相關申請的交叉引用本申請要求于2014年10月24日提交的美國臨時申請62/068,294的優(yōu)先權權益，該申請在此以引用方式并入。本發(fā)明涉及在醇生產，特別是在用于生物燃料生產的生物乙醇生產中使用的三肽基肽酶。
背景技術：
：蛋白酶(與肽酶同義)是能夠在底物肽、低聚肽和/或蛋白質中切割氨基酸之間的肽鍵的酶。蛋白酶基于其催化反應機制和涉及催化用活性位點的氨基酸殘基而被分成7個家族。絲氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶為4個主要家族，而蘇氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶和未分組的蛋白酶構成其余的3個家族。通常根據優(yōu)先切割的底物中特定氨基酸之間的鍵來定義蛋白酶的底物特異性。通常，底物肽中的氨基酸位置相對于易裂鍵的位置(即，蛋白酶切割的位置)來定義：nh2-……p3-p2-p1*p1’-p2’-p3’……-cooh使用以上假設的肽示出，易裂鍵以星號(*)表示，而氨基酸殘基以字母“p”表示，殘基n-末端相對于易裂鍵以p1開始并且在從易裂鍵離開移向n-末端時數量越來越大。氨基酸殘基c-末端相對于易裂鍵以p1’開始，并且移向c-末端殘基的數量增大。蛋白酶通常也可基于其底物特異性而被細分為兩大類。第一類為內切蛋白酶，其為能夠切割肽或蛋白質底物的內部肽鍵并趨于遠離n-末端或c-末端起作用的蛋白分解肽酶。內切蛋白酶的示例包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和胃蛋白酶。相比之下，第二類蛋白酶是切割位于接近蛋白質或肽底物的c-末端或n-末端的氨基酸之間的肽鍵的外肽酶。外肽酶類中的某些酶可具有三肽基肽酶活性。此類酶因而能夠從底物肽、低聚肽和/或蛋白質的未取代的n-末端切割3個氨基酸片段(三肽)。已知三肽基肽酶從底物的n-末端切割三肽序列，但除在p1和/或p1’位置處具有脯氨酸的鍵之外。另選地，三肽基肽酶可以是脯氨酸特異性的，并且僅能夠切割相對于易裂鍵具有脯氨酸殘基n-末端(即，在p1位置中)的底物。技術實現(xiàn)要素：在廣義方面，本發(fā)明提供了用于制備醇的方法，該方法包括：(a)混合包含以下氨基酸序列的三肽基肽酶：選自seqidno.29、seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4、seqidno.5、seqidno.6、seqidno.7、seqidno.8、seqidno.9、seqidno.10、seqidno.11、seqidno.12、seqidno.13、seqidno.14、seqidno.15、seqidno.16、seqidno.17、seqidno.18、seqidno.19、seqidno.20、seqidno.21、seqidno.22、seqidno.23、seqidno.24、seqidno.25、seqidno.26、seqidno.27、seqidno.28、seqidno.30、seqidno.31、seqidno.32、seqidno.33、seqidno.34、seqidno.35、seqidno.36、seqidno.37、seqidno.38、seqidno.39、seqidno.40、seqidno.41、seqidno.42、seqidno.43、seqidno.44、seqidno.45、seqidno.46、seqidno.47、seqidno.48、seqidno.49、seqidno.50、seqidno.51、seqidno.52、seqidno.53、seqidno.54、seqidno.55中的一個或多個氨基酸序列或它們的功能性片段或與其具有至少70％的同一性的氨基酸序列；或者由以下核苷酸序列表達的三肽基肽酶：選自seqidno.56、seqidno.57、seqidno.58、seqidno.59、seqidno.60、seqidno.61、seqidno.62、seqidno.63、seqidno.64、seqidno.65、seqidno.66、seqidno.67、seqidno.68、seqidno.69、seqidno.70、seqidno.71、seqidno.72、seqidno.73、seqidno.74、seqidno.75、seqidno.76、seqidno.77、seqidno.78、seqidno.79、seqidno.80、seqidno.81、seqidno.82、seqidno.83、seqidno.84、seqidno.85、seqidno.86、seqidno.87、seqidno.88、seqidno.89、seqidno.90、seqidno.91、seqidno.92、seqidno.93、seqidno.94或seqidno.95的核苷酸序列中的一種或多種，或與其具有至少70％同一性的核苷酸序列，或因遺傳密碼的簡并性而不同于這些核苷酸序列的核苷酸序列，或在中等或高嚴格條件下雜交的核苷酸序列；以及(b)回收醇。在第一方面，本發(fā)明提供了用于制備醇的方法，該方法包括：(a)將主要具有外肽酶活性的三肽基肽酶與原料或其級分在所述原料或級分發(fā)酵之前、期間或之后混合；以及(b)回收醇。在第二方面，本發(fā)明提供了主要具有外肽酶活性的三肽基肽酶用于在醇的制造中提高醇的收率的用途。在第三方面，本發(fā)明提供了主要具有外肽酶活性的一種或多種三肽基肽酶用于在醇的制造中提高產醇宿主的發(fā)酵能力的用途。在第四方面，本發(fā)明提供了通過本發(fā)明的方法可獲得的(或獲得的)醇生產的副產物。附圖說明現(xiàn)在將參考附圖而僅以舉例的方式描述本發(fā)明的實施方案，其中：圖1示出在200ppm脲發(fā)酵中對肽酶而言的乙醇水平。圖2示出雙劑量發(fā)酵中的乙醇水平。圖3示出對不同蛋白酶的發(fā)酵中的葡萄糖水平。圖4示出相比于蛋白酶以400ppm脲發(fā)酵的乙醇水平。圖5示出400ppm脲發(fā)酵的發(fā)酵后期乙醇水平。圖6示出采用添加的三肽基肽酶發(fā)酵的乙醇水平。圖7示出發(fā)酵中的總葡萄糖釋放。圖8示發(fā)酵和不同的蛋白酶處理中的小糖的濃度。圖9示出三肽基肽酶單獨或與(酸性真菌內切蛋白酶)組合對乙醇收率的影響。圖10示出雙劑量發(fā)酵速率比較結果。圖11示出表達載體pttt-tri083的質粒圖譜。圖12示出表達載體pttt-pyrg13-tri071的質粒圖譜。內源性的信號序列被來自里氏木霉(trichodermareesei)酸性真菌蛋白酶(afp(獲得于genencordivision,foodenzymes))的分泌信號序列和來自里氏木霉葡糖淀粉酶基因(trga1)的內含子替代(參見圖12的下部)。圖13示出多個三肽基肽酶氨基酸序列之間的比對。示出xeanld、y’tzx’g和qnfsv基序(加框)。具體實施方式本發(fā)明的一項重要發(fā)現(xiàn)在于在醇生產期間使用主要具有外肽酶活性的三肽基肽酶來提高醇的收率。此外或另選地，另一項發(fā)現(xiàn)在于在醇生產期間使用主要具有外肽酶活性的三肽基肽酶來提高產醇宿主的發(fā)酵能力?；谶@些發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了用于制備醇的方法，該方法包括：(a)將主要具有外肽酶活性的三肽基肽酶與原料或其級分在所述原料或級分發(fā)酵之前、期間或之后混合；以及(b)回收醇。如本文所用，術語“醇”是指作為生物發(fā)酵過程的結果產生的任何醇。醇可例如為乙醇和/或丁醇。優(yōu)選地，醇可例如為生物燃料，諸如生物乙醇。本發(fā)明的方法包括用于回收醇的步驟。術語“醇的回收”或“回收醇”是指醇的純化和/或分離。適當地，回收步驟產生基本上不含其它組分(例如污染物)的醇。因此，回收可產生至少約90％純度，適當地至少約95％純度，更適當地至少99％純度的醇。優(yōu)選地，回收可產生至少約99.9％純度的醇。醇的回收可通過本領域的技術人員已知的任何方法實現(xiàn)。在一個實施方案中，可對醇進行蒸餾。如本文所用，術語“混合”是指混合一種或多種成分和/或酶，其中一種或多種成分或酶以任何次序和任何組合添加。適當地，混合可涉及同時或順序地混合一種或多種成分和/或酶。在一個實施方案中，可順序地混合一種或多種成分和/或酶。優(yōu)選地，可同時混合一種或多種成分和/或酶。在一個實施方案中，在本發(fā)明的方法和/或用途中使用的三肽基肽酶可在至少約25℃的溫度下與底物(例如，蛋白質和/或肽底物)一起溫育。換句話講，本發(fā)明的方法可在至少約25℃的溫度下進行。適當地，三肽基肽酶可在至少約30℃，適當地至少約35℃的溫度下與底物一起溫育。在一個實施方案中，在本發(fā)明的方法和/或用途中使用的三肽基肽酶可在約25℃至約40℃的溫度，適當地在約25℃至約35℃的溫度下與底物一起溫育。在另一個實施方案中，在本發(fā)明的方法和/或用途中使用的三肽基肽酶可在約40℃至約70℃的溫度下與底物(例如，蛋白質和/或肽底物)一起溫育。換句話講，本發(fā)明的方法可在約40℃至約70℃的溫度下進行。適當地，三肽基肽酶可在約40℃至約65℃的溫度，更適當地在約45℃至約65℃的溫度下與底物一起溫育。優(yōu)選地，三肽基肽酶可在約50℃至約60℃的溫度下與底物一起溫育。術語“三肽基肽酶”是指主要具有外肽酶活性并且能夠從蛋白質、低聚肽和/或肽底物的n-末端切割三肽的蛋白酶。在一個實施方案中，三肽基肽酶不為內切蛋白酶。在另一個實施方案中，三肽基肽酶不為從底物的n-末端切割四肽的酶。在另一個實施方案中，三肽基肽酶不為從底物的n-末端切割二肽的酶。在另一個實施方案中，三肽基肽酶不為從底物的n-末端切割單個氨基酸的酶。三肽基肽酶可切割存在于原料中的蛋白質和/或肽底物以釋放三肽，令人驚奇地，這可在發(fā)酵期間增加醇的產量。因此，在另一方面，本發(fā)明提供了主要具有外肽酶活性的三肽基肽酶用于在醇的制造中提高醇的收率的用途。使用三肽基肽酶的另一個優(yōu)點在于其用途可提高產醇宿主在醇生產期間的發(fā)酵能力。因此，在另一方面，本發(fā)明提供了主要具有外肽酶活性的三肽基肽酶用于在醇的制造中提高產醇宿主的發(fā)酵能力的用途。在一個實施方案中，根據本發(fā)明使用的三肽基肽酶可為s53家族的外切-三肽基肽酶。如本文所用，術語“s53家族的外切-三肽基肽酶”是指主要具有外肽酶活性并且具有從蛋白質和/或肽底物的n-末端切割三肽的能力的蛋白酶。s53家族肽酶廣義地涵蓋絲氨酸蛋白酶類。雖然s53家族包括內切蛋白酶和外肽酶兩者，但本文預期該定義僅指主要具有外肽酶活性的那些三肽基肽酶。在本文教導的“外肽酶廣泛特異性測定”(ebsa)中，“s53家族的外切-三肽基肽酶”具有至少約50nkat/mg蛋白質的活性。適當地，在本文教導的ebsa活性測定中，根據本發(fā)明的“s53家族的外切-三肽基肽酶”具有約50-2000nkat/mg蛋白質的活性。在一個實施方案中，三肽基肽酶可為“耐脯氨酸三肽基肽酶”，在本文也稱為3pp。如本文所用，術語“耐脯氨酸三肽基肽酶”是指可從肽、低聚肽和/或蛋白質底物的n-末端切割三肽的外肽酶?！澳透彼崛幕拿浮蹦軌蚯懈罡彼崽幱谖恢胮1的肽鍵以及切割除脯氨酸之外的氨基酸處于p1的肽鍵，和/或能夠切割脯氨酸處于位置p1’的肽鍵以及切割除脯氨酸之外的氨基酸處于p1’的肽鍵。有利地，在本發(fā)明中使用的三肽基肽酶(例如，耐脯氨酸三肽基肽酶)可對在p1和/或p1’處具有脯氨酸以及在p1和/或p1’處具有任何其它氨基酸的底物具有活性。這是非常令人驚奇的，因為本領域已記載的三肽基肽酶通常在脯氨酸處于p1時受到抑制或者在脯氨酸處于p1時呈活性，但在除脯氨酸之外的氨基酸存在于底物中的位置p1時失活，這有時在本文稱為脯氨酸特異性三肽基肽酶。進一步有利地，具有此類活性的三肽基肽酶(例如，耐脯氨酸三肽基肽酶)能夠對寬泛范圍的肽和/或蛋白質底物起作用，并且由于具有此類廣泛的底物特異性不易于抑制切割富含某些氨基酸(例如，脯氨酸和/或賴氨酸和/或精氨酸和/或甘氨酸)的底物。使用此類耐脯氨酸三肽基肽酶因而可有效和/或快速降解蛋白質底物(例如，存在于底物中以制備水解產物)。適當地，在本發(fā)明的方法和/或用途中使用的三肽基肽酶(例如，耐脯氨酸三肽基肽酶)能夠從在p1處具有脯氨酸；以及在p1處具有選自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸或合成氨基酸的氨基酸的肽的n-末端切割三肽。另選地或除此之外，在本發(fā)明的方法中使用的三肽基肽酶(例如，耐脯氨酸三肽基肽酶)能夠從在p1’處具有脯氨酸；以及在p1’處具有選自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸或合成氨基酸的氨基酸的肽的n-末端切割三肽。在一個實施方案中，三肽基肽酶(例如，耐脯氨酸三肽基肽酶)能夠切割脯氨酸處于位置p1的肽鍵以及切割除脯氨酸之外的氨基酸處于p1的肽鍵。在另一個實施方案中，三肽基肽酶(例如，耐脯氨酸三肽基肽酶)能夠切割脯氨酸處于位置p1’的肽鍵以及切割除脯氨酸之外的氨基酸處于p1’的肽鍵。適當地，三肽基肽酶(例如，耐脯氨酸三肽基肽酶)還能夠切割其中存在于位置p1和/或p1’處的脯氨酸以其順式或反式構型存在的肽鍵。適當地，“除脯氨酸之外的氨基酸”可為選自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸或合成氨基酸的氨基酸。在另一個實施方案中，“除脯氨酸之外的氨基酸”可為選自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸或纈氨酸的氨基酸。適當地，在此類實施方案中，合成氨基酸可排除在外。優(yōu)選地，耐脯氨酸三肽基肽酶可能能夠切割其中脯氨酸存在于位置p1和/或p1’處的肽鍵。令人驚奇地是，三肽基肽酶可對在位置p1和/或p1’處具有脯氨酸的底物起作用。甚至更令人驚奇地是，除了該活性之外，三肽基肽酶還可當除脯氨酸之外的氨基酸存在于位置p1和/或p1’時具有活性。除對如上所述的任何各種物質具有活性之外，在本發(fā)明中使用的三肽基肽酶(例如，耐脯氨酸三肽基肽酶)另外可耐受選自以下的一個或多個位置處的脯氨酸：p2、p2’、p3和p3’。適當地，除具有上述活性之外，三肽基肽酶(例如，耐脯氨酸三肽基肽酶)還可耐受位置p2、p2’、p3和p3’處的脯氨酸。這是有利的，因為其允許有效地切割具有脯氨酸區(qū)段的肽和/或蛋白質底物并允許切割寬泛范圍的肽和/或蛋白質底物。三肽基肽酶(例如，耐脯氨酸三肽基肽酶)可對在p1位置處具有一個或多個賴氨酸、精氨酸或甘氨酸的肽和/或蛋白質具有優(yōu)先活性。不受理論的束縛，通常就多種三肽基肽酶和/或蛋白酶而言，在p1位置處包含這些氨基酸的肽和/或蛋白質底物可能難以消化，并且在遇到此類殘基時，三肽基肽酶和/或蛋白酶對肽和/或蛋白質底物的切割可停止或減慢。有利地，利用本發(fā)明的三肽基肽酶(例如，耐脯氨酸三肽基肽酶)可以有效地消化在p1處包含賴氨酸、精氨酸和/或甘氨酸的蛋白質和/或肽底物。適當地，三肽基肽酶(例如，耐脯氨酸三肽基肽酶)可對在p1位置處具有賴氨酸的肽和/或蛋白質具有優(yōu)先活性。有利地，這允許有效地切割賴氨酸含量較高的底物，諸如乳清蛋白。在一個實施方案中，三肽基肽酶(例如，耐脯氨酸三肽基肽酶)可包含氨基酸絲氨酸、天冬氨酸鹽和組氨酸的催化三聯(lián)體。本發(fā)明中使用的三肽基肽酶可為熱穩(wěn)定的三肽基肽酶。術語“熱穩(wěn)定的”意指當酶加熱至高達約60℃的溫度時保持其活性。適當地，“熱穩(wěn)定的”可意指當酶加熱至約65℃，更適當地約70℃時保持其活性。在另一個實施方案中，“熱穩(wěn)定的”意指當酶加熱至高達約75℃的溫度時保持其活性。適當地，“熱穩(wěn)定的”可意指當酶加熱至約80℃，更適當地約90℃時保持其活性。有利地，當與非熱穩(wěn)定的變體相比時，熱穩(wěn)定的三肽基肽酶不易于變性(例如，當在發(fā)酵前添加至原料時)和/或在經受升高的溫度時將在較長時間段內保持其活性。本發(fā)明中使用的三肽基肽酶可在約ph2至約ph8的范圍內具有活性。適當地，三肽基肽酶可在約ph4至約ph8的范圍內，更適當地在約ph4.5至約ph6.5的范圍內具有活性。適當地，本發(fā)明的方法可在2至約7的ph下進行。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法可在約4至約7(例如4.5至6.5)的ph下進行。使用在ph4至約ph7的ph范圍內具有活性的三肽基肽酶是有利的，因為其允許三肽基肽酶與在該ph范圍內具有活性的一種或多種內切蛋白酶一起使用。當使用在約ph4至約ph7的ph范圍內具有活性的三肽基肽酶時，適當地，其可與中性或堿性的內切蛋白酶組合使用。有利地，這意指在酶處理之間不必改變用于產生水解產物的包含蛋白質和/或肽底物的反應培養(yǎng)基的ph。換句話講，其允許三肽基肽酶和內切蛋白酶同時添加到反應物中，這可使得產生水解產物的過程更快和/或更有效和/或更節(jié)約成本。此外，這允許更有效的反應，因為在較低的ph值下，底物可從溶液中沉淀出來并因此未被切割?？稍诒景l(fā)明中使用任何合適的堿性內切蛋白酶。在一個實施方案中，堿性內切蛋白酶可為酶的絲氨酸蛋白酶家族的成員(ec3.4.21)。絲氨酸蛋白酶具有引發(fā)蛋白質的肽鍵水解的絲氨酸活性位點?；诮z氨酸蛋白酶的結構，存在兩大類絲氨酸蛋白酶：胰凝乳蛋白酶樣(胰蛋白酶樣)和枯草桿菌蛋白酶樣。原型枯草桿菌蛋白酶(ecno.3.4.21.62)最初獲自枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)?？莶輻U菌蛋白酶及其同系物是merops分類方案的s8肽酶家族的成員。s8家族的成員具有在其氨基酸序列中次序為asp、his和ser的催化三聯(lián)體。適當地，堿性內切蛋白酶可為選自以下項中的一者或多者：枯草桿菌蛋白酶、中性細菌蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶。在一個實施方案中，枯草桿菌蛋白酶可為絲氨酸蛋白酶家族的枯草桿菌蛋白酶。適當地，枯草桿菌蛋白酶可為可獲得(例如獲得的)自芽孢桿菌屬細菌的枯草桿菌蛋白酶。在一個實施方案中，枯草桿菌蛋白酶可為fna枯草桿菌蛋白酶，例如，如在us20120003718中所教導的，其內容以引用方式并入本文。在另一個實施方案中，三肽基肽酶可在酸性ph下具有活性(適當地，三肽基肽酶可在酸性ph下具有最佳活性)。三肽基肽酶可在小于約ph6，更適當地小于約ph5的ph下具有活性。優(yōu)選地，三肽基肽酶可在約2.5至約ph4.0，更適當地在約3.0至約3.3的ph下具有活性。適當地，本發(fā)明的方法可具體地在水解步驟中于2至約4(例如3至3.3)的ph下進行。在一個實施方案中，耐脯氨酸三肽基肽酶可在約2.5的ph下具有活性。在一個實施方案中，耐脯氨酸三肽基肽酶可在約2.5的ph下具有活性。在一些實施方案中，三肽基肽酶可與內切蛋白酶組合使用。如本文所用，術語“內切蛋白酶”與“肽鏈內切酶”同義并且指能夠切割肽或蛋白質底物的內部肽鍵(例如，不位于接近肽或蛋白質底物的c-末端或n-末端)的蛋白分解肽酶。此類內切蛋白酶可被定義為趨于遠離n-末端或c-末端而起作用的酶。合適的內切蛋白酶包括動物、植物或微生物來源的那些。包括經化學修飾或蛋白質工程改造的突變體，以及天然制成的蛋白質。內切蛋白酶可為絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶、堿性微生物蛋白酶、胰蛋白酶樣蛋白酶或胰凝乳蛋白酶樣蛋白酶。堿性內切蛋白酶的示例為枯草桿菌蛋白酶，尤其是源自芽孢桿菌屬的那些，例如枯草桿菌蛋白酶novo、枯草桿菌蛋白酶carlsberg、枯草桿菌蛋白酶309、枯草桿菌蛋白酶147和枯草桿菌蛋白酶168(參見例如wo89/06279)。另外的示例包括美國專利re34,606、5,955,340、5,700,676、6,312,936和6,482,628中描述的那些突變體蛋白酶，所有這些專利以引用方式并入本文。胰蛋白酶樣內切蛋白酶的示例為胰蛋白酶(如豬或牛來源)和鐮孢菌蛋白酶(參見例如wo89/06270和wo94/25583)?？捎玫牡鞍酌傅氖纠€包括但不限于wo92/19729、wo98/20115、wo98/20116和wo98/34946中所述的變體。可商購獲得的蛋白酶包括但不限于：primasetm、duralasetm、blazetm、和(novonordiska/s和novozymesa/s)、maxacaltm、maxapemtm、purafectoxptm、purafectprimetm、fnatm、fn2tm、fn3tm、puramaxtm、excellasetm、和purafasttm(daniscousinc./dupontindustrialbiosciences，paloalto，california，usa)、blaptm和blaptm變體(henkelkommanditgesellschaftaufaktien,duesseldorf,germany)和kap(嗜堿芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶(b.alkalophilussubtilisin)；日本東京花王公司(kaocorp.,tokyo,japan))。另外的示例性蛋白酶是來自液化淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquifaciens)的npre和來自纖維單胞菌屬(cellulomonassp.)菌株69b4的asp(daniscousinc./dupontindustrialbiosciences，paloalto，california，usa)。各種蛋白酶描述于wo95/23221、wo92/21760、wo09/149200、wo09/149144、wo09/149145、wo11/072099、wo10/056640、wo10/056653、wo11/140364、wo12/151534、美國專利公布2008/0090747，和美國專利5,801,039、5,340,735、5,500,364、5,855,625、usre34,606、5,955,340、5,700,676、6,312,936和6,482,628，以及各種其它專利。在一些另外的實施方案中，金屬蛋白酶可用于本發(fā)明，包括但不限于wo07/044993中描述的中性金屬蛋白酶。合適的內切蛋白酶包括天然存在的蛋白酶或經過特定選擇或工程改造以在相對低的溫度下工作的工程改造的變體。在一個實施方案中，內切蛋白酶可為選自以下的一種或多種：絲氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、蘇氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶以及選自未分組蛋白酶家族的蛋白酶。在一個實施方案中，內切蛋白酶可為選自以下的一種或多種：酸性真菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、布魯馬林(bromalin)、熱穩(wěn)定細菌中性金屬內肽酶、金屬中性肽鏈內切酶、堿性絲氨酸蛋白酶、真菌內切蛋白酶或選自商業(yè)蛋白酶產品afp、fp2、np。優(yōu)選地，根據本發(fā)明使用的內切蛋白酶可為天冬氨酸內切蛋白酶。在一個實施方案中，內切蛋白酶可為酸性內切蛋白酶。適當地，內切蛋白酶可為酸性真菌蛋白酶。優(yōu)選地，酸性真菌蛋白酶可為天冬氨酸內切蛋白酶。合適的酸性真菌蛋白酶的至少一個示例為酶組合物(購自dupontindustrialbiosciences——以前為genencor(usa))。在一個實施方案中，根據本發(fā)明使用的蛋白酶可能不可獲得(例如獲得)自擬諾卡氏菌(nocardiopsis)。有利地，將內切蛋白酶與三肽基肽酶組合使用可增大底物切割的效率。不受理論的束縛，據信內切蛋白酶能夠在遠離c-末端或n-末端的多個區(qū)域切割肽和/或蛋白質底物，從而產生三肽基肽酶的更多個n-末端以用作底物，由此有利地增大反應效率和/或減少反應時間。術語“產醇宿主”是指能夠使可發(fā)酵糖源發(fā)酵以產生醇的任何生物體。此類生物體也可被稱為產乙醇生物或被稱為產乙醇的。如本文所用，“可發(fā)酵糖”指能夠在發(fā)酵條件下被代謝的糖類。這些糖通常指葡萄糖、麥芽糖和麥芽三糖(dp1、dp2和dp3)。在一些實施方案中，蔗糖也可為可發(fā)酵糖。適當地，可發(fā)酵糖通過水解淀粉可獲得(例如獲得)。如本文所用，“淀粉”指由植物的復雜多糖碳水化合物構成的任何材料，由具有式(c6h10o5)x(其中“x”可以是任何數字)的直鏈淀粉和支鏈淀粉構成。具體地講，該術語指任何基于植物的材料，包括但不限于谷物、谷類、草、塊莖和根，更具體地講，指小麥、大麥、玉米、裸麥、稻、高粱、麩皮、木薯、粟、馬鈴薯、甘薯和木薯粉?！邦w粒狀淀粉”是指未煮過的(生)淀粉，其未經受糊化，其中“淀粉糊化”意指使淀粉分子溶解以形成粘性懸浮液。適當地，塊莖可為糧谷塊莖。如本文所用，“淀粉的水解”等是指加入水分子時裂解糖苷鍵。因此，具有“淀粉水解活性”的酶在加入水分子情況下催化糖苷鍵的切割。產醇宿主可選自任何合適的真核生物。在一個實施方案中，產醇宿主可為細菌。適當地，選自變形菌門(proteobacteria)，更適當地選自鞘脂單胞菌科(shingomonadaceae)。在一個具體的實施方案中，產醇宿主可為來自于選自以下項的一個或多個屬的細菌：發(fā)酵單胞菌屬(zymomonas)、節(jié)桿菌屬(arthrobacter)、芽孢桿菌屬(bacillus)、梭菌屬(clostridium)、歐文氏菌屬(erwinia)、埃希氏菌屬(escherichia)、克雷伯氏菌屬(klebsiella)、乳桿菌屬(lactobacillus)、假單胞菌屬(pseudomonas)、鏈霉菌屬(streptomyces)、熱厭氧桿菌屬(thermoanaerobacter)。適當地，細菌可選自運動發(fā)酵單胞菌(zymomonasmobilis)。在一些實施方案中，產醇宿主可為真菌。根據本發(fā)明使用的真菌可為任何子囊真菌(例如，子囊菌(ascomycete))。適當地，產醇宿主可為酵母。適當地，酵母可選自：酵母屬(saccharomyces)、克魯維酵母屬(kluyveromyces)、接合酵母屬(zygosaccharomyces)、伊薩酵母屬(issatchenkia)、kazachstania和有孢圓酵母屬(torulaspora)。更適當地，酵母可為選自以下的一種或多種：釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)、貝酵母(saccharomycesbayanus)、卡氏酵母(saccharomycescarlsbergensis)、saccharomyceskudriavtsevii、saccharomyceskudriavzevii和巴斯德氏酵母(saccharomycespastorianus)。適當地，酵母可為釀酒酵母變種糖化酵母(saccharomycescerevisiaevar.diastaticusyeast)。如本文所用，術語“原料”是指包含以下中的至少一者的組合物：淀粉、纖維素、半纖維素、木質纖維素、可發(fā)酵糖或它們的組合?！霸系募壏帧笔侵冈谔幚硭鲈掀陂g分離出來的任何原料組分。原料可為淀粉、基于谷物的材料(例如，谷類、小麥、大麥、裸麥、稻、黑小麥、粟、買羅高粱、高粱或玉米)、塊莖(例如，馬鈴薯或木薯)、根、糖(例如，蔗糖、甜菜糖、糖蜜或糖漿)、釜餾物、濕餅、ddgs、纖維素生物質、半纖維素生物質、乳清蛋白、基于大豆的材料、木質纖維素生物質或它們的組合。木質纖維素生物質可包含纖維素、半纖維素和芳族聚合物木質素。半纖維素和纖維素(包括不溶性阿拉伯木聚糖)本身也為潛在的能量源，因為它們由c5-糖和c6-糖組成。單c6-糖可被動物用作能量源，而寡c5-糖可被存在于動物腸道中的微生物群落轉化成短鏈脂肪酸(vandenbroek等人，2008molecularnutrition&foodresearch,52,146-163)，該短鏈脂肪酸可被動物的腸道吸收和消化。適當地，木質纖維素生物質可為任何纖維素、半纖維素或木質纖維素材料，例如農業(yè)殘余物、生物能源作物、工業(yè)固體廢物、市政固體垃圾、來自造紙的淤渣、庭院垃圾、木料廢物、林業(yè)廢物以及它們的組合。木質纖維素生物質可選自玉米棒、作物廢棄物諸如玉米苞葉、玉米面筋粉(cgm)、玉米秸稈、玉米纖維、草、甜菜渣、小麥秸稈、小麥殼、燕麥秸稈、小麥粗粉、次小麥粉、米糠、稻殼、小麥麩、燕麥殼、濕餅、干酒糟(ddg)、含可溶物干酒糟(ddgs)、棕櫚仁、柑橘渣、棉花、木質素、大麥秸稈、干草、稻秸、稻殼、柳枝稷、芒草、大米草、草蘆、廢紙、甘蔗渣、高粱渣、飼用高粱、高粱秸稈、大豆秸稈、大豆、由研磨樹、枝、根、葉、木屑、鋸末、灌木和灌叢、蔬菜、水果和花獲得的組分。濕餅、干酒糟和含可溶物干酒糟是在通過谷物蒸餾產業(yè)所用的方法從發(fā)酵的谷物或谷物混合物中蒸餾而移除乙醇之后得到的產物。來自蒸餾的釜餾物(例如，包含水，其余的谷物、酵母細胞等)被分為“固體”部分和液體部分。固體部分稱為“濕餅”并且可原樣用作動物飼料。液體部分(部分地)蒸發(fā)成糖漿(可溶物)。液體部分通常被稱為稀釜餾物。當對濕餅進行干燥時，其為干酒糟(ddg)。當將濕餅與糖漿(可溶物)一起進行干燥時，其為含可溶物干酒糟(ddgs)。濕餅可用于乳牛場的作業(yè)(dairyoperations)和肉牛飼養(yǎng)場。干ddgs可用于牲畜(例如，乳牛、牛和豬)飼料和家禽飼料。玉米ddgs對乳牛而言是極好的蛋白質源。玉米面筋粉(cgm)是玉米研磨工業(yè)的粉末狀副產物。cgm例如在動物飼料中具有實用性。其可用作飼料諸如寵物食物、牲畜飼料和家禽飼料的廉價蛋白質源。其尤其是氨基酸半胱氨酸的良好來源，但對于賴氨酸必須與其它蛋白質保持平衡?；诠任锏牟牧峡蔀檫x自以下的一種或多種：玉米、小麥、大麥、燕麥、裸麥、玉蜀黍、粟、稻、木薯和高粱。在一些實施方案中，當與不包含一種或多種三肽基肽酶的發(fā)酵混合物相比時，在本發(fā)明的方法和/或用途中使用三肽基肽酶可增大發(fā)酵混合物中的三肽濃度。