背景技術(shù)：
：序列表本申請以引用方式并入以計算機(jī)可讀形式提交的序列表，該序列表于2015年8月3日創(chuàng)建為文件8700wo_st25.txt(75,769字節(jié))。本發(fā)明提供重組蛋白在哺乳動物細(xì)胞中以一致和高效的方式表達(dá)。具體地講，本發(fā)明包括通過采用哺乳動物選擇標(biāo)記在哺乳動物細(xì)胞中實現(xiàn)改善的蛋白表達(dá)的方法和組合物。本發(fā)明包括在哺乳動物細(xì)胞中促進(jìn)重組蛋白的選擇性以及增加表達(dá)拷貝數(shù)和蛋白產(chǎn)率的方法，和使用此類表達(dá)系統(tǒng)的方法。相關(guān)領(lǐng)域說明細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的開發(fā)是提供用于研究和治療用途的可靠且高效的給定蛋白來源的重要目標(biāo)。由于例如哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)對重組蛋白進(jìn)行適當(dāng)?shù)姆g后修飾的能力，哺乳動物細(xì)胞中的重組蛋白表達(dá)就制備治療性蛋白而言通常是優(yōu)選的。有多種載體可用于在哺乳動物宿主中表達(dá)，它們各自含有使得能夠在細(xì)胞培養(yǎng)期間容易地分離表達(dá)重組蛋白的細(xì)胞的選擇標(biāo)記。在此類系統(tǒng)中利用選擇性標(biāo)記基因(smg)，原因是它們?yōu)楸磉_(dá)所關(guān)注蛋白的細(xì)胞賦予選擇性優(yōu)勢，然而，smg必須就其表型中性、高效性和多能性等原因進(jìn)行優(yōu)化。盡管有許多宿寄smg的載體和表達(dá)系統(tǒng)可用，但在哺乳動物系統(tǒng)中實現(xiàn)的重組蛋白的表達(dá)無論在數(shù)量還是質(zhì)量還是這兩者上通常都無法令人滿意。分子的生物“指紋”(例如翻譯后修飾，比如糖基化)在開發(fā)重組蛋白治療劑中在限定分子的實用性和功效方面尤為重要(cumming,d.a.,1990,glycobiology,1(2):115-130)。對表達(dá)的所關(guān)注蛋白的生物性質(zhì)不會有負(fù)面影響的smg是特別有利的。大多數(shù)smg為細(xì)菌來源的，且由于日漸擔(dān)憂細(xì)菌抗生素抗性基因?qū)Νh(huán)境細(xì)菌的橫向轉(zhuǎn)移風(fēng)險，就用于哺乳動物系統(tǒng)而言帶來其他缺點(breyer,d.等人,2014,criticalreviewsinplantsciences33:286-330)。取消使用細(xì)菌抗生素抗性基因可能對于消費者認(rèn)可和減輕此類感知風(fēng)險具有積極作用?；蚬こ袒淖泽w細(xì)胞在臨床上快速取得成功(參見例如kershaw,m.h.等人,2013,naturereviews:cancer13:525-541)。對用于人類自體細(xì)胞產(chǎn)物中的基因修飾的載體的選擇和設(shè)計是至關(guān)重要的，特別是因為將非人類組分不希望地引入人類自體細(xì)胞可能對患者的安全具有嚴(yán)重后果(eaker等人2013,stemcellstrans.med.2:871–883；最先在2013年10月7日在線發(fā)表于sctmexpress)。僅具有哺乳動物來源而非細(xì)菌來源的組分的載體系統(tǒng)就用于過繼性免疫治療的患者特異性t細(xì)胞而言將是有利的。因此，期望引入哺乳動物選擇性基因，特別是在用于產(chǎn)生所關(guān)注的哺乳動物蛋白的表達(dá)系統(tǒng)中為轉(zhuǎn)化的細(xì)胞提供表型或代謝優(yōu)勢的那些基因。此外，可靠地表達(dá)足夠高水平的治療性蛋白并對該治療性蛋白進(jìn)行適當(dāng)且一致的翻譯后修飾的細(xì)胞系是高度期望的。因此，在本領(lǐng)域中需要改善的哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)。技術(shù)實現(xiàn)要素：使用哺乳動物衣霉素(tn)抗性基因作為哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)中的選擇性標(biāo)記可增加轉(zhuǎn)染子的效率和拷貝數(shù)。已觀察到，可操作地連接到所關(guān)注基因的tn抗性基因的使用對哺乳動物細(xì)胞群產(chǎn)生選擇性壓力，從而增加轉(zhuǎn)染子(即所關(guān)注基因)的隨機(jī)整合。應(yīng)當(dāng)理解，選擇性標(biāo)記系統(tǒng)可促進(jìn)所需轉(zhuǎn)染子的選擇，然而本發(fā)明的方法賦予所關(guān)注基因的效率和隨機(jī)整合出人意料的增加，以及賦予所需蛋白可靠的生物質(zhì)量。因此本發(fā)明的組合物和方法使得可以實現(xiàn)對所表達(dá)蛋白的質(zhì)量上良好的翻譯后修飾的有利選擇。在一個方面，本發(fā)明提供包括哺乳動物衣霉素(tn)抗性基因的分離的細(xì)胞，所述基因編碼與seqidno:3氨基酸序列具有至少93％同一性的蛋白，所述基因可操作地連接到所關(guān)注基因(goi)和至少一個調(diào)控元件。在另一個方面，本發(fā)明提供制備重組的所關(guān)注蛋白(poi)的方法，其中該方法包括：提供編碼核酸分子的哺乳動物宿主細(xì)胞，所述核酸分子包含(i)哺乳動物衣霉素(tn)抗性基因和(ii)編碼該poi的基因；在第一濃度的tn存在下培養(yǎng)該細(xì)胞；分離表達(dá)tn抗性基因的至少一個拷貝的細(xì)胞群；在增加濃度的tn存在下培養(yǎng)該細(xì)胞群，其中增加tn的濃度增加poi的產(chǎn)生；以及從細(xì)胞培養(yǎng)中分離該poi。在又一個方面，本發(fā)明提供使n-聚糖蛋白底物糖基化的方法，其中該方法包括：提供編碼核酸分子的哺乳動物宿主細(xì)胞，所述核酸分子包含可操作地連接到編碼需要糖基化的蛋白底物的基因的哺乳動物衣霉素(tn)抗性基因；在第一濃度的tn存在下培養(yǎng)該細(xì)胞；分離表達(dá)tn抗性基因的至少一個拷貝的細(xì)胞群；在增加濃度的tn存在下培養(yǎng)該細(xì)胞群，其中增加tn的濃度增加poi的產(chǎn)生；以及從細(xì)胞培養(yǎng)中分離該蛋白底物。在所述方法的一些實施方案中，該tn抗性基因可操作地連接到編碼poi的基因，且該編碼poi的基因可操作地連接到至少一個調(diào)控元件。在一些實施方案中，該tn抗性基因外源性添加到細(xì)胞。在其他實施方案中，該tn抗性基因編碼與seqidno:3的氨基酸序列具有至少93％同一性的蛋白。在其他實施方案中，該tn抗性基因編碼與seqidno:3的氨基酸序列具有至少94％同一性的蛋白。在一些實施方案中，該tn抗性基因編碼與seqidno:4的氨基酸序列具有至少93％同一性的蛋白。在另外其他實施方案中，該tn抗性基因編碼與seqidno:4的氨基酸序列具有至少94％同一性的蛋白。在一些實施方案中，該哺乳動物tn抗性基因包括中國倉鼠(cricetulusgriseus)tn抗性基因。在其他實施方案中，該哺乳動物tn抗性基因包括人類tn抗性基因。tn抗性基因還可包括選自以下的核酸序列：seqidno:2、seqidno:11、seqidno:12、seqidno:13、seqidno:14、seqidno:15、seqidno:16和seqidno:17。在前述發(fā)明的某些實施方案中，該哺乳動物tn抗性基因包括與seqidno:2的核酸序列具有至少92％同一性的核酸序列。在一些實施方案中，該哺乳動物tn抗性基因包括與seqidno:12的核酸序列具有至少92％同一性的核酸序列。在本發(fā)明的分離的細(xì)胞中提供可操作地連接到tn抗性基因的至少一個調(diào)控元件，其中該調(diào)控元件包括但不限于啟動子、核糖體結(jié)合位點和增強(qiáng)子。在又一個實施方案中，該goi可操作地連接到啟動子。在另一個實施方案中，該goi可操作地連接到核糖體結(jié)合位點，諸如ires。在一些實施方案中，本發(fā)明的分離的細(xì)胞和方法還包括第二所關(guān)注基因(goi)，而該goi編碼所關(guān)注蛋白(poi)。在一個實施方案中，該所關(guān)注基因(goi)為外源性添加的goi。在另一個實施方案中，該外源性添加的goi為人類基因。在又一個實施方案中，該調(diào)控元件為外源性添加的調(diào)控元件。在其他實施方案中，該第一和/或第二goi編碼包括但不限于抗體重鏈、抗體輕鏈、抗原結(jié)合片段和/或fc融合蛋白的poi。在另一個實施方案中，該第一goi和第二goi獨立地選自編碼抗體輕鏈或其抗原特異性片段、抗體重鏈或其抗原特異性片段、fc融合蛋白或其片段以及受體或其配體特異性片段的基因。在一個實施方案中，重組酶識別位點存在于第一goi與第二goi之間。在其他實施方案中，本發(fā)明還提供在第一goi的5’的重組酶識別位點和相對于第二goi在3’的重組酶識別位點。在又一個實施方案中，該goi編碼選自抗體輕鏈或其抗原結(jié)合片段、抗體重鏈或其抗原結(jié)合片段、fc融合蛋白或其片段、配體以及受體或其配體結(jié)合片段的糖蛋白。本發(fā)明的分離的、非天然存在的細(xì)胞可衍生自真核細(xì)胞。在一個實施方案中，該細(xì)胞為哺乳動物細(xì)胞。在一些實施方案中，該分離的細(xì)胞為離體人類細(xì)胞。在其他實施方案中，該細(xì)胞選自：cho(例如chok1、dxb-11cho、veggie-cho)、cos(例如cos-7)、淋巴細(xì)胞、干細(xì)胞、視網(wǎng)膜細(xì)胞、vero、cv1、腎(例如hek293、293ebna、msr293、mdck、hak、bhk21)、hela、hepg2、wi38、mrc5、colo25、hb8065、hl-60、jurkat、daudi、a431(表皮的)、cv-1、u937、3t3、l細(xì)胞、c127細(xì)胞、sp2/0、ns-0、mmt細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞以及衍生自前述細(xì)胞的細(xì)胞系。在某些實施方案中，本發(fā)明的分離的細(xì)胞為cho-k1細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、視網(wǎng)膜細(xì)胞或干細(xì)胞。在一個實施方案中，第一濃度的tn為1μg/ml。在另一個實施方案中，增加濃度的tn包括第二和第三濃度的tn。在一些實施方案中，第二濃度大于第一濃度的tn，而第三濃度大于第二濃度的tn。在某些實施方案中，第二濃度的tn為2.5μg/ml，而第三濃度為5μg/ml。在另外其他實施方案中，增加濃度的tn包括第二濃度的tn，其中該第二濃度的tn為2.5μg/ml或5μg/ml。除非另有說明或上下文中顯而易見，否則本發(fā)明的任何方面和實施方案可與本發(fā)明的任何其他方面或?qū)嵤┓桨附Y(jié)合使用。通過審閱接下來的詳細(xì)說明，其他目標(biāo)和優(yōu)點將變得顯而易見。附圖說明圖1說明用于將編碼所關(guān)注基因(例如egfp)的核酸序列引入細(xì)胞基因組中的克隆載體結(jié)構(gòu)中的可操作表達(dá)盒的示意圖。sv40啟動子：猴病毒40啟動子；gpt：glcnac-1-p轉(zhuǎn)移酶(例如cho-gpt，seqidno:2；或hgpt，seqidno:12)；ires：內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點；egfp：增強(qiáng)的綠色熒光蛋白；sv40polya：猴病毒40polya。圖2a至2c代表哺乳動物gpt氨基酸序列，即人類(gpt_human；uniprotkb登錄號q9h3h5；seqidno:4)、恒河猴(rhesusmacaque)(gpt_macmu；uniprotkb登錄號f6txm3；seqidno:5)、黑猩猩(gpt_pantr；uniprotkb登錄號h2r346；seqidno:6)、狗(gpt_canfa；uniprotkb登錄號e2rq47；seqidno:7)、豚鼠(gpt_cavpo；uniprotkb登錄號e2rq47；seqidno:8)、大鼠(gpt_rat；uniprotkb登錄號q6p4z8；seqidno:9)和小鼠(gpt_mouse；uniprotkb登錄號p42867；seqidno:10)相較于中國倉鼠(gpt_crigr；uniprotkb登錄號p24140；seqidno:3)gpt氨基酸序列的比對。圖3a和3b舉例說明可如何使用本發(fā)明的方法和組合物實現(xiàn)蛋白優(yōu)化。圖3a描繪從用1μg/ml衣霉素(tn)培養(yǎng)的第一細(xì)胞池中選擇陽性細(xì)胞轉(zhuǎn)染子的方法。隨后，以增加濃度的衣霉素(例如2.5μg/ml或5μg/ml)培養(yǎng)第二細(xì)胞，以增強(qiáng)蛋白表達(dá)。圖3b描繪從用1μg/ml衣霉素(tn)培養(yǎng)的第一細(xì)胞池中選擇陽性細(xì)胞轉(zhuǎn)染子的方法，然后連續(xù)地增加后續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)中的tn濃度以便優(yōu)化蛋白表達(dá)。圖4a至4b經(jīng)修飾的cho細(xì)胞包括側(cè)翼為lox位點的yfp基因。側(cè)翼為lox位點的選擇標(biāo)記(抗生素抗性基因和egfp)合并在yfp位點并經(jīng)由靶向整合用cre重組酶置換yfp。隨機(jī)整合體既表達(dá)yfp也表達(dá)egfp。圖4a：用cre重組酶載體和包括egfp的hpt表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞；但培養(yǎng)中無潮霉素。圖4b：用cre重組酶載體和包括egfp的hpt表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞；存在400μg/ml潮霉素。圖5a至5f顯示代表衣霉素選擇性的各種參數(shù)的facs散點圖。經(jīng)修飾的cho細(xì)胞包括側(cè)翼為lox位點的yfp基因。側(cè)翼為lox位點的選擇標(biāo)記(抗生素抗性基因和egfp)合并在yfp位點并經(jīng)由靶向整合用cre重組酶置換yfp。隨機(jī)整合體既表達(dá)yfp也表達(dá)egfp。圖5a：用cre重組酶載體和包括egfp的cho-gpt表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞；但培養(yǎng)中無衣霉素。圖5b：用cre重組酶載體和包括egfp的cho-gpt表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞；存在1μg/ml衣霉素。圖5c:用cre重組酶載體和包括egfp的cho-gpt表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞；存在2.5μg/ml衣霉素。圖5d:用cre重組酶載體和包括egfp的人類gpt表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞；但培養(yǎng)中無衣霉素。圖5e:用cre重組酶載體和包括egfp的人類gpt表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞；存在1μg/mltn。圖5f:用cre重組酶載體和包括egfp的人類gpt表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞；存在2.5μg/mltn。圖6a和6b顯示gpt表達(dá)細(xì)胞池與非gpt表達(dá)池在其增強(qiáng)可操作地連接的goi(諸如egfp)的表達(dá)的相對能力方面的比較。圖6a如下說明通過pcr就細(xì)胞池所測得的cho-gpt的基因拷貝相對數(shù)：無tn選擇的pool-49細(xì)胞(未添加外源性gpt)；具有5μgtn選擇的pool-49細(xì)胞(無外源性gpt)；pool-1細(xì)胞天然表達(dá)較高量的gpt(數(shù)據(jù)未顯示)，并在無tn選擇的情況下進(jìn)行測試；無tn選擇的pool-78細(xì)胞(無外源性gpt)；表達(dá)外源性添加的hpt的cho細(xì)胞和400μg/ml潮霉素選擇；在1μg/mltn選擇條件下表達(dá)外源性gpt的cho細(xì)胞；從1μg/mltn選擇池選擇的表達(dá)外源性gpt的cho細(xì)胞進(jìn)一步在1μg/mltn中培養(yǎng)；從1μg/mltn選擇池選擇的表達(dá)外源性gpt的cho細(xì)胞進(jìn)一步在2.5μg/mltn中培養(yǎng)；從1μg/mltn選擇池選擇的表達(dá)外源性gpt的cho細(xì)胞進(jìn)一步在5μg/mltn中培養(yǎng)。圖6b說明通過qpcr就相同的細(xì)胞池(如圖6a)所測得的所關(guān)注基因egpt的基因拷貝相對數(shù)目。圖7a至7d如下說明由細(xì)胞培養(yǎng)所產(chǎn)生的fc融合蛋白1fcfp1)的糖型特征，圖7a：使用標(biāo)準(zhǔn)方案的不表達(dá)gpt的cho細(xì)胞(批次b10002m410)，相較于圖7b：表達(dá)cho-gpt且無tn選擇的cho細(xì)胞(批次110728)。圖7c：表達(dá)cho-gpt的且以1μg/mltn選擇的cho細(xì)胞(批次110728-01)，相較于圖7d：表達(dá)cho-gpt的且以5μg/mltn選擇的cho細(xì)胞(批次110728-02)。各色譜圖如下指出含有唾液酸化殘基的級分：0sa＝0個唾液酸殘基；1sa＝1個唾液酸殘基；2sa＝2個唾液酸殘基；3sa＝3個唾液酸殘基；4sa＝4個唾液酸殘基。圖8說明從(a)批次b10002m410、(b)批次110728、(c)批次110728-01和(d)批次110728-02取樣的fc融合蛋白1(fcfp1)的疊加糖基化譜。從gpt批次中產(chǎn)生的各蛋白的糖基化譜(glycoprofile)與參比標(biāo)準(zhǔn)蛋白相容，且一致地產(chǎn)生主要的糖型種類。顯然的是，相較于參比標(biāo)準(zhǔn)蛋白，在gpt批次中并未產(chǎn)生新的和獨特的糖型種類。具體實施方式在描述本發(fā)明的方法前，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不限于所述的特定方法和實驗條件，因為此類方法和條件可以變化。還應(yīng)當(dāng)理解，本文所用的術(shù)語僅用于描述特定實施方案的目的，而無意進(jìn)行限制，因為本發(fā)明的范圍將僅由所附權(quán)利要求書限制。如在該說明書和所附權(quán)利要求書中所用，除非上下文明確地相反指出，否則單數(shù)形式“一個”、“一種”和“該/所述”包括復(fù)數(shù)含義。因此，例如提及“一種方法”包括本文所述類型的和/或在閱讀本公開后對本領(lǐng)域的技術(shù)人員將變得顯而易見的一種或多種方法和/或一個或多個步驟。除非另有定義或另有規(guī)定，否則本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語均具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同意義。盡管與本文中描述的那些方法和材料類似或等同的任何方法和材料均可用于本發(fā)明的實踐或檢驗，但現(xiàn)在描述特定的方法和材料。本文提及的所有出版物均以引用方式整體并入本文。本領(lǐng)域中熟知的多種基因可向培養(yǎng)中的哺乳動物細(xì)胞賦予選擇性表型。一般來講，選擇性標(biāo)記基因表達(dá)蛋白，通常是在細(xì)胞培養(yǎng)中賦予對各種抗生素的抗性的酶。在某些選擇條件下，可使表達(dá)熒光蛋白標(biāo)記的細(xì)胞顯現(xiàn)，并因此為可選擇的。本領(lǐng)域的實例包括β-內(nèi)酰胺酶(bla；β-內(nèi)酰胺抗生素抗性基因或ampr；氨芐青霉素抗性基因)、bls(滅瘟素抗性乙酰轉(zhuǎn)移酶基因)、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(hpt；潮霉素抗性基因)等。本文所述的方法依賴于使用衣霉素以及能讓細(xì)胞耐衣霉素而得以在細(xì)胞培養(yǎng)中生長的酶(標(biāo)記)。衣霉素(tn)為抗生素的混合物，其作為細(xì)菌和真核生物n-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶的抑制劑，從而防止n-乙酰葡糖胺脂質(zhì)中間體的形成以及新合成的糖蛋白的糖基化。(king,i.a.和tabiowo,a.,1981,effectoftunicamycinonepidermalglycoproteinandglycosaminoglycansynthesisinvitro.biochem.j.,198(2):331-338)。tn具有細(xì)胞毒性，因為其特異性抑制udp-n-乙酰葡糖胺：磷酸多萜醇n-乙酰葡糖胺-1-p轉(zhuǎn)移酶(gpt)，一種催化多萜醇連接的寡糖類的生物合成起始步驟的酶。在衣霉素的存在下，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(er)中制備的天冬酰胺連接的糖蛋白不被n-連接的聚糖糖基化，并因此在er內(nèi)可能無法正確折疊且因而可被分解(koizumi等人1999,plantphysiol.121(2):353–362)。因此，tn是在細(xì)菌和真核細(xì)胞中導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的值得注意的未折疊蛋白反應(yīng)(upr)的誘導(dǎo)物。二磷酸尿苷gpt(也稱為glcnac-1-p轉(zhuǎn)移酶)的基因被鑒定為在某些細(xì)胞條件下過表達(dá)，以便于賦予對tn的抗性(criscuolo和krag,1982,jbiolchem,263(36):19796-19803；koizumi等人,1999,plantphysiology,第121卷,第353–361頁)。編碼gpt的基因(也描述為genbank登錄號m36899(seqidno:2))從耐tn的中國倉鼠卵巢細(xì)胞系中分離出且編碼408個氨基酸的蛋白(seqidno:3)(scocca和krag,1990,jbiolchem265(33):20621-20626；lehrman,m.等人,1988,jbiolchem263(36):19796-803)。倉鼠gpt在酵母細(xì)胞(粟酒裂殖酵母(s.pombe))中過表達(dá)且在這些細(xì)胞中賦予tn抗性；還提供方便的純化gpt酶的來源(scoccajr等人1995,glycobiology,5(1):129-36)。在雜交瘤細(xì)胞(表達(dá)igg的b細(xì)胞，相比靜止期b細(xì)胞)中分析了gpt的轉(zhuǎn)錄水平，盡管觀察到產(chǎn)igg的細(xì)胞并未表現(xiàn)出升高水平的gpt轉(zhuǎn)錄或活性，但在從靜止期過渡到活化的b細(xì)胞中看到了gpt的少量增加。結(jié)論是，gpt水平可與b細(xì)胞中對lps(抗原)刺激的增殖反應(yīng)的早期產(chǎn)生相對應(yīng)(crick,d.c.等人1994,jbiolchem269(14):10559-65)。此外，之前并不清楚，在有或無tn存在下改變gpt的表達(dá)，在細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中是否對蛋白產(chǎn)物的糖基化有影響并因而影響產(chǎn)物質(zhì)量。應(yīng)當(dāng)理解，最佳和一致的糖基化在制備治療性糖蛋白中至關(guān)重要的蛋白屬性。本發(fā)明提供在哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)中利用哺乳動物tn抗性基因gpt作為可調(diào)節(jié)的選擇標(biāo)記來制備重組蛋白的改進(jìn)方法，而可操作地連接到gpt的所關(guān)注基因增加的拷貝數(shù)與gpt表達(dá)盒增加的隨機(jī)整合到細(xì)胞中相關(guān)。本領(lǐng)域已認(rèn)識到，制備治療性蛋白特別是糖蛋白依賴于模擬此類蛋白的天然糖基化的哺乳動物型表達(dá)系統(tǒng)。(有關(guān)綜述，參見bork,k.等人,2009,jpharmsci.98(10):3499-3508)。例如，某些糖蛋白的末端單糖(諸如n‐連接的復(fù)合聚糖)通常被唾液酸占據(jù)。