比的算法的另一優(yōu)選實例是blast和blast2.0算法(分別altschul等,nucacidsres,25:3389-3402,1977；以及altschul等,jmolbiol,215:403-410,1990)。以本文所述的參數(shù)使用blast和blast2.0以確定本公開的核酸和蛋白質(zhì)的序列同一性百分比。用于進行blast分析的軟件可通過國家生物技術(shù)信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation)網(wǎng)站公開獲得。這個算法涉及首先通過鑒定查詢序列中長度是w的短字符來鑒定高分序列對(hsp)，所述短字符在與數(shù)據(jù)庫序列中具有相同長度的字符比對時匹配或滿足某一正值閾值評分t。t被稱為鄰近字符評分閾值。這些初始鄰近字符命中物充當(dāng)用于引發(fā)搜索以發(fā)現(xiàn)含有它們的較長hsp的種子。字符命中物在兩個方向上沿各序列延伸直至累積比對評分可得以增加。對于核苷酸序列，使用參數(shù)m(一對匹配殘基的獎勵評分；始終>0)和n(錯配殘基的懲罰評分；始終<0)來計算累積評分。對于氨基酸序列，評分矩陣用于計算累積評分。在以下情況時停止字符命中物在各方向上的延伸：累積比對評分從它的最大實現(xiàn)值減少了數(shù)量x；由于一個或多個負(fù)評分殘基比對的積累，累積評分達到零或低于零；或到達任一序列的末端。blast算法參數(shù)w、t和x決定比對的靈敏度和速度。blastn程序(針對核苷酸序列)使用字長(w)11、預(yù)期值(e)10、m＝5、n＝-4以及比較兩條鏈作為缺省值。對于氨基酸序列，blastp程序使用字長3和預(yù)期值(e)10、以及blosum62評分矩陣(henikoff和henikoff,procnatlacadsciusa,89:10915,1989)比對值(b)50、預(yù)期值(e)10、m＝5、n＝-4和比較兩條鏈作為缺省值。blast算法也進行兩個序列之間的類似性的統(tǒng)計分析(參見例如karlin和altschul,procnatlacadsciusa,90:5873-5787,1993)。由blast算法提供的一種類似性量度是最小總和概率(p(n))，其提供對在兩個核苷酸或氨基酸序列之間將偶然發(fā)生匹配所具有的概率的指示。舉例來說，如果在測試核酸與參照核酸比較時的最小總和概率小于約0.2，更優(yōu)選小于約0.01，并且最優(yōu)選小于約0.001，那么核酸被視為與參照序列類似。適用算法的另一實例是pileup。pileup使用進行性成對比對由一組相關(guān)序列產(chǎn)生多序列比對以顯示關(guān)系和序列同一性百分比。它也繪制顯示用于產(chǎn)生比對的群集關(guān)系的樹或樹形圖。pileup使用進行性比對方法(feng和doolittle,jmolevol,35:351-360,1987)的簡化形式，采用與公開方法(higgins和sharp,cabios5:151-153,1989)類似的方法。程序可比對多達300個序列，各自具有5,000個核苷酸或氨基酸的最大長度。多重比對程序以兩個最類似序列的成對比對開始，從而產(chǎn)生兩個經(jīng)比對序列的集群。接著使這個集群與下一最相關(guān)序列或經(jīng)比對序列的集群比對。通過簡單延伸兩個個別序列的成對比對來比對兩個序列集群。通過一系列進行性成對比對來實現(xiàn)最終比對。通過指定序列比較區(qū)域的特定序列和它們的氨基酸或核苷酸坐標(biāo)，以及通過指定程序參數(shù)來運行程序。使用pileup，利用以下參數(shù)將參照序列與其它測試序列進行比較以確定序列同一性百分比關(guān)系：缺省空位權(quán)重(3.00)，缺省空位長度權(quán)重(0.10)，和加權(quán)末端空位。pileup可從例如7.0版gcg序列分析軟件包(devereaux等,nucacidsres,12:387-395,1984)獲得。適于多重dna和氨基酸序列比對的算法的另一優(yōu)選實例是clustalw程序(thompson等,nuclacids.res,22:4673-4680,1994)。clustalw在各組序列之間進行多重成對比較，并且基于同源性將它們匯編成多重比對?？瘴婚_放罰分和空位延伸罰分分別是10和0.05。對于氨基酸比對，blosum算法可用作蛋白質(zhì)權(quán)重矩陣(henikoff和henikoff,procnatlacadsciusa,89:10915-10919,1992)。表達盒和載體在一些實施方案中，宿主細(xì)胞含有多核苷酸，其包括(1)編碼多肽的第一鏈的第一翻譯單元；(2)編碼多肽的第二鏈的第二翻譯單元；和(3)編碼至少一種選自肽基-脯氨?；悩?gòu)酶、蛋白質(zhì)二硫化物氧化還原酶及其組合的伴侶蛋白的第三翻譯單元。在一些實施方案中，宿主細(xì)胞含有多核苷酸，其包括(1)編碼多肽的第一鏈的第一翻譯單元；(2)編碼多肽的第二鏈的第二翻譯單元；(3)編碼第一伴侶蛋白的第三翻譯單元；(4)編碼第二伴侶蛋白的第四翻譯單元；和(5)編碼第三伴侶蛋白的第五翻譯單元，其中所述第一、第二和第三伴侶蛋白選自肽基-脯氨酰基異構(gòu)酶、蛋白質(zhì)二硫化物氧化還原酶及其組合。本公開發(fā)現(xiàn)可使用單一質(zhì)粒系統(tǒng)(即含有編碼雙鏈蛋白質(zhì)的各鏈的翻譯單元和一個或多個編碼一種或多種伴侶蛋白的翻譯單元的單一多核苷酸)或可相容質(zhì)粒系統(tǒng)(即含有編碼雙鏈蛋白質(zhì)的各鏈的翻譯單元的第一多核苷酸和含有一個或多個編碼一種或多種伴侶蛋白的翻譯單元的第二多核苷酸)實現(xiàn)適當(dāng)折疊和裝配的雙鏈蛋白質(zhì)的產(chǎn)生增加。在一些實施方案中，多核苷酸進一步含有啟動子的三個拷貝，其中第一拷貝與第一翻譯單元可操作組合，第二拷貝與第二翻譯單元可操作組合，并且第三拷貝與第三翻譯單元可操作組合以驅(qū)動第一鏈、第二鏈和伴侶蛋白的轉(zhuǎn)錄。在一些實施方案中，編碼三種伴侶蛋白中的兩種的兩個翻譯單元是單一翻譯單元的一部分。在一些實施方案中，多核苷酸進一步含有與各翻譯單元可操作組合的啟動子。在一些實施方案中，啟動子是誘導(dǎo)型啟動子。如上所述，誘導(dǎo)型啟動子的活性響應(yīng)于信號而增加或降低。舉例來說，誘導(dǎo)型啟動子可響應(yīng)于存在信號諸如iptg而促進轉(zhuǎn)錄。誘導(dǎo)型啟動子可響應(yīng)于不存在信號諸如磷酸鹽而促進轉(zhuǎn)錄。在這些方案中的任一個中，轉(zhuǎn)錄的量可或可不與信號的量或其缺乏度成比例。適于原核宿主細(xì)胞的誘導(dǎo)型啟動子的眾多實例在本領(lǐng)域中是已知的。這些可包括不限于lac、tac、trc、trp、pho、reca、teta、nar、噬菌體pl、cspa、t7和pbad啟動子(對于更詳細(xì)描述，參見terpek.2006appl.microbiol.biotechnol.72:211)。在一些實施方案中，誘導(dǎo)型啟動子的三個拷貝用于以協(xié)調(diào)方式驅(qū)動單獨翻譯單元例如雙鏈蛋白質(zhì)的兩條鏈和伴侶蛋白的表達。在一些實施方案中，誘導(dǎo)型啟動子是iptg誘導(dǎo)型啟動子。iptg誘導(dǎo)型啟動子可指以對異丙基β-d-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(iptg)或能夠促進從lac操縱元轉(zhuǎn)錄的任何其它乳糖衍生物(例如異乳糖)起響應(yīng)的方式促進轉(zhuǎn)錄的任何多核苷酸序列。iptg誘導(dǎo)型啟動子的許多實例在本領(lǐng)域中是已知的，包括不限于tac(例如taci、tacii等)啟動子、lac啟動子及其衍生物(例如lacuv5、taclac等)。在一些實施方案中，誘導(dǎo)型啟動子是驅(qū)動第一鏈、第二鏈和伴侶蛋白的轉(zhuǎn)錄的iptg誘導(dǎo)型啟動子。本公開驚人地發(fā)現(xiàn)調(diào)控伴侶蛋白的表達的iptg誘導(dǎo)型啟動子可在不通過iptg來誘導(dǎo)下，在相較于所述伴侶蛋白在通過iptg來誘導(dǎo)所述iptg誘導(dǎo)型啟動子時的表達，促進更高產(chǎn)物效價的水平下促進所述伴侶蛋白的表達。在一些實施方案中，誘導(dǎo)型啟動子是當(dāng)培養(yǎng)基中的磷酸鹽已耗盡時驅(qū)動第一鏈、第二鏈和伴侶蛋白的轉(zhuǎn)錄的pho啟動子。pho啟動子可指以對細(xì)胞外磷酸鹽(例如無機磷酸鹽)起響應(yīng)的方式促進轉(zhuǎn)錄的任何多核苷酸序列。舉例來說，大腸桿菌中的磷酸鹽(pho)調(diào)控元包括感應(yīng)細(xì)胞外磷酸鹽，并且響應(yīng)于磷酸鹽水平來通過pho啟動子調(diào)控眾多下游基因的表達的蛋白質(zhì)組分(對于更詳細(xì)描述，參見hsiehyj和wannerbl2010curr.opin.microbiol.13(2):198)。當(dāng)使細(xì)菌在培養(yǎng)基中生長時，已知這個pho調(diào)控元的表達在培養(yǎng)基中有磷酸鹽(例如無機磷酸鹽pi)可用時被阻遏，并且在磷酸鹽已耗盡時被誘導(dǎo)。用于本文所述的方法中的pho啟動子的一個非限制性實例是大腸桿菌phoa啟動子。這個啟動子在本領(lǐng)域中被廣泛知曉和使用來以依賴于細(xì)胞培養(yǎng)基中磷酸鹽的濃度的方式調(diào)控原核宿主細(xì)胞中的重組蛋白表達(對于更詳細(xì)描述，參見lubkec等1995enzymemicrob.technol.17(10):923)。在一些實施方案中，多核苷酸進一步含有可選擇標(biāo)記，并且培養(yǎng)基包括使用單一抗生素的選擇劑以致使宿主細(xì)胞維持多核苷酸。有利的是，本文所述的方法允許在共表達一種或多種伴侶蛋白以使編碼這些組分各自的翻譯單元全都包括在單一多核苷酸(例如如本文所述的表達質(zhì)?；騿我毁|(zhì)粒系統(tǒng))中的情況下產(chǎn)生雙鏈蛋白質(zhì)的各鏈。這種系統(tǒng)的優(yōu)勢是因為這些組分都由同一質(zhì)粒編碼，所以僅需要一種可選擇標(biāo)記來在原核宿主細(xì)胞中維持這些多核苷酸?？蛇x擇標(biāo)記可指編碼在細(xì)胞經(jīng)受選擇時促進宿主細(xì)胞的存活的蛋白質(zhì)的任何多核苷酸，所述選擇即用于相對于缺乏可選擇標(biāo)記的細(xì)胞的豐度，優(yōu)先增加攜帶可選擇標(biāo)記的細(xì)胞的豐度的任何條件?？蛇x擇標(biāo)記的實例是在抗生素存在下促進宿主細(xì)胞存活的基因。眾多可選擇標(biāo)記和使用單一抗生素的相應(yīng)選擇劑在本領(lǐng)域中是已知的。舉例且不加限制地來說，許多可選擇標(biāo)記和相應(yīng)抗生素被描述和引用于jangcw和magnusont2013plosone8(2):e57075中。在一些實施方案中，可選擇標(biāo)記可指彌補宿主細(xì)胞的基因組內(nèi)存在的基因缺失的基因(例如從質(zhì)粒表達的基因)。在這些實例的情況下，當(dāng)細(xì)胞經(jīng)受選擇(即在需要從宿主基因組缺失的基因的活性的條件下生長)時，由質(zhì)粒供給的基因的拷貝彌補宿主基因組的缺陷，由此選擇攜帶外源性彌補基因的細(xì)胞。所述基因可包括為產(chǎn)生細(xì)胞培養(yǎng)基中缺乏的特定營養(yǎng)物所需的營養(yǎng)缺陷標(biāo)記或基因，其實例進一步描述于本文中。以下進一步描述若干示例性可選擇標(biāo)記和抗生素。在一些實施方案中，第一翻譯單元包括第一翻譯起始區(qū)(tir)與第一鏈的編碼區(qū)可操作組合，并且第二翻譯單元包括第二翻譯起始區(qū)(tir)與第二鏈的編碼區(qū)可操作組合。已知翻譯起始區(qū)(tir)對于重組蛋白在原核宿主細(xì)胞中的翻譯是重要的(參見例如simmonslc和yansuradg1996nat.biotechnol.14:629以及vimbergv等2007bmcmol.biol.8:100)。tir可決定翻譯單元的翻譯效率。tir通常包括翻譯單元特征物諸如起始密碼子、shine-dalgarno(sd)序列和翻譯增強子。tir可進一步包括編碼信號肽的分泌信號序列。tir的特征物之間的序列和間隔可調(diào)控翻譯起始效率。在一些實施方案中，第一tir和第二tir的相對翻譯強度是約1.0至約3.0。本文描述包括編碼雙鏈蛋白質(zhì)的各鏈的翻譯單元的載體，并且各翻譯單元可包括tir。如本文所用，“翻譯強度”可指通過使翻譯單元翻譯所達成的多肽的產(chǎn)生。這個產(chǎn)生可取決于許多特征，包括不限于mrna翻譯、mrna穩(wěn)定性、核糖體結(jié)合mrna的效率、以及由此編碼的多肽的折疊、裝配和/或易位。相對翻譯強度可指相較于由具有野生型或?qū)φ誸ir的翻譯單元編碼的多肽的產(chǎn)生，由具有特定或?qū)嶒瀟ir的翻譯單元編碼的多肽的產(chǎn)生，此時所述實驗tir與所述對照tir兩者均由在相同條件下培養(yǎng)的類似原核宿主細(xì)胞(例如相同屬和種)表達。對tir的進一步描述可見于美國專利號8,361,744中。重組多肽本公開的某些方面涉及產(chǎn)生具有兩條鏈的多肽的方法。有利的是，本文所述的方法可適用于促進許多不同類型的蛋白質(zhì)，特別是具有二硫鍵的那些，諸如如上所述的雙鏈蛋白質(zhì)的表達、折疊和裝配。以下描述特定雙鏈蛋白質(zhì)，但本文所述的方法不限于這些特定實施方案。如本文所用，雙鏈蛋白質(zhì)可包括含有超過一個不同多肽鏈的蛋白質(zhì)。盡管本文所述的許多實施方案涉及具有兩個多肽鏈的雙鏈蛋白質(zhì)，但涵蓋具有超過兩個多肽鏈(例如三個或更多個多肽)的雙鏈蛋白質(zhì)，并且可通過本文所述的方法產(chǎn)生。如上所述，也涵蓋由單一多肽鏈構(gòu)成的雙鏈蛋白質(zhì)(例如單鏈抗體、單鏈可變片段等)，并且可通過本文所述的方法產(chǎn)生，所述雙鏈蛋白質(zhì)以另外方式如同如果它們是不同多肽鏈那么它們將表現(xiàn)的那樣進行締合。在一些實施方案中，本公開的雙鏈多肽的兩條鏈由至少一個二硫鍵彼此連接。二硫鍵可指連接兩個硫醇基團的任何共價鍵。多肽中的二硫鍵通常在半胱氨酸殘基的硫醇基團之間形成。本領(lǐng)域中已知多肽二硫鍵對于許多多肽諸如本公開的雙鏈蛋白質(zhì)的折疊和裝配是重要的。多肽二硫鍵可包括單一多肽鏈中半胱氨酸殘基之間的二硫鍵(即分子內(nèi)或鏈內(nèi)二硫鍵)。多肽二硫鍵也可包括見于單獨多肽鏈上的半胱氨酸殘基之間的二硫鍵(即分子間或鏈間二硫鍵)。因此，在一些實施方案中，雙鏈多肽的兩條鏈由至少一個二硫鍵彼此連接。本領(lǐng)域中已知二硫鍵對于抗體和抗體片段的折疊和裝配是重要的。已知不同抗體同種型和同種型內(nèi)的不同子類具有不同二硫鍵樣式。舉例來說，igg抗體可含有12個鏈內(nèi)二硫鍵，在各輕鏈和它的相應(yīng)重鏈之間的1個鏈間二硫鍵，以及視特定igg子類而定在重鏈之間的2個與11個之間的鏈間二硫鍵(對于更詳細(xì)描述，參見liuh和mayk2012mabs.4(1):17)。也已知igm(參見例如wiersmaej和shulmanmj1995j.immunol.154(10):5265)、ige(參見例如helmba等1991eur.j.immunol.21(6):1543)、iga(參見例如chintalacharuvukr等2002j.immunol.169(9):5072)和igd(參見例如shinsu等1992hum.antibodieshybridomas3(2):65)在折疊和裝配期間形成二硫鍵。在一些實施方案中，本公開的雙鏈多肽對于宿主細(xì)胞是異源性的。如本文所用，異源性多肽在關(guān)于宿主細(xì)胞使用時可指并不在所述宿主細(xì)胞中，即并不在從自然界分離所述宿主細(xì)胞時內(nèi)源性表達的任何多肽。異源性多肽也可指可由宿主細(xì)胞內(nèi)源性表達，但在不同于從自然界分離宿主細(xì)胞時的調(diào)控下表達的多肽。不同調(diào)控的實例可包括不限于不同表達量、響應(yīng)于不同刺激而表達、或任何其它改變的表達情形，諸如通過使用異源性啟動子諸如誘導(dǎo)型啟動子。在一些實施方案中，本公開的雙鏈多肽是異二聚體的單體。如本文所用，異二聚體可指含有兩個呈可操作連接的不同多肽或多肽復(fù)合物的任何多肽復(fù)合物。異二聚體的一非限制性實例是由兩個不同抗體單體(即呈可操作連接的輕鏈-重鏈對)組成的雙特異性或二價抗體。在這個實例的情況下，識別第一抗原的第一重鏈-輕鏈對的折疊和裝配產(chǎn)生第一抗體單體。識別第二抗原的第二重鏈-輕鏈對的折疊和裝配產(chǎn)生第二抗體單體。這些單體可通過本領(lǐng)域中已知的任何手段(以下關(guān)于雙特異性抗體更詳細(xì)描述)來裝配以形成異二聚體。對于有關(guān)異二聚抗體形成的說明性實例的更多細(xì)節(jié)，參見ridgwayjbb等1996proteineng.9(7):617。在一些實施方案中，本公開的雙鏈多肽是單價抗體，其中第一鏈和第二鏈代表免疫球蛋白重鏈和免疫球蛋白輕鏈。如本文所用，單價抗體可指由可操作地連接在一起以形成重鏈-輕鏈對的抗體重鏈和抗體輕鏈構(gòu)成的任何多肽復(fù)合物，其中所述重鏈-輕鏈對并不可操作地連接于第二重鏈-輕鏈對。術(shù)語“半抗體(hab)”可在本文中可互換使用。在一些實施方案中，本公開的單價抗體能夠特異性結(jié)合抗原。如本文所用，術(shù)語“結(jié)合”、“特異性結(jié)合”或“對…具有特異性”是指可測量和可重現(xiàn)的相互作用，諸如靶標(biāo)(即)與抗體之間的結(jié)合，所述結(jié)合確定在包括生物分子的分子的異質(zhì)群體存在下存在所述靶標(biāo)。舉例來說，結(jié)合或特異性結(jié)合靶標(biāo)(其可為表位)的抗體是相比于它結(jié)合其它靶標(biāo)，以更大親和力、親合力，更易于和/或以更久持續(xù)時間結(jié)合這個靶標(biāo)的抗體。在一個實施方案中，抗體結(jié)合無關(guān)靶標(biāo)的程度小于所述抗體與靶標(biāo)的結(jié)合的約10％，如例如通過放射免疫測定(ria)所測量。在某些實施方案中，特異性結(jié)合靶標(biāo)的抗體具有≤1μm、≤100nm、≤10nm、≤1nm或≤0.1nm的解離常數(shù)(kd)。在某些實施方案中，抗體特異性結(jié)合蛋白質(zhì)上在來自不同物種的蛋白質(zhì)之間保守的表位。在另一個實施方案中，特異性結(jié)合可包括但不要求排它性結(jié)合。在一些實施方案中，本公開的雙鏈多肽是分泌蛋白。如本文所用，分泌蛋白可指由宿主細(xì)胞分泌至宿主細(xì)胞周質(zhì)或細(xì)胞外環(huán)境中的任何蛋白質(zhì)。分泌蛋白可為由宿主細(xì)胞內(nèi)源性分泌的蛋白質(zhì)，或分泌蛋白可為不由宿主細(xì)胞內(nèi)源性分泌，但以促進它的分泌的方式加以修飾的蛋白質(zhì)。舉例來說，存在通常見于多肽的n末端的信號序列可將多肽引導(dǎo)至分泌路徑中以達成分泌。眾多信號序列在本領(lǐng)域中是已知的，并且可適用于促進分泌蛋白的分泌或允許不天然地由宿主細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)的分泌；參見例如picken等,infect.immun.42:269-275(1983)；simmons和yansura,naturebiotechnology14:629-634(1996)；以及humphreysdp等2000proteinexpr.purif.20(2):252。信號序列的一個非限制性實例是熱穩(wěn)定腸毒素(enterotoxin)ii(stii)信號序列。在一些實施方案中，本公開的雙鏈多肽是抗癌免疫動員單克隆t細(xì)胞受體(immtac)。immtac可指組合抗cd3單鏈抗體片段(或結(jié)合t細(xì)胞，并且活化t細(xì)胞應(yīng)答的類似抗體片段)與可溶性單克隆t細(xì)胞受體(tcr)的融合蛋白。在一些實施方案中，immtac的可溶性單克隆tcr可經(jīng)工程化以相較于尚未工程改造的tcr(例如天然存在的tcr)對特定抗原的親和力，對所述抗原具有增加的親和力。