原料或其部分可在發(fā)酵之前、期間或之后經受一個或多個工序。在一個實施方案中，原料或其部分可經受一個或多個選自以下的工序：研磨、烹飪、糖化、發(fā)酵以及同時糖化和發(fā)酵。如本文所用，術語“研磨”是指對原料的任何研磨。例如，研磨可包括濕磨、干磨或它們的組合。研磨是指如下過程：有助于將用于制備原料的原材料粉碎成適當尺寸的顆粒以利于原料下游工藝，例如為了有利于烹飪過程。在一些方法中，研磨過程有助于暴露淀粉。濕磨是需要在處理前濕浸泡例如玉米谷粒的研磨過程。然后進行一系列的單元操作，從而回收淀粉。在經受一系列研磨機之前，通常用稀釋的亞硫酸將谷物浸漬或“浸泡”在水中24小時至48小時。下游工藝可包括除去油(例如，玉米油)，之后進行另外的階段以分離出纖維、蛋白質(例如谷蛋白)和淀粉組分(例如，諸如胚乳)。這可使用篩網和旋液分離器(hydroclonicseparators)通過離心來實現(xiàn)。接著，可使從該過程保留的淀粉和水經受發(fā)酵。干磨是指在進一步加工前將原材料諸如谷物研磨成面粉(例如粗粉)的過程。通常，然后用水將面粉漿化以在下游步驟(例如糖化)中處理之前形成麥芽漿。可將氨添加到麥芽漿中并且用于控制ph并為用于發(fā)酵的產醇宿主提供營養(yǎng)源。在一個優(yōu)選的實施方案中，可在處理原料或其級分期間使用干磨。適當地，可在研磨或干碾磨期間將三肽基肽酶與原料或其級分混合。適當地，在研磨或干碾磨之后獲得的原料或其級分可經受液化和/或糖化和/或發(fā)酵和/或同時糖化和發(fā)酵。這可例如在研磨之后并在液化或糖化之前具有或不具有烹飪步驟。原料或其級分可經受烹飪。通常，烹飪過程可發(fā)生在研磨后。適當地，烹飪過程可發(fā)生于90℃-120℃。適當地，烹飪可在液化和/或糖化之前進行。適當地，烹飪過程可在發(fā)酵之前降低細菌水平。在一些實施方案中，可在該階段或其后添加一種或多種酶。適當地，可在烹飪過程之后，例如在液化過程中添加α-淀粉酶。在一些實施方案中，原料或其級分可能不經受烹飪。在此類實施方案中，糖化和發(fā)酵或ssf可在包含顆粒狀淀粉或生淀粉(例如，在低于淀粉糊化的溫度下處理的淀粉)的原料或其級分上進行。在一個實施方案中，原料或其級分可經受酶處理，例如采用α-淀粉酶和/或淀粉葡糖苷酶。在一些實施方案中，該酶處理替代烹飪步驟。在一些實施方案中，原料或其級分可經歷一個或多個液化步驟。如本文所用，術語“液化”是指通常利用增大溫度使淀粉液化的過程。淀粉的液化導致粘度顯著增大。因此，可引入淀粉酶以降低粘度。淀粉液化的溫度根據淀粉的來源變化。淀粉處理也可在約25℃至恰好低于液化溫度的溫度下進行。這些類型的工藝通常稱為顆粒狀淀粉水解、直接淀粉水解、生淀粉水解、低溫淀粉水解或其它術語。在一些情況下，在低于液化溫度的溫度下對淀粉進行預處理，以增強酶水解或用于處理淀粉的其它過程。液化可在高溫或低溫以及本領域的技術人員已知或能夠選擇的合適溫度下進行。例如，液化可在使存在于原料或其級分中的淀粉和/或多糖液化的溫度(例如，使粘度增大的溫度)下進行。此類溫度將取決于原料或其級分的來源以及其中的淀粉和/或多糖含量。在一些實施方案中，技術人員可在低于(例如，恰好低于)原料或其級分中所含的淀粉和/或多糖的液化溫度的溫度下進行液化。液化可在高溫或低溫諸如約25℃至約95℃(例如約25℃至約84℃)下進行。在一個實施方案中，液化可在約85℃至約95℃下進行。在其它實施方案中，液化可在較低溫度下進行和/或可采用不包括完全液化淀粉的“冷烹飪過程”。原料或其級分也可經歷糖化。糖化對于發(fā)酵可以是獨立的或與之同時的。分別糖化和發(fā)酵是這樣的過程，其中存在于原料(例如玉米)或其級分中的淀粉轉化為葡萄糖，隨后產醇宿主(例如，產乙醇生物)將葡萄糖轉化為乙醇。同時糖化和發(fā)酵(ssf)是這樣的過程，其中存在于原料或其級分中的淀粉轉化為葡萄糖，與此同時并且在相同的反應器中，產醇宿主(例如，產乙醇生物)將葡萄糖轉化為乙醇。在一些實施方案中，糖化可在低溫下進行。在糖化期間，通常可添加一種或多種酶以利于葡萄糖分解。適用于糖化的酶制劑包括ssf(購自dupontindustrialbiosciences——以前為genencor)，其包括淀粉酶(1,4-α-d-葡聚糖葡聚糖水解酶——ec3.2.1.1)、葡糖淀粉酶(1,4-α-d-葡聚糖葡糖水解酶e.c.3.2.1.3)、異淀粉酶、β淀粉酶、普魯蘭酶以及曲霉胃蛋白酶1(ec3.4.23.18)。另選地或除此之外，可在糖化步驟期間添加一種或多種內切蛋白酶和/或外肽酶。適當地，內切蛋白酶和/或外肽酶可獲得(例如獲得)自木霉屬(trichoderma)。在一個實施方案中，可在糖化步驟期間添加fermgentm(購自genencor)。在一些實施方案中，可在糖化過程期間添加纖維素酶和/或半纖維素酶和/或另外的酶。適當地，還可添加一種或多種選自以下的另外的酶：內切葡聚糖酶(e.c.3.2.1.4)；纖維二糖水解酶(e.c.3.2.1.91)、β-葡糖苷酶(e.c.3.2.1.21)、纖維素酶(e.c.3.2.1.74)、地衣多糖酶(e.c.3.1.1.73)、脂肪酶(e.c.3.1.1.3)、脂質酰基轉移酶(通常歸類為e.c.2.3.1.x)、磷脂酶(e.c.3.1.1.4，e.c.3.1.1.32或e.c.3.1.1.5)、植酸酶(例如6-植酸酶(e.c.3.1.3.26)或3-植酸酶(e.c.3.1.3.8)、淀粉酶、α-淀粉酶(e.c.3.2.1.1)、木聚糖酶(例如，內切-1,4-β-d-木聚糖酶(e.c.3.2.1.8)或1,4β-木糖苷酶(e.c.3.2.1.37)或e.c.3.2.1.32，e.c.3.1.1.72，e.c.3.1.1.73)、葡糖淀粉酶(e.c.3.2.1.3)、半纖維素酶(例如，木聚糖酶)、蛋白酶(例如，枯草桿菌蛋白酶(e.c.3.4.21.62)或芽孢桿菌溶素(e.c.3.4.24.28)或堿性絲氨酸蛋白酶(e.c.3.4.21.x)或角蛋白酶(e.c.3.4.x.x))、脫支酶、角質酶、酯酶和/或甘露聚糖酶(例如，β-甘露聚糖酶(e.c.3.2.1.78))轉移酶、葡糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶?？稍谠匣蚱浼壏值囊粋€或多個處理階段添加三肽基肽酶。適當地，可在研磨期間添加三肽基肽酶。適當地，可在糖化期間添加三肽基肽酶。優(yōu)選地，可在同時糖化和發(fā)酵期間添加三肽基肽酶。適當地，可在液化期間添加三肽基肽酶。適當地，可在發(fā)酵期間添加三肽基肽酶。在一些實施方案中，三肽基肽酶可與內切蛋白酶組合使用。在一些實施方案中，可將三肽基肽酶與原料或其級分在發(fā)酵之后混合。適當地，可然后(例如，經由研磨)進一步處理混合物。本發(fā)明的方法可包括一個或多個發(fā)酵。可在任何發(fā)酵之前、期間或之后添加本發(fā)明的三肽基肽酶。在一些實施方案中，可將根據本發(fā)明的三肽基肽酶與發(fā)酵后可獲得的(例如，獲得的)原料或其級分(例如，全釜餾物或ddgs)混合。在一個實施方案中，發(fā)酵后可獲得的(例如，獲得的)原料或其級分(例如，全釜餾物或ddgs)可用根據本發(fā)明的三肽基肽酶處理(或進一步處理)。適當地，這可與原料或其級分的一個或多個額外處理(例如，加酸和/或碾磨)組合使用。在一個實施方案中，經處理的原料或其級分然后可充當一個或多個額外發(fā)酵的原料?？稍陬~外發(fā)酵中添加根據本發(fā)明的三肽基肽酶。適當地，本發(fā)明中使用的原料或其級分可為含纖維的級分。本發(fā)明的方法可包括在將三肽基肽酶與原料或其級分混合之前、期間或之后添加產醇菌株。所述方法還可包括將脲與原料或其級分混合。有利地，使用本發(fā)明的三肽基肽酶可降低需要添加至原料的脲的量。用途在一個方面，本發(fā)明提供了在醇(優(yōu)選生物乙醇)的制造中主要具有外肽酶活性的三肽基肽酶用于提高醇(優(yōu)選生物乙醇)的收率的用途。如本文所用，術語“提高醇的收率”是指當與在處理方法期間不使用三肽基肽酶時發(fā)酵后回收的醇的濃度相比時，在處理方法期間使用三肽基肽酶時發(fā)酵后回收的醇(例如，生物乙醇)的濃度增大。適當地，醇的收率可提高至少約0.1％v/v，更適當地至少約0.3％v/v，甚至更適當地至少0.5％v/v。在一些實施方案中，將三肽基肽酶與內切蛋白酶組合使用可使回收的醇的濃度提高至少約0.4％v/v，適當地至少0.6％v/v，更適當地至少0.8％v/v。在另一個方面，本發(fā)明提供了主要具有外肽酶活性的三肽基肽酶用于在醇的制造中提高產醇宿主的發(fā)酵能力的用途。不受理論的束縛，據信本發(fā)明的三肽基肽酶可增大存在于原料或其級分中的三肽的濃度。本發(fā)明的一個優(yōu)點在于如此形成的三肽可為例如產醇宿主的良好氨基酸源和/或能量和/或營養(yǎng)源。產醇宿主的發(fā)酵能力的提高可通過以下測量：與未和三肽基肽酶混合的所述產醇宿主在發(fā)酵期間消耗的糖(例如葡萄糖)的水平相比，產醇宿主在發(fā)酵期間消耗的糖(例如葡萄糖)的量增大。適當地，與未和三肽基肽酶混合的產醇宿主在發(fā)酵期間消耗的葡萄糖水平相比，發(fā)酵培養(yǎng)基中的糖(例如葡萄糖)的水平在約15小時至約20小時之間測量時可小于約0.1％w/v。適當地，發(fā)酵培養(yǎng)基中糖(例如葡萄糖)的水平可小于0.2％w/v，適當地小于約0.3％w/v。醇和/或糖(例如葡萄糖)的濃度可通過本領域的技術人員已知的任何方法測量。例如，可使用高效液相色譜法(hplc)分析。另選的發(fā)酵結束(eof)產物包括但不限于代謝物，諸如檸檬酸、乳酸、琥珀酸、谷氨酸一鈉、葡糖酸、葡糖酸鈉、葡糖酸鈣、葡糖酸鉀、衣康酸以及其它羧酸、葡糖酸δ-內酯、異抗壞血酸鈉、賴氨酸以及其它氨基酸、ω-3脂肪酸、異戊二烯、1,3-丙二醇、乙醇、丁醇、其它醇、以及其它生化物質和生物材料。除eof之外，三肽基肽酶也可用于制備糖漿(例如，dp1、2、3等、特制糖漿、低聚糖、以及多糖)。三肽基肽酶也可生成可用于生產宿主的肽；或者與另外的一種或多種蛋白酶協(xié)同作用以生成氨基酸和/或有潛在價值的肽。產醇宿主的表達本發(fā)明中使用的三肽基肽酶可由產醇宿主表達和分泌。適當地，三肽基肽酶可對產醇宿主是異源的。如本文所用，術語“對產醇宿主是異源的”可指在產醇宿主中正常表達的酶，但是酶或編碼其的核苷酸序列已經以某些方式被工程改造，由此使得酶和/或核苷酸序列不同于“天然”酶和/或編碼所述酶的核苷酸序列。另選地或除此之外，異源酶可為來源于不同生物體的酶，例如來源于外源的酶。換句話講，其可指不在產醇宿主中正常表達的酶。在其它實施方案中，三肽基肽酶可對產醇宿主是同源的。在一些實施方案中，產醇宿主可共表達三肽基肽酶以及一種或多種選自以下的酶：葡糖淀粉酶、淀粉酶、另外的淀粉改性酶、蛋白酶、植酸酶、纖維素酶、半纖維素酶、另外的酶以及它們的組合。適當地，除表達三肽基肽酶之外，產醇宿主還可另外地表達一種或多種選自以下的酶：內切葡聚糖酶(e.c.3.2.1.4)；纖維二糖水解酶(e.c.3.2.1.91)、β-葡糖苷酶(e.c.3.2.1.21)、纖維素酶(e.c.3.2.1.74)、地衣多糖酶(e.c.3.1.1.73)、脂肪酶(e.c.3.1.1.3)、脂質酰基轉移酶(通常歸類為e.c.2.3.1.x)、磷脂酶(e.c.3.1.1.4，e.c.3.1.1.32或e.c.3.1.1.5)、植酸酶(例如6-植酸酶(e.c.3.1.3.26)或3-植酸酶(e.c.3.1.3.8)、淀粉酶、α-淀粉酶(e.c.3.2.1.1)、普魯蘭酶、異淀粉酶、β-淀粉酶、α-葡糖苷酶、木聚糖酶(例如，內切-1,4-β-d-木聚糖酶(e.c.3.2.1.8)或1,4β-木糖苷酶(e.c.3.2.1.37)或e.c.3.2.1.32，e.c.3.1.1.72，e.c.3.1.1.73)、葡糖淀粉酶(e.c.3.2.1.3)、半纖維素酶、蛋白酶(例如，枯草桿菌蛋白酶(e.c.3.4.21.62)或芽孢桿菌溶素(e.c.3.4.24.28)或堿性絲氨酸蛋白酶(e.c.3.4.21.x)或角蛋白酶(e.c.3.4.x.x))、脫支酶、角質酶、酯酶和/或甘露聚糖酶(例如，β-甘露聚糖酶(e.c.3.2.1.78))、轉移酶、葡糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶?；钚院蜏y定本發(fā)明中使用的三肽基肽酶主要具有外肽酶活性。如本文所用，術語“外肽酶”活性意指能夠從底物(諸如蛋白質和/或肽底物)的n-末端切割三肽的三肽基肽酶。如本文所用，術語“主要具有外肽酶活性”意指不具有或基本上不具有內切蛋白酶活性的三肽基肽酶?！盎旧喜痪哂袃惹械鞍酌富钚浴币庵府斚啾扔诒疚慕虒У摹巴怆拿笍V泛特異性測定(ebsa)”中的1000nkat的外肽酶活性時，耐脯氨酸三肽基肽酶或s53家族的外肽酶在本文教導的“內切蛋白酶測定”中具有小于約100u的內切蛋白酶活性。適當地，“基本上不具有內切蛋白酶活性”意指當相比于本文教導的“外肽酶廣泛特異性測定”中的1000nkat的外肽酶活性時，耐脯氨酸三肽基肽酶在本文教導的“內切蛋白酶測定”中具有小于約100u的內切蛋白酶活性。優(yōu)選地，耐脯氨酸三肽基肽酶或s53家族的外肽酶在相比于本文教導的“外肽酶廣泛特異性測定”中的1000nkat的外肽酶活性時，在本文教導的“內切蛋白酶測定”中可具有小于約10u的內切蛋白酶活性，更優(yōu)選地，在相比于本文教導的“外肽酶廣泛特異性測定”中的1000nkat的外肽酶活性時，在本文教導的“內切蛋白酶測定”中具有小于約1u的內切蛋白酶活性。甚至更優(yōu)選地，當相比于在本文教導的“外肽酶廣泛特異性測定”中的1000nkat的外肽酶活性時，耐脯氨酸三肽基肽酶或外切-三肽基肽酶可在本文教導的“內切蛋白酶測定”中具有小于約0.1u的內切蛋白酶活性。“內切蛋白酶測定”偶氮酪蛋白測定內切蛋白酶的活性使用iversen和1995(biotechnologytechniques9，573-576)描述的修改型式的內切蛋白酶測定法。將50μl的酶樣品添加至250μl偶氮酪蛋白(0.25％w/v；得自sigma)的4倍稀釋的mcilvaine緩沖液(ph5)中并在振蕩(800rpm)下于40℃溫育15min。通過添加50μl的2m三氯乙酸(tca)(得自sigmaaldrich，denmark)并在20,000g下離心5min使反應終止。向195μl樣品的上清液添加65μl的1mnaoh，并在450nm處測量吸光度。一個內切蛋白酶活性單位被定義為：在40℃下，使得450nm處的吸光度在15min內增加0.1的量?！巴怆拿笢y定”第1部分——“外肽酶廣泛特異性測定”(ebsa)在微量滴定板中，將10μl的顯色肽溶液(10mmh-ala-ala-ala-pna，溶解于二甲基亞砜(dmso)；mw＝387.82；bachem，switzerland)添加至130μl乙酸鈉(20mm，用乙酸調節(jié)至ph4.0)并在40℃加熱5分鐘。添加10μl適當稀釋的酶，在mtp讀出器(versamax，moleculardevices，denmark)中測量405nm處的吸收值。一開特的蛋白分解活性被定義為每秒釋放1摩爾對硝基苯胺所需的酶量。在一個實施方案中，根據本發(fā)明的三肽基肽酶在本文教導的ebsa活性測定中具有至少約50nkat的活性。適當地，在本文教導的ebsa活性測定中，根據本發(fā)明的三肽基肽酶具有約50-2000nkat單位的活性。為了測定三肽基肽酶是否為耐脯氨酸三肽基肽酶，可將以下測定與第1部分組合。第2部分(i)——p1脯氨酸測定(a)將底物h-arg-gly-pro-phe-pro-ile-ile-val(mw＝897.12；得自schafer-n，copenhagen)以1mg/ml的濃度溶解于10倍稀釋的mcilvain緩沖液(ph＝4.5)中。(b)在40℃下，將1000ul的底物溶液與10ug的耐脯氨酸三肽基肽酶溶液一起溫育。(c)在七個時間點(0min、30min、60min、120min、720min和900min)采取100ul樣品，用50ul5％tfa稀釋，熱滅活(10min，80℃)并保持于-20℃直至lc-ms分析；(d)用接口至ltqorbitrapclassic混合質譜儀(thermoscientific，bremen，germany)的agilent1100seriescapillaryhplc系統(tǒng)(agilenttechnologies，santaclara，ca)進行l(wèi)c-mc/ms分析；(e)將樣品上樣到50mmfortistmc18柱上，該柱具有2.1mm的內徑和1.7μm的實際尺寸；(f)在ionmax源中使用14min梯度的2％-28％的溶劑b(h2o/ch3cn/hcooh(50/950/0.65v/v/v))以200μl/min的流速進行分離——ltqorbitrapclassic儀器以數據依賴性ms/ms模式操作；(g)通過orbitrap(在m/z400下，采用60.000的分辨率獲得ms掃描)測量肽質量，并且選擇最強肽m/z中的多至2者并在線性離子阱(ltq)中用cid進行碎裂。啟動動態(tài)排除，列表大小為500個質量，持續(xù)時間40s，并且相對于列表上的質量，排除質量寬度為±10ppm；(h)使用開放源代碼程序skyline1.4.0.4421(購自maccosslabsoftware，universityofwashington，departmentofgenomesciences，372015thaveneseattle，washington，us)以訪問raw文件并提取ms1強度來構建色譜圖。在60,000分辨率下將前體同位素導入過濾器設定為計數三(m、m+1和m+2)，并使用最強電荷狀態(tài)；(i)將底物和切割產物的肽序列鍵入skyline中，并且計算每個樣品中的強度(0min、30min、60min、120min、720min和900min水解)。(j)一個活性單位被定義為在該測定中于720min內將水解50％的底物并同時釋放arg-gly-pro的酶量。第2部分(ii)——p1’脯氨酸測定(a)將肽h-ala-ala-phe-pro-ala-nh2(mw＝474.5；得自schafer-n，copenhagen)以0.1mg/ml的濃度溶解于10倍稀釋的mcilvain緩沖液(ph＝4.5)中。(b)在40℃下，用10ug的耐脯氨酸三肽基肽酶溶液溫育1000ul的底物溶液。(c)在七個時間點(0min、30min、60min、120min、720min和900min)采取100ul樣品，用50ul5％tfa稀釋，熱滅活(10min，80℃)并保持于-20℃直至lc-ms分析；(d)用接口至ltqorbitrapclassic混合質譜儀(thermoscientific，bremen，germany)的agilent1100seriescapillaryhplc系統(tǒng)(agilenttechnologies，santaclara，ca)進行l(wèi)c-mc/ms分析；(e)將樣品上樣到50mmfortistmc18柱上，該柱具有2.1mm的內徑和1.7μm的實際尺寸；(f)在ionmax源中使用14min梯度的2％-28％的溶劑b(h2o/ch3cn/hcooh(50/950/0.65v/v/v))以200μl/min的流速進行分離——ltqorbitrapclassic儀器以數據依賴性ms/ms模式操作；(g)通過orbitrap(在m/z400下，采用60.000的分辨率獲得ms掃描)測量肽質量，并且選擇最強肽m/z中的多至2者并在線性離子阱(ltq)中用cid進行碎裂。啟動動態(tài)排除，列表大小為500個質量，持續(xù)時間40s，并且相對于列表上的質量，排除質量寬度為±10ppm。(h)使用開放源代碼程序skyline1.4.0.4421(購自maccosslabsoftware，universityofwashington，departmentofgenomesciences，372015thaveneseattle，washington，us)以訪問raw文件并提取ms1強度來構建色譜圖。在60,000分辨率下將前體同位素導入過濾器設定為計數三(m、m+1和m+2)，并使用最強電荷狀態(tài)；(i)將底物和切割產物的肽序列鍵入skyline中，并且計算每個樣品中的強度。(j)一個活性單位被定義為在該測定中于720min內將水解50％的底物并同時釋放ala-ala-phe的酶量。如果在本發(fā)明中使用的三肽基肽酶為如本文所定義的耐脯氨酸三肽基肽酶，則在一個實施方案中，耐脯氨酸三肽基肽酶的每mg蛋白質在本文教導的第1部分活性中具有至少50nkat的活性，并且在本文教導的第2(i)部分或第2(ii)部分測定中具有至少100u的活性。在一個實施方案中，根據本發(fā)明的耐脯氨酸三肽基肽酶的每mg蛋白質在本文教導的第1部分活性中具有約50-2000nkat的活性，并且在本文教導的第2(i)部分或第2(ii)部分測定中具有約1-500單位活性。應當注意，蛋白質測量描述于實施例4中。“p1和p1’蛋白質活性測定”適當地，本發(fā)明中使用的三肽基肽酶能夠切割在位置p1和p1’處具有脯氨酸的底物。這可用下文教導的測定來評估。在該測定中，就三肽基肽酶水解合成底物aappa的能力而言，通過lc-ms和免標記量化來檢查三肽基肽酶。(a)將肽h-aappa-nh2(mw＝424.3，得自schafer-n，copenhagen)溶解于20mmmes緩沖液，ph＝4.0(1mg/ml)；(b)在室溫下，將1000ul的h-aappa-nh2溶液與200ul耐脯氨酸三肽基肽酶溶液(40ug/ml)(底物/酶100:0.8)一起溫育；(c)在七個時間點(0min、5min、15min、60min、180min、720min和1440min)采取100ul樣品，用50ul5％tfa稀釋，熱滅活(10min，80℃)并保持于-20℃直至lc-ms分析；(d)用接口至ltqorbitrapclassic混合質譜儀(thermoscientific，bremen，germany)的easylc系統(tǒng)(thermoscientific，odense，dk)進行nanolc-ms/ms分析；(e)將樣品上樣到定制的2cm捕獲柱(100μm內徑，375μm外徑，裝填reprosilc18，5μm反相顆粒(dr.maischgmbh，ammerbuch-entringen，germany))上，該柱連接至具有鋼針的10cm分析柱(75μm內徑，375μm外徑，裝填reprosilc18，3μm反相顆粒(dr.maischgmbh，ammerbuch-entringen，germany))；(f)在納升電噴霧離子源(thermoscientific，odense，dk)中使用10min梯度的0％-34％的溶劑b(h2o/ch3cn/tfe/hcooh(100/800//100/1v/v/v/v))以300nl/min流速進行分離——ltqorbitrapclassic儀器以數據依賴性ms/ms模式操作；(g)通過orbitrap(在m/z400下，采用60000的分辨率獲得ms掃描)測量肽質量，并且選擇最強肽m/z中的多至2者并在線性離子阱(ltq)中用cid進行碎裂。啟動動態(tài)排除，列表大小為500個質量，持續(xù)時間40s，并且相對于列表上的質量，排除質量寬度為±10ppm；(h)使用開放源代碼程序skyline1.4.0.4421(購自maccosslabsoftware，universityofwashington，departmentofgenomesciences，372015thaveneseattle，washington，us)以訪問raw文件，該程序可用ms1強度來構建色譜圖。在60,000分辨率下將前體同位素導入過濾器設定為計數三(m、m+1和m+2)，并使用最強電荷狀態(tài)；(i)將底物和切割產物的肽序列鍵入skyline中，并且計算每個樣品中的強度。(j)一個活性單位被定義為在該測定中于24h內將水解50％的底物并同時釋放aap的酶的量。在一個實施方案中，根據本發(fā)明的耐脯氨酸三肽基肽酶的每mg蛋白質在本文教導的第1部分活性中具有至少50nkat的活性，并且在本文教導的第2(i)部分或第2(ii)部分測定中具有至少100u的活性。在一個實施方案中，根據本發(fā)明的耐脯氨酸三肽基肽酶的每mg蛋白質在本文教導的第1部分活性中具有約50-2000nkat的活性，并且在本文教導的第2(i)部分或第2(ii)部分測定中具有約1-500單位活性(蛋白質濃度如實施例2計算)。在一個實施方案中，在本文教導的“p1和p1’脯氨酸活性測定”中，本發(fā)明中使用的耐脯氨酸三肽基肽酶的每mg蛋白質可具有至少10u的活性。在一個實施方案中，在本文教導的“p1和p1’脯氨酸活性測定”中，根據本發(fā)明的耐脯氨酸三肽基肽酶的每mg蛋白質可具有約1u-500u的活性。除上文之外，耐脯氨酸三肽基肽酶還可具有根據以上教導的第1部分的“外肽酶活性測定”的活性。在一個實施方案中，本發(fā)明中使用的耐脯氨酸三肽基肽酶的每mg蛋白質在本文教導的“p1和p1’脯氨酸活性測定”中可具有至少10u的活性，并且在本文教導的第1部分的“外肽酶活性測定”中具有至少50nkatal的活性。在另一個實施方案中，根據本發(fā)明的耐脯氨酸三肽基肽酶的每mg蛋白質在本文教導的“p1和p1’脯氨酸活性測定”中具有約1u-500u的活性，并且在本文教導的第1部分的“外肽酶活性測定”中具有約50u-2000ukatal的活性。氨基酸和核苷酸序列根據本發(fā)明使用的三肽基肽酶可獲得(例如獲得)自任何來源，只要其具有本文所述的活性即可。在一個實施方案中，根據本發(fā)明使用的三肽基肽酶可獲得(例如獲得)自木霉屬。適當地得自里氏木霉，更適當地，得自里氏木霉qm6a。適當地得自綠木霉菌(trichodermavirens)，更適當地，得自綠木霉菌gv29-8。適當地得自深綠木霉(trichodermaatroviride)。更適當地，得自深綠木霉imi206040。在一個實施方案中，根據本發(fā)明使用的三肽基肽酶可獲得(例如獲得)自曲霉屬(aspergillus)。適當地得自煙曲霉(aspergillusfumigatus)，更適當地得自煙曲霉cae17675。適當地得自白曲霉(aspergilluskawachii)，更適當地得自白曲霉ifo4308。適當地得自構巢曲霉(aspergillusnidulans)，更適當地得自構巢曲霉fgsca4。適當地得自米曲霉(aspergillusoryzae)，更適當地得自米曲霉rib40。適當地得自赤曲霉(aspergillusruber)，更適當地得自赤曲霉cbs135680。適當地得自土曲霉(aspergillusterreus)，更適當地得自土曲霉nih2624。在一個實施方案中，根據本發(fā)明使用的三肽基肽酶可獲得(例如獲得)自平臍蠕孢屬(bipolaris)，適當地得自玉米小斑病菌(bipolarismaydis)，更適當地得自玉米小斑病菌c5。在一個實施方案中，根據本發(fā)明使用的三肽基肽酶可獲得(例如獲得)自togninia，適當地得自togniniaminima，更適當地得自togniniaminimaucrpa7。在一個實施方案中，根據本發(fā)明使用的三肽基肽酶可獲得(例如獲得)自踝節(jié)菌屬(talaromyces)，適當地得自柄籃狀菌(talaromycesstipitatus)，更適當地得自柄籃狀菌atcc10500。在一個實施方案中，根據本發(fā)明使用的三肽基肽酶可獲得(例如獲得)自節(jié)皮菌屬(arthroderma)，適當地得自貝納米節(jié)絲皮裸囊菌(arthrodermabenhamiae)，更適當地得自貝納米節(jié)絲皮裸囊菌cbs112371。在一個實施方案中，根據本發(fā)明使用的三肽基肽酶可獲得(例如獲得)自稻瘟菌(magnaporthe)，適當地得自稻瘟病菌(magnaportheoryzae)，更適當地得自稻瘟病菌70-1。在另一個實施方案中，根據本發(fā)明使用的三肽基肽酶可獲得(例如獲得)自鐮孢屬(fusarium)。適當地得自尖孢鐮孢菌(fusariumoxysporum)，更適當地得自尖孢鐮孢菌4號生理小種(fusariumoxysporumf.sp.cubenserace4)。適當地得自禾谷鐮孢菌(fusariumgraminearum)，更適當地得自禾谷鐮孢菌ph-1。在另一個實施方案中，根據本發(fā)明使用的三肽基肽酶可獲得(例如獲得)自暗球腔菌屬(phaeosphaeria)，適當地得自小麥穎枯病菌(phaeosphaerianodorum)，更適當地得自小麥穎枯病菌sn15。在另一個實施方案中，根據本發(fā)明使用的耐脯氨酸三肽基肽酶可獲得(例如獲得)自傘草屬(agaricus)，適當地得自雙孢蘑菇(agaricusbisporus)，更適當地得自雙孢蘑菇變種burnettiijb137-s8。在另一個實施方案中，根據本發(fā)明使用的三肽基肽酶可獲得(例如獲得)自枝頂孢屬(acremonium)，適當地得自嗜堿枝頂孢(acremoniumalcalophilum)。在另一個實施方案中，根據本發(fā)明使用的耐脯氨酸三肽基肽酶可獲得(例如獲得)自sodiomyces，適當地得自sodiomycesalkalinus。在一個實施方案中，根據本發(fā)明使用的三肽基肽酶可獲得(例如獲得)自青霉屬(penicillium)。適當地，三肽基肽酶可獲自指狀青霉菌(penicilliumdigitatum)，更適當地得自指狀青霉菌pd1。適當地，三肽基肽酶可獲自草酸青霉(penicilliumoxalicum)，更適當地得自草酸青霉114-2。適當地，三肽基肽酶可獲自羅克福爾青霉菌(penicilliumroqueforti)，更適當地得自羅克福爾青霉菌fm164。適當地，三肽基肽酶可獲自產紅青霉(ppenicilliumrubens)，更適當地得自產紅青霉wisconsin54-1255。在另一個實施方案中，根據本發(fā)明使用的三肽基肽酶可獲得(例如獲得)自新薩托菌屬(neosartorya)。適當地，三肽基肽酶可獲自費氏新薩托菌(pneosartoryafischeri)，更適當地得自費氏新薩托菌nrrl181。在一個實施方案中，根據本發(fā)明使用的三肽基肽酶(例如，耐脯氨酸三肽基肽酶)不可獲得(例如獲得)自黑曲霉(aspergillusniger)。