相關(guān)申請的交叉引用

本申請要求2014年7月22日提交的美國臨時(shí)專利申請?zhí)?2/027,668的優(yōu)先權(quán)，該文通過引用納入本文。

發(fā)明背景

聚合酶用于大量不同的分子反應(yīng)，包括但不限于聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本文提供了用于儲(chǔ)存聚合酶的溶液。在一些實(shí)施方式中，溶液包含聚合酶；陰離子表面活性劑；和陽離子表面活性劑。在一些實(shí)施方式中，陰離子表面活性劑和陽離子表面活性劑的濃度為0.0001％至0.1％。在一些實(shí)施方式中，陰離子去污劑是十二烷基硫酸鈉(sds)。在一些實(shí)施方式中，陽離子去污劑是十六烷基三甲基溴化銨(ctab)。在一些實(shí)施方式中，陰離子去污劑是sds并且陽離子去污劑是ctab。

在一些實(shí)施方式中，溶液還包含兩性離子表面活性劑。在一些實(shí)施方式中，兩性離子表面活性劑是3-[(3-膽酰胺丙基)二甲基銨基]-1-丙磺酸鹽(chaps)。在一些實(shí)施方式中，兩性離子表面活性劑的濃度為0.01-1.0％。

在一些實(shí)施方式中，其中，聚合酶是熱穩(wěn)定的。

還提供了包含聚合酶、陰離子表面活性劑和陽離子表面活性劑的反應(yīng)混合物。在一些實(shí)施方式中，反應(yīng)混合物還包含核酸樣品。在一些實(shí)施方式中，反應(yīng)混合物還包含以下中的至少一種：核苷酸或寡核苷酸引物，適于聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)的緩沖劑，和鎂。

在一些實(shí)施方式中，陰離子表面活性劑和陽離子表面活性劑的濃度為0.0001％至0.1％。在一些實(shí)施方式中，陰離子去污劑是十二烷基硫酸鈉(sds)。在一些實(shí)施方式中，陽離子去污劑是十六烷基三甲基溴化銨(ctab)。在一些實(shí)施方式中，陰離子去污劑是sds并且陽離子去污劑是ctab。

在一些實(shí)施方式中，反應(yīng)混合物還包含兩性離子表面活性劑。在一些實(shí)施方式中，兩性離子表面活性劑是3-[(3-膽酰胺丙基)二甲基銨基]-1-丙磺酸鹽(chaps)。在一些實(shí)施方式中，兩性離子表面活性劑的濃度為0.01-1.0％。

在一些實(shí)施方式中，聚合酶是熱穩(wěn)定的。

還提供了進(jìn)行引物延伸反應(yīng)的方法。在一些實(shí)施方式中，該方法包括：

形成包含以下組分的反應(yīng)混合物：可能包含靶序列的核酸樣品；與靶序列退火的引物；聚合酶；陰離子表面活性劑；和陽離子表面活性劑。

將引物與可能存在的靶序列退火；并且

用聚合酶將引物延伸至少一個(gè)核苷酸。

在一些實(shí)施方式中，延伸包括熱循環(huán)條件。在一些實(shí)施方式中，延伸包括聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)。

在一些實(shí)施方式中，陰離子表面活性劑和陽離子表面活性劑的濃度為0.0001％至0.1％。在一些實(shí)施方式中，陰離子去污劑是十二烷基硫酸鈉(sds)。在一些實(shí)施方式中，陽離子去污劑是十六烷基三甲基溴化銨(ctab)。在一些實(shí)施方式中，陰離子去污劑是sds并且陽離子去污劑是ctab。

在一些實(shí)施方式中，反應(yīng)混合物還包含兩性離子表面活性劑。在一些實(shí)施方式中，兩性離子表面活性劑是3-[(3-膽酰胺丙基)二甲基銨基]-1-丙磺酸鹽(chaps)。在一些實(shí)施方式中，兩性離子表面活性劑的濃度為0.01-1.0％。

在一些實(shí)施方式中，聚合酶是熱穩(wěn)定的。

還提供了包含聚合酶、陰離子表面活性劑和陽離子表面活性劑的試劑盒。在一些實(shí)施方式中，第一容器含有聚合酶且第二容器包含陰離子表面活性劑和陽離子表面活性劑。在一些實(shí)施方式中，容器包含聚合酶，陰離子表面活性劑，和陽離子表面活性劑。在一些實(shí)施方式中，陰離子表面活性劑和陽離子表面活性劑處于母液濃度。在一些實(shí)施方式中，陰離子表面活性劑和陽離子表面活性劑的濃度為0.0001％至0.1％。在一些實(shí)施方式中，陰離子去污劑是十二烷基硫酸鈉(sds)。在一些實(shí)施方式中，陽離子去污劑是十六烷基三甲基溴化銨(ctab)。在一些實(shí)施方式中，陰離子去污劑是sds并且陽離子去污劑是ctab。在一些實(shí)施方式中，試劑盒還包含兩性離子表面活性劑。在一些實(shí)施方式中，兩性離子表面活性劑是3-[(3-膽酰胺丙基)二甲基銨基]-1-丙磺酸鹽(chaps)。在一些實(shí)施方式中，兩性離子表面活性劑的濃度為0.01-1.0％。在一些實(shí)施方式中，聚合酶是熱穩(wěn)定的。

定義

除非另有說明，本文所用的所有科技術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所理解的含義。通常，本文所用的命名和下述細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、有機(jī)化學(xué)和核酸化學(xué)以及雜交中的實(shí)驗(yàn)室步驟均為本領(lǐng)域熟知和常用的。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行核酸和肽合成。按照本領(lǐng)域和各種通用參考文獻(xiàn)所述的常規(guī)方法進(jìn)行這些技術(shù)和步驟(通常參見，sambrook等，《分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊》(molecularcloning：alaboratorymanual)，第2版(1989)冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(coldspringharborlaboratorypress)，紐約冷泉港(coldspringharbor，n.y.)，其通過引用納入本文)，將它們引入本文全文中。本文所用的命名以及下述分析化學(xué)和有機(jī)合成中的實(shí)驗(yàn)室步驟均為本領(lǐng)域熟知且常用。

“表面活性劑”是降低兩種液體之間或液體和固體之間的表面張力(或界面張力)的化合物。表面活性劑可用作去污劑、潤濕劑、乳化劑、泡沫劑和分散劑。表面活性劑通常是兩性的有機(jī)化合物。

術(shù)語“sso7”或“sso7dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域”或“sso7樣dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域”或“sso7結(jié)構(gòu)域”指核酸和多肽多態(tài)性變體、等位基因、突變體和種間同源物，其：(1)氨基酸序列與wo2012/177695的seqidno：4或seqidno：10的氨基酸序列具有大于約60％(65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高)的序列相同性；或(2)在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下特異性雜交至wo2012/177695的seqidno：4或seqidno：10的sso7d編碼核酸序列；及其保守修飾變體。該術(shù)語包括全長sso7d多肽和具有序列非特異性雙鏈結(jié)合活性的多肽片段。sso7樣蛋白包括但不限于sso7d、sac7d和sac7e。比野生型sso7d的特異性增加的各種sso7d突變結(jié)構(gòu)域描述于，例如，wo2012/138417和wo2012/138416。

“結(jié)構(gòu)域”指蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復(fù)合物的單元，包含多肽子序列、完整多肽序列，或多個(gè)多肽序列，這些序列中該單元具有限定的功能。該功能理解為廣義定義并且可以是配體結(jié)合、催化活性或者可對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)有穩(wěn)定化效果。

用于蛋白質(zhì)部分時(shí)，“異源”指該蛋白質(zhì)包含在天然情況下彼此不存在于同一關(guān)系中的兩個(gè)或更多結(jié)構(gòu)域。這類蛋白質(zhì)(如融合蛋白)含有來自不相關(guān)蛋白質(zhì)的兩個(gè)或更多個(gè)結(jié)構(gòu)域，其排列為生成新的功能性蛋白質(zhì)。

“接合”是指本領(lǐng)域已知的用于功能性連接蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的任何方法，包括但不限于用或不用中間結(jié)構(gòu)域的重組融合，內(nèi)含肽-介導(dǎo)的融合，非共價(jià)結(jié)合，和共價(jià)鍵合，包括二硫鍵鍵合；氫鍵鍵合；靜電鍵合；和構(gòu)象鍵合，例如，抗體-抗原，和生物素-親和素結(jié)合。

本文使用的“熱穩(wěn)定聚合酶”或“熱穩(wěn)定性聚合酶”指使用dna或rna作為模板通過向核苷酸鏈中加入核苷酸單元以催化多核苷酸合成的酶且該酶在高于45℃的溫度下達(dá)到最佳活性。

“嗜熱酶”是指從任何嗜熱物種分離的a家族dna聚合酶，包括但不限于水生棲熱菌(thermusaquaticus)、布魯克棲熱菌(thermusbrockianus)、和嗜熱棲熱菌(thermusthermophilus)；衍生自嗜熱物種的任意重組聚合酶，及其任意功能性衍生物，無論是衍生自遺傳修飾或化學(xué)修飾或本領(lǐng)域已知的其他方法。