immtac可用于許多應(yīng)用，包括不限于活化針對呈現(xiàn)由immtac識別的同源抗原的細(xì)胞諸如腫瘤細(xì)胞的t細(xì)胞應(yīng)答。在一些實施方案中，可溶性單克隆tcr包含tcrα鏈可變結(jié)構(gòu)域和tcrβ鏈可變結(jié)構(gòu)域。在一些實施方案中，可溶性單克隆tcr進一步包含由天然或非天然二硫鍵連接的tcrα鏈恒定結(jié)構(gòu)域和tcrβ鏈恒定結(jié)構(gòu)域。對于immtac的更詳細(xì)描述，參見例如美國專利號7,569,664；liddy等,nat.med.18:908-7(2012)；以及oates和jakobsen,oncoimmunology2:e22891(2013)。在一些實施方案中，從宿主細(xì)胞的周質(zhì)回收本公開的分泌蛋白。本領(lǐng)域中已知周質(zhì)用以指代革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞的內(nèi)膜或細(xì)胞質(zhì)膜與外膜之間的間隔。在不希望束縛于理論下，據(jù)認(rèn)為周質(zhì)是有利于形成二硫鍵的氧化環(huán)境。因此，可有利的是使具有二硫鍵作為它的適當(dāng)折疊和裝配結(jié)構(gòu)的一部分的多肽(例如本公開的雙鏈蛋白質(zhì))定位于周質(zhì)(對于更詳細(xì)描述，參見schlapschym等2006proteineng.des.sel.19(8):385)。用于回收周質(zhì)蛋白質(zhì)的眾多方法在本領(lǐng)域中是已知的。大規(guī)模純化周質(zhì)蛋白質(zhì)的一個非限制性實例描述于歐洲專利號ep1356052b1(參見例如實施例4)中?？赏ㄟ^從原生質(zhì)球制備物提取周質(zhì)部分來回收周質(zhì)蛋白質(zhì)(參見例如schlapschym等2006proteineng.des.sel.19(8):385)。一旦已產(chǎn)生周質(zhì)提取物，即可通過本領(lǐng)域中已知的任何標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化技術(shù)諸如親和純化、色譜法等來純化周質(zhì)蛋白質(zhì)?？贵w本文所述的雙鏈蛋白質(zhì)可通過本領(lǐng)域中已知的任何適合技術(shù)制備。一個示例性類別的雙鏈蛋白質(zhì)是抗體。如下所述，使用本領(lǐng)域中可用于產(chǎn)生抗體的技術(shù)制備抗體，所述技術(shù)的示例性方法更詳細(xì)描述于以下章節(jié)中。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到許多下述方法可應(yīng)用于除抗體以外的雙鏈蛋白質(zhì)?？贵w針對目標(biāo)抗原(例如且不限于pd-l1(諸如人pd-l1)、her2、或cd3(諸如人cd3)、il13、il4、vegfc、vegfa和vegf)。優(yōu)選地，抗原是生物重要多肽，并且向罹患病癥的哺乳動物施用抗體可在那個哺乳動物中產(chǎn)生治療益處。在某些實施方案中，本文提供的抗體具有≤1μm、≤150nm、≤100nm、≤50nm、≤10nm、≤1nm、≤0.1nm、≤0.01nm或≤0.001nm(例如10-8m或更小，例如10-8m至10-13m，例如10-9m至10-13m)的解離常數(shù)(kd)。在一個實施方案中，通過如由以下測定所述，用目標(biāo)抗體的fab形式和它的抗原進行的放射性標(biāo)記抗原結(jié)合測定(ria)來測量kd。通過以下方式來測量fab對抗原的溶液結(jié)合親和力：在一滴定系列的未標(biāo)記抗原存在下，用最小濃度的(125i)標(biāo)記抗原使fab平衡，接著用抗fab抗體涂布板捕集結(jié)合的抗原(參見例如chen等,j.mol.biol.293:865-881(1999))。為建立用于測定的條件，將多孔板(thermoscientific)用含5μg/ml捕集抗fab抗體(cappellabs)的50mm碳酸鈉(ph9.6)涂布過夜，并且隨后在室溫(約23℃)下用含2％(w/v)牛血清白蛋白的pbs阻斷2-5小時。在非吸附板(nunc#269620)中，使100pm或26pm[125i]-抗原與連續(xù)稀釋度的目標(biāo)fab混合。接著將目標(biāo)fab孵育隔夜；然而，孵育可持續(xù)較長時期(例如約65小時)以確保達到平衡。此后，將混合物轉(zhuǎn)移至捕集板中以在室溫下孵育(例如1小時)。接著移除溶液，并且用含0.1％聚山梨醇酯20的pbs將板洗滌8次。當(dāng)板已干燥時，每孔添加150μl閃爍體(microscint-20tm；packard)，并且在topcounttmγ計數(shù)器(packard)上對板進行計數(shù)10分鐘。選擇各fab的賦予小于或等于最大結(jié)合的20％的濃度用于競爭性結(jié)合測定中。根據(jù)另一個實施方案，使用或(biacore,inc.,piscataway,nj)，用固定抗原cm5芯片在約10響應(yīng)單位(ru)下在25℃下利用表面等離子體共振測定來測量kd。簡要來說，根據(jù)供應(yīng)商說明書用n-乙基-n’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽(edc)和n-羥基丁二酰亞胺(nhs)活化羧甲基化右旋糖苷生物傳感器芯片(cm5，biacore,inc.)。用10mm乙酸鈉(ph4.8)將抗原稀釋至5μg/ml(約0.2μm)，隨后在5μl/分鐘的流速下注射以獲得約10響應(yīng)單位(ru)的偶聯(lián)蛋白質(zhì)。在注射抗原之后，注射1m乙醇胺以封阻未反應(yīng)基團。對于動力學(xué)測量，在25℃下，在約25μl/min的流速下注射fab于含0.05％聚山梨醇酯20(tween-20tm)表面活性劑的pbs(pbst)中的兩倍連續(xù)稀釋液(0.78nm至500nm)。通過同時擬合締合傳感圖和解離傳感圖，使用簡單一對一朗繆爾(langmuir)結(jié)合模型(3.2版評估軟件)計算締合速率(k締合)和離解速率(k解離)。將平衡解離常數(shù)(kd)計算為比率k解離/k締合。參見例如chen等,j.mol.biol.293:865-881(1999)。如果根據(jù)以上表面等離子體共振測定的締合速率超過106m-1s-1，那么可通過使用熒光淬滅技術(shù)來測定締合速率，所述技術(shù)測量在如在分光計(諸如停流配備分光光度計(avivinstruments)或具有攪拌比色皿的8000系列slm-amincotm分光光度計(thermospectronic))中測量的遞增濃度的抗原存在下，在25℃下于pbs(ph7.2)中的20nm抗抗原抗體(fab形式)的熒光發(fā)射強度(激發(fā)＝295nm；發(fā)射＝340nm，16nm帶通)的增加或降低。(i)抗原制備任選綴合于其它分子的可溶性抗原或其片段可用作用于產(chǎn)生抗體的免疫原。對于諸如受體的跨膜分子，這些分子的片段(例如受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域)可用作免疫原?；蛘?，表達跨膜分子的細(xì)胞可用作免疫原。所述細(xì)胞可源于天然來源(例如癌細(xì)胞系)，或可為已通過重組技術(shù)來轉(zhuǎn)化以表達跨膜分子的細(xì)胞。適用于制備抗體的其它抗原及其各種形式將為本領(lǐng)域中的人士顯而易知。(ii)某些基于抗體的方法優(yōu)選通過多次皮下(sc)或腹膜內(nèi)(ip)注射相關(guān)抗原和佐劑來在動物中產(chǎn)生多克隆抗體?？蛇m用的是使用雙官能試劑或衍生化試劑例如順丁烯二酰亞胺基苯甲?；腔《啺孵?通過半胱氨酸殘基來綴合)、n-羥基丁二酰亞胺(通過賴氨酸殘基)、戊二醛、丁二酸酐、socl2或r1n＝c＝nr(其中r和r1是不同烷基)來使相關(guān)抗原綴合于在待免疫的物種中具有免疫原性的蛋白質(zhì)，例如鑰孔蟲戚血藍蛋白(keyholelimpethemocyanin)、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑。通過組合例如100μg或5μg蛋白質(zhì)或綴合物(分別對于兔或小鼠)與3體積的弗氏完全佐劑(freund'scompleteadjuvant)，以及在多個部位處真皮內(nèi)注射溶液來使動物針對抗原、免疫原性綴合物或衍生物免疫。1個月后，通過在多個部位處皮下注射來用含1/5至1/10原始量的肽或綴合物的弗氏完全佐劑使動物加強免疫。7至14天后，將動物放血，并且測定血清的抗體效價。使動物加強免疫直至效價平穩(wěn)。優(yōu)選地，用具有相同抗原，但綴合于不同蛋白質(zhì)和/或通過不同交聯(lián)試劑所獲得的綴合物來使動物加強免疫。也可在重組細(xì)胞培養(yǎng)物中以蛋白質(zhì)融合物形式制備綴合物。此外，諸如明礬的聚集劑適合地用于增強免疫應(yīng)答?？墒褂檬紫扔蒶ohler等,nature,256:495(1975)所述，并且例如在hongo等,hybridoma,14(3):253-260(1995)，harlow等,antibodies:alaboratorymanual,(coldspringharborlaboratorypress,第2版1988)；hammerling等,monoclonalantibodiesandt-cellhybridomas563-681(elsevier,n.y.,1981)以及ni,xiandaimianyixue,26(4):265-268(2006)(關(guān)于人-人雜交瘤)中進一步描述的雜交瘤方法制備本公開的單克隆抗體。額外方法包括例如在美國專利號7,189,826中描述的關(guān)于從雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生單克隆人天然igm抗體的那些。人雜交瘤技術(shù)(三源雜交瘤技術(shù))描述于vollmers和brandlein,histologyandhistopathology,20(3):927-937(2005)以及vollmers和brandlein,methodsandfindingsinexperimentalandclinicalpharmacology,27(3):185-91(2005)中。一旦已從雜交瘤分離所需單克隆抗體，即可將編碼它們的多核苷酸亞克隆至原核表達載體中，并且可通過任何本文所述的方法在原核宿主細(xì)胞中表達來產(chǎn)生抗體。(iii)文庫源性抗體可通過篩選組合文庫中具有一種或多種所需活性的抗體來分離本公開的抗體。舉例來說，本領(lǐng)域中已知多種用于產(chǎn)生噬菌體展示文庫以及篩選所述文庫中具有所需結(jié)合特征的抗體的方法，諸如實施例3中所述的方法。額外方法例如在hoogenboom等,methodsinmolecularbiology178:1-37(o’brien等編,humanpress,totowa,nj,2001)中綜述，并且例如在mccafferty等,nature348:552-554；clackson等,nature352:624-628(1991)；marks等,j.mol.biol.222:581-597(1992)；marks和bradbury,methodsinmolecularbiology248:161-175(lo編,humanpress,totowa,nj,2003)；sidhu等,j.mol.biol.338(2):299-310(2004)；lee等,j.mol.biol.340(5):1073-1093(2004)；fellouse,proc.natl.acad.sci.usa101(34):12467-12472(2004)；以及l(fā)ee等,j.immunol.methods284(1-2):119-132(2004)中進一步描述。在某些噬菌體展示方法中，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)來分別克隆vh和vl基因的譜系，并且隨機重組于噬菌體文庫中，可接著篩選所述文庫中的抗原結(jié)合性噬菌體，如winter等,ann.rev.immunol.,12:433-455(1994)中所述。噬菌體通常展示呈單鏈fv(scfv)片段形式或呈fab片段形式的抗體片段。來自經(jīng)免疫來源的文庫提供對免疫原具有高親和力的抗體而無需構(gòu)建雜交瘤?；蛘撸煽寺?例如從人克隆)天然譜系以提供單一來源的針對廣泛范圍的非自身抗原以及自身抗原的抗體而不進行任何免疫，如由griffiths等,emboj,12:725-734(1993)所述。最后，天然文庫也可通過以下方式合成制備：從干細(xì)胞克隆未重排v基因區(qū)段，以及使用含有隨機序列的pcr引物來編碼高變cdr3區(qū)并且實現(xiàn)體外重排，如由hoogenboom和winter,j.mol.biol.,227:381-388(1992)所述。描述人抗體噬菌體文庫的專利公布包括例如美國專利號5,750,373以及美國專利公布號2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。從人抗體文庫分離的抗體或抗體片段在本文中被視為人抗體或人抗體片段。(iv)嵌合抗體、人源化抗體和人抗體在某些實施方案中，本文提供的抗體是嵌合抗體。某些嵌合抗體例如描述于美國專利號4,816,567；以及morrison等,proc.natl.acad.sci.usa,81:6851-6855(1984))中。在一個實例中，嵌合抗體包含非人可變區(qū)(例如源于小鼠、大鼠、倉鼠、兔或非人靈長類動物諸如猴的可變區(qū))和人恒定區(qū)。在另一實例中，嵌合抗體是“類別轉(zhuǎn)換”抗體，其中類別或子類已從親本抗體的類別或子類改變。嵌合抗體包括其抗原結(jié)合片段。在某些實施方案中，嵌合抗體是人源化抗體。通常，使非人抗體人源化以降低在人中的免疫原性，同時保留親本非人抗體的特異性和親和力。通常，人源化抗體包含一個或多個其中hvr例如cdr(或其部分)源于非人抗體，而fr(或其部分)源于人抗體序列的可變結(jié)構(gòu)域。人源化抗體任選也將包含至少一部分人恒定區(qū)。在一些實施方案中，人源化抗體中的一些fr殘基被來自非人抗體(例如hvr殘基所源于的抗體)的相應(yīng)殘基替代例如以恢復(fù)或改進抗體特異性或親和力。人源化抗體和制備它們的方法例如在almagro和fransson,front.biosci.13:1619-1633(2008)中綜述，并且例如在riechmann等,nature332:323-329(1988)；queen等,proc.nat’lacad.sci.usa86:10029-10033(1989)；美國專利號5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；kashmiri等,methods36:25-34(2005)(描述sdr(a-cdr)移植)；padlan,mol.immunol.28:489-498(1991)(描述“表面重塑”)；dall’acqua等,methods36:43-60(2005)(描述“fr改組”)；以及osbourn等,methods36:61-68(2005)和klimka等,br.j.cancer,83:252-260(2000)(描述用以fr改組的“引導(dǎo)選擇”方法)中進一步描述?？捎糜谌嗽椿娜丝蚣軈^(qū)包括但不限于：使用“最佳配合”方法選擇的框架區(qū)(參見例如sims等j.immunol.151:2296(1993))；源于具有特定子組的輕鏈或重鏈可變區(qū)的人抗體的共有序列的框架區(qū)(參見例如carter等proc.natl.acad.sci.usa,89:4285(1992)；以及presta等j.immunol.,151:2623(1993))；人成熟(體細(xì)胞突變)框架區(qū)或人種系框架區(qū)(參見例如almagro和fransson,front.biosci.13:1619-1633(2008))；和由篩選fr文庫獲得的框架區(qū)(參見例如baca等,j.biol.chem.272:10678-10684(1997)以及rosok等,j.biol.chem.271:22611-22618(1996))。在某些實施方案中，本文提供的抗體是人抗體。可使用本領(lǐng)域中已知的各種技術(shù)來產(chǎn)生人抗體。人抗體一般地描述于vandijk和vandewinkel,curr.opin.pharmacol.5:368-74(2001)以及l(fā)onberg,curr.opin.immunol.20:450-459(2008)中。人抗體可例如且不限于通過任何本文所述的方法在原核宿主細(xì)胞中由原核表達載體表達來制備。人抗體也可通過分離選自人源性噬菌體展示文庫的fv克隆可變結(jié)構(gòu)域序列來產(chǎn)生。所述可變結(jié)構(gòu)域序列可接著與所需人恒定結(jié)構(gòu)域組合。以下描述用于從抗體文庫選擇人抗體的技術(shù)。(v)抗體片段可通過傳統(tǒng)手段諸如酶促消化，或通過重組技術(shù)來產(chǎn)生抗體片段。在某些情況下，使用抗體片段而非完全抗體存在優(yōu)勢。片段的較小尺寸允許快速清除，并且可導(dǎo)致到達實體腫瘤得以改進。對于某些抗體片段的綜述，參見hudson等(2003)nat.med.9:129-134。已開發(fā)用于產(chǎn)生抗體片段的各種技術(shù)。在傳統(tǒng)上，通過蛋白水解消化完整抗體來獲得這些片段(參見例如morimoto等,journalofbiochemicalandbiophysicalmethods24:107-117(1992)；以及brennan等,science,229:81(1985))。然而，這些片段現(xiàn)時可以由重組宿主細(xì)胞直接產(chǎn)生。fab、fv和scfv抗體片段全都可在大腸桿菌中表達并從大腸桿菌分泌，由此允許輕易產(chǎn)生大量的這些片段?？蓮囊陨嫌懻摰目贵w噬菌體文庫分離抗體片段?；蛘?，可直接從大腸桿菌回收fab'-sh片段，并且化學(xué)偶聯(lián)以形成f(ab')2片段(carter等,bio/technology10:163-167(1992))。根據(jù)另一方法，可直接從重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物分離f(ab')2片段。包含補救受體結(jié)合表位殘基，具有增加的體內(nèi)半衰期的fab和f(ab')2片段描述于美國專利號5,869,046中。用于產(chǎn)生抗體片段的其它技術(shù)將為熟練從業(yè)者顯而易知。在某些實施方案中，抗體是單鏈fv片段(scfv)。參見wo93/16185；美國專利號5,571,894；和5,587,458。fv和scfv是僅有的具有完整結(jié)合位點，缺乏恒定區(qū)的種類；因此，它們可適于在體內(nèi)使用期間達成非特異性結(jié)合降低?？蓸?gòu)建scfv融合蛋白以在scfv的氨基或羧基末端產(chǎn)生效應(yīng)蛋白融合。參見antibodyengineering,borrebaeck編(上文)。抗體片段也可為“線性抗體”，例如如例如美國專利號5,641,870中所述。所述線性抗體可為單特異性的或雙特異性的。(vi)多特異性抗體多特異性抗體對至少兩種不同表位具有結(jié)合特異性，其中所述表位通常來自不同抗原。盡管所述分子通常將僅結(jié)合兩種不同表位(即雙特異性抗體bsab)，但是當(dāng)在本文中使用時，具有額外特異性的抗體諸如三特異性抗體由這個表述所涵蓋。雙特異性抗體可被制備成全長抗體或抗體片段(例如f(ab')2雙特異性抗體)。用于制備雙特異性抗體的方法在本領(lǐng)域中是已知的。全長雙特異性抗體的傳統(tǒng)產(chǎn)生是基于共表達兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對，其中兩條鏈具有不同特異性(millstein等,nature,305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機分配，這些雜交瘤(四源雜交瘤)產(chǎn)生10種不同抗體分子的潛在混合物，其中僅一種具有正確雙特異性結(jié)構(gòu)。