唾液酸化可影響糖蛋白的藥代動力學(xué)性質(zhì)，諸如吸收度、血清半衰期和清除率或糖蛋白的其他物理化學(xué)或免疫原性性質(zhì)。過表達(dá)的重組糖蛋白通常具有不完整或不一致的糖基化?？煽康姆椒▽τ谠诓溉閯游锛?xì)胞系中產(chǎn)生的治療性糖蛋白的工藝一致性和質(zhì)量至關(guān)重要。本發(fā)明還提供用于使重組蛋白糖基化的改進(jìn)方法，即在哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)中制備糖蛋白的方法，以便提供一致質(zhì)量產(chǎn)率的所需的蛋白。定義dna區(qū)當(dāng)在功能上彼此相關(guān)時為可操作地連接的。例如，如果啟動子能夠參與序列的轉(zhuǎn)錄，則該啟動子可操作地連接到編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點經(jīng)定位成以便可以翻譯，則該核糖體結(jié)合位點可操作地連接到編碼序列。一般來講，可操作地連接包括但不必須為鄰近。就序列諸如分泌性前導(dǎo)序列而言，鄰近且適當(dāng)放置在閱讀框中為典型的特征。增強(qiáng)生成的序列(諸如啟動子)當(dāng)與goi功能上相關(guān)，例如其存在造成goi的表達(dá)增加時，則可操作地連接到所關(guān)注基因(goi)。因此，短語“可操作地連接的”(諸如在dna表達(dá)載體構(gòu)建體的上下文中)控制序列(例如啟動子或操縱子或標(biāo)記)適當(dāng)?shù)匚挥谙鄬τ诰幋a序列的某一位置，使得該控制序列指導(dǎo)或允許由該編碼序列編碼的所關(guān)注多肽/蛋白的產(chǎn)生。例如，當(dāng)選擇標(biāo)記為細(xì)胞在某些培養(yǎng)條件下存活所必需的時，該所關(guān)注基因可操作地連接到該選擇標(biāo)記基因，因為在沒有可操作的選擇標(biāo)記蛋白的存在下，表達(dá)將不會發(fā)生。如本文所用的“啟動子”是指足以指導(dǎo)其可操作地連接到的dna序列轉(zhuǎn)錄的dna序列，即其連接方式使得當(dāng)適當(dāng)?shù)男盘柎嬖跁r，允許所關(guān)注基因和/或選擇標(biāo)記基因轉(zhuǎn)錄?；虻谋磉_(dá)可置于本領(lǐng)域已知的任何啟動子或增強(qiáng)子元件的控制下。在本發(fā)明的上下文中的“表達(dá)載體”可以是任何適合的載體，包括染色體、非染色體和合成的核酸載體(包括一組適合的表達(dá)控制元件的核酸序列)。此類載體的實例包括sv40的衍生物、細(xì)菌質(zhì)粒、嗜菌體dna、桿狀病毒、酵母質(zhì)粒、衍生自質(zhì)粒和嗜菌體dna組合的載體、以及病毒核酸(rna或dna)載體。在一個實施方案中，編碼fc融合蛋白或多肽的核酸分子包括在裸dna或rna載體(包括例如線性表達(dá)元件(如描述于例如sykes和johnston,1997,natbiotech12,355-59中))、緊湊的核酸載體(如描述于例如us6,077,835和/或wo00/70087中)或質(zhì)粒載體諸如pbr322、puc19/18或puc118/119中。此類核酸載體及其用法是本領(lǐng)域熟知的(參見例如us5,589,466和us5,973,972)。如本文所用的“操縱子”是指這樣的dna序列，其引入基因中或基因附近的方式使得該基因可通過將阻遏蛋白與該操縱子結(jié)合而調(diào)控，并因此防止或允許goi(即編碼所關(guān)注多肽或蛋白的核苷酸)的轉(zhuǎn)錄。核糖體結(jié)合位包括“內(nèi)部核糖體進(jìn)入位”(ires)或可包括5’帽。許多ires序列是本領(lǐng)域熟知的。ires代表翻譯控制序列，其中ires位點通常位于所關(guān)注基因的5’，并使得以帽非依賴性方式翻譯rna。經(jīng)轉(zhuǎn)錄的ires可直接結(jié)合核糖體亞單位，以使得mrna起始密碼子的位置在核糖體中適當(dāng)?shù)厝∠蛞赃M(jìn)行翻譯。ires序列通常位于mrna的5’utr中(起始密碼子的正上游)。ires在功能上取代對各種與真核生物翻譯機(jī)制相互作用的蛋白因子的需求。術(shù)語“增強(qiáng)的”或“改善的”當(dāng)用于描述蛋白表達(dá)時包括由本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)或方法產(chǎn)生的蛋白(即基因產(chǎn)物)的量和/或質(zhì)量一致性的增加。因此，這包括相比通常通過隨機(jī)整合到基因組中所觀察到的結(jié)果，例如相較于使用另一種選擇性標(biāo)記構(gòu)建體的整合體池，在表達(dá)上增加至少約1.5倍至增加至少約3倍。因此，將所關(guān)注蛋白所觀察到的表達(dá)增加倍數(shù)與在不存在包括gpt基因的本發(fā)明表達(dá)盒或細(xì)胞的情況下，或在存在包括不同選擇性標(biāo)記的表達(dá)盒或細(xì)胞的情況下，在基本上相同條件下測得的相同基因的表達(dá)水平進(jìn)行比較。表達(dá)增加還可通過所產(chǎn)生的隨機(jī)整合事件的數(shù)量來測量。增加的重組效率包括基因座重組能力的增強(qiáng)(例如，采用重組酶識別位點)。增強(qiáng)是指相比隨機(jī)重組而言的可測量效率，隨機(jī)重組通常為0.1％。在某些條件下，增強(qiáng)的重組效率是隨機(jī)的大約10倍，或約1％。除非規(guī)定，否則受權(quán)利要求書保護(hù)的發(fā)明不限于特定的重組效率。表達(dá)增強(qiáng)也可通過所產(chǎn)生的基因拷貝數(shù)來測量，如通過定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qpcr)或其他熟知的技術(shù)來測量。增強(qiáng)或改善的產(chǎn)物還指更一致的質(zhì)量，例如通過本發(fā)明的gpt表達(dá)系統(tǒng)所觀察到的翻譯后修飾。一致的質(zhì)量包括例如在重復(fù)的生產(chǎn)線后具有所需的糖基化譜。一致性就質(zhì)量而言是指均勻性和標(biāo)準(zhǔn)化程度，而重復(fù)的生產(chǎn)批次基本上無變化。在本文中教導(dǎo)了計算用以度量一致性的z數(shù)。用于度量一致性的其他統(tǒng)計指標(biāo)是本領(lǐng)域已知的。短語“選擇壓力”是施加給活的生物體(例如細(xì)胞)或系統(tǒng)(例如表達(dá)系統(tǒng))的力或刺激，其改變該活的生物體或系統(tǒng)在給定環(huán)境中的行為和存活(例如存活能力)。短語“基因擴(kuò)增”表示基因序列的相同拷貝的數(shù)目的增加。某些細(xì)胞過程的特征在于產(chǎn)生一種或多種特定基因的多個拷貝，其擴(kuò)增該基因賦予細(xì)胞的表型，例如抗生素抗性。當(dāng)關(guān)于表達(dá)盒采用短語“外源性添加的基因”或“外源性添加的goi”時，該短語是指不存在于自然界中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞基因組內(nèi)的任何基因，或整合至該基因組中(該基因組內(nèi)的不同的基因座中)的另外的基因拷貝。例如，cho基因組內(nèi)的“外源性添加的基因”(例如選擇性標(biāo)記基因)可為并非在自然界中在特定cho基因座內(nèi)發(fā)現(xiàn)的倉鼠基因(即，來自倉鼠基因組中的另一基因座的倉鼠基因)、來自任何其他物種的基因(例如人類基因)、嵌合基因(例如人/小鼠)，或者可以為并非在自然界中在cho基因組內(nèi)發(fā)現(xiàn)的倉鼠基因(即與來自倉鼠基因組中的另一基因座的基因具有低于99.9％同一性的倉鼠基因)，或并非在自然界中發(fā)現(xiàn)存在于cho天然基因組內(nèi)的任何其他基因。隨機(jī)整合事件不同于靶向整合事件，而將基因插入細(xì)胞的基因組在隨機(jī)整合事件中并非位點特異性的。靶向整合的實例是同源重組。隨機(jī)(非同源)整合表示所產(chǎn)生的整合體的位置(基因座)并非已知的或指定的。隨機(jī)整合被認(rèn)為通過非同源末端接合(nhej)發(fā)生，然而并不限于該方法。選擇效率表示表達(dá)選擇性標(biāo)記且適當(dāng)時表達(dá)在選擇性標(biāo)記控制下的所關(guān)注蛋白的存活細(xì)胞的群體百分比。百分比同一性當(dāng)描述tn抗性蛋白時意在包括沿著鄰接的同源區(qū)展示出所述同一性的同源序列，但在相比較的序列中不具有同源性的間隙、缺失或插入的存在不納入百分比同一性的計算中。在該上下文中在解釋“百分比同一性”的使用時，將涉及下列氨基酸序列比較：如本文所用，上述“gpt_crig”序列(對于中國倉鼠gpt)與小鼠同源物(“gpt_小鼠”)之間的“百分比同一性”測定不應(yīng)包括倉鼠氨基酸10和11的比較，因為在比對中該倉鼠同源物并不具有同源的序列來進(jìn)行比較(即小鼠gpt在該點具有插入，或該倉鼠同源物具有間隙或缺失，視具體情況而定)。因此，在上述比較中，百分比同一性比較將從5’端的“mwa”延伸至3’端的“esq”。在該事件中，小鼠同源物的差異僅在于：其在倉鼠gpt位置51具有“r”。因為該比較在一段60個堿基對中的58個鄰接的堿基上進(jìn)行，其中僅有一個氨基酸差異(其并非間隙、缺失或插入)，所以兩個序列(小鼠和倉鼠)之間從倉鼠gpt位置1至倉鼠gpt位置58有超過98％的同一性(因為“百分比同一性”并不包括間隙、缺失和插入的罰分)。雖然上述實例以氨基酸序列為基礎(chǔ)，但是應(yīng)當(dāng)理解，核酸序列百分比同一性將以相同的方式來計算。術(shù)語“細(xì)胞”包括適合表達(dá)重組核酸序列的任何細(xì)胞。細(xì)胞包括原核生物和真核生物(單細(xì)胞或多細(xì)胞)的細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞(例如，大腸桿菌(e.coli)、芽孢桿菌屬菌種(bacillusspp.)、鏈霉菌屬菌種(streptomycesspp.)等的菌株)、分枝桿菌細(xì)胞、真菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞(例如，釀酒酵母(s.cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(s.pombe)、巴斯德畢赤酵母(p.partoris)、甲醇畢赤酵母(p.methanolica)等)、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞(例如，sf-9、sf-21、桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞、粉紋夜蛾(trichoplusiani)等)、非人動物細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞、人細(xì)胞或細(xì)胞融合物例如雜交瘤或四源雜交瘤。在某些實施方案中，細(xì)胞為人、猴、猿、倉鼠、大鼠或小鼠細(xì)胞。在其他實施方案中，細(xì)胞為真核細(xì)胞并且選自以下細(xì)胞：cho(例如chok1、dxb-11cho、veggie-cho)、cos(例如cos-7)、視網(wǎng)膜細(xì)胞、vero、cv1、腎(例如hek293、293ebna、msr293、mdck、hak、bhk21)、hela、hepg2、wi38、mrc5、colo25、hb8065、hl-60、jurkat、daudi、a431(表皮的)、cv-1、u937、3t3、l細(xì)胞、c127細(xì)胞、sp2/0、ns-0、mmt細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和來源于前述細(xì)胞的細(xì)胞系。在一些實施方案中，細(xì)胞包含一個或多個病毒基因，例如表達(dá)病毒基因的視網(wǎng)膜細(xì)胞(例如per.細(xì)胞)。短語“累積細(xì)胞密度”或“icd”表示在一段時間內(nèi)作為整體考慮的培養(yǎng)基中的細(xì)胞密度，以每毫升的細(xì)胞-天數(shù)來表示。在一些實施方案中，icd以培養(yǎng)中約第12天的細(xì)胞來測量?！疤腔被蚨陶Z“使蛋白糖基化”包括形成糖蛋白，而寡糖附連到蛋白的天冬酰胺(asn)殘基(即n-連接的)或絲氨酸(ser)/蘇氨酸(thr)殘基(即o-連接的)的側(cè)鏈。聚糖可以為單糖殘基的均聚物或雜聚物，其可以為直鏈的或支鏈的。n-連接的糖基化已知主要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中開始，而o-連接的糖基化顯示出在er或高爾基體中開始。“n-聚糖蛋白”或“n-聚糖蛋白底物”包括含有或可接受n-連接的寡糖的蛋白。n-聚糖可由n-乙酰基半乳糖胺(galnac)、甘露糖(man)、果糖(fuc)、半乳糖(gal)、神經(jīng)氨酸(nana)和其他單糖組成，然而n-聚糖通常具有共同的核心五糖結(jié)構(gòu)，其包括：三個甘露糖和兩個n-乙酰葡糖胺(glcnac)糖。帶有連續(xù)氨基酸序列(即序列段(sequon))asn-x-ser或asn-x-thr的蛋白(其中x為除脯氨酸之外的任何氨基酸)可提供n-聚糖的附連位點。一般說明本發(fā)明至少部分地基于以下發(fā)現(xiàn)：在某些條件下可在細(xì)胞中產(chǎn)生重組蛋白，其中編碼該蛋白的基因可操作地連接到tn抗性基因gpt，且將產(chǎn)蛋白的細(xì)胞的選擇設(shè)定為在細(xì)胞基因組中增加隨機(jī)整合事件并因此增加所關(guān)注基因的拷貝數(shù)以及最終增加蛋白產(chǎn)量。本發(fā)明還至少部分地基于以下發(fā)現(xiàn)：產(chǎn)蛋白的細(xì)胞可經(jīng)優(yōu)化以表達(dá)具有一致和可靠的翻譯后修飾的蛋白。gpt表達(dá)盒還可以如在表達(dá)構(gòu)建體中諸如經(jīng)由表達(dá)載體使用本領(lǐng)域已知的各種基因編輯技術(shù)而整合到細(xì)胞基因組中。包括gpt的表達(dá)載體可通過隨機(jī)或靶向重組，諸如同源重組或由識別特定重組位點的重組酶所介導(dǎo)的重組(例如，cre-lox介導(dǎo)的重組)整合到基因組中?？赏ㄟ^在整合位點在染色體dna中引入斷裂來促進(jìn)真核細(xì)胞中的同源重組。模型系統(tǒng)已證明，如果在染色體靶序列中引入雙鏈斷裂，那么在基因靶向期間同源重組的頻率會增加。這可通過將某些核酸酶靶向特定整合位點而實現(xiàn)。在靶基因座識別dna序列的dna結(jié)合蛋白是本領(lǐng)域已知的?；虬邢蜉d體也用于促進(jìn)同源重組。在不存在用于同源指導(dǎo)修復(fù)(homologydirectedrepair)的基因靶向載體的情況下，細(xì)胞常常會通過非同源末端接合(nhej)(其可能在裂解位點處導(dǎo)致多個核苷酸的缺失或插入)來閉合該雙鏈斷裂?；虬邢蜉d體構(gòu)建和核酸酶選擇在本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員的技術(shù)范圍內(nèi)。在一些實例中，具有模塊化結(jié)構(gòu)并含有單獨鋅指域的鋅指核酸酶(zfn)在靶向序列中識別特定的3-核苷酸序列(例如靶向整合的位點)。一些實施方案可利用具有靶向多個靶序列的單獨鋅指域的組合的zfn。轉(zhuǎn)錄活化因子樣(tal)效應(yīng)子核酸酶(talen)也可用于位點特異性基因組編輯。tal效應(yīng)子蛋白dna結(jié)合域通常與限制性核酸酶諸如foki的非特異性裂解域組合使用。在一些實施方案中，將包含tal效應(yīng)子蛋白dna結(jié)合域和限制性核酸酶裂解域的融合蛋白用于識別和裂解本發(fā)明基因座內(nèi)的靶序列處的dna(bochj等人,2009science326:1509-1512)。rna引導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶(rgen)是從細(xì)菌適應(yīng)性免疫機(jī)制開發(fā)的可編程的基因組工程化工具。在該系統(tǒng)(成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(crispr)/crispr相關(guān)性(cas)免疫反應(yīng))中，蛋白cas9當(dāng)與兩個rna(其中一個引導(dǎo)靶選擇)復(fù)合時形成序列特異性核酸內(nèi)切酶。rgen由組分(cas9和tracrrna)以及靶特異性crisprrna(crrna)組成。dna靶裂解的效率以及裂解位點的位置均基于前間區(qū)序列鄰近基序(pam)的位置而變化，該基序是針對靶識別的額外要求(chen,h.等人,j.biol.chem.2014年3月14作為手稿m113.539726在線發(fā)表)。另外其他同源重組方法可供技術(shù)人員使用，諸如具有精確dna結(jié)合特異性的bud衍生的核酸酶(budn)(stella,s.等人actacryst.2014,d70,2042-2052)。精確的基因組修飾方法基于與基因組內(nèi)的獨特靶序列相容可獲得的工具來選擇，以使得避免細(xì)胞表型被破壞。本發(fā)明提供細(xì)胞和方法以供穩(wěn)定地將核酸序列(所關(guān)注基因)整合到哺乳動物細(xì)胞中，其中該核酸序列能夠通過與gpt序列整合來增強(qiáng)表達(dá)。本發(fā)明還提供組合物和方法以供與表達(dá)構(gòu)建體(例如表達(dá)載體)相關(guān)地使用gpt，以及將外源性gpt添加到所關(guān)注的哺乳動物細(xì)胞中。本發(fā)明提供細(xì)胞和方法以供用于一致但穩(wěn)健地制備糖蛋白特別是治療性糖蛋白的方法。gpt選擇標(biāo)記盒的構(gòu)建本文提供包括可操作的gpt表達(dá)盒的表達(dá)載體。該表達(dá)盒包括必需的調(diào)控元件以允許和驅(qū)動哺乳動物gpt和所需基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄和翻譯。還可開發(fā)本文所述的基因和調(diào)控序列的各種組合。還可開發(fā)的本文所述的適當(dāng)序列的其他組合的實例包括含有本文所公開的gpt基因的多個拷貝的序列，或通過將所公開的gpt與其他核苷酸序列組合以實現(xiàn)最佳調(diào)控元件組合而衍生的序列。此類組合可連續(xù)地連接或排列以提供向所關(guān)注基因和調(diào)控元件取向的最佳的gpt間距。編碼gpt的基因的同源序列已知存在于來自其他哺乳動物物種的細(xì)胞中(比如人類；參見圖2)以及衍生自其他哺乳動物組織類型的細(xì)胞系中，且可通過本領(lǐng)域熟知的技術(shù)來分離。示例性哺乳動物gpt氨基酸序列的列表提供于圖2中?？蓪eqidno:2和11-17所示的核苷酸序列進(jìn)行核苷酸序列的改變，諸如密碼子優(yōu)化，以便允許seqidno:3-10所示的對應(yīng)gpt蛋白的最佳表達(dá)。此外，可通過改變編碼gpt的核苷酸序列，來改變seqidno:3-10所示的氨基酸序列。此類技術(shù)包括但不限于本領(lǐng)域熟知的定點或隨機(jī)誘變技術(shù)。然后可將所得的gpt變體就本文所述的gpt活性進(jìn)行測試，例如對衣霉素的抗性進(jìn)行測試。通過常規(guī)實驗，將氨基酸序列與具有g(shù)pt活性的seqidno:3至少約93％相同、或至少約95％相同、或至少約96％相同、或至少約97％相同、或至少約98％相同的gpt蛋白分離出，且預(yù)期其表現(xiàn)出與seqidno:3相同的tn抗性、選擇性效率和翻譯后益處。因此，gpt的哺乳動物同源物和gpt變體也可由本發(fā)明的實施方案涵蓋。圖2a至2c顯示各種哺乳動物gpt氨基酸序列(即seqidno:3-10)的比對。哺乳動物gpt序列(核酸和氨基酸)在倉鼠、人類、小鼠和大鼠基因組之中為保守的。表1鑒別示例性哺乳動物gpt蛋白及其同源性程度。表1a：gpt同源物的氨基酸同一性表1b：代表性gpt同源物的核酸同一性動物seqidno％倉鼠同一性倉鼠2-小鼠1192人類1292大鼠1394獼猴1492黑猩猩1592可使用本文所提供的gpt/衣霉素法來產(chǎn)生表達(dá)增加水平的所關(guān)注蛋白的細(xì)胞群。取決于蛋白被細(xì)胞加工的效率如何，表達(dá)的絕對水平將隨特定蛋白而變化。因此，本發(fā)明還包括選自seqidno:2和11-17的表達(dá)gpt的核苷酸序列。本發(fā)明還涵蓋表達(dá)gpt的核苷酸序列，該序列與選自seqidno:2和11-17的核苷酸序列至少92％相同、至少93％相同、至少94％相同、至少95％相同、至少96％相同、至少98％相同或至少99％相同。本發(fā)明包括含有seqidno:1、seqidno:2或seqidno:12的載體。包括哺乳動物gpt基因和任選的調(diào)控元件的載體包括供瞬時或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的載體。在一個實施方案中，gpt基因用于增強(qiáng)goi的表達(dá)，如圖1所示。圖1顯示與ires序列和gpt選擇性標(biāo)記可操作地連接的goi。gpt盒還包括啟動子序列，例如sv40啟動子，和多聚腺苷酸化(poly(a))序列，例如sv40poly(a)。表達(dá)增強(qiáng)盒(包括gpt和上游啟動子)最佳地整合在細(xì)胞基因組中。使用本發(fā)明的方法，goi在以增加濃度的tn為基礎(chǔ)的培養(yǎng)條件下在gpt表達(dá)盒內(nèi)表達(dá)(圖3a或圖3b)。facs讀出結(jié)果(諸如圖5b、5c、5e和5f中所示)舉例說明穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞群中的表達(dá)分布，特別是使用哺乳動物tn抗性選擇標(biāo)記cho-gpt和hgpt在選擇效率上的急劇增加。哺乳動物gpt表達(dá)還增強(qiáng)了所關(guān)注基因產(chǎn)物的表達(dá)，例如熒光蛋白egfp的產(chǎn)生。相較于使用gpt在以一種濃度的tn為基礎(chǔ)的培養(yǎng)條件下在表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的goi，增加濃度的tn的連續(xù)培養(yǎng)導(dǎo)致約2倍的增強(qiáng)表達(dá)，諸如圖6b中所舉例說明。本發(fā)明包括包含這樣的gpt基因的哺乳動物細(xì)胞，其中該gpt基因為外源性的且通過本發(fā)明的方法整合到細(xì)胞基因組中。包括這樣的gpt基因的細(xì)胞具有至少一個外源性添加的所關(guān)注基因(goi)，該基因在gpt基因的上游或下游。在多種實施方案中，可通過將goi置于哺乳動物選擇性標(biāo)記gpt的控制下來增強(qiáng)goi的表達(dá)。在其他實施方案中，可通過將goi置于哺乳動物選擇性標(biāo)記gpt的控制下并提供包括大于0.5μg/mltn濃度的細(xì)胞培養(yǎng)條件，來增強(qiáng)goi的隨機(jī)整合事件。在一些實施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)條件包括大于1μg/ml的tn濃度。調(diào)控元件可以可操作地連接到goi，其中g(shù)oi的表達(dá)—在goi和gpt的選定距離下(在5’或3’方向)-保留增強(qiáng)goi表達(dá)的能力，例如，超過通常由于隨機(jī)整合事件所觀察到的表達(dá)。在多種實施方案中，增強(qiáng)為至少約1.5倍至約2倍或更多。相較于隨機(jī)整合或隨機(jī)表達(dá)，表達(dá)的增強(qiáng)為約1.5倍或約2倍或更多。在另一個實施方案中，使用本發(fā)明的方法和組合物可得到一致地糖基化的蛋白。如表4中所示，經(jīng)tn處理的gpt/goi重組蛋白批次使得重復(fù)批次具有同等的糖基化譜。因此，增強(qiáng)的蛋白表達(dá)諸如一致的糖基化譜可直接通過計算如本文所教導(dǎo)的z數(shù)來比較。z數(shù)方程式將色譜圖上代表唾液酸(sa)部分的相對波峰數(shù)以及各波峰的相對形狀和強(qiáng)度列入考慮。z數(shù)以各波峰所占據(jù)的面積為基礎(chǔ)并且可用作復(fù)合糖蛋白的一致性指標(biāo)(參見例如圖7a-7d、圖8和實施例3，如本文所述)。蛋白表達(dá)優(yōu)化還可就各goi而實現(xiàn)，包括例如表達(dá)盒取向或密碼子優(yōu)化。蛋白優(yōu)化還可通過在細(xì)胞培養(yǎng)法中改變遞增的tn濃度來實現(xiàn)。重組表達(dá)載體可包括編碼蛋白的合成的或cdna衍生的dna片段，其可操作地連接到衍生自哺乳動物、病毒或昆蟲基因的適合的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯調(diào)控元件。