術(shù)語“擴(kuò)增反應(yīng)”指用于倍增核酸靶序列拷貝的任何體外方法。這類方法包括但不限于聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)、dna連接酶鏈反應(yīng)(參見美國專利號(hào)4,683,195和4,683,202；《pcr方案：方法和應(yīng)用指南》(innis等編，1990))、(lcr)、qbetarna復(fù)制酶、和基于rna轉(zhuǎn)錄(如tas和3sr)的擴(kuò)增反應(yīng)以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它反應(yīng)。

“擴(kuò)增”指將溶液置于足以擴(kuò)增多核苷酸的條件下的步驟(如果反應(yīng)的所有組分是完整的)。擴(kuò)增反應(yīng)的組分包括，例如，引物、多核苷酸模板、聚合酶、核苷酸等。術(shù)語“擴(kuò)增”一般是指靶核酸的“指數(shù)型”增長。然而，本文所用的“擴(kuò)增”也可指核酸的選擇靶序列數(shù)量的線性增長，如由循環(huán)測序所得。

術(shù)語“擴(kuò)增反應(yīng)混合物”指包含用于擴(kuò)增靶核酸的各種試劑的水性溶液。這些試劑包括酶、水性緩沖劑、鹽、擴(kuò)增引物、靶核酸和三磷酸核苷。如本發(fā)明中進(jìn)一步討論的那樣，擴(kuò)增反應(yīng)混合物還可包含穩(wěn)定劑和其它添加劑以優(yōu)化效率和特異性。根據(jù)內(nèi)容，混合物可以是完整或不完整(例如，缺少核酸模板、引物，或同時(shí)缺少兩者)擴(kuò)增反應(yīng)混合物。

“聚合酶鏈反應(yīng)”或“pcr”是指靶雙鏈dna的特定區(qū)段或子序列得以幾何級(jí)數(shù)式擴(kuò)增的一種方法。pcr是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的；參見例如，美國專利號(hào)4,683,195和4,683,202；和《pcr方案：方法和應(yīng)用指南》，innis等編，1990。示例性pcr反應(yīng)條件一般包括兩步或三步循環(huán)。兩步循環(huán)具有變性步驟，之后是雜交/延伸步驟。三步循環(huán)包括變性步驟，之后是雜交步驟，之后是獨(dú)立的延伸步驟。

“引物”指與靶核酸上的序列雜交并且用作核酸合成的起始點(diǎn)的多核苷酸序列。引物可以是各種長度的并且通常長度小于50個(gè)核苷酸，例如長度為12-30個(gè)核苷酸?？苫诒绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的原理設(shè)計(jì)用于pcr的引物的長度和序列，參見例如innis等(同上)。

“模板”指包含待擴(kuò)增的多核苷酸、側(cè)接引物雜交位點(diǎn)的多核苷酸序列。因此，“靶模板”包含側(cè)接5′引物和3′引物的雜交位點(diǎn)的靶多核苷酸序列。

本文所用的“核酸”表示dna、rna、單鏈、雙鏈、或更高度聚集的雜交基序及其任意化學(xué)修飾。修飾包括但不限于，提供整合入其它電荷、極化性、氫鍵、靜電相互作用、與核酸配體堿基或核酸配體整體的連接點(diǎn)和作用點(diǎn)的化學(xué)基團(tuán)的那些修飾。這類修飾包括但不限于，肽核酸(pna)、磷酸二酯基團(tuán)修飾(例如，硫代磷酸酯、甲基膦酸酯)、2′-位糖修飾、5-位嘧啶修飾、8-位嘌呤修飾、環(huán)外胺處的修飾、4-硫尿核苷的取代、5-溴或5-碘-尿嘧啶的取代、骨架修飾、甲基化、不常見的堿基配對組合如異堿基(isobases)、異胞苷和異胍(isoguanidine)等。核酸也可包含非天然堿基，如硝基吲哚。修飾還可包括3′和5′修飾，例如用熒光團(tuán)(例如，量子點(diǎn))或其他部分加帽。

術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中互換使用，指氨基酸殘基的聚合物。該術(shù)語可用于表示其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是相應(yīng)天然產(chǎn)生氨基酸的人造化學(xué)模擬物的氨基酸聚合物，以及天然產(chǎn)生的氨基酸聚合物和非天然產(chǎn)生的氨基酸聚合物。

術(shù)語“氨基酸”指天然產(chǎn)生的和合成的氨基酸，以及作用方式類似于天然產(chǎn)生氨基酸的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然產(chǎn)生的氨基酸是由遺傳密碼編碼的那些氨基酸，以及隨后經(jīng)修飾的那些氨基酸，例如，羥基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和o-磷酸絲氨酸。氨基酸類似物指與天然產(chǎn)生的氨基酸具有相同基本化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物，即碳原子與氫原子、羧基、氨基和r基結(jié)合，如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基锍。這種類似物具有修飾的r基(如正亮氨酸)或修飾的肽主鏈，但保留了與天然產(chǎn)生的氨基酸基本相同的化學(xué)結(jié)構(gòu)。氨基酸模擬物指結(jié)構(gòu)不同于氨基酸的普通化學(xué)結(jié)構(gòu)，但作用方式類似于天然產(chǎn)生氨基酸的化合物。

本文中氨基酸可按iupac-iub生物化學(xué)命名委員會(huì)推薦的俗稱三字母符號(hào)或單字母符號(hào)表述。同樣，核苷酸可指其普遍接受的單字母代碼。

“保守修飾變體”可應(yīng)用于氨基酸和核酸序列。對于特定的核酸序列，保守修飾變體指編碼相同或基本相同的氨基酸序列的核酸，或者當(dāng)核酸不編碼氨基酸序列時(shí)，指基本相同的序列。由于遺傳密碼的簡并性，大量功能相同的核酸編碼任何給定的蛋白質(zhì)。例如，密碼子gca、gcc、gcg和gcu都編碼氨基酸丙氨酸。因此，在密碼子指定丙氨酸的每個(gè)位置上，可將所述密碼子改變成所述的任何相應(yīng)密碼子而不改變編碼的多肽。這類核酸變異是“沉默變異”，這是保守修飾變異的一種。本文編碼多肽的每種核酸序列也描述該核酸的每種可能的沉默變異。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到，可修飾核酸中的各個(gè)密碼子(除了aug和tgg，aug通常是甲硫氨酸的唯一密碼子，tgg通常是色氨酸的唯一密碼子)，以產(chǎn)生功能相同的分子。因此，在所述的各序列中隱含了編碼多肽的各核酸沉默變異。

至于氨基酸序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，在編碼序列中改變、加入或刪除一個(gè)氨基酸或較少百分?jǐn)?shù)氨基酸的某一核酸、肽、多肽或蛋白質(zhì)序列單獨(dú)取代、缺失或添加是“保守修飾變體”，其中所述改變導(dǎo)致氨基酸被化學(xué)上相似的氨基酸所取代。提供功能上相似氨基酸的保守取代表是本領(lǐng)域熟知的。此類保守修飾的變體是本發(fā)明的多態(tài)性變體、種間同源物和等位基因的補(bǔ)充且并不排除它們。

術(shù)語“編碼”指編碼一種或多種氨基酸的多核苷酸序列。該術(shù)語無需起始或終止密碼子。氨基酸序列可編碼于多核苷酸序列提供的六種不同的閱讀框中任一種中。

術(shù)語“啟動(dòng)子”指定位于轉(zhuǎn)錄起始上游和/或下游且涉及識(shí)別和結(jié)合rna聚合酶和其他蛋白質(zhì)以起始轉(zhuǎn)錄的區(qū)域或序列。

“聚合酶”是指進(jìn)行模板引導(dǎo)的多核苷酸(例如，dna和/或rna)合成的酶。該術(shù)語同時(shí)包括全長多肽和具有聚合酶活性的結(jié)構(gòu)域。dna聚合酶是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，包括但不限于從激烈火球菌(pyrococcusfuriosus)、濱海嗜熱球菌(thermococcuslitoralis)和海棲熱袍菌(thermotogamaritime)分離或衍生的dna聚合酶或其修飾版本。它們包括dna-依賴聚合酶和rna-依賴聚合酶，如逆轉(zhuǎn)錄酶。已知至少5個(gè)dna-依賴dna聚合酶家族，雖然大多數(shù)落入a、b和c家族。各家族之間很少或沒有序列相似性。大多數(shù)a家族聚合酶是可含有多重酶促功能(包括聚合酶、3′到5′外切核酸酶活性和5′到3′外切核酸酶活性)的單鏈蛋白質(zhì)。野生型b家族聚合酶通常有具有聚合酶和3′到5′外切核酸酶活性的單個(gè)催化結(jié)構(gòu)域，以及輔助因子。c家族聚合酶通常是具有聚合和3′到5′外切核酸酶活性的多亞基蛋白質(zhì)。在大腸桿菌中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了3種類型的dna聚合酶，dna聚合酶i(a家族)、dna聚合酶ii(b家族)和dna聚合酶iii(c家族)。在真核細(xì)胞中，核復(fù)制中涉及3種不同的b家族聚合酶，dna聚合酶α、δ和ε，并且a家族聚合酶，聚合酶γ用于線粒體dna復(fù)制。其他類型的dna聚合酶包括噬菌體聚合酶或者兩種或更多種聚合酶之間的融合體。相似地，rna聚合酶通常包括真核rna聚合酶i、ii和iii，和細(xì)菌rna聚合酶以及噬菌體和病毒聚合酶。rna聚合酶可以是dna-依賴的和rna-依賴的。