至少一種三肽基肽酶可：(a)包含氨基酸序列seqidno.29、seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4、seqidno.5、seqidno.6、seqidno.7、seqidno.8、seqidno.9、seqidno.10、seqidno.11、seqidno.12、seqidno.13、seqidno.14、seqidno.15、seqidno.16、seqidno.17、seqidno.18、seqidno.19、seqidno.20、seqidno.21、seqidno.22、seqidno.23、seqidno.24、seqidno.25、seqidno.26、seqidno.27、seqidno.28、seqidno.30、seqidno.31、seqidno.32、seqidno.33、seqidno.34、seqidno.35、seqidno.36、seqidno.37、seqidno.38、seqidno.39、seqidno.40、seqidno.41、seqidno.42、seqidno.43、seqidno.44、seqidno.45、seqidno.46、seqidno.47、seqidno.48、seqidno.49、seqidno.50、seqidno.51、seqidno.52、seqidno.53、seqidno.54、seqidno.55或它們的功能性片段；(b)包含與seqidno.29、seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4、seqidno.5、seqidno.6、seqidno.7、seqidno.8、seqidno.9、seqidno.10、seqidno.11、seqidno.12、seqidno.13、seqidno.14、seqidno.15、seqidno.16、seqidno.17、seqidno.18、seqidno.19、seqidno.20、seqidno.21、seqidno.22、seqidno.23、seqidno.24、seqidno.25、seqidno.26、seqidno.27、seqidno.28、seqidno.30、seqidno.31、seqidno.32、seqidno.33、seqidno.34、seqidno.35、seqidno.36、seqidno.37、seqidno.38、seqidno.39、seqidno.40、seqidno.41、seqidno.42、seqidno.43、seqidno.44、seqidno.45、seqidno.46、seqidno.47、seqidno.48、seqidno.49、seqidno.50、seqidno.51、seqidno.52、seqidno.53、seqidno.54、seqidno.55或它們的功能性片段具有至少70％的同一性的氨基酸；(c)由包含序列seqidno.56、seqidno.57、seqidno.58、seqidno.59、seqidno.60、seqidno.61、seqidno.62、seqidno.63、seqidno.64、seqidno.65、seqidno.66、seqidno.67、seqidno.68、seqidno.69、seqidno.70、seqidno.71、seqidno.72、seqidno.73、seqidno.74、seqidno.75、seqidno.76、seqidno.77、seqidno.78、seqidno.79、seqidno.80、seqidno.81、seqidno.82、seqidno.83、seqidno.84、seqidno.85、seqidno.86、seqidno.87、seqidno.88、seqidno.89、seqidno.90、seqidno.91、seqidno.92、seqidno.93、seqidno.94或seqidno.95的核苷酸序列編碼；(d)由與seqidno.56、seqidno.57、seqidno.58、seqidno.59、seqidno.60、seqidno.61、seqidno.62、seqidno.63、seqidno.64、seqidno.65、seqidno.66、seqidno.67、seqidno.68、seqidno.69、seqidno.70、seqidno.71、seqidno.72、seqidno.73、seqidno.74、seqidno.75、seqidno.76、seqidno.77、seqidno.78、seqidno.79、seqidno.80、seqidno.81、seqidno.82、seqidno.83、seqidno.84、seqidno.85、seqidno.86、seqidno.87、seqidno.88、seqidno.89、seqidno.90、seqidno.91、seqidno.92、seqidno.93、seqidno.94或seqidno.95具有至少約70％的序列同一性的核苷酸序列編碼；(e)由在中等嚴格性條件下與seqidno.56、seqidno.57、seqidno.58、seqidno.59、seqidno.60、seqidno.61、seqidno.62、seqidno.63、seqidno.64、seqidno.65、seqidno.66、seqidno.67、seqidno.68、seqidno.69、seqidno.70、seqidno.71、seqidno.72、seqidno.73、seqidno.74、seqidno.75、seqidno.76、seqidno.77、seqidno.78、seqidno.79、seqidno.80、seqidno.81、seqidno.82、seqidno.83、seqidno.84、seqidno.85、seqidno.86、seqidno.87、seqidno.88、seqidno.89、seqidno.90、seqidno.91、seqidno.92、seqidno.93、seqidno.94或seqidno.95雜交的核苷酸序列編碼；或(f)由因遺傳密碼的簡并性而不同于seqidno.56、seqidno.57、seqidno.58、seqidno.59、seqidno.60、seqidno.61、seqidno.62、seqidno.63、seqidno.64、seqidno.65、seqidno.66、seqidno.67、seqidno.68、seqidno.69、seqidno.70、seqidno.71、seqidno.72、seqidno.73、seqidno.74、seqidno.75、seqidno.76、seqidno.77、seqidno.78、seqidno.79、seqidno.80、seqidno.81、seqidno.82、seqidno.83、seqidno.84、seqidno.85、seqidno.86、seqidno.87、seqidno.88、seqidno.89、seqidno.90、seqidno.91、seqidno.92、seqidno.93、seqidno.94或seqidno.95的核苷酸序列編碼。三肽基肽酶可表達為經歷進一步轉錄后和/或翻譯后修飾的多肽序列。在一個實施方案中，三肽基肽酶可包含氨基酸序列seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4、seqidno.5、seqidno.6、seqidno.7、seqidno.8、seqidno.9、seqidno.10、seqidno.11、seqidno.12、seqidno.13、seqidno.14、seqidno.15、seqidno.16、seqidno.17、seqidno.18、seqidno.19、seqidno.20、seqidno.21、seqidno.22、seqidno.23、seqidno.24、seqidno.25、seqidno.26、seqidno.27、seqidno.28或它們的功能性片段。在另一個實施方案中，三肽基肽酶包含與seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4、seqidno.5、seqidno.6、seqidno.7、seqidno.8、seqidno.9、seqidno.10、seqidno.11、seqidno.12、seqidno.13、seqidno.14、seqidno.15、seqidno.16、seqidno.17、seqidno.18、seqidno.19、seqidno.20、seqidno.21、seqidno.22、seqidno.23、seqidno.24、seqidno.25、seqidno.26、seqidno.27、seqidno.28或它們的功能性片段具有至少70％的同一性的氨基酸。在一個實施方案中，三肽基肽酶可包含氨基酸序列seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4、seqidno.5、seqidno.6、seqidno.7、seqidno.8、seqidno.9、seqidno.10、seqidno.11、seqidno.12、seqidno.13、seqidno.14、seqidno.15、seqidno.16、seqidno.17、seqidno.18或它們的功能性片段。在另一個實施方案中，三肽基肽酶包含與seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4、seqidno.5、seqidno.6、seqidno.7、seqidno.8、seqidno.9、seqidno.10、seqidno.11、seqidno.12、seqidno.13、seqidno.14、seqidno.15、seqidno.16、seqidno.17、seqidno.18或它們的功能性片段具有至少70％的同一性的氨基酸。在另一個實施方案中，三肽基肽酶可為已經歷轉錄后和/或翻譯后修飾(例如，翻譯后切割)的“成熟”三肽基肽酶。適當地，此類修飾可導致酶的活化。適當地，三肽基肽酶可包含氨基酸序列seqidno.29、seqidno.30、seqidno.31、seqidno.32、seqidno.33、seqidno.34、seqidno.35、seqidno.36、seqidno.37、seqidno.38、seqidno.39、seqidno.40、seqidno.41、seqidno.42、seqidno.43、seqidno.44、seqidno.45、seqidno.46、seqidno.47、seqidno.48、seqidno.49、seqidno.50、seqidno.51、seqidno.52、seqidno.53、seqidno.54、seqidno.55或它們的功能性片段。在另一個實施方案中，三肽基肽酶包含與seqidno.29、seqidno.30、seqidno.31、seqidno.32、seqidno.33、seqidno.34、seqidno.35、seqidno.36、seqidno.37、seqidno.38、seqidno.39、seqidno.40、seqidno.41、seqidno.42、seqidno.43、seqidno.44、seqidno.45、seqidno.46、seqidno.47、seqidno.48、seqidno.49、seqidno.50、seqidno.51、seqidno.52、seqidno.53、seqidno.54、seqidno.55或它們的功能性片段具有至少70％的同一性的氨基酸。在另一個實施方案中，三肽基肽酶可包含氨基酸序列seqidno.29、seqidno.30、seqidno.31、seqidno.32、seqidno.33、seqidno.34、seqidno.35、seqidno.36、seqidno.37、seqidno.38、seqidno.39、seqidno.40、seqidno.41、seqidno.42、seqidno.43、seqidno.44、seqidno.45或它們的功能性片段。在另一個實施方案中，三肽基肽酶包含與seqidno.29、seqidno.30、seqidno.31、seqidno.32、seqidno.33、seqidno.34、seqidno.35、seqidno.36、seqidno.37、seqidno.38、seqidno.39、seqidno.40、seqidno.41、seqidno.42、seqidno.43、seqidno.44、seqidno.45或它們的功能性片段具有至少70％的同一性的氨基酸。術語“功能性片段”為氨基酸序列的保持其肽酶活性的部分。換句話講，其為氨基酸序列的保持如本文所定義的三肽基肽酶活性(例如保持如使用本文教導的ebsa測定所測量的三肽基肽酶活性)的部分。在一個實施方案中，三肽基肽酶的功能性片段可為耐脯氨酸三肽基肽酶的功能性片段。耐脯氨酸三肽基肽酶的功能性片段為耐脯氨酸三肽基肽酶的主要具有外肽酶活性的部分，其中所述耐脯氨酸三肽基肽酶能夠從(i)(a)在p1處具有脯氨酸；以及(b)在p1處具有選自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸或合成氨基酸的氨基酸的肽的n-末端切割三肽；和/或能夠從(ii)(a’)在p1’處具有脯氨酸；以及(b’)在p1’處具有選自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸或合成氨基酸的氨基酸的肽的n-末端切割三肽。另選地或除此之外，耐脯氨酸三肽基肽酶的功能性片段為耐脯氨酸三肽基肽酶的主要具有外肽酶活性的部分，并且能夠從在p1和p1’處具有脯氨酸的肽的n-末端切割三肽?！安糠帧睘槿跃哂腥缟隙x的活性的任何部分，適當地，該部分的長度可為至少50個氨基酸，更適當地至少100個氨基酸。在其它實施方案中，所述部分的長度可為約150個氨基酸或約200個氨基酸。在一個實施方案中，在轉錄后和/或翻譯后修飾(例如，切割)之后，功能性片段可為三肽基肽酶的一部分。適當地，功能性片段可包含如下所示的序列：seqidno.29、seqidno.30、seqidno.31、seqidno.32、seqidno.33、seqidno.34、seqidno.35、seqidno.36、seqidno.37、seqidno.38、seqidno.39、seqidno.40、seqidno.41、seqidno.42、seqidno.43、seqidno.44、seqidno.45、seqidno.46、seqidno.47、seqidno.48、seqidno.49、seqidno.50、seqidno.51、seqidno.52、seqidno.53、seqidno.54或seqidno.55。三肽基肽酶可包含選自seqidno.1或其功能性片段的一種或多種氨基酸序列。三肽基肽酶可包含與seqidno.1或其功能性片段具有至少70％的同一性的氨基酸。三肽基肽酶可包含選自seqidno.2或其功能性片段的一種或多種氨基酸序列。三肽基肽酶可包含與seqidno.2或其功能性片段具有至少70％的同一性的氨基酸。耐脯氨酸三肽基肽酶可包含選自seqidno.3或其功能性片段的一種或多種氨基酸序列。三肽基肽酶可包含與seqidno.3或其功能性片段具有至少70％的同一性的氨基酸。三肽基肽酶可包含選自seqidno.4或其功能性片段的一種或多種氨基酸序列。三肽基肽酶可包含與seqidno.4或其功能性片段具有至少70％的同一性的氨基酸。三肽基肽酶可包含選自seqidno.5或其功能性片段的一種或多種氨基酸序列。三肽基肽酶可包含與seqidno.5或其功能性片段具有至少70％的同一性的氨基酸。三肽基肽酶可包含選自seqidno.6或其功能性片段的一種或多種氨基酸序列。三肽基肽酶可包含與seqidno.6或其功能性片段具有至少70％的同一性的氨基酸。三肽基肽酶可包含選自seqidno.7或其功能性片段的一種或多種氨基酸序列。三肽基肽酶可包含與seqidno.7或其功能性片段具有至少70％的同一性的氨基酸。三肽基肽酶可包含選自seqidno.8或其功能性片段的一種或多種氨基酸序列。三肽基肽酶可包含與seqidno.8或其功能性片段具有至少70％的同一性的氨基酸。三肽基肽酶可包含選自seqidno.9或其功能性片段的一種或多種氨基酸序列。三肽基肽酶可包含與seqidno.9或其功能性片段具有至少70％的同一性的氨基酸。三肽基肽酶可包含選自seqidno.10或其功能性片段的一種或多種氨基酸序列。三肽基肽酶可包含與seqidno.10或其功能性片段具有至少70％的同一性的氨基酸。三肽基肽酶可包含選自seqidno.11或其功能性片段的一種或多種氨基酸序列。三肽基肽酶可包含與seqidno.11或其功能性片段具有至少70％的同一性的氨基酸。三肽基肽酶可包含選自seqidno.12或其功能性片段的一種或多種氨基酸序列。三肽基肽酶可包含與seqidno.12或其功能性片段具有至少70％的同一性的氨基酸。三肽基肽酶可包含選自seqidno.13或其功能性片段的一種或多種氨基酸序列。三肽基肽酶可包含與seqidno.13或其功能性片段具有至少70％的同一性的氨基酸。三肽基肽酶可包含選自seqidno.14或其功能性片段的一種或多種氨基酸序列。三肽基肽酶可包含與seqidno.14或其功能性片段具有至少70％的同一性的氨基酸。三肽基肽酶可包含選自seqidno.15或其功能性片段的一種或多種氨基酸序列。三肽基肽酶可包含與seqidno.15或其功能性片段具有至少70％的同一性的氨基酸。三肽基肽酶可包含選自seqidno.16或其功能性片段的一種或多種氨基酸序列。三肽基肽酶可包含與seqidno.16或其功能性片段具有至少70％的同一性的氨基酸。三肽基肽酶可包含選自seqidno.17或其功能性片段的一種或多種氨基酸序列。三肽基肽酶可包含與seqidno.17或其功能性片段具有至少70％的同一性的氨基酸。三肽基肽酶可包含選自seqidno.18或其功能性片段的一種或多種氨基酸序列。三肽基肽酶可包含與seqidno.18或其功能性片段具有至少70％的同一性的氨基酸。三肽基肽酶可包含選自seqidno.19或其功能性片段的一種或多種氨基酸序列。三肽基肽酶可包含與seqidno.19或其功能性片段具有至少70％的同一性的氨基酸。三肽基肽酶可包含選自seqidno.20或其功能性片段的一種或多種氨基酸序列。三肽基肽酶可包含與seqidno.20或其功能性片段具有至少70％的同一性的氨基酸。三肽基肽酶可包含選自seqidno.21或其功能性片段的一種或多種氨基酸序列。三肽基肽酶可包含與seqidno.21或其功能性片段具有至少70％的同一性的氨基酸。三肽基肽酶可包含選自seqidno.22或其功能性片段的一種或多種氨基酸序列。三肽基肽酶可包含與seqidno.22或其功能性片段具有至少70％的同一性的氨基酸。三肽基肽酶可包含選自seqidno.23或其功能性片段的一種或多種氨基酸序列。三肽基肽酶可包含與seqidno.23或其功能性片段具有至少70％的同一性的氨基酸。三肽基肽酶可包含選自seqidno.24或其功能性片段的一種或多種氨基酸序列。三肽基肽酶可包含與seqidno.24或其功能性片段具有至少70％的同一性的氨基酸。三肽基肽酶可包含選自seqidno.25或其功能性片段的一種或多種氨基酸序列。三肽基肽酶可包含與seqidno.25或其功能性片段具有至少70％的同一性的氨基酸。三肽基肽酶可包含選自seqidno.26或其功能性片段的一種或多種氨基酸序列。三肽基肽酶可包含與seqidno.26或其功能性片段具有至少70％的同一性的氨基酸。三肽基肽酶可包含選自seqidno.27或其功能性片段的一種或多種氨基酸序列。三肽基肽酶可包含與seqidno.27或其功能性片段具有至少70％的同一性的氨基酸。三肽基肽酶可包含選自seqidno.28或其功能性片段的一種或多種氨基酸序列。三肽基肽酶可包含與seqidno.28或其功能性片段具有至少70％的同一性的氨基酸。三肽基肽酶可包含選自seqidno.29或其功能性片段的一種或多種氨基酸序列。三肽基肽酶可包含與seqidno.29或其功能性片段具有至少70％的同一性的氨基酸。三肽基肽酶可包含選自seqidno.30或其功能性片段的一種或多種氨基酸序列。三肽基肽酶可包含與seqidno.30或其功能性片段具有至少70％的同一性的氨基酸。三肽基肽酶可包含選自seqidno.31或其功能性片段的一種或多種氨基酸序列。三肽基肽酶可包含與seqidno.31或其功能性片段具有至少70％的同一性的氨基酸。三肽基肽酶可包含選自seqidno.32或其功能性片段的一種或多種氨基酸序列。三肽基肽酶可包含與seqidno.32或其功能性片段具有至少70％的同一性的氨基酸。三肽基肽酶可包含選自seqidno.33或其功能性片段的一種或多種氨基酸序列。三肽基肽酶可包含與seqidno.33或其功能性片段具有至少70％的同一性的氨基酸。三肽基肽酶可包含選自seqidno.34或其功能性片段的一種或多種氨基酸序列。三肽基肽酶可包含與seqidno.34或其功能性片段具有至少70％的同一性的氨基酸。三肽基肽酶可包含選自seqidno.35或其功能性片段的一種或多種氨基酸序列。三肽基肽酶可包含與seqidno.35或其功能性片段具有至少70％的同一性的氨基酸。三肽基肽酶可包含選自seqidno.36或其功能性片段的一種或多種氨基酸序列。三肽基肽酶可包含與seqidno.36或其功能性片段具有至少70％的同一性的氨基酸。三肽基肽酶可包含選自seqidno.37或其功能性片段的一種或多種氨基酸序列。三肽基肽酶可包含與seqidno.37或其功能性片段具有至少70％的同一性的氨基酸。三肽基肽酶可包含選自seqidno.38或其功能性片段的一種或多種氨基酸序列。三肽基肽酶可包含與seqidno.38或其功能性片段具有至少70％的同一性的氨基酸。三肽基肽酶可包含選自seqidno.39或其功能性片段的一種或多種氨基酸序列。三肽基肽酶可包含與seqidno.39或其功能性片段具有至少70％的同一性的氨基酸。三肽基肽酶可包含選自seqidno.40或其功能性片段的一種或多種氨基酸序列。三肽基肽酶可包含與seqidno.40或其功能性片段具有至少70％的同一性的氨基酸。三肽基肽酶可包含選自seqidno.41或其功能性片段的一種或多種氨基酸序列。三肽基肽酶可包含與seqidno.41或其功能性片段具有至少70％的同一性的氨基酸。三肽基肽酶可包含選自seqidno.42或其功能性片段的一種或多種氨基酸序列。三肽基肽酶可包含與seqidno.42或其功能性片段具有至少70％的同一性的氨基酸。三肽基肽酶可包含選自seqidno.43或其功能性片段的一種或多種氨基酸序列。三肽基肽酶可包含與seqidno.43或其功能性片段具有至少70％的同一性的氨基酸。三肽基肽酶可包含選自seqidno.44或其功能性片段的一種或多種氨基酸序列。三肽基肽酶可包含與seqidno.44或其功能性片段具有至少70％的同一性的氨基酸。三肽基肽酶可包含選自seqidno.45或其功能性片段的一種或多種氨基酸序列。三肽基肽酶可包含與seqidno.45或其功能性片段具有至少70％的同一性的氨基酸。三肽基肽酶可包含選自seqidno.46或其功能性片段的一種或多種氨基酸序列。三肽基肽酶可包含與seqidno.46或其功能性片段具有至少70％的同一性的氨基酸。三肽基肽酶可包含選自seqidno.47或其功能性片段的一種或多種氨基酸序列。三肽基肽酶可包含與seqidno.47或其功能性片段具有至少70％的同一性的氨基酸。三肽基肽酶可包含選自seqidno.48或其功能性片段的一種或多種氨基酸序列。三肽基肽酶可包含與seqidno.48或其功能性片段具有至少70％的同一性的氨基酸。三肽基肽酶可包含選自seqidno.49或其功能性片段的一種或多種氨基酸序列。三肽基肽酶可包含與seqidno.49或其功能性片段具有至少70％的同一性的氨基酸。三肽基肽酶可包含選自seqidno.50或其功能性片段的一種或多種氨基酸序列。三肽基肽酶可包含與seqidno.50或其功能性片段具有至少70％的同一性的氨基酸。三肽基肽酶可包含選自seqidno.51或其功能性片段的一種或多種氨基酸序列。三肽基肽酶可包含與seqidno.51或其功能性片段具有至少70％的同一性的氨基酸。三肽基肽酶可包含選自seqidno.52或其功能性片段的一種或多種氨基酸序列。三肽基肽酶可包含與seqidno.52或其功能性片段具有至少70％的同一性的氨基酸。三肽基肽酶可包含選自seqidno.53或其功能性片段的一種或多種氨基酸序列。三肽基肽酶可包含與seqidno.53或其功能性片段具有至少70％的同一性的氨基酸。三肽基肽酶可包含選自seqidno.54或其功能性片段的一種或多種氨基酸序列。三肽基肽酶可包含與seqidno.54或其功能性片段具有至少70％的同一性的氨基酸。三肽基肽酶可包含選自seqidno.55或其功能性片段的一種或多種氨基酸序列。三肽基肽酶可包含與seqidno.55或其功能性片段具有至少70％的同一性的氨基酸。適當地，三肽基肽酶可包含與seqidno.29、seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4、seqidno.5、seqidno.6、seqidno.7、seqidno.8、seqidno.9、seqidno.10、seqidno.11、seqidno.12、seqidno.13、seqidno.14、seqidno.15、seqidno.16、seqidno.17、seqidno.18、seqidno.19、seqidno.20、seqidno.21、seqidno.22、seqidno.23、seqidno.24、seqidno.25、seqidno.26、seqidno.27、seqidno.28、seqidno.30、seqidno.31、seqidno.32、seqidno.33、seqidno.34、seqidno.35、seqidno.36、seqidno.37、seqidno.38、seqidno.39、seqidno.40、seqidno.41、seqidno.42、seqidno.43、seqidno.44、seqidno.45、seqidno.46、seqidno.47、seqidno.48、seqidno.49、seqidno.50、seqidno.51、seqidno.52、seqidno.53、seqidno.54、seqidno.55或它們的功能性片段具有至少80％的同一性的氨基酸。適當地，三肽基肽酶可包含與seqidno.29、seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4、seqidno.5、seqidno.6、seqidno.7、seqidno.8、seqidno.9、seqidno.10、seqidno.11、seqidno.12、seqidno.13、seqidno.14、seqidno.15、seqidno.16、seqidno.17、seqidno.18、seqidno.19、seqidno.20、seqidno.21、seqidno.22、seqidno.23、seqidno.24、seqidno.25、seqidno.26、seqidno.27、seqidno.28、seqidno.30、seqidno.31、seqidno.32、seqidno.33、seqidno.34、seqidno.35、seqidno.36、seqidno.37、seqidno.38、seqidno.39、seqidno.40、seqidno.41、seqidno.42、seqidno.43、seqidno.44、seqidno.45、seqidno.46、seqidno.47、seqidno.48、seqidno.49、seqidno.50、seqidno.51、seqidno.52、seqidno.53、seqidno.54、seqidno.55或它們的功能性片段具有至少85％的同一性的氨基酸。適當地，三肽基肽酶可包含與seqidno.29、seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4、seqidno.5、seqidno.6、seqidno.7、seqidno.8、seqidno.9、seqidno.10、seqidno.11、seqidno.12、seqidno.13、seqidno.14、seqidno.15、seqidno.16、seqidno.17、seqidno.18、seqidno.19、seqidno.20、seqidno.21、seqidno.22、seqidno.23、seqidno.24、seqidno.25、seqidno.26、seqidno.27、seqidno.28、seqidno.30、seqidno.31、seqidno.32、seqidno.33、seqidno.34、seqidno.35、seqidno.36、seqidno.37、seqidno.38、seqidno.39、seqidno.40、seqidno.41、seqidno.42、seqidno.43、seqidno.44、seqidno.45、seqidno.46、seqidno.47、seqidno.48、seqidno.49、seqidno.50、seqidno.51、seqidno.52、seqidno.53、seqidno.54、seqidno.55或它們的功能性片段具有至少90％的同一性的氨基酸。適當地，三肽基肽酶可包含與seqidno.29、seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4、seqidno.5、seqidno.6、seqidno.7、seqidno.8、seqidno.9、seqidno.10、seqidno.11、seqidno.12、seqidno.13、seqidno.14、seqidno.15、seqidno.16、seqidno.17、seqidno.18、seqidno.19、seqidno.20、seqidno.21、seqidno.22、seqidno.23、seqidno.24、seqidno.25、seqidno.26、seqidno.27、seqidno.28、seqidno.30、seqidno.31、seqidno.32、seqidno.33、seqidno.34、seqidno.35、seqidno.36、seqidno.37、seqidno.38、seqidno.39、seqidno.40、seqidno.41、seqidno.42、seqidno.43、seqidno.44、seqidno.45、seqidno.46、seqidno.47、seqidno.48、seqidno.49、seqidno.50、seqidno.51、seqidno.52、seqidno.53、seqidno.54、seqidno.55或它們的功能性片段具有至少95％的同一性的氨基酸。