此類調(diào)控元件包括轉(zhuǎn)錄啟動子、增強(qiáng)子、編碼適合的mrna核糖體結(jié)合位點的序列以及控制轉(zhuǎn)錄和翻譯終止的序列，如本文詳細(xì)描述。哺乳動物表達(dá)載體還可包括非轉(zhuǎn)錄元件，諸如復(fù)制起點、其他5'或3'側(cè)翼非轉(zhuǎn)錄序列，以及5'或3'非翻譯序列諸如剪接供體和受體位點。還可并入幫助識別轉(zhuǎn)染子的另外的選擇性標(biāo)記基因(諸如熒光標(biāo)記)。在另一個實施方案中，載體包括編碼所關(guān)注蛋白的核酸分子(或所關(guān)注基因)，其包括含有所述核酸分子(基因)的表達(dá)載體，其中該核酸分子(基因)可操作地連接到表達(dá)控制序列。提供包括所關(guān)注基因(goi)的載體，其中該goi可操作地連接到適合在哺乳動物宿主細(xì)胞中表達(dá)的表達(dá)控制序列?？捎糜诒景l(fā)明的有用的啟動子包括但不限于sv40早期啟動子區(qū)、包含在勞氏肉瘤病毒的3'長末端重復(fù)序列中的啟動子、金屬硫蛋白基因的調(diào)控序列、小鼠或人類巨細(xì)胞病毒ie啟動子(gossen等人,(1995)proc.nat.acad.sci.usa89:5547-5551)、花椰菜花葉病毒35srna啟動子以及光合成酶核酮糖二磷酸羧化酶的啟動子、來自酵母或其他真菌的啟動子元件諸如gal4啟動子、adc(醇脫氫酶)啟動子、pgk(磷酸甘油激酶)啟動子、堿性磷酸酶啟動子以及下列動物轉(zhuǎn)錄控制區(qū)，其表現(xiàn)出組織特異性并已用于轉(zhuǎn)基因動物：彈性蛋白酶i、胰島素、免疫球蛋白、小鼠乳腺腫瘤病毒、白蛋白、甲胎蛋白、α1-抗胰蛋白酶、β-球蛋白和肌球蛋白輕鏈-2。本發(fā)明的核酸分子還可以可操作地連接到有效的poly(a)終止序列(例如sv40poly(a))、用于大腸桿菌中質(zhì)粒產(chǎn)物的復(fù)制起點和/或方便的克隆位點(例如多接頭)。核酸還可包括與組成型啟動子相反的可調(diào)節(jié)的誘導(dǎo)型啟動子(可誘導(dǎo)的、可抑制的、發(fā)育性調(diào)節(jié)的)，諸如cmvie(技術(shù)人員將認(rèn)識到，此類術(shù)語實際上為某些條件下的基因表達(dá)程度的描述語)。本發(fā)明提供制備所關(guān)注蛋白的方法，而提供包括所關(guān)注基因(goi)的表達(dá)載體。此類表達(dá)載體可用于重組制備任何所關(guān)注蛋白?？捎糜谵D(zhuǎn)染脊椎動物細(xì)胞的表達(dá)載體中的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列可通過病毒來源而提供。例如，常用的啟動子和增強(qiáng)子衍生自病毒，諸如多瘤病毒、腺病毒2、猴病毒40(sv40)和人類巨細(xì)胞病毒(cmv)。病毒基因組啟動子、控制和/或信號序列可用于驅(qū)動表達(dá)，所提供的此類控制序列與所選擇的宿主細(xì)胞相容。取決于在其中表達(dá)重組蛋白的細(xì)胞類型，還可使用非病毒細(xì)胞啟動子(例如，β-球蛋白和ef-1α啟動子)。衍生自sv40病毒基因組的dna序列例如sv40起點、早期和晚期啟動子、增強(qiáng)子、剪接和多聚腺苷化位點可用于提供對異源dna序列的表達(dá)有用的其他基因元件。早期和晚期啟動子是特別有用的，因為二者可容易地從sv40病毒作為還含有sv40病毒復(fù)制起點的片段得到(fiers等人,nature273:113,1978)。也可使用較小或較大的sv40片段。通常，包括從位于sv40復(fù)制起點中的hindiii位點向bgli位點延伸的大約250bp序列。用于表達(dá)多個轉(zhuǎn)錄物的雙順反子表達(dá)載體先前已有描述(kims.k.和woldb.j.,cell42:129,1985；kaufman等人1991，同上)并可與gpt表達(dá)系統(tǒng)組合使用。其他類型的表達(dá)載體也將是有用的，例如描述于美國專利第4,634,665號(axel等人)和美國專利第4,656,134號(ringold等人)中的那些。整合位點(例如重組酶識別位點)可置于編碼poi的基因序列的5’或3’。適合的整合位點的一個實例為loxp位點。適合的整合位點的另一個實例為兩個重組酶識別位點，例如選自loxp位點、lox和lox5511位點?；驍U(kuò)增盒及其表達(dá)載體先前已描述或本領(lǐng)域已知的有用調(diào)控元件也可包括在用于轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞的核酸中。圖1舉例說明gpt載體中的可操作盒，其還包括啟動子序列、ires序列、所關(guān)注基因和poly(a)序列。在本發(fā)明的上下文中的表達(dá)載體可以是任何適合的載體，包括染色體、非染色體和合成的核酸載體(包括一組適合的表達(dá)控制元件的核酸序列)。此類載體的實例包括sv40的衍生物、細(xì)菌質(zhì)粒、嗜菌體dna、桿狀病毒、酵母質(zhì)粒、衍生自質(zhì)粒和嗜菌體dna組合的載體、以及病毒核酸(rna或dna)載體。在一個實施方案中，編碼抗體的核酸分子包含在裸dna或rna載體中，包括例如線性表達(dá)元件(如描述于例如sykes和johnston,natbiotech12,355-59(1997)中)、緊湊的核酸載體(如描述于例如us6,077,835和/或wo00/70087中)或質(zhì)粒載體諸如pbr322、puc19/18或puc118/119。此類核酸載體及其用法為本領(lǐng)域熟知的(參見例如us5,589,466和us5,973,972)?；蛘?，表達(dá)載體可為適合在酵母系統(tǒng)中表達(dá)的載體?？墒褂萌魏芜m合在酵母系統(tǒng)中表達(dá)的載體。適合的載體包括例如包含組成型或誘導(dǎo)型啟動子的載體，諸如酵母α因子、醇氧化酶和pgh(綜述見于：f.ausubel等人編currentprotocolsinmolecularbiology,greenepublishingandwileyintersciencenewyork(1987)以及grant等人,methodsinenzymol153,516-544(1987))。在某些實施方案中，載體包括編碼所關(guān)注蛋白的核酸分子(或所關(guān)注基因)，其包括含有所述核酸分子(基因)的表達(dá)載體，其中該核酸分子(基因)可操作地連接到適合在宿主細(xì)胞中表達(dá)的表達(dá)控制序列。表達(dá)控制序列經(jīng)工程化以控制和驅(qū)動所關(guān)注基因的轉(zhuǎn)錄，及后續(xù)在各種細(xì)胞系統(tǒng)中的蛋白表達(dá)。質(zhì)粒將可表達(dá)的所關(guān)注基因與包括所需調(diào)控元件比如啟動子、增強(qiáng)子、選擇性標(biāo)記、操縱子等的表達(dá)控制序列(即表達(dá)盒)組合。在本發(fā)明的表達(dá)載體中，gpt和所關(guān)注蛋白諸如編碼抗體的核酸分子可包括以下部分或與它們相關(guān)：任何適合的啟動子、增強(qiáng)子、操縱子、阻遏蛋白、poly(a)終止序列和其他表達(dá)促進(jìn)元件。所關(guān)注基因(例如編碼抗體的核苷酸序列)的表達(dá)可置于本領(lǐng)域已知的任何啟動子或增強(qiáng)子元件的控制下。此類元件的實例包括強(qiáng)表達(dá)啟動子(例如，人類cmvie啟動子/增強(qiáng)子或cmv主要ie(cmv-mie)啟動子，以及rsv、sv40晚期啟動子、sl3-3、mmtv、泛素(ubi)、泛素c(ubc)和hivltr啟動子)。在一些實施方案中，該載體包括選自以下的啟動子：sv40、cmv、cmv-ie、cmv-mie、rsv、sl3-3、mmtv、ubi、ubc和hivltr。本發(fā)明的核酸分子還可以可操作地連接到有效的poly(a)終止序列、用于大腸桿菌中質(zhì)粒產(chǎn)物的復(fù)制起點、作為選擇性標(biāo)記的抗生素抗性基因、和/或方便的克隆位點(例如多接頭)。核酸還可包括與組成型啟動子相反的可調(diào)節(jié)的誘導(dǎo)型啟動子(可誘導(dǎo)的、可抑制的、發(fā)育性調(diào)節(jié)的)，諸如cmvie(技術(shù)人員將認(rèn)識到，此類術(shù)語實際上為某些條件下的基因表達(dá)程度的描述語)。選擇性標(biāo)記是本領(lǐng)域熟知的元件。在某些情況下，除了gpt之外，還可以使用另外的選擇性標(biāo)記，其中此類標(biāo)記使細(xì)胞可見?？墒褂谜x擇或負(fù)選擇。在一些實施方案中，該載體包括一種或多種編碼綠色熒光蛋白(gfp)、增強(qiáng)的綠色熒光蛋白(egfp)、氰基熒光蛋白(cfp)、增強(qiáng)的氰基熒光蛋白(ecfp)、黃色熒光蛋白(yfp)或增強(qiáng)的黃色熒光蛋白(eyfp)的選擇性標(biāo)記基因。就本發(fā)明的目的而言，真核細(xì)胞中的基因表達(dá)可使用強(qiáng)啟動子緊密調(diào)節(jié)，該啟動子通過操縱子來控制，而該操縱子繼而由調(diào)節(jié)性融合蛋白(rfp)來調(diào)節(jié)。rfp基本上由轉(zhuǎn)錄阻斷域和調(diào)節(jié)其活性的配體結(jié)合域組成。此類表達(dá)系統(tǒng)的實例描述于us20090162901a1中，其全文以引用方式并入本文。許多真核細(xì)胞和嗜菌體中的操縱子已研究透徹(neidhardt編escherichiacoliandsalmonella；cellularandmolecularbiology第2版第2卷asmpress,washingtond.c.1996)。這些包括但不限于大腸桿菌的lexa基因的操縱子區(qū)，其與lexa肽結(jié)合，以及乳糖和色氨酸操縱子，其與由大腸桿菌的laci和trpr基因編碼的阻遏蛋白結(jié)合。這些還包括來自λpr和噬菌體p22ant/mnt基因的嗜菌體操縱子，其與由λci和p22arc編碼的阻遏蛋白結(jié)合。在一些實施方案中，當(dāng)阻遏蛋白的轉(zhuǎn)錄阻斷域為限制酶諸如noti時，操縱子為該酶的識別序列。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識到，操縱子必須位于啟動子附近或位于啟動子的3'，以使得其能夠通過該啟動子控制轉(zhuǎn)錄。例如，美國專利第5,972,650號(以引用方式并入本文)規(guī)定了teto序列在tata盒的特定距離內(nèi)。在具體實施方案中，該操縱子優(yōu)選地置于啟動子的正下游。在其他實施方案中，該操縱子置于啟動子的10個堿基對內(nèi)。在某些實施方案中，該操縱子選自：tet操縱子(teto)、noti識別序列、lexa操縱子、乳糖操縱子、色氨酸操縱子和arc操縱子(ao)。在一些實施方案中，阻遏蛋白選自tetr、lexa、laci、trpr、arc、λc1和gal4。在其他實施方案中，該轉(zhuǎn)錄阻斷域衍生自真核阻遏蛋白，例如衍生自gal4的阻遏域。在示例性細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中，細(xì)胞經(jīng)工程化以表達(dá)四環(huán)素阻遏蛋白(tetr)且所關(guān)注蛋白置于啟動子的轉(zhuǎn)錄控制下，而該啟動子的活性受tetr調(diào)控。兩個一前一后的tetr操縱子(teto)置于載體中的cmv-mie啟動子/增強(qiáng)子的正下游。由這樣的載體中的cmv-mie啟動子所指導(dǎo)的編碼所關(guān)注蛋白的基因的轉(zhuǎn)錄在不存在四環(huán)素或在某些其他適合的誘導(dǎo)物(例如強(qiáng)力霉素)的情況下可被tetr阻斷。在誘導(dǎo)物的存在下，tetr蛋白能結(jié)合teto，因而使所關(guān)注蛋白的轉(zhuǎn)錄然后使翻譯(表達(dá))發(fā)生(參見例如美國專利第7,435,553號，其全文以引用方式并入本文)。另一種示例細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)包括調(diào)節(jié)性融合蛋白，諸如tetr-erlbdt2融合蛋白，其中該融合蛋白的轉(zhuǎn)錄阻斷域為tetr而配體結(jié)合域為具有t2突變的雌激素受體配體結(jié)合域(erlbd)(erlbdt2；feil等人(1997)biochem.biophys.res.commun.237:752-757)。當(dāng)teto序列置于強(qiáng)cmv-mie啟動子的下游和附近時，來自cmv-mie/teto啟動子的所關(guān)注核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄在他莫昔芬的存在下被阻斷，并通過移除他莫昔芬解除阻斷。在另一個實例中，使用融合蛋白arc2-erlbdt2(由通過15個氨基酸的接頭所連接的兩個arc蛋白所組成的單鏈二聚體和erlbdt2(同上)所組成的融合蛋白)涉以及arc操縱子(ao)，更具體地講，cmv-mie啟動子/增強(qiáng)子正下游的兩個一前一后的arc操縱子。細(xì)胞系可由arc2-erlbdt2調(diào)節(jié)，其中表達(dá)所關(guān)注蛋白的細(xì)胞由cmv-mie/arco2啟動子驅(qū)動并可通過移除他莫昔芬來誘導(dǎo)。(參見例如us20090162901a1，其以引用方式并入本文)。在一些實施方案中，本發(fā)明的載體包括cmv-mie/teto或cmv-mie/ao2雜交啟動子。本發(fā)明的載體還可將cre-lox工具用于重組技術(shù)，以便有利于所關(guān)注基因的復(fù)制。cre-lox策略需要至少兩個組成部分：1)cre重組酶，一種催化兩個loxp位點之間的重組的酶；以及2)loxp位點(例如，由8-bp核心序列(重組在其中進(jìn)行)和兩個側(cè)翼13-bp反向重復(fù)序列所組成的特異性34-堿基對bp序列)或突變lox位點。(參見例如araki等人pnas92:160-4(1995)；nagy,a.等人genesis26:99-109(2000)；araki等人nucacidsres30(19):e103(2002)和us20100291626a1，其全部以引用方式并入本文)。在另一種重組策略中，酵母衍生的flp重組酶可與共有序列frt一起使用(另見例如dymecki,s.pnas93(12):6191-6196(1996))。在另一個方面，基因(即編碼本發(fā)明重組多肽的核苷酸序列)插入表達(dá)盒的gpt基因的上游或下游，且任選可操作地連接到啟動子，其中該啟動子連接的基因的5’側(cè)翼為第一重組酶識別位點而3’側(cè)翼為第二重組酶識別位點。此類重組酶識別位點允許表達(dá)系統(tǒng)的宿主細(xì)胞中cre介導(dǎo)的重組。在一些情況下，第二啟動子連接的基因在第一基因的下游(3’)且3’側(cè)翼為第二重組酶識別位點。在另外其他情況下，第二啟動子連接的基因的5’側(cè)翼為第二重組酶識別位點，而3’側(cè)翼為第三重組酶識別位點。在一些實施方案中，重組酶識別位點選自loxp位點、lox511位點、lox2272位點和frt位點。在其他實施方案中，重組酶識別位點為不同的。在又一個實施方案中，宿主細(xì)胞包括能表達(dá)cre重組酶的基因。在一個實施方案中，載體包括編碼本發(fā)明的抗體輕鏈或抗體重鏈的第一基因，以及編碼本發(fā)明的抗體輕鏈或抗體重鏈的第二基因。在一些實施方案中，載體還包括x-盒結(jié)合蛋白1(mxbp1)基因，其能夠通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(er)中的蛋白折疊所涉及到的基因表達(dá)的控制進(jìn)一步增強(qiáng)蛋白產(chǎn)生/蛋白分泌。(參見例如rond和walterp.natrevmolcellbiol.8:519–529(2007))。任何細(xì)胞均適于表達(dá)本發(fā)明的重組核酸序列。用于本發(fā)明的細(xì)胞包括哺乳動物細(xì)胞，諸如非人類動物細(xì)胞、人類細(xì)胞或細(xì)胞融合物，比如雜交瘤或四源雜交瘤。在某些實施方案中，細(xì)胞為人、猴、倉鼠、大鼠或小鼠細(xì)胞。在其他實施方案中，細(xì)胞為真核細(xì)胞并且選自以下細(xì)胞：cho(例如chok1、dxb-11cho、veggie-cho)、cos(例如cos-7)、視網(wǎng)膜細(xì)胞、vero、cv1、腎(例如hek293、293ebna、msr293、mdck、hak、bhk21)、hela、hepg2、wi38、mrc5、colo25、hb8065、hl-60、jurkat、daudi、a431(表皮的)、cv-1、u937、3t3、l細(xì)胞、c127細(xì)胞、sp2/0、ns-0、mmt細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和來源于前述細(xì)胞的細(xì)胞系。在一些實施方案中，細(xì)胞包含一個或多個病毒基因，例如表達(dá)病毒基因的視網(wǎng)膜細(xì)胞(例如per.細(xì)胞)。在又一個方面，本發(fā)明涉及重組的哺乳動物宿主細(xì)胞，諸如轉(zhuǎn)染瘤，其產(chǎn)生免疫球蛋白，諸如抗體或雙特異性分子。此類宿主細(xì)胞的實例包括工程化的哺乳動物細(xì)胞，諸如cho或hek細(xì)胞。例如，在一個實施方案中，本發(fā)明提供包括穩(wěn)定整合到細(xì)胞基因組中的核酸的細(xì)胞，該核酸包括編碼抗體表達(dá)的序列，而該抗體包括本發(fā)明的重組多肽。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供包括非整合(即附加型)核酸(諸如質(zhì)粒、粘粒、噬?；蚓€性表達(dá)元件)的細(xì)胞，該核酸包括編碼抗體表達(dá)的序列，而該抗體包括本發(fā)明的重組多肽。在其他實施方案中，本發(fā)明提供通過用包括本發(fā)明表達(dá)載體的質(zhì)粒來穩(wěn)定轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞而產(chǎn)生的細(xì)胞系。因此，在一個方面，本發(fā)明提供包含以下部分的細(xì)胞：(a)編碼外源性添加的哺乳動物gpt基因的重組多核苷酸以及(b)編碼多亞基蛋白的多核苷酸。在一些實施方案中，外源性添加的gpt基因與seqidno:2的核酸序列90％相同，其非限制性實例提供于seqidno:11-17中，且多亞基蛋白為抗體。在其他實施方案中，細(xì)胞還含有外源性添加的gpt基因和調(diào)控元件。在一個實施方案中，細(xì)胞為哺乳動物細(xì)胞，諸如用于制備生物藥品的cho細(xì)胞。在另一個方面，本發(fā)明提供衍生自在之前方面所述的細(xì)胞的細(xì)胞系。所謂“衍生自”是指由各個細(xì)胞無性繁殖的并具有某些選定品質(zhì)(諸如以給定效價產(chǎn)生活性蛋白的能力，或增殖至特定密度的能力)的細(xì)胞群。在一些實施方案中，衍生自具有編碼哺乳動物gpt基因的重組多核苷酸和編碼多亞基蛋白的多核苷酸的細(xì)胞的細(xì)胞系能夠以至少3克每升(g/l)培養(yǎng)基、至少5g/l或至少8g/l的效價產(chǎn)生多亞基蛋白。在一些實施方案中，該細(xì)胞系可達(dá)到比由基本上相同但無編碼gpt的重組多核苷酸的細(xì)胞所衍生的細(xì)胞系所能達(dá)到的累積細(xì)胞密度(icd)大至少30％、大至少50％、大至少60％或大至少90％的累積細(xì)胞密度。提供了擴(kuò)增goi的方法。舉例說明的方法將增加濃度的衣霉素施用于真核gpt表達(dá)系統(tǒng)，從而擴(kuò)增可操作地連接到外源性添加的哺乳動物gpt基因的goi的基因拷貝。所關(guān)注蛋白編碼所關(guān)注基因的核酸序列可方便地整合到包括tn抗性標(biāo)記基因和ires，且任選側(cè)翼有重組酶識別位點的細(xì)胞中?？墒褂萌魏芜m合在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的所關(guān)注蛋白，然而糖蛋白將尤其受益于本發(fā)明的方法。例如，所關(guān)注蛋白可為抗體或其抗原結(jié)合片段、雙特異性抗體或其片段、嵌合抗體或其片段、scfv或其片段、fc標(biāo)簽蛋白(例如trap蛋白)或其片段、生長因子或其片段、細(xì)胞因子或其片段、細(xì)胞表面受體的胞外域或其片段。具有天冬酰胺連接的(n-連接的)聚糖的糖蛋白普遍存在于真核細(xì)胞中。這些聚糖的生物合成及其向多肽的轉(zhuǎn)化在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(er)中發(fā)生。n-聚糖結(jié)構(gòu)在er和高爾基復(fù)合體中通過許多糖苷酶和糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)一步修飾。使用本發(fā)明進(jìn)行的蛋白制備針對天然n-聚糖結(jié)構(gòu)的一致性，以消除免疫原性表位(“糖表位”(glycotope))。使用本發(fā)明的方法，重組蛋白批次表現(xiàn)出有利的特性。重復(fù)的蛋白生產(chǎn)批次的hplc(以熒光檢測)證明了糖蛋白具有統(tǒng)一的表達(dá)和糖基化模式，如本文圖7-8中舉例說明。提供了使n-聚糖蛋白底物糖基化的方法，其中提供編碼核酸分子的哺乳動物宿主細(xì)胞，該核酸分子包含可操作地連接到編碼需要糖基化的蛋白底物的基因的哺乳動物衣霉素(tn)抗性基因；將該細(xì)胞在第一濃度的tn存在下培養(yǎng)；將表達(dá)tn抗性基因的至少一個拷貝的細(xì)胞群分離；將該細(xì)胞群在增加濃度的tn存在下培養(yǎng)；以及從細(xì)胞培養(yǎng)中分離n-聚糖蛋白底物。蛋白底物的n-聚糖含量可就單糖、寡糖的存在通過本領(lǐng)域已知的任何方法來評估。聚糖連接的蛋白的詳細(xì)結(jié)構(gòu)分析可與蛋白的功能特征相關(guān)聯(lián)。這種對蛋白糖基化進(jìn)行表征的分析通常涉以及以下幾個步驟：i)酶或化學(xué)釋放所連接的聚糖；ii)經(jīng)由芳族或脂族胺的還原性胺化或全甲基化使釋放的聚糖衍生化；iii)分析聚糖。許多分析糖化模式的變化是技術(shù)人員已知的。糖蛋白可帶有以特定數(shù)量占據(jù)各個位點的數(shù)種形式的糖型，并因此而言，其復(fù)雜性可能使其難以在某些生產(chǎn)方法中重現(xiàn)。糖型的類型和數(shù)量的一致性是可測量的且代表治療性蛋白生產(chǎn)的期望結(jié)果。宿主細(xì)胞和轉(zhuǎn)染用于本發(fā)明方法中的哺乳動物宿主細(xì)胞為真核宿主細(xì)胞，通常為哺乳動物細(xì)胞，包括例如cho細(xì)胞和小鼠細(xì)胞。在一個實施方案中，本發(fā)明提供包括編碼衍生自中國倉鼠(cricetulusgriseus)的tn抗性標(biāo)記蛋白的核酸序列(如seqidno:3所示)或其同源物或變體的細(xì)胞。在一些實施方案中，該細(xì)胞包括tn抗性標(biāo)記基因的多基因拷貝。在其他實施方案中，本發(fā)明提供編碼衍生自人類(seqidno:4)、獼猴(seqidno:5)、黑猩猩(seqidno:6)、狗(seqidno:7)、豚鼠(seqidno:8)、大鼠(seqidno:9)或小鼠(seqidno:10)的tn抗性標(biāo)記蛋白的核酸序列。本發(fā)明包括用本發(fā)明的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的哺乳動物宿主細(xì)胞。經(jīng)轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞包括經(jīng)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，而該表達(dá)載體包括編碼所關(guān)注蛋白或多肽的序列。所表達(dá)的蛋白將通常取決于所選的核酸序列而分泌到培養(yǎng)基中，但可能保持在細(xì)胞中或沉積在細(xì)胞膜中。各種哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)均可用于表達(dá)重組蛋白。適合的哺乳動物宿主細(xì)胞系的實例包括gluzman(1981)cell23:175所述的猴腎臟細(xì)胞的cos-7細(xì)胞系，以及能夠表達(dá)適當(dāng)載體的其他細(xì)胞系，包括例如cv-1/ebna(atcccrl10478)、l細(xì)胞、c127、3t3、cho、hela和bhk細(xì)胞系。針對特定選擇或擴(kuò)增流程而開發(fā)的其他細(xì)胞系也可與本文所提供的方法和組合物一起使用。