通常通過親和色譜法步驟進行的對正確分子的純化是相當(dāng)麻煩的，并且產(chǎn)物產(chǎn)率低下。類似程序公開于wo93/08829中以及traunecker等,emboj.,10:3655-3659(1991)中。本領(lǐng)域中已知的一種用于制備雙特異性抗體的方法是“鈕入孔(knobs-into-holes)”或“突起入空腔(protuberance-into-cavity)”方法(參見例如美國專利號5,731,168)。在這個方法中，兩種免疫球蛋白多肽(例如重鏈多肽)各自包含界面。一種免疫球蛋白多肽的界面與另一免疫球蛋白多肽上的相應(yīng)界面相互作用，由此允許兩種免疫球蛋白多肽締合。這些界面可經(jīng)工程化以使位于一種免疫球蛋白多肽的界面中的“鈕”或“突起”(這些術(shù)語可在本文中可互換使用)與位于另一免疫球蛋白多肽的界面中的“孔”或“空腔”(這些術(shù)語可在本文中可互換使用)對應(yīng)。在一些實施方案中，孔與鈕具有相同或類似尺寸，并且被適合地定位以使當(dāng)兩個界面相互作用時，一個界面的鈕可位于另一界面的相應(yīng)孔中。在不希望束縛于理論下，這被認(rèn)為使異多聚體穩(wěn)定，并且有利于超過其它種類例如同多聚體來形成異多聚體。在一些實施方案中，這個方法可用于促進兩種不同免疫球蛋白多肽的異多聚化，從而產(chǎn)生包含兩種對不同表位具有結(jié)合特異性的免疫球蛋白多肽的雙特異性抗體。在一些實施方案中，鈕可通過用較大側(cè)鏈替換小氨基酸側(cè)鏈來構(gòu)建。在一些實施方案中，孔可通過用較小側(cè)鏈替換大氨基酸側(cè)鏈來構(gòu)建。鈕或孔可存在于原始界面中，或它們可被合成引入。舉例來說，鈕或孔可通過改變編碼界面的核酸序列以用至少一個“輸入”氨基酸殘基替換至少一個“原始”氨基酸殘基來合成引入。用于改變核酸序列的方法可包括本領(lǐng)域中熟知的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)。各種氨基酸殘基的側(cè)鏈體積顯示于下表中。在一些實施方案中，原始?xì)埢哂行?cè)鏈體積(例如丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸或纈氨酸)，并且用于形成鈕的輸入殘基是天然存在的氨基酸，且可包括精氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。在一些實施方案中，原始?xì)埢哂写髠?cè)鏈體積(例如精氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)，并且用于形成孔的輸入殘基是天然存在的氨基酸，且可包括丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和纈氨酸。表1b.氨基酸殘基的性質(zhì)a氨基酸的分子量減去水的分子量。數(shù)值來自handbookofchemistryandphysics,第43版cleveland,chemicalrubberpublishingco.,1961。b數(shù)值來自a.a.zamyatnin,prog.biophys.mol.biol.24:107-123,1972。c數(shù)值來自c.chothia,j.mol.biol.105:1-14,1975。可及表面積在這個參考文獻的圖6-20中加以確定。在一些實施方案中，基于異多聚體的三維結(jié)構(gòu)鑒定用于形成鈕或孔的原始?xì)埢?。本領(lǐng)域中已知用于獲得三維結(jié)構(gòu)的技術(shù)可包括x射線晶體分析法和nmr。在一些實施方案中，界面是免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域的ch3結(jié)構(gòu)域。在這些實施方案中，人igg1的ch3/ch3界面涉及在各結(jié)構(gòu)域上位于4個反平行β鏈上的16個殘基。在不希望束縛于理論下，突變的殘基優(yōu)選位于2個中心反平行β鏈上以使鈕可被周圍溶劑而非配偶體ch3結(jié)構(gòu)域中的補償性孔容納的風(fēng)險最小。在一些實施方案中，兩種免疫球蛋白多肽中形成相應(yīng)鈕和孔的突變對應(yīng)于下表中提供的一對或多對。表2.示例性的各組相應(yīng)鈕和孔形成突變突變通過以下方式來表示：原始?xì)埢?，繼之以使用kabat編號系統(tǒng)的位置，接著是輸入殘基(所有殘基都以單字母氨基酸代碼給出)。多個突變由冒號分隔。在一些實施方案中，免疫球蛋白多肽包含含有一個或多個列于上表2中的氨基酸取代的ch3結(jié)構(gòu)域。在一些實施方案中，雙特異性抗體包含第一免疫球蛋白多肽，所述第一免疫球蛋白多肽包含含有一個或多個列于表2的左列中的氨基酸取代的ch3結(jié)構(gòu)域；和第二免疫球蛋白多肽，所述第二免疫球蛋白多肽包含含有一個或多個列于表2的右列中的相應(yīng)氨基酸取代的ch3結(jié)構(gòu)域。在如上所討論使dna突變之后，編碼具有一個或多個相應(yīng)鈕或孔形成突變的經(jīng)修飾免疫球蛋白多肽的多核苷酸可使用本領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)和細(xì)胞系統(tǒng)來表達和純化。參見例如美國專利號5,731,168；5,807,706；5,821,333；7,642,228；7,695,936；8,216,805；美國公布號2013/0089553；以及spiess等,naturebiotechnology31:753-758,2013。經(jīng)修飾免疫球蛋白多肽可使用原核宿主細(xì)胞諸如大腸桿菌來產(chǎn)生。可以共培養(yǎng)方式在宿主細(xì)胞中表達相應(yīng)鈕和孔攜帶性免疫球蛋白多肽，并且以異多聚體形式一起純化，或它們可以單培養(yǎng)方式表達，分別純化，并且在體外裝配。在一些實施方案中，使用本領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)共培養(yǎng)兩種細(xì)菌宿主細(xì)胞菌株(一種表達具有鈕的免疫球蛋白多肽，并且另一種表達具有孔的免疫球蛋白多肽)。在一些實施方案中，兩種菌株可以特定比率混合例如以便在培養(yǎng)時實現(xiàn)相等表達水平。在一些實施方案中，兩種菌株可以50:50、60:40或70:30比率混合。在多肽表達之后，可使細(xì)胞一起溶解，并且可提取蛋白質(zhì)。本領(lǐng)域中已知的允許測量同多聚種類相對于異多聚種類的豐度的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可包括尺寸排阻色譜法。在一些實施方案中，使用標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)分別表達各經(jīng)修飾免疫球蛋白多肽，并且它們可在體外一起裝配。裝配可例如通過以下方式來實現(xiàn)：純化各經(jīng)修飾免疫球蛋白多肽，以相等質(zhì)量一起混合和孵育它們，使二硫化物還原(例如通過用二硫蘇糖醇處理)，濃縮，以及使多肽再氧化。形成的雙特異性抗體可使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)包括陽離子交換色譜法純化，并且使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)包括尺寸排阻色譜法測量。對于這些方法的更詳細(xì)描述，參見speiss等,natbiotechnol31:753-8,2013。在一些實施方案中，經(jīng)修飾免疫球蛋白多肽可分別在cho細(xì)胞中表達，并且使用上述方法在體外裝配。根據(jù)一種不同方法，使具有所需結(jié)合特異性(抗體-抗原結(jié)合位點)的抗體可變結(jié)構(gòu)域融合于免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域序列。優(yōu)選地，融合是與包含至少一部分鉸鏈區(qū)、ch2區(qū)和ch3區(qū)的免疫球蛋白重鏈恒定結(jié)構(gòu)域融合。典型的是具有存在于至少一種融合物中的含有為輕鏈結(jié)合所必需的位點的第一重鏈恒定區(qū)(ch1)。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物以及必要時免疫球蛋白輕鏈的dna插入單獨表達載體中，并且共同轉(zhuǎn)染至適合宿主生物體中。這提供在用于構(gòu)建的不等比率的三個多肽鏈提供最優(yōu)產(chǎn)率時的實施方案中，調(diào)整三種多肽片段的相互比例的極大靈活性。然而，當(dāng)以相等比率表達至少兩個多肽鏈會產(chǎn)生高產(chǎn)率時或當(dāng)比率不具有特定重要性時，有可能在一個表達載體中插入兩個或所有三個多肽鏈的編碼序列。在這個方法的一個實施方案中，雙特異性抗體由一個臂中的具有第一結(jié)合特異性的雜交免疫球蛋白重鏈、以及另一臂中的雜交免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結(jié)合特異性)組成。發(fā)現(xiàn)這個不對稱結(jié)構(gòu)有助于使所需雙特異性化合物與非所要免疫球蛋白鏈組合分離，因為僅在雙特異性分子的一半中存在免疫球蛋白輕鏈提供一種輕易分離方式。這個方法公開于wo94/04690中。對于產(chǎn)生雙特異性抗體的進一步細(xì)節(jié)，參見例如suresh等,methodsinenzymology,121:210(1986)。根據(jù)wo96/27011中所述的另一方法，一對抗體分子之間的界面可經(jīng)工程化以使從重組細(xì)胞培養(yǎng)物回收的異二聚體的百分比最大。一個界面包含抗體恒定結(jié)構(gòu)域的至少一部分ch3結(jié)構(gòu)域。在這個方法中，一個或多個來自第一抗體分子的界面的小氨基酸側(cè)鏈被較大側(cè)鏈(例如酪氨酸或色氨酸)替換。通過用較小氨基酸側(cè)鏈(例如丙氨酸或蘇氨酸)替換大氨基酸側(cè)鏈來在第二抗體分子的界面上產(chǎn)生尺寸與大側(cè)鏈相同或類似的補償性“空腔”。這提供一種用于使異二聚體的產(chǎn)率增加超過其它非所要最終產(chǎn)物諸如同二聚體的機理。雙特異性抗體包括交聯(lián)抗體或“異源綴合物”抗體。舉例來說，可使異源綴合物中的一種抗體偶聯(lián)于抗生蛋白，另一種偶聯(lián)于生物素。所述抗體已例如被提出以使免疫系統(tǒng)細(xì)胞靶向非所要細(xì)胞(美國專利號4,676,980)，以及用于治療hiv感染(wo91/00360、wo92/200373和ep03089)?？墒褂萌魏芜m宜交聯(lián)方法制備異源綴合物抗體。適合交聯(lián)劑在本領(lǐng)域中是熟知的，并且連同許多交聯(lián)技術(shù)一起公開于美國專利號4,676,980中。用于從抗體片段產(chǎn)生雙特異性抗體的技術(shù)也已描述于文獻中。舉例來說，可使用化學(xué)連接來制備雙特異性抗體。brennan等,science,229:81(1985)描述其中將完整抗體蛋白水解裂解以產(chǎn)生f(ab')2片段的程序。在二硫醇復(fù)合劑亞砷酸鈉存在下還原這些片段以使鄰近二硫醇穩(wěn)定，并且防止分子間二硫化物形成。接著使產(chǎn)生的fab'片段轉(zhuǎn)化成硫硝基苯甲酸酯(tnb)衍生物。接著通過用巰基乙胺還原使一種fab'-tnb衍生物再轉(zhuǎn)化成fab'-硫醇，并且與等摩爾量的另一fab'-tnb衍生物混合以形成雙特異性抗體。所產(chǎn)生的雙特異性抗體可用作用于選擇性固定酶的試劑。新近進展已有助于從大腸桿菌直接回收fab'-sh片段，其可被化學(xué)偶聯(lián)以形成雙特異性抗體。shalaby等,j.exp.med.,175:217-225(1992)描述完全人源化雙特異性抗體f(ab')2分子的產(chǎn)生。各fab'片段分別從大腸桿菌分泌，并且經(jīng)受體外定向化學(xué)偶聯(lián)以形成雙特異性抗體。也已描述用于直接從重組細(xì)胞培養(yǎng)物制備和分離雙特異性抗體片段的各種技術(shù)。舉例來說，已使用亮氨酸拉鏈來產(chǎn)生雙特異性抗體。kostelny等,j.immunol.,148(5):1547-1553(1992)。通過基因融合使來自fos和jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽連接于兩種不同抗的fab'部分。在鉸鏈區(qū)處還原抗體同二聚體以形成單體，接著再氧化以形成抗體異二聚體。這個方法也可用于產(chǎn)生抗體同二聚體。由hollinger等,proc.natl.acad.sci.usa,90:6444-6448(1993)所述的“微型雙功能抗體”技術(shù)已提供一種用于制備雙特異性抗體片段的替代性機理。片段包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域(vh)由接頭連接于輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(vl)，所述接頭太短以致不允許在同一鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域之間配對。因此，一個片段的vh結(jié)構(gòu)域和vl結(jié)構(gòu)域被迫與另一片段的互補vl結(jié)構(gòu)域和vh結(jié)構(gòu)域配對，由此形成兩個抗原結(jié)合位點。也已報道用于通過使用單鏈fv(sfv)二聚體來制備雙特異性抗體片段的另一策略。參見gruber等,j.immunol,152:5368(1994)。用于制備雙特異性抗體片段的另一技術(shù)是“雙特異性t細(xì)胞銜接物”或方法(參見例如wo2004/106381、wo2005/061547、wo2007/042261和wo2008/119567)。這個方法利用安置在單一多肽上的兩個抗體可變結(jié)構(gòu)域。舉例來說，單一多肽鏈包括兩個單鏈fv(scfv)片段，各自具有由長度足以允許在兩個結(jié)構(gòu)域之間進行分子內(nèi)締合的多肽接頭分隔的可變重鏈(vh)和可變輕鏈(vl)結(jié)構(gòu)域。這個單一多肽進一步在兩個scfv片段之間包括多肽間隔體序列。各scfv識別不同表位，并且這些表位可為不同細(xì)胞類型所特有，以致兩種不同細(xì)胞類型的細(xì)胞在各scfv與它的同源表位銜接時被致使緊密鄰近或栓系。這個方法的一個特定實施方案包括識別由免疫細(xì)胞表達的細(xì)胞表面抗原例如t細(xì)胞上的cd3多肽的scfv連接于識別由靶標(biāo)細(xì)胞諸如惡性或腫瘤細(xì)胞表達的細(xì)胞表面抗原的另一scfv。因為雙特異性t細(xì)胞銜接物是單一多肽，所以它可使用本領(lǐng)域中已知的任何原核細(xì)胞表達系統(tǒng)來表達。然而，特定純化技術(shù)(參見例如ep1691833)可為使單體雙特異性t細(xì)胞銜接物與可具有除單體的預(yù)定活性以外的生物活性的其它多聚種類分離所必需。在一種示例性純化流程中，首先使含有分泌多肽的溶液經(jīng)受金屬親和色譜法，并且用某一咪唑濃度梯度洗脫多肽。使用陰離子交換色譜法進一步純化這個洗脫物，并且使用某一氯化鈉濃度梯度洗脫多肽。最后，使這個洗脫物經(jīng)受尺寸排阻色譜法以使單體與多聚種類分離。涵蓋具有超過兩價的抗體。舉例來說，可制備三特異性抗體。tuft等j.immunol.147:60(1991)。在一些實施方案中，雙鏈蛋白質(zhì)是多特異性抗體或雙特異性抗體的一部分。多特異性抗體或雙特異性抗體可含有兩種或更多種本公開的單價抗體。在一些實施方案中，雙特異性抗體的第一抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含一個或多個重鏈恒定結(jié)構(gòu)域，其中所述一個或多個重鏈恒定結(jié)構(gòu)域選自第一ch1(ch11)結(jié)構(gòu)域、第一ch2(ch21)結(jié)構(gòu)域、第一ch3(ch31)結(jié)構(gòu)域；并且雙特異性抗體的第二抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含一個或多個重鏈恒定結(jié)構(gòu)域，其中所述一個或多個重鏈恒定結(jié)構(gòu)域選自第二ch1(ch12)結(jié)構(gòu)域、第二ch2(ch22)結(jié)構(gòu)域和第二ch3(ch32)結(jié)構(gòu)域。在一些實施方案中，第一抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的一個或多個重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中的至少一個與第二抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的另一重鏈恒定結(jié)構(gòu)域配對。在一些實施方案中，ch31結(jié)構(gòu)域和ch32結(jié)構(gòu)域各自包含突起或空腔，并且其中ch31結(jié)構(gòu)域中的突起或空腔可分別位于ch32結(jié)構(gòu)域中的空腔或突起中。在一些實施方案中，ch31結(jié)構(gòu)域和ch32結(jié)構(gòu)域在所述突起與空腔之間的界面處相遇。ch31結(jié)構(gòu)域和ch32結(jié)構(gòu)域中的示例性的各組氨基酸取代顯示于本文表2中。在一些實施方案中，ch21結(jié)構(gòu)域和ch22結(jié)構(gòu)域各自包含突起或空腔，并且其中ch21結(jié)構(gòu)域中的突起或空腔可分別位于ch22結(jié)構(gòu)域中的空腔或突起中。在一些實施方案中，ch21結(jié)構(gòu)域和ch22結(jié)構(gòu)域在所述突起與空腔之間的界面處相遇。在一些實施方案中，igg的ch31結(jié)構(gòu)域和/或ch32結(jié)構(gòu)域在選自由以下組成的組的殘基處含有一個或多個氨基酸取代：347、349、350、351、366、368、370、392、394、395、398、399、405、407和409，根據(jù)如美國專利號8,216,805的圖5中所示的氨基酸編號。在一些實施方案中，突起包含一個或多個選自由以下組成的組的引入殘基：精氨酸(r)殘基、苯丙氨酸(f)殘基、酪氨酸(y)殘基和色氨酸(w)殘基。在一些實施方案中，空腔包含一個或多個選自由以下組成的組的引入殘基：丙氨酸(a)殘基、絲氨酸(s)殘基、蘇氨酸(t)殘基和纈氨酸(v)殘基。在一些實施方案中，ch3結(jié)構(gòu)域和/或ch2結(jié)構(gòu)域來自igg(例如igg1亞型、igg2亞型、igg2a亞型、igg2b亞型、igg3亞型或igg4亞型)。在一些實施方案中，雙特異性抗體的一個ch3結(jié)構(gòu)域包含氨基酸取代t366y，并且另一ch3結(jié)構(gòu)域包含氨基酸取代y407t。在一些實施方案中，一個ch3結(jié)構(gòu)域包含氨基酸取代t366w，并且另一ch3結(jié)構(gòu)域包含氨基酸取代y407a。在一些實施方案中，一個ch3結(jié)構(gòu)域包含氨基酸取代f405a，并且另一ch3結(jié)構(gòu)域包含氨基酸取代t394w。在一些實施方案中，一個ch3結(jié)構(gòu)域包含氨基酸取代t366y和f405a，并且另一ch3結(jié)構(gòu)域包含氨基酸取代t394w和y407t。在一些實施方案中，一個ch3結(jié)構(gòu)域包含氨基酸取代t366w和f405w，并且另一ch3結(jié)構(gòu)域包含氨基酸取代t394s和y407a。在一些實施方案中，一個ch3結(jié)構(gòu)域包含氨基酸取代f405w和y407a，并且另一ch3結(jié)構(gòu)域包含氨基酸取代t366w和t394s。在一些實施方案中，一個ch3結(jié)構(gòu)域包含氨基酸取代f405w，并且另一ch3結(jié)構(gòu)域包含氨基酸取代t394s。突變通過以下方式來表示：原始?xì)埢?，繼之以使用kabat編號系統(tǒng)的位置，接著是輸入殘基。