適當地，三肽基肽酶可包含與seqidno.29、seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4、seqidno.5、seqidno.6、seqidno.7、seqidno.8、seqidno.9、seqidno.10、seqidno.11、seqidno.12、seqidno.13、seqidno.14、seqidno.15、seqidno.16、seqidno.17、seqidno.18、seqidno.19、seqidno.20、seqidno.21、seqidno.22、seqidno.23、seqidno.24、seqidno.25、seqidno.26、seqidno.27、seqidno.28、seqidno.30、seqidno.31、seqidno.32、seqidno.33、seqidno.34、seqidno.35、seqidno.36、seqidno.37、seqidno.38、seqidno.39、seqidno.40、seqidno.41、seqidno.42、seqidno.43、seqidno.44、seqidno.45、seqidno.46、seqidno.47、seqidno.48、seqidno.49、seqidno.50、seqidno.51、seqidno.52、seqidno.53、seqidno.54、seqidno.55或它們的功能性片段具有至少97％的同一性的氨基酸。適當地，三肽基肽酶可包含與seqidno.29、seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4、seqidno.5、seqidno.6、seqidno.7、seqidno.8、seqidno.9、seqidno.10、seqidno.11、seqidno.12、seqidno.13、seqidno.14、seqidno.15、seqidno.16、seqidno.17、seqidno.18、seqidno.19、seqidno.20、seqidno.21、seqidno.22、seqidno.23、seqidno.24、seqidno.25、seqidno.26、seqidno.27、seqidno.28、seqidno.30、seqidno.31、seqidno.32、seqidno.33、seqidno.34、seqidno.35、seqidno.36、seqidno.37、seqidno.38、seqidno.39、seqidno.40、seqidno.41、seqidno.42、seqidno.43、seqidno.44、seqidno.45、seqidno.46、seqidno.47、seqidno.48、seqidno.49、seqidno.50、seqidno.51、seqidno.52、seqidno.53、seqidno.54、seqidno.55或它們的功能性片段具有至少99％的同一性的氨基酸。在一個實施方案中，三肽基肽酶可包含選自以下項中的一者或多者的氨基酸序列：seqidno.29、seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4、seqidno.5、seqidno.6、seqidno.7、seqidno.8、seqidno.9、seqidno.10、seqidno.11、seqidno.12、seqidno.13、seqidno.14、seqidno.15、seqidno.16、seqidno.17、seqidno.18、seqidno.19、seqidno.20、seqidno.21、seqidno.22、seqidno.23、seqidno.24、seqidno.25、seqidno.26、seqidno.27、seqidno.28、seqidno.30、seqidno.31、seqidno.32、seqidno.33、seqidno.34、seqidno.35、seqidno.36、seqidno.37、seqidno.38、seqidno.39、seqidno.40、seqidno.41、seqidno.42、seqidno.43、seqidno.44、seqidno.45、seqidno.46、seqidno.47、seqidno.48、seqidno.49、seqidno.50、seqidno.51、seqidno.52、seqidno.53、seqidno.54、seqidno.55。在一些實施方案中，三肽基肽酶可包含選自以下項中的一者或多者的氨基酸序列：seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.29和seqidno.30、或與其具有至少70％的同一性的序列。適當地，與其具有至少80％的同一性或與其具有至少90％的同一性的序列。在一些實施方案中，可能合適的是三肽基肽酶可包含選自以下的氨基酸序列：seqidno.3、seqidno.4、seqidno.30和seqidno.31、或與其具有至少70％的同一性的序列。適當地，與其具有至少80％的同一性或與其具有至少90％的同一性的序列。有利地，這些特定氨基酸序列可能特別適于切割富含賴氨酸、精氨酸和/或甘氨酸的肽和/或蛋白質底物。特別是在賴氨酸、精氨酸和/或甘氨酸存在于p1位置的情況下。在其它實施方案中，三肽基肽酶可包含選自以下項中的一者或多者的氨基酸序列：seqidno.1、seqidno.2、seqidno.5、seqidno.6、seqidno.7、seqidno.29、seqidno.32、seqidno.33和seqidno.34、或與其具有至少70％的同一性的序列。適當地，與其具有至少80％的同一性或與其具有至少90％的同一性的序列。適當地，耐脯氨酸三肽基肽酶可具有序列seqidno.1、seqidno.2或seqidno.29。三肽基肽酶可包含一個或多個選自以下的序列基序：xeanld、y’tzx’g和qnfsv。適當地，三肽基肽酶可包含xeanld。x可為選自以下的一種或多種氨基酸：g、t、s和v。在另一個實施方案中，耐脯氨酸三肽基肽酶可包含y’tzx’g。y’可為選自以下的一種或多種氨基酸：i、l和v。z可為選自以下的一種或多種氨基酸：s和t。x’可為選自以下的一種或多種氨基酸：i和v。在另一個實施方案中，三肽基肽酶可包含序列基序qnfsv。在另一個實施方案中，三肽基肽酶可包含序列基序xeanld和y’tzx’g或xeanld和qnfsv。在另一個實施方案中，三肽基肽酶可包含序列基序y’tzx’g和qnfsv。適當地，三肽基肽酶可包含序列基序xeanld、y’tzx’g和qnfsv。一個或多個基序存在于本發(fā)明所用的三肽基肽酶中。圖13指出了這些基序的定位。在一個實施方案中，三肽基肽酶可由如seqidno.56、seqidno.57、seqidno.58、seqidno.59、seqidno.60、seqidno.61、seqidno.62、seqidno.63、seqidno.64、seqidno.65、seqidno.66、seqidno.67、seqidno.68、seqidno.69、seqidno.70、seqidno.71、seqidno.72、seqidno.73、seqidno.74、seqidno.75、seqidno.76、seqidno.77、seqidno.78、seqidno.79、seqidno.80所示的核苷酸序列或與其具有至少70％的同一性的核苷酸序列編碼。適當地，由與其具有至少80％的同一性或與其具有至少90％的同一性的序列編碼。優(yōu)選地，三肽基肽酶可由與seqidno.56、seqidno.57、seqidno.58、seqidno.59、seqidno.60、seqidno.61、seqidno.62、seqidno.63、seqidno.64、seqidno.65、seqidno.66、seqidno.67、seqidno.68、seqidno.69、seqidno.70、seqidno.71、seqidno.72、seqidno.73、seqidno.74、seqidno.75、seqidno.76、seqidno.77、seqidno.78、seqidno.79或seqidno.80具有至少95％的序列同一性，更優(yōu)選與seqidno.56、seqidno.57、seqidno.58、seqidno.59、seqidno.60、seqidno.61、seqidno.62、seqidno.63、seqidno.64、seqidno.65、seqidno.66、seqidno.67、seqidno.68、seqidno.69、seqidno.70、seqidno.71、seqidno.72、seqidno.73、seqidno.74、seqidno.75、seqidno.76、seqidno.77、seqidno.78、seqidno.79或seqidno.80具有至少99％的同一性的核苷酸序列編碼。在另一個實施方案中，三肽基肽酶可由在中等嚴格性條件下與seqidno.56、seqidno.57、seqidno.58、seqidno.59、seqidno.60、seqidno.61、seqidno.62、seqidno.63、seqidno.64、seqidno.65、seqidno.66、seqidno.67、seqidno.68、seqidno.69、seqidno.70、seqidno.71、seqidno.72、seqidno.73、seqidno.74、seqidno.75、seqidno.76、seqidno.77、seqidno.78、seqidno.79、seqidno.80雜交的核苷酸序列編碼。適當地，由在高嚴格性條件下與seqidno.56、seqidno.57、seqidno.58、seqidno.59、seqidno.60、seqidno.61、seqidno.62、seqidno.63、seqidno.64、seqidno.65、seqidno.66、seqidno.67、seqidno.68、seqidno.69、seqidno.70、seqidno.71、seqidno.72、seqidno.73、seqidno.74、seqidno.75、seqidno.76、seqidno.77、seqidno.78、seqidno.79、seqidno.80雜交的核苷酸序列編碼。在另一個實施方案中，三肽基肽酶可由因遺傳密碼的簡并性而不同于seqidno.56、seqidno.57、seqidno.58、seqidno.59、seqidno.60、seqidno.61、seqidno.62、seqidno.63、seqidno.64、seqidno.65、seqidno.66、seqidno.67、seqidno.68、seqidno.69、seqidno.70、seqidno.71、seqidno.72、seqidno.73、seqidno.74、seqidno.75、seqidno.76、seqidno.77、seqidno.78、seqidno.79、seqidno.80的核苷酸序列編碼。在一個實施方案中，核苷酸序列可為dna、cdna、合成dna和/或rna序列，該核苷酸序列包含如seqidno.56、seqidno.57、seqidno.58、seqidno.59、seqidno.60、seqidno.61、seqidno.62、seqidno.63、seqidno.64、seqidno.65、seqidno.66、seqidno.67、seqidno.68、seqidno.69、seqidno.70、seqidno.71、seqidno.72、seqidno.73、seqidno.74、seqidno.75、seqidno.76、seqidno.77、seqidno.78、seqidno.79、seqidno.80、seqidno.81、seqidno.82、seqidno.83、seqidno.84、seqidno.85、seqidno.86、seqidno.87、seqidno.88、seqidno.89、seqidno.90、seqidno.91、seqidno.92、seqidno.93、seqidno.94或seqidno.95所示的核苷酸序列。優(yōu)選地，該序列為dna序列，更優(yōu)選地編碼本發(fā)明的三肽基肽酶的cdna序列。在一個方面，優(yōu)選地，本發(fā)明中使用的氨基酸和/或核苷酸序列是分離的形式。術語“分離”意指至少基本上不含至少一種如在自然界中發(fā)現(xiàn)的那樣以及本質上與序列天然相關的其它組分的序列。用于本發(fā)明的氨基酸和/或核苷酸序列可以基本上不含所述物質原本與之相關聯(lián)的一種或多種污染物的形式提供。因此，例如，其可基本上不含一或多種潛在污染性的多肽和/或核酸分子。在一個方面，優(yōu)選地，在本發(fā)明中使用的氨基酸和/或核苷酸序列是純化的形式。術語“純化的”意指給定的組分是以高水平存在。組分有利地是組合物中存在的主要組分。優(yōu)選地，其以至少約90％、或至少約95％或至少約98％的水平存在，所述水平是相對于所考慮總組合物以干重/基于干重來測定。酶在一個實施方案中，在本發(fā)明中使用的酶可為耐脯氨酸三肽基肽酶，包含：seqidno.1、其功能性片段或與seqidno.1具有至少70％的同一性的序列。適當地，酶可與其具有至少80％或85％的同一性。優(yōu)選地，與其具有至少90％或95％的同一性。更優(yōu)選地，與其具有至少97％或99％的同一性。在一個實施方案中，在本發(fā)明中使用的酶可為耐脯氨酸三肽基肽酶，包含：seqidno.2、其功能性片段或與seqidno.2具有至少70％的同一性的序列。適當地，酶可與其具有至少80％或85％的同一性。優(yōu)選地，與其具有至少90％或95％的同一性。更優(yōu)選地，與其具有至少97％或99％的同一性。在一個實施方案中，在本發(fā)明中使用的酶可為耐脯氨酸三肽基肽酶，包含：seqidno.3、其功能性片段或與seqidno.3具有至少70％的同一性的序列。適當地，酶可與其具有至少80％或85％的同一性。優(yōu)選地，與其具有至少90％或95％的同一性。更優(yōu)選地，與其具有至少97％或99％的同一性。在一個實施方案中，在本發(fā)明中使用的酶可為耐脯氨酸三肽基肽酶，包含：seqidno.4、其功能性片段或與seqidno.4具有至少70％的同一性的序列。適當地，酶可與其具有至少80％或85％的同一性。優(yōu)選地，與其具有至少90％或95％的同一性。更優(yōu)選地，與其具有至少97％或99％的同一性。在一個實施方案中，在本發(fā)明中使用的酶可為耐脯氨酸三肽基肽酶，包含：seqidno.5、其功能性片段或與seqidno.5具有至少70％的同一性的序列。適當地，酶可與其具有至少80％或85％的同一性。優(yōu)選地，與其具有至少90％或95％的同一性。更優(yōu)選地，與其具有至少97％或99％的同一性。在一個實施方案中，在本發(fā)明中使用的酶可為耐脯氨酸三肽基肽酶，包含：seqidno.6、其功能性片段或與seqidno.6具有至少70％的同一性的序列。適當地，酶可與其具有至少80％或85％的同一性。優(yōu)選地，與其具有至少90％或95％的同一性。更優(yōu)選地，與其具有至少97％或99％的同一性。在一個實施方案中，在本發(fā)明中使用的酶可為耐脯氨酸三肽基肽酶，包含：seqidno.7、其功能性片段或與seqidno.7具有至少70％的同一性的序列。適當地，酶可與其具有至少80％或85％的同一性。優(yōu)選地，與其具有至少90％或95％的同一性。更優(yōu)選地，與其具有至少97％或99％的同一性。在一個實施方案中，在本發(fā)明中使用的酶可為耐脯氨酸三肽基肽酶，包含：seqidno.8、其功能性片段或與seqidno.8具有至少70％的同一性的序列。適當地，酶可與其具有至少80％或85％的同一性。優(yōu)選地，與其具有至少90％或95％的同一性。更優(yōu)選地，與其具有至少97％或99％的同一性。在一個實施方案中，在本發(fā)明中使用的酶可為耐脯氨酸三肽基肽酶，包含：seqidno.9、其功能性片段或與seqidno.9具有至少70％的同一性的序列。適當地，酶可與其具有至少80％或85％的同一性。優(yōu)選地，與其具有至少90％或95％的同一性。更優(yōu)選地，與其具有至少97％或99％的同一性。在一個實施方案中，在本發(fā)明中使用的酶可為耐脯氨酸三肽基肽酶，包含：seqidno.10、其功能性片段或與seqidno.10具有至少70％的同一性的序列。適當地，酶可與其具有至少80％或85％的同一性。優(yōu)選地，與其具有至少90％或95％的同一性。更優(yōu)選地，與其具有至少97％或99％的同一性。在一個實施方案中，在本發(fā)明中使用的酶可為耐脯氨酸三肽基肽酶，包含：seqidno.11、其功能性片段或與seqidno.11具有至少70％的同一性的序列。適當地，酶可與其具有至少80％或85％的同一性。優(yōu)選地，與其具有至少90％或95％的同一性。更優(yōu)選地，與其具有至少97％或99％的同一性。在一個實施方案中，在本發(fā)明中使用的酶可為耐脯氨酸三肽基肽酶，包含：seqidno.12、其功能性片段或與seqidno.12具有至少70％的同一性的序列。適當地，酶可與其具有至少80％或85％的同一性。優(yōu)選地，與其具有至少90％或95％的同一性。更優(yōu)選地，與其具有至少97％或99％的同一性。在一個實施方案中，在本發(fā)明中使用的酶可為耐脯氨酸三肽基肽酶，包含：seqidno.13、其功能性片段或與seqidno.13具有至少70％的同一性的序列。適當地，酶可與其具有至少80％或85％的同一性。優(yōu)選地，與其具有至少90％或95％的同一性。更優(yōu)選地，與其具有至少97％或99％的同一性。在一個實施方案中，在本發(fā)明中使用的酶可為耐脯氨酸三肽基肽酶，包含：seqidno.14、其功能性片段或與seqidno.14具有至少70％的同一性的序列。適當地，酶可與其具有至少80％或85％的同一性。優(yōu)選地，與其具有至少90％或95％的同一性。更優(yōu)選地，與其具有至少97％或99％的同一性。在一個實施方案中，在本發(fā)明中使用的酶可為耐脯氨酸三肽基肽酶，包含：seqidno.15、其功能性片段或與seqidno.15具有至少70％的同一性的序列。適當地，酶可與其具有至少80％或85％的同一性。優(yōu)選地，與其具有至少90％或95％的同一性。更優(yōu)選地，與其具有至少97％或99％的同一性。在一個實施方案中，在本發(fā)明中使用的酶可為耐脯氨酸三肽基肽酶，包含：seqidno.16、其功能性片段或與seqidno.16具有至少70％的同一性的序列。適當地，酶可與其具有至少80％或85％的同一性。優(yōu)選地，與其具有至少90％或95％的同一性。更優(yōu)選地，與其具有至少97％或99％的同一性。在一個實施方案中，在本發(fā)明中使用的酶可為耐脯氨酸三肽基肽酶，包含：seqidno.17、其功能性片段或與seqidno.17具有至少70％的同一性的序列。適當地，酶可與其具有至少80％或85％的同一性。優(yōu)選地，與其具有至少90％或95％的同一性。更優(yōu)選地，與其具有至少97％或99％的同一性。在一個實施方案中，在本發(fā)明中使用的酶可為耐脯氨酸三肽基肽酶，包含：seqidno.18、其功能性片段或與seqidno.18具有至少70％的同一性的序列。適當地，酶可與其具有至少80％或85％的同一性。優(yōu)選地，與其具有至少90％或95％的同一性。更優(yōu)選地，與其具有至少97％或99％的同一性。在一個實施方案中，在本發(fā)明中使用的酶可為耐脯氨酸三肽基肽酶，包含：seqidno.19、其功能性片段或與seqidno.19具有至少70％的同一性的序列。適當地，酶可與其具有至少80％或85％的同一性。優(yōu)選地，與其具有至少90％或95％的同一性。更優(yōu)選地，與其具有至少97％或99％的同一性。在一個實施方案中，在本發(fā)明中使用的酶可為耐脯氨酸三肽基肽酶，包含：seqidno.20、其功能性片段或與seqidno.20具有至少70％的同一性的序列。適當地，酶可與其具有至少80％或85％的同一性。優(yōu)選地，與其具有至少90％或95％的同一性。更優(yōu)選地，與其具有至少97％或99％的同一性。在一個實施方案中，在本發(fā)明中使用的酶可為耐脯氨酸三肽基肽酶，包含：seqidno.21、其功能性片段或與seqidno.21具有至少70％的同一性的序列。適當地，酶可與其具有至少80％或85％的同一性。優(yōu)選地，與其具有至少90％或95％的同一性。更優(yōu)選地，與其具有至少97％或99％的同一性。在一個實施方案中，在本發(fā)明中使用的酶可為耐脯氨酸三肽基肽酶，包含：seqidno.22、其功能性片段或與seqidno.22具有至少70％的同一性的序列。適當地，酶可與其具有至少80％或85％的同一性。優(yōu)選地，與其具有至少90％或95％的同一性。更優(yōu)選地，與其具有至少97％或99％的同一性。在一個實施方案中，在本發(fā)明中使用的酶可為耐脯氨酸三肽基肽酶，包含：seqidno.23、其功能性片段或與seqidno.23具有至少70％的同一性的序列。適當地，酶可與其具有至少80％或85％的同一性。優(yōu)選地，與其具有至少90％或95％的同一性。更優(yōu)選地，與其具有至少97％或99％的同一性。在一個實施方案中，在本發(fā)明中使用的酶可為耐脯氨酸三肽基肽酶，包含：seqidno.24、其功能性片段或與seqidno.24具有至少70％的同一性的序列。適當地，酶可與其具有至少80％或85％的同一性。優(yōu)選地，與其具有至少90％或95％的同一性。更優(yōu)選地，與其具有至少97％或99％的同一性。在一個實施方案中，在本發(fā)明中使用的酶可為耐脯氨酸三肽基肽酶，包含：seqidno.25、其功能性片段或與seqidno.25具有至少70％的同一性的序列。適當地，酶可與其具有至少80％或85％的同一性。優(yōu)選地，與其具有至少90％或95％的同一性。更優(yōu)選地，與其具有至少97％或99％的同一性。在一個實施方案中，在本發(fā)明中使用的酶可為耐脯氨酸三肽基肽酶，包含：seqidno.26、其功能性片段或與seqidno.26具有至少70％的同一性的序列。適當地，酶可與其具有至少80％或85％的同一性。優(yōu)選地，與其具有至少90％或95％的同一性。更優(yōu)選地，與其具有至少97％或99％的同一性。在一個實施方案中，在本發(fā)明中使用的酶可為耐脯氨酸三肽基肽酶，包含：seqidno.27、其功能性片段或與seqidno.27具有至少70％的同一性的序列。適當地，酶可與其具有至少80％或85％的同一性。優(yōu)選地，與其具有至少90％或95％的同一性。更優(yōu)選地，與其具有至少97％或99％的同一性。在一個實施方案中，在本發(fā)明中使用的酶可為耐脯氨酸三肽基肽酶，包含：seqidno.28、其功能性片段或與seqidno.28具有至少70％的同一性的序列。適當地，酶可與其具有至少80％或85％的同一性。優(yōu)選地，與其具有至少90％或95％的同一性。更優(yōu)選地，與其具有至少97％或99％的同一性。在一個實施方案中，在本發(fā)明中使用的酶可為耐脯氨酸三肽基肽酶，包含：seqidno.29、其功能性片段或與seqidno.29具有至少70％的同一性的序列。適當地，酶可與其具有至少80％或85％的同一性。優(yōu)選地，與其具有至少90％或95％的同一性。更優(yōu)選地，與其具有至少97％或99％的同一性。在一個實施方案中，在本發(fā)明中使用的酶可為耐脯氨酸三肽基肽酶，包含：seqidno.30、其功能性片段或與seqidno.30具有至少70％的同一性的序列。適當地，酶可與其具有至少80％或85％的同一性。優(yōu)選地，與其具有至少90％或95％的同一性。更優(yōu)選地，與其具有至少97％或99％的同一性。在一個實施方案中，在本發(fā)明中使用的酶可為耐脯氨酸三肽基肽酶，包含：seqidno.31、其功能性片段或與seqidno.31具有至少70％的同一性的序列。適當地，酶可與其具有至少80％或85％的同一性。優(yōu)選地，與其具有至少90％或95％的同一性。更優(yōu)選地，與其具有至少97％或99％的同一性。在一個實施方案中，在本發(fā)明中使用的酶可為耐脯氨酸三肽基肽酶，包含：seqidno.32、其功能性片段或與seqidno.32具有至少70％的同一性的序列。適當地，酶可與其具有至少80％或85％的同一性。優(yōu)選地，與其具有至少90％或95％的同一性。更優(yōu)選地，與其具有至少97％或99％的同一性。在一個實施方案中，在本發(fā)明中使用的酶可為耐脯氨酸三肽基肽酶，包含：seqidno.33、其功能性片段或與seqidno.33具有至少70％的同一性的序列。適當地，酶可與其具有至少80％或85％的同一性。優(yōu)選地，與其具有至少90％或95％的同一性。更優(yōu)選地，與其具有至少97％或99％的同一性。在一個實施方案中，在本發(fā)明中使用的酶可為耐脯氨酸三肽基肽酶，包含：seqidno.34、其功能性片段或與seqidno.34具有至少70％的同一性的序列。適當地，酶可與其具有至少80％或85％的同一性。優(yōu)選地，與其具有至少90％或95％的同一性。更優(yōu)選地，與其具有至少97％或99％的同一性。在一個實施方案中，在本發(fā)明中使用的酶可為耐脯氨酸三肽基肽酶，包含：seqidno.35、其功能性片段或與seqidno.35具有至少70％的同一性的序列。適當地，酶可與其具有至少80％或85％的同一性。優(yōu)選地，與其具有至少90％或95％的同一性。更優(yōu)選地，與其具有至少97％或99％的同一性。在一個實施方案中，在本發(fā)明中使用的酶可為耐脯氨酸三肽基肽酶，包含：seqidno.36、其功能性片段或與seqidno.36具有至少70％的同一性的序列。適當地，酶可與其具有至少80％或85％的同一性。優(yōu)選地，與其具有至少90％或95％的同一性。更優(yōu)選地，與其具有至少97％或99％的同一性。在一個實施方案中，在本發(fā)明中使用的酶可為耐脯氨酸三肽基肽酶，包含：seqidno.37、其功能性片段或與seqidno.37具有至少70％的同一性的序列。適當地，酶可與其具有至少80％或85％的同一性。優(yōu)選地，與其具有至少90％或95％的同一性。更優(yōu)選地，與其具有至少97％或99％的同一性。在一個實施方案中，在本發(fā)明中使用的酶可為耐脯氨酸三肽基肽酶，包含：seqidno.38、其功能性片段或與seqidno.38具有至少70％的同一性的序列。適當地，酶可與其具有至少80％或85％的同一性。優(yōu)選地，與其具有至少90％或95％的同一性。更優(yōu)選地，與其具有至少97％或99％的同一性。在一個實施方案中，在本發(fā)明中使用的酶可為耐脯氨酸三肽基肽酶，包含：seqidno.39、其功能性片段或與seqidno.39具有至少70％的同一性的序列。適當地，酶可與其具有至少80％或85％的同一性。優(yōu)選地，與其具有至少90％或95％的同一性。更優(yōu)選地，與其具有至少97％或99％的同一性。在一個實施方案中，在本發(fā)明中使用的酶可為耐脯氨酸三肽基肽酶，包含：seqidno.40、其功能性片段或與seqidno.40具有至少70％的同一性的序列。適當地，酶可與其具有至少80％或85％的同一性。優(yōu)選地，與其具有至少90％或95％的同一性。更優(yōu)選地，與其具有至少97％或99％的同一性。在一個實施方案中，在本發(fā)明中使用的酶可為耐脯氨酸三肽基肽酶，包含：seqidno.41、其功能性片段或與seqidno.41具有至少70％的同一性的序列。適當地，酶可與其具有至少80％或85％的同一性。優(yōu)選地，與其具有至少90％或95％的同一性。更優(yōu)選地，與其具有至少97％或99％的同一性。在一個實施方案中，在本發(fā)明中使用的酶可為耐脯氨酸三肽基肽酶，包含：seqidno.42、其功能性片段或與seqidno.42具有至少70％的同一性的序列。適當地，酶可與其具有至少80％或85％的同一性。優(yōu)選地，與其具有至少90％或95％的同一性。更優(yōu)選地，與其具有至少97％或99％的同一性。在一個實施方案中，在本發(fā)明中使用的酶可為耐脯氨酸三肽基肽酶，包含：seqidno.43、其功能性片段或與seqidno.43具有至少70％的同一性的序列。適當地，酶可與其具有至少80％或85％的同一性。優(yōu)選地，與其具有至少90％或95％的同一性。更優(yōu)選地，與其具有至少97％或99％的同一性。在一個實施方案中，在本發(fā)明中使用的酶可為耐脯氨酸三肽基肽酶，包含：seqidno.44、其功能性片段或與seqidno.44具有至少70％的同一性的序列。適當地，酶可與其具有至少80％或85％的同一性。優(yōu)選地，與其具有至少90％或95％的同一性。更優(yōu)選地，與其具有至少97％或99％的同一性。在一個實施方案中，在本發(fā)明中使用的酶可為耐脯氨酸三肽基肽酶，包含：seqidno.45、其功能性片段或與seqidno.45具有至少70％的同一性的序列。適當地，酶可與其具有至少80％或85％的同一性。優(yōu)選地，與其具有至少90％或95％的同一性。更優(yōu)選地，與其具有至少97％或99％的同一性。