當(dāng)如下述比對最大對應(yīng)性時(shí)，如果在兩條序列中核苷酸或氨基酸殘基的序列分別是相同的，兩條核酸序列或多肽被稱為“相同的”。在兩條或更多條核酸或多肽序列內(nèi)容中的術(shù)語“相同的”或“相同性”百分比指就比較窗的最大對應(yīng)性進(jìn)行比較和比對時(shí)，相同或有特定百分?jǐn)?shù)的相同氨基酸殘基或核苷酸的兩條或更多條序列或子序列，如使用下列序列比較算法之一或通過手工比對和目測測量。序列相同性百分比涉及蛋白和肽使用時(shí)，認(rèn)為不同的殘基位置通常由于保守氨基酸取代而不同，其中氨基酸殘基被具有相似化學(xué)性質(zhì)(如電荷或疏水性)的其他氨基酸殘基取代，因此不改變分子的功能性質(zhì)。當(dāng)序列由于保守取代而不同時(shí)，序列相同性百分比可上調(diào)以根據(jù)該取代的保守性質(zhì)校正。進(jìn)行該調(diào)整的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知。通常其包括將保守取代作為部分評分而不是完全錯(cuò)配，從而增加序列相同性百分比。因此例如，相同氨基酸得分為1，非保守取代得分為0，保守取代得分為0-1。保守取代的評分按照，例如meyers和miller的算法，computerapplic.biol.sci.4：11-17(1988)，例如，如在程序pc/gene(美國加利福尼亞州芒廷維尤的智慧遺傳公司(intelligenetics，mountainview，california，usa))中執(zhí)行的進(jìn)行計(jì)算。

如果采用以下序列比較算法之一或通過手工比對和目測檢查測量時(shí)，當(dāng)就比較窗口或指定區(qū)域上的最大對應(yīng)性而言，這些序列有特定百分?jǐn)?shù)的核苷酸或氨基酸殘基相同(例如在特定區(qū)域上至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同)，則序列彼此間“基本相同”。

對于序列比較，一般將一條序列用作與測試序列比較的參比序列。使用序列比較算法時(shí)，測試和參比序列均輸入計(jì)算機(jī)，必要時(shí)指定子序列坐標(biāo)，指定序列算法程序參數(shù)?？墒褂媚J(rèn)的程序參數(shù)，或者可指定另外的參數(shù)。然后，該序列比較算法基于程序參數(shù)計(jì)算出測試序列相對于參比序列的序列相同性百分?jǐn)?shù)。

本文所用的“比較窗口”包括參考選自20-600，通常約50-200，更常見約100-150的任一數(shù)量的毗連位置的區(qū)段，其中對兩個(gè)序列進(jìn)行最優(yōu)比對后，可將序列與具有相同數(shù)量毗連位置的參比序列作比較。比對序列的比較方法是本領(lǐng)域熟知的。可進(jìn)行最優(yōu)序列比對以作比較，例如，通過smith和waterman的局部同源性算法，adv.appl.math.2：482(1981)；通過needleman和wunsch的同源性比對算法，j.mol.biol.48：443(1970)；通過pearson和lipman的相似性搜索法，proc.nat’l.acad.sci.usa85：2444(1988)；通過計(jì)算機(jī)執(zhí)行這些算法(阿克賽勒里公司(accelrys)的威斯康星遺傳學(xué)軟件包(wisconsingeneticssoftwarepackage)中的gap、bestfit、fasta和tfasta)，或通過手工比對和目測。

適合確定序列相同性和序列相似性百分?jǐn)?shù)的算法分別是blast和blast2.0算法，分別描述于altschul等，nuc.acidsres.25：3389-402(1977)和altschul等，j.mol.biol.215：403-10(1990)。進(jìn)行blast分析的軟件可從國家生物技術(shù)信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation)公開獲得(http：//ncbi.nlm.nih.gov/)。此算法包括：首先通過鑒定查詢序列中長度為w的短字來鑒定高評分序列對(hsp)，與數(shù)據(jù)庫序列中長度相同的字比對時(shí)它們能匹配或滿足一些正值的閾值評分t。t稱為相鄰字評分閾值(altschul等，同上)。這些初始相鄰字命中用作啟動(dòng)搜索的種子，以便找到含有它們的較長hsp。只要可提高累積比對評分，該字命中在兩個(gè)方向上沿各序列延伸。出現(xiàn)以下情況時(shí)中止字命中在各個(gè)方向上的延伸：累積比對評分比其最大獲得值降低x；由于一個(gè)或多個(gè)負(fù)評分殘基比對的累積，累積評分變?yōu)榱慊蛄阋韵?；或者達(dá)到任一序列的末端。blast算法參數(shù)w、t和x決定比對的靈敏度和速度。blast程序使用的默認(rèn)值為：字長(w)11，blosum62評分矩陣(參見henikoff和henikoff，proc.natl.acad.sci.usa89：10915(1989))比對(b)50，期望值(e)10，m＝5，n＝-4，以及比較兩條鏈。

blast算法也對兩條序列間的相似性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(參見例如，karlin和altschul，proc.nat’l.acad.sci.usa90：5873-5787(1993))。blast算法提供的一種相似性測量是最小概率和(p(n))，它表明兩條核苷酸或氨基酸序列之間偶爾發(fā)生匹配的概率。例如，如果測試核酸與參比核酸比較時(shí)的最小概率和小于約0.2，更優(yōu)選小于約0.01，最優(yōu)選小于約0.001，那么認(rèn)為該核酸與參比序列相似。

術(shù)語“嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件”指通常在核酸的復(fù)雜混合物中，探針與其目標(biāo)子序列雜交，但不與其他序列雜交的條件。嚴(yán)謹(jǐn)條件是序列依賴性的，在不同情況下不同。較長的序列在較高溫度下特異性雜交。有關(guān)核酸雜交的廣泛指南參見tijssen，techniquesinbiochemistryandmolecularbiology--hybridizationwithnucleicprobes(《生物化學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)-與核酸探針雜交》)，“overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidassays(核酸測定的雜交原理和方案概覽)”(1993)。通常，高嚴(yán)謹(jǐn)條件選擇為比特定序列在確定離子強(qiáng)度、ph下的解鏈溫度(tm)低約5-10℃。通常低嚴(yán)謹(jǐn)條件選擇為低于tm約15-30℃。tm是50％靶標(biāo)互補(bǔ)探針與靶序列雜交平衡時(shí)的溫度(在確定離子強(qiáng)度、ph和核酸濃度下)(由于靶序列過量存在，在tm時(shí)50％探針被平衡地占據(jù))。雜交條件一般是鹽濃度小于約1.0m鈉離子，一般約0.01至1.0m鈉離子濃度(或其它鹽)，ph7.0至8.3，對短探針(例如，10-50個(gè)核苷酸)而言溫度至少約為30℃、對長探針(例如大于50個(gè)核苷酸)而言至少約60℃的條件。也可加入去穩(wěn)定劑如甲酰胺以獲得嚴(yán)謹(jǐn)條件。在選擇性或特異性雜交中，陽性信號(hào)至少是背景雜交的兩倍，優(yōu)選10倍。

如果核酸編碼的多肽基本相同，那么在嚴(yán)謹(jǐn)條件下彼此不雜交的核酸仍基本相同。例如，用遺傳密碼所允許的最大密碼子簡并性產(chǎn)生核酸拷貝時(shí)可能發(fā)生這種情況。在這種情況下，核酸一般在中等嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾s交條件下雜交。示范性“中等嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件”包括37℃，在40％甲酰胺、1mnacl、1％sds的緩沖液中雜交，45℃，1xssc洗滌。示例性“嚴(yán)謹(jǐn)條件”包含在40％甲酰胺、1mnaci、1％sds的緩沖液中37℃雜交，和至少一次在0.2xssc中于至少約50℃的溫度下(通常約55℃-約60℃)洗滌20分鐘，或等同的條件。陽性雜交至少是背景的兩倍。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員不難認(rèn)識(shí)到，可利用替代的雜交和洗滌條件提供相似嚴(yán)謹(jǐn)性的條件。

附圖的簡要說明

圖1顯示了經(jīng)過瓊脂糖凝膠中的電泳的擴(kuò)增反應(yīng)的結(jié)果。在實(shí)施例中在表1中提供了各反應(yīng)的相同性。

圖2顯示了經(jīng)過瓊脂糖凝膠中的電泳的擴(kuò)增反應(yīng)的結(jié)果。在實(shí)施例中在表2中提供了各反應(yīng)的相同性。

發(fā)明詳述

發(fā)明人已經(jīng)驚訝地發(fā)現(xiàn)，在擴(kuò)增反應(yīng)中包含陰離子表面活性劑和陽離子表面活性劑導(dǎo)致與缺少兩種表面活性劑之一或同時(shí)缺少兩者相比改善的擴(kuò)增產(chǎn)率。事實(shí)上，如圖1所示，僅包含陰離子表面活性劑(例如，sds)或僅包含陽離子表面活性劑(例如，ctab)并沒有在擴(kuò)增反應(yīng)中提供任何明顯益處。相反，同時(shí)包含陰離子和陽離子表面活性劑導(dǎo)致高擴(kuò)增產(chǎn)率。另外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在兩性離子表面活性劑(例如，chap)存在下，可以高濃度將陰離子和陽離子表面活性劑儲(chǔ)存在一起以維持陰離子和陽離子表面活性劑的溶解性，同時(shí)允許它們從更高濃度母液用于擴(kuò)增反應(yīng)。因此，在一些實(shí)施方式中，提供了包含陰離子和陽離子表面活性劑，并且任選地也包含兩性離子表面活性劑的反應(yīng)混合物和擴(kuò)增反應(yīng)母液及其使用方法。