也參見美國專利號8,216,805的圖5中的編號。(vii)單結(jié)構(gòu)域抗體在一些實施方案中，本公開的抗體是單結(jié)構(gòu)域抗體。單結(jié)構(gòu)域抗體是包含抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的全部或部分或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的全部或部分的單一多肽鏈。在某些實施方案中，單結(jié)構(gòu)域抗體是人單結(jié)構(gòu)域抗體(domantis,inc.,waltham,mass.；參見例如美國專利號6,248,516b1)。在一個實施方案中，單結(jié)構(gòu)域抗體由抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的全部或部分組成。(viii)抗體變體在一些實施方案中，涵蓋本文所述的抗體的氨基酸序列修飾。舉例來說，可合乎需要的是改進抗體的結(jié)合親和力和/或其它生物性質(zhì)?？赏ㄟ^將適當(dāng)變化引入編碼抗體的核苷酸序列中，或通過肽合成來制備抗體的氨基酸序列變體。所述修飾包括例如抗體的氨基酸序列內(nèi)的殘基缺失和/或插入和/或取代?？蓪θ笔?、插入和取代進行任何組合以獲得最終構(gòu)建體，前提是最終構(gòu)建體具有所需特征。氨基酸改變可在產(chǎn)生序列時引入主題抗體氨基酸序列中。(ix)取代、插入和缺失變體在某些實施方案中，提供具有一個或多個氨基酸取代的抗體變體。用于取代性誘變的目標(biāo)位點包括hvr和fr。保守性取代以標(biāo)題“保守性取代”顯示于表1中。更實質(zhì)性變化以標(biāo)題“示例性取代”提供于表1中，并且如以下關(guān)于氨基酸側(cè)鏈類別進一步所述。可將氨基酸取代引入目標(biāo)抗體中，并且篩選具有所需活性例如維持/改進的抗原結(jié)合性、降低的免疫原性或改進的adcc或cdc的產(chǎn)物。表3.示例性取代?？筛鶕?jù)共同側(cè)鏈性質(zhì)將氨基酸分組：a.疏水性：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；b.中性親水性：cys、ser、thr、asn、gln；c.酸性：asp、glu；d.堿性：his、lys、arg；e.影響鏈定向的殘基：gly、pro；f.芳族：trp、tyr、phe。非保守性取代將必須伴有將這些類別中的一個的成員更換成另一類別。一種類型的取代性變體涉及取代親本抗體(例如人源化抗體或人抗體)的一個或多個高變區(qū)殘基。通常，選擇用于進一步研究的所得變體相對于親本抗體將在某些生物性質(zhì)方面具有改變(例如改進)(例如親和力增加、免疫原性降低)和/或?qū)⒕哂杏H本抗體的大致上得以保留的某些生物性質(zhì)。一示例性取代性變體是親和力成熟抗體，其可例如使用基于噬菌體展示的親和力成熟技術(shù)諸如本文所述的那些來便利地產(chǎn)生。簡要來說，使一個或多個hvr殘基突變，并且使變體抗體展示在噬菌體上并針對特定生物活性(例如結(jié)合親和力)加以篩選。可在hvr中進行改變(例如取代)例如以改進抗體親和力。可在hvr“熱點”(即由在體細(xì)胞成熟過程期間在高頻率下經(jīng)受突變的密碼子編碼的殘基)(參見例如chowdhury,methodsmol.biol.207:179-196(2008))和/或sdr(a-cdr)中進行所述改變，并且測試所得變體vh或vl的結(jié)合親和力。通過構(gòu)建次級文庫并從其進行再選擇來達成親和力成熟已例如描述于hoogenboom等,methodsinmolecularbiology178:1-37(o’brien等編,humanpress,totowa,nj,(2001).)中。在親和力成熟的一些實施方案中，通過多種方法(例如易出錯pcr、鏈改組或寡核苷酸定向誘變)中的任一種將多樣性引入選擇用于成熟的可變基因中。接著產(chǎn)生次級文庫。接著篩選文庫以鑒定具有所需親和力的任何抗體變體。用以引入多樣性的另一方法涉及hvr定向方法，其中使若干hvr殘基(例如一次4-6個殘基)隨機化?？衫缡褂帽彼釖呙枵T變或建模來特異性鑒定抗原結(jié)合中涉及的hvr殘基。特定來說，cdr-h3和cdr-l3常常被靶向。在某些實施方案中，取代、插入或缺失可發(fā)生在一個或多個hvr內(nèi)，只要所述改變不實質(zhì)上降低抗體結(jié)合抗原的能力即可。舉例來說，可在hvr中進行不實質(zhì)上降低結(jié)合親和力的保守性改變(例如如本文提供的保守性取代)。所述改變可處于hvr“熱點”或sdr外部。在以上提供的變體vh和vl序列的某些實施方案中，各hvr未被改變，或含有至多一個、兩個或三個氨基酸取代。一種適用于鑒定抗體的可被靶向來誘變的殘基或區(qū)域的方法稱為“丙氨酸掃描誘變”，如由cunningham和wells(1989)science,244:1081-1085所述。在這個方法中，鑒定某一殘基或一組靶標(biāo)殘基(例如帶電荷殘基，諸如arg、asp、his、lys和glu)，并且用中性或帶負(fù)電荷氨基酸(例如丙氨酸或聚丙氨酸)替換以確定抗體與抗原的相互作用是否受影響。可在對初始取代顯示功能性敏感性的氨基酸位置處引入進一步取代?；蛘呋蛄硗猓乖?抗體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)用于鑒定抗體與抗原之間的接觸點。所述接觸殘基和鄰近殘基可作為取代候選物被靶向或消除?？珊Y選變體以確定它們是否含有所需性質(zhì)。氨基酸序列插入物包括長度在一個殘基至含有一百個或更多個殘基的多肽的范圍內(nèi)的氨基末端和/或羧基末端融合物，以及具有單一或多個氨基酸殘基的序列內(nèi)插入物。末端插入物的實例包括具有n末端甲硫氨?；鶜埢目贵w?？贵w分子的其它插入性變體包括抗體與增加抗體的血清半衰期的酶(例如用于adept)或多肽的n末端或c末端融合物。(x)fc區(qū)變體在某些實施方案中，可將一個或多個氨基酸修飾引入本文提供的抗體的fc區(qū)中，由此產(chǎn)生fc區(qū)變體。fc區(qū)變體可包含在一個或多個氨基酸位置處包含氨基酸修飾(例如取代)的人fc區(qū)序列(例如人igg1、igg2、igg3或igg4fc區(qū))。在某些實施方案中，本公開涵蓋具有一些而非所有效應(yīng)物功能的抗體變體，此使得所述抗體變體成為合乎各種應(yīng)用需要的候選物，在所述應(yīng)用中，抗體在體內(nèi)的半衰期是重要的，但某些效應(yīng)物功能(諸如補體和adcc)是不必要的或有害的?？蛇M行體外和/或體內(nèi)細(xì)胞毒性測定以確認(rèn)cdc和/或adcc活性的降低/消減。舉例來說，可進行fc受體(fcr)結(jié)合測定以確?？贵w缺乏fcγr結(jié)合性(因此可能缺乏adcc活性)，但保留fcrn結(jié)合能力。用于介導(dǎo)adcc的初級細(xì)胞nk細(xì)胞僅表達fc(riii，而單核細(xì)胞表達fc(ri、fc(rii和fc(riii。fcr在造血細(xì)胞上的表達概述于ravetch和kinet,annu.rev.immunol.9:457-492(1991)的第464頁上的表3中。用以評估目標(biāo)分子的adcc活性的體外測定的非限制性實例描述于美國專利號5,500,362(參見例如hellstrom,i.等proc.nat’lacad.sci.usa83:7059-7063(1986))以及hellstrom,i等,proc.nat’lacad.sci.usa82:1499-1502(1985)；5,821,337(參見bruggemann,m.等,j.exp.med.166:1351-1361(1987))中?；蛘?，可采用非放射性測定方法，參見例如用于流式細(xì)胞計量術(shù)的actitm非放射性細(xì)胞毒性測定(celltechnology,inc.mountainview,ca)；以及cytotox非放射性細(xì)胞毒性測定(promega,madison,wi)。適用于所述測定的效應(yīng)細(xì)胞包括外周血液單核細(xì)胞(pbmc)和自然殺傷(nk)細(xì)胞?；蛘呋蛄硗?，可在體內(nèi)，例如在諸如clynes等proc.nat’lacad.sci.usa95:652-656(1998)中公開的動物模型中評估目標(biāo)分子的adcc活性。也可進行c1q結(jié)合測定以確認(rèn)抗體不能結(jié)合c1q，并且因此缺乏cdc活性。參見例如wo2006/029879和wo2005/100402中的c1q和c3c結(jié)合elisa。為評估補體活化，可進行cdc測定(參見例如gazzano-santoro等,j.immunol.methods202:163(1996)；cragg,m.s.等,blood101:1045-1052(2003)；以及cragg,m.s.和m.j.glennie,blood103:2738-2743(2004))。也可使用本領(lǐng)域中已知的方法進行fcrn結(jié)合和體內(nèi)清除率/半衰期測定(參見例如petkova,s.b.等,int’l.immunol.18(12):1759-1769(2006))。效應(yīng)物功能降低的抗體包括fc區(qū)殘基238、265、269、270、297、327和329中的一個或多個被取代的那些(美國專利號6,737,056)。所述fc突變體包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的兩個或更多個處具有取代的fc突變體，包括殘基265和297被取代成丙氨酸的所謂“dana”fc突變體(美國專利號7,332,581)。描述與fcr的結(jié)合得以改進或減弱的某些抗體變體。(參見例如美國專利號6,737,056；wo2004/056312以及shields等,j.biol.chem.9(2):6591-6604(2001).)在某些實施方案中，抗體變體包含具有一個或多個改進adcc的氨基酸取代(例如在fc區(qū)的位置298、333和/或334(eu殘基編號)處的取代)的fc區(qū)在一個示例性實施方案中，抗體在它的fc區(qū)中包含以下氨基酸取代：s298a、e333a和k334a。在一些實施方案中，在fc區(qū)中進行導(dǎo)致c1q結(jié)合和/或補體依賴性細(xì)胞毒性(cdc)改變(即改進或減弱)的改變，例如如美國專利號6,194,551、wo99/51642以及idusogie等j.immunol.164:4178-4184(2000)中所述。半衰期增加且與負(fù)責(zé)將母體igg轉(zhuǎn)移至胎兒的新生兒fc受體(fcrn)(guyer等,j.immunol.117:587(1976)andkim等,j.immunol.24:249(1994))的結(jié)合得以改進的抗體描述于us2005/0014934a1(hinton等)中。那些抗體包含其中具有一個或多個改進fc區(qū)與fcrn的結(jié)合的取代的fc區(qū)。所述fc變體包括在以下一個或多個fc區(qū)殘基處具有取代的那些：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如fc區(qū)殘基434的取代(美國專利號7,371,826)。也參見涉及fc區(qū)變體的其它實例的duncan和winter,nature322:738-40(1988)；美國專利號5,648,260；美國專利號5,624,821；以及wo94/29351。(xi)抗體衍生物本公開的抗體可被進一步修飾以含有本領(lǐng)域中已知且可易于獲得的額外非蛋白質(zhì)部分。在某些實施方案中，適于使抗體衍生的部分是水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性實例包括但不限于聚乙二醇(peg)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纖維素、右旋糖苷、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚1,3-二氧雜環(huán)戊烷、聚1,3,6-三噁烷、乙烯/順丁烯二酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或無規(guī)共聚物)、以及右旋糖苷或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚合物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由于它在水中的穩(wěn)定性而可具有制造優(yōu)勢。聚合物可具有任何分子量，并且可為分支的或未分支的。連接于抗體的聚合物的數(shù)目可變化，并且如果連接一個以上聚合物，那么它們可為相同或不同分子。一般來說，用于衍生化的聚合物的數(shù)目和/或類型可基于包括但不限于以下的考慮事項加以確定：待改進的抗體的特定性質(zhì)或功能、抗體衍生物是否將在確定條件下用于療法中等。(xii)載體、宿主細(xì)胞和重組方法也可使用重組方法產(chǎn)生抗體。對于重組產(chǎn)生抗抗原抗體，將編碼所述抗體的核酸分離并插入可復(fù)制載體中以進行進一步克隆(擴增dna)或表達。使用常規(guī)程序(例如通過使用能夠特異性結(jié)合編碼抗體的重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)，可易于分離和測序編碼抗體的dna。許多載體是可用的。載體組分通常包括但不限于以下中的一種或多種：信號序列、復(fù)制起點、一種或多種標(biāo)記基因、增強子元件、啟動子和轉(zhuǎn)錄終止序列。(a)信號序列組分本公開的抗體可不僅直接重組產(chǎn)生，而且也以與異源性多肽的融合多肽形式重組產(chǎn)生，所述異源性多肽優(yōu)選是在成熟蛋白質(zhì)或多肽的n末端的信號序列或具有特定裂解位點的其它多肽。所選異源性信號序列優(yōu)選是由宿主細(xì)胞識別和處理(例如由信號肽酶裂解)的信號序列。對于不識別和處理天然抗體信號序列的原核宿主細(xì)胞，信號序列用例如選自堿性磷酸酶、青霉素酶、lpp或熱穩(wěn)定腸毒素ii前導(dǎo)物的組的原核信號序列替代。(b)復(fù)制起點表達載體與克隆載體兩者均含有使得載體能夠在一種或多種所選宿主細(xì)胞中復(fù)制的核酸序列。通常，在克隆載體中，這個序列是使得載體能夠獨立于宿主染色體dna進行復(fù)制的序列，并且包括復(fù)制起點或自主復(fù)制序列。用于多種原核宿主細(xì)胞的所述序列是熟知的。舉例來說，來自質(zhì)粒pbr322的復(fù)制起點適于大多數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌。(c)選擇基因組分表達載體和克隆載體可含有選擇基因，也被稱為可選擇標(biāo)記。典型選擇基因編碼以下蛋白質(zhì)：其(a)賦予對抗生素或其它毒素例如氨芐青霉素(ampicillin)、新霉素(neomycin)、甲氨蝶呤(methotrexate)或四環(huán)素(tetracycline)的抗性；(b)彌補營養(yǎng)缺陷性缺陷；或(c)供給不可從復(fù)合培養(yǎng)基獲得的關(guān)鍵營養(yǎng)物，例如編碼用于桿菌屬(bacilli)的d-丙氨酸外消旋酶的基因。選擇流程的一個實例利用藥物來阻滯宿主細(xì)胞的生長。用異源性基因成功轉(zhuǎn)化的那些細(xì)胞產(chǎn)生賦予藥物抗性的蛋白質(zhì)，并且因此在選擇方案的情況下存活。所述顯性選擇的實例使用藥物新霉素、霉酚酸(mycophenolicacid)和潮霉素(hygromycin)。另一選擇方案使用具有染色體缺失的原核宿主細(xì)胞，所述缺失移除其基因產(chǎn)物為在特定培養(yǎng)基中生長所必需的基因。在這些實例的情況下，當(dāng)在特定培養(yǎng)基中生長時，用彌補宿主細(xì)胞的染色體缺失的異源性基因成功轉(zhuǎn)化的那些細(xì)胞將存活。適用于這個流程中的基因的實例可包括營養(yǎng)缺陷標(biāo)記基因，或為在使宿主細(xì)胞在特定培養(yǎng)基中生長時產(chǎn)生必需營養(yǎng)物所需的其它基因。(d)啟動子組分表達載體和克隆載體通常含有由宿主生物體識別，并且可操作地連接于編碼抗體的核酸的啟動子。適于與原核宿主一起使用的啟動子包括phoa啟動子、β-內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動子系統(tǒng)、堿性磷酸酶啟動子、色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)和雜合啟動子諸如tac啟動子。然而，其它已知細(xì)菌啟動子是適合的。用于細(xì)菌系統(tǒng)中的啟動子也將含有可操作地連接于編碼抗體的dna的shine-dalgarno(s.d.)序列。(e)翻譯起始區(qū)組分如上所述，已知翻譯起始區(qū)(tir)對于重組蛋白在原核宿主細(xì)胞中的翻譯是重要的(參見例如simmonslc和yansuradg1996nat.biotechnol.14:629以及vimbergv等2007bmcmol.biol.8:100)。tir可決定翻譯單元的翻譯效率。tir通常包括翻譯單元特征物諸如起始密碼子、shine-dalgarno(sd)序列和翻譯增強子。tir可進一步包括編碼信號肽的分泌信號序列。tir的特征物之間的序列和間隔可調(diào)控翻譯起始效率。對于在產(chǎn)生蛋白質(zhì)時使用tir的進一步描述，參見例如美國專利號5,840,523(simmons等)，其描述用于使表達和分泌最優(yōu)化的翻譯起始區(qū)(tir)和信號序列。(f)轉(zhuǎn)錄終止組分用于原核宿主細(xì)胞中的表達載體也可含有為終止轉(zhuǎn)錄以及使mrna穩(wěn)定所必需的序列。在原核細(xì)胞中，終止子可包括rho依賴性或rho非依賴性終止子。適用于原核宿主細(xì)胞中的終止子的一個實例包括不限于λt0終止子(scholtissek和grosse,nucleicacidsres.15:3185,1987)。iii.方法優(yōu)化本文提供通過以下方式來在原核宿主細(xì)胞中產(chǎn)生含有兩條鏈的多肽的方法：培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞以表達所述多肽的所述兩條鏈，其中在表達后，所述兩條鏈折疊并裝配以在所述宿主細(xì)胞中形成生物活性多肽，其中在培養(yǎng)基中在包括以下的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞：包括生長溫度和生長攪拌速率的生長期，和包括產(chǎn)生溫度和產(chǎn)生攪拌速率的產(chǎn)生期，其中所述生長溫度高于所述產(chǎn)生溫度2至10℃，并且所述生長攪拌速率高于所述產(chǎn)生攪拌速率50至250rpm。本公開驚人地發(fā)現(xiàn)某些產(chǎn)生方法優(yōu)化實現(xiàn)在雙鏈蛋白質(zhì)的產(chǎn)率方面顯著增加，如由本文所述的數(shù)據(jù)所證明。(g)宿主細(xì)胞的選擇和轉(zhuǎn)化本公開的某些方面涉及原核宿主細(xì)胞。適于克隆或表達本文載體中的dna的原核生物包括真細(xì)菌，諸如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體，例如腸桿菌科(enterobacteriaceae)諸如埃希氏菌屬(escherichia)(例如大腸桿菌)、腸桿菌屬(enterobacter)、歐文氏菌屬(erwinia)、克雷伯氏菌屬(klebsiella)、變形桿菌屬(proteus)、沙門氏菌屬(salmonella)(例如鼠傷寒沙門氏菌(salmonellatyphimurium))、沙雷氏菌屬(serratia)(例如粘質(zhì)沙雷氏菌(serratiamarcescans))和志賀氏菌屬(shigella)，以及桿菌綱(諸如枯草芽孢桿菌(b.subtilis)和地衣芽孢桿菌(b.licheniformis)(例如1989年4月12日公布的dd266,710中公開的地衣芽孢桿菌41p))、假單胞菌屬(pseudomonas)(諸如綠膿假單胞菌(p.aeruginosa))和鏈霉菌屬(streptomyces)。