在本發(fā)明的一個實施方案中，該細(xì)胞為稱為k1的cho細(xì)胞系(即chok1細(xì)胞)。為了實現(xiàn)重組蛋白高產(chǎn)量的目標(biāo)，宿主細(xì)胞系應(yīng)在適當(dāng)?shù)那闆r下預(yù)先適應(yīng)生物反應(yīng)器培養(yǎng)基。本領(lǐng)域已知數(shù)種轉(zhuǎn)染方法，它們在kaufman(1988)meth.enzymology185:537中進(jìn)行了綜述。所選的轉(zhuǎn)染方案將取決于宿主細(xì)胞類型和goi性質(zhì)，且可基于常規(guī)實驗來選擇。任何這樣的方案的基本要求是首先將編碼所關(guān)注蛋白的dna引入適合的宿主細(xì)胞中，然后以相對穩(wěn)定、可表達(dá)的方式鑒定和分離已包含異源dna的宿主細(xì)胞?？捎糜趯愒磀na引入哺乳動物細(xì)胞的某些試劑包括lipofectintm試劑和lipofectaminetm試劑(gibcobrl,gaithersburg,md.)。這兩種試劑均為用于形成脂質(zhì)-核酸復(fù)合物(或脂質(zhì)體)的市售試劑，當(dāng)應(yīng)用于培養(yǎng)的細(xì)胞時，有利于核酸攝入細(xì)胞中。所選的轉(zhuǎn)染方案和選擇用于其中的元件將取決于所用的宿主細(xì)胞的類型。本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道許多不同的方案和宿主細(xì)胞，并且可基于所用的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的要求來選擇用于表達(dá)所需蛋白的適當(dāng)系統(tǒng)。在另一個方面，本發(fā)明涉及編碼多肽的表達(dá)載體，其包括但不限于抗體、雙特異性抗體、嵌合抗體、scfv、抗原結(jié)合蛋白或fc融合蛋白。此類表達(dá)載體可用于使用本發(fā)明的方法和組合物進(jìn)行的重組多肽制備。本發(fā)明的其他特征在以下對示例性實施方案的描述過程中將變得顯而易見，這些實施方案用于說明本發(fā)明而無意限制本發(fā)明。實施例提供以下實施例是為了向本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員描述如何構(gòu)造和使用本發(fā)明的方法和組合物，而非旨在限制發(fā)明人所認(rèn)為的其發(fā)明的范圍。已努力確保有關(guān)所用的數(shù)字(例如量、溫度等)的準(zhǔn)確性，但應(yīng)考慮某些實驗誤差和偏差。除非另有指出，否則份數(shù)為重量份，分子量為平均分子量，溫度為攝氏度，而壓力為大氣壓或接近大氣壓。實施例1表達(dá)gpt的轉(zhuǎn)染細(xì)胞的選擇效率。將經(jīng)修飾的chok1細(xì)胞用含有cho-gpt(seqidno:2)、人類gpt(seqidno:12)的質(zhì)粒載體或含有潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(hpt，潮霉素抗性基因)的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染；例如，將選擇性標(biāo)記基因(cho-gpt或hpt)在其相應(yīng)載體中經(jīng)由ires序列在轉(zhuǎn)錄上連接到下游egfp基因。例如，各質(zhì)粒被構(gòu)建成在5’至3’方向上包含下列基因序列：lox位點、sv40晚期啟動子、cho-gpt(或hpt)、ires、增強(qiáng)的綠色熒光蛋白(egfp)和第二lox位點。將純化的重組質(zhì)粒與表達(dá)cre重組酶的質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染進(jìn)從5'至3'在轉(zhuǎn)錄活性基因座處含有以下位點的經(jīng)修飾的cho宿主細(xì)胞：lox位點、yfp和第二lox位點。因此，宿主cho細(xì)胞可通過流式細(xì)胞術(shù)作為綠色陽性或黃色陰性細(xì)胞分離。當(dāng)表達(dá)egfp(轉(zhuǎn)錄上受gpt或hpt基因調(diào)控)的重組質(zhì)粒與表達(dá)cre重組酶的質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染時，由cre重組酶介導(dǎo)的重組在含有l(wèi)ox位點的染色體基因座處導(dǎo)致gpt/egfp盒的位點特異性整合，并且發(fā)生yfp基因的取代(即綠色陽性細(xì)胞)。若egfp隨機(jī)整合，則將產(chǎn)生綠色陽性和黃色陽性兩種細(xì)胞。將細(xì)胞群用0、1μg/ml、2.5μg/ml或5μg/ml衣霉素(tn)或400μg潮霉素(hyg)溫育，如表2所概述。通過熒光激活細(xì)胞分選(facs)分析來測量觀察到的重組群體(orp)。對細(xì)胞進(jìn)行分選以定量各細(xì)胞群，并針對僅表達(dá)gfp而不表達(dá)yfp的細(xì)胞計算選擇效率(圖4或5)。比較耐tn或hyg的細(xì)胞池之間的選擇效率(表達(dá)gfp的存活細(xì)胞的群體百分比)(表2)。表2：選擇效率據(jù)觀察，衣霉素選擇與潮霉素選擇同樣高效。cho-gpt和人類gpt在1μg/ml或2.5μg/ml衣霉素存在下在整合體的選擇方面均是高效的。實施例2基因產(chǎn)物的擴(kuò)增。通過將增加濃度的衣霉素施用于gpt表達(dá)系統(tǒng)來進(jìn)行增量選擇。用含有如上cho-gpt基因(seqidno:2)的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染chok1細(xì)胞。該質(zhì)粒以5’至3’方向含有第一lox位點、sv40晚期啟動子、cho-gpt基因、ires、egfp和第二lox位點。cre-lox位點指導(dǎo)所關(guān)注基因整合到基因組中，從而產(chǎn)生每個細(xì)胞具有至少一個gpt插入的穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞池。(如上所見，由于隨機(jī)整合，可產(chǎn)生更多的整合體)。最初在1μg/ml衣霉素(tn)存在下培養(yǎng)cho細(xì)胞。然后從穩(wěn)定的池(稱為細(xì)胞池2)中選擇轉(zhuǎn)染子，隨后在1μg/ml、2.5μg/ml或5μg/mltn存在下擴(kuò)增。進(jìn)行數(shù)輪選擇以鑒別能增強(qiáng)egfp表達(dá)(多個拷貝)的細(xì)胞群。在2.5μg/ml或5μg/mltn存在下，隨機(jī)整合事件大大增加。使用標(biāo)準(zhǔn)qpcr法測量基因產(chǎn)物chogpt、egfp或mgapdh(歸一化對照)的拷貝數(shù)。來自進(jìn)一步用2.5μg/mltn溫育的1μg/mltn抗性池的細(xì)胞中的egfp拷貝數(shù)為來自進(jìn)一步用1μg/mltn溫育的1μg/mltn抗性池的egfp拷貝數(shù)的至少2倍。當(dāng)經(jīng)1μg/mltn處理的池進(jìn)一步用5μg/mltn溫育時，基因拷貝數(shù)進(jìn)一步增加。egfp基因拷貝數(shù)的增加與增加的cho-gpt基因拷貝相關(guān)聯(lián)。(參見圖6a和6b)。為了確定基因拷貝數(shù)的增加是否會轉(zhuǎn)變成增加的蛋白表達(dá)，針對經(jīng)多輪tn選擇(即1、2.5或5μgtn)處理過的表達(dá)gpt和egfp的相同細(xì)胞池，通過facs測量了平均熒光強(qiáng)度(mfi)(參見例如圖6b中的實例7、8和9)。這些細(xì)胞池的egfp表達(dá)的比較在表3中示出。就egfp生成而言，接受第二輪5μgtn選擇的表達(dá)gpt的細(xì)胞池，相較于1μgtn處理，產(chǎn)量恰好為2.5倍，相較于2.5μgtn處理，產(chǎn)量為1.5倍(表3)。表3：egfp蛋白產(chǎn)生gpt1μg池+第二tn(μg)處理mfi1μg10982.5μg18675μg2854不受任一理論的束縛，tn濃度的遞增以受控的方式放大了對細(xì)胞的選擇壓力，從而提高產(chǎn)量。如下所述，還將tn抗性表達(dá)載體用于另外的實驗，以檢測tn選擇對糖基化模式的作用。實施例3示例性二聚蛋白的表達(dá)和糖基化譜。用含有g(shù)pt的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染表達(dá)“trap”蛋白(fc融合蛋白1，下文稱為fcfp1)的cho細(xì)胞。該質(zhì)粒以5’至3’方向具有l(wèi)ox位點、sv40晚期啟動子、tn抗性基因(cho-gpt)、iresegfp、sv40polya和第二lox位點。使用1μg/mltn或5μg/mltn進(jìn)行g(shù)pt選擇性標(biāo)記的選擇。通過懸浮培養(yǎng)于無血清的生產(chǎn)培養(yǎng)基中來擴(kuò)增所選的細(xì)胞池。通過facs分析，由egfp的表達(dá)確認(rèn)了gpt轉(zhuǎn)染。將從所選的池收集的團(tuán)塊送去進(jìn)行g(shù)pt表達(dá)的拷貝數(shù)分析，并建立12天的生產(chǎn)率分析，以測定用不同濃度的衣霉素選擇的池中的fcfp1表達(dá)水平。對fcfp1就其復(fù)合糖基化模式進(jìn)行選擇，其具有豐富的糖基化位點。為了測定糖基化譜，將表達(dá)fcf1蛋白的細(xì)胞在標(biāo)準(zhǔn)方案(無tn)或tn處理條件(如表4所示)下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)而擴(kuò)增，然后分離并純化蛋白。表4：fcfp1蛋白產(chǎn)生蛋白批號處理fcfp1trap110728無fcfp1trap110728-11μg/mltnfcfp1trap110728-25μg/mltn使用基于熟知的hplc方法的色譜法和熒光鄰氨基苯甲酸(aa)標(biāo)簽(anumula和dhume,glycobiology,8(7):685-694,1998)，就各批次糖蛋白進(jìn)行詳細(xì)的聚糖分析，以確定tn對糖基化譜是否有負(fù)面影響。還將生產(chǎn)批次與代表治療上可接受的蛋白批次的參照標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了比較。代表性聚糖分析如圖7a-7d所示。各批次(相較于參照批次)一致地產(chǎn)生相同的波峰數(shù)目、相對形狀和相對強(qiáng)度。各色譜圖的重疊(圖8)表明并無獨特或異常的波峰露出。通過熟知的hplc方法針對參照標(biāo)準(zhǔn)批次就fcfp1蛋白進(jìn)行了寡糖性質(zhì)分析。就fcfp1trap蛋白批次測量了唾液酸化的量，并計算了各批次(3個重復(fù))的z數(shù)。z數(shù)代表各批次之間變異的量度。z數(shù)考慮相對波峰數(shù)以及各波峰的相對形狀和強(qiáng)度。例如，圖7a-7d中各0sa、1sa、2sa、3sa和4sa波峰的面積如表5經(jīng)定量。表5：寡糖定量分析os＝寡糖；0sa＝0個唾液酸殘基；1sa＝1個唾液酸殘基；2sa＝2個唾液酸殘基；3sa＝3個唾液酸殘基；4sa＝4個唾液酸殘基相較于參照批次，各批所計算的z數(shù)在可接受范圍內(nèi)，因此應(yīng)當(dāng)理解，各蛋白批次達(dá)到與治療分子相同的物質(zhì)。因為tn的存在已知對于n-連接的糖蛋白的糖基化具有負(fù)面作用，因此，鑒于由tn產(chǎn)生的增加的選擇壓力條件，蛋白產(chǎn)生和產(chǎn)率是可靠和一致的這種情況出人意料。在不背離本發(fā)明的精神或?qū)嵸|(zhì)的情況下，本發(fā)明可以體現(xiàn)為其他具體實施方案。序列表<110>regeneronpharmaceuticals,inc.deshpande,dipaliburakov,daryachen,gangfandl,jamesp.<120>重組蛋白的高效選擇性<130>8700wo<150>us62/039,416<151>2014-08-19<160>17<170>patentin3.5版<210>1<211>6964<212>dna<213>人工序列<220><223>合成的<400>1aagcttatactcgagctctagattgggaacccgggtctctcgaattcgagatctagttta60aacacgcggccgctaatcagccataccacatttgtagaggttttacttgctttaaaaaac120ctcccacacctccccctgaacctgaaacataaaatgaatgcaattgttgttgttaacttg180tttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaa240gcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcat300gtctaccggtataacttcgtataatgtatactatacgaagttagccggtagggcccctct360cttcatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggc420gtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagag480gtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgt540gcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcggg600aagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcg660ctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccgg720taactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccac780tggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtg840gcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagt900taccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcgg960tggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcc1020tttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggatttt1080ggtcatgggcgcgcctcatactcctgcaggcatgagattatcaaaaaggatcttcaccta1140gatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttg1200gtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcg1260ttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttacc1320atctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatc1380agcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgc1440ctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatag1500tttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtat1560ggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtg1620caaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagt1680gttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaag1740atgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcg1800accgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataatactgcgccacatagcagaacttt1860aaaagtgctcatcattggaaaacgtttttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgct1920gttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttac1980tttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaat2040aagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcat2100ttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaaca2160aataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtcaggtacacaacttc2220gtatagcatacattatacgaagttatggtaccaagcctaggcctccaaaaaagcctcctc2280actacttctggaatagctcagaggcagaggcggcctcggcctctgcataaataaaaaaaa2340ttagtcagccatggggcggagaatgggcggaactgggcggagttaggggcgggatgggcg2400gagttaggggcgggactatggttgctgactaattgagatgcatgctttgcatacttctgc2460ctgctggggagcctggggactttccacacctggttgctgactaattgagatgcatgcttt2520gcatacttctgcctgctggggagcctggggactttccacaccggatccaccatgtgggcc2580ttcccggagttgccgctgccgctgctggtgaatttgttcggctcgctgctgggatttgtg2640gctactgtgaccctcatccctgccttccgtagccactttatcgccgcgcgcctctgtggc2700caggacctcaacaagctcagccggcagcagatcccagaatcccagggagtgatctgcggt2760gctgttttccttatcatcctcttctgcttcatccctttccccttcctgaactgctttgtg2820gaggagcagtgtaaggcattcccccaccatgaatttgtggccctgataggtgccctcctt2880gccatctgctgcatgatcttcctgggcttcgctgatgatgtactcaatctgcgctggcgc2940cataagctgctgctgcccacagctgcctctctacctctcctcatggtttacttcactaac3000tttggcaatacaaccattgtggtacccaagcccttccgctggattcttggcctgcatttg3060gacttgggaatcctatactatgtctacatgggactgcttgcggtgttctgtaccaatgcc3120atcaacatcctagcaggaattaatggcctagaggctggtcagtcactagtcatctctgct3180tctatcattgtcttcaacctggtagagctggaaggtgattatcgggatgatcatgtcttt3240tccctctacttcatgataccatttttttttaccaccttgggattgctataccataactgg3300tacccatcacaggtgtttgtgggagataccttctgttattttgctggcatgacctttgcc3360gtggtgggaatcttgggacacttcagcaagaccatgctactcttctttattccacaagtg3420ttcaatttcctctactcgctgcctcagctccttcacgccatcccctgccctcgacaccgc3480atacccagactcaatccgaagacgggcaaactggagatgagctattccaagttcaagacc3540aagaacctctctttcttgggcacctttattttaaaggtagcagagcgcctccagctagtg3600acagttcaccgaggcgagagtgaggatggtgccttcactgaatgtaacaacatgaccctc3660atcaacttgctactcaaaatctttgggcccatacatgagagaaacctcacactgctcctg3720ctgcttttgcagatcctgagcagcgctgtcaccttctccattcgataccagcttgtccga3780ctcttctatgatgtctgaacgcgtcccccctctccctcccccccccctaacgttactggc3840cgaagccgcttggaataaggccggtgtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattg3900ccgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacctggccctgtcttcttgacgagcattcct3960aggggtctttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagca4020gttcctctggaagcttcttgaagacaaacaacgtctgtagcgaccctttgcaggcagcgg4080aaccccccacctggcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacgtgtataagatacacct4140gcaaaggcggcacaaccccagtgccacgttgtgagttggatagttgtggaaagagtcaaa4200tggctctcctcaagcgtattcaacaaggggctgaaggatgcccagaaggtaccccattgt4260atgggatctgatctggggcctcggtgcacatgctttacatgtgtttagtcgaggttaaaa4320aacgtctaggccccccgaaccacggggacgtggttttcctttgaaaaacacgattgctcg4380aatcaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcga4440gctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgc4500cacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctg4560gcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgacca4620catgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcac4680catcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcga4740caccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcct4800ggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctacatcatggccgacaagca4860gaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgca4920gctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccga4980caaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatca5040catggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgta5100caagtaatcggccgctaatcagccataccacatttgtagaggttttacttgctttaaaaa5160acctcccacacctccccctgaacctgaaacataaaatgaatgcaattgttgttgttaact5220tgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaata5280aagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatc5340atgtcggcgcgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtca5400ttagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcct5460ggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagta5520acgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccac5580ttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggt5640aaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcag5700tacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaat5760gggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaat5820gggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgcc5880ccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctc5940cctatcagtgatagagatctccctatcagtgatagagatcgtcgacgtttagtgaaccgt6000cagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccga6060tccagcctccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgac6120gtaagtaccgcctatagagtctataggcccacccccttggcttcttatgcatgctatact6180gtttttggcttggggtctatacacccccgcttcctcatgttataggtgatggtatagctt6240agcctataggtgtgggttattgaccattattgaccactcccctattggtgacgatacttt6300ccattactaatccataacatggctctttgccacaactctctttattggctatatgccaat6360acactgtccttcagagactgacacggactctgtatttttacaggatggggtctcatttat6420tatttacaaattcacatatacaacaccaccgtccccagtgcccgcagtttttattaaaca6480taacgtgggatctccacgcgaatctcgggtacgtgttccggacatgggctcttctccggt6540agcggcggagcttctacatccgagccctgctcccatgcctccagcgactcatggtcgctc6600ggcagctccttgctcctaacagtggaggccagacttaggcacagcacgatgcccaccacc6660accagtgtgccgcacaaggccgtggcggtagggtatgtgtctgaaaatgagctcggggag6720cgggcttgcaccgctgacgcatttggaagacttaaggcagcggcagaagaagatgcaggc6780agctgagttgttgtgttctgataagagtcagaggtaactcccgttgcggtgctgttaacg6840gtggagggcagtgtagtctgagcagtactcgttgctgccgcgcgcgccaccagacataat6900agctgacagactaacagactgttcctttccatgggtcttttctgcagtcaccgtccttga6960cacg6964<210>2<211>1231<212>dna<213>中國倉鼠<400>2caccatgtgggccttcccggagttgccgctgccgctgctggtgaatttgttcggctcgct60gctgggatttgtggctactgtgaccctcatccctgccttccgtagccactttatcgccgc120gcgcctctgtggccaggacctcaacaagctcagccggcagcagatcccagaatcccaggg180agtgatctgcggtgctgttttccttatcatcctcttctgcttcatccctttccccttcct240gaactgctttgtggaggagcagtgtaaggcattcccccaccatgaatttgtggccctgat300aggtgccctccttgccatctgctgcatgatcttcctgggcttcgctgatgatgtactcaa360tctgcgctggcgccataagctgctgctgcccacagctgcctctctacctctcctcatggt420ttacttcactaactttggcaatacaaccattgtggtacccaagcccttccgctggattct480tggcctgcatttggacttgggaatcctatactatgtctacatgggactgcttgcggtgtt540ctgtaccaatgccatcaacatcctagcaggaattaatggcctagaggctggtcagtcact600agtcatctctgcttctatcattgtcttcaacctggtagagctggaaggtgattatcggga660tgatcatgtcttttccctctacttcatgataccatttttttttaccaccttgggattgct720ataccataactggtacccatcacaggtgtttgtgggagataccttctgttattttgctgg780catgacctttgccgtggtgggaatcttgggacacttcagcaagaccatgctactcttctt840tattccacaagtgttcaatttcctctactcgctgcctcagctccttcacgccatcccctg900ccctcgacaccgcatacccagactcaatccgaagacgggcaaactggagatgagctattc960caagttcaagaccaagaacctctctttcttgggcacctttattttaaaggtagcagagcg1020cctccagctagtgacagttcaccgaggcgagagtgaggatggtgccttcactgaatgtaa1080caacatgaccctcatcaacttgctactcaaaatctttgggcccatacatgagagaaacct1140cacactgctcctgctgcttttgcagatcctgagcagcgctgtcaccttctccattcgata1200ccagcttgtccgactcttctatgatgtctga1231<210>3<211>408<212>prt<213>中國倉鼠<400>3mettrpalapheprogluleuproleuproleuleuvalasnleuphe151015glyserleuleuglyphevalalathrvalthrleuileproalaphe202530argserhispheilealaalaargleucysglyglnaspleuasnlys354045leuserargglnglnileprogluserglnglyvalilecysglyala505560valpheleuileileleuphecyspheileprophepropheleuasn65707580cysphevalglugluglncyslysalapheprohishisglupheval859095alaleuileglyalaleuleualailecyscysmetilepheleugly100105110phealaaspaspvalleuasnleuargtrparghislysleuleuleu115120125prothralaalaserleuproleuleumetvaltyrphethrasnphe130135140glyasnthrthrilevalvalprolyspropheargtrpileleugly145150155160leuhisleuaspleuglyileleutyrtyrvaltyrmetglyleuleu165170175alavalphecysthrasnalaileasnileleualaglyileasngly180185190leuglualaglyglnserleuvalileseralaserileilevalphe195200205asnleuvalgluleugluglyasptyrargaspasphisvalpheser210215220leutyrphemetileprophephephethrthrleuglyleuleutyr225230235240hisasntrptyrproserglnvalphevalglyaspthrphecystyr245250255phealaglymetthrphealavalvalglyileleuglyhispheser260265270lysthrmetleuleuphepheileproglnvalpheasnpheleutyr275280285serleuproglnleuleuhisalaileprocysproarghisargile290295300proargleuasnprolysthrglylysleuglumetsertyrserlys305310315320phelysthrlysasnleuserpheleuglythrpheileleulysval325330335alagluargleuglnleuvalthrvalhisargglyglusergluasp340345350glyalaphethrglucysasnasnmetthrleuileasnleuleuleu355360365lysilepheglyproilehisgluargasnleuthrleuleuleuleu370375380leuleuglnileleuserseralavalthrpheserileargtyrgln385390395400leuvalargleuphetyraspval405<210>4<211>408<212>prt<213>智人<400>4mettrpalaphesergluleuprometproleuleuileasnleuile151015valserleuleuglyphevalalathrvalthrleuileproalaphe202530argglyhispheilealaalaargleucysglyglnaspleuasnlys354045thrserargglnglnileprogluserglnglyvalileserglyala505560valpheleuileileleuphecyspheileprophepropheleuasn65707580cysphevallysgluglncyslysalapheprohishisglupheval859095alaleuileglyalaleuleualailecyscysmetilepheleugly100105110phealaaspaspvalleuasnleuargtrparghislysleuleuleu115120125prothralaalaserleuproleuleumetvaltyrphethrasnphe130135140glyasnthrthrilevalvalprolyspropheargproileleugly145150155160leuhisleuaspleuglyileleutyrtyrvaltyrmetglyleuleu165170175alavalphecysthrasnalaileasnileleualaglyileasngly180185190leuglualaglyglnserleuvalileseralaserileilevalphe195200205asnleuvalgluleugluglyaspcysargaspasphisvalpheser210215220leutyrphemetileprophephephethrthrleuglyleuleutyr225230235240hisasntrptyrproserargvalphevalglyaspthrphecystyr245250255phealaglymetthrphealavalvalglyileleuglyhispheser260265270lysthrmetleuleuphephemetproglnvalpheasnpheleutyr275280285serleuproglnleuleuhisileileprocysproarghisargile290295300proargleuasnilelysthrglylysleuglumetsertyrserlys305310315320phelysthrlysserleuserpheleuglythrpheileleulysval325330335alagluserleuglnleuvalthrvalhisglnsergluthrgluasp340345350glygluphethrglucysasnasnmetthrleuileasnleuleuleu355360365lysvalleuglyproilehisgluargasnleuthrleuleuleuleu370375380leuleuglnileleuglyseralailethrpheserileargtyrgln385390395400leuvalargleuphetyraspval405<210>5<211>408<212>prt<213>獼猴<400>5mettrpalaphesergluleuprometproleuleuvalasnleuile151015valserleuleuglyphevalalathrvalthrleuileproalaphe202530argglyhispheilealaalaargleucysglyglnaspleuasnlys354045thrserargglnglnileprogluserglnglyvalileserglyala505560valpheleuileileleuphecyspheileprophepropheleuasn65707580cysphevallysgluglncyslysalapheprohishisglupheval859095alaleuileglyalaleuleualailecyscysmetilepheleugly100105110phealaaspaspvalleuasnleuargtrparghislysleuleuleu115120125prothralaalaserleuproleuleumetvaltyrphethrasnphe130135140glyasnthrthrilevalvalprolyspropheargproileleugly145150155160leuhisleuaspleuglyileleutyrtyrvaltyrmetglyleuleu165170175alavalphecysthrasnalaileasnileleualaglyileasngly180185190leuglualaglyglnserleuvalileseralaserileilevalphe195200205asnleuvalgluleugluglyaspcysargaspasphisvalpheser210215220leutyrphemetileprophephephethrthrleuglyleuleutyr225230235240hisasntrptyrproserargvalphevalglyaspthrphecystyr245250255phealaglymetthrphealavalvalglyileleuglyhispheser260265270lysthrmetleuleuphephemetproglnvalpheasnpheleutyr275280285serleuproglnleuleuhisileileprocysproarghisargile290295300proargleuasnilelysthrglylysleuglumetsertyrserlys305310315320phelysthrlysserleuserpheleuglythrpheileleulysval325330335alagluserleuargleuvalthrilehisglnseraspthrgluasp340345350glygluphethrglucysasnasnmetthrleuileasnleuleuleu355360365lysilepheglyproilehisgluargasnleuthrleuleuleuleu370375380leuleuglnileleuglyseralaphethrpheserileargtyrgln385390395400leuvalargleuphetyraspval405<210>6<211>408<212>prt<213>黑猩猩<400>6mettrpalaphesergluleuprometproleuleuileasnleuile151015valserleuleuglyphevalalathrvalthrleuileproalaphe202530argglyhispheilealaalaargleucysglyglnaspleuasnlys354045thrserargglnglnileprogluserglnglyvalileserglyala505560valpheleuileileleuphecyspheileprophepropheleuasn65707580cysphevallysgluglncyslysalapheprohishisglupheval859095alaleuileglyalaleuleualailecyscysmetilepheleugly100105110phealaaspaspvalleuasnleuargtrparghislysleuleuleu115120125prothralaalaserleuproleuleumetvaltyrphethrasnphe130135140glyasnthrthrilevalvalprolyspropheargproileleugly145150155160leuhisleuaspleuglyileleutyrtyrvaltyrmetglyleuleu165170175alavalphecysthrasnalaileasnileleualaglyileasngly180185190leuglualaglyglnserleuvalileseralaserileilevalphe195200205asnleuvalgluleugluglyaspcysargaspasphisvalpheser210215220leutyrphemetileprophephephethrthrleuglyleuleutyr225230235240hisasntrptyrproserargvalphevalglyaspthrphecystyr245250255phealaglymetthrphealavalvalglyileleuglyhispheser260265270lysthrmetleuleuphephemetproglnvalpheasnpheleutyr275280285serleuproglnleuleuhisileileprocysproarghisargile290295300proargleuasnilelysthrglylysleuglumetsertyrserlys305310315320phelysthrlysserleuserpheleuglythrpheileleulysval325330335alagluserleuglnleuvalthrvalhisglnsergluthrgluasp340345350glygluphethrglucysasnasnmetthrleuileasnleuleuleu355360365lysileleuglyproilehisgluargasnleuthrleuleuleuleu370375380leuleuglnileleuglyseralailethrpheserileargtyrgln385390395400leuvalargleuphetyraspval405<210>7<211>408<212>prt<213>家犬<400>7mettrpalapheprogluleuprometproleuleuvalasnleuval151015glyserleuleuglyphevalalathrvalthrleuileproalaphe202530argglyhispheilealaalahisleucysglyglnaspleuasnlys354045thrglyargglnglnileprogluserglnglyvalileserglyala505560valpheleuileileleuphecyspheileprophepropheleuasn65707580cysphemetglugluglncyslysalapheprohishisglupheval859095alaleuileglyalaleuleualailecyscysmetilepheleugly100105110phealaaspaspvalleuasnleuargtrparghislysleuleuleu115120125prothralaalaserleuproleuleumetvaltyrphethrasnphe130135140glyasnthrthrilevalvalprolyspropheargproileleugly145150155160leuhisleuaspleuglyileleutyrtyrvaltyrmetglyleuleu165170175alavalphecysthrasnalaileasnileleualaglyileasngly180185190leuglualaglyglnserleuvalileseralaserileilevalphe195200205asnleuvalgluleugluglyasptyrargaspasphisvalpheser210215220leutyrphemetileprophephephethrthrleuglyleuleutyr225230235240hisasntrptyrproserglnvalphevalglyaspthrphecystyr245250255phealaglymetthrphealavalvalglyileleuglyhispheser260265270lysthrmetleuleuphephemetproglnvalpheasnpheleutyr275280285serleuproglnleuleuhisileileprocysproarghisargile290295300proargleuasnthrlysthrglylysleuglumetsertyrserlys305310315320phelysthrlysserleuserpheleuglyasnpheileleulysval325330335alaalaserleuglnleuvalthrvalhisglnsergluasngluasp340345350glyalaphethrglucysasnasnmetthrleuleuasnleuleuleu355360365lysvalleuglypromethisgluargasnleuthrleuleuleuleu370375380leuleuglnileleuglyseralavalthrpheserileargtyrgln385390395400leuvalargleuphetyraspval405<210>8<211>408<212>prt<213>豚鼠<400>8mettrpalaphesergluvalproileproleuleuvalasnleuile151015glyserleuleuglyphevalalathrleuthrleuileproalaphe202530argglyhispheilealaalaargleucysglyglnaspleuasnlys354045thrasnargglnglnileprogluserglnglyvalileserglyala505560valpheleuileileleuphecyspheileprophepropheleuasn65707580cysphevallysgluglncyslysalapheprohishisglupheval859095alaleuileglyalaleuleualailecyscysmetilepheleugly100105110phealaaspaspvalleuasnleuargtrparghislysleuleuleu115120125prothralaalaserleuproleuleumetvaltyrphethrasnphe130135140glyasnthrthrilevalvalprolyspropheargprovalleugly145150155160leuhisleuaspleuglyileleutyrtyrvaltyrmetglyleuleu165170175alavalphecysthrasnalaileasnileleualaglyileasngly180185190leuglualaglyglnserleuvalileseralaserileilevalphe195200205asnleuvalgluleuglnglyasptyrargaspasphisvalpheser210215220leutyrphemetileprophephephethrthrleuglyleuleutyr225230235240hisasntrptyrproserglnvalphevalglyaspthrphecystyr245250255phealaglymetthrphealavalvalglyileleuglyhispheser260265270lysthrmetleuleuphephemetproglnvalpheasnpheleutyr275280285serleuproglnleuleuhisileileprocysproarghisargile290295300proargleuasnthrlysthrglylysleuglumetsertyrserlys305310315320phelysthrasnserleuserpheleuglythrpheileleulysval325330335alagluargleuglnleuvalthrvalhisargsergluglygluasp340345350glyalaphethrglucysasnasnmetthrleuileasnleuleuleu355360365lysilepheglyproilehisgluargasnleuthrleuleuleuleu370375380leuleuglnilevalglyseralavalthrpheserileargtyrgln385390395400leuvalargleuphetyraspval405<210>9<211>410<212>prt<213>褐家鼠<400>9mettrpalapheprogluleuproleuproleuproleuleuvalasn151015leuileglyserleuleuglyphevalalathrvalthrleuilepro202530alapheargserhispheilealaalaargleucysglyglnaspleu354045asnlysleuserargglnglnileprogluserglnglyvalileser505560glyalavalpheleuileileleuphecyspheilepropheprophe65707580leuasncysphevalglugluglncyslysalapheprohishisglu859095phevalalaleuileglyalaleuleualailecyscysmetilephe100105110leuglyphealaaspaspvalleuasnleuargtrparghislysleu115120125leuleuprothralaalaserleuproleuleumetvaltyrphethr130135140asnpheglyasnthrthrilevalvalprolyspropheargtrpile145150155160leuglyleuhisleuaspleuglyileleutyrtyrvaltyrmetgly165170175leuleualavalphecysthrasnalaileasnileleualaglyile180185190asnglyleuglualaglyglnserleuvalileseralaserileile195200205valpheasnleuvalgluleugluglyasptyrargaspasphisval210215220pheserleutyrphemetmetprophephephethrthrleuglyleu225230235240leutyrhisasntrptyrproserglnvalphevalglyaspthrphe245250255cystyrphealaglymetthrphealavalvalglyileleuglyhis260265270pheserlysthrmetleuleuphephemetproglnvalpheasnphe275280285leutyrserleuproglnleupheglnileileprocysproarghis290295300argmetproargleuasnthrlysthrglylysleuglumetsertyr305310315320serlysphelysthrlysserleuserpheleuglythrpheileleu325330335lysvalalagluserleuargleuvalthrvalhisargglygluser340345350gluaspglyalaphethrglucysasnasnmetthrleuileasnleu355360365leuleulysvalpheglyprothrhisgluargasnleuthrleuphe370375380leuleuleuleuglnvalleuserseralavalthrpheserilearg385390395400tyrglnleuvalargleuphetyraspval405410<210>10<211>410<212>prt<213>小家鼠<400>10mettrpalapheprogluleuproleuproleuproleuleuvalasn151015leuileglyserleuleuglyphevalalathrvalthrleuilepro202530alapheargserhispheilealaalaargleucysglyglnaspleu354045asnlysleuserglnglnglnileprogluserglnglyvalileser505560glyalavalpheleuileileleuphecyspheilepropheprophe65707580leuasncysphevalglugluglncyslysalapheprohishisglu859095phevalalaleuileglyalaleuleualailecyscysmetilephe100105110leuglyphealaaspaspvalleuasnleuargtrparghislysleu115120125leuleuprothralaalaserleuproleuleumetvaltyrphethr130135140asnpheglyasnthrthrilevalvalprolyspropheargtrpile145150155160leuglyleuhisleuaspleuglyileleutyrtyrvaltyrmetgly165170175leuleualavalphecysthrasnalaileasnileleualaglyile180185190asnglyleuglualaglyglnserleuvalileseralaserileile195200205valpheasnleuvalgluleugluglyasptyrargaspasphisile210215220pheserleutyrphemetileprophephephethrthrleuglyleu225230235240leutyrhisasntrptyrproserargvalphevalglyaspthrphe245250255cystyrphealaglymetthrphealavalvalglyileleuglyhis260265270pheserlysthrmetleuleuphephemetproglnvalpheasnphe275280285leutyrserleuproglnleuphehisileileprocysproarghis290295300argmetproargleuasnalalysthrglylysleuglumetsertyr305310315320serlysphelysthrlysasnleuserpheleuglythrpheileleu325330335lysvalalagluasnleuargleuvalthrvalhisglnglygluser340345350gluaspglyalaphethrglucysasnasnmetthrleuileasnleu355360365leuleulysvalpheglyproilehisgluargasnleuthrleuleu370375380leuleuleuleuglnvalleuserseralaalathrpheserilearg385390395400tyrglnleuvalargleuphetyraspval405410<210>11<211>1920<212>dna<213>小家鼠<400>11gttgcttcctaagagcttcttgctggtcaggagggagggtcaggtcctagcgtcctagct60gggttttgttcccgctggcgccggaatcctctgcgggttgggagccgcactgccggctgc120cgaggccacgggattgttcctggcttaccagttagctgagtaggcggcggggcggcggcc180accggagggtcaccatgtgggccttcccggagttgcccctgccgctgccgctgctggtga240atttgatcggctcgctgttgggattcgtggctacagtcaccctcatccctgccttccgta300gccactttatcgccgcgcgcctctgtggccaggacctcaacaagctcagccagcagcaga360tcccagagtcccagggagtgatcagcggtgctgttttccttatcatcctcttctgcttca420tccctttccccttcctgaactgcttcgtggaggagcagtgtaaggcattcccccaccatg480aatttgtggccctaataggtgccctccttgccatctgctgcatgatcttcctggggtttg540ctgatgatgtcctcaatctccgctggcgccacaagctgctgctgcccacagctgcctcac600tacctctcctcatggtctacttcacaaactttggcaatacaaccatcgtggtgcccaagc660ccttccgctggattctgggcctgcatttggacttggggatcctgtactacgtctacatgg720ggctgcttgcagtgttctgtaccaatgccatcaacatcctggcgggcattaatggcctag780aggccggtcagtcactagtcatctctgcttctatcattgtcttcaacctggtggaactgg840aaggtgattatcgagatgatcatatcttttccctttacttcatgataccatttttcttta900ccaccttgggactgctttaccacaactggtacccgtcccgcgtgtttgtgggagacacct960tctgttactttgcgggcatgacttttgccgtggtggggatcttgggacacttcagcaaga1020ccatgctgctcttctttatgccacaagtattcaatttcctctactcactgcctcagctct1080tccatatcatcccctgccctcgacaccggatgcccagactcaacgcaaagacaggcaaac1140tggaaatgagctattccaagttcaagaccaagaacctctctttcctgggcacctttattt1200taaaggtagcagagaacctccggttagtgacagttcaccaaggtgagagtgaggacggtg1260ccttcactgagtgtaacaacatgaccctcatcaacttgctacttaaagtctttgggccta1320tacatgagagaaacctcaccctgctcctgctgctcctgcaggtcctaagcagcgccgcca1380ccttctccattcgttaccaactcgtccgactcttctatgatgtctgagctccctgacagc1440tgccctttacctcacagtctccattggacctcagccaggaccagcctctgtctggtccga1500gatgaccctctggtccaggcctcgctgacacttttgttctcagcttctgccatctgtgac1560tactgatatcctggatggacaccttgctggacttgaagtccgctagttggactttgccta1620gggctttcatcttgccttgccctccctttctgtcccatctgcagcctcaccaggtgggct1680tgtagcctctattatgcaaatattcgtagctcagctttcagagcgctaactctaaaggaa1740ttcacctgagccttgagagagaacctgggctagggctagagttagggctacatactccaa1800ggtgacctcacatttgactatcaaatgaagtgttgtgattgggaagcgtagaggcagggc1860catgtgctcagaacggtgacaataaaggactgccttttacttgttaaaaaaaaaaaaaaa1920<210>12<211>2150<212>dna<213>智人<400>12aagtatccgttcttggctgcctttctttaattgcgtttccagtactctctcggtgattct60actcttgaacataggatgaaatttggaatcacacttctcttccacttccatccccaccct120ctaatgcccatattaaaaatggcggccgccgccttccgcagtaatggttgttcagcgaac180aagatccgggcggaaacagtagataggcgggtgcagcggggcagaacataggttgcctta240gagaggttccccggtgtcccgacggcggctcaagtcagagttgctgggttttgctcagat300tggtgtgggaagagcctgcctgtggggagcggccactccatactgctgaggcctcaggac360tgctgctcagcttgcccgttacctgaagaggcggcggagccgggcccctgaccggtcacc420atgtgggccttctcggaattgcccatgccgctgctgatcaatttgatcgtctcgctgctg480ggatttgtggccacagtcaccctcatcccggccttccggggccacttcattgctgcgcgc540ctctgtggtcaggacctcaacaaaaccagccgacagcagatcccagaatcccagggagtg600atcagcggtgctgttttccttatcatcctcttctgcttcatccctttccccttcctgaac660tgctttgtgaaggagcagtgtaaggcattcccccaccatgaatttgtggccctgataggt720gccctccttgccatctgctgcatgatcttcctgggctttgcggatgatgtactgaatctg780cgctggcgccataagctgctgctacctacagctgcctcactacctctcctcatggtctat840ttcaccaactttggcaacacgaccattgtggtgcccaagcccttccgcccgatacttggc900ctgcatctggacttgggaatcctgtactatgtctacatggggctgctggcagtgttctgt960accaatgccatcaatatcctagcaggaattaacggcctagaggctggccagtcactagtc1020atttctgcttccatcattgtcttcaacctggtagagttggaaggtgattgtcgggatgat1080catgtcttttccctctacttcatgatacccttttttttcaccactttgggattgctctac1140cacaactggtacccatcacgggtgtttgtgggagataccttctgttactttgctggcatg1200acctttgccgtggtgggcatcttgggacacttcagcaagaccatgctactattcttcatg1260ccccaggtgttcaacttcctctactcactgcctcagctcctgcatatcatcccctgccct1320cgccaccgcatacccagactcaatatcaagacaggcaaactggagatgagctattccaag1380ttcaagaccaagagcctctctttcttgggcacctttattttaaaggtggcagagagcctc1440cagctggtgacagtacaccagagtgagactgaagatggtgaattcactgaatgtaacaac1500atgaccctcatcaacttgctacttaaagtccttgggcccatacatgagagaaacctcaca1560ttgctcctgctgctgctgcagatcctgggcagtgccatcaccttctccattcgatatcag1620ctcgttcgactcttctatgatgtctgagtcccttgatcattgtcctttacctcacagtct1680ctaggattcctgactcaggctgacctctctctctggtcccagactgcctccttgcccagg1740cctctctcactcttcatactcctccagattttgttctcagcattttcctttctctgtgat1800cattggcatcctgggcgtttcttgccctctgctgactactgattggattttacctatggc1860tttctgcaacttgctactctctccctctccatcccatctttgcagcctcatagggtggga1920tacagcagctttttttgcagttatccacactcacatttcagagtcctgactctcaaggaa1980ccactggtttttgggatagaacttgggccagggctaggaacacaggctccacggtgacat2040gtcatttgattgtaaattaagtgttctgattagtaagaactaagcagggggccacatgct2100ctcaatggagacaataaagtgttgtctttttcttattgtttaaaaaaaaa2150<210>13<211>1840<212>dna<213>褐家鼠<400>13gggggctggcgccggaatcctctgagtgtagggagctgcactgctggctgccgaggcctc60tggtttgttcctggcttaccaagttagctgagtaggcggcggagcggcggcccccggagg120gtcactatgtgggccttcccggagttacctctgccgctgccgctgttggtgaatttgatc180ggatcgctgttgggatttgtggctaccgtcaccctcatccctgccttccgtagccacttt240atcgccgcgcgtctctgtggccaggacctcaacaagctcagccggcagcagatcccagag300tcccagggagtgatcagcggtgctgttttccttatcatcctcttctgcttcatccctttc360cctttcctgaactgctttgtggaggagcagtgtaaggcattcccccaccatgaatttgtg420gccctgataggtgccctccttgctatctgctgcatgatcttcctgggttttgctgatgac480gtactcaatctgcgatggcgtcataagctgctgctccccacagctgcctcactacctctc540ctcatggtctacttcactaactttggcaatacaaccattgtggtgccgaagcccttccgc600tggattcttggcctgcatttggatttgggcatcctgtactatgtctacatgggactgctt660gcagtgttctgtaccaatgccatcaacatcctagcgggaattaatggcctagaggctggt720caatcactagtcatctctgcttctattattgtcttcaacctggtggagctggaaggtgat780tatcgggacgatcatgtcttttccctctacttcatgatgccatttttttttaccaccttg840ggattgctgtaccataactggtacccgtctcaggtgtttgtgggagacaccttctgttat900tttgctggcatgacctttgccgtggtgggaatcttgggacacttcagcaagaccatgctg960ctcttctttatgccacaagtattcaatttcctctactcactgcctcagctctttcagatc1020atcccctgccctcgacaccgtatgcccagactcaatacgaagacaggcaaactggagatg1080agctattccaagttcaagaccaagagcctctctttcttgggcacgtttattttaaaggta1140gcagagagcctccggctggtgacagttcaccgaggggagagtgaggatggtgccttcact1200gagtgtaacaacatgaccctcatcaacttgctacttaaagtctttgggcctacacatgag1260agaaacctcacactgttcctgctgctcctgcaggttctgagcagcgctgtcaccttctcc1320attcgttaccagctcgtccgactcttctatgatgtctgagctccctgacgactgcccttt1380accacacagtctccattggacctcagccaggacccacctctgtccgctccgaccgccttc1440tggtccaggctcagcttctgccgtcatctgtgactactgacatcctggatggactcctta1500gtggacttgacgtccactagttggacttgcctatgctttcttgagtttgctactccctcc1560ctttctgcagcctcaccaggtgggcctgtagcatcttttatgcaaatattcatggctcaa1620ctttcagaaccctaactctaaaggaatcccctgggccttgagagagaacctgggctaggg1680ctagagttagggcaacatactccaaggtaacctcacatctgactatcaaattaagtgttc1740tgattaggaagagcagaggcagggccatgtgctcagaatggtgacaataaaggattgcct1800tttacttgccaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa1840<210>14<211>5424<212>dna<213>獼猴<400>14tattaaaaatggcggctgccgccctccgcagtaatagttgttcagcgaataaaatccggg60cggaaacagtaggtaggctggttcagtgggggcagaacctaggttgccttagagaggttc120ttcgaggtcccgagggcggctcaagtcagagttgttggattctgctcagattggtgtggg180aagagcctgcctgtggggagcggccactccatactgctgaggcctcaggactgctgctca240gcttgccagttacctgaagaggcggcggagccgggcccctgaccggtcaccatgtgggcc300ttctcggaattgcccatgccgctgctggtcaatttgatcgtctcgctgctgggatttgtg360gccacagtcaccctcatcccagccttccggggccacttcattgctgcgcgcctctgtggt420caggacctcaacaaaaccagccgacaacagatgtgagcagcggcacacggttccgggcag480ggggcaagggctaaggaaggagtggctagggcaggggcggggaccggggtgtttgaccac540acgtgaaaactcagaactaacccaggcagcctggaactcggagaggtgatgagcagaact600tattcgcattggggaaaggatgggtagggaaccttgggtatatcagggactctagcagtg660gtgctttcctccctccgcccccctcaccacttcccaaaataaaaaaccaggaatgagaag720accgctttgggttattgtaacacctgcactagtgagtgaccacaccccctttcctctttc780ccctcgcccccttgctgctgggccacagcccagaatcccagggagtgatcagcggtgctg840ttttccttatcatcctcttctgcttcatccctttccccttcctgaactgctttgtgaagg900agcagtgtaaggcattcccccaccatgaagtaagtgggttcgtgggggttgttgcctgtg960gctgggacctgggaggtacctgagagaattggtgttatttgggcttgtggggaggggcta1020agaaatgataagaaaagacaagaattcttaaaaggtgaaatgggagcaggcttgagtcat1080ggacctgccctagcctcccccagtttgtggccctgataggtgccctccttgccatctgct1140gcatgatcttcctgggctttgcggatgatgtactgaatctgcgctggcgccataagctgc1200tgctacccacagctgcctcactacctctcctcatggtctatttcaccaactttggcaaca1260cgaccattgtggtgccgaagcccttccgcccgattcttggcctgcatctggacttgggta1320ggtagtcctgccactgctactcctatggcacctacttcagggcacccttcctggtgcttc1380acattctccttcaagtgttccttttctgtctctgtgtcttcccagatcctttctggtagc1440ccttcatcctatcctctgtcctcaccacttttctaaatcctcctcccctaggtggcacta1500cttttcctaccatctctcccttcaggaatcctgtactatgtctacatggggctgctggca1560gtgttctgtaccaatgccatcaatatcctagcaggaattaatggcctagaggctggccag1620tcactagtaatttctgcttccatcattgtcttcaacctggtagagttggaaggtaggtgg1680gattgggggtggggagagagaagtctgaatgttaaaggtgtggcctgatatatgactttg1740ggaaattcagggaaaaaaagcaatatgcgtagtaattatagaagataagggaggctactt1800actttgcaaataatgcagatttattgaaagtgagaaagaaaaatagcagccgtgtcattt1860atagctggattggcactaacagctaggccatgatcttctcccattgaatataaacaattt1920cacagaacctcaacgttacacagggtcattctgtgaccatgatggaggaagaccaaaact1980cgacccctccctctataatcctgtttgagcacagataaaaccacaaaaacactgagcaac2040ccacaaaatggccaagatcctctctctctgttaacgtgagccatgagcgactgctgcggc2100tttccaataacaactcagttcctaccaccttttattttgttttttgagacagggtctccc2160tctgtcacccaggctggagagcagtggcacgatcttagctcactgcatcctctgactcaa2220acgatcctcctgccccagactcccaggtagctggggctacaggcatgcgccaccacacct2280ggcaaatttttgtattttttgtagagacagggtttcaccacgttgcctaggctggtcttg2340aactcctgggccgaagtgatttgtcagccttggcctcccaaagtgctgggattacactct2400tgagccactgtggccagccagttcctaccacttcttagataaacattaaaatgcttgatc2460agagaattattgttgttttcttttctttttcttttttttttttttttgagacggagtttc2520actcttgcccaggctggagtgcaatggtgcgatctcggctcactgcaacctccacctccc2580aggttcaggcgattctcctgcctcagcctccctagtagctgggattacaggcatgtgcca2640tcacgcccagctagttttgtatttttagtagagatgggatttctccatgttggtcaagct2700ggtctcaaactccagacctcaggtgatccgcccacctcggcctcccaaagtgctgggatt2760acaggtgtgagccaccgcacccggccatgaattacacctgctttctaacagcacccaatc2820cagagcaaaactcttactttcttttaccctctcccaaaatacccaaaactgcaagcccct2880cctaacactctcttactgagacattccgtggttcccaatggtgtgtggtttctgaagtct2940ccctttttacaacaagtcattaaacctagcttcgaactatagatgtgtttctagtggtct3000ttggctgatggacatcaacaaatgtttattaaagctaagtactttttaaacatgatcgta3060tttaaatcttgtaatggttttatgtggcacatgttataatcagccctgttttacagatga3120gtaaacagatttagagaagttaaatgtgtcatgatcaagatcaaggtcacaaagctaaga3180agtaaagttggtgtccaaactgacatcagaatgggctaaaccaaatttaagacagtaact3240agtttggaaggctgcatgaaagaggtggaatattgggaattgccttgggtgacataaaag3300gggtattgagttcttgaaagtgacttgggtgaggtggatgatacagctgtaaacagaact3360tagacaaaaataggaccatggtatgcagaagaagtgggtattaattttcccttctttctt3420ccttgcttccaaaggtgattgtcgggatgatcatgtcttttccctctacttcatgatacc3480cttttttttcaccactttgggattgctgtaccacaactggtaagtaggcctatggataag3540gggaaaaggggaaaactacccgaacacatggcaaagatggcccttatcataacccacctt3600gtggtggagaggttaaacctgtgcatacctccatggaattttctgtgtcttcagttggtc3660gtattctgaaatttctccctacccaacagtatttggggatgagtgcgtggaggtcccagg3720aatagatgaattcagggccttggatcctgcagagttgctgcacaactggagtctcctcta3780agtcagaactagggtcagggctagtacagtgcccatagggtgtgatgtgagagaaaggat3840tggtaatgcctcttgccactggctcggatcctctcccccacacaggtacccatcacgggt3900gtttgtgggagacaccttctgttactttgctggcatgacctttgccgtggtgggcatctt3960gggacacttcagcaagaccatgctactattcttcatgccccaggtgttcaacttcctcta4020ctcactgcctcagctcctgcatatcatcccctgccctcgccaccgcatacccaggtagcc4080gctttggggcttgaaatggacatcatagccttttcacttgggatatctaatgccagcctt4140tacattgctgtgcaaagggagtgggcccaaagaagggctatttccatgtgagtaaccctt4200tataacttccaaagcacatttatttgcatcatctgatactcacagtggttctgataacag4260caagcagcagagccagaaatagatctcaggttgactccacattcaatgctcttcctattg4320attagccacagggaggagggttcaaatagtggcccagtcacatgaagctgtcttcccccc4380gcagactcaatatcaagacaggcaaactggagatgagctattccaagttcaagaccaaga4440gcctctctttcttgggcacctttattttaaaggtaacagggtaacaaggaggtaaggccc4500taggctgccatcctgaccttgaggaatggggaacctaggcctacatcagatccaagggga4560acttggaagcattaaatagatccacattcctaaagcataggtattagctgaggttctctt4620cacctctggtccctccaggtggcagagagcctccggctggtgacaatacaccaaagtgat4680actgaggatggtgaattcactgaatgtaacaacatgaccctcatcaacttgctacttaaa4740atctttgggcccatacatgagagaaacctcacattgctcctgctgctgctgcaggtgagg4800atggggattgggtttatacctccttgtctccctttctccgtgattcttattccagtccat4860ttctccttgcagatcctgggcagtgccttcaccttctccattcgatatcagctcgttcga4920ctcttctatgatgtctgagtcccttgatcattgtcctttacctcacagtctctaggattc4980ctgactcaggctgacctctctctggtcccagactgcctccttgcccaggcctctctcact5040cttcatactcttccagattttgttctcagcattttcttttccctgtgatcactggcatcc5100tgggcgtttcttgccccctactgtctactgattggattttacttatgactttctgcaact5160tgctactctccctctccatcctgtctttgcagcctcacagggtgggatacagaagttttt5220tttttgcagttatccacagtcacatttcagagtcctgactctcaaggaactactggtttt5280tgggatagaacttgggccagggctagggacacaggctccacagtgacctgttatttgatt5340gtaaattaagtgttctgattagtaagaagtaagcagggggccacatgctctcaatggaga5400caataaagtgttgtctatttctta5424<210>15<211>5894<212>dna<213>黑猩猩<220><221>misc_feature<222>(3408)..(3408)<223>n為a、c、g或t<400>15aaaccgtagctgcgtttccgggaactgagttgtgtttaccttggcttccgactatgttgg60caacaggtttcctgcaagaaactggcgcgtctccacaccctcgtccctcctccccacccc120ctgcctttcaatagccatcttcctggagccggaggcatcccagattaagggagaggtacg180ggccctttaagcttgacctatggaggcggacggagctaaaactgacgtggaaccggaatg240tgagcggtgtcagacacgtggtacaaggaggcattcatcttggaaccgggcaattggcat300ttccgctctgggtagtacatctttaacataatgttagggaagtatccgttcttggctgcc360tttctttaattgcgtttccagtactctctcggtgattctactcttgaacataggatgaaa420tttggaatcacacttctcttgcacttccatccccaccctctaatgcccatattaaaaatg480gcggccgccgccttccgcagtaatggttgttcagcgaacaagatccgggcggaaacagta540gataggcgggtgcagcggggcagaacataggttgccttagagaggttctccggtgtctcg600agggcggctcaagttagagttgttgggttttgctcagattggtgtgggaagagcctgcct660gtggggagcggccactccatactgctgaggcctcaggactgctgctcagcttgcccgtta720cctgaagaggcggcggagccgggcccctgaccggtcaccatgtgggccttctcggaattg780cccatgccgctgctgatcaatttgatcgtctcgctgctgggatttgtggccacagtcacc840ctcatcccggccttccggggccacttcattgctgcgcgcctctgtggtcaggacctcaac900aaaaccagccgacagcagatgtgagcagcggcacacgggtctgggcagggggcaagggct960aaggaaggagtggctagggcaggggcggggaccggggtgcttgaccacacgtgaagactc1020agaactaacccaggcagcctggaactcggagaggtgatgagcagaacttactcgcattgg1080ggaaaggatgggtagggacccttgggtatatctgggactctggcagtggtgctttcctcc1140ctccgcccccctcaccacttaccagaataaaaaaccgggaatgagaagaccactttgggt1200tattgtaacacctgcactagtgagtgaccacgccccctttgctcttccccctcgccccct1260tgctgctgggccacagcccagaatcccagggagtgatcagcggtgctgttttccttatca1320tcctcttctgcttcatccctttccccttcctgaactgctttgtgaaggagcagtgtaagg1380cattcccccaccatgaagtaagtgggttcgtgggggtgattgcctgtggctgggacctgg1440gaggtacctgagagaattggggttatttgggcttgtggggaggggctaagaaattatcag1500aaaagacaggaattcttaaaaggtggaatgggagcaggcttgagtcatggacctgcccga1560gccccccccagtttgtggccctgataggtgccctccttgccatctgctgcatgatcttcc1620tgggctttgcggatgatgtactgaatctgcgctggcgccataaactgctgctacctacag1680ctgcctcactacctctcctcatggtctatttcaccaactttggcaacacgaccattgtgg1740tgcccaagcccttccgcccgatacttggcctgcatctggacttgggtaggtagtcctacc1800actgctgcccctatggcacctacttcagggaacccttcctggtgctccacattctcctcc1860aagtgttccttttctgtctctgtgtcttcccagatcctttctggtagcccttcatcctat1920cgtccgtcctcaccacttttctaaaaattcttaaatcctcctcccctaggtggcactact1980tcttttcctaccatttctccccgcaggaatcctgtactatgtctacatggggctgctggc2040agtgttctgtaccaatgccatcaatatcctagcaggaattaacggcctagaggctggcca2100gtcactagtcatttctgcttccatcattgtcttcaacctggtagagttggaaggtaggtg2160ggattgggggtggggagagagaagtctgagcattaaaggtgtggcctgatatatgacttt2220gggaaattcagggaaaaaaagcaatatgtgtagtaattatagaagataagggaagctact2280tactttgcaaataacaatgcagatttattaaaagtgagaaagaaaaatagcagccctgtc2340atttatagctggattggcactaatagctaggccatgatcttctcccattgaatataaaca2400gtttcacagaaccccaacgttacacagggtcattctgtgaccatgatggagcaagactaa2460aactagacccctccctctgtaatcatgtttgagcacaggcaaaaccacaagaacactgag2520caacccacaaaatggccaagatcccctctctcggctaacatgagcgactgctgctgctct2580ccaataacaactcagttcctaccacttcttttttttttttttgagacagggtctccctct2640gtcatgcaggctggagagcagtggcgcaatcttagctcactgcatcctctgactcaaacg2700atcctcctgccccagcctcccaagtagctggggctacaggcatgtgccaccacacctggc2760aaatttttgtattttttgtagagacagggtttcaccatgttccctaggctggtcttgaac2820tcctggactcaagtgatctgccaggcctcccaaagtgctgggattcactcttgagccact2880gtgcccagccagttcctaccatttcttaaataaacattaaaatgcttgatcatagaatta2940ctcttgctttcttttcttttcttttcttttttttttgagacggagttttgttcttgccca3000ggccggagtacaatggtgcgatctcggctcaccgcaacctccgcctcccaggttcaagcg3060attctcctgcctcagcctccctagtagctgggattacaggcacgtgccaccacgcccagc3120taattttgtatttctagtagagacggggtttctccatgttggtcaggctggtctcgaact3180cctgacctcaggtgatctgcctgcttcagcctcccaaagtgctgggattacaggcgtgag3240tcaccgcacccggccatgaattactcctgctttctaacagcacccagtccagagcaaaac3300tactttctttcaccctctcccaaaatacccaaaacaaacgctactacaagcccctcctaa3360caccctcttactgagacattccgtggttcccaatggtgtgtggtttcngaagtctccctt3420tttacaacaagtcattaaacctagctttgagctatagatgtgtttctgatggtcttggct3480gatgaacatcaacaagtgtttattaaagctaagtactttttaaacactatcttatttaaa3540tcttgtaatggttttatgtggcagatgttataatcagccctgttttacagatgagaaaac3600aggcttagagaagtcaaatgtgtcatgatcaagatgaaggtcacaaagctaagaagtaaa3660gttggtatccaaacttacatcagaatgggctaaaccaaatttaagatagtaactagtttg3720gaaggctgcacgaaagaggtggaatattgggaattgccttgggtgacataaaaggagtat3780tgagttcttaaaagtgacttgggtgaggtggatgataacagctgtaaacagaacttagac3840aaaaataggaccaaggtttgcagaggaagtgggtattaacttttccttctttcttccttg3900cttccaaaggtgattgtcgggatgatcatgtcttttccctctacttcatgataccctttt3960ttttcaccactttgggattgctctaccacaactggtaagtaggcctgtggataaggggac4020aactacctgaacacatggcaaagatggcccttatcataacccaccttgtggtggtgaagc4080taaacctgcgcatacctctatggagttttctgcgtcttcagttggtagtattctgaaatt4140tctctctacccagtagtagttagggatgagtgcgtggaggccccaggaatagttgaattc4200agggccttggatcctgcagagttgctgcacaactggagtctcctctgagtcagaactagg4260gtcagggctagtccagtgcccatagggtgtgatgtgagagaagggattggtaatgcctct4320tgccactggctcggatcctcttcccccacacaggtacccatcacgggtgtttgtgggaga4380taccttctgttactttgctggcatgacctttgccgtggtgggcatcttgggacacttcag4440caagaccatgctactattcttcatgccccaggtgttcaacttcctctactcactgcctca4500gctcctgcatatcatcccctgccctcgccaccgcatacccaggtagccgctttggggctt4560gaaatggacatcatagccttttcacttgggatatctaatgccagcctatacatttgctgt4620gcaaagggagtgggcccaaagaagggctatttccatgtgagtagccctttataacttaca4680aagcacatttatttgcataatctgctacagtggttctgataacagtaagcagcagagcca4740gaaatagatctcaggttgactccacattcaatgctcttcctattagccacagggaggagg4800gttcaaatagtggcccagtcacatgaagctatcttccccccgcagactcaatatcaagac4860aggcaaactggagatgagctattccaagttcaagaccaagagcctctctttcttgggcac4920ctttattttaaaggtaacagggtaacaaggaggtaaggccctaggctgccatcctgacct4980tgaggaatggggaacctagtcctacatcagatccaaggggaacttgaaagcattaaatag5040atccacattcctaaagcataggtattagctgaggttctcttcacctctggtccctccagg5100tggcagagagcctccagctggtgacagtacaccagagtgagactgaagatggtgaattca5160ctgaatgtaacaacatgaccctcatcaacttgctacttaaaatccttgggcccatacatg5220agagaaacctcacattgctcctgctgctgctgcaggtgaggatgggaatcgagtttatac5280ctccgtgtctccctttctgcgtgattcttactccagtccatttctccttgcagatcctgg5340gcagtgccatcaccttctccattcgatatcagctcgttcgactcttctatgatgtctgag5400tcccttgatcattgtcctttacctcacagtctctaggattcctgactcaggctgacctct5460ctctctggtcccagactgcctccttgcccaggcctctctcactcttcatactcctccaga5520ttttgttctcagcattttcctttctctgtgatcattggcatcctgggcgtttcttgccct5580ctactgactactgattggattttacctatggctttctgcgacttgctactctctccctct5640ccatcccatctttgcagcctcatagggtgggatacagcagctttttttgcagttatccac5700actcacatttcagagtcctgactctcaaggaaccactggtttttgggatagaacttgggc5760cagggctaggaacacaggctccacggtgacatgtcatttgattgtaaattaagtgttctg5820attagtaagaactaagcagggggccacatgctctcaatggagacaataaagtgttgtctt5880tttcttattgttta5894<210>16<211>4557<212>dna<213>家犬<400>16gtgaggaggcaagtgcggcgggggacagccgagggtgcgcgctggaggctcgcgggagtc60ctgggggcgcctcaattcagagttgggttttgctcaggccgctgtgggaggatccagcct120gtgccgagcggctgctcctccccgcggggggctccgggctaccgcccagctcgcccatta180gccgaggcggcggcagagcggggcccctggctggtcatcatgtgggccttcccggagttg240ccgatgccgctgctggtgaatttggtcggctcgctgctgggatttgtggccacggtcacc300ctcatccccgccttccgtggccacttcatcgccgcgcacctctgtggccaggacctcaac360aaaaccggccggcagcagatgtgagcggtggcacccgggtccggggagggggccggcagg420gcaagggcgggacctggggtgcctgaccccgcggacacgcagcgctaaccccgcagacag480ctgcgggctctgggagacgaagggcagcgctggccaactctgggaagggatgttgcagta540caggggaccctcgggtgtatcagggactccagcgctggtgcccttccaccccccttcccc600gtagatcgctgtaatgcttgctctagtgagtgaccacgccccctctcctctcccccgccc660cctccctttgctgctgggccacagcccagagtcccagggagtgatcagcggtgctgtttt720ccttatcatcctcttctgcttcatccctttccccttcctgaactgttttatggaggagca780gtgtaaagccttcccccatcacgaagtaagtgggtgagttgggggcggttgcttggggct840ggggcctgggagctacctgggagagttgtggttattagggtttgggtggaggggctgagg900aaggagcgaagagacgggtgtttttgcaagatgatgtgggcataggcttgagcggtgacc960tgcccgagcctcccccagttcgtggccctgataggtgcgctccttgccatctgctgcatg1020attttcctgggctttgcggacgatgtactgaatctgcgctggcgccacaagctgctgctg1080cctacagctgcctcgctacctcttcttatggtctatttcaccaactttggcaacacgacc1140attgtggtgcccaagcctttccggccgattcttggcctgcatctggacttgggtgagtag1200ccctgtgactgacgtccctgtggcccttactttggggcacccttaccctgggagataatc1260tagcagagcatcattcctggtgctccagatcctcttccaagtgtccccatcttgttcctg1320tgtcttctcagatccgttctgttggtccttcgtccaatcctctgtcctcaccacttttct1380cagaagaatattcttaagtcctcatttctatggatggcacacttcttactctcttcttcc1440cccagggatcctgtattatgtttacatggggctgctggcagtgttctgtaccaatgccat1500caatatcctagcaggaattaatggcctagaggcaggccagtcgctagttatttctgcttc1560catcatcgtcttcaatctggtggagctggaaggtaggtgagagtgggagtctgagtatta1620aggaaactgcctgatacctggctttggggaattcaggaaaaaataaaagcaatatattaa1680gattaaatgtaaagaaaaacagctctgtcattgacagctgaattggcactaataggtagg1740ccatggtcttctgctgaacataaacaatttcacagaacttcacaatcagacgaggtcact1800ctatgtccatgatagagtaaagcaaacccagattcctccataaacatgtctgagtatagc1860cagaactgcattttgtgcatcccacaaaaatgactaggatctccctcttctggctaaggt1920gagcaattgcttccttctgataacttggttctacttagagaaaactaagatgctcataga1980attacttccactgacagcacccagtcttgggcaaaactttgcctccttcctttctccccc2040aaattactcaaaacaatcctataacacatcttcctaatacttccctactgaggcatcccc2100tggttacctatggtgcgtggtctacagtgtctctcttgttacacgtcagtaaacccagct2160ttgactgcaggtgtgtttctggtggtctttggctgatggatatcagtgcttattaaaaca2220aaatactcttaaagcatttaaactttgtaatgtggcaagtgttctcatgaaccatatttt2280acagttgaggaaacagagggcgagagaatttaagtgtgtcatgatcaaggtcacacagtt2340agaaagtaaagctagtattcaaacctgggctgaatgatctaaaccaaattgaagacagca2400acttgtattaggaagggttcatgaatgaggtggaatattaggaattgcctgagtgacaca2460aaagaagtagtgagttctggaatgggacttggaagaggtggaaagtacagctggggacag2520aacttgagacagaaataggacccagttatgcagggggaagtaccttatcaactcatcctt2580ctttctttttcttcttcccctgcttccaaaggtgattatcgggatgatcacgtcttttcc2640ctctactttatgatacccttttttttcaccaccttgggattgctctaccataactggtaa2700gtgggccatgtgaacatgtagcaagtatggtcctgttggtcctgacccaactcctgttgg2760agaggctaagcctgcgcacacctgtattgagtgttttctggatgcctagttggtaatatt2820cttcaattactctctacccagttgcagttagagacaagtgctgtggagcccccaagaaga2880gatgaattcagggctttgggttctggaggcttgttggaagatctggagtttcctccgggc2940caggactagagtcagggctagtccagggttcagggcgtgtaatatgagagaaaagactga3000tagtgcctcctgccactggctcagatcctctcccccacacaggtacccatcacaggtgtt3060tgtgggagataccttctgttactttgctggcatgacctttgccgtggtgggcatcttggg3120acacttcagcaagaccatgctactcttcttcatgccccaggtgttcaacttcctctactc3180actgcctcagctcctgcatatcataccctgccctcgccaccgcattcccaggtagccact3240ttggggcttaaaagggacatcttagctttttcacttgggatgcataaagccagccttctg3300catctgctgtgtaaggggaatgggcccaaaggagggctctttccgtgcaattagccctta3360taaatgacagagcacattcacccacataatctgatcagctctgatcacacagtggtaagc3420agagccggaaacagatcttcaggttgtctgattccactttcggtactcttcctattaatt3480gaccgcagtgtggagagttcttggagtagtggcccagtcacataaagctctcttccccct3540gcagactcaataccaagacaggcaaactggagatgagctattccaagttcaagaccaaga3600gcctctctttcttgggcaactttattctaaaggtaacagggtaacgaggtaaggctctag3660gccaccatccggaattcagggcctggggaccctcggcttgcatcagatccaaggggagcc3720tggaagcatgaagcagatcccccattgctgaagcagagttgaagttctctccacctctgg3780cccctccaggtagcagcgagcctgcagctagtgacagtgcaccagagtgagaatgaggat3840ggtgccttcacggagtgtaacaacatgacgctcctcaacttgctccttaaggttctcggg3900cccatgcatgagagaaacctgactctgctcctgctgctgctccaggtgtggtcagggaag3960ggctttgctggctctggtctccctttctccatggctctgactctggtgtgtttctttctc4020ctcacagatccttggcagtgctgtcaccttctccatccggtaccagcttgtccggctctt4080ctacgatgtctgagtcccccaatccttgcccttcactgcatagtctgcagggttcctgac4140tcaggcctgcctctttctgggccaggcacgcttccgggcccaggcctctctcacctctta4200cttttctccagattttgtacttagcgattccgttccgctgtgatcgacatcctgggcctg4260tcttgccctgtactgactgttgattggactttgcctgtggctttcttcaacttgctgctc4320tccctctctatcccatccctgcggcctcccaaagtgggatactgtgctttttatgcagtt4380atccaccactcggactctcgaggaatatgttgggcctggggatagaaccctggctgggga4440gagggacacaggctcgaagatcacttgattatttgaccataaattaagtattctgattcg4500taagagcagattggggggccaggtgctcccagtggtgacaataaagtgttgtctttt4557<210>17<211>5374<212>dna<213>中國倉鼠<400>17caaggcagagcctaggttgctttataaaacctcttggggaagcccgagggcggttcaaat60taagagttgttgggttttgccccgcctcgcatgtgaggagcggacactgctcacggctga120gacctcggggctgcttcccaccagttagctgagaaggctgcggagctggaacctctggcc180actcgccatgtgggccttctctgaggtaccgattccgctgctggtgaatttgatcggctc240gctgctgggatttgtggccacgctcaccctcatcccggcctttcgtggccactttatcgc300tgcgcgcctctgtggccaggacctcaacaaaaccaaccggcagcagatgtgagcagtggc360acacgggtgtcccgggcaggggccaggggtgggcaaggcacaggcgagctctgaggtgct420taaatgtgcgtacgaaccaaatctaactggagttgtccgggaccctgggactcgatggcc480agaagtggttagcactggggaatgctaaggaaggggacccttgagtgagaacatccagcg540gcgcctgcctccccccgccccccactgccctcccgctccactgctcccccgcctcactcc600tgggaagatcttttgggtcacatggtttttgcactaaccacgcccatttcttcttccttc660tccacccccttgctgcggggccacagcccagaatcccagggagtgatcagcggtgccgtt720ttccttatcatcctgttctgcttcatccccttccccttcttgaactgctttgtgaaggag780cagtgtaaggctttcccccaccatgaagtaagtgggttcgtgggggcggttgcctggggc840ctgggaggttcccgagagagttggggttgtgtggatttgaggaggagggactgaggacct900agtggaaaagacagaaatttttgaaagcttgaatggcagtaggcttgagtcatgacctgc960ccgagcctcccccagtttgtggccctcataggtgcccttcttgccatctgctgcatgatt1020ttcttgggcttcgcggacgatgtcctgaatctacgctggcgccataagctgctgctgccc1080acagctgcatcactacctcttcttatggtctattttaccaactttggcaacacaaccatt1140gtggtacccaagcccttccgcccagttcttggcttgcatctggatttgggtgagtatccc1200tgctgctacagcccctgtggcacttatttcaagtcaccctccccccaaaggtgcccagca1260gagcacccttcttgatgttccacactcccctgtttttgttccgtccctgtgaatgctcag1320gttctctcttgtgccctgtcattgtgtgttctgttttcagaataccgttagatcctttcc1380tagctgtcactgctttttatactatgtcttgcagggatcctgtactatgtctacatgggg1440ctcctggcagtgttctgtaccaatgccatcaatatcctagcaggaattaacggcctagag1500gccggccagtcattggtcatctctgcttccatcattgtcttcaacctggtggagctgcaa1560ggttggtgggaagagagagatctcagtgttcagagaattgcctgatatatagctttgaga1620aaaggggggcttatagaagatagggaaagctatttactttgcaaataacaatgaagagtt1680acttgagtaggaggaagaaaaatagcagtctgtcatttatagctggattggcatgagtag1740ctagaccatgactgtttcctattggacataaatagtttcatagaaccccagcatgagaga1800ggggcgccctgaccgtggtgaaacaagacagaaaccagacttctcccactgtaatcatgt1860ctgaacaccgacaaaagcacaggaacaaagtcagcccaaacatcccttcttgtctaatgt1920gagagggtatagcttctttgcagtaacaactcagttcctgctacttcttaagttgttcag1980tcagaaaattacttctgctttctgacatcaggcagtccagagcacaacttttccttgcag2040cctccccagaaccacttaaagtgaatcctattgtaagtcccttctaacaacctttagagt2100acctgcccagcatgaggccttgggtacagtccccagtatctctgtttgcatgcatgtaca2160catacccacatgcacacactgaacttacttattgaaggtaagcaatatttatttgcattt2220tttgtgtgtgtgacaaaatttcactatgtaattcagaatagccttgaattcactatgtag2280cctaggccgtcctcgaacttacagtgataatcctgcctcagcttcctaagtgctaagatt2340caaggtatgcactaccaggccagctaagaaagcaatttttaaactaggtatggtggcaca2400catcactaattctaacactctgggagacttgggcaggaagatcatgagtttgagctcagc2460ctgggcacttggtaagtctctgtttctagaaataaaacatggagtggtgatacacacctg2520taatcccagcattcatgaggctggggcaggaggatcaccacaaggtcaagacctgcctgg2580gttacataagcaagttcaaggccagcgtgaactacgtagtgagaccctgcctcaaacaaa2640caaataaataaataaacatgatcctgagtttggttcccagtactccccccaataaatgaa2700atgaaatgaaagagctggggaggcagcttagtgctaaggtccaggaccccatgtgaaggc2760agctgcgtgtatgtgttatcagccctgtttcatacactagataataaaactggttttcaa2820acttaagtcagcatgtctggacaaagtgaagactttaacttgtttttgacggtttcatga2880cagtagtgagctattgggaactgcctgggtaccatcaaaggaataatgaggggctgggga2940tttagctcagcggcataagcgcctgccttgcaagcaggcagtcatgagtttgatccccgg3000taccgataaaaaggaaaaagacaaaaaaaaaaggaataatgagtttttgaaggtggctcg3060ggtgaggggaggtggcaacagagacagggatgcgacagacaaaatgaagagcaggggaca3120taggggagatgggtgttcacttttccttctttgtcctttgtttcccaaggtgattaccgg3180gatgatcatgtcttttccctctacttcatgataccgttttttttcaccaccttgggattg3240ctgtatcataactggtaaggaggctgtggctcagggaaaaggaaaacaactaactggtca3300ttggacaaagatggtcctgatcttaacccagctcctgaaagacaggctgaacttgcgcat3360acttttgctcagtgttttctgggtattcagttggtggattgcctccccccgccccgtttt3420ttttttgagacacctgtggcctctcgagtgctaggccagtgctttactactgagtcttgc3480cctctagtattctcaggtttgttcttttctcagcagttggagacaagtgctatggagccc3540caggaataattatggggacttgcgttctgcagacttgctagaccctcctgtccgaactag3600gatcaggggagcatgtgtggtggctcacacctgtaatcccagcactcaggagactgaggc3660aggaggattaccatgagatcgagggcaccctcagctcacatagtgactttgaggccagcc3720tggactacatagcgagactcttgtctccaaaagaaaaaaaaagaaagaataaaagaacag3780gggtctgagttcgtccagtacctagcctgtgtgatgtgagagaaaagactgtgatgcctc3840ttggcactggcttggatcctttcccccacacaggtacccatctcaggtgtttgtgggaga3900caccttctgttactttgctggcatgacctttgccgtggtaggcatcttgggacacttcag3960caagaccatgctgctcttcttcatgccacaggtgttcaacttcctctactcgctgcctca4020gctcctgcatatcatcccctgtcctcgccaccgtatacccaggtagctgtttgggggctg4080gaaagcctttctactgggatgtctaacaccaggctctacatttgctgtgcaaagaatgtg4140ggcccataggaaggctaacttttttcatgtaggtggccctttaagtttacacagcacgtt4200tacttccataatctcatttaatactcacagtagttctgatcatagagtagtaagcagcag4260agccagaaatagatctcactccatgatcagtgtttttcttagtcattaacggaagaaagt4320tttttgagtagtgacccagtcacacgaagctgtctttcccctacagactcaataccaaga4380caggcaaactggagatgagctattccaagttcaagaccaacagcctttctttcttgggca4440cctttattttaaaggtaacaaggtaacgaggaggtaaggccccaggccaccatcctgaac4500ttgggacatgggggacccaggcctacattagatctagagggagcttggaagcattaagca4560gagccctgttcctgacatacaggtattggctgaagtttttctgtctgtctctggtctctc4620taggtagcagagagactccagctagtgacagtgcaccggagtgagggtgaggacggggcc4680ttcactgagtgtaacaacatgaccctcatcaacttgctgcttaaaatctttgggcccata4740catgagaggaacctcacattgctcttgctgctgctacaggtgagcctggggtgagtttgt4800gcctcctcatgtccttttctctatggttcttattctagtccatttctccttgcagatcgt4860gggcagtgctgtcaccttctccattcgataccagcttgtccgactcttctatgacgtttg4920agttcctgaagattgccctctgccacactgtctccaggggtcctgctcaggccagccagt4980ctggttctgtgggcctctcccaatcttcagtctccttcagatttattcccagcatttttc5040ataacctatgattatcaacatcctgagccatttttgccctccagcaactactaactggac5100tttgcctatggcctccttcaacttgccactctccctacccatcacagccagaggcttgat5160gtagcagcttttatgcagatatccacaactcagctttcagagtcctcactctcaaagaac5220atgctgggccttgagatagaacctgagctagggctagggacactggtgcaagggtgattt5280gatatttgattataaattaagtgttctgattagtaagacagaaggggagcctggtgctcc5340caacggtgacaataaagtgttacctttttcttgt5374當(dāng)前第1頁12