在一個實施方案中，在本發(fā)明中使用的酶可為耐脯氨酸三肽基肽酶，包含：seqidno.46、其功能性片段或與seqidno.46具有至少70％的同一性的序列。適當地，酶可與其具有至少80％或85％的同一性。優(yōu)選地，與其具有至少90％或95％的同一性。更優(yōu)選地，與其具有至少97％或99％的同一性。在一個實施方案中，在本發(fā)明中使用的酶可為耐脯氨酸三肽基肽酶，包含：seqidno.47、其功能性片段或與seqidno.47具有至少70％的同一性的序列。適當地，酶可與其具有至少80％或85％的同一性。優(yōu)選地，與其具有至少90％或95％的同一性。更優(yōu)選地，與其具有至少97％或99％的同一性。在一個實施方案中，在本發(fā)明中使用的酶可為耐脯氨酸三肽基肽酶，包含：seqidno.48、其功能性片段或與seqidno.48具有至少70％的同一性的序列。適當地，酶可與其具有至少80％或85％的同一性。優(yōu)選地，與其具有至少90％或95％的同一性。更優(yōu)選地，與其具有至少97％或99％的同一性。在一個實施方案中，在本發(fā)明中使用的酶可為耐脯氨酸三肽基肽酶，包含：seqidno.49、其功能性片段或與seqidno.49具有至少70％的同一性的序列。適當地，酶可與其具有至少80％或85％的同一性。優(yōu)選地，與其具有至少90％或95％的同一性。更優(yōu)選地，與其具有至少97％或99％的同一性。在一個實施方案中，在本發(fā)明中使用的酶可為耐脯氨酸三肽基肽酶，包含：seqidno.50、其功能性片段或與seqidno.50具有至少70％的同一性的序列。適當地，酶可與其具有至少80％或85％的同一性。優(yōu)選地，與其具有至少90％或95％的同一性。更優(yōu)選地，與其具有至少97％或99％的同一性。在一個實施方案中，在本發(fā)明中使用的酶可為耐脯氨酸三肽基肽酶，包含：seqidno.51、其功能性片段或與seqidno.51具有至少70％的同一性的序列。適當地，酶可與其具有至少80％或85％的同一性。優(yōu)選地，與其具有至少90％或95％的同一性。更優(yōu)選地，與其具有至少97％或99％的同一性。在一個實施方案中，在本發(fā)明中使用的酶可為耐脯氨酸三肽基肽酶，包含：seqidno.52、其功能性片段或與seqidno.52具有至少70％的同一性的序列。適當地，酶可與其具有至少80％或85％的同一性。優(yōu)選地，與其具有至少90％或95％的同一性。更優(yōu)選地，與其具有至少97％或99％的同一性。在一個實施方案中，在本發(fā)明中使用的酶可為耐脯氨酸三肽基肽酶，包含：seqidno.53、其功能性片段或與seqidno.53具有至少70％的同一性的序列。適當地，酶可與其具有至少80％或85％的同一性。優(yōu)選地，與其具有至少90％或95％的同一性。更優(yōu)選地，與其具有至少97％或99％的同一性。在一個實施方案中，在本發(fā)明中使用的酶可為耐脯氨酸三肽基肽酶，包含：seqidno.54、其功能性片段或與seqidno.54具有至少70％的同一性的序列。適當地，酶可與其具有至少80％或85％的同一性。優(yōu)選地，與其具有至少90％或95％的同一性。更優(yōu)選地，與其具有至少97％或99％的同一性。在一個實施方案中，在本發(fā)明中使用的酶可為耐脯氨酸三肽基肽酶，包含：seqidno.55、其功能性片段或與seqidno.55具有至少70％的同一性的序列。適當地，酶可與其具有至少80％或85％的同一性。優(yōu)選地，與其具有至少90％或95％的同一性。更優(yōu)選地，與其具有至少97％或99％的同一性。在一個實施方案中，本發(fā)明中使用的酶可為由包含以下序列的核苷酸序列編碼的三肽基肽酶：如seqidno.56所示的序列或與其具有至少70％的同一性的序列。適當地，由與其具有至少80％或85％的同一性的序列編碼。優(yōu)選地，由與其具有至少90％或95％的同一性的序列編碼。更優(yōu)選地，由與其具有至少97％或99％的同一性的序列編碼。在一個實施方案中，本發(fā)明中使用的酶可為由包含以下序列的核苷酸序列編碼的三肽基肽酶：如seqidno.57所示的序列或與其具有至少70％的同一性的序列。適當地，由與其具有至少80％或85％的同一性的序列編碼。優(yōu)選地，由與其具有至少90％或95％的同一性的序列編碼。更優(yōu)選地，由與其具有至少97％或99％的同一性的序列編碼。在一個實施方案中，本發(fā)明中使用的酶可為由包含以下序列的核苷酸序列編碼的耐脯氨酸三肽基肽酶：如seqidno.58所示序列或與其具有至少70％的同一性的序列。適當地，由與其具有至少80％或85％的同一性的序列編碼。優(yōu)選地，由與其具有至少90％或95％的同一性的序列編碼。更優(yōu)選地，由與其具有至少97％或99％的同一性的序列編碼。在一個實施方案中，本發(fā)明中使用的酶可為由包含以下序列的核苷酸序列編碼的耐脯氨酸三肽基肽酶：如seqidno.59所示序列或與其具有至少70％的同一性的序列。適當地，由與其具有至少80％或85％的同一性的序列編碼。優(yōu)選地，由與其具有至少90％或95％的同一性的序列編碼。更優(yōu)選地，由與其具有至少97％或99％的同一性的序列編碼。在一個實施方案中，本發(fā)明中使用的酶可為由包含以下序列的核苷酸序列編碼的耐脯氨酸三肽基肽酶：如seqidno.60所示序列或與其具有至少70％的同一性的序列。適當地，由與其具有至少80％或85％的同一性的序列編碼。優(yōu)選地，由與其具有至少90％或95％的同一性的序列編碼。更優(yōu)選地，由與其具有至少97％或99％的同一性的序列編碼。在一個實施方案中，本發(fā)明中使用的酶可為由包含以下序列的核苷酸序列編碼的耐脯氨酸三肽基肽酶：如seqidno.61所示序列或與其具有至少70％的同一性的序列。適當地，由與其具有至少80％或85％的同一性的序列編碼。優(yōu)選地，由與其具有至少90％或95％的同一性的序列編碼。更優(yōu)選地，由與其具有至少97％或99％的同一性的序列編碼。在一個實施方案中，本發(fā)明中使用的酶可為由包含以下序列的核苷酸序列編碼的耐脯氨酸三肽基肽酶：如seqidno.62所示序列或與其具有至少70％的同一性的序列。適當地，由與其具有至少80％或85％的同一性的序列編碼。優(yōu)選地，由與其具有至少90％或95％的同一性的序列編碼。更優(yōu)選地，由與其具有至少97％或99％的同一性的序列編碼。在一個實施方案中，本發(fā)明中使用的酶可為由包含以下序列的核苷酸序列編碼的耐脯氨酸三肽基肽酶：如seqidno.63所示序列或與其具有至少70％的同一性的序列。適當地，由與其具有至少80％或85％的同一性的序列編碼。優(yōu)選地，由與其具有至少90％或95％的同一性的序列編碼。更優(yōu)選地，由與其具有至少97％或99％的同一性的序列編碼。在一個實施方案中，本發(fā)明中使用的酶可為由包含以下序列的核苷酸序列編碼的耐脯氨酸三肽基肽酶：如seqidno.64所示序列或與其具有至少70％的同一性的序列。適當地，由與其具有至少80％或85％的同一性的序列編碼。優(yōu)選地，由與其具有至少90％或95％的同一性的序列編碼。更優(yōu)選地，由與其具有至少97％或99％的同一性的序列編碼。在一個實施方案中，本發(fā)明中使用的酶可為由包含以下序列的核苷酸序列編碼的耐脯氨酸三肽基肽酶：如seqidno.65所示序列或與其具有至少70％的同一性的序列。適當地，由與其具有至少80％或85％的同一性的序列編碼。優(yōu)選地，由與其具有至少90％或95％的同一性的序列編碼。更優(yōu)選地，由與其具有至少97％或99％的同一性的序列編碼。在一個實施方案中，本發(fā)明中使用的酶可為由包含以下序列的核苷酸序列編碼的耐脯氨酸三肽基肽酶：如seqidno.66所示序列或與其具有至少70％的同一性的序列。適當地，由與其具有至少80％或85％的同一性的序列編碼。優(yōu)選地，由與其具有至少90％或95％的同一性的序列編碼。更優(yōu)選地，由與其具有至少97％或99％的同一性的序列編碼。在一個實施方案中，本發(fā)明中使用的酶可為由包含以下序列的核苷酸序列編碼的耐脯氨酸三肽基肽酶：如seqidno.67所示序列或與其具有至少70％的同一性的序列。適當地，由與其具有至少80％或85％的同一性的序列編碼。優(yōu)選地，由與其具有至少90％或95％的同一性的序列編碼。更優(yōu)選地，由與其具有至少97％或99％的同一性的序列編碼。在一個實施方案中，本發(fā)明中使用的酶可為由包含以下序列的核苷酸序列編碼的耐脯氨酸三肽基肽酶：如seqidno.68所示序列或與其具有至少70％的同一性的序列。適當地，由與其具有至少80％或85％的同一性的序列編碼。優(yōu)選地，由與其具有至少90％或95％的同一性的序列編碼。更優(yōu)選地，由與其具有至少97％或99％的同一性的序列編碼。在一個實施方案中，本發(fā)明中使用的酶可為由包含以下序列的核苷酸序列編碼的耐脯氨酸三肽基肽酶：如seqidno.69所示序列或與其具有至少70％的同一性的序列。適當地，由與其具有至少80％或85％的同一性的序列編碼。優(yōu)選地，由與其具有至少90％或95％的同一性的序列編碼。更優(yōu)選地，由與其具有至少97％或99％的同一性的序列編碼。在一個實施方案中，本發(fā)明中使用的酶可為由包含以下序列的核苷酸序列編碼的耐脯氨酸三肽基肽酶：如seqidno.70所示序列或與其具有至少70％的同一性的序列。適當地，由與其具有至少80％或85％的同一性的序列編碼。優(yōu)選地，由與其具有至少90％或95％的同一性的序列編碼。更優(yōu)選地，由與其具有至少97％或99％的同一性的序列編碼。在一個實施方案中，本發(fā)明中使用的酶可為由包含以下序列的核苷酸序列編碼的耐脯氨酸三肽基肽酶：如seqidno.71所示序列或與其具有至少70％的同一性的序列。適當地，由與其具有至少80％或85％的同一性的序列編碼。優(yōu)選地，由與其具有至少90％或95％的同一性的序列編碼。更優(yōu)選地，由與其具有至少97％或99％的同一性的序列編碼。在一個實施方案中，本發(fā)明中使用的酶可為由包含以下序列的核苷酸序列編碼的耐脯氨酸三肽基肽酶：如seqidno.72所示序列或與其具有至少70％的同一性的序列。適當地，由與其具有至少80％或85％的同一性的序列編碼。優(yōu)選地，由與其具有至少90％或95％的同一性的序列編碼。更優(yōu)選地，由與其具有至少97％或99％的同一性的序列編碼。在一個實施方案中，本發(fā)明中使用的酶可為由包含以下序列的核苷酸序列編碼的耐脯氨酸三肽基肽酶：如seqidno.73所示序列或與其具有至少70％的同一性的序列。適當地，由與其具有至少80％或85％的同一性的序列編碼。優(yōu)選地，由與其具有至少90％或95％的同一性的序列編碼。更優(yōu)選地，由與其具有至少97％或99％的同一性的序列編碼。在一個實施方案中，本發(fā)明中使用的酶可為由包含以下序列的核苷酸序列編碼的耐脯氨酸三肽基肽酶：如seqidno.74所示序列或與其具有至少70％的同一性的序列。適當地，由與其具有至少80％或85％的同一性的序列編碼。優(yōu)選地，由與其具有至少90％或95％的同一性的序列編碼。更優(yōu)選地，由與其具有至少97％或99％的同一性的序列編碼。在一個實施方案中，本發(fā)明中使用的酶可為由包含以下序列的核苷酸序列編碼的耐脯氨酸三肽基肽酶：如seqidno.75所示序列或與其具有至少70％的同一性的序列。適當地，由與其具有至少80％或85％的同一性的序列編碼。優(yōu)選地，由與其具有至少90％或95％的同一性的序列編碼。更優(yōu)選地，由與其具有至少97％或99％的同一性的序列編碼。在一個實施方案中，本發(fā)明中使用的酶可為由包含以下序列的核苷酸序列編碼的耐脯氨酸三肽基肽酶：如seqidno.76所示序列或與其具有至少70％的同一性的序列。適當地，由與其具有至少80％或85％的同一性的序列編碼。優(yōu)選地，由與其具有至少90％或95％的同一性的序列編碼。更優(yōu)選地，由與其具有至少97％或99％的同一性的序列編碼。在一個實施方案中，本發(fā)明中使用的酶可為由包含以下序列的核苷酸序列編碼的耐脯氨酸三肽基肽酶：如seqidno.77所示序列或與其具有至少70％的同一性的序列。適當地，由與其具有至少80％或85％的同一性的序列編碼。優(yōu)選地，由與其具有至少90％或95％的同一性的序列編碼。更優(yōu)選地，由與其具有至少97％或99％的同一性的序列編碼。在一個實施方案中，本發(fā)明中使用的酶可為由包含以下序列的核苷酸序列編碼的耐脯氨酸三肽基肽酶：如seqidno.78所示序列或與其具有至少70％的同一性的序列。適當地，由與其具有至少80％或85％的同一性的序列編碼。優(yōu)選地，由與其具有至少90％或95％的同一性的序列編碼。更優(yōu)選地，由與其具有至少97％或99％的同一性的序列編碼。在一個實施方案中，本發(fā)明中使用的酶可為由包含以下序列的核苷酸序列編碼的耐脯氨酸三肽基肽酶：如seqidno.79所示序列或與其具有至少70％的同一性的序列。適當地，由與其具有至少80％或85％的同一性的序列編碼。優(yōu)選地，由與其具有至少90％或95％的同一性的序列編碼。更優(yōu)選地，由與其具有至少97％或99％的同一性的序列編碼。在一個實施方案中，本發(fā)明中使用的酶可為由包含以下序列的核苷酸序列編碼的耐脯氨酸三肽基肽酶：如seqidno.80所示序列或與其具有至少70％的同一性的序列。適當地，由與其具有至少80％或85％的同一性的序列編碼。優(yōu)選地，由與其具有至少90％或95％的同一性的序列編碼。更優(yōu)選地，由與其具有至少97％或99％的同一性的序列編碼。在一個實施方案中，本發(fā)明中使用的酶可為由包含以下序列的核苷酸序列編碼的耐脯氨酸三肽基肽酶：如seqidno.81所示序列或與其具有至少70％的同一性的序列。適當地，由與其具有至少80％或85％的同一性的序列編碼。優(yōu)選地，由與其具有至少90％或95％的同一性的序列編碼。更優(yōu)選地，由與其具有至少97％或99％的同一性的序列編碼。在一個實施方案中，本發(fā)明中使用的酶可為由包含以下序列的核苷酸序列編碼的耐脯氨酸三肽基肽酶：如seqidno.82所示序列或與其具有至少70％的同一性的序列。適當地，由與其具有至少80％或85％的同一性的序列編碼。優(yōu)選地，由與其具有至少90％或95％的同一性的序列編碼。更優(yōu)選地，由與其具有至少97％或99％的同一性的序列編碼。在一個實施方案中，本發(fā)明中使用的酶可為由包含以下序列的核苷酸序列編碼的耐脯氨酸三肽基肽酶：如seqidno.83所示序列或與其具有至少70％的同一性的序列。適當地，由與其具有至少80％或85％的同一性的序列編碼。優(yōu)選地，由與其具有至少90％或95％的同一性的序列編碼。更優(yōu)選地，由與其具有至少97％或99％的同一性的序列編碼。在一個實施方案中，本發(fā)明中使用的酶可為由包含以下序列的核苷酸序列編碼的耐脯氨酸三肽基肽酶：如seqidno.84所示序列或與其具有至少70％的同一性的序列。適當地，由與其具有至少80％或85％的同一性的序列編碼。優(yōu)選地，由與其具有至少90％或95％的同一性的序列編碼。更優(yōu)選地，由與其具有至少97％或99％的同一性的序列編碼。在一個實施方案中，本發(fā)明中使用的酶可為由包含以下序列的核苷酸序列編碼的耐脯氨酸三肽基肽酶：如seqidno.85所示序列或與其具有至少70％的同一性的序列。適當地，由與其具有至少80％或85％的同一性的序列編碼。優(yōu)選地，由與其具有至少90％或95％的同一性的序列編碼。更優(yōu)選地，由與其具有至少97％或99％的同一性的序列編碼。在一個實施方案中，本發(fā)明中使用的酶可為由包含以下序列的核苷酸序列編碼的耐脯氨酸三肽基肽酶：如seqidno.86所示序列或與其具有至少70％的同一性的序列。適當地，由與其具有至少80％或85％的同一性的序列編碼。優(yōu)選地，由與其具有至少90％或95％的同一性的序列編碼。更優(yōu)選地，由與其具有至少97％或99％的同一性的序列編碼。在一個實施方案中，本發(fā)明中使用的酶可為由包含以下序列的核苷酸序列編碼的耐脯氨酸三肽基肽酶：如seqidno.87所示序列或與其具有至少70％的同一性的序列。適當地，由與其具有至少80％或85％的同一性的序列編碼。優(yōu)選地，由與其具有至少90％或95％的同一性的序列編碼。更優(yōu)選地，由與其具有至少97％或99％的同一性的序列編碼。在一個實施方案中，本發(fā)明中使用的酶可為由包含以下序列的核苷酸序列編碼的耐脯氨酸三肽基肽酶：如seqidno.88所示序列或與其具有至少70％的同一性的序列。適當地，由與其具有至少80％或85％的同一性的序列編碼。優(yōu)選地，由與其具有至少90％或95％的同一性的序列編碼。更優(yōu)選地，由與其具有至少97％或99％的同一性的序列編碼。在一個實施方案中，本發(fā)明中使用的酶可為由包含以下序列的核苷酸序列編碼的耐脯氨酸三肽基肽酶：如seqidno.89所示序列或與其具有至少70％的同一性的序列。適當地，由與其具有至少80％或85％的同一性的序列編碼。優(yōu)選地，由與其具有至少90％或95％的同一性的序列編碼。更優(yōu)選地，由與其具有至少97％或99％的同一性的序列編碼。在一個實施方案中，本發(fā)明中使用的酶可為由包含以下序列的核苷酸序列編碼的耐脯氨酸三肽基肽酶：如seqidno.90所示序列或與其具有至少70％的同一性的序列。適當地，由與其具有至少80％或85％的同一性的序列編碼。優(yōu)選地，由與其具有至少90％或95％的同一性的序列編碼。更優(yōu)選地，由與其具有至少97％或99％的同一性的序列編碼。在一個實施方案中，本發(fā)明中使用的酶可為由包含以下序列的核苷酸序列編碼的耐脯氨酸三肽基肽酶：如seqidno.91所示序列或與其具有至少70％的同一性的序列。適當地，由與其具有至少80％或85％的同一性的序列編碼。優(yōu)選地，由與其具有至少90％或95％的同一性的序列編碼。更優(yōu)選地，由與其具有至少97％或99％的同一性的序列編碼。在一個實施方案中，本發(fā)明中使用的酶可為由包含以下序列的核苷酸序列編碼的耐脯氨酸三肽基肽酶：如seqidno.92所示序列或與其具有至少70％的同一性的序列。適當地，由與其具有至少80％或85％的同一性的序列編碼。優(yōu)選地，由與其具有至少90％或95％的同一性的序列編碼。更優(yōu)選地，由與其具有至少97％或99％的同一性的序列編碼。在一個實施方案中，本發(fā)明中使用的酶可為由包含以下序列的核苷酸序列編碼的耐脯氨酸三肽基肽酶：如seqidno.93所示序列或與其具有至少70％的同一性的序列。適當地，由與其具有至少80％或85％的同一性的序列編碼。優(yōu)選地，由與其具有至少90％或95％的同一性的序列編碼。更優(yōu)選地，由與其具有至少97％或99％的同一性的序列編碼。在一個實施方案中，本發(fā)明中使用的酶可為由包含以下序列的核苷酸序列編碼的耐脯氨酸三肽基肽酶：如seqidno.94所示序列或與其具有至少70％的同一性的序列。適當地，由與其具有至少80％或85％的同一性的序列編碼。優(yōu)選地，由與其具有至少90％或95％的同一性的序列編碼。更優(yōu)選地，由與其具有至少97％或99％的同一性的序列編碼。在一個實施方案中，本發(fā)明中使用的酶可為由包含以下序列的核苷酸序列編碼的耐脯氨酸三肽基肽酶：如seqidno.95所示序列或與其具有至少70％的同一性的序列。適當地，由與其具有至少80％或85％的同一性的序列編碼。優(yōu)選地，由與其具有至少90％或95％的同一性的序列編碼。更優(yōu)選地，由與其具有至少97％或99％的同一性的序列編碼。核苷酸序列本發(fā)明的范圍涵蓋編碼具有本文所限定的特定性質的蛋白質的核苷酸序列。如本文所用，術語“核苷酸序列”是指寡核苷酸序列或多核苷酸序列，以及其變體、同系物、片段和衍生物(諸如其部分)。核苷酸序列可為基因組起源的或者合成或重組起源的，其可以是雙鏈的或單鏈的而無論是代表有義鏈還是反義鏈。與本發(fā)明有關的術語“核苷酸序列”包括基因組dna、cdna、合成dna和rna。優(yōu)選地，其意指dna，更優(yōu)選地，意指編碼本發(fā)明的cdna序列。在一個優(yōu)選的實施方案中，當與本發(fā)明的范圍本身有關以及當為本發(fā)明的范圍本身所涵蓋時，核苷酸序列不包括處于其天然環(huán)境中時或其連接至其也存在于其/它們的天然環(huán)境中的天然相關的序列時的天然的根據本發(fā)明的核苷酸序列。為了易于參考，我們應將這個優(yōu)選的實施方案稱為“非天然核苷酸序列”。為此，術語“天然核苷酸序列”意指處于它的天然環(huán)境中且當與和它天然相關聯(lián)的整個啟動子可操作地連接時的整個核苷酸序列，所述啟動子也處于它的天然環(huán)境中。然而，本發(fā)明范圍所涵蓋的氨基酸序列可以是分離和/或純化的其天然生物體中的核苷酸序列的后表達。然而，優(yōu)選地，本發(fā)明的范圍所涵蓋的氨基酸序列可由核苷酸序列在其天然生物體中表達，但其中該核苷酸序列不處于在該生物體中其天然與之相關聯(lián)的啟動子的控制之下。通常，由本發(fā)明的范圍所涵蓋的核苷酸序列使用重組dna技術制備(即重組dna)。然而，在本發(fā)明的備選實施方案中，核苷酸序列可用本領域所熟知的化學方法整體或分部分地合成(參見caruthersmh等人，(1980)nucacidsressympser215-223和hornt等人，(1980)nucacidsressympser225-232)。核苷酸序列的制備編碼具有本文所定義的特定性質的蛋白質或適于修飾的蛋白質的核苷酸序列可從產生所述蛋白質的任何細胞或生物體鑒定和/或分離和/或純化。多種方法是核苷酸序列鑒定和/或分離和/或純化領域所熟知的。以舉例的方式，一旦已鑒定和/或分離和/或純化合適的序列后即可使用pcr擴增技術來制備更多條序列。以另一個示例的方式，可使用來自產生酶的生物體的染色體dna或信使rna來構建基因組dna和/或cdna文庫。如果該酶的氨基酸序列是已知的話，可合成標記的寡核苷酸探針并用于從由生物體制備的基因組文庫鑒定酶編碼克隆。另選地，可將含有與另一已知酶基因同源的序列的標記的寡核苷酸探針用于鑒定酶編碼克隆。在后一種情況中，使用較低嚴格性的雜交和洗滌條件。另選地，酶編碼克隆可通過這樣來鑒定：將基因組dna的片段插入表達載體(諸如質粒)中，用所得的基因組dna文庫轉化酶陰性細菌，然后將轉化細菌接種于含有酶底物(即麥芽糖)的瓊脂板上，從而使得表達該酶的克隆被鑒定。在又一個另選方案中，編碼該酶的核苷酸序列可以通過已確立的標準方法，例如，beucages.l.等人，(1981)tetrahedronletters22，第1859-1869頁所描述的亞磷酰胺方法，或matthes等人，(1984)emboj.3，第801-805頁所描述的方法，合成制備。在亞磷酰胺方法中，寡核苷酸例如在自動dna合成儀中合成，將其純化、退火、連接并克隆進適當的載體中。核苷酸序列可以為混合的基因組和合成起源、混合的合成和cdna起源或混合的基因組和cdna起源，根據標準技術通過連接合成、基因組或cdna起源的片段制備(視情況而定)。每一連接的片段對應整個核苷酸序列的各個部分。dna序列還可使用特定引物通過聚合酶鏈反應(pcr)制備，例如如us4,683,202或saikirk等人(science(1988)239，第487-491頁)中所述，這些文檔的教導以引用方式并入本文中。氨基酸序列本發(fā)明的范圍還涵蓋具有本文所限定的特定性質的酶的氨基酸序列。如本文所使用，術語“氨基酸序列”與術語“多肽”和/或術語“蛋白質”同義。在一些情況中，術語“氨基酸序列”與術語“肽”同義。在一些情況中，術語“氨基酸序列”與術語“酶”同義。氨基酸序列可從合適的來源制備/分離，或者其可通過合成制備或者其可通過利用重組dna技術制備。本發(fā)明中所涵蓋的蛋白質可與其它蛋白質，特別是酶一起使用。因而，本發(fā)明還涵蓋蛋白質的組合，其中該組合包含本發(fā)明的蛋白質/酶和其它蛋白質/酶，所述其它蛋白質/酶可以是根據本發(fā)明的其它蛋白質/酶。該方面在后面的部分中有所討論。優(yōu)選地，當與本發(fā)明的本身范圍有關或當為本發(fā)明的本身范圍所涵蓋時氨基酸序列不是天然的酶。就這一點而言，術語“天然的酶”意指處于其天然環(huán)境中并且在其已由其天然核苷酸序列表達時的整個酶。分離在一個方面，優(yōu)選地，根據本發(fā)明的氨基酸序列、或核酸、或酶是分離的形式。術語“分離的”意指序列或酶或核酸至少基本上不含所述序列或酶或核酸在自然界中天然與之相關聯(lián)或在自然界中存在的至少一種其它組分。本發(fā)明的序列、酶或核酸可以基本上不含所述物質原本與之相關聯(lián)的一種或多種污染物的形式提供。因此，例如，其可基本上不含一或多種潛在污染性的多肽和/或核酸分子。純化在一個方面，優(yōu)選地，根據本發(fā)明的序列、酶或核酸是純化的形式。術語“純化的”意指給定的組分是以高水平存在。組分有利地是組合物中存在的主要組分。優(yōu)選地，其以至少約80％的水平存在，所述水平是相對于所考慮總組合物以干重/基于干重來測定。適當地，其可以至少約90％、或至少約95％、或至少約98％的水平存在，所述水平是相對于所考慮總組合物以干重/基于干重來測定。序列同一性或序列同源性本發(fā)明還涵蓋與具有本文所限定的特定性質的多肽的氨基酸序列具有一定程度的序列同一性或序列同源性的序列或編碼這種多肽的任何核苷酸序列(下文稱為“同源序列”)的用途。在此，術語“同系物”意指與主題氨基酸序列和主題核苷酸序列具有一定同源性的實體。在此，術語“同源性”可等同于“同一性”。該同源氨基酸序列和/或核苷酸序列應該提供和/或編碼保持該酶的功能活性和/或增強該酶的活性的多肽。在本說明書的語境中，同源序列意指包括這樣的氨基酸或核苷酸序列，其可與主題序列有至少75％、85％或90％的同一性、優(yōu)選地至少95％或98％的同一性。通常，同系物將包含與例如主題氨基酸序列相同的活性位點等等。盡管同源性也可以根據相似性(即氨基酸殘基具有類似的化學性質/功能)來考慮，但在本發(fā)明的語境中優(yōu)選根據序列同一性來表示同源性。在一個實施方案中，同源序列意指包含這樣的氨基酸序列或核苷酸序列，其相比于主題序列具有一個或若干個添加、缺失和/或置換。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及其氨基酸序列示于本文的蛋白質，或者通過在親本蛋白質的氨基酸序列中置換、缺失或添加一個或若干個氨基酸(諸如2、3、4、5、6、7、8、9個氨基酸)，或更多個氨基酸(例如10個或多于10個氨基酸)并具有親本蛋白質的活性而來源于該(親本)蛋白質的蛋白質。適當地，關于氨基酸序列的同一性程度是在至少20個連續(xù)氨基酸上，優(yōu)選地在至少30個連續(xù)氨基酸上，優(yōu)選地在至少40個連續(xù)氨基酸上，優(yōu)選地在至少50個連續(xù)氨基酸上，優(yōu)選地在至少60個連續(xù)氨基酸上，優(yōu)選地在至少100個連續(xù)氨基酸上，優(yōu)選地在至少200個連續(xù)氨基酸上進行測定。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及編碼其氨基酸序列示于本文的蛋白質，或者編碼通過在親本蛋白質的氨基酸序列中置換、缺失或添加一個或若干個氨基酸(諸如2、3、4、5、6、7、8、9個氨基酸)，或更多個氨基酸(諸如10個或多于10個氨基酸)并具有親本蛋白質的活性而來源于該(親本)蛋白質的蛋白質的核酸序列(或基因)。在本說明書的語境中，同源序列意指包含這樣的核苷酸序列，其可與編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列(主題序列)具有至少75％、85％或90％的同一性，優(yōu)選地至少95％或98％的同一性。通常，同系物將包含與主題序列相同的編碼活性位點等的序列。盡管同源性也可以根據相似性(即氨基酸殘基具有類似的化學性質/功能)來考慮，但在本發(fā)明的語境中優(yōu)選根據序列同一性來表示同源性。同源性比較可通過眼，或更通常地，借助于容易獲得的序列比較程序來進行。這些可商購獲得的計算機程序可計算兩條或更多條序列之間的％同源性。％同源性可在連續(xù)的序列上計算，即將一條序列與另一條序列進行比對，并將一條序列中的每個氨基酸與另一條序列中的對應氨基酸直接比較，一次一個殘基。這稱為“不產生空位的”比對。通常，這種不產生空位的比對僅在相對較短數目的殘基上進行。盡管這是十分簡單和可靠的方法，但其不能考慮，例如，在原本相同的一對序列中，一個插入或缺失將引起后面的氨基酸殘基不再對準，從而在進行全局比對時可能導致％同源性有大的降低。因此，大多數序列比較方法被設計來產生最佳的比對，該最佳比對考慮可能的插入和缺失而不會罰掉過多的整體同源性分數。這通過在序列比對中插入“空位”以試圖使局部同源性最大化來實現(xiàn)。然而，這些更復雜的方法給比對中出現(xiàn)的每一個空位分配“空位罰分”使得，對于同樣數目的相同氨基酸，具有盡可能少空位的序列比對(反映兩條比較序列之間相關性較高)將獲得比具有許多空位的序列比對高的分數。通常使用“仿射空位成本(affinegapcosts)”，其對空位的存在征收相對較高的成本，對空位中每一個后續(xù)的殘基征收較少的罰分。這是最通常使用的空位計分系統(tǒng)。高的空位罰分將當然產生具有較少空位的最佳比對。大多數比對程序允許修改空位罰分。然而，當用這種軟件進行序列比較時優(yōu)選使用默認值。最大％同源性或％同一性的計算因而首先需要在考慮空位罰分的情況下產生最佳比對。進行這種比對的合適計算機程序是vectornti(英杰公司(invitrogencorp.))?？蛇M行序列比較的軟件的示例包括但不限于例如blast軟件包(參考ausubel等人，1999，shortprotocolsinmolecularbiology，第4版-第18章)、blast2(參見femsmicrobiollett1999174(2):247-50；femsmicrobiollett1999177(1):187-8以及tatiana@ncbi.nlm.nih.gov)、fasta(altschul等人1990j.mol.biol.403-410)以及alignx。