陰離子表面活性劑是例如在ph7下帶負(fù)電的表面活性劑。示例性的陰離子表面活性劑包括，但不限于，十二烷基硫酸鈉(sds)、月桂基硫酸鈉、十二烷基苯磺酸鈉、全氟辛酸、月桂基硫酸鉀、月桂基硫酸鋰、全氟丁磺酸、全氟壬酸、全氟辛烷磺酸、二辛基磺基琥珀酸鈉、月桂基硫酸銨、月桂酰肌氨酸鈉、肉豆蔻醇聚醚硫酸鈉、鏈烷醇聚醚硫酸鈉、硬脂酸鈉。

陽離子表面活性劑是例如在ph7下帶正電的表面活性劑。示例性的陽離子表面活性劑包括，但不限于，十六烷基三甲基溴化銨(ctab)，具有ph-決定伯胺、仲胺或叔胺的表面活性劑，如奧替尼啶二鹽酸鹽，或烷基三甲基銨鹽(例如，ctab或十六烷基三甲基氯化銨(ctac))，或十六烷基氯化吡啶鎓(cpc)、三甲基(十四烷基)溴化銨(ttab)，苯扎氯銨(bac)，氯化芐乙銨(bzt)，5-溴-5-硝基-1，3-二噁烷，二甲基雙十八烷基氯化銨，十六烷基三甲基溴化銨，或雙十八烷二甲基基溴化銨(dodab)。

可按照需要調(diào)節(jié)反應(yīng)混合物中的陰離子表面活性劑以優(yōu)化擴(kuò)增產(chǎn)率。在一些實(shí)施方式中，以相同濃度在反應(yīng)混合物中提供陰離子和陽離子表面活性劑，或者其中表面活性劑之一的濃度與另一種表面活性劑的差異不超過5％、10％或20％。例如，陰離子和陽離子表面活性劑之一或兩者的濃度可以是0.0001％-0.1％，例如，0.001-0.1％，例如，0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、或0.09％或者如本文他處所述。

在一些實(shí)施方式中，反應(yīng)混合物或母液還包含兩性離子表面活性劑。示例性的兩性離子表面活性劑包括，但不限于，3-[(3-膽酰胺丙基)二甲基銨]-1-丙磺酸鹽(chaps)、3-([3-膽酰胺丙基)二甲基銨基)-2-羥基-1-丙磺酸鹽(chapso)。在一些實(shí)施方式中，兩性離子表面活性劑的濃度為0.001-1％，例如，0.001-0.01％或0.01-0.1％。

一般而言，認(rèn)為基本上任何聚合酶可包含在包含陰離子和陽離子表面活性劑的反應(yīng)混合物中以改善擴(kuò)增產(chǎn)率。在一個(gè)示例性的實(shí)施方式中，聚合酶包含衍生自2種親本聚合酶pfu和deepvent的聚合酶結(jié)構(gòu)域。這類聚合酶描述于，例如，美國申請公開號(hào)20040219558，20040214194，20040191825，20030162173，其各自通過引用納入本文。

多種聚合酶可用于反應(yīng)混合物中，或者作為反應(yīng)混合物中雜交聚合酶的聚合酶結(jié)構(gòu)域的至少一部分。已知至少5個(gè)dna-依賴dna聚合酶家族，雖然大多數(shù)落入a、b和c家族。各家族之間很少或沒有結(jié)構(gòu)或序列相似性。大多數(shù)a家族聚合酶是可含有多重酶促功能(包括聚合酶、3′到5′外切核酸酶活性和5′到3′外切核酸酶活性)的單鏈蛋白質(zhì)。野生型b家族聚合酶通常有具有聚合酶和3′到5′外切核酸酶活性的單個(gè)催化結(jié)構(gòu)域，以及輔助因子。c家族聚合酶通常是具有聚合和3′到5′外切核酸酶活性的多亞基蛋白質(zhì)。在大腸桿菌中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了3種類型的dna聚合酶，dna聚合酶i(a家族)、dna聚合酶ii(b家族)和dna聚合酶iii(c家族)。在真核細(xì)胞中，核復(fù)制中涉及3種不同的b家族聚合酶，dna聚合酶α、δ和ε，并且a家族聚合酶，聚合酶γ用于線粒體dna復(fù)制。其它類型的dna聚合酶包括噬菌體聚合酶。任意這些聚合酶，這些聚合酶的全部或部分的組合，以及這些聚合酶中的2種或更多種之間的嵌合物或雜交體或其等價(jià)物可用于形成聚合酶結(jié)構(gòu)域的部分或全部用于本文所述的混合物中。

在一些實(shí)施方式中，聚合酶包含賦予聚合酶外切核酸酶缺陷的一個(gè)或多個(gè)突變。本文所用的“外切核酸酶缺失”表示聚合酶具有明顯降低的(即，少于10％、5％或1％的來自激烈火球菌(pyrococcusfuriosus)的pfudna聚合酶的3’-5’外切核酸酶活性)或者沒有外切核酸酶活性。例如，在d141和e143位置處丙氨酸取代的聚合酶結(jié)構(gòu)域中的兩點(diǎn)突變可去除或消除3’-5’外切核酸酶活性。參見例如，derbyshire等，methodsinenzymology，卷262(1995)，第363-385頁。包含這種兩點(diǎn)突變的雜交體(例如，融合至序列非特異性雙鏈dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域)聚合酶將一般在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中顯示出增加的特異性，導(dǎo)致較少的擴(kuò)增副產(chǎn)物(如引物二聚體的擴(kuò)增)和增加的所需靶核酸擴(kuò)增效率。

在一些實(shí)施方式中，聚合酶融合至dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域。這種融合肽有時(shí)在本文中稱為“雜交聚合酶”。dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域是以序列不依賴的方式結(jié)合(例如結(jié)合不顯示對特定序列的總體偏好)核酸的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的限定區(qū)域。dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域可結(jié)合單鏈或雙鏈核酸。

本發(fā)明使用的dna結(jié)合蛋白質(zhì)通常是熱穩(wěn)定的。這類蛋白質(zhì)的示例包括但不限于古細(xì)菌小基礎(chǔ)dna結(jié)合蛋白sso7d和sso7d樣蛋白(參見例如，choli等，biochimicaetbiophysicaacta950：193-203，1988；baumann等，structuralbiol.1：808-819，1994；以及gao等，naturestruc.biol.5：782-786，1998)，古細(xì)菌hmf樣蛋白(參見例如，starich等，j.molec.biol.255：187-203，1996；sandman等，gene150：207-208，1994)，以及pcna同源物(參見例如，cann等，j.bacteriology181：6591-6599，1999；shamoo和steitz，cell：99，155-166，1999；defelice等，j.molec.biol.291，47-57，1999；以及zhang等，biochemistry34：10703-10712.1995)。

hmf樣蛋白是古細(xì)菌組蛋白，其在氨基酸序列和結(jié)構(gòu)上都與被認(rèn)為和與dna直接相互作用的真核細(xì)胞h4組蛋白具有同源性。這些hmf家族蛋白在溶液中形成穩(wěn)定的二聚體，且已從熱穩(wěn)定的物種(例如熾熱甲烷嗜熱菌(methanothermusfervidus)和火球菌菌株gb-3a)中鑒定到若干hmf同源物。hmf家族蛋白質(zhì)，一旦連接至具有低固有持續(xù)合成能力的dna聚合酶或任何dna修飾酶，可增強(qiáng)酶沿著dna底物滑動(dòng)的能力并由此增加其持續(xù)合成能力。例如，二聚體hmf-樣蛋白質(zhì)可共價(jià)連接至taqdna聚合酶的n端，例如，通過化學(xué)修飾，并由此改善聚合酶的持續(xù)性。