一種優(yōu)選大腸桿菌克隆宿主是大腸桿菌294(atcc31,446)，但其它菌株諸如大腸桿菌b、大腸桿菌x1776(atcc31,537)和大腸桿菌w3110(atcc27,325)是適合的。這些實例是說明性的而非限制性的。在一些實施方案中，原核宿主細(xì)胞是革蘭氏陰性細(xì)菌。革蘭氏陰性細(xì)菌是指含有包圍通過革蘭氏染色(gramstaining)加以檢測的肽聚糖層的外膜的任何細(xì)菌。許多革蘭氏陰性細(xì)菌宿主細(xì)胞在本領(lǐng)域中是已知的。舉例來說，已知革蘭氏陰性細(xì)菌包括不限于變形菌門(proteobacteria)，諸如α變形菌綱(alphaproteobacteria)、β變形菌綱(betaproteobacteria)、γ變形菌綱(gammaproteobacteria)、ζ變形菌綱(zetaproteobacteria)、ε變形菌綱(epsilonproteobacteria)、δ變形菌綱(deltaproteobacteria)，以及酸桿菌門(acidobacteria)；藍菌門(cyanobacteria)；和螺旋體門(spirochaetes)。熟知革蘭氏陰性細(xì)菌可包括來自諸如埃希氏菌屬、沙門氏菌屬、志賀氏菌屬、假單胞菌屬、螺桿菌屬(heliobacter)、軍團菌屬(legionella)、奈瑟菌屬(neisseria)和克雷伯氏菌屬的屬的種。在一些實施方案中，本公開的革蘭氏陰性細(xì)菌是大腸桿菌。如本文所用，大腸桿菌可指屬于大腸桿菌種的細(xì)菌的任何菌株或分離株。大腸桿菌可包括天然存在的菌株或已諸如通過突變或用如本文所述的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化來遺傳修飾的菌株。在一些實施方案中，本公開的大腸桿菌是缺乏內(nèi)源性蛋白酶活性的菌株。在不希望束縛于理論下，據(jù)認(rèn)為缺乏內(nèi)源性蛋白酶活性的菌株可允許增強產(chǎn)生重組蛋白，諸如本公開的周質(zhì)蛋白質(zhì)，因為一些內(nèi)源性蛋白酶針對重組表達的底物具有活性(對于一個所述實例，參見baneyxf和georgiug1990j.bacteriol.172(1):491)。缺乏內(nèi)源性蛋白酶活性的菌株可包括其中編碼內(nèi)源性蛋白酶的基因被突變、缺失或另外失活的菌株。所述基因的實例可包括不限于degp、prc和ompt。用于將突變引入廣泛多種原核宿主細(xì)胞中(例如以獲得缺乏內(nèi)源性蛋白酶活性的工程改造菌株)的方法在本領(lǐng)域中是熟知的，參見例如snyderl等2013moleculargeneticsofbacteria第4版asmpress)?？稍诩?xì)菌中產(chǎn)生雙鏈蛋白質(zhì)諸如全長抗體、抗體融合蛋白和抗體片段，特別是當(dāng)不需要糖基化和fc效應(yīng)物功能時，諸如當(dāng)使治療性抗體綴合于本身在破壞腫瘤細(xì)胞方面顯示有效性的細(xì)胞毒性劑(例如毒素)時。全長抗體在循環(huán)中具有更久半衰期。在大腸桿細(xì)菌中的產(chǎn)生更快，并且更具有成本效率。對于在細(xì)菌中表達抗體片段和多肽，參見例如美國專利號5,648,237(carter等)、美國專利號5,789,199(joly等)、描述用于使表達和分泌最優(yōu)化的翻譯起始區(qū)(tir)和信號序列的美國專利號5,840,523(simmons等)。也參見charlton,methodsinmolecularbiology,第248卷(b.k.c.lo編,humanapress,totowa,n.j.,2003),第245-254頁，其描述在大腸桿菌中表達抗體片段。在表達之后，可將抗體從大腸桿菌細(xì)胞糊狀物分離于可溶性部分中，并且可視同種型而定通過例如蛋白質(zhì)a或g管柱來純化。最終純化可類似于用于純化例如在cho細(xì)胞中表達的抗體的方法來進行。用上述用于產(chǎn)生雙鏈蛋白質(zhì)的表達或克隆載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并且在如適于誘導(dǎo)啟動子，選擇轉(zhuǎn)化體，或擴增編碼所需序列的基因加以改良的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。(h)培養(yǎng)宿主細(xì)胞本公開的某些方面涉及在培養(yǎng)基中在包括生長期和產(chǎn)生期的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞。這些時期各自可進一步涉及在特定時期期間使宿主細(xì)胞生長所處的條件。舉例來說，如本文所用，生長期可包括生長溫度和生長攪拌速率，并且產(chǎn)生期可包括產(chǎn)生溫度和產(chǎn)生攪拌速率。生長期可指宿主細(xì)胞的培養(yǎng)物以指數(shù)方式生長所處的任何時間。如本文所用的生長溫度可指含有本公開的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基在所述宿主細(xì)胞的生長期期間的溫度。宿主細(xì)胞培養(yǎng)物的生長期可通過本領(lǐng)域中通常已知的方法來確定，例如通過隨時間測量培養(yǎng)物的光密度(例如在約550nm、約600nm的波長或兩者之間的波長下)以及確定指數(shù)生長期何時停止。如果宿主細(xì)胞含有具有pho啟動子的載體，那么生長期可指宿主細(xì)胞的培養(yǎng)物以指數(shù)方式生長，并且培養(yǎng)基中磷酸鹽的濃度足以防止誘導(dǎo)pho啟動子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄所處的任何時間。產(chǎn)生期可指宿主細(xì)胞的培養(yǎng)物產(chǎn)生產(chǎn)物所處的任何時間。如本文所用的產(chǎn)生溫度可指含有本公開的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基在所述宿主細(xì)胞的產(chǎn)生期期間的溫度。如果宿主細(xì)胞含有具有驅(qū)動產(chǎn)物的表達的pho啟動子的載體，那么生長期可指培養(yǎng)基中磷酸鹽的濃度足夠低下以誘導(dǎo)pho啟動子介導(dǎo)的產(chǎn)物基因轉(zhuǎn)錄所處的任何時間。在一些實施方案中，在高于產(chǎn)生溫度2℃至10℃的生長溫度下培養(yǎng)本公開的宿主細(xì)胞。在一些實施方案中，在高于產(chǎn)生溫度2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃或10℃的生長溫度下培養(yǎng)本公開的宿主細(xì)胞。在一些實施方案中，生長溫度高于產(chǎn)生溫度小于約任何以下量(以℃計)：10、9.5、9、8.5、8、7.5、7、6.5、6、5.5、5、4.5、4、3.5、3或2.5。在一些實施方案中，生長溫度高于產(chǎn)生溫度大于約任何以下量(以℃計)：2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9或9.5。也就是說，生長溫度高于產(chǎn)生溫度具有上限10、9.5、9、8.5、8、7.5、7、6.5、6、5.5、5、4.5、4、3.5、3或2.5，和獨立選擇的下限2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9或9.5的任何數(shù)量范圍，其中所述下限小于所述上限。在一些實施方案中，在生長期期間，生長溫度在約30℃至約34℃的范圍內(nèi)。在一些實施方案中，在生長期期間，生長溫度是約30℃、約30.5℃、約31℃、約31.5℃、約32℃、約32.5℃、約33℃、約33.5℃或約34℃。在一些實施方案中，在生長期期間，生長溫度小于約任何以下溫度(以℃計)：34、33.5、33、32.5、32、31.5、31或30.5。在一些實施方案中，在生長期期間，生長溫度大于約任何以下溫度(以℃計)：30、30.5、31、31.5、32、32.5、33或33.5。也就是說，在生長期期間，生長溫度可為具有上限34、33.5、33、32.5、32、31.5、31或30.5，和獨立選擇的下限30、30.5、31、31.5、32、32.5、33或33.5的任何溫度(以℃計)范圍，其中所述下限小于所述上限。在一些實施方案中，在產(chǎn)生期期間，產(chǎn)生溫度在約25℃至約29℃的范圍內(nèi)。在一些實施方案中，在產(chǎn)生期期間，產(chǎn)生溫度是約25℃、約25.5℃、約26℃、約26.5℃、約27℃、約27.5℃、約28℃、約28.5℃或約29℃。在一些實施方案中，在產(chǎn)生期期間，產(chǎn)生溫度小于約任何以下溫度(以℃計)：29、28.5、28、27.5、27、26.5、26或25.5。在一些實施方案中，在產(chǎn)生期期間，產(chǎn)生溫度大于約任何以下溫度(以℃計)：25、25.5、26、26.5、27、27.5、28或28.5。也就是說，在產(chǎn)生期期間，產(chǎn)生溫度可為具有上限29、28.5、28、27.5、27、26.5、26或25.5，和獨立選擇的下限25、25.5、26、26.5、27、27.5、28或28.5的任何溫度(以℃計)范圍，其中所述下限小于所述上限。攪拌速率是指攪拌(例如通過振蕩)細(xì)胞培養(yǎng)物所處的速率。如本文所用的生長攪拌速率可指在本公開的宿主細(xì)胞的生長期期間攪拌含有所述宿主細(xì)胞的培養(yǎng)物所處的速率。如本文所用的產(chǎn)生攪拌速率可指在本公開的宿主細(xì)胞的產(chǎn)生期期間攪拌含有所述宿主細(xì)胞的培養(yǎng)物所處的速率。可攪拌細(xì)胞培養(yǎng)物以維持細(xì)胞培養(yǎng)物的通氣。在一些實施方案中，在高于產(chǎn)生攪拌速率50至250rpm的生長攪拌速率下培養(yǎng)本公開的宿主細(xì)胞。在一些實施方案中，在高于產(chǎn)生攪拌速率50rpm、75rpm、100rpm、125rpm、150rpm、175rpm、200rpm、225rpm或250rpm的生長攪拌速率下培養(yǎng)本公開的宿主細(xì)胞。在一些實施方案中，生長攪拌速率高于產(chǎn)生攪拌速率小于約任何以下速率(以rpm計)：250、225、200、175、150、125、100或75。在一些實施方案中，生長攪拌速率低于產(chǎn)生攪拌速率大于約任何以下速率(以rpm計)：50、75、100、125、150、175、200或225。也就是說，生長攪拌速率高于產(chǎn)生攪拌速率具有上限250、225、200、175、150、125、100或75，和獨立選擇的下限50、75、100、125、150、175、200或225的任何速率(以rpm計)范圍，其中所述下限小于所述上限。在一些實施方案中，在生長期期間，生長攪拌速率在約600至800rpm的范圍內(nèi)。在一些實施方案中，在生長期期間，生長攪拌速率是約600rpm、約625rpm、約650rpm、約675rpm、約700rpm、約725rpm、約750rpm、約775rpm或約800rpm。在一些實施方案中，生長攪拌速率小于約任何以下速率(以rpm計)：800、775、750、725、700、675、650或625。在一些實施方案中，在生長期期間，生長攪拌速率大于約任何以下速率(以rpm計)：600、625、650、675、700、725、750或775。也就是說，在生長期期間，生長攪拌速率是具有上限800、775、750、725、700、675、650或625，和獨立選擇的下限600、625、650、675、700、725、750或775的任何速率(以rpm計)范圍，其中所述下限小于所述上限。在一些實施方案中，在產(chǎn)生期期間，產(chǎn)生攪拌速率在約300至500rpm的范圍內(nèi)。在一些實施方案中，在產(chǎn)生期期間，產(chǎn)生攪拌速率是約300rpm、約325rpm、約350rpm、約375rpm、約400rpm、約425rpm、約450rpm、約475rpm或約500rpm。在一些實施方案中，在產(chǎn)生期期間，產(chǎn)生攪拌速率小于約任何以下速率(以rpm計)：500、475、450、425、400、375、350或325。在一些實施方案中，在產(chǎn)生期期間，產(chǎn)生攪拌速率大于約任何以下速率(以rpm計)：300、325、350、375、400、425、450或475。也就是說，在產(chǎn)生期期間，產(chǎn)生攪拌速率是具有上限500、475、450、425、400、375、350或325，和獨立選擇的下限300、325、350、375、400、425、450或475的任何速率(以rpm計)范圍，其中所述下限小于所述上限。在不希望束縛于理論下，據(jù)認(rèn)為當(dāng)限制氧濃度時，氧轉(zhuǎn)移速率(otr)等于細(xì)胞的氧攝取速率(our)或代謝速率?？赏ㄟ^調(diào)整攪拌速率來促進對otr的操縱，由此操縱our。對our和它與otr的關(guān)系的更詳細(xì)描述可見于ochoa-garcia等,biotechnol.adv.27:153,2009中。用于測量細(xì)胞培養(yǎng)物的our的技術(shù)在本領(lǐng)域中是已知的，并且包括不限于使用質(zhì)譜儀來監(jiān)測來自細(xì)胞培養(yǎng)物的排氣的組成，以及計算細(xì)胞培養(yǎng)物的氧攝取速率和二氧化碳逸出速率。在一些實施方案中，在足以實現(xiàn)在生長期期間宿主細(xì)胞中氧攝取速率高于在產(chǎn)生期期間宿主細(xì)胞中峰值氧攝取速率0.5至2.5mmol/l/min的生長攪拌速率下培養(yǎng)本公開的宿主細(xì)胞。本公開發(fā)現(xiàn)使在產(chǎn)生期期間細(xì)胞培養(yǎng)物的攪拌速率降低至足以實現(xiàn)宿主細(xì)胞中氧攝取速率相較于生長期小于約2.5mmol/l/min的速率極大增強產(chǎn)物諸如本公開的雙鏈多肽的產(chǎn)生。在一些實施方案中，在足以實現(xiàn)在生長期期間宿主細(xì)胞中氧攝取速率高于在產(chǎn)生期期間宿主細(xì)胞中峰值氧攝取速率0.5mmol/l/min、1.0mmol/l/min、1.5mmol/l/min、2.0mmol/l/min或2.5mmol/l/min的生長攪拌速率下培養(yǎng)本公開的宿主細(xì)胞。在一些實施方案中，在足以實現(xiàn)在生長期期間宿主細(xì)胞中氧攝取速率高于在產(chǎn)生期期間宿主細(xì)胞中峰值氧攝取速率小于約任何以下氧攝取速率(以mmol/l/min計)的生長攪拌速率下培養(yǎng)本公開的宿主細(xì)胞：2.5、2.0、1.5或1.0。在一些實施方案中，在足以實現(xiàn)在生長期期間宿主細(xì)胞中氧攝取速率高于在產(chǎn)生期期間宿主細(xì)胞中峰值氧攝取速率大于約任何以下氧攝取速率(以mmol/l/min計)的生長攪拌速率下培養(yǎng)本公開的宿主細(xì)胞：0.5、1.0、1.5、2.0或2.5。也就是說，在足以實現(xiàn)在生長期期間宿主細(xì)胞中氧攝取速率高于在產(chǎn)生期期間宿主細(xì)胞中峰值氧攝取速率具有上限2.5、2.0、1.5或1.0，和獨立選擇的下限0.5、1.0、1.5、2.0或2.5的任何氧攝取速率(以mmol/l/min計)范圍的生長攪拌速率下培養(yǎng)本公開的宿主細(xì)胞。在一些實施方案中，在生長期期間，宿主細(xì)胞的峰值氧攝取速率在3.5mmol/l/min至4.5mmol/l/min的范圍內(nèi)。在一些實施方案中，在生長期期間，宿主細(xì)胞的峰值氧攝取速率是3.5mmol/l/min、3.75mmol/l/min、4.0mmol/l/min、4.25mmol/l/min或4.5mmol/l/min。在一些實施方案中，在產(chǎn)生期期間，宿主細(xì)胞的氧攝取速率在1.0mmol/l/min至3.0mmol/l/min的范圍內(nèi)。在一些實施方案中，在產(chǎn)生期期間，宿主細(xì)胞的氧攝取速率是1.0mmol/l/min、1.25mmol/l/min、1.5mmol/l/min、1.75mmol/l/min、2.0mmol/l/min、2.25mmol/l/min、2.5mmol/l/min、2.75mmol/l/min或3.0mmol/l/min。在一些實施方案中，在高于產(chǎn)生攪拌速率約10％至約40％(rpm/rpm)的生長攪拌速率下培養(yǎng)本公開的宿主細(xì)胞。在一些實施方案中，在具有下限即產(chǎn)生攪拌速率的至少10％、15％、20％、25％、30％或35％(rpm/rpm)，和獨立選擇的上限即產(chǎn)生攪拌速率的至多40％、35％、30％、25％、20％或15％(rpm/rpm)的生長攪拌速率下培養(yǎng)宿主細(xì)胞。在一優(yōu)選實施方案中，在10l發(fā)酵罐中在1巴背壓和20l/min的通氣速率下培養(yǎng)本公開的宿主細(xì)胞?？稍诙喾N培養(yǎng)基中培養(yǎng)本公開的宿主細(xì)胞。如本文所用的“培養(yǎng)基”是指支持本公開的細(xì)菌的生長的任何組合物或培養(yǎng)液。適合培養(yǎng)基可為液體或固體，并且含有支持細(xì)胞的生長和活力的任何營養(yǎng)物、鹽、緩沖劑、元素和其它化合物。培養(yǎng)基的常見營養(yǎng)物可包括氮、碳、氨基酸、碳水化合物、微量元素、維生素和礦物質(zhì)來源。這些營養(yǎng)物可以個別組分形式(如在確定培養(yǎng)基的情況下)或作為復(fù)雜提取物(例如酵母提取物)的組分加以添加。培養(yǎng)基可富含營養(yǎng)物以支持快速生長或最低限度地含有營養(yǎng)物以支持較緩慢生長。培養(yǎng)基也可含有用于抑制污染性生物體的生長或殺滅污染性生物體的任何試劑(例如抗生素)。培養(yǎng)基也可含有用于控制誘導(dǎo)型啟動子或酶的活性的任何化合物(作為一個實例，可包括iptg以誘導(dǎo)由lac操縱元或在功能上類似的啟動子控制的任何多核苷酸的表達)。適合培養(yǎng)基的許多實例在本領(lǐng)域中是熟知的，并且包括不限于m9培養(yǎng)基、溶原性培養(yǎng)液(lb)、極品培養(yǎng)液(tb)、nzy培養(yǎng)液、sob培養(yǎng)基和yt培養(yǎng)液。任何這些培養(yǎng)基必要時都可補充以鹽(諸如氯化鈉、鈣、鎂和磷酸鹽)、緩沖劑(諸如hepes)、核苷酸(諸如腺苷和胸苷)、抗生素、抗霉物質(zhì)、微量元素(定義為通常在微體積摩爾濃度范圍內(nèi)的最終濃度下存在的無機化合物)、葡萄糖和/或適當(dāng)能量來源。見于原核細(xì)胞培養(yǎng)基中的典型成分包括酵母提取物、鹽(例如nacl)、胰蛋白胨、緩沖劑(例如磷酸鹽緩沖劑)、甘油等。任何其它必要補充劑也可在將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的適當(dāng)濃度下加以包括。諸如溫度、ph等的培養(yǎng)條件是先前在選擇用于表達的原核宿主細(xì)胞的情況下使用的那些，并且將為普通熟練技術(shù)人員顯而易知。(i)純化生物活性多肽本公開的某些方面涉及從宿主細(xì)胞回收生物活性多肽。通常，回收(術(shù)語“純化(purifying/purification)可在本文中可互換使用)本公開的生物活性多肽涉及從宿主細(xì)胞(或如果多肽被分泌至培養(yǎng)基中，那么從細(xì)胞培養(yǎng)基)分離所述多肽，以及從其它相伴大分子例如細(xì)胞碎片和其它多肽純化所述多肽。用于從多種宿主細(xì)胞區(qū)室純化多種蛋白質(zhì)的眾多技術(shù)在本領(lǐng)域中是已知的(參見例如evans,jr.,tc和xumq(編)heterologousgeneexpressionine.coli(2011)methodsinmolecularbiology第705卷,humanapress)。以下描述示例性技術(shù)，但這些技術(shù)僅出于說明性目的而包括以補充熟練技術(shù)人員的理解，并且決不意圖具有限制性。