至少blast、blast2和fasta可用于諸如例如在genomequest搜索工具(www.genomequest.com)中離線和在線搜索(參見ausubel等人1999，第7-58至7-60頁)。盡管最終的％同源性也可以同一性來度量，但比對過程本身通常不是基于要么全有要么全無的成對比較。相反，通常使用標度化相似性計分矩陣，該矩陣基于化學相似性或進化距離給每一成對比較分配分值。通常使用的這種矩陣的示例是blosum62矩陣-blast程序包的默認矩陣。vectornti程序通常使用公用默認值或定制的符號比較表(如果提供的話)(對于進一步的細節(jié)請參見用戶手冊)。對于一些應用而言，優(yōu)選的是使用vectornti軟件包的默認值。另選地，百分比同源性可用vectornti(英杰公司)中的多比對特征來計算，該特征基于類似于clustal(higginsdg&sharppm(1988),gene73(1),237-244)的算法。一旦該軟件產生了最佳比對，則有可能計算％同源性，優(yōu)選％序列同一性。作為序列比較的一部分該軟件通常進行這些計算，并生成數值結果。當測定序列同一性時應該使用空位罰分，然后優(yōu)選地將如下參數用于逐對比對：對于blast空位開放(gapopen)9空位延伸(gapextension)2對于clustaldna蛋白質權重矩陣iubgonnet250空位開放1510空位延伸6.660.1在一個實施方案中，可使用采用上面限定的空位罰分和空位延伸組的clustal。適當地，關于核苷酸序列的同一性程度是在至少20個連續(xù)核苷酸上，優(yōu)選地在至少30個連續(xù)核苷酸上，優(yōu)選地在至少40個連續(xù)核苷酸上，優(yōu)選地在50個連續(xù)核苷酸上，優(yōu)選地在至少60個連續(xù)核苷酸上，優(yōu)選地在至少100個連續(xù)核苷酸上測定。適當地，關于核苷酸序列的同一性程度是在至少100個連續(xù)核苷酸上，優(yōu)選地在至少200個連續(xù)核苷酸上，優(yōu)選地在至少300個連續(xù)核苷酸上，優(yōu)選地在400個連續(xù)核苷酸上，優(yōu)選地在至少500個連續(xù)核苷酸上，優(yōu)選地在至少600個連續(xù)核苷酸上，優(yōu)選地在至少700個連續(xù)核苷酸上，優(yōu)選地在至少800個連續(xù)核苷酸上測定。適當地，關于核苷酸序列的同一性程度可在整個序列上測定。適當地，關于蛋白質(氨基酸)序列的同一性程度是在至少100個連續(xù)氨基酸上，優(yōu)選地在至少200個連續(xù)氨基酸上，優(yōu)選地在至少300個連續(xù)氨基酸上進行測定。適當地，關于氨基酸或蛋白質序列的同一性程度可在本文所教導的整個序列上進行測定。在本發(fā)明語境中，術語“查詢序列”是指與主題序列比對以便查看其是否落在本發(fā)明范圍之內的同源序列或外源序列。因此，此類查詢序列可例如為現(xiàn)有技術序列或第三方序列。在一個優(yōu)選的實施方案中，通過全局比對程序對序列進行比對，并且通過識別程序所識別的準確匹配數除以主題序列的長度來計算序列同一性。在一個實施方案中，查詢序列與主題序列之間的序列同一性程度如下確定：1)使用默認計分矩陣和默認空位罰分通過任何合適的比對程序來比對兩個序列，2)識別準確匹配數，其中準確匹配是比對程序在比對中在給定位置上識別兩個比對序列中的相同氨基酸或核苷酸，3)將準確匹配數除以主題序列的長度。在另一個優(yōu)選的實施方案中，全局比對程序選自clustal和blast(優(yōu)選blast)，并且通過識別程序所識別的準確匹配數除以主題序列的長度來計算序列同一性。序列還可以具有氨基酸殘基的缺失、插入或置換，這產生了沉默改變并形成功能等價的物質?？苫跉埢臉O性、電荷、溶解度、疏水性、親水性和/或兩親性質的相似性作出有意的氨基酸置換，只要該物質的二級結合活性得以保持。例如，帶負電的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；帶正電的氨基酸包括賴氨酸和精氨酸；并且具有類似親水性值的含不帶電的極性頭部基團的氨基酸包括亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸?？衫绺鶕卤磉M行保守置換。第二列同一區(qū)塊中的氨基酸和優(yōu)選第三列同一行中的氨基酸可彼此置換：本發(fā)明還涵蓋可能出現(xiàn)的同源置換(在本文中，置換和替換都用來指將現(xiàn)有的氨基酸殘基與替代的殘基進行交換)，即對等置換，諸如堿性對堿性，酸性對酸性，極性對極性等。非同源置換也可能出現(xiàn)，即從一類殘基置換成另一類殘基，或者涉及加入非天然氨基酸，諸如鳥氨酸(下文稱為z)、二氨基丁酸鳥氨酸(下文稱為b)、正亮氨酸鳥氨酸(下文稱為o)、吡啶丙氨酸、噻吩丙氨酸、萘丙氨酸和苯甘氨酸。替換還可通過合成氨基酸(例如非天然氨基酸)進行，包括；α*和α-二取代的*氨基酸、n-烷基氨基酸*、乳酸*、天然氨基酸的鹵化物衍生物，諸如三氟酪氨酸*、對-cl-苯丙氨酸*、對-br-苯丙氨酸*、對-i-苯丙氨酸*、l-烯丙基-甘氨酸*、β-丙氨酸*,l-α-氨基丁酸*、l-γ-氨基丁酸*、l-α-氨基異丁酸*、l-ε-氨基己酸#、7-氨基庚酸*、l-甲硫氨酸砜#*、l-正亮氨酸*、l-正纈氨酸*、對-硝基-l-苯丙氨酸*、l-羥脯氨酸#、l-硫代脯氨酸*、苯丙氨酸(phe)的甲基衍生物，諸如，4-甲基-phe*、五甲基-phe*、l-phe(4-氨基)#、l-tyr(甲基)*、l-phe(4-異丙基)*、l-tic(1,2,3,4-四氫異喹啉-3-羧基)*、l-二氨基丙酸#和l-phe(4-芐基)*。符號*用于以上討論的目的(與同源或非同源置換相關)，以指示衍生物的疏水性質，而#用于指示衍生物的親水性質，#*指示兩親性特征。變體氨基酸序列可以包含可在序列的任何兩個氨基酸殘基之間插入的合適的間隔基團，這些間隔基團除了氨基酸間隔基諸如甘氨酸或β-丙氨酸殘基外還包括烷基基團諸如甲基、乙基或丙基基團。變異的另一種形式涉及存在類肽形式的一個或多個氨基酸殘基，這將是本領域技術人員十分了解的。為避免疑義，“類肽形式”用于指其中α-碳取代基處于殘基的氮原子而不是α-碳上的變體氨基酸殘基。用于制備類肽形式的肽的方法在本領域中是已知的，例如simonrj等人，pnas(1992)89(20),9367-9371和horwelldc,trendsbiotechnol.(1995)13(4),132-134。本發(fā)明中使用的核苷酸序列可在其中包含合成的或修飾的核苷酸。對寡核苷酸的多種不同類型的修飾在本領域中是已知的。這包括甲基膦酸酯和硫代磷酸酯主鏈和/或在分子的3'和/或5'端添加吖啶或聚賴氨酸鏈。出于本發(fā)明的目的，應當理解本文所述的核苷酸序列可通過本領域可用的任何方法修飾?？蛇M行此類修飾以提高本發(fā)明的核苷酸序列的體內活性或壽命。本發(fā)明還涵蓋與本文所示的序列互補的核苷酸序列或其任何衍生物、片段或衍生物的用途。如果序列與其片段互補，則該序列可用作探針來鑒定其它生物體中的相似編碼序列等等。不與本發(fā)明的序列100％同源但落在本發(fā)明的范圍之內的多核苷酸可以多種方式獲得。本文所述的序列的其它變體可例如通過探測從一系列個體，例如來自不同種群的個體制備的dna文庫來獲得。此外，可獲得其它同系物，此類同系物及其片段通常將能夠選擇性地雜交至本文序列表所示的序列。此類序列可通過如下方法獲得：探測從其它動物物種制備的cdna文庫或基因組dna文庫，并且在中等至高嚴格性條件下用包含隨附的序列表中的序列中任一者的全部或部分的探針探測此類文庫?？蓱妙愃频目紤]來獲得本發(fā)明的多肽或核苷酸序列的物種同系物和等位基因變體。變體和株系/物種同系物還可用簡并pcr獲得，簡并pcr將使用這樣的引物，其被設計成靶向變體和同系物內編碼本發(fā)明序列內的保守氨基酸序列的序列。保守序列可例如通過將來自若干變體/同系物的氨基酸序列進行比對來預測。序列比對可用本領域已知的計算機軟件來進行。例如，廣泛使用gcgwisconsinpileup程序。簡并pcr中使用的引物將含有一個或多個簡并位置并將在比針對已知序列用單序列引物克隆序列所用的嚴格性條件低的嚴格性條件下使用?；蛘撸@種多核苷酸可通過對已表征的序列進行定點誘變來獲得。在例如需要沉默密碼子序列變化來優(yōu)化多核苷酸序列在其中表達的特定宿主細胞的密碼子偏好的情形中這可能是有用的。為了引入限制性酶識別位點，或者為了改變被多核苷酸所編碼的多肽的性質或功能，可能需要其它的序列變化。本發(fā)明的多核苷酸(核苷酸序列)可用于制備引物(例如pcr引物)、可變擴增反應的引物、如用放射性或非放射性標記通過常規(guī)手段標記有顯示標記的探針，或者多核苷酸可克隆進載體中。這種引物、探針和其它片段的長度將為至少15個，優(yōu)選地至少20個，例如至少25個、30個或40個核苷酸，并且也為本文所用的術語“本發(fā)明的多核苷酸”所涵蓋。根據本發(fā)明的多核苷酸諸如dna多核苷酸和探針可通過重組、通過合成或通過可供本領域技術人員使用的任何手段產生。它們還可以通過標準技術克隆。通常，引物將通過合成手段產生，涉及所需核酸序列的逐步制備，一次一個核苷酸。使用自動化技術完成該過程的技術在本領域中是容易獲得的。較長的多核苷酸將通常使用重組手段產生，例如使用pcr(聚合酶鏈反應)克隆技術。引物可被設計為含有合適的限制性酶識別位點使得可將擴增的dna克隆進合適的克隆載體中。雜交本發(fā)明還涵蓋與本發(fā)明的核酸序列互補的序列或能夠雜交至本發(fā)明的序列或雜交至與本發(fā)明序列互補的序列的序列。如本文所用，術語“雜交”應包括“一條核酸鏈與互補鏈通過堿基配對接合的過程”以及在聚合酶鏈反應(pcr)技術中所進行的擴增過程。本發(fā)明還涵蓋能夠雜交至與本文給出的序列互補的序列的核苷酸序列或其任何衍生物、片段或衍生物的用途。術語“變體”還涵蓋與能夠雜交至本文給出的核苷酸序列的序列互補的序列。優(yōu)選地，術語“變體”涵蓋與能夠在中等嚴格性條件下(例如，50℃和0.2xssc{1xssc＝0.15mnacl，0.015m檸檬酸三鈉，ph7.0})雜交至本文給出的核苷酸序列的序列互補的序列。更優(yōu)選地，術語“變體”涵蓋與能夠在高嚴格性條件下(例如65℃和0.1xssc{1xssc＝0.15mnacl，0.015m檸檬酸三鈉，ph7.0})雜交至本文給出的核苷酸序列的序列互補的序列。本發(fā)明還涉及可雜交至本發(fā)明的核苷酸序列(包括本文所示的那些的互補序列)的核苷酸序列。本發(fā)明還涉及與可雜交到本發(fā)明的核苷酸序列(包括本文給出的那些的互補序列)上的序列互補的核苷酸序列。在本發(fā)明的范圍內還包括能夠在中等至最高嚴格性條件下雜交至本文給出的核苷酸序列的多核苷酸序列。在一個優(yōu)選的方面，本發(fā)明涵蓋可在中等嚴格性條件下(例如50℃和0.2xssc{1xssc＝0.15mnacl，0.015m檸檬酸三鈉，ph7.0})雜交至本發(fā)明的核苷酸序列或其互補序列的核苷酸序列。在一個更優(yōu)選的方面，本發(fā)明涵蓋可在高嚴格性條件下(例如65℃和0.1xssc{1xssc＝0.15mnacl，0.015m檸檬酸三鈉，ph7.0}})雜交至本發(fā)明的核苷酸序列或其互補序列的核苷酸序列。優(yōu)選地，在本文教導的整個序列上對雜交進行分析。分子進化作為一個非限制性示例，有可能在體內或體外對核苷酸序列作出多個定點突變或隨機突變，并且隨后通過各種方法篩選所編碼多肽的改善的功能性。此外，可將多核苷酸序列的突變體或天然變體與野生型或其它突變體或天然變體進行重組，以產生新的變體。也可以針對所編碼的多肽的功能性改善對這種新的變體進行篩選。新的優(yōu)選變體的制備可通過本領域完好建立的各種方法實現(xiàn)，例如錯誤閾值誘變(wo92/18645)、寡核苷酸介導的隨機誘變(us5,723,323)、dna改組(us5,605,793)、外切-介導的基因裝配wo00/58517。這些和類似的隨機定向分子進化方法的應用，使得可以在事先不知道蛋白質結構或功能的情況下鑒定和選擇具有優(yōu)選特性的本發(fā)明的酶的變體，并且使得實現(xiàn)了非可預測但有利的突變體或變體的生產。本領域中存在分子進化的應用的多個示例以優(yōu)化或改變酶活性，例如包括但不限于以下項中的一者或多者：在宿主細胞中或體外的表達和/或活性優(yōu)化，增大酶活性，改變底物和/或產物特異性，增大或減小酶或結構的穩(wěn)定性，在優(yōu)選的環(huán)境條件(例如，溫度、ph、底物)中改變酶活性/特異性。定點誘變一旦分離了編碼蛋白質的核苷酸序列，或者鑒定了推定的編碼蛋白質的核苷酸序列，將該序列突變以制備本發(fā)明的酶可能是有利的。可用合成的寡核苷酸引入突變。這些寡核苷酸含有所需突變位點旁側的核苷酸序列。合適的方法在morinaga等人(biotechnology(1984)2，第646-649頁)中有所公開。向編碼酶的核苷酸序列引入突變的另一種方法在nelson和long(analyticalbiochemistry(1989),180，第147-151頁)中有所描述。重組在一個方面，本發(fā)明中使用的序列為重組序列–即使用重組dna技術制備的序列。這些重組dna技術在本領域普通技術人員的能力范圍內。此類技術在文獻(例如)j.sambrook,e.f.fritsch和t.maniatis,1989,molecularcloning:alaboratorymanual，第二版，第1-3卷，coldspringharborlaboratorypress中進行了解釋。合成在一個方面，本發(fā)明中使用的序列為合成序列–即通過體外化學或酶合成而制備的序列。其包括(但不限于)用宿主生物的最佳密碼子用法制備的序列-諸如甲基營養(yǎng)型酵母畢赤酵母屬(pichia)和漢遜酵母屬(hansenula)。本發(fā)明中使用的蛋白質和/或肽也可為合成來源。酶的表達還可將本發(fā)明中使用的核苷酸序列引入重組的可復制載體中。載體可用于在相容的宿主細胞中和/或從相容的宿主細胞復制核苷酸序列并以蛋白質/酶形式表達核苷酸序列。表達可使用對照序列(例如調控序列)進行控制。由宿主重組細胞通過表達核苷酸序列制備的蛋白質可以分泌或包含在細胞內，具體取決于所用的序列和/或載體。編碼序列可設計有引導物質編碼序列穿過特定原核或真核細胞膜分泌的信號序列。術語“表達載體”意指能夠在體內或體外表達的構建體。在一個實施方案中，在本發(fā)明中使用的三肽基肽酶可由載體編碼。換句話講，載體可包含編碼三肽基肽酶的核苷酸序列。優(yōu)選地，將表達載體摻入合適的宿主生物的基因組中。術語“摻入”優(yōu)選地涵蓋穩(wěn)定摻入基因組中。本發(fā)明的核苷酸序列可以存在于載體中，在該載體中核苷酸序列可操作地連接至調控序列，該調控序列能夠通過合適的宿主生物提供核苷酸序列的表達。本發(fā)明中使用的載體可以轉化進如下所述的合適的宿主細胞，從而提供本發(fā)明的多肽的表達。載體如質粒、粘粒、或噬菌體載體的選擇通常將取決于它即將引入其中的宿主細胞。本發(fā)明中使用的載體可以包含一個或多個選擇性標記基因，諸如賦予抗生素抗性(如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素抗性)的基因?；蛘?，可通過共轉化(如wo91/17243中描述)實現(xiàn)選擇。載體可以在體外使用，例如用于rna的制備或用于轉染、轉化、轉導或感染宿主細胞。因此，在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了如下制備本發(fā)明的核苷酸序列的方法：將本發(fā)明的核苷酸序列引入可復制載體中，將載體引入相容的宿主細胞中，以及使宿主細胞在導致載體復制的條件下生長。載體還可包含使得載體能在所考慮的宿主細胞中復制的核苷酸序列。此類序列的示例為質粒puc19、pacyc177、pub110、pe194、pamb1和pij702的復制起點。編碼三肽基肽酶和/或內切蛋白酶的核苷酸序列和/或載體可經密碼子優(yōu)化以在特定宿主生物中表達。編碼三肽基肽酶和/或內切蛋白酶的核苷酸序列和/或載體可經密碼子優(yōu)化以在原核或真核細胞中表達。適當地，編碼三肽基肽酶和/或內切蛋白酶的核苷酸序列和/或載體可經密碼子優(yōu)化以在真菌宿主生物(例如木霉屬，優(yōu)選地里氏木霉)中表達。密碼子優(yōu)化是指通過以下步驟修飾核酸序列以增強在目的宿主細胞中表達的過程：用宿主細胞基因中更頻繁使用的密碼子替換天然序列中的至少一個密碼子(例如，至少約多于1、2、3、4、5、10、15、20、25、50、60、70、80或100個密碼子)，同時維持天然氨基酸序列。對于特定氨基酸的某些密碼子，不同物種表現(xiàn)出特定的偏好性。密碼子偏好性(生物體間密碼子使用的差異)通常與信使rna(mrna)的翻譯效率相關聯(lián)，其中，據信其繼而取決于被翻譯密碼子的性質和特定轉運rna(trna)分子的可用性等。細胞中優(yōu)勢選擇的trna通常是肽合成中最頻繁使用的密碼子的反映。因此，可基于密碼子優(yōu)化，對基因進行裁剪以在給定生物體中實現(xiàn)最佳的基因表達。經歷該裁剪的核苷酸序列和/或載體因而可稱為“密碼子優(yōu)化的”核苷酸序列和/或載體。密碼子使用表可例如在“密碼子使用數據庫”中容易獲得，并且這些表能以多種方式進行調整。參見nakamura,y.等人，“codonusagetabulatedfromtheinternationaldnasequencedatabases:statusfortheyear2000”nucl.acidsres.(《核酸研究》)28:292(2000)。用于密碼子優(yōu)化特定序列以在特定宿主細胞中表達的計算機算法也是可獲得的，諸如geneforge(aptagen；jacobus,pa.)。在一些實施方案中，編碼本發(fā)明中使用的三肽基肽酶和/或內切蛋白酶的序列中的一個或多個密碼子(例如，1、2、3、4、5、10、15、20、25、50、或更多個、或所有密碼子)對應于特定氨基酸的最頻繁使用的密碼子。在一個實施方案中，編碼三肽基肽酶的核苷酸序列可為經密碼子優(yōu)化以在里氏木霉中表達的核苷酸序列。在一個實施方案中，密碼子優(yōu)化的序列可包含如seqidno.81、seqidno.82、seqidno.83、seqidno.84、seqidno.85、seqidno.86、seqidno.87、seqidno.88、seqidno.89、seqidno.90、seqidno.91、seqidno.92、seqidno.93、seqidno.94、seqidno.95所示的核苷酸序列或與其具有至少70％的同一性的核苷酸序列。適當地，與其具有至少80％的同一性或與其具有至少90％的同一性的序列。優(yōu)選地，密碼子優(yōu)化的序列可包含與seqidno.81、seqidno.82、seqidno.83、seqidno.84、seqidno.85、seqidno.86、seqidno.87、seqidno.88、seqidno.89、seqidno.90、seqidno.91、seqidno.92、seqidno.93、seqidno.94、seqidno.95具有至少95％的序列同一性，更優(yōu)選地與seqidno.81、seqidno.82、seqidno.83、seqidno.84、seqidno.85、seqidno.86、seqidno.87、seqidno.88、seqidno.89、seqidno.90、seqidno.91、seqidno.92、seqidno.93、seqidno.94或seqidno.95具有至少99％的同一性的核苷酸序列。在一個實施方案中，耐脯氨酸三肽基肽酶可由在中等嚴格性條件下與seqidno.81、seqidno.82、seqidno.83、seqidno.84、seqidno.85、seqidno.86、seqidno.87、seqidno.88、seqidno.89、seqidno.90、seqidno.91、seqidno.92、seqidno.93、seqidno.94或seqidno.95雜交的核苷酸序列編碼。適當地，由在高嚴格性條件下與seqidno.81、seqidno.82、seqidno.83、seqidno.84、seqidno.85、seqidno.86、seqidno.87、seqidno.88、seqidno.89、seqidno.90、seqidno.91、seqidno.92、seqidno.93、seqidno.94或seqidno.95雜交的核苷酸序列編碼。在另一個實施方案中，耐脯氨酸三肽基肽酶可由因遺傳密碼的簡并性而不同于seqidno.81、seqidno.82、seqidno.83、seqidno.84、seqidno.85、seqidno.86、seqidno.87、seqidno.88、seqidno.89、seqidno.90、seqidno.91、seqidno.92、seqidno.93、seqidno.94或seqidno.95的核苷酸序列編碼。本發(fā)明還提供了載體(例如，質粒)，該載體包含選自以下的序列中的一種或多種：seqidno.81、seqidno.82、seqidno.83、seqidno.84、seqidno.85、seqidno.86、seqidno.87、seqidno.88、seqidno.89、seqidno.90、seqidno.91、seqidno.92、seqidno.93、seqidno.94或seqidno.95。在一個實施方案中，在本發(fā)明中使用的三肽基肽酶是發(fā)酵物的一部分。如本文所用，術語“發(fā)酵物”是指在培養(yǎng)宿主細胞(例如，結束時)之后所存在的組分的混合物，該宿主細胞的發(fā)酵物包含例如由宿主細胞表達的三肽基肽酶。發(fā)酵物可包含根據本發(fā)明的三肽基肽酶以及其它組分，諸如顆粒物、固體、在培養(yǎng)期間未利用的底物、碎片、培養(yǎng)基、細胞廢物等。在一個方面，從發(fā)酵物中移除宿主細胞(并且特別是任何孢子)和/或使其失活以提供無細胞發(fā)酵物。在其它實施方案中，在本發(fā)明中使用的三肽基肽酶是分離的或純化的。調控序列在一些應用中，本發(fā)明中使用的核苷酸序列可操作地連接至調控序列，該調控序列能夠諸如通過所選的宿主細胞提供核苷酸序列的表達。以舉例的方式，本發(fā)明涵蓋這樣的載體，其含有可操作地連接至這類調控序列的本發(fā)明的核苷酸序列，即載體為表達載體。術語“可操作地連接”意指并置，其中所述組分處于允許它們以它們預期的方式起作用的關系。“可操作地連接”至編碼序列的調控序列是以使得編碼序列在與該控制序列相容的條件下實現(xiàn)表達的方式連接。術語“調控序列”包括啟動子和增強子以及其它表達調控信號。術語“啟動子”以本領域的通常意義使用，如rna聚合酶結合位點。編碼本發(fā)明的酶的核苷酸序列的增強表達還可以通過選擇異源調控區(qū)，如啟動子、分泌前導序列和終止子區(qū)實現(xiàn)。優(yōu)選地，根據本發(fā)明的核苷酸序列可操作地連接至至少一個啟動子。其它啟動子甚至能夠被用來直接表達本發(fā)明的多肽。用于引導核苷酸序列在細菌、真菌或酵母宿主中轉錄的合適的啟動子的示例在本領域中是熟知的。啟動子可額外包括特征結構以確?；蛱岣咴诤线m宿主中的表達。例如，特征結構可為保守區(qū)，諸如pribnow框或tata框。構建體術語“構建體”-其與術語諸如“綴合物”、“盒”和“雜交體”是同義的——包括將根據本發(fā)明使用的核苷酸序列直接或間接地連接到啟動子。間接連接的示例為提供合適的間隔基團諸如內含子序列，諸如sh1-內含子或adh內含子，其位于啟動子和本發(fā)明的核苷酸序列之間。對于與本發(fā)明有關的術語“融合”而言同樣如此，其包括直接或間接連接。在一些情況下，該術語不涵蓋通常與野生型基因啟動子相關聯(lián)的編碼蛋白質的核苷酸序列且當它們均處于其天然環(huán)境中時的天然組合。構建體甚至可以包含或表達允許選擇基因構建體的標記。就一些應用而言，優(yōu)選地，本發(fā)明的構建體至少包含可操作地連接至啟動子的本發(fā)明的核苷酸序列。宿主細胞與本發(fā)明有關的術語“宿主細胞”包括任何包含上述核苷酸序列或表達載體的細胞，并且，其用于具有如本文所定義的特定性能的蛋白質的重組制品中。因此，本發(fā)明的另一個實施方案提供了由表達本發(fā)明的蛋白質的核苷酸序列轉化或轉染的宿主細胞。選擇與所述載體相容的細胞，并且細胞可以為，例如，原核(例如細菌)、真菌、酵母或植物細胞。合適的細菌宿主生物的示例為革蘭氏陽性或革蘭氏陰性的細菌菌種。根據編碼本發(fā)明的多肽的核苷酸序列的性質，和/或進一步加工表達的蛋白質的目的，真核宿主諸如酵母或其它真菌可為優(yōu)選的。一般來講，酵母細胞相對于真菌細胞是優(yōu)選的，因為它們更易于操縱。然而，某些蛋白質很難從酵母細胞中分泌，或在某些情況下不能妥善處理(例如在酵母中過度糖基化)。在這些情況下，應該選擇不同的真菌宿主生物。使用合適的宿主細胞(諸如酵母、真菌和植物宿主細胞)可以根據可能的需要提供翻譯后修飾(如豆蔻酰化、糖基化、截短、脂化和酪氨酸、絲氨酸或蘇氨酸磷酸化)，從而賦予本發(fā)明的重組表達產品最佳的生物活性。宿主細胞可以為蛋白酶缺陷菌株或蛋白酶缺失菌株。這可例如為蛋白酶缺陷菌株米曲霉jal125，缺失了稱作“alp”的堿性蛋白酶基因。該菌株在wo97/35956中有所描述。生物體與本發(fā)明有關的術語“生物體”包括可包含編碼根據本發(fā)明的多肽的核苷酸序列和/或由此獲得的產物，和/或其中啟動子可允許根據本發(fā)明的核苷酸序列在存在于生物體時表達的任何生物體。合適的生物體可包括原核生物、真菌、酵母或植物。與本發(fā)明有關的術語“轉基因生物體”包括包含編碼根據本發(fā)明的多肽的核苷酸序列和/或由此獲得的產物，和/或其中啟動子可允許根據本發(fā)明的核苷酸序列在生物體內表達的任何生物體。優(yōu)選地將核苷酸序列摻入生物體的基因組中。術語“轉基因生物體”不涵蓋當其由天然環(huán)境中的天然啟動子控制時的天然環(huán)境中的天然核苷酸編碼序列。因此，本發(fā)明的轉基因生物體包括含有以下中任一項或以下的組合的生物體：編碼根據本發(fā)明的多肽的核苷酸序列、根據本發(fā)明的構建體、根據本發(fā)明的載體、根據本發(fā)明的質粒、根據本發(fā)明的細胞、根據本發(fā)明的組織、或其產物。例如，轉基因生物體還可包含在異源啟動子的控制下編碼本發(fā)明的多肽的核苷酸序列。宿主細胞/生物體的轉化如前面所指出的那樣，宿主生物可以為原核或真核生物體。合適的原核宿主的示例包括大腸桿菌(e.coli)和枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌(bacilluslicheniformis)、鏈霉菌屬、梭菌屬等等。有關原核宿主的轉化的教導內容在本領域中有詳細記載，例如參見sambrook等人(molecularcloning:alaboratorymanual，第2版，1989,coldspringharborlaboratorypress)。如果使用原核宿主，那么在轉化之前可能需要對核苷酸序列進行適當的修飾-諸如通過移除內含子?？梢允褂帽绢I域中已知的多種方法轉化絲狀真菌細胞–諸如涉及原生質體形成和原生質體的轉化，然后用已知的方式再生細胞壁的方法。ep0238023中描述了使用曲霉菌作為宿主微生物。另外的宿主生物可以為植物。用于轉化植物的通用技術的綜述可見于以下文章中：potrykus(annurevplantphysiolplantmolbiol[1991]42:205-225)和christou(agro-food-industryhi-tech，1994年3月/4月，17-27)。另外的有關植物轉化的教導內容可見于ep-a-0449375。有關真菌、酵母和植物的轉化的通用教導內容在以下部分示出。轉化的真菌宿主生物可以為真菌——諸如霉菌。合適的這類宿主的示例包括任何屬于嗜熱真菌屬(thermomyces)、枝頂孢屬(acremonium)、曲霉菌屬、青霉菌屬(penicillium)、毛霉菌屬(mucor)、脈孢菌屬(neurospora)、木霉屬(trichoderma)、根霉(rhizopus)、踝節(jié)菌屬(talaromyces)、腐質霉屬(humicola)等的成員。在一個實施方案中，宿主生物可為絲狀真菌。轉化絲狀真菌在us-a-5741665中進行了討論，該專利說明了用于絲狀真菌轉化和培養(yǎng)真菌的標準技術在本領域中是熟知的。應用于粗糙脈孢菌的技術的詳細綜述見于例如davisanddeserres,methodsenzymol(1971)17a:79-143。還可用于轉化絲狀真菌的另外教導綜述于us-a-5674707。此外，在絲狀真菌中的基因表達教導于punt等人(2002)trendsbiotechnol2002年5月；20(5):200-6,archer&peberdycritrevbiotechnol(1997)17(4):273-306中。本發(fā)明涵蓋使用這些標準技術制備的根據本發(fā)明的轉基因絲狀真菌的產生。適當地，宿主生物為木霉屬宿主生物，例如里氏木霉宿主生物。在另一個實施方案中，宿主生物可以為曲霉菌屬，諸如黑曲霉。根據本發(fā)明的轉基因曲霉菌還可通過例如以下的教導內容制備：turnerg.1994(vectorsforgeneticmanipulation.載于：martinellis.d.,kinghornj.r.(編輯)aspergillus:50yearson.progressinindustrialmicrobio-logy，第29卷，elsevieramsterdam1994.第641-666頁)。轉化的酵母在另一個實施方案中，轉基因生物體可以為酵母。酵母中異源基因表達的原理的綜述在例如methodsmolbiol(1995),49:341-54和curropinbiotechnol(1997)10月；8(5):554-60中提供。