某些螺旋-發(fā)夾-螺旋基序已被證明非特異性結(jié)合dna并增強(qiáng)其融合的dna聚合酶的持續(xù)合成能力(pavlov等，procnatlacadsciusa.99：13510-5，2002)。

sso7d和sso7d樣蛋白、sac7d和sac7d樣蛋白(例如sac7a、sac7b、sac7d和sac7e)是分別來自極端嗜熱性古細(xì)菌硫磺礦硫化葉菌(sulfolobussolfataricus)和酸熱脂環(huán)酸硫化葉菌(s.acidocaldarius)的小(約7,000kdmw)、基礎(chǔ)染色體蛋白。這些蛋白質(zhì)是富賴氨酸的且具有高度的熱、酸和化學(xué)穩(wěn)定性。其以不依賴序列的方式結(jié)合dna，在一些情況下，一旦結(jié)合，使得dna的tm升高最多達(dá)40℃(mcafee，biochemistry34：10063-10077，1995；gao等，nat.struct.biol.5(9)：782-786，1998)。這些蛋白質(zhì)及其同源物通常被認(rèn)為參與在升高的溫度下穩(wěn)定基因組dna。用于本發(fā)明的合適的sso7d樣dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域可基于其與sso7d的序列同源性進(jìn)行修飾。通常，在約25個(gè)氨基酸的比較窗口上(任選約50-100個(gè)氨基酸或整個(gè)蛋白質(zhì)的長度)與已知的dna結(jié)合蛋白相同或基本相同的dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域可用于本發(fā)明。該序列可針對比較窗口或指定區(qū)域上的最大對應(yīng)性進(jìn)行比較和比對，所述最大對應(yīng)性的測量方法為使用描述的比較算法之一或通過手動(dòng)比對和視覺觀察。在一些實(shí)施方式中，dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含wo2012/177695的seqidno：4或seqidno：10或與其基本相同的序列(例如，至少60％、70％、80％、90％、或95％相同)。sso7結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的多種突變已描述于例如美國專利申請?zhí)?005/0048530和2007/0141591。

適于使用的其他dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域可通過與已知dna結(jié)合蛋白的同源性和/或通過抗體交叉反應(yīng)性來鑒定，或可通過生物化學(xué)試驗(yàn)方法發(fā)現(xiàn)。可使用本發(fā)明所述和本領(lǐng)域已知的技術(shù)合成或分離dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域。

本發(fā)明所使用的序列非特異性雙鏈核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域還可使用抗體通過交叉反應(yīng)性進(jìn)行鑒定，所述抗體包括但不限于結(jié)合已知核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多克隆抗體。多克隆抗體使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法生成(參見例如coligan，currentprotocolsinimmunology(《新編免疫學(xué)方法》)(1991)；harlow和lane，antibodies，alaboratorymanual(《抗體，實(shí)驗(yàn)室手冊》)(1988))。這些屬于免疫交叉反應(yīng)性結(jié)合蛋白的蛋白質(zhì)可隨后通過多種試驗(yàn)方法檢測。對于可使用的多種形式和條件的描述，參見例如，methodsincellbiology：antibodiesincellbiology(《細(xì)胞生物學(xué)中的方法：細(xì)胞生物學(xué)中的抗體》)，卷37(asai編，1993)，coligan(同上)和harlow和lane(同上)。

可使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的多種試驗(yàn)來測試對雙鏈核酸的結(jié)合特異性。這些試驗(yàn)包括諸如過濾結(jié)合試驗(yàn)或凝膠遷移試驗(yàn)的試驗(yàn)。例如，在過濾結(jié)合試驗(yàn)中，在適當(dāng)?shù)木彌_液中將待評估與雙鏈dna結(jié)合活性的多肽與放射性標(biāo)記的dna(雙鏈或單鏈)預(yù)混合。通過保留蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-dna復(fù)合物的膜(如硝酸纖維素)過濾混合物。保留在過濾器上的dna的量表示與蛋白質(zhì)結(jié)合的量?？赏ㄟ^競爭分析來定量結(jié)合，其中通過加入含量遞增的未標(biāo)記的dna來競爭標(biāo)記的dna的結(jié)合。以比單鏈dna高10倍或更高的親和性結(jié)合雙鏈dna的多肽在本發(fā)明中被定義為雙鏈dna結(jié)合蛋白。或者，可通過凝膠遷移試驗(yàn)評估結(jié)合活性，其中放射性標(biāo)記的dna與測試多肽孵育。與未結(jié)合的dna相比，蛋白質(zhì)-dna復(fù)合物將較慢地通過凝膠移動(dòng)，導(dǎo)致遷移的條帶。通過將樣品與含量遞增的雙鏈或單鏈未標(biāo)記dna孵育并定量遷移的條帶中的放射性的量來評估結(jié)合量。

適用于本發(fā)明的結(jié)合結(jié)構(gòu)域以序列不依賴的方式結(jié)合雙鏈核酸，即本發(fā)明的結(jié)合結(jié)構(gòu)域以顯著的親和性結(jié)合雙鏈核酸，但是沒有已知核酸以相比具有相同核苷酸組成但不同核酸序列的另一核酸高超過100倍的親和力結(jié)合該結(jié)構(gòu)域?？墒褂妙愃朴诖_定雙鏈對比單鏈核酸結(jié)合的方法來測試非特異性結(jié)合?？扇缟衔乃鍪褂孟嗤塑账峤M成但不同核酸序列的競爭物dna來進(jìn)行過濾結(jié)合試驗(yàn)或凝膠遷移試驗(yàn)以確定結(jié)合特異性。

也可評價(jià)本發(fā)明使用的序列非特異性雙鏈核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域，例如，通過測試雙鏈結(jié)合結(jié)構(gòu)域增加修飾酶的持續(xù)合成能力或效率或提高核酸雙鏈的穩(wěn)定性至少1℃的能力。

本發(fā)明的結(jié)合結(jié)構(gòu)域還可通過直接評估這類結(jié)構(gòu)域穩(wěn)定雙鏈核酸構(gòu)象的能力來鑒定。例如，可通過監(jiān)測260nm處的dna的uv吸收在蛋白質(zhì)存在或不存在的情況下獲得引物-模板構(gòu)建體的解鏈曲線?？捎山怄溓€的中點(diǎn)確定雙鏈底物的tm?？呻S后通過比較經(jīng)修飾的酶存在的情況下獲得的tm與未修飾的酶存在的情況下獲得的tm來確定序列非特異性雙鏈核酸結(jié)合蛋白對于tm的影響。(該蛋白質(zhì)不顯著導(dǎo)致uv吸收，因?yàn)槠湓?60nm處的消光系數(shù)遠(yuǎn)低于dna)?？蛇x擇將tm提高1℃(通常提高5℃、10℃或更多)的結(jié)構(gòu)域用于本發(fā)明。

新型序列非特異性雙鏈核酸結(jié)合蛋白還可通過利用其dna結(jié)合活性來分離，例如通過在dna-纖維素柱上純化。分離的蛋白質(zhì)隨后可通過常規(guī)手段進(jìn)一步純化，測序，并使用pcr通過常規(guī)方法克隆基因。隨后可通過上文所述的任意方法測試由這些克隆過表達(dá)的蛋白質(zhì)。

dna聚合酶可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法接合至序列非特異性dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域。這些方法包括化學(xué)和重組手段。

例如，可如bioconjugatetechniques(《生物偶聯(lián)技術(shù)》)，hermanson編，學(xué)術(shù)出版公司(academicpress)(1996)所述進(jìn)行dna聚合酶對非特異性dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域的化學(xué)連接。接合可包括，例如，出于將2種蛋白質(zhì)互相連接的目的的衍生化，所述衍生化通過蛋白質(zhì)化學(xué)領(lǐng)域所熟知的方法以直接或通過連接化合物的方式進(jìn)行。例如，在一個(gè)化學(xué)偶聯(lián)實(shí)施方式中，連接催化結(jié)構(gòu)域和核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域的手段包括雜雙官能-偶聯(lián)劑，其最終導(dǎo)致在2個(gè)基團(tuán)之間形成分子間二硫鍵?？捎糜诒景l(fā)明的這種能力的其他類型的偶聯(lián)劑描述于，例如，美國專利號(hào)4,545,985?；蛘?，分子間二硫鍵可在各基團(tuán)中的半胱氨酸之間方便地形成，其是天然產(chǎn)生的或者通過遺傳工程改造插入的。連接基團(tuán)的手段也可使用雙官能交聯(lián)劑或特定低ph可切割交聯(lián)劑之間的硫醚連接或特定蛋白酶可切割接頭或其他可切割或不可切割化學(xué)連接。

將dna聚合酶連接至非特異性dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域也可包括在基團(tuán)之間形成肽基鍵，其通過標(biāo)準(zhǔn)肽合成化學(xué)或重組手段分開合成。也可使用化學(xué)方法來產(chǎn)生偶聯(lián)蛋白質(zhì)本身以整體或部分合成氨基酸序列。例如，可通過固相技術(shù)來合成肽，例如，merrifield固相合成方法，其中，向氨基酸的生長鏈連續(xù)加入氨基酸(參見，merrifield(1963)j.am.chem.soc.，85：2149-2146)。用于自動(dòng)化合成多肽的設(shè)備可購自供應(yīng)商如pe公司(加利福尼亞州福斯特城(fostercity，ca))并且一般可按照生產(chǎn)商的說明操作。然后合成的肽可從樹脂上切下，并且純化，例如，通過制備型高效液相色譜(參見creighton，proteinsstructuresandmolecularprinciples(《蛋白質(zhì)、結(jié)構(gòu)和分子原理》)，50-60(1983))。可通過氨基酸合成或測序來確認(rèn)合成多肽或多肽亞片段的組成(例如，埃得曼降解步驟；參見，creighton，proteins，structuresandmolecularprinciples(《蛋白質(zhì)、結(jié)構(gòu)和分子原理》)，第34-49頁(1983))。