當(dāng)使用重組技術(shù)時，雙鏈蛋白質(zhì)諸如分泌蛋白可在細(xì)胞內(nèi)，在周質(zhì)間隙中產(chǎn)生，或直接分泌至培養(yǎng)基中。如果分泌蛋白在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生，那么作為第一步驟，例如通過離心或超濾來移除顆粒碎片，即宿主細(xì)胞或經(jīng)溶解片段。在一些實施方案中，從宿主細(xì)胞的周質(zhì)回收分泌蛋白。carter等,bio/technology10:163-167(1992)描述用于分離分泌至大腸桿菌的周質(zhì)間隙中的分泌蛋白的程序。簡要來說，在乙酸鈉(ph3.5)、edta和苯基甲基磺酰氟(pmsf)存在下歷經(jīng)約30分鐘使細(xì)胞糊狀物解凍?？赏ㄟ^離心來移除細(xì)胞碎片。當(dāng)分泌蛋白被分泌至培養(yǎng)基中時，通常首先使用可商購獲得的蛋白質(zhì)濃縮過濾器例如amicon或milliporepellicon超濾裝置來濃縮來自所述表達系統(tǒng)的上清液?？蓪⒌鞍酌敢种苿┲T如pmsf包括在任何先前步驟中以抑制蛋白水解，并且可包括抗生素以防止不定污染物的生長。由細(xì)胞制備的分泌蛋白組合物可使用例如羥磷灰石色譜法、疏水性相互作用色譜法、凝膠電泳、透析和親和色譜法來純化，其中親和色譜法屬于通常優(yōu)選的純化步驟之一。關(guān)于抗體，蛋白質(zhì)a作為親和配體的適合性取決于抗體中存在的任何免疫球蛋白fc結(jié)構(gòu)域的種類和同種型。蛋白質(zhì)a可用于純化基于人γ1、γ2或γ4重鏈的抗體(lindmark等,j.immunol.meth.62:1-13(1983))。蛋白質(zhì)g被推薦用于所有小鼠同種型和人γ3(guss等,emboj.5:15671575(1986))。親和配體所連接的基質(zhì)最常是瓊脂糖，但其它基質(zhì)是可用的。相比于可用瓊脂糖實現(xiàn)的流速和處理時間，機械穩(wěn)定基質(zhì)諸如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯允許流速更快以及處理時間更短。當(dāng)抗體包含ch3結(jié)構(gòu)域時，bakerbondabxtm樹脂(j.t.baker,phillipsburg,n.j.)適用于純化。視待回收的抗體而定，其它蛋白質(zhì)純化技術(shù)諸如在離子交換柱上分級分離、乙醇沉淀、反相hplc、二氧化硅色譜法、肝素sepharosetm色譜法、陰離子或陽離子交換樹脂色譜法(諸如聚天冬氨酸柱)、色譜聚焦、sds-page和硫酸銨沉淀也是可用的。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到適用于抗體回收的許多這些技術(shù)可易于應(yīng)用于回收其它雙鏈蛋白質(zhì)諸如分泌蛋白。一般來說，用于制備供在研究、測試和臨床中使用的抗體的各種方法在本領(lǐng)域中是明確確定的，與上述方法一致和/或如由本領(lǐng)域技術(shù)人員視為適于特定目標(biāo)抗體。實施例通過參照以下實施例，本公開將得以更充分了解。然而，它們不應(yīng)被解釋為限制本公開的范圍。應(yīng)了解本文所述的實施例和實施方案僅出于說明目的，并且根據(jù)其的各種修改或變化將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所想起，并將包括在本申請的精神和界限以及隨附權(quán)利要求的范圍內(nèi)?？s寫：ab(抗體)、hab(半抗體)、hc(重鏈)、immtac(抗癌免疫動員單克隆t細(xì)胞受體)、iptg(異丙基β-d-1-硫代半乳糖吡喃糖苷)、lc(輕鏈)、od(光密度)、orf(開放閱讀框)、otr(氧轉(zhuǎn)移速率)、our(氧攝取速率)、tg(生長溫度)、tp(產(chǎn)生溫度)、tir(翻譯起始區(qū))、xil4(抗白介素-4)、xil13(抗白介素-13)、xil17(抗白介素-17)和xil33(抗白介素-33)。實施例1：伴侶蛋白和氧化還原酶水平對半抗體產(chǎn)生效價的影響使用重組技術(shù)產(chǎn)生異源性分泌蛋白對于許多治療性分子是重要的。多特異性抗體(例如雙特異性抗體)是具有許多重要治療用途諸如癌癥免疫療法和其它應(yīng)用的異源性分泌蛋白的一個非限制性實例。產(chǎn)生供治療使用的多特異性抗體要求能夠在工業(yè)規(guī)模上產(chǎn)生這些抗體諸如半抗體(hab)的構(gòu)筑嵌段。為滿足這個要求，本文描述超過標(biāo)準(zhǔn)方法在產(chǎn)生方面給予顯著增加的優(yōu)化表達載體和方法步驟。重要的是，發(fā)現(xiàn)用于與伴侶蛋白fkpa、dsba和dsbc組合共表達hab的重鏈(hc)和輕鏈(lc)的單一質(zhì)粒或可相容質(zhì)粒系統(tǒng)顯著增強經(jīng)裝配hab的產(chǎn)生。測試這個系統(tǒng)，并且發(fā)現(xiàn)其改進多種hab的產(chǎn)生，從而證明它用于產(chǎn)生許多分泌蛋白的廣泛效用。隨后對方法步驟(包括例如攪拌速率、ph、fkpa啟動子和在不同培養(yǎng)時期的培養(yǎng)溫度)的優(yōu)化導(dǎo)致產(chǎn)物產(chǎn)率甚至進一步顯著增加。材料和方法半抗體(hab)載體構(gòu)建以與ep1356052中所述的方式類似的那些方式構(gòu)建載體。特定來說，制備用于表達hab的各種表達載體。對于各載體，將表達盒在ecori位點處克隆至大腸桿菌質(zhì)粒pbr322的框架中(sutcliffe,coldspringharborsymp.quant.biol.43:77-90,1978)。各表達盒含有至少以下組分：(1)用于控制轉(zhuǎn)錄的phoa啟動子(kikuchi等,nucleicacidsres.9:5671-5678,1981)；(2)用于翻譯起始的來自大腸桿菌trp的shine-dalgarno序列、熱穩(wěn)定腸毒素ii(stii)信號序列或兩者組合(chang等,gene55:189-196,1987)；和(3)用以終止轉(zhuǎn)錄的λt0終止子(scholtissek和grosse,nucleicacidsres.15:3185,1987)。另外，stii信號序列或此信號序列的沉默密碼子變體位于輕鏈或重鏈的編碼序列之前。這個序列引導(dǎo)多肽分泌至周質(zhì)中(picken等,infect.immun.42:269-275,1983；以及simmons和yansura,naturebiotechnology14:629-634,1996)。設(shè)計具有單獨順反子的載體以提供免疫球蛋白輕鏈和重鏈基因的獨立表達。在此類載體中，各鏈的順反子單元在它的自身phoa啟動子的控制下，并且繼之以λt0終止子。此外，各順反子并有tir(翻譯起始區(qū))以調(diào)節(jié)輕鏈與重鏈兩者的表達(simmons等,j.immunol.meth.,263:133-147,2002)。在一個示例性實施方案中，表達盒從5’至3’含有第一phoa啟動子，繼之以輕鏈的順反子(tir-l+輕鏈)和第一λt0終止子，以及第二phoa啟動子，繼之以重鏈的順反子(tir-h+重鏈)和第二λt0終止子。或者，表達盒從5’至3’含有第一phoa啟動子，繼之以重鏈的順反子(tir-h+重鏈)和第一λt0終止子，以及第二phoa啟動子，繼之以輕鏈的順反子(tir-l+輕鏈)和第二λt0終止子。tir-l與tir-h兩者均含于stii信號序列或其變體內(nèi)。對于xil13和xil4igg4hab表達載體，評估1,1和2,2的tir組合。對于xil17和xil33igg4hab表達載體，評估tir2,2。第一編號代表輕鏈的tir強度，并且第二編號代表重鏈的tir強度。除xil13、xil4、xil17和xil33igg4hab之外，也構(gòu)建并測試其它igg1同種型hab載體。伴侶蛋白表達質(zhì)粒構(gòu)建為測定待與上述載體組合以產(chǎn)生xil13、xil4、xil17和xil33hab的最高效價的伴侶蛋白表達，提供用于共表達的質(zhì)粒。測試許多已知伴侶蛋白，包括fkpa蛋白，即具有伴侶蛋白活性的肽基脯氨酰基順-反異構(gòu)酶。為此，構(gòu)建含有fkpa的orf的可相容質(zhì)粒(pacyc，novagen,madison,wi)，如ep1356052(參見例如實施例9-10，特別是段落[0207])中所述。根據(jù)當(dāng)前方法的這個操作進行擴展，類似地產(chǎn)生一組fkpa可相容載體以調(diào)節(jié)fkpa共表達水平。通過如先前所述優(yōu)化信號肽來實現(xiàn)對fkpa水平的調(diào)節(jié)(simmons和yansura(上文),1996)。簡要來說，fkpaorf的5’末端含有fkpa信號肽(天然或變體)或stii信號肽。所有fkpa變體基因構(gòu)建體都在tacii啟動子的控制下。接著將這些質(zhì)粒與上述hab表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化至菌株66f8中。宿主菌株66f8的基因型是w3110δfhuaδphoailvg2096(valr)δprcspr43h1δdegpδmanalaciqδomptδmene。對于xil13hab，構(gòu)建編碼半抗體的lc和hc以及fkpa的tir1,1和tir2,2質(zhì)粒，并且用于轉(zhuǎn)化66f8。在這些質(zhì)粒構(gòu)建體中，fkpa的表達由在lc的orf的上游的phoa啟動子控制。pbr322質(zhì)粒通常在約30個拷貝/細(xì)胞下維持(bolivar等,gene,2:95-113,1977)，并且pacyc質(zhì)粒通常在約15個拷貝/細(xì)胞下維持(chang和cohen,j.bacteriol.,134:1141-1156,1978)。在不希望束縛于理論下，據(jù)認(rèn)為當(dāng)將fkpa移動于ab表達質(zhì)粒上時的拷貝數(shù)增加可導(dǎo)致制備的fkpa的量增加。氧化還原酶質(zhì)粒構(gòu)建類似于對于fkpa的共表達所述的可相容質(zhì)粒系統(tǒng)，可相容質(zhì)粒與并有一種先前描述的fkpatir變體的hab表達質(zhì)粒組合用于篩選各種已知氧化還原酶。用標(biāo)識為pxil13.2.2.fkpac13的tir2,2質(zhì)粒進行這個操作。此外，可相容質(zhì)粒與xil4和其它igg1hab組合用于篩選fkpa和氧化還原酶。原始氧化還原酶可相容質(zhì)粒的構(gòu)建如ep1356052(參見例如實施例9)中所述。對氧化還原酶的篩選包括與hab表達質(zhì)粒xil13.2.2.fkpac13一起從可相容質(zhì)粒jj247進行表達。在xil13hab實例的情況下，將氧化還原酶表達用1mmiptg誘導(dǎo)或保持不誘導(dǎo)以調(diào)節(jié)氧化還原酶水平。也構(gòu)建編碼hab的lc和hc以及伴侶蛋白fkpa、dsba和dsbc的單一質(zhì)粒，并且用于轉(zhuǎn)化66f8。在xil13hab實例的情況下，構(gòu)建在用于驅(qū)動fkpa的表達的啟動子方面不同的兩種tir2,2單一質(zhì)粒。單一質(zhì)粒md157含有用于fkpa表達的phoa啟動子，并且質(zhì)粒ka01含有tacii啟動子。利用不同啟動子允許進一步調(diào)節(jié)fkpa表達。在xil17hab實例的情況下，構(gòu)建tir2,2單一質(zhì)粒(md341)，其利用phoa啟動子來達成fkpa表達。在所有單一質(zhì)粒條件下，dsba和dsbc的表達都以多順反子方式在tacii啟動子的控制下。在xil4hab實例的情況下，構(gòu)建并有下述可相容伴侶蛋白質(zhì)粒ah8145的orf的tir2,2單一質(zhì)粒，并且標(biāo)識為cb1。除上述單一質(zhì)粒系統(tǒng)之外，也在具有igg1同種型與igg4同種型兩者的許多hab的情況下評估三重伴侶蛋白可相容質(zhì)粒系統(tǒng)。在可相容質(zhì)粒系統(tǒng)中，將先前描述的fkpatir變體之一克隆至多順反子dsba和dsbc可相容質(zhì)粒(jj247)中，并且標(biāo)識為ah8145。發(fā)酵方法大規(guī)模產(chǎn)生基本上如ep1356052(參見例如實施例4和段落[0159]-[160])中所述。對于各10升發(fā)酵，使0.5ml冷凍儲備培養(yǎng)物(含有10-15％dmso)解凍，并且用于接種含有500ml大豆lb培養(yǎng)基的2l振蕩燒瓶，所述培養(yǎng)基補充以0.5ml四環(huán)素溶液(5mg/ml)和/或2ml卡那霉素溶液(5mg/ml)以及2.5ml1m磷酸鈉溶液。使這個種子培養(yǎng)物在30℃下在振蕩下生長約16小時，并且接著用于接種10升發(fā)酵罐。發(fā)酵罐初始含有約7.0升培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基含有1.1g葡萄糖、100ml1m硫酸鎂、10ml微量元素溶液(在最終體積1升中：100ml鹽酸、27g氯化鐵六水合物、8g硫酸鋅七水合物、7g氯化鈷六水合物、7g鉬酸鈉二水合物、8g硫酸銅五水合物、2g硼酸、5g硫酸錳單水合物)、20ml四環(huán)素溶液(5mg/ml于乙醇中)或250ml氨芐青霉素溶液(2mg/ml)、1袋hcd鹽(37.5g硫酸銨、19.5g磷酸氫二鉀、9.75g磷酸二氫鈉二水合物、7.5g檸檬酸鈉二水合物、11.3g磷酸二氫鉀)、200gbl4大豆(一種大豆蛋白水解物)和100克酵母提取物。初始在30℃下在20標(biāo)準(zhǔn)升/分鐘(slpm)的空氣流的情況下進行發(fā)酵，并且控制在7.0±0.2的ph下(盡管在一些情況下發(fā)生偶爾偏移超出這個范圍)。使發(fā)酵罐的背壓維持在1巴規(guī)格下，并且初始將攪拌速率設(shè)置成650rpm。如以下實施例2中所詳細(xì)討論，也可改變攪拌速率以操縱發(fā)酵罐中的氧轉(zhuǎn)移速率，并且因此控制細(xì)胞呼吸速率。此外，如以下實施例3中所詳細(xì)討論，可調(diào)整在生長期和產(chǎn)生期期間的溫度以使產(chǎn)物產(chǎn)率最大化。在用來自振蕩燒瓶的含細(xì)胞培養(yǎng)基接種發(fā)酵罐之后，通過使用基于計算機的算法來將濃縮葡萄糖溶液饋入發(fā)酵罐中，使培養(yǎng)物在發(fā)酵罐中生長至高細(xì)胞密度。需要時也將氫氧化銨(58％溶液)和硫酸(24％溶液)饋入發(fā)酵罐中以控制ph。在一些情況下，也添加l-61消泡劑以控制起泡。當(dāng)培養(yǎng)物達到約40od550的細(xì)胞密度時，再添加100ml1m硫酸鎂至發(fā)酵罐中。另外，添加濃縮鹽饋料(在最終體積1250ml中：12.5g硫酸銨、32.5g磷酸氫二鉀、16.25g磷酸二氫鈉二水合物、2.5g檸檬酸鈉二水合物、18.75g磷酸二氫鉀、10ml2.7％氯化鐵和10ml微量元素)至發(fā)酵罐中，并且當(dāng)培養(yǎng)物達到約20od550時在2.5ml/min的速率下開始，并且持續(xù)直至將約1250ml添加至發(fā)酵中。通常使發(fā)酵持續(xù)70-80小時。用于電泳、免疫印跡和hplc分析的樣品制備非還原可溶性樣品制備類似于ep1356052中所述(參見例如實施例4，特別是段落[0162])。特定來說，如下制備非還原可溶性樣品：在室溫下使冷凍的在發(fā)酵過程期間獲取的1ml全培養(yǎng)液樣品解凍。添加100μl解凍全培養(yǎng)液至500μl提取緩沖液中。(提取緩沖液：10mmtris(ph6.8)、5mmedta、新鮮添加的0.2mg/ml母雞卵溶菌酶和用以達到5-10mm的最終濃度的新鮮制備的碘乙酸。)使全培養(yǎng)液樣品加提取緩沖液在冰上孵育5-10分鐘，接著超聲處理2x10個脈沖，然后在4℃和14,000rpm下離心15-20分鐘。將上清液作為可溶性級分加以移除。對于通過sds-page和免疫印跡進行的分析，將可溶性級分1:10稀釋至無還原劑的2xnovex三(羥甲基)甲基甘氨酸樣品緩沖液中。將10μl這個制備物上樣于10孔novex10％bis-trisnupage凝膠上，并且在150v下在mes緩沖液的情況下進行電泳。凝膠接著用于免疫印跡或用考馬斯藍染色。提交可溶性級分的樣品以通過lc-κ/rp測定進行分析。這個測定是2維hplc測定，其中第一柱是捕集含有κ-輕鏈的igg組分的親和柱，并且第二柱是反相柱。將積分hplc工作站配置成雙柱模式。溶劑儲集器是：溶劑1a，親和上樣緩沖液；溶劑1b，親和洗脫緩沖液，含0.2％tfa的水；溶劑2a，反相水性緩沖液，含0.1％tfa的水；溶劑2b，反相有機洗脫緩沖液，含0.1％tfa的80％乙腈。第一柱是從lifetechnologies(carlsbad,ca)購買的captureselecttmlcκ親和柱(2.1x30mm)。涉及親和柱的所有程序都在環(huán)境溫度下進行。第二柱是從lifetechnologies(carlsbad,ca)購買的r220μm反相柱(2.1x30mm)。使反相柱溫度維持在80℃下。使親和柱于上樣緩沖液中平衡，并且將樣品在2ml/min的流速下上樣。將流穿物引導(dǎo)至廢棄物中。在將樣品上樣之后，用上樣緩沖液(3ml)洗滌親和柱以減少非特異性結(jié)合的組分。接著，通過閥轉(zhuǎn)換，使親和柱連接于反相柱，并且用洗脫緩沖液(5ml)在2ml/min的流速下洗脫以將親和捕集組分轉(zhuǎn)移至反相柱中。在這個轉(zhuǎn)移步驟期間，使積分紫外檢測器位于親和柱之后以及反相柱之前，因此監(jiān)測親和柱的洗脫物，所述洗脫物變?yōu)榉聪嘀纳蠘游铩Ｔ谙疵撘约皬姆聪嘀鶖嚅_之后，將親和柱用水(2ml)洗滌，并且隨后用上樣緩沖液(4ml)再平衡。將上樣反相柱用0.1％tfa水溶液(1.1ml)洗滌。將流速設(shè)置成2ml/min，并且將快速梯度(0.25min)操作成35％溶劑2b(0.1％tfa/80％乙腈)，繼之以歷經(jīng)3分鐘達到50％溶劑2b的平緩梯度。洗脫通過在0.5分鐘內(nèi)達到100％溶劑2b，并且持續(xù)1.5分鐘的梯度來完成。接著使反相柱在0.05分鐘內(nèi)返回至初始條件，并且持續(xù)2分鐘以進行再平衡。在280和214nm下監(jiān)測柱洗脫物。基于由反相柱獲得的分離，通過將積分峰面積與已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)物的那些積分峰面積比較來進行定量。也定量在發(fā)酵過程期間產(chǎn)生的lc和hc的可溶量和總量。為進行總體rp-hplc定量，用含100mmdl-二硫蘇糖醇(sigma目錄號43816)的6m鹽酸胍、360mmtris、2mmedta(ph8.6)將發(fā)酵培養(yǎng)液樣品稀釋10倍，用200mm。將樣品渦旋，在60℃下孵育20分鐘，并且在4℃下在13,000rpm下離心15分鐘。在于hplc上注射之前使用0.22um過濾器過濾可溶性級分。所用hplc系統(tǒng)是agilenttechnologies1290infinity系統(tǒng)。將樣品注射于zorbax300sb-c3快速分離(rapidresolution)(4.6x150mm，3.5微米)分析柱(目錄號863973-909)上。流動相a由含0.1％三氟乙酸(thermo目錄號28901)的sqh2o組成，并且流動相b是含0.08％三氟乙酸的hplc級乙腈(honeywell目錄號ah015-4)。為進行總體可溶性rp-hplc定量，用pro-scientificdps-20使發(fā)酵培養(yǎng)液樣品均質(zhì)化(10,000rpm)并進行超聲處理(88％振幅)，持續(xù)10秒4次。接著在4℃和14,000rpm下離心樣品15-20分鐘。將上清液作為可溶性級分加以移除，并且如上所述進行變性以及在rp-hplc上處理。結(jié)果fkpa表達對hab效價的影響如圖1a中所示，從xil13habtir1,1載體產(chǎn)生輕鏈和重鏈亞單位導(dǎo)致輕鏈和重鏈產(chǎn)生的總量分別是2.9g/l和1.2g/l。對于tir2,2，產(chǎn)生的輕鏈和重鏈的總量分別是6.4g/l和4.1g/l。