就這一點而言，酵母諸如fems釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)菌種或巴斯德畢赤酵母(pichiapastoris)菌種(參見femsmicrobiolrev(200024(1):45-66)可以用作異源基因表達的媒介物。釀酒酵母中異源基因表達和基因產物的分泌的原理的綜述由ehinchcliffeekenny(1993,“yeastasavehiclefortheexpressionofheterologousgenes”,yeasts，第5卷，anthonyhrose和j.stuartharrison編輯，第2版，academicpressltd.)給出。對于酵母的轉化，已經開發(fā)出若干轉化方案。例如，根據本發(fā)明的轉基因酵母菌(saccharomyces)可以通過以下的教導內容制備：hinnen等人(1978,proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheusa75,1929)；beggs,jd(1978,nature,london,275,104)；以及ito,h等人(1983,jbacteriology153,163-168)?？梢允褂酶鞣N選擇性標記諸如營養(yǎng)缺陷型標記顯性抗生素抗性標記來選擇轉化的酵母細胞。培養(yǎng)和制備用本發(fā)明的核苷酸序列轉化的宿主細胞可以在有利于制備編碼多肽以及有利于從細胞和/或培養(yǎng)基中回收多肽的條件下培養(yǎng)。用于培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基可以是任何適于使所考慮的宿主細胞生長并獲得多肽的表達的常規(guī)培養(yǎng)基。由重組細胞制備的蛋白質可以展示在細胞表面上。蛋白質可從宿主細胞分泌并且可使用熟知的規(guī)程從培養(yǎng)基中方便地回收。分泌通常，期望蛋白質從表達宿主分泌至培養(yǎng)基中，從而可更易于從培養(yǎng)基中回收蛋白質。根據本發(fā)明，分泌前導序列可以根據所需的表達宿主進行選擇。雜合信號序列也可以根據本發(fā)明的語境使用。異源分泌前導序列的典型示例是來源于真菌淀粉轉葡糖苷酶(ag)基因(glaa——18和24個氨基酸型式兩者，例如來自于曲霉屬)、a-因子基因(酵母，例如酵母屬、克魯維酵母屬(kluyveromyces)和漢遜酵母屬(hansenula))或α-淀粉酶基因(芽孢桿菌屬)的那些。以舉例的方式，大腸桿菌中異源蛋白質的分泌綜述于methodsenzymol(1990)182:132-143。轉錄后和翻譯后修飾適當地，本發(fā)明中使用的三肽基肽酶和/或內切蛋白酶可由本文教導的核苷酸序列中的任一種編碼。根據所用宿主細胞，可進行轉錄后和/或翻譯后修飾?？梢栽O想，用于本發(fā)明方法和/或用途的酶(例如，三肽基肽酶和/或內切蛋白酶)涵蓋已經歷轉錄后和/或翻譯后修飾的酶(例如，三肽基肽酶和/或內切蛋白酶)。轉錄后和/或翻譯后修飾的一個非限制性示例為“剪切”或“切割”多肽(例如，三肽基肽酶和/或內切蛋白酶)。在一些實施方案中，可“剪切”或“切割”多肽(例如，三肽基肽酶和/或內切蛋白酶)。這可導致三肽基肽酶和/或內切蛋白酶從失活或基本失活狀態(tài)轉化為活性狀態(tài)(即，能夠表現(xiàn)本文所述的活性)。三肽基肽酶可為前肽，該前肽經歷進一步翻譯后修飾成為成熟肽，即具有三肽基肽酶活性的多肽。以舉例的方式，僅seqidno.1與seqidno.29相同，不同的是seqidno.1經歷了翻譯后和/或轉錄后修飾以移除一些氨基酸，更具體地從n-末端移除197個氨基酸。因此，本文示為seqidno.1的多肽可在一些情況下(即，在一些宿主細胞中)視為前肽——其經由翻譯后和/或轉錄后修飾而進一步加工為成熟肽(seqidno.29)。就翻譯后和/或轉錄后修飾而言，精確修飾，例如一個或多個切割位點可根據宿主物種略微變化。在一些宿主物種中，可能不存在翻譯后和/或轉錄后修飾，因而前肽然后將等同于成熟肽(即，具有本發(fā)明的三肽基肽酶活性的多肽)。不受理論的束縛，與參考相比于seqidno.1的seqidno.29所示的切割位點相比，一個或多個切割位點可在任一方向移位數個殘基(例如，1、2或3個殘基)。換句話講，不同于第197位(r)的切割，例如，切割可例如在第196-a、195-a、194-a、198q、199e、200p位。此外或另選地，切割可導致移除約197個氨基酸，在一些實施方案中，切割可導致移除194至200個殘基。轉錄后和/或翻譯后修飾的一個示例包括但不限于豆蔻酰化、糖基化、截短、脂化以及酪氨酸、絲氨酸或蘇氨酸磷酸化。技術人員將會知道，蛋白質(例如，三肽基肽酶和/或內切蛋白酶)可能發(fā)生的轉錄后和/或翻譯后修飾的類型可取決于蛋白質(例如，三肽基肽酶和/或內切蛋白酶)在其中表達的宿主生物。檢測用于檢測和測量氨基酸序列的表達的多種方案在本領域中是已知的。示例包括酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)、放射性免疫測定(ria)和熒光激活細胞分選(facs)。多種多樣的標記和偶聯(lián)技術為本領域內的技術人員所熟知，并且可以用于各種核酸和氨基酸測定。多個公司諸如pharmaciabiotech(piscataway,nj)、promega(madison,wi)和usbiochemicalcorp(cleveland,oh)為這些規(guī)程提供商業(yè)試劑盒和方案。合適的報道分子或標記包括那些放射性核素、酶、熒光、化學發(fā)光或顯色劑以及底物、輔酶因子、抑制劑、磁性粒子等等。教導使用這類標記的專利包括us-a-3,817,837；us-a-3,850,752；us-a-3,939,350；us-a-3,996,345；us-a-4,277,437；us-a-4,275,149和us-a-4,366,241。另外，重組的免疫球蛋白可以如us-a-4,816,567中所示進行制備。融合蛋白根據本發(fā)明使用的氨基酸序列可以制成融合蛋白，例如從而有助于提取和純化。融合蛋白伴侶的示例包括谷胱甘肽-s-轉移酶(gst)、6xhis、gal4(dna結合和/或轉錄激活結構域)和β-半乳糖苷酶。還可以方便地包括介于融合蛋白伴侶和目的蛋白序列之間的蛋白水解裂解位點以允許移除融合蛋白序列。優(yōu)選地，融合蛋白不妨礙蛋白序列的活性。大腸桿菌中的基因融合表達系統(tǒng)綜述于curropinbiotechnol(1995)6(5):501-6。在本發(fā)明的另一個實施方案中，可將氨基酸序列連接至異源序列以編碼融合蛋白。例如，對于從肽文庫中篩選能夠影響物質活性的試劑，它可以用于編碼表達異源表位的嵌合物質，異源表位可由可商購獲得的抗體識別。常規(guī)重組和方法技術除非另有指示，否則本發(fā)明采用化學、分子生物學、微生物學、重組dna和免疫學的常規(guī)技術，這些技術在本領域的普通技術人員的能力之內。此類技術在文獻中有所闡明。參見，例如j.sambrook,e.f.fritsch和t.maniatis,1989,molecularcloning:alaboratorymanual，第二版，第1-3卷，coldspringharborlaboratorypress；ausubel,f.m.等人(1995andperiodicsupplements；currentprotocolsinmolecularbiology，第9、13和16章，johnwiley&sons,newyork,n.y.)；b.roe,j.crabtree和a.kahn,1996,dnaisolationandsequencing:essentialtechniques,johnwiley&sons；m.j.gait(編輯)，1984,oligonucleotidesynthesis:apracticalapproach,irlpress；以及d.m.j.lilley和j.e.dahlberg,1992,methodsofenzymology:dnastructureparta:synthesisandphysicalanalysisofdnamethodsinenzymology,academicpress。這些常規(guī)文件各自以引用方式并入本文。劑量本發(fā)明的方法和/或用途中使用的三肽基肽酶和/或內切蛋白酶的劑量可為任何合適的量。在一個實施方案中，三肽基肽酶可以以約5mg至3g酶/kg原料的量投配。在一個實施方案中，適當地，三肽基肽酶可以以25mg至1000mg酶/kg原料的量投配。在一個實施方案中，三肽基肽酶可以以約0.01mg-100mg；0.5mg-100mg；1mg-50mg；5mg-100mg；5mg-20mg，10mg-100mg；0.05mg-50mg；或0.10mg-10mg酶/kg原料的量投配。在某些實施方案中，三肽基肽酶可以以約0.01g至1000g，諸如0.1g至500g，諸如0.5g至700g酶/kg原料的量，諸如以約0.01g-200g，0.01g-100g；0.5g-100g；1g-50g；5g-100g；5g-20g，5g-15g，10g-100g；0.05g-50g；或0.10g-10g酶/kg原料的量投配。在一個優(yōu)選的實施方案中，三肽基肽酶可以以約5mg–20mg酶/kg原料的量投配。精確的量將取決于所用組合物的特定類型和每mg蛋白質的蛋白酶比活性。在另一個實施方案中，三肽基肽酶可以以約1mg至約1kg酶/kg原料的量投配。適當地，三肽基肽酶的劑量可以以約1mg至約250g/kg原料投配。優(yōu)選地，約1mg至約100g(更優(yōu)選地，約1mg至約1g)/kg原料。在一些實施方案中，三肽基肽酶的劑量可基于根據以下測定計算的原料中存在的每克干固體的三肽基肽酶單位(tppu)數：三肽基肽酶的tppu單位數可利用以下計算：在96孔微量滴定板的孔中，使150ul的1mmh-ala-ala-phe-pna(對-硝基苯胺衍生的底物)的0.1mnaoac(ph4.5)溶液與各種量的酶稀釋液混合以符合測定的線性范圍。在室溫(25℃)下，動力學上跟蹤410nm處的吸光度。1u被定義為每分鐘釋放1微摩爾pna的酶的量。410處的pna摩爾吸附假設為8800。因此，在一個實施方案中，三肽基肽酶可以以至少約0.01tppu/g原料中存在的干固體，適當地至少0.02tppu/g原料中存在的干固體的量投配。在另一個實施方案中，三肽基肽酶可以以約0.01tppu/g原料中存在的干固體至約0.5tppu/g原料中存在的干固體的量投配。適當地，三肽基肽酶可以以約0.1tppu/g原料中存在的干固體至約0.25tppu/g原料中存在的干固體的量投配。更適當地，三肽基肽酶可以以約0.01tppu/g原料中存在的干固體至約0.1tppu/g原料中存在的干固體的量投配。優(yōu)選地，三肽基肽酶可以以約0.01tppu/g原料中存在的干固體至約0.05tppu/g原料中存在的干固體的量投配。優(yōu)選地，三肽基肽酶可以以約0.02tppu/g原料中存在的干固體的量投配。內切蛋白酶可以以約50mg至約3000mg酶/kg蛋白質底物，例如0.05g至3g酶/公噸(mt)原料的量投配。適當地，內切蛋白酶可以以少于約4.0g酶/mt原料的量投配。在另一個實施方案中，內切蛋白酶可以以介于約0.5g和約5.0g酶/mt原料之間的量投配。適當地，內切蛋白酶可以以介于約0.5g和約3.0g酶/mt原料之間的量投配。更適當地，內切蛋白酶可以以約1.0g至約2.0g酶/mt原料的量投配。在一個實施方案中，內切蛋白酶可以以至少約0.01sapu/g原料中存在的干固體，適當地至少0.02sapu/g原料中存在的干固體的量投配。在另一個實施方案中，內切蛋白酶可以以約0.01sapu/g原料中存在的干固體至約0.5sapu/g原料中存在的干固體的量投配。適當地，內切蛋白酶可以以約0.1sapu/g原料中存在的干固體至約0.25sapu/g原料中存在的干固體的量投配。更適當地，內切蛋白酶可以以約0.01sapu/g原料中存在的干固體至約0.1sapu/g原料中存在的干固體的量投配。優(yōu)選地，內切蛋白酶可以以約0.01sapu/g原料中存在的干固體至約0.05sapu/g原料中存在的干固體的量投配。優(yōu)選地，內切蛋白酶可以以約0.02sapu/g原料中存在的干固體的量投配。在一個實施方案中，內切蛋白酶可以以至少約0.1sapu/g原料中存在的干固體投配。適當地，內切蛋白酶可以以至少約0.2sapu/g原料中存在的干固體投配。在另一些實施方案中，內切蛋白酶可以以約0.1sapu至約0.5sapu/g原料中存在的干固體投配。適當地，內切蛋白酶可以以約0.1sapu至約0.3sapu/g原料中存在的干固體投配。優(yōu)選地，內切蛋白酶可以以約0.15sapu至約0.25sapu/g原料中存在的干固體投配。sapu是指分光光度測定的酸性蛋白酶單位，其中1sapu是在測定條件下每分鐘從酪蛋白底物中釋放一微摩爾酪氨酸的蛋白酶活性量。基于谷物的材料根據本發(fā)明使用的原料可為谷物/谷類(例如，小麥、大麥、裸麥、稻、黑小麥、粟、買羅高粱、高粱或玉米)、根、塊莖(例如，馬鈴薯或木薯)、糖(例如，蔗糖、甜菜糖、糖蜜或糖漿)、釜餾物、濕餅、ddgs、或它們的混合物或部分。為避免疑義，谷物可通過機械方式破碎。基于谷物的材料可分解或降解為葡萄糖。對于任何發(fā)酵過程，例如生物燃料(例如生物乙醇)生產，葡萄糖可隨后用作原料?；诠任锏牟牧峡蔀樯锶剂?例如生物乙醇)生產過程的原料。目前，大部分燃料乙醇由玉米(玉蜀黍)谷物制得，該玉米谷物被研磨或碾磨，經淀粉酶處理以將淀粉水解成糖，糖化并發(fā)酵，或經受ssf，以及蒸餾。在所述過程中通常使用其它酶。雖然在降低乙醇生產成本方面已取得了實質性進步，但是仍面臨著重大挑戰(zhàn)。仍然需要改善的技術來降低用于乙醇生產的生物燃料原料的成本。例如，在基于谷物的乙醇生產中，阿拉伯木聚糖的降解可增大淀粉的易獲得性。在一些實施方案中，木聚糖酶可用于分解半纖維素，例如阿拉伯木聚糖——具體地為axinsol和axsol。僅以舉例的方式，在歐洲燃料醇工業(yè)中，小粒谷物如小麥、大麥和裸麥為常見原材料，在us主要使用玉米。除淀粉之外，小麥、大麥和裸麥還包含高含量的非淀粉多糖聚合物(nsp)，如纖維素、β-葡聚糖和半纖維素。其中表示不同的nsp的比率對于每種原料有所不同并且根據所用測量方法變化，但是僅以舉例的方式，下表示出相比于某些其它原料，小麥、大麥和裸麥中nsp的量不同。表1：不同原料中存在的非淀粉多糖(gkg-1干物質)1非纖維素多糖：戊聚糖、(阿拉伯)木聚糖及其它半纖維素本發(fā)明的一個優(yōu)點在于，在醇(例如，生物燃料)生產中使用本發(fā)明的三肽基肽酶還可由該過程產生改善的副產物，諸如濕餅、干酒糟(ddg)或含可溶物干酒糟(ddgs)。因此，本發(fā)明的一個優(yōu)點在于，因為濕餅、ddg和ddgs是生物燃料(例如，生物乙醇)生產的副產物，所以本發(fā)明的用途可導致這些副產物的質量提高。醇生產的副產物本發(fā)明提供了通過本發(fā)明的方法可獲得的(或獲得的)醇生產的副產物。適當地，醇生產的副產物可基本上富含一種或多種三肽。如本文所用，術語“基本上富含三肽”意指由本領域已知的任何方法(例如，液相色譜-質譜(lc-ms))測量的總肽濃度的至少約20％(適當地，至少約30％)的那些肽是三肽。適當地，至少約40％，更適當地至少約50％的那些肽是三肽。在一個實施方案中，如本文所用，術語“基本上富含三肽”意指由本領域已知的任何方法(例如，液相色譜-質譜(lc-ms))測量的總肽濃度的至少約70％的那些肽是三肽。在一些實施方案中，醇生產的副產物可基本上富含一種或多種在n-末端、c-末端或它們的組合處具有脯氨酸的三肽。適當地，副產物可富含一種或多種在n-末端并在c-末端具有脯氨酸的三肽。副產物可為在醇發(fā)酵過程后可獲得的任何材料。適當地，醇生產的副產物可為全釜餾物、稀釜餾物、濕餅、干酒糟(ddg)、含可溶物干酒糟(ddgs)或富含蛋白質的ddg或ddgs、或蛋白質級分。優(yōu)選地，副產物可為生物燃料生產過程的副產物。與其它組分/形式的組合三肽基肽酶和/或內切蛋白酶可以以本領域已知的任何方式配制。在一個實施方案中，可將本發(fā)明中使用的三肽基肽酶和/或內切蛋白酶配制為液體、干粉或顆粒。優(yōu)選地，三肽基肽酶和/或內切蛋白酶可配制為液體制劑。在其它實施方案中，三肽基肽酶和/或內切蛋白酶可配制為干粉。在一些實施方案中，可將另外的成分與三肽基肽酶(例如，耐脯氨酸三肽基肽酶)混合，所述另外的成分諸如鹽(諸如na2so4)、麥芽糖糊精、石灰石(碳酸鈣)、環(huán)糊精、小麥或小麥組分、淀粉、滑石、pva、多元醇(諸如山梨糖醇和甘油)、苯甲酸酯、山梨酸酯、糖(諸如蔗糖和葡萄糖)、丙二醇、1,3-丙二醇、對羥基苯甲酸酯、氯化鈉、檸檬酸鹽、乙酸鹽、乙酸鈉、磷酸鹽、鈣、偏亞硫酸氫鹽、甲酸鹽或它們的混合物。在一個優(yōu)選的實施方案中，根據本發(fā)明的食物添加劑組合物或飼料添加劑組合物包含根據本發(fā)明的三肽基肽酶(例如耐脯氨酸三肽基肽酶)或根據本發(fā)明的發(fā)酵物，并且進一步包含一種或多種選自以下的成分：鹽、多元醇包括山梨糖醇和甘油、小麥或小麥組分、乙酸鈉、三水合醋酸鈉、山梨酸鉀、滑石、pva、苯甲酸酯、山梨酸酯、1,3-丙二醇、葡萄糖、對羥基苯甲酸酯、氯化鈉、檸檬酸鹽、偏亞硫酸氫鹽、甲酸鹽或它們的組合。在一個實施方案中，鹽可選自：na2so4、nah2po4、na2hpo4、na3po4、(nh4)h2po4、k2hpo4、kh2po4、k2so4、khso4、znso4、mgso4、cuso4、mg(no3)2、(nh4)2so4、硼酸鈉、乙酸鎂、檸檬酸鈉或它們的組合。干粉或顆?？赏ㄟ^本領域技術人員已知的手段，諸如，在頂噴式流化床涂布器中、在wurster型底噴式流化床(buttomspraywurster)中或通過轉鼓制粒(例如高剪切制粒)、擠出、衣鍋包衣或在微成分混合器中制備。適當地，可將三肽基肽酶(任選地與內切蛋白酶組合)與如本文公開的產醇宿主一起干燥。對于一些實施方案而言，可涂布(例如包封)三肽基肽酶和/或內切蛋白酶。在一個實施方案中，涂層保護經修飾的酶免受熱影響并且可視為防熱劑。在一些實施方案中，可使用稀釋劑(諸如淀粉粉末、石灰石等)稀釋三肽基肽酶和/或內切蛋白酶。在一個實施方案中，三肽基肽酶和/或內切蛋白酶含有如下中的一者或多者：緩沖劑、鹽、山梨糖醇和/或甘油。在另一個實施方案中，可通過將酶施加(例如噴涂)于承載基底(諸如碾碎的小麥)上來配制三肽基肽酶和/或內切蛋白酶。食品級酶的典型的液體制劑可包含以下組分(％為以w/w計)：目的酶0,2％-30％，優(yōu)選地2％-20％。在一些實施方案中，可將多元醇與三肽基肽酶和/或內切蛋白酶混合。多元醇諸如甘油和/或山梨糖醇可以以5％(w/w)-50％(w/w)，優(yōu)選地10％-50％(w/w)并且更優(yōu)選地10％-30％(w/w)的量混合，％(w/w)意指％(重量多元醇/重量溶液)，不受理論的束縛，較低濃度的10％多元醇可有助于增大酶的溶解度和貯存穩(wěn)定性。然而，許多商業(yè)酶需要30％甘油，從而使酶隨時間推移以目標濃度保持穩(wěn)定。50％的較高多元醇仍可能進一步改善穩(wěn)定性，但在該多元醇水平下，低水活度的益處還有利于微生物保藏。具體地對食品酶而言，這在中性ph下可極為重要，其中選擇較好的防腐劑受到了限制。可將糖(具體地葡萄糖)與三肽基肽酶和/或內切蛋白酶混合。糖例如葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、海藻糖都為底物的示例，對許多酶而言該底物可代替多元醇的使用。適當地，它們(具體地葡萄糖)可在5％(w/w)-50％(w/w)范圍內單獨地或與多元醇組合使用。還可通過使用濃度為約0.1％至約20％(適當地約0.1％至約5％)的鹽如nacl、kcl、cacl2、na2so4或其它食品級鹽來增大酶制劑的穩(wěn)定性。不受理論的束縛，據信單獨的或與多元醇或糖組合的高濃度鹽還可為一種實現(xiàn)微生物穩(wěn)定性的方式。作用機制可能歸因為低水活度或某些酶與鹽之間的特定作用。因此，在一些實施方案中，可將三肽基肽酶與至少一種鹽混合?？蓪⒁宜徕c以5％(w/w)-50％(w/w)，優(yōu)選地8％-40％，優(yōu)選地8％-12％(w/w)，優(yōu)選地10％-50％，還更優(yōu)選地10％-30％(w/w)的量混合，％(w/w)意指％(重量乙酸鈉/重量溶液)。在一個實施方案中，可將三肽基肽酶和/或內切蛋白酶與防腐劑混合。適當地，防腐劑可為苯甲酸鹽(諸如苯甲酸鈉)和/或山梨酸鉀。這些防腐劑可通常以約0.1％-1％，適當地約0.2％-0.5％的組合濃度使用。苯甲酸鈉在ph<5.5下最有效，并且山梨酸鈉在ph<6下最有效。在一個實施方案中，一種或多種成分(例如，用于配制酶(例如，三肽基肽酶和/或內切蛋白酶))可選自：小麥載體、多元醇、糖、鹽和防腐劑。適當地，糖為山梨糖醇。適當地，鹽為硫酸鈉。適當地，多元醇可為聚乙二醇。在一個實施方案中，一種或多種成分(例如，用于配制酶(例如，三肽基肽酶和/或內切蛋白酶))可選自：小麥載體、多元醇、山梨糖醇、硫酸鈉和防腐劑。適當地，一種或多種成分(例如，用于配制三肽基肽酶和/或內切蛋白酶)可選自：小麥載體、山梨糖醇和硫酸鈉。適當地，可將三肽基肽酶和/或內切蛋白酶與小麥載體混合。適當地，可將三肽基肽酶和/或內切蛋白酶與山梨糖醇混合。適當地，可將三肽基肽酶和/或內切蛋白酶與硫酸鈉混合。在一個實施方案中，本發(fā)明中使用的酶(例如，三肽基肽酶和/或內切蛋白酶)可用一種或多種選自以下的成分配制：多元醇，諸如甘油和/或山梨糖醇；糖，諸如葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖和海藻糖；鹽，諸如nacl、kcl、cacl2、na2so4或其它鹽；防腐劑，例如苯甲酸鈉和/或山梨酸鉀；或它們的組合。在另一個實施方案中，在本發(fā)明的方法和/或用途中使用的三肽基肽酶可用包含以下物質(或實質上由以下物質組成；或由以下物質組成)的載體配制：na2so4、nah2po4、na2hpo4、na3po4、(nh4)h2po4、k2hpo4、kh2po4、k2so4、khso4、znso4、mgso4、cuso4、mg(no3)2、(nh4)2so4、硼酸鈉、乙酸鎂、檸檬酸鈉或它們的組合。在另一個實施方案中，在本發(fā)明的方法和/或用途中使用的三肽基肽酶可用na2so4配制。三肽基肽酶和/或內切蛋白酶可與其它組分組合使用。在一個實施方案中，“另外的組分”可為一種或多種酶。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明的方法和/或用途可進一步包括利用一種或多種纖維素酶活性、半纖維素酶活性、另外的酶活性或它們的組合。適當地，一種或多種纖維素酶活性、半纖維素酶活性、另外的酶活性或它們的組合選自：選自以下的酶中的一種或多種：內切葡聚糖酶(e.c.3.2.1.4)；纖維二糖水解酶(e.c.3.2.1.91)、β-葡糖苷酶(e.c.3.2.1.21)、纖維素酶(e.c.3.2.1.74)、地衣多糖酶(e.c.3.1.1.73)、脂肪酶(e.c.3.1.1.3)、脂質?；D移酶(通常歸類為e.c.2.3.1.x)、磷脂酶(e.c.3.1.1.4，e.c.3.1.1.32或e.c.3.1.1.5)、植酸酶(例如6-植酸酶(e.c.3.1.3.26)或3-植酸酶(e.c.3.1.3.8)、酸性磷酸酶、淀粉酶、α-淀粉酶(e.c.3.2.1.1)、木聚糖酶(例如，內切-1,4-β-d-木聚糖酶(e.c.3.2.1.8)或1,4β-木糖苷酶(e.c.3.2.1.37)或e.c.3.2.1.32，e.c.3.1.1.72，e.c.3.1.1.73)、葡糖淀粉酶(e.c.3.2.1.3)、普魯蘭酶、半纖維素酶、蛋白酶(例如，枯草桿菌蛋白酶(e.c.3.4.21.62)或芽孢桿菌溶素(e.c.3.4.24.28)或堿性絲氨酸蛋白酶(e.c.3.4.21.x)或角蛋白酶(e.c.3.4.x.x))、脫支酶、角質酶、酯酶和/或甘露聚糖酶(例如，β-甘露聚糖酶(e.c.3.2.1.78))、轉移酶、葡糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶。適當地，其它組分可為植酸酶(例如，6-植酸酶(e.c.3.1.3.26)或3-植酸酶(e.c.3.1.3.8))。在一個實施方案中，其它組分可為選自以下的酶中的一種或多種：木聚糖酶(e.c.3.2.1.8，e.c.3.2.1.32，e.c.3.2.1.37，e.c.3.1.1.72，e.c.3.1.1.73)、淀粉酶(包括α-淀粉酶(e.c.3.2.1.1)、g4-形成淀粉酶(e.c.3.2.1.60)、β-淀粉酶(e.c.3.2.1.2)和γ-淀粉酶(e.c.3.2.1.3)；和/或蛋白酶(例如，枯草桿菌蛋白酶(e.c.3.4.21.62)或芽孢桿菌溶素(e.c.3.4.24.28)或堿性絲氨酸蛋白酶(e.c.3.4.21.x)或角蛋白酶(e.c.3.4.x.x))。在一個實施方案中，其它組分可為淀粉酶(例如，α-淀粉酶(e.c.3.2.1.1))和蛋白酶(例如，枯草桿菌蛋白酶(e.c.3.4.21.62))的組合。在一個優(yōu)選的實施方案中，三肽基肽酶可用一種或多種葡糖淀粉酶、α-淀粉酶和/或另外的蛋白酶配制。適當地，另外的蛋白酶可為內切蛋白酶。在一個實施方案中，其它組分可為β-葡聚糖酶，例如，內切-1,3(4)-β-葡聚糖酶(e.c.3.2.1.6)。在一個實施方案中，其它組分可為甘露聚糖酶(例如，β-甘露聚糖酶(e.c.3.2.1.78))。在一個實施方案中，其它組分可為脂肪酶(e.c.3.1.1.3)、脂質?；D移酶(通常歸類為e.c.2.3.1.x)、或磷脂酶(e.c.3.1.1.4，e.c.3.1.1.32或e.c.3.1.1.5)、適當的脂肪酶(e.c.3.1.1.3)。在一個實施方案中，其它組分可為蛋白酶(例如，枯草桿菌蛋白酶(e.c.3.4.21.62)或芽孢桿菌溶素(e.c.3.4.24.28)或堿性絲氨酸蛋白酶(e.c.3.4.21.x)或角蛋白酶(e.c.3.4.x.x))。在一個實施方案中，另外的酶可為α-淀粉酶(e.c.3.2.1.1)、普魯蘭酶(ec3.2.1.41))、β-淀粉酶(e.c.3.2.1.2)、麥芽糖淀粉酶(例如，葡聚糖1,4-α-麥芽糖水解酶(ec3.2.1.133)),g4-形成淀粉酶(e.c.3.2.1.60)、異淀粉酶(ec3.2.1.68)、葡糖淀粉酶(e.c.3.2.1.3)或它們的組合。在一些實施方案中，根據本發(fā)明的方法和/或用途可進一步包括使用一種或多種糖苷水解酶(gh)。gh酶可包括木聚糖酶、甘露聚糖酶、淀粉酶、β-葡聚糖酶、纖維素酶、以及其它糖酶，并且可基于如下特性分類：氨基酸β-葡聚糖酶、纖維素酶、以及其它糖酶，并且可基于如下特性分類：氨基酸的序列、它們的三維結構以及它們催化位點的幾何結構(gilkes等人，1991,microbiol.reviews55:303-315)。在一個實施方案中，根據前述實施方案的gh酶(例如，木聚糖酶)可為選自由以下項組成的組中的一者或多者的gh家族酶：gh10、gh11、gh5、gh7、gh8和gh43。最初，所有已知且表征的木聚糖酶均屬于家族gh10或gh11。進一步的工作然后鑒定了屬于家族gh5、gh7、gh8和gh43的多種其它類型的木聚糖酶(collins等人(2005)femsmicrobiolrev.,29(1),3-23)。gh11木聚糖酶的結構可描述為β-果凍卷結構或全β-鏈夾層折疊結構(himmel等人1997appl.biochem.biotechnol.63-65,315-325)。gh11酶具有約20kda的催化結構域。gh10木聚糖酶具有分子量在32kda-39kda范圍內的催化結構域。gh10木聚糖酶的催化結構域的結構由八重β/α筒組成(harris等人1996–acta.crystallog.sec.d52,393-401)。三維結構可用于大量的家族gh10酶，首先實現(xiàn)是變鉛青鏈霉菌木聚糖酶a(derewenda等人，jbiolchem，1994年8月19日；269(33)20811-4)、糞堿纖維單胞菌(c.fimi)內切-聚糖酶cex(white等人，biochemistry，1994年10月25日；33(42)12546-52)和纖維弧菌(cellvibriojaponicus)xyn10a(先前為熒光假單胞菌(pseudomonasfluorescens)亞種木聚糖酶a)(harris等人，structure1994年11月15日；2(11)1107-1116的那些。作為clangha的成員，它們具有典型的(α/β)8tim筒狀折疊，而兩個關鍵的活性位點谷氨酸位于β-鏈4(酸/堿)和7(親核體)的c-末端(henrissat等人，procnatlacadsciusa，1995年7月18日；92(15)7090-4)。gh家族酶可通過本領域已知的技術由技術人員鑒定。蛋白質相似性搜索(例如，蛋白質blast，http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi？cmd＝web&page_type＝blasthome)可確定未知序列是否可落入例如gh10木聚糖酶家族成員的項目內，具體地講，gh家族可基于關鍵區(qū)中的序列同源性分類。此外或另選地，為了確定未知蛋白質序列是否為gh10家族內的木聚糖酶蛋白質，不僅可對序列相似性/同源性/同一性，還可對3d結構相似性進行評價。gh-家族的分類通常基于3d折疊。預測未知蛋白質序列的3d折疊的軟件為hhpred(http://toolkit.tuebingen.mpg.de/hhpred)。預測蛋白質結構的該種軟件的功效依賴于使用待用作模板的已知結構來鑒定同源序列。其效果良好，因為結構比一級序列發(fā)散(diverge)得更慢。甚至當其序列發(fā)散到不能識別的程度時，同一家族的蛋白質也可能具有極為類似的結構。例如，可將未知序列以fasta格式粘貼到軟件中(http://toolkit.tuebingen.mpg.de/hhpred)。在完成了這步后，可提交搜索。搜索的輸出將示出具有已知3d結構的序列的列表。為了確認未知序列實際為例如gh10木聚糖酶，可發(fā)現(xiàn)gh10木聚糖酶有>90的概率在同系物的列表之內。