另外，可以取代或添加向序列中導(dǎo)入非經(jīng)典氨基酸或化學(xué)氨基酸類似物。非經(jīng)典氨基酸一般包括但不限于：普通氨基酸的d-異構(gòu)體、α-氨基異丁酸、4-氨基丁酸、abu、2-氨基丁酸、γ-abu、ε-ahx、6-氨基己酸、aib、2-氨基異丁酸、3-氨基丙酸、鳥氨酸、正亮氨酸、正纈氨酸、羥基脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、磺基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、環(huán)己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟代-氨基酸、設(shè)計(jì)氨基酸如β-甲基氨基酸、cα-甲基氨基酸、nα-甲基氨基酸和氨基酸類似物。此外，氨基酸可以是d(右旋)或l(左旋)。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，dna聚合酶和非特異性dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域通過連接基團(tuán)接合。連接基團(tuán)可以是化學(xué)交聯(lián)劑，包括，例如琥珀酰亞胺基-(n-馬來酰亞胺甲基)-環(huán)己烷-1-羧酸酯(smcc)。連接基團(tuán)也可以是其他氨基酸序列，包括，例如，聚丙氨酸、聚甘氨酸或類似的連接基團(tuán)。

或者，在一些實(shí)施方式中，雜交聚合酶中各多肽的編碼序列在其氨基或羧基端通過任意順序的肽鍵接合?；蛘?，氨基酸接頭序列可用于將第一和第二多肽組件隔開足夠距離以確保各多肽折疊成其二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。這類氨基酸接頭序列整合至融合蛋白中。合適的肽接頭序列可基于以下因素選擇：(1)其采取撓性延伸構(gòu)象的能力；(2)其采取可與第一和第二多肽上功能性表位相互作用的二級(jí)結(jié)構(gòu)的能力；以及(3)缺少可與多肽功能性表位反應(yīng)的疏水性或帶電殘基。典型的肽接頭序列含有g(shù)ly、ser、val和thr殘基。其他的近中性氨基酸(如ala)也可用于接頭序列?？捎米鹘宇^的氨基酸序列包括下述中公開的那些：maratea等，(1985)gene40：39-46；murphy等，(1986)proc.natl.acad.sci.usa83：8258-8262；美國專利號(hào)4,935,233和4,751,180。該接頭序列的長度通?？梢允?至約50個(gè)氨基酸，例如長度為3、4、6或10個(gè)氨基酸，但長度也可以是100或200個(gè)氨基酸。當(dāng)?shù)谝缓偷诙嚯木哂锌捎糜诜指艄δ苄越Y(jié)構(gòu)域且阻止位阻干擾的非必需n端氨基酸區(qū)域時(shí)，可以不需要接頭序列。

其他化學(xué)接頭包括碳水化合物接頭、脂質(zhì)接頭、脂肪酸接頭、聚醚接頭，如peg，等。例如，聚(乙二醇)接頭可獲自阿拉巴馬州漢茨維爾的謝氏聚合物有限公司(shearwaterpolymers，inc.)。這些接頭任選具有酰胺鍵、巰基鍵或雜雙官能鍵。

連接dna聚合酶和非特異性dna接合結(jié)構(gòu)域的其他方法包括通過表達(dá)負(fù)電荷和正電荷尾部進(jìn)行離子結(jié)合和通過抗體和鏈霉親和素-生物素相互作用進(jìn)行間接結(jié)合。(參見，例如《生物偶聯(lián)技術(shù)》，同上)。結(jié)構(gòu)域也可通過中間相互作用序列接合在一起。例如，sso7d-相互作用序列，即結(jié)合sso7d的序列可接合至聚合酶。然后，所得的融合蛋白可被允許與sso7d非共價(jià)結(jié)合以生成sso7d-聚合酶偶聯(lián)物。

在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的雜交聚合酶通過編碼蛋白質(zhì)的核酸的重組表達(dá)產(chǎn)生?？赏ㄟ^由本領(lǐng)域已知的方法，在合適的編碼框架中將編碼所需氨基酸序列的合適核酸序列互相連接，并且通過本領(lǐng)域已知的方法表達(dá)產(chǎn)物來制備這種雜交聚合酶。

可使用重組遺傳領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)來獲得編碼待整合到本發(fā)明的雜交聚合酶的結(jié)構(gòu)域的核酸。公開本發(fā)明所用一般方法的基礎(chǔ)文本包括sambrook和russell，molecularcloning，alaboratorymanual(《分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊》)(第3版，2001)；kriegler，genetransferandexpression：alaboratorymanual(《基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)：實(shí)驗(yàn)室手冊》)(1990)；以及currentprotocolsinmolecularbiology(《新編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》)(ausubel等編，1994-1999))。

可使用多種方法中的任一種來獲得編碼dna聚合酶和非特異性dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域多肽的核酸序列。在一些實(shí)施方式中，通過與探針雜交從cdna和基因組dna文庫中克隆編碼多肽的核酸序列，或者使用寡核苷酸引物的擴(kuò)增技術(shù)分離。更常見的，使用擴(kuò)增技術(shù)采用dna或rna模板來擴(kuò)增并分離sso7和聚合酶序列(參見，例如，dieffenfach和dveksler，pcrprimers：alaboratorymanual(《pcr引物：實(shí)驗(yàn)室手冊》)(1995))?；蛘撸稍诤铣缮袭a(chǎn)生重疊寡核苷酸并且接合以產(chǎn)生結(jié)構(gòu)域中的一個(gè)或多個(gè)。也可使用抗體作為探針從表達(dá)文庫中分離編碼催化或雙鏈核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核酸。

在使用pcr獲得編碼dna聚合酶或非特異性dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核酸的實(shí)施例中，使用含有一個(gè)限制性位點(diǎn)的正義引物和含有另一個(gè)限制性位點(diǎn)的反義引物來pcr擴(kuò)增核酸序列或子序列。這將產(chǎn)生編碼所需結(jié)構(gòu)域序列或子序列并且具有末端限制性位點(diǎn)的核酸。該核酸然后可連接到含有編碼第二結(jié)構(gòu)域并具有合適的相應(yīng)限制性位點(diǎn)的核酸的載體中。結(jié)構(gòu)域可直接接合或可被接頭，或蛋白質(zhì)序列分隔。使用genbank或其他來源中提供的序列信息，本領(lǐng)域技術(shù)人員可確定合適的pcr引物。也可通過定點(diǎn)誘變向編碼蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)子序列的核酸中添加合適的限制性位點(diǎn)。含有結(jié)構(gòu)域編碼核苷酸序列或子序列的質(zhì)粒被合適的限制性內(nèi)切酶切割，并且然后連接至合適的載體用于按照標(biāo)準(zhǔn)方法擴(kuò)增和/或表達(dá)。

可使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)產(chǎn)生聚合酶?？墒褂弥亟M遺傳學(xué)領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)來獲得編碼聚合酶并且任選地連接至dna接合結(jié)構(gòu)域的核酸。根據(jù)待表達(dá)聚合酶的宿主細(xì)胞，可采用密碼子優(yōu)化來優(yōu)化聚合酶在特定宿主細(xì)胞中的表達(dá)。公開本發(fā)明所用一般方法的基礎(chǔ)文本包括sambrook和russell，molecularcloning，alaboratorymanual(《分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊》)(第3版，2001)；kriegler，genetransferandexpression：alaboratorymanual(《基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)：實(shí)驗(yàn)室手冊》)(1990)；以及currentprotocolsinmolecularbiology(《新編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》)(ausubel等編，1994-1999))。這類核酸還可通過體外擴(kuò)增方法獲得，例如描述于以下文獻(xiàn)中的那些：berger，sambrook，和ausubel，以及mullis等(1987)美國專利號(hào)4,683,202；pcrprotocolsaguidetomethodsandapplications(《pcr實(shí)驗(yàn)方法：方法和應(yīng)用指南》)(innis等編)學(xué)術(shù)出版社公司，加利福尼亞州圣地亞哥(1990)(innis)；arnheim和levinson(1990年10月1日)c&en36-47；thejournalofnihresearch(1991)3：81-94；kwoh等(1989)proc.natl.acad.sci.usa86：1173；guatelli等(1990)proc.natl.acad.sci.usa87,1874；lomell等(1989)j.clin.chem.，35：1826；landegren等(1988)science241：1077-1080；vanbrunt(1990)biotechnology8：291-294；wu和wallace(1989)gene4：560；以及barringer等(1990)gene89：117，其各自通過引用全文納入本文用于所有目的且尤其是所有涉及擴(kuò)增方法的教導(dǎo)。

還可向聚合酶進(jìn)行修飾而不降低其生物活性。可進(jìn)行一些修飾以促進(jìn)克隆、表達(dá)或?qū)⒔Y(jié)構(gòu)域整合至融合蛋白中。這類修飾為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知并且包括，例如，在編碼結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多核苷酸的一端添加密碼子(例如在氨基端添加甲硫氨酸)以提供起始位點(diǎn)，或?qū)㈩~外的氨基酸(如聚his)置于一端以建立方便地設(shè)置的限制性酶切位點(diǎn)或終止密碼子或純化序列。

在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了使用聚合酶在包含陽離子表面活性劑和陰離子表面活性劑，任選的兩性離子表面活性劑的反應(yīng)緩沖液中擴(kuò)增靶核酸的方法。這類擴(kuò)增反應(yīng)包括但不限于聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)?？墒褂帽景l(fā)明所述組合物進(jìn)行的聚合酶鏈反應(yīng)包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄pcr(rt-pcr)和定量pcr(qpcr)。

在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法可用于擴(kuò)增0.1-2kb、1-5kb、至少5kb、至少7kb、至少10kb、至少12kb或更大的擴(kuò)增子。

可使用反應(yīng)混合物來進(jìn)行擴(kuò)增方法，該反應(yīng)混合物足夠擴(kuò)增核酸分子(包含聚合酶)以及陽離子表面活性劑和陰離子表面活性劑。另外，在一些實(shí)施方式中，擴(kuò)增反應(yīng)混合物包含以下組分中的至少一種或多種：核苷酸三磷酸酯、一種或多種寡核苷酸引物、鹽、緩沖劑、水、穩(wěn)定劑和dna-結(jié)合染料。

在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的擴(kuò)增方法包括使用聚合酶和改善擴(kuò)增特異性的試劑，例如，選自精氨酸、亞精胺和精胺的試劑。在一些實(shí)施方式中，除dna聚合酶或雜交聚合酶以外，擴(kuò)增反應(yīng)混合物包含以下組分中的一種或多種：核苷酸三磷酸酯、一種或多種寡核苷酸引物、鹽、緩沖劑、水、穩(wěn)定劑和dna-結(jié)合染料；以及選自精氨酸、亞精胺或精胺的試劑。

在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的擴(kuò)增反應(yīng)混合物包含：例如本文所述的濃度的陰離子表面活性劑和陽離子表面活性劑，例如本文所述的濃度的任選的兩性離子表面活性劑，約1u/ml至約75u/ml濃度的聚合酶(例如，約1u/ml、5u/ml、10u/ml、15u/ml、20u/ml、25u/ml、30u/ml、35u/ml、40u/ml、45u/ml、50u/ml、55u/ml、60u/ml、65u/ml、70u/ml、或75u/ml)；約0.1mm至約10mm濃度的dntp(例如，約0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、或10mm)；約1mm至約20mm的鎂，例如mgcl2(例如，約1mm、1.5mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、11mm、12mm、13mm、14mm、15mm、16mm、17mm、18mm、19mm、或20mm)；約10mm至約100mm濃度的(nh4)28o4(例如，約10mm、15mm、20mm、30mm、40mm、50mm、60mm、70mm、80mm、90mm、或100mm)；約50mm至約200mm濃度的鉀，例如kcl(例如，約50mm、60mm、70mm、80mm、90mm、100mm、110mm、120mm、130mm、140mm、150mm、160mm、170mm、180mm、190mm、或200mm)；約20mm至約200mm濃度的緩沖劑，例如trisph8.5-9.5(例如，約50mm、60mm、70mm、80mm、90mm、100mm、110mm、120mm、130mm、140mm、150mm、160mm、170mm、180mm、190mm、或200mm)。任選地，反應(yīng)混合物還可包含下列的一種或多種：約100mm至約500mm濃度的二糖，例如，海藻糖(例如，約100mm、125mm、150mm、175mm、200mm、225mm、250mm、275mm、300mm、325mm、350mm、375mm、400mm、425mm、450mm、475mm、或500mm)；約50mm至約200mm濃度的一種或多種滲透物，例如，肌氨酸、三甲基胺n-氧化物(tmao)、二甲基磺丙酸酯、和三甲基甘氨酸(例如，約50mm、60mm、70mm、80mm、90mm、100mm、110mm、120mm、130mm、140mm、150mm、160mm、170mm、180mm、190mm、或200mm)；約1％至約10％濃度的dmso(例如，約1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、或10％)；約0.001％至約0.01％濃度的熒光素(例如，約0.001％、0.002％、0.003％、0.004％、0.005％、0.006％、0.007％、0.008％、0.009％、或0.01％)；約0.5倍至約5倍濃度的dna結(jié)合染料(例如，花青染料)(例如，約0.5倍、0.6倍、0.7倍、0.8倍、0.9倍、1倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、或5倍)；和任選的約1mm至約100mm濃度的精氨酸、亞精胺、或精胺或其鹽(例如，約1mm、5mm、10mm、15mm、20mm、25mm、30mm、35mm、40mm、45mm、50mm、55mm、60mm、65mm、70mm、75mm、80mm、85mm、90mm、95mm、或100mm)。

除了包含上述濃度成分的反應(yīng)混合物以外，還提供了包含上述成分中的全部或一些的母液，其中母液中的所有成分是上述濃度的2倍、3倍、5倍、10倍、20倍、25倍、50倍、100倍、或其他倍數(shù)，使得可以最終反應(yīng)混合物的總體積的部分添加小量的母液。例如，在一些實(shí)施方式中，在母液中可包括如上所所列的陽離子表面活性劑、陰離子表面活性劑、核苷酸(例如，dntp)、緩沖劑、鎂和鉀源、以及任選的硫酸銨源和/或兩性離子表面活性劑的母液。在一些實(shí)施方式中，母液中也包括聚合酶，或者，包括在第二容器中，使得可在待進(jìn)行反應(yīng)時(shí)添加聚合酶。

在一些實(shí)施方式中，擴(kuò)增反應(yīng)還包括添加劑以改善效率。已顯示滲透物家族的成員能夠改善蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性(santoro，biochemistry，1992)并降低dna雙螺旋穩(wěn)定性(chadalavada，febsletters，1997)。在一些實(shí)施方式中，滲透物是由活的生物體響應(yīng)環(huán)境應(yīng)激如極端溫度、脫水或鹽度而產(chǎn)生的小分子或化合物，保護(hù)其細(xì)胞組分并幫助維持最佳細(xì)胞溶質(zhì)條件。本發(fā)明中使用的滲透物可包括但不限于：肌氨酸、三甲胺n-氧化物(tmao)、二甲基磺丙酸酯(dimethylsulfoniopropionate)和三甲基甘氨酸。肌氨酸在化學(xué)上類似于甜菜堿，一種已被證明改善常規(guī)pcr的化學(xué)品(henke，nucleicacidsresearch，1997)。

在滲透劑的常規(guī)應(yīng)用中，這類混合物的穩(wěn)定化作用通常在較高的濃度(>1m)下觀察到。然而，在本發(fā)明的方法中，發(fā)現(xiàn)毫摩爾濃度的滲透劑能夠有效地改善擴(kuò)增反應(yīng)(如qpcr)的反應(yīng)效率。不受作用機(jī)制的限制，對于含有低濃度的輸入dna樣品的反應(yīng)而言，效率上的改善可能是由于改善dna聚合酶對dna模板的靶向區(qū)域的可及性。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法和試劑盒中使用濃度為約100至約1000mm的滲透劑。在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法和試劑盒中使用濃度為約50至約700、約100至約600、約150至約500、約200至約400mm，和約300至約350mm的滲透劑。在一些實(shí)施方式中，使用的滲透物是。

可用本文所述的反應(yīng)混合物來進(jìn)行多種擴(kuò)增方法。這類擴(kuò)增反應(yīng)方法可包括但不限于聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)、dna連接酶鏈反應(yīng)(lcr)、qbetarna復(fù)制酶和基于rna轉(zhuǎn)錄(如tas和3sr)的擴(kuò)增反應(yīng)以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他反應(yīng)?？墒褂帽景l(fā)明所述反應(yīng)混合物進(jìn)行的聚合酶鏈反應(yīng)包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄pcr(rt-pcr)和定量pcr(qpcr)。

在一些實(shí)施方式中，該pcr是定量pcr，其中實(shí)時(shí)監(jiān)測擴(kuò)增子的累積(即連續(xù)地，例如每個(gè)循環(huán)一次，而非僅在完成擴(kuò)增后)。定量擴(kuò)增方法(例如，定量pcr或定量線性擴(kuò)增)可涉及擴(kuò)增核酸模板，直接或間接確定(例如，確定ct值)擴(kuò)增的dna的量，然后基于擴(kuò)增循環(huán)數(shù)計(jì)算初始模板的量。使用反應(yīng)擴(kuò)增dna基因座是熟知的(參見美國專利號(hào)4,683,195和4,683,202；《pcr方案：方法和應(yīng)用指南》(pcrprotocols：aguidetomethodsandapplications)(innis等編，1990))。通常，使用pcr來擴(kuò)增dna模板。然而，替代性擴(kuò)增方法已有描述且也可使用，前提是與擴(kuò)增切割的dna的方法相比，這些替代性方法以較高的程度擴(kuò)增完整的dna。定量擴(kuò)增的方法公開于，例如，美國專利號(hào)6,180,349；6,033,854；和5,972,602，以及例如，gibson等，genomeresearch6：995-1001(1996)；degraves等，biotechniques34(1)：106-10，112-5(2003)；deimanb等，molbiotechnol.20(2)：163-79(2002)。