然而，總體亞單位產(chǎn)生的量不導(dǎo)致顯著可溶性亞單位積累。使用xil13tir1,1hab質(zhì)粒，產(chǎn)生的輕鏈和重鏈的總可溶量分別是0.2g/l和小于0.1g/l(圖1b)。對于tir2,2hab，產(chǎn)生的輕鏈和重鏈的總可溶量分別是0.3g/l和0.3g/l(圖1c)。產(chǎn)生的經(jīng)裝配xil13hab的效價對于tir1,1發(fā)酵僅是0.1g/l，并且對于tir2,2發(fā)酵，效價小于0.2g/l(圖2)。這些結(jié)果表明在hab產(chǎn)物的折疊和/或裝配方面存在顯著低效。因此，進行評估使用tir1,1和tir2,2質(zhì)粒在伴侶蛋白的共表達的情況下對效價的影響的進一步研究。已知若干類別的伴侶蛋白會促進蛋白質(zhì)折疊和裝配(圖3a-b)。特定目標(biāo)伴侶蛋白包括fkpa，已知其充當(dāng)肽基-脯氨?；?反異構(gòu)酶和伴侶蛋白；以及dsba和dsbc，已知其充當(dāng)氧化還原酶。進行實驗以測試fkpa、dsba和dsbc的表達是否影響hab產(chǎn)生。特定來說，考查使用單獨質(zhì)粒(可相容質(zhì)粒系統(tǒng))或編碼habhc和lcorf的同一質(zhì)粒(單一質(zhì)粒系統(tǒng))表達fkpa的影響(圖4a-b)。使用單一表達質(zhì)粒消除對使用多種抗生素或其它選擇壓力手段來確保質(zhì)粒保留的需要。在用于xil13hab的單一質(zhì)粒系統(tǒng)中，使驅(qū)動fkpa表達的啟動子從iptg誘導(dǎo)型tacii啟動子變?yōu)閜hoa啟動子。因此，培養(yǎng)物中磷酸鹽耗盡導(dǎo)致hc、lc和fkpa的表達。對于igg1同種型hab(xvegf)，除經(jīng)裝配hab增加之外，fkpa伴侶蛋白共表達水平增加也與可溶性單體重鏈積累量增加相關(guān)聯(lián)(圖5a)。在這個實驗中，在1mmiptg誘導(dǎo)的情況下篩選如先前所述的一組fkpa表達變體。在無fkpa共表達的情況下，xvegfhab的效價是0.2g/l，并且在fkpa共表達的最高水平的情況(fkpa(wt))下，hab效價是約0.4g/l(圖5b)。對于xil13hab的產(chǎn)生，測試使用tir1,1或tir2,2抗體表達載體的可相容質(zhì)粒系統(tǒng)(從一種質(zhì)粒表達xil13hc和lc，以及從另一質(zhì)粒表達fkpa，如圖4a中所示)。對于用1mmiptg誘導(dǎo)以驅(qū)動fkpa的共表達的可相容質(zhì)粒系統(tǒng)，對于tir1,1質(zhì)粒，效價是0.2g/l，并且對于tir2,2質(zhì)粒，效價是0.4g/l(圖6a，泳道3和4)。相較于伴有內(nèi)源性fkpa水平的tir1,1和tir2,2條件(圖6a，泳道1和2)，這導(dǎo)致效價增加近似兩倍。圖6b顯示相較于內(nèi)源性表達，在可相容系統(tǒng)的情況下誘導(dǎo)的fkpa表達的量，如通過超高效液相色譜法(uplc)以毫吸收單位(mau)以及蛋白質(zhì)印跡所測量。也測試圖4b中所示的用于fkpa表達和hab產(chǎn)生的單一質(zhì)粒系統(tǒng)。對于xil13hab，對于單一質(zhì)粒tir1,1和tir2,2，效價分別是0.4g/l和0.7g/l(圖6a)。這代表超過可相容質(zhì)粒系統(tǒng)在效價方面增加約兩倍。fkpa在單一質(zhì)粒系統(tǒng)中的表達水平也比在誘導(dǎo)可相容質(zhì)粒系統(tǒng)中高約兩倍(圖6b)。fkpa表達水平增加與在兩種tir條件下可溶性單體重鏈積累量均增加相關(guān)聯(lián)。以tir1,1與tir2,2兩種條件，在從可相容質(zhì)粒系統(tǒng)誘導(dǎo)fkpa共表達的情況下測試第三hab(xil4igg4)。在這個實驗中，在兩種tir條件下fkpa(wt)共表達均使可溶性單體重鏈的量增加(圖7a)，但不導(dǎo)致產(chǎn)生的hab的效價增加(圖7b)。在從可相容質(zhì)粒系統(tǒng)誘導(dǎo)fkpa共表達的情況下測試第四hab(xvegfcigg1)。在這個實驗中，fkpa(wt)共表達使可溶性單體重鏈的量增加，并且使效價從0.5g/l增加至0.8g/l(圖8a)。如通過考馬斯染色所測定的fkpa表達增加(圖8b)與可溶性單體hc鏈積累增加(圖8c)相關(guān)聯(lián)。總之，這些結(jié)果表明fkpa表達使可溶性單體重鏈的積累增強，但對經(jīng)裝配hab效價的影響可變。這指示進一步優(yōu)化是合乎需要的。dsba和dsbc表達對hab效價的影響通過組合上述pxil13.2.2.fkpac13(單一質(zhì)粒)與用于表達氧化還原酶dsba和dsbc的可相容質(zhì)粒(圖9)來進一步優(yōu)化xil13hab產(chǎn)生。表達dsba與dsbc兩者的質(zhì)粒(jj247)與pxil13.2.2.fkpac13一起使hab效價增加。圖10顯示在存在和不存在iptg誘導(dǎo)dsba和dsbc下，隨時間產(chǎn)生的xil13hab的效價。對于pxil13.2.2.fkpac13與jj247一起，在進入發(fā)酵52小時實現(xiàn)最高效價。在這個時間點，在無iptg的條件(非誘導(dǎo)條件)下，xil13效價是1.2±0.2g/l，并且在有iptg的條件(誘導(dǎo)條件)下，xil13效價是1.0±0.2g/l(圖10)。對于兩種測試條件，從52至72小時，效價下降均是顯著的，并且歸因于在發(fā)酵過程期間氧攝取速率(our)下降和同滲重摩升高，如實施例2中所述。也在xil4tir1,1和tir2,2ab表達質(zhì)粒的情況下評估用于表達dsba、dsbc和fkpa的可相容系統(tǒng)(ah8145)(圖11a)。所有三種伴侶蛋白的非誘導(dǎo)共表達導(dǎo)致tir1,1和tir2,2效價分別是0.8g/l和1.2g/l(圖12泳道5和6)。這代表相較于先前描述的fkpa可相容tir2,2條件(圖12泳道3和4)，對于tir2,2條件，效價增加約六倍。在另一hab的情況下進一步評估可相容非誘導(dǎo)ah8145質(zhì)粒系統(tǒng)。使用用以產(chǎn)生xvegfcigg1hab的基于tir2,2的載體，相較于僅fkpa共表達，非誘導(dǎo)可相容ah8145條件使效價從0.8g/l增加至1.0g/l(圖13)。在ah8145可相容質(zhì)粒的情況下，以tir1,1與tir2,2兩種條件測試第五hab(xvegfaigg1)。在無伴侶蛋白共表達的情況下，對于tir1,1與tir2,2兩種條件，效價是類似的，約為0.9g/l(圖14泳道1和3)。就處于非誘導(dǎo)ah8145條件下的可相容質(zhì)粒來說，對于tir1,1和tir2,2質(zhì)粒，效價分別是1.2g/l和1.7g/l(圖14泳道2和4)。造成對并有ah8145的伴侶蛋白orf的xil4tir2,2單一質(zhì)粒的產(chǎn)生(cb1)，并且說明于圖11b中。cb1質(zhì)粒在不添加iptg下產(chǎn)生的效價略微高于在可相容質(zhì)粒系統(tǒng)的情況下觀察的效價(圖15)。應(yīng)注意，這個比較中報道的hab效價由利用如實施例2中所述的優(yōu)化攪拌策略的發(fā)酵產(chǎn)生。根據(jù)蛋白質(zhì)印跡，在cb1的情況下，所有三種伴侶蛋白的水平略微較高(圖15)。在不希望束縛于理論下，單一質(zhì)粒系統(tǒng)可允許達成較高質(zhì)?？截悢?shù)，其可導(dǎo)致產(chǎn)率較高。將xil13單一質(zhì)粒系統(tǒng)md157與未誘導(dǎo)可相容pxil13.2.2.fkpac13和jj247可相容質(zhì)粒系統(tǒng)進行比較(圖16)。相較于在可相容系統(tǒng)中的1.9±0.04g/l，md157單一質(zhì)粒條件產(chǎn)生2.1±0.3g/l的效價(圖17)。應(yīng)注意，這個比較中報道的效價由利用如實施例2中所述的優(yōu)化攪拌策略的發(fā)酵產(chǎn)生。總之，這些結(jié)果證明連同dsba和dsbc一起共表達fkpa使經(jīng)裝配hab的產(chǎn)生增加，使用多種hab構(gòu)建體來確認(rèn)這些影響。實施例2：氧攝取對半抗體產(chǎn)生的影響以上結(jié)果證明通過連同habhc和lc一起fkpa、dsba和dsbc的共表達實現(xiàn)hab產(chǎn)生改進。然而，即使在這個產(chǎn)生增強的情況下，也發(fā)現(xiàn)效價在52小時產(chǎn)生之后的時間點達到平穩(wěn)狀態(tài)或甚至減小。因此，進行額外實驗以進一步優(yōu)化hab產(chǎn)生。如先前所述，初始在30℃下在20標(biāo)準(zhǔn)升/分鐘(slpm)的空氣流的情況下進行發(fā)酵，并且控制在7.0±0.2的ph下。使發(fā)酵罐的背壓維持在1巴規(guī)格下，并且初始將攪拌速率設(shè)置成650rpm。所述額外巴規(guī)格的背壓導(dǎo)致200％的初始溶氧濃度(do2)。在do2信號下降低于起始水平的2％(通常是進入產(chǎn)生培養(yǎng)的約兩小時)之后饋入濃縮葡萄糖溶液，并且歷經(jīng)發(fā)酵過程連續(xù)饋入以使葡萄糖是非限制性營養(yǎng)物。在12小時，培養(yǎng)物中的細(xì)胞密度足以維持do2濃度處于或接近零值百分比。在不希望束縛于理論下，據(jù)認(rèn)為當(dāng)限制氧濃度時，氧轉(zhuǎn)移速率(otr)等于細(xì)胞的氧攝取速率(our)或代謝速率。對otr的操作通過調(diào)整攪拌速率來促進，并且對培養(yǎng)物our具有直接影響。質(zhì)譜儀用于監(jiān)測來自發(fā)酵的排氣的組成，并且使得能夠計算發(fā)酵中的氧攝取速率和二氧化碳逸出速率。如圖18中所示，在上述pxil13.2.2.fkpac13與jj247質(zhì)粒系統(tǒng)的情況下，誘導(dǎo)tir2,2培養(yǎng)物與非誘導(dǎo)tir2,2培養(yǎng)物兩者在第12小時均具有4.25mmol/l/min的峰值our，在所述時點之后，do2變得受限制。使這些培養(yǎng)物在處于650rpm的恒定速率下的攪拌下生長。圖19顯示這些培養(yǎng)物隨時間的同滲重摩。總之，圖18-19顯示在50時間之后，細(xì)胞培養(yǎng)物our急劇下降，并且同滲重摩升高。圖20顯示在這些培養(yǎng)物中隨時間產(chǎn)生的xil13hab效價。觀察到效價從在52小時時的1.2g/l±0.2g/l下降至在72小時時的0.7±0.04g/l。類似地，在誘導(dǎo)條件下，觀察到從在52小時時的1.0±0.2g/l下降至在72小時時的0.5±0.05g/l。引起興趣的是，在這些培養(yǎng)物中，這個產(chǎn)生下降發(fā)生在our下降和同滲重摩升高的同時。為緩和效價下降以及消除同滲重摩升高，在非誘導(dǎo)tir2,2條件下評估在26小時時的攪拌變動。使攪拌速率從650rpm變動至實現(xiàn)目標(biāo)our設(shè)置點的水平。測試四個不同our目標(biāo)設(shè)置點：約1.5、1.75、2.0和2.5mmol/l/min。在our設(shè)置點在約1.5與2.0mmol/l/min之間的情況下的攪拌變動消除our下降(圖21)和同滲重摩升高(圖22)。重要的是，在所有攪拌變動條件下，在54小時時的效價都高于在非變動條件下(圖23)。在近似2.5mmol/l/min條件下，our在約60小時時下降(圖21)，并且同滲重摩在72小時時升高至1200mosm的峰值(圖22)。在72小時，近似2.5mmol/l/min條件效價(0.7g/l)下降至與非變動條件(0.6±0.1g/l)類似的水平。近似2.0mmol/l/min條件的平均效價是四種測試條件下最高的(2.4±0.6g/l)；然而，在效價方面存在一定可變性，并且似乎在our圖譜中存在略微下降。近似1.5mmol/l/min條件具有2.1±0.3g/l的再現(xiàn)平均效價，但同樣似乎在our圖譜中在發(fā)酵晚期存在一定可變性。近似1.75mmol/l/min條件具有可再現(xiàn)效價(1.8±0.2g/l)，以及一致our趨勢兩者，因此它被選作優(yōu)選設(shè)置點。這些結(jié)果證明變動培養(yǎng)物的攪拌速率會緩和觀察到的our下降和同滲重摩升高。重要的是，這些攪拌變動也允許hab產(chǎn)生效價增強，特別是在較晚產(chǎn)生時間點。實施例3：溫度對半抗體產(chǎn)生的影響盡管先前實施例顯示hab產(chǎn)生顯著增加，但進行額外測試以更進一步優(yōu)化產(chǎn)生方法。因此，對于xil13hab產(chǎn)生，實施例1中所述的高表現(xiàn)性單一質(zhì)粒系統(tǒng)和實施例2中所述的約1.75mmol/l/min的our設(shè)置點被用作起始點。更進一步優(yōu)化方法以產(chǎn)生顯著更大產(chǎn)率，如下所述。本公開的優(yōu)選實施方案的發(fā)酵過程可被分成兩個不同節(jié)段：生長期和產(chǎn)生期。在生長期中，大多數(shù)營養(yǎng)物處于過量，并且培養(yǎng)物密度快速增加。在產(chǎn)生期中，磷酸鹽變得受限制，生長停止，并且目標(biāo)產(chǎn)物的表達開始。對于這些時期的每一個測試溫度對hab產(chǎn)生的影響。與溫度實驗組合，評估第二宿主。在這些實驗中，將md157質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至67a6產(chǎn)生宿主中。67a6菌株的基因型是w3110δfhuaδphoailvg+δprcspr43h1δdegpδmanalaciqδomptδmene742degps210a。67a6菌株含有編碼degp的degp基因(也稱為htra和ptd)的蛋白酶缺陷等位基因的敲入。degp(也稱為蛋白酶do)是為在高溫下存活所需的周質(zhì)絲氨酸蛋白酶。另外，degp充當(dāng)分子伴侶蛋白。用丙氨酸取代絲氨酸消除了degp的蛋白水解活性，但不影響它的伴侶蛋白功能(spiess等,cell,97:339-347,1999)。對生長期(tg)與產(chǎn)生期(tp)兩者進行xil13tir2,2單一質(zhì)粒系統(tǒng)的溫度優(yōu)化。圖24顯示以30℃或28℃的恒定tg/tp生長的培養(yǎng)物的生長。相較于30℃的恒定tg/tp，28℃的恒定tg/tp導(dǎo)致生長速率遲滯。圖25顯示在這些溫度下的生長的培養(yǎng)物的our。與生長速率類似，相較于30℃，當(dāng)使培養(yǎng)物在28℃的恒定tg/tp下生長時，our被延遲。如圖26中所示，使用30℃的恒定tg/tp，磷酸鹽在22±2小時時被耗盡。當(dāng)使tg/tp向下變動至28℃時，培養(yǎng)物的生長速率如上所述被延緩，并且磷酸鹽耗盡被變動至26±2小時。圖27顯示這些培養(yǎng)物的xil13hab產(chǎn)生。對于各條件，產(chǎn)物表達都開始于當(dāng)發(fā)生磷酸鹽耗盡時。相較于恒定30℃tg/tp條件的1.3±0.2g/l，恒定28℃tg/tp條件實現(xiàn)2.5±0.2g/l的最終效價。為試圖增加處于產(chǎn)生期的時間量，測試溫度變動策略。在這個實驗中，將生長期溫度設(shè)置在30℃下，并且在20小時時，使溫度變動至28℃。對于tg30/tp28℃變動和恒定tg/tp30℃條件，0與20小時之間的生長(圖28)、磷酸鹽(圖29)和our(圖30)圖譜是類似的。如圖31中所示，將在tg30/tp28℃條件下產(chǎn)生的3.1g/l的最終效價與在恒定tg/tp28℃條件下產(chǎn)生的2.5g/l的最終效價進行比較，在產(chǎn)物誘導(dǎo)時使用溫度變動至28℃提供效價進一步增加0.6g/l。這些結(jié)果證明使培養(yǎng)物在較高溫度下生長，接著在產(chǎn)生時降低培養(yǎng)溫度可導(dǎo)致產(chǎn)物形成顯著增加。進行部分析因?qū)嶒炘O(shè)計(doe)以確定利用67a6宿主菌株，對于xil13hab最優(yōu)的操作條件。doe集中于三種操作參數(shù)和fkpa的水平。表3-1.xil13hab參數(shù)如表3-1中所示，操作參數(shù)包括tg和tp以及ph。樣式是指特定參數(shù)的操作范圍；(-)是指低值參數(shù)，(+)是指高值參數(shù)，并且0001和0002是指中心點參數(shù)。tg在30至34℃的范圍內(nèi)，tp在25至28℃的范圍內(nèi)，并且ph在6.7與7.0之間的范圍內(nèi)。產(chǎn)生的fkpa的量通過所用啟動子來調(diào)節(jié)。高水平的fkpa由md157上的phoa啟動子產(chǎn)生，并且低水平的fkpa由ka01上的非誘導(dǎo)tac啟動子產(chǎn)生。通過操作10個實驗來進行部分析因分析。如圖32中所示，這些因素對產(chǎn)生的xil13hab的效價具有顯著影響。由表3-1中所述的用于doe實驗的條件產(chǎn)生的hab的效價在約1.5至約4.5g/l的范圍內(nèi)。在由xil13doe鑒定的最優(yōu)發(fā)酵條件(tg34℃，tp28℃，ph7.0)下測試xil4單一質(zhì)粒(cb1)。然而，在cb1條件下，tacii啟動子在無iptg誘導(dǎo)下用于驅(qū)動fkpa表達。將xil14hab效價與其中tg/tp保持恒定在30℃下，并且使ph維持在7.0下的發(fā)酵條件進行比較。在不添加iptg的新工藝條件下，xil4hab效價從1.3g/l增加至3.1g/l(圖33)。進行部分析因doe以確定對于xil17hab最優(yōu)的操作條件。通過用xil17lc和hc的orf替換xil13hab單一質(zhì)粒(md157)lc和hc的orf來構(gòu)建md341單一質(zhì)粒。用于表達抗體片段和伴侶蛋白的啟動子與xil13(md157)質(zhì)粒相同。doe集中于三種操作參數(shù)。表3-2.xil17hab參數(shù)樣式生長溫度(tg)產(chǎn)生溫度(tp)ph效價(g/l)-+-30306.70.3800013227.57.02.0---30256.72.5--+30257.32.6+-+34257.32.600023227.57.01.9++-34306.70.34+--34256.72.0-++30307.30.2+++34307.30.12如表3-2中所示，操作參數(shù)包括tg和tp以及ph。tg在30至34℃的范圍內(nèi)，tp在25至30℃的范圍內(nèi)，并且ph在6.7與7.3之間的范圍內(nèi)。圖34顯示在tp是25℃的條件下實現(xiàn)最顯著效價積累。圖35顯示首先優(yōu)化伴侶蛋白共表達、接著優(yōu)化方法步驟(例如攪拌速率、tg和tp)對xil13hab效價的產(chǎn)生的影響。在一個示例性實施方案中，分子優(yōu)化(例如伴侶蛋白表達和載體特征)提供效價增加約16倍。通過工藝開發(fā)(例如攪拌速率、tg和tp)，這個產(chǎn)生水平進一步增強約3.5倍?？傊?，這些結(jié)果證明可通過優(yōu)化包括伴侶蛋白表達、載體系統(tǒng)、攪拌速率、ph和生長/產(chǎn)生溫度的變量來實現(xiàn)在產(chǎn)生和穩(wěn)健性方面的顯著增加。最終，確定tg在34℃下，tp在25℃下，ph是6.7，并且fkpa水平通過phoa啟動子而產(chǎn)生的條件導(dǎo)致最高xil13hab效價。實施例4：宿主菌株對半抗體產(chǎn)生的影響盡管先前實施例顯示hab產(chǎn)生顯著增加，但進行額外測試以表征在宿主菌株66f8與67a6之間在hab產(chǎn)生方面的潛在差異。因此，對于hab產(chǎn)生，在兩種大腸桿菌宿主菌株：66f8和67a6中評估實施例1中所述的高表現(xiàn)性單一質(zhì)粒系統(tǒng)、實施例2中所述的our變動和實施例3中所述的溫度變動。66f8菌株的基因型是w3110δfhuaδphoailvg+δprcspr43h1δdegpδmanalaciqδomptδmene742。67a6菌株的基因型是w3110δfhuaδphoailvg+δprcspr43h1δdegpδmanalaciqδomptδmene742degps210a。