在一些實(shí)施方式中，定量擴(kuò)增是基于監(jiān)測代表擴(kuò)增(例如pcr)反應(yīng)循環(huán)中模板拷貝的信號(hào)(例如探針的熒光)。在pcr的初始循環(huán)中，由于形成的擴(kuò)增子的量不能支持來自試驗(yàn)的可測量的信號(hào)輸出，觀察到非常低的信號(hào)。在初始循環(huán)之后，隨著形成的擴(kuò)增子的量增加，信號(hào)強(qiáng)度增加至可測量的水平并在后續(xù)循環(huán)中達(dá)到平臺(tái)(此時(shí)pcr進(jìn)入非對數(shù)期)。通過信號(hào)強(qiáng)度對循環(huán)次數(shù)作圖，從pcr反應(yīng)獲得可測量的信號(hào)的特定循環(huán)可以推導(dǎo)和用于倒推計(jì)算pcr開始之前靶標(biāo)的量。該方法確定的特定循環(huán)的次數(shù)通常稱為循環(huán)閾值(ct)。示例性的方法描述于例如heid等，genomemethods6：986-94(1996)，參照水解探針。

一種檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的方法是5′-3′外切核酸酶“水解”pcr試驗(yàn)(有時(shí)也稱為taqman^tm試驗(yàn))(美國專利號(hào)5,210,015和5,487,972；holland等，pnasusa88：7276-7280(1991)；lee等，nucleicacidsres.21：3761-3766(1993))。該試驗(yàn)通過擴(kuò)增反應(yīng)期間雙重標(biāo)記的熒光探針(如″taqman^tm探針)的雜交和切割檢測產(chǎn)生的特定pcr產(chǎn)物的累積。熒光探針由用熒光報(bào)告染料和淬滅染料雙重標(biāo)記的寡核苷酸組成。pcr期間，當(dāng)且僅當(dāng)該探針與正在擴(kuò)增的片段雜交，則該探針被dna聚合酶的5′-3’外切核酸酶活性切割。探針的切割導(dǎo)致報(bào)告染料的熒光強(qiáng)度增加。

依賴于使用能量轉(zhuǎn)移的檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的另一種方法是“信標(biāo)探針”方法，描述于tyagi和kramer，naturebiotech.14：303-309(1996)，其也是美國專利號(hào)5,119,801和5,312,728的主題。該方法使用能夠形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的寡核苷酸雜交探針。在雜交探針的一端上(5′或3′端)存在供體熒光團(tuán)，且在另一端上存在受體部分。在tyagi和kramer方法中，該受體部分是淬滅劑，即該受體吸收由供體釋放的能量，但隨后其本身不產(chǎn)生熒光。因此，當(dāng)信標(biāo)處于開放構(gòu)象時(shí)，供體熒光團(tuán)的熒光是可檢測的，而當(dāng)信標(biāo)處于發(fā)夾(閉合)構(gòu)象時(shí)，供體熒光團(tuán)的熒光被淬滅。應(yīng)用于pcr時(shí)，與pcr產(chǎn)物的一條鏈雜交的分子信標(biāo)探針處于開發(fā)構(gòu)象并檢測到熒光，而保持未雜交的那些不會(huì)產(chǎn)生熒光(tyagi和kramer，naturebiotechnol.14：303-306(1996))。結(jié)果，熒光的量將隨著pcr產(chǎn)物的量的增加而增加，因而可用作pcr進(jìn)程的測量。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解定量擴(kuò)增的其他方法也是可得的。

用于進(jìn)行核酸定量擴(kuò)增的多種其他技術(shù)也是已知的。例如，一些方法采用一種或多種結(jié)構(gòu)化后使得寡核苷酸雜交至靶核酸時(shí)產(chǎn)生熒光變化的探針寡核苷酸。例如，一種這樣的方法包括利用熒光能量共振轉(zhuǎn)移(fret)的二元熒光團(tuán)方法，例如lightcycler^tm雜交探針，其中兩個(gè)寡探針與擴(kuò)增子退火。寡核苷酸設(shè)計(jì)成在離開與高效的能量轉(zhuǎn)移相容的距離處以頭-尾取向與熒光團(tuán)雜交。結(jié)構(gòu)化形成當(dāng)與核酸結(jié)合或者摻入延伸產(chǎn)物中時(shí)發(fā)射信號(hào)的標(biāo)記的寡核苷酸的其他例子包括：scorpions^tm探針(例如，whitcombe等，naturebiotechnology17：804-807，1999，和美國專利號(hào)6,326,145)，sunrise^tm(或amplifiuor^tm)探針(例如，nazarenko等，nuc.acidsres.25：2516-2521，1997，和美國專利號(hào)6,117,635)，以及形成次級(jí)結(jié)構(gòu)導(dǎo)致信號(hào)降低而沒有淬滅劑并且與靶標(biāo)雜交時(shí)發(fā)射信號(hào)增強(qiáng)的探針(例如luxprobes^tm)。

在一些實(shí)施方式中，該pcr反應(yīng)混合物不包含經(jīng)標(biāo)記的探針寡核苷酸。例如，該反應(yīng)混合物缺少用于監(jiān)測擴(kuò)增子的實(shí)時(shí)或末端累積的taqman或其他標(biāo)記的寡核苷酸探針。在這些實(shí)施方式的一些中，包含嵌入熒光染料。在一些實(shí)施方式中，與單鏈核酸相比，在與雙鏈核酸結(jié)合時(shí)，該嵌入染料改變信號(hào)(提高或降低)。示例性的試劑包括sybrgreen^tm、sybrgold^tm和evagreen^tm。由于這些試劑不是模板特異性的，推定基于模板特異性擴(kuò)增產(chǎn)生信號(hào)。這可以通過監(jiān)測溫度導(dǎo)致的信號(hào)變化得到證實(shí)，因?yàn)槟０逍蛄械娜埸c(diǎn)通常比例如引物-二聚體、非特異性擴(kuò)增序列等高很多或與之不同。

在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供可用于進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)的試劑盒。該試劑盒包含陽離子表面活性劑和陰離子表面活性劑，一般在相同溶液中。該溶液還可包含緩沖劑(例如，tris)、鎂和鉀以及核苷酸(dntp)。該溶液還可任選地包含本文所述的兩性離子表面活性劑。在一些實(shí)施方式中，試劑盒還包含在相同溶液或分開溶液或分開容器中的本文所述的dna聚合酶。如上所述，在一些實(shí)施方式中，包含陽離子表面活性劑和陰離子表面活性劑的溶液是母液，并且因此成分濃度是反應(yīng)混合物最終所需濃度的多倍(例如，2倍、5倍、10倍等)。

任選地，試劑盒包含雙鏈dna結(jié)合染料。這類試劑盒也可包含穩(wěn)定劑和其他添加劑(例如，肌氨酸)以提高擴(kuò)增反應(yīng)的效率。這類試劑盒還可包含一種或多種引物以及使用試劑盒的組分進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)的指南。任選地，試劑盒還可包含足量的試劑以提高核酸擴(kuò)增的特異性。例如，在一些實(shí)施方式中，該試劑選自精氨酸(例如，l-精氨酸或d-精氨酸)、亞精胺、和精胺、或其鹽。

實(shí)施例

提供以下實(shí)施例用于說明而非限制本發(fā)明所要求的權(quán)利。

測試了各種表面活性劑對pcr反應(yīng)混合物中聚合酶活性和產(chǎn)率的影響。在多種反應(yīng)混合物中配制衍生自2個(gè)親本聚合酶pfu和deepvent并且與sso7d融合的聚合酶以鑒定改善pcr產(chǎn)率的反應(yīng)組分。

測試了包含聚合酶，tris-hclph9.0，kcl，硫酸銨，20ng模板dna和靶標(biāo)引物的反應(yīng)混合物，其中添加下述一種或多種其他組分(結(jié)果示于圖1)：

表1

如圖1所示，雖然sds(一種陰離子表面活性劑)和ctab(一種陽離子表面活性劑)各自單獨(dú)并不改善pcr產(chǎn)率，這兩種表面活性劑的組合令人驚訝地導(dǎo)致pcr產(chǎn)率增加(參見圖1的泳道7-8)。

測試了ctab和sds的濃度范圍并且也測試了其他組分如辛基b-d-吡喃葡糖苷(ogp)和牛血清白蛋白(bsa)。參見圖2。下表2中表述了圖2的泳道：

表2

鑒于包含sds和ctab的反應(yīng)混合物令人驚訝的成功，生成了5倍母液。然而，在一些情況中，在母液中形成沉淀。為了解決沉淀，向5倍母液中添加兩性離子表面活性劑chaps并且這防止沉淀形成。例如，當(dāng)5倍母液含有1％chaps時(shí)，在母液中沒有觀察到沉淀。另外，當(dāng)在pcr反應(yīng)中使用包含0.05％sds和0.05％ctab的5倍母液時(shí)，成功生成2和5kb擴(kuò)增子，表明chaps的存在在該濃度下并不干擾pcr(數(shù)據(jù)未顯示)。

應(yīng)理解，本文所述的實(shí)施例和實(shí)施方式僅用于說明目的，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解據(jù)此作出的各種修飾或改變，且它們包括在本申請的主旨和權(quán)益以及所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。本文引用的所有發(fā)表物、專利和專利申請通過引用全文納入本文以用于所有目的。