在66f8宿主菌株與67a6宿主菌株兩者中表達xil13hab。在采用如上所述的溫度和攪拌速率變動的條件下進行發(fā)酵。相較于66f8菌株，使用67a6菌株導(dǎo)致可溶性xil13hab效價(圖36a)和lc與hc兩者的總體亞單位積累(圖36b)的增加。也在66f8宿主菌株與67a6宿主菌株兩者中表達xil4hab。當(dāng)在30℃的恒定溫度下進行xil4hab發(fā)酵時，由兩種菌株獲得約1.5g/l的類似效價(圖37a)。然而，在其中使tg從34℃降低至25℃的tp的發(fā)酵條件下，67a6菌株產(chǎn)生3.0g/l的平均值，并且66f8菌株產(chǎn)生2.0g/l的平均值(圖37b)。此外，在采用溫度變動的條件下，在67a6發(fā)酵中l(wèi)c與hc兩者的總體亞單位積累大于在66f8發(fā)酵中(圖38a和圖38b)。因此，xil13hab與xil4hab兩者是由67a6宿主菌株和相對于生長溫度降低產(chǎn)生溫度所提供的效價益處的兩個實例。在不受理論束縛下，缺乏degp的宿主菌株中的重組蛋白積累似乎達到平穩(wěn)狀態(tài)，而在具有突變degps210a的宿主菌株中，重組蛋白似乎積累直至發(fā)酵結(jié)束。實施例5：使用優(yōu)化表達載體和優(yōu)化培養(yǎng)條件產(chǎn)生xil33hab通過用xil33lc和hc的orf替換xil13hab單一質(zhì)粒(md157)lc和hc的orf來構(gòu)建xil33hab(md501質(zhì)粒)。用于表達抗體片段和伴侶蛋白的啟動子與xil13(md157)質(zhì)粒相同(圖39)。用僅含有xil33lc和hc的orf的xil33hab表達載體(md481)進行單一發(fā)酵。md481質(zhì)粒不含有分子伴侶蛋白dsba、dsbc或fkpa的orf。發(fā)酵在30℃的恒定溫度、7.0的ph和650rpm的攪拌速率下進行(圖40的基礎(chǔ)情況)。接著，用含有xil33lc和hc的orf以及分子伴侶蛋白dsba、dsbc或fkpa的orf的xil33hab表達載體(md501)進行單一發(fā)酵。與對于md481發(fā)酵相同的操作條件用于md501發(fā)酵。相較于基礎(chǔ)情況，使用單一質(zhì)粒(md501)導(dǎo)致xil-33hab效價增加近似10倍。進行部分析因doe以確定對于xil33habmd501單一質(zhì)粒最優(yōu)的培養(yǎng)條件。doe以分?jǐn)?shù)因子，以在67a6宿主中進行的包括兩個中心點平行測定的10個實驗集中于四種參數(shù)(表5-1)。在od550是150時進行攪拌速率和溫度變動。表5-1.xil33hab參數(shù)如表5-1中所示，tg在30至34℃的范圍內(nèi)，tp在25至30℃的范圍內(nèi)，ph在6.7與7.3之間的范圍內(nèi)，并且our設(shè)置點在1.9至2.8mmolo2/l/min的范圍內(nèi)。圖41顯示中心點條件對效價提供最重大益處，其中實現(xiàn)的最高效價是4.0±0.05g/l，此相當(dāng)于相較于基礎(chǔ)情況操作條件(圖40)，hab效價進一步增加。最佳培養(yǎng)條件包括7.0的ph、32℃的tg、27.5℃的tp(2小時勻變)和約2.3mmol/lmin的目標(biāo)our(2小時攪拌速率勻變)。實施例6：fkpa優(yōu)化為試圖優(yōu)化fkpa的表達水平，在用于xil13、xil17和xil33hab的單一質(zhì)粒(md157、md341和md501質(zhì)粒)中測試兩種額外fkpatir變體。如相較于內(nèi)源性fkpa信號序列所述來表征fkpatir變體(圖42)。md157、md341和md501質(zhì)粒并有fkpac13的orf，其與為3的tir強度相關(guān)聯(lián)(圖43)。在md157、md341和md501單一質(zhì)粒中，fkpac13orf被fkpatir1或tir2orf替換，并且在先前對于各hab鑒定的優(yōu)化發(fā)酵條件下測試。fkpa表達水平增加與xil13hab積累增加相關(guān)聯(lián)(圖44)。fkpatir1和tir2條件分別導(dǎo)致最終fkpa量是0.5和2.5g/l，并且xil13hab效價是1.5和2.5g/l。tir3條件產(chǎn)生4g/l的fkpa和3.8g/l的hab。fkpa表達水平也對產(chǎn)生期our圖譜具有影響?？傊味╢kpa使產(chǎn)生的hab的量增加約3倍。在xil33hab發(fā)酵中，最低效價積累圖譜與fkpatir1條件相關(guān)聯(lián)，其中操作結(jié)束時的效價是2.4g/l(圖45)。當(dāng)相較于tir1條件時，xil33tir2和tir3條件導(dǎo)致xil33hab效價增加近似2倍(圖45)。數(shù)據(jù)表明fkpa水平增加有益于hab產(chǎn)生。在xil17hab發(fā)酵中，最低效價積累圖譜與fkpatir1條件相關(guān)聯(lián)，其中操作結(jié)束時的效價是2.0g/l(圖46)。使用先前對于xil13hab所述的最佳條件測試兩種額外fkpatir變體(tir2.3和tir6)。tir2.3效價圖譜傾向于高于先前測試的tir2條件，但仍然低于對照tir3條件(圖47a)。tir6條件導(dǎo)致效價積累圖譜類似于tir2.3條件，但同樣低于tir3對照。如通過蛋白質(zhì)印跡分析測定的fkpa積累顯示在各tir變體之間的fkpa滴定(圖47b)。數(shù)據(jù)表明存在與hab產(chǎn)生相關(guān)聯(lián)的最優(yōu)fkpa表達量，其在xil13hab(md157單一質(zhì)粒)的情況下是tir3。實施例7：氧轉(zhuǎn)移速率(otr)條件的影響也用第二otr策略測試在實施例3中鑒定的xil13hab最佳條件。在實驗(n＝3)中，使容器背壓(bp)和噴射速率分別從1.0降低至0.3巴以及從20降低至13slpm。為試圖彌補歸因于背壓和噴射速率降低的otr損失，使生長期和產(chǎn)生期攪拌速率從650增加至880rpm以及從475增加至650rpm。容器背壓、噴射速率和攪拌速率的不同組合可用于實現(xiàn)與先前實施例中引用的那些otr條件類似的otr條件。對于整個發(fā)酵過程，用恒定bp進行發(fā)酵。在改變的otr條件下，使背壓維持在0.3巴(n＝3)下，并且在對照條件下，使背壓維持在1.0巴(n＝5)下。對于整個發(fā)酵過程，用恒定空氣流進行發(fā)酵。在改變的otr條件下，使空氣流維持在13slpm(n＝3)下，并且在對照條件下，使空氣流維持在20slpm(n＝5)下。在改變的otr條件與對照條件兩者下，發(fā)酵均在150od550時實施攪拌變動。在改變的otr條件下，初始攪拌速率被設(shè)置成880rpm，并且變動至650rpm，而在對照條件下，初始攪拌速率被設(shè)置成650rpm，并且變動至475rpm。攪拌速率增加補償歸因于噴射和背壓降低的otr下降。改變的otr條件導(dǎo)致與對照條件類似的峰值和產(chǎn)生期our(圖48a)以及生長圖譜(圖48b)。改變的otr條件導(dǎo)致與對照條件類似的積累圖譜和峰值效價(4.1±0.4g/l)(圖49)。實施例8：優(yōu)化immtac產(chǎn)生抗癌免疫動員單克隆t細(xì)胞受體(immtac)是本公開的潛在可用于一定范圍的抗癌療法的雙鏈多肽(參見例如oates和jakobsen,oncoimmunology2:e22891,2013以及l(fā)iddy等,nat.med.18:908-7,2012)。如同多特異性抗體，產(chǎn)生供治療使用的immtac要求能夠在工業(yè)規(guī)模上產(chǎn)生構(gòu)筑嵌段諸如α和βtcr鏈以及融合于其的任何多肽(例如抗cd3效應(yīng)物諸如scfv)。為滿足這個要求，優(yōu)化表達載體和方法步驟以超過標(biāo)準(zhǔn)方法在產(chǎn)生方面給予顯著增加。重要的是，如同以上實施例，發(fā)現(xiàn)表達fkpa、工藝變化、tir優(yōu)化和dsbc表達提供多種immtac在產(chǎn)生方面的這些增加。材料和方法對于immtac表達載體(圖50a)，評估1,1；1,2；和2,3的tir組合。如本文關(guān)于immtac產(chǎn)生所用，第一編號代表α鏈的tir強度，并且第二編號代表β鏈的tir強度(圖50b)。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至具有基因型w3110δfhuaδphoailvg2096(valr)δprcspr43h1δdegpδmanalaciqδomptδmenedegps210a的宿主菌株67a6中。在以下條件下進行初始發(fā)酵：恒定30℃和ph7.0，其中在24小時啟始?xì)v經(jīng)4小時過程的攪拌勻變，并且以約1.75mmol/l/min的our為目標(biāo)。構(gòu)建含有fkpa的orf的可相容質(zhì)粒(pacyc，novagen,madison,wi)，如上文和歐洲專利號ep1356052b1中所述。fkpa基因構(gòu)建體在tacii啟動子的控制下。原始氧化還原酶可相容質(zhì)粒的構(gòu)建如歐洲專利號ep1356052b1(參見例如實施例9)中所述。對氧化還原酶的篩選包括與immtactir1,1fkpa單一質(zhì)粒一起從可相容質(zhì)粒jj141(dsbc)、jj142(dsba)和jj247(dsba/c)進行表達。用于驅(qū)動氧化還原酶的表達的tac啟動子不加以誘導(dǎo)，并且依賴于從啟動子的滲漏表達。對于測定immtac效價，提交可溶性級分的樣品以通過蛋白質(zhì)l/rp測定進行分析。這個測定是二維hplc測定，其中第一柱是捕集含有可變輕鏈的igg組分的親和柱，并且第二柱是反相柱。將積分hplc工作站配置成雙柱模式。溶劑儲集器是：溶劑1a，親和上樣緩沖液，pbs；溶劑1b，親和洗脫緩沖液，含0.2％tfa的水；溶劑2a，反相水性緩沖液，含0.1％tfa的水；溶劑2b，反相有機洗脫緩沖液，含0.08％tfa的乙腈。親和柱是利用從sigmaaldrich(ca,usa)購買的純化蛋白質(zhì)l偶聯(lián)于從lifetechnologies(ca,usa)購買的al活化樹脂的內(nèi)部填充柱。涉及親和柱的所有程序都在環(huán)境溫度下進行。第二柱是從mac-mod(ca,usa)購買的haloc4蛋白質(zhì)反相柱(2.1x20mm)。使反相柱溫度維持在80℃下。使親和柱于上樣緩沖液中平衡，并且將樣品在2ml/min的流速下上樣。將流穿物引導(dǎo)至廢棄物中。在將樣品上樣之后，用上樣緩沖液洗滌親和柱以減少非特異性結(jié)合的組分。接著，通過閥轉(zhuǎn)換，使親和柱連接于反相柱，并且用洗脫緩沖液在2ml/min的流速下洗脫以將親和捕集組分轉(zhuǎn)移至反相柱中。在這個轉(zhuǎn)移步驟期間，使紫外檢測器位于親和柱之后以及反相柱之前，并且因此監(jiān)測親和柱的洗脫物(其變?yōu)榉聪嘀纳蠘游?。在洗脫之后，隨后用上樣緩沖液再平衡親和柱。經(jīng)上樣反相柱用0.1％tfa水溶液洗滌。將流速設(shè)置成2ml/min，并且從5％至30％溶劑2b(含0.08％tfa的acn)操作快速梯度，繼之以達到34％溶劑2b的平緩梯度。通過達到100％溶劑2b的梯度來完成洗脫以進行再生。接著使反相柱返回至初始條件以進行再平衡。在280和214nm下監(jiān)測柱洗脫物?；谟煞聪嘀@得的分離，通過將積分峰面積與已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)物的積分峰面積比較來進行定量。這個測定的定量限度(loq)是0.0125g/l。結(jié)果初始發(fā)酵評估tir1,1構(gòu)建體(圖51)。條件如下：30℃，ph7.0，以及約1.75mmolo2/l/min的our。發(fā)酵導(dǎo)致10mg/l的效價積累。總體α和β亞單位積累分別是550和800mg/l(圖52)。為確定伴侶蛋白表達對immtac效價的影響，提供用于在使用上述載體的情況下共表達伴侶蛋白的質(zhì)粒。與immtac表達組合測試許多已知伴侶蛋白，包括fkpa蛋白，即具有伴侶蛋白活性的肽基脯氨?；?反異構(gòu)酶。接著將fkpa可相容質(zhì)粒與上述tir1,1immtac1表達質(zhì)粒(圖53)共同轉(zhuǎn)化至菌株67a6中。發(fā)酵條件與用于上述初始發(fā)酵中并且顯示于圖51中的那些相同。當(dāng)培養(yǎng)物達到200od550時，用1mmiptg誘導(dǎo)fkpatac啟動子。抗α和抗β可溶性蛋白質(zhì)印跡指示除經(jīng)裝配immtac之外，α可溶性亞單位與β可溶性亞單位兩者的積累也均增加(可溶性還原印跡；圖54a)。效價分析也指示相較于無伴侶蛋白條件，經(jīng)裝配immtac增加2倍，具有20mg/l的最終效價(圖54b)。在隨后immtac實驗中改變發(fā)酵工藝條件(圖55)。在所有隨后發(fā)酵中，攪拌勻變以約2.5mmolo2/l/min的特定our設(shè)置點為目標(biāo)。此外，在24小時進行使生長溫度從30℃降低至25℃的產(chǎn)生溫度的溫度變動。使用上述fkpa可相容系統(tǒng)測試改變的工藝條件，并且所述工藝條件包括在200od550時添加1mmiptg。當(dāng)相較于先前工藝條件時，使用改變的工藝條件導(dǎo)致效價增加近似2倍，具有40mg/l的最終效價(圖57)。對于immtactir1,1；tir1,2；和tir2,3，構(gòu)建編碼immtac的α鏈和β鏈以及fkpa的質(zhì)粒，并且用于轉(zhuǎn)化67a6(圖58)。在這些質(zhì)粒構(gòu)建體中，fkpaorf在αorf的上游，并且phoa啟動子控制轉(zhuǎn)錄。pbr322質(zhì)粒通常維持在約30個拷貝/細(xì)胞下(bolivar等,gene,2:95-113,1977)，并且pacyc質(zhì)粒通常維持在約15個拷貝/細(xì)胞下(chang和cohen,j.bacteriol.,134:1141-1156,1978)。在不希望束縛于理論下，據(jù)認(rèn)為當(dāng)將fkpa移動于immtac表達質(zhì)粒上時的拷貝數(shù)增加可導(dǎo)致制備的fkpa的量增加。并有fkpaorf的三種immtactir變體單一質(zhì)粒導(dǎo)致效價高于先前所述的tir1,1可相容fkpa系統(tǒng)。tir1,2和tir2,3條件各自導(dǎo)致約50mg/l的效價(圖59a)，而tir1,1條件導(dǎo)致65mg/l的效價(圖59a)。對于tir2,3條件，總體α和β亞單位積累分別是2.5和5.5g/l(圖59b)。在tir1,1條件下，總體α和β亞單位積累分別是1g/l和2.5g/l。在tir1,2條件下，α和β亞單位積累分別是約0.8g/l和3.2g/l(圖59b)。關(guān)于可溶性fkpa表達(通過蛋白質(zhì)印跡來測定)來比較tir1,1單一質(zhì)粒和tir1,1可相容質(zhì)粒系統(tǒng)指示單一質(zhì)粒系統(tǒng)導(dǎo)致產(chǎn)生的fkpa的量增加(圖60a)。當(dāng)相較于先前可相容質(zhì)粒系統(tǒng)時，可溶性fkpa增加導(dǎo)致效價進一步增加，并且實現(xiàn)65mg/l的最終效價(圖60b)。類似于對于fkpa的共表達所述的可相容質(zhì)粒系統(tǒng)，可相容質(zhì)粒與并有先前描述的fkpaorf的tir1,1immtac1組合用于篩選各種已知的氧化還原酶(圖61)。當(dāng)相較于先前僅fkpa條件時，單獨dsba以及dsba與dsbc組合的共表達導(dǎo)致20mg/ml的類似效價降低。然而，單獨dsbc的共表達導(dǎo)致80mg/l的效價，其對應(yīng)于經(jīng)裝配immtac產(chǎn)生增加15-20mg/l(圖62)。在tir1,1單一質(zhì)粒中，經(jīng)裝配效價在dsbc的共表達下增加導(dǎo)致以下假設(shè)：在先前fkpa單一tir2,3條件下所見的亞單位積累增加可對個別亞單位的折疊和裝配提供進一步益處，并且可進一步增加效價。在dsbc可相容系統(tǒng)(n＝4)的情況下測試tir2,3fkpa單一質(zhì)粒，并且導(dǎo)致110mg/l的平均效價(圖63)。重要的是，與伴侶蛋白fkpa和dsbc的共表達以及上述改進工藝條件(圖55)聯(lián)合來優(yōu)化α和β亞單位tir導(dǎo)致immtac1效價增加10倍(圖64)。對immtac1產(chǎn)生的優(yōu)化步驟包括fkpa的共表達、工藝變化(增加our，更堿性ph、溫度變動)、具有fkpa和immtac1的單一質(zhì)粒系統(tǒng)、滲漏dsbc表達和增加的tir強度。使用immtac1評估以上優(yōu)化。使用相同優(yōu)化來測試第二、不同的immtacimmtac2。如圖65a(α鏈印跡)和圖65b(β鏈印跡)中所示，相同immtactir和伴侶蛋白條件對經(jīng)裝配immtac2提供最大益處。總之，這些結(jié)果證明連同dsbc和關(guān)鍵工藝改進一起fkpa的共表達使經(jīng)裝配immtac的產(chǎn)生增加，使用多種immtac構(gòu)建體來確認(rèn)這些影響。序列除非另外指示，否則所有多肽序列都以n末端至c末端方式呈現(xiàn)。除非另外指示，否則所有多核苷酸序列都以5’至3’方式呈現(xiàn)。fkpatir1gaattatgaagtccctgtttaaagtgacgctgctggcgaccacaatggccgttgccctgcatgcaccaatcacttttgct(seqidno：1)fkpatir2gaattatgaagtcgctattcaaagtgacgctgctggcgaccacaatggccgttgccctgcatgcaccaatcacttttgct(seqidno：2)fkpatir3(c13)gaattatgaagtcgctgtttaaagttacgctgctggcgaccacaatggccgttgccctgcatgcaccaatcacttttgct(seqidno：3)fkpa信號肽mkslfkvtllattmavalhapitfa(seqidno：4)序列表<110>基因泰克公司（genentech,inc.）j·朱利安諾蒂d·賴?yán)鹝·奧羅里l·c·西蒙斯<120>在細(xì)菌中產(chǎn)生雙鏈蛋白質(zhì)的方法<130>146392035140<140>尚末指定<141>與此同時<150>us62/075,798<151>2014-11-05<160>4<170>供windows使用的4.0版fastseq<210>1<211>80<212>dna<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>1gaattatgaagtccctgtttaaagtgacgctgctggcgaccacaatggccgttgccctgc60atgcaccaatcacttttgct80<210>2<211>80<212>dna<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>2gaattatgaagtcgctattcaaagtgacgctgctggcgaccacaatggccgttgccctgc60atgcaccaatcacttttgct80<210>3<211>80<212>dna<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>3gaattatgaagtcgctgtttaaagttacgctgctggcgaccacaatggccgttgccctgc60atgcaccaatcacttttgct80<210>4<211>25<212>prt<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>4metlysserleuphelysvalthrleuleualathrthrmetalaval151015alaleuhisalaproilethrpheala2025當(dāng)前第1頁12