并非所有被鑒定為同系物的蛋白質將表征為gh10木聚糖酶，但是一些將是這樣。后者蛋白質是具有已知結構并且它們被鑒定為木聚糖酶的生化特征的蛋白質。前者并未生化表征為gh10木聚糖酶。若干參考文獻描述了該方案，諸如j.(2005)proteinhomologydetectionbyhmm-hmmcomparison-bioinformatics21,951-960(doi:10.1093/bioinformatics/bti125)和j,biegerta和lupasan.(2005)thehhpredinteractiveserverforproteinhomologydetectionandstructureprediction-nucleicacidsresearch33,w244--w248(web服務器發(fā)布)(doi:10.1093/nar/gki40)。根據cazy網站(http://www.cazy.org/)，家族10糖苷水解酶可如下表征：已知活性：內切-1,4-β-木聚糖酶(ec3.2.1.8)；內切-1,3-β-木聚糖酶(ec3.2.1.32)；番茄皂甙酶(tomatinase)(ec3.2.1.-)機制：保持clan：gh-a催化親核物質/堿glu(實驗)催化質子供體：glu(實驗)3d結構狀態(tài)：(β/α)8根據本發(fā)明使用的gh10木聚糖酶可具有分子量在32kda-39kda范圍內的催化結構域。gh10木聚糖酶的催化結構域的結構由八重β/α筒組成(harris等人1996–acta.crystallog.sec.d52,393-401)。三維結構可用于大量的家族gh10酶，首先實現(xiàn)是變鉛青鏈霉菌木聚糖酶a(derewenda等人，jbiolchem，1994年8月19日；269(33)20811-4)、糞堿纖維單胞菌(c.fimi)內切-聚糖酶cex(white等人，biochemistry，1994年10月25日；33(42)12546-52)和纖維弧菌(cellvibriojaponicus)xyn10a(先前為熒光假單胞菌(pseudomonasfluorescens)亞種木聚糖酶a)(harris等人，structure1994年11月15日；2(11)1107-1116)那些。作為clangha的成員，它們具有典型的(α/β)8tim筒狀折疊，而兩個關鍵的活性位點谷氨酸位于β-鏈4(酸/堿)和7(親核體)的c-末端(henrissat等人，procnatlacadsciusa，1995年7月18日；92(15)7090-4)。因此，如本文所用，“gh10木聚糖酶”意指這樣的多肽：具有木聚糖酶活性并具有(α/β)8tim筒狀折疊，而兩個關鍵的活性位點谷氨酸位于β-鏈4(酸/堿)和7(親核體)的c-末端。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，三肽基肽酶不可與具有以下多肽序列的酶組合：mrtaaasltlaatclfelasalmpraplipamkakvalpsgnatfeqyidhnnpglgtfpqrywynpefwagpgspvllftpgesdaadydgfltnktivgrfaeeiggavillehrywgasspypelttetlqyltleqsiadlvhfaktvnlpfdeihssnadnapwvmtggsysgalaawtasiapgtfwayhassapvqaiydfwqyfvpvvegmpkncskdlnrvveyidhvyesgdierqqeikemfglgalkhfddfaaaitngpwlwqdmnfvsgysrfykfcdavenvtpgaksvpgpegvglekalqgyaswfnstylpgscaeykywtdkdavdcydsyetnspiytdkavnntsnkqwtwflcneplfywqdgapkdestivsrivsaeywqrqchayfpevngytfgsangktaedvnkwtkgwdltnttrliwangqfdpwrdasvssktrpggplqsteqapvhvipggfhcsdqwlvygeanagvqkvideevaqikawvaeypkyrkp在另一個實施方案中，其它組分可為另外的蛋白酶。適當地，另外的蛋白酶可選自：氨肽酶和羧肽酶。如在該語境中使用的術語“氨肽酶”是指能夠從蛋白質和/或肽底物的n-末端切割單個氨基酸、二氨基酸或它們的組合的外肽酶。優(yōu)選地，氨肽酶能夠僅從蛋白質和/或肽底物的n-末端切割單個氨基酸。氨肽酶可獲得(例如獲得)自乳桿菌，適當地獲得自瑞士乳桿菌(lactobacillushelveticus)。在一個實施方案中，氨肽酶可為氨肽酶n(例如，pepn)(ec3.4.11.2)。在另一個實施方案中，氨肽酶可包含如下所示序列：mavkrfyktfhpehydlrinvnrknktingtstitgdvienpvfinqkfmtidsvkvdgknvdfdviekdeaikiktgvtgkavieiaysapltdtmmgiypsyyelegkkkqiigtqfettfarqafpcvdepeakatfslalkwdeqdgevalanmpevevdkdgyhhfeetvrmssylvafafgelqsktthtkdgvligvyatkahkpkeldfaldiakraiefyeefyqtkyplpqslqlalpdfsagamenwglvtyreayllldpdntslemkklvatvithelahqwfgdlvtmkwwdnlwlnesfanmmeylsvdglepdwhiwemfqtseaasalnrdatdgvqpiqmeindpadidsvfdgaivyakgsrmlvmvrsllgddalrkglkyyfdhhkfgnatgddlwdalstatdldigkimhswlkqpgypvvnafvaedghlkltqkqffigegedkgrqwqiplnanfdapkimsdkeidlgnykvlreeaghplrlnvgnnshfiveydktllddilsdvneldpidklqllqdlrllaegkqisyasivpllvkfadsksslvinalyttaaklrqfvepesneeknlkklydllskdqvarlgwevkpgesdedvqirpyelsaslyaenadsikaahqiftenednlealnadirpyvlinevknfgnaelvdklikeyqrtadpsykvdlrsavtstkdlaaikaivgdfenadvvkpqdlcdwyrgllanhygqqaawdwiredwdwldktvggdmefakfitvtagvfhtperlkefkeffepkinvpllsreikmdvkvieskvnlieaekdavndavakaid如本文所用，術語“羧肽酶”具有其在本領域中常用的含義并且指能夠從肽和/或蛋白質底物的c-末端切割n個氨基酸的外肽酶。在一個實施方案中，n可為至少1，適當地，n可為至少2。在其它實施方案中，n可為至少3，適當地至少4。在其它實施方案中，可將三肽基肽酶(任選地與內切蛋白酶組合)與一種或多種另外的外肽酶一起使用。在一個實施方案中，耐脯氨酸三肽基肽酶(任選地與內切蛋白酶組合)不與脯氨酸特異性外肽酶組合。在一個實施方案中，額外組分可為穩(wěn)定劑或乳化劑或粘結劑或載體或賦形劑或稀釋劑或崩解劑。如本文所用，術語“穩(wěn)定劑”定義為保持產品免于隨時間推移而變化的成分或成分的組合。如本文所用，術語“乳化劑”是指防止乳液分離的成分。乳液是兩種不可混溶的物質，一種以小滴形式存在，包含于另一者中。乳液可由以下組成：水包油，其中小滴或分散相為油并且連續(xù)相為水；或油包水，其中水變?yōu)榉稚⑾嗖⑶疫B續(xù)相為油。也可通過使用乳化劑使泡沫(其是液包氣)和混懸液(其為液包固混懸液)穩(wěn)定。如本文所用，術語“粘結劑”是指通過物理或化學反應將產品粘結在一起的成分。例如，在“膠凝”期間，水被吸收，從而提供結合效果。然而，粘結劑可吸收其它液體(諸如油)，從而將其保持在產品中。在本發(fā)明上下文中，粘結劑將通常用于固體或低水分產品(例如烘焙產品：甜點、甜甜圈、面包等等)中。制粒粘結劑的示例包括以下項中的一者或多者：聚乙烯吡咯烷酮、羥丙基甲基纖維素(hpmc)、羥丙基纖維素(hpc)、蔗糖、麥芽糖、明膠和阿拉伯樹膠?！拜d體”意指適于施用酶的材料且包括本領域已知的任何此類材料，諸如例如任何液體、凝膠、溶劑、液體稀釋劑、穩(wěn)定劑等等，其為無毒的并且并不以有害方式與組合物的任何組分相互作用。本發(fā)明提供了組合物的用途以及用于制備該組合物的方法，所述組合物包含與至少一種選自如下中的至少一者的生理學上可接受的載體組合的三肽基肽酶(任選地與內切蛋白酶組合)：麥芽糖糊精、石灰石(碳酸鈣)、環(huán)糊精、小麥或小麥組分、蔗糖、淀粉、na2so4、滑石、pva、山梨糖醇、苯甲酸酯、山梨酸酯、甘油、蔗糖、丙二醇、1,3-丙二醇、葡萄糖、對羥基苯甲酸酯、氯化鈉、檸檬酸鹽、乙酸鹽、磷酸鹽、鈣、偏亞硫酸氫鹽、甲酸鹽以及它們的混合物。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了組合物的用途和制備組合物的方法，該組合物包含用選自由以下項組成的組中的一者或多者的化合物配制的本發(fā)明的酶：na2so4、nah2po4、na2hpo4、na3po4、(nh4)h2po4、k2hpo4、kh2po4、k2so4、khso4、znso4、mgso4、cuso4、mg(no3)2、(nh4)2so4、硼酸鈉、乙酸鎂、檸檬酸鈉或它們的組合?！百x形劑”的示例包括以下中的一者或多者：微晶纖維素和其它纖維素、乳糖(lactose)、檸檬酸鈉、碳酸鈣、磷酸氫鈣、甘氨酸、淀粉、乳糖(milksugar)和高分子量聚乙二醇?！氨澜鈩钡氖纠ㄒ韵轮械囊徽呋蚨嗾撸旱矸?優(yōu)選玉米、馬鈴薯或木薯淀粉)、羥基乙酸淀粉鈉、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉和某些復合硅酸鹽?！跋♂寗钡氖纠ㄒ韵轮械囊徽呋蚨嗾撸核?、乙醇、丙二醇和甘油、以及它們的組合。其它的組分可同時使用(例如當它們混合在一起時或者甚至當它們通過不同的途徑遞送時)或者依序用于組合物(例如它們可通過不同的途徑遞送)。在一個實施方案中，優(yōu)選地，組合物不包含鉻或有機鉻。在一個實施方案中，優(yōu)選地，組合物不包含山梨酸。本發(fā)明中使用的三肽基肽酶和/或內切蛋白酶可以以任何合適的形式使用。三肽基肽酶和/或內切蛋白酶可以固體或液體制劑或其備選形式使用。固體制劑的示例包括散劑、糊劑、大丸劑、膠囊劑、丸粒、片劑、藥丸、顆粒劑、膠囊劑、胚珠、溶液或混懸劑、粉劑和顆粒劑，其可以是可潤濕的、噴霧干燥的或冷凍干燥的。液體制劑的示例包括但不限于水性、有機或水性-有機溶液、混懸劑和乳劑。三肽基肽酶和/或內切蛋白酶可包含調味劑或著色劑，以供立即、延遲、改性、持續(xù)、脈沖或受控釋放應用。以舉例的方式，如果三肽基肽酶和/或內切蛋白酶以固體例如丸粒形式使用，其還可包含以下中的一者或多者：賦形劑，諸如微晶纖維素、乳糖、檸檬酸鈉、碳酸鈣、磷酸氫鈣和甘氨酸；崩解劑，諸如淀粉(優(yōu)選地玉米、馬鈴薯或木薯淀粉)、羥基乙酸淀粉鈉、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉和某些復合硅酸鹽；制粒粘結劑，諸如聚乙烯吡咯烷酮、羥丙基甲基纖維素(hpmc)、羥丙基纖維素(hpc)、蔗糖、明膠和阿拉伯樹膠；潤滑劑，諸如硬脂酸鎂、硬脂酸、甘油基二十二烷酸酯和滑石可包括在內。用于制備這些形式的營養(yǎng)上可接受的載體的示例包括(例如)水、鹽溶液、醇、有機硅(silicone)、蠟、石油凝膠、植物油、聚乙二醇、丙二醇、脂質體、糖、明膠、乳糖、直鏈淀粉、硬脂酸鎂、滑石、表面活性劑、硅酸、粘性石蠟、香料油、脂肪酸甘油單酯和脂肪酸甘油二酯、石油醚(petroethral)脂肪酸酯、羥甲基-纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等等。用于這些形式的優(yōu)選賦形劑包括乳糖(lactose)、淀粉、纖維素、乳糖(milksugar)或高分子量聚乙二醇。對于水性混懸劑和/或酏劑而言，可將本發(fā)明的組合物與各種甜味劑或調味劑、著色物質或染料、與乳化劑和/或助懸劑以及與稀釋劑(諸如水、丙二醇和甘油)以及它們的組合進行組合。包裝在一個實施方案中，可包裝根據本發(fā)明的三肽基肽酶和/或內切蛋白酶。在一個優(yōu)選的實施方案中，將三肽基肽酶和/或內切蛋白酶包裝于袋(諸如紙袋)中。在一個另選的實施方案中，可將三肽基肽酶和/或內切蛋白酶密封于容器中?？墒褂萌魏魏线m的容器。優(yōu)點本文的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，三肽基肽酶可切割存在于原料中的蛋白質和/或肽底物以釋放三肽，令人驚奇地發(fā)現(xiàn)這例如在生物乙醇生產期間增加醇的產量。在另一個實施方案中，使用三肽基肽酶可有利地提高產醇宿主在醇生產期間的發(fā)酵能力。不受理論的束縛，據信本發(fā)明的三肽基肽酶可使存在于原料或其級分中的三肽的濃度增大，所述三肽可為產醇宿主的良好的氨基酸源和/或能量和/或營養(yǎng)源。因此，本發(fā)明的優(yōu)點在于其可改善產醇宿主的總體健康狀態(tài)。有利地，使用本發(fā)明的三肽基肽酶可降低需要向原料添加的脲的量。本發(fā)明的一個優(yōu)點在于，在醇(例如，生物燃料)生產中使用本發(fā)明的三肽基肽酶可由該過程產生改善的副產物，諸如濕餅、干酒糟(ddg)或含可溶物干酒糟(ddgs)。因此，本發(fā)明的一個優(yōu)點在于，因為濕餅、ddg和ddgs是生物燃料(例如，生物乙醇)生產的副產物，所以本發(fā)明的用途可導致這些副產物的質量提高。具體地，副產物可富含蛋白質。在一個具體實施方案中，(副)產物可富含三肽，例如富脯氨酸三肽。有利地，在本發(fā)明中使用的所教導的三肽基肽酶能夠對寬泛范圍的肽和/或蛋白質底物起作用，并且由于具有此類廣泛的底物特異性不易于阻止切割富含某些氨基酸(例如，脯氨酸和/或賴氨酸和/或精氨酸和/或甘氨酸)的底物。使用此類三肽基肽酶(例如，耐脯氨酸三肽基肽酶)因而可有效和/或快速地降解原料中的蛋白質底物并產生三肽。優(yōu)選地，三肽基肽酶可對在p1位置處具有賴氨酸、精氨酸或甘氨酸中的一者或多者的肽和/或蛋白質具有較高的活性。不受理論的束縛，通常就多種三肽基肽酶和/或蛋白酶而言，在p1位置處包含這些氨基酸的肽和/或蛋白質底物可能難以消化，并且在遇到此類殘基時，三肽基肽酶和/或蛋白酶對肽和/或蛋白質底物的切割可停止或減慢。有利地，利用本發(fā)明的三肽基肽酶，可以有效地消化在p1處包含賴氨酸、精氨酸和/或甘氨酸的蛋白質和/或肽底物和/或不顯著減慢切割反應，這導致更有效地消化原料中的底物和/或更有效地生成三肽。本發(fā)明還提供了耐脯氨酸三肽基肽酶的用途，所述耐脯氨酸三肽基肽酶除具有上述活性之外，還可耐受位置p2、p2’、p3和p3’處的脯氨酸。這是有利的，因為其允許有效地切割具有脯氨酸區(qū)段的肽和/或蛋白質底物并允許切割寬泛范圍的肽和/或蛋白質底物，這導致更有效地消化原料。有利地，三肽基肽酶可對在p1位置處具有賴氨酸的肽和/或蛋白質具有優(yōu)先活性，這允許有效地切割賴氨酸含量較高的底物，諸如乳清蛋白。本發(fā)明還提供了熱穩(wěn)定的三肽基肽酶，該熱穩(wěn)定的三肽基肽酶在與非熱穩(wěn)定變體相比時不易于變性和/或因此將在較長時間段內保持活性。有利地，耐脯氨酸三肽基肽酶可在約ph7的ph范圍內具有活性，因而可與堿性內切蛋白酶一起使用。這意指在酶處理之間不必改變用于產生水解產物的包含蛋白質和/或肽底物的反應培養(yǎng)基的ph。換句話講，其允許三肽基肽酶和內切蛋白酶同時添加到反應中(例如，在本發(fā)明的方法和/或用途期間)，這可使得該過程更快和/或更有效和/或更節(jié)約成本。此外，這允許更有效的反應，因為在較低的ph值下，底物可從溶液中沉淀出來并因此未被切割。在酸性ph下具有活性的三肽基肽酶可與酸性內切蛋白酶組合使用，并且有利地不需要在酶處理之間改變反應培養(yǎng)基的ph。有利地，將內切蛋白酶與三肽基肽酶組合使用可增大底物切割的效率。不受理論的束縛，據信內切蛋白酶能夠在遠離c-末端或n-末端的多個區(qū)切割肽和/或蛋白質底物，從而產生三肽基肽酶的更多個n-末端以用作底物，由此有利地增大反應效率和/或縮短反應時間。使用內切蛋白酶、三肽基肽酶和另外的組分，例如羧肽酶和/或氨肽酶具有許多優(yōu)點：·其允許有效地產生能被產醇宿主有效吸收(例如，因為對攝入有更佳的滲透勢)的單個氨基酸和/或二肽和/或三肽；·蛋白質和/或肽底物可更有效和/或更快速地消化；·具體地，在體外使用時，諸如在通過使三肽消化為單個氨基酸和/或二肽來制造水解產物中，降低耐脯氨酸三肽基肽酶的終點抑制(即，被其反應產物抑制)；和/或·對包含高含量的脯氨酸、賴氨酸、精氨酸和/或甘氨酸的底物具有協(xié)同和/或加成活性。令人驚奇地，可通過實施本發(fā)明的方法和/或用途獲得的ddgs可具有改善的味道。有利地，因此可通過本發(fā)明獲得的ddgs對于用ddgs喂養(yǎng)的受試者(例如，動物)更為美味。其它定義除非另有定義，否則本文所用的所有技術和科學術語都具有本公開所屬領域的普通技術人員通常理解的含義。singleton等人，dictionaryofmicrobiologyandmolecularbiology(《微生物學和分子生物學詞典》)，第20版，紐約約翰威立國際出版公司(johnwileyandsons,newyork)(1994)，以及hale和marham，theharpercollinsdictionaryofbiology,harperperennial,ny(1991)為本領域技術人員提供關于本公開中所用的多個術語的一般性詞典。本公開并不受本文公開的示例性方法和材料的限制，并且任何與本文所述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料都可用于本公開的實施方案的實施或測試。數值范圍包括定義該范圍的數字。除非另外指明，否則分別是，任何核酸序列從左至右以5'至3'取向寫出；氨基酸序列從左至右以氨基至羧基取向寫出。本文提供的標題并非是對本公開的各個方面或實施方案的限制，這些方面或實施方案可通過將說明書作為一個整體來參考而得到。相應地，下面就要定義的術語通過將說明書作為一個整體來參考會得到更完全的定義。氨基酸在本文中用氨基酸名稱、三字母縮寫或單字母縮寫來指代。如本文所用，術語“蛋白質”包括蛋白質、多肽和肽。如本文所用，術語“氨基酸序列”與術語“多肽”和/或術語“蛋白質”同義。在一些情況中，術語“氨基酸序列”與術語“肽”同義。在一些情況中，術語“氨基酸序列”與術語“酶”同義。術語“蛋白質”和“多肽”在本文中可互換使用。在本公開和權利要求書中，可使用氨基酸殘基的常規(guī)一字母和三字母代碼。氨基酸的3字母代碼遵照iupaciub生物化學命名聯(lián)合委員會(jointcommissiononbiochemicalnomenclature,jcbn)的定義。還應理解，由于遺傳密碼的簡并性，多肽可由不止一種核苷酸序列編碼。術語的其它定義可在整個本說明書中出現(xiàn)。在更詳細地描述示例性的實施方案之前，應理解本公開并不限于所描述的具體實施方案，因為這些實施方案當然是可變的。還應理解，本文所用的術語僅出于描述具體的實施方案的目的，并不意在具有限制意義，因為本公開的范圍將僅受所附權利要求的限定。在提供數值范圍的情況中，應理解，該范圍的上限和下限之間的每個中間數值(至下限的個位的十分之一，除非上下文另有清楚規(guī)定)也被具體公開。規(guī)定的范圍中的任何規(guī)定值或中間值與該規(guī)定的范圍中的任何其它規(guī)定值或中間值之間的每個較小范圍，被涵蓋在本公開內。這些較小范圍的上限和下限可獨立地被包括或排除在該范圍中，而且其中任一個、沒有一個或兩個界限被包括在較小范圍中的每個范圍也被涵蓋在本公開中，但依據該規(guī)定的范圍中的任何被具體排除的界限而定。在規(guī)定的范圍包括界限中的一個或兩個的情況中，排除這些被包括的界限中的任一個或兩個的范圍，也被包括在本公開中。必須指出，如本文和所附權利要求書中所用，單數形式的“一個”、“一種”和“所述”包括復數指代，除非上下文另有清楚規(guī)定。因此，例如，提到“三肽基肽酶”、“內切蛋白酶”或“酶”則包括多個此類候選物質，而提到“原料”則包括提到一種或多種原料以及本領域技術人員知道的它們的等同物，以此類推。本文論述的出版物只是為了它們在本申請的提交日之前的公開內容而提供。本文的任何內容都不能被解釋為承認這些出版物構成本文所附權利要求的現(xiàn)有技術。現(xiàn)在參考以下附圖和實施例，僅以舉例的方式描述本發(fā)明。實施例實施例1主題：玉米乙醇發(fā)酵——使用三肽基肽酶(3pp)增大發(fā)酵速率和總乙醇水平目的：為了鑒定該酶與已存在于葡糖淀粉酶產物中的蛋白酶的發(fā)酵有益效果。介紹：從里氏木霉分離三肽基肽酶(3pp)。在玉米乙醇發(fā)酵中，該肽酶具有作為添加劑的較高潛能，以三肽形式作為酵母的氮供應者。當該酶單獨投配和與蛋白酶(天冬氨酸蛋白酶家族的酸性真菌內切蛋白酶)一起投配時示出發(fā)酵速率增大。材料：液化物：bigriverdyersville(5/04/2012)酵母：redstar，ethanolred脲：jtbaker，usp等級，批號a23338表1：該實驗中使用的酶實驗：使液化物在60℃水浴中解凍，然后將每者所需的量稱重到燒杯中。添加固體脲以產生600ppm的最終濃度。用6nh2so4將ph調節(jié)至4.5，然后在通過水分天平測定干固體(ds)％后采集0時間點，一式三份。稱取酵母以產生0.1％總質量的最終濃度，并且將其干投擲到液化物中，之后進行充分混合。接著，將100g量的液化物分配到250ml廣口錐形瓶中，每個待測試條件一式三份。如表2所示投配酶。表1顯示的三肽基肽酶的活性單位數利用以下計算：在96孔微量滴定板的孔中，使150ul的1mmh-ala-ala-phe-pna(對-硝基苯胺衍生的底物)的0.1mnaoac(ph4.5)溶液與各種量的酶稀釋液混合以符合測定的線性范圍。在室溫(25℃)下，動力學上跟蹤410nm處的吸光度。1u被定義為每分鐘釋放1微摩爾pna的酶的量。410處的pna摩爾吸附假設為8800。表2：用于600ppm脲發(fā)酵的燒瓶條件和酶劑量表2：里氏木霉葡糖淀粉酶(ga)和白曲霉α淀粉酶(akaa)分別以0.325gau/gds和1.95ssu/gds投配。兩種蛋白酶均以0.02u/gds投配。將燒瓶用單穿孔的8號尺寸橡膠塞塞住并置于150rpm和32℃的1”軌道搖動器中。在指示的時間點一式三份收集約2ml的發(fā)酵樣品，以16,000xg旋轉沉淀固體3分鐘備用。樣品收集物由收集的500μl上清液組成，用50μl的1nh2so4使酶失活5分鐘，用dih2o1:10稀釋并通過13mm直徑、0.45μm孔徑的尼龍過濾器。就與以下競爭對手的產品的比較而言，在與3pp實驗相同的時間完成這些采樣差異，但并非直接相關。通過上述常規(guī)方法采集顯示的全部數據。允許留下兩種方法并非是錯誤的，但其可能被混淆(其還可能屬于本領域的技術人員的基礎知識)。在以下條件下，通過hplc分析所收集的樣品：制備液化物并如上所述進行分配，不同的是僅添加200ppm的脲。酶如表3所述投配。表3：用于200ppm脲發(fā)酵的燒瓶條件和酶劑量表3：酶以與600ppm脲發(fā)酵相同的水平投配。溫育燒瓶并收集樣品，并且如上所述進行分析。圖1示出200ppm脲下在對照與樣品發(fā)酵之間有更好的突破。肽酶自身提供了一些益處，但在兩倍劑量時并未增大。然而，當與組合時，觀察到速率和最終水平大大提高。同樣，圖2示出2x三肽基肽酶僅產生少量增大，而兩種酶的混合物卻產生與雙倍劑量相當的增大速率。發(fā)酵中酵母健康狀態(tài)(即，酵母的發(fā)酵能力)的另一表現(xiàn)為葡萄糖消耗的速率(圖3)。肽酶示出相對于對照的改善，這并不在較高劑量下改變。有利于比肽酶攝入更多的葡萄糖并且示出特征劑量響應。兩者的混合物與雙劑量的幾乎相同。實施例2主題：玉米乙醇發(fā)酵——三肽基肽酶和蛋白酶a的效果目的：就新的生成三肽的肽酶有益于釀酒酵母在玉米乙醇發(fā)酵中的能力的應用而言，需要對該肽酶進行分析。結論：·新肽酶自身和與協(xié)同下兩者均在發(fā)酵中有效地提高乙醇水平?！な褂帽景l(fā)明的三肽基肽酶時的乙醇收率比在使用蛋白酶a(蛋白酶(來源于擬諾卡氏菌并且其為絲氨酸蛋白，具有內切蛋白酶和外肽酶活性兩者)商購自novozymesa/s)時所見的乙醇收率高得多?！ぎ惡鯇こ５?，在hplc分析的中范圍時間點以及顯著的等待時間處的高水平較小糖可表明，使發(fā)酵樣品中酶失活的簡單酸殺滅步驟可能是不夠的。介紹：從里氏木霉分離三肽基肽酶(tripeptidogenicpeptidase)即sedolisin3pp并將其與酸性真菌蛋白酶一起測試。在玉米乙醇發(fā)酵中，該肽酶具有作為添加劑的較高潛能，以三肽形式作為酵母的氮供應者。在該實施例中，采用三肽基肽酶、和fan(芽孢桿菌屬產生的堿性蛋白酶)單獨發(fā)酵以及一起發(fā)酵。材料：液化物：lincolnwayenergy酵母：redstar，ethanolred脲：jtbaker，usp等級，批號a23338表4：該實驗中使用的酶實驗：使得自lincolnwayenergy的液化物在60℃水浴中解凍，然后將各個實驗所需的量稱重到燒杯中。添加固體脲以產生400ppm的最終濃度。用6nh2so4將ph調節(jié)至4.5，然后通過水分天平測定ds％。稱取酵母以產生0.1％總質量的最終濃度，并且將其干投擲到液化物中，之后進行充分混合。接著，將100g量的液化物分配到250ml廣口錐形瓶中，每個待測試條件一式三份。酶如表5所示投配。表5：用于400ppm脲發(fā)酵的燒瓶條件和酶劑量表5：ssf以0.325gau/gds投配；excel以0.058％wt/wt原樣玉米投配。肽酶以0.02u/gds投配；fan和蛋白酶a以0.1kg/mtds投配。將燒瓶用單穿孔的8號尺寸橡膠塞塞住并置于150rpm和32℃的1”軌道搖動器中。在指示的時間點收集約2ml的發(fā)酵樣品，以16,000xg旋轉沉淀固體3分鐘備用，收集500μl的上清液，用50μl的1nh2so4使酶失活5分鐘，用dih2o1:10稀釋并通過13mm直徑、0.45μm孔徑的尼龍過濾器。在以下條件下，通過hplc分析所收集的樣品：圖4：在三肽基肽酶產生比對照更高水平的乙醇的情況下；唯一無任何蛋白酶、excel(包含葡糖淀粉酶或葡糖淀粉酶/淀粉酶組合的產品)的樣品沒有達到16體積％乙醇并且在發(fā)酵結束時升高了葡萄糖水平。這可能指出，在僅400ppm脲下，酵母細胞缺氮。400ppm被選擇成使得發(fā)酵將結束，但仍可觀察到來自于所添加蛋白酶的益處；然而，在未添加蛋白酶時發(fā)酵沒有結束，因此該數目需要增大至600ppm的標準劑量。圖5：易于觀察到添加三肽基肽酶的益處。令人感興趣地，fan示出乙醇的產量增大。當將兩者添加至已在ssf(購自dupontindustrialbiosciences——以前為genencor)中的時，觀察到速率增大。另一實驗的液化物被制備為第一種，不同的是添加脲至600ppm的最終濃度。另外，采集2ml剩余的液化物的樣品，一式三份，作為0時間點。酶如表6所示投配。表6：用于600ppm脲發(fā)酵的條件和酶劑量表6：葡糖淀粉酶如表2所述投配，akaa以1.95ssu/gds投配。和三肽基肽酶以0.02sapu/gds投配，并且fan和蛋白酶a以0.25kg/mtds投配。圖6：和新三肽基肽酶兩者均在發(fā)酵中生成更高的乙醇水平，并且當將兩者一起添加時觀察到加合效應。圖7：對于該液化物的％ds，總葡萄糖釋放約高1％。圖8：葡萄糖和dp2水平示出在這些特定發(fā)酵中的一些不常見的趨勢。葡萄糖高于慣常的大部分發(fā)酵，并且當運行蛋白酶a試驗時，在16小時與24小時的時間點之間觀察到水平增大。在24小時還觀察到此種葡萄糖增大伴隨著dp2降低。由于上樣到hplc系統(tǒng)5，給定樣品采集之間的時間量并分析，據信這可表明酸殺滅步驟不足以完全使葡糖淀粉酶；尤其是excel中的那些失活。實施例3材料：液化物：bigriverdyersville(5/04/2012)酵母：redstar，ethanolred脲：jtbaker，usp等級，批號a23338表7：該實驗中使用的酶實驗：使全玉米粉液化物在60℃水浴中解凍，然后將每者所需的量稱重到燒杯中。添加固體脲以產生600ppm的最終濃度。用6nh2so4將ph調節(jié)至4.5，并且在通過水分天平測定ds％后采集0時間點，一式三份。稱取酵母以產生0.1％總質量的最終濃度，并且將其干投擲到液化物中，之后進行充分混合。接著，將100g量的液化物分配到250ml廣口錐形瓶中，每個待測試條件一式三份。酶如表8所示投配。表8：用于600ppm脲發(fā)酵的燒瓶條件和酶劑量表8：里氏木霉葡糖淀粉酶和akaa分別以0.325gau/gds和1.95ssu/gds投配。兩種蛋白酶均以0.02u/gds投配。將燒瓶用單穿孔的8號尺寸橡膠塞塞住并置于150rpm和32℃的1”軌道搖動器中。在指示的時間點一式三份收集約2ml的發(fā)酵樣品，以16,000xg旋轉沉淀固體3分鐘備用。將600μl的上清液收集到1.5ml的螺旋蓋微量離心管中，添加60μl的1nh2so4，在99℃加熱器中將管煮五分鐘而無需搖動。然后冷卻樣品并用dih2o1:10稀釋，接著通過13mm直徑、0.2μm孔徑的尼龍過濾器。在以下條件下，通過hplc分析所收集的樣品：圖9：對于3pp肽酶的乙醇收率的益處看起來是加合的；因為+三肽基肽酶樣品的乙醇濃度增大類似于和三肽基肽酶(分別為1.959％和2.288％)的單獨益處。圖10：當將肽酶與組合時，觀察到速率類似于雙劑量的速率。雙劑量肽酶改善了發(fā)酵速率，但是沒有含的樣品那樣多。然而，雙劑量的肽酶并未導致最終乙醇水平類似于含的樣品。結論：該肽酶確實提供類似于所觀察的當前酸性真菌蛋白酶的益處的發(fā)酵乙醇水平的益處。實施例4三肽基肽酶在里氏木霉中的克隆和表達除作為基因序列生成的tri079(seqidno.57)和tri083(seqidno.56)之外，使用優(yōu)選的密碼子生成編碼耐脯氨酸三肽基肽酶的合成基因以在里氏木霉中進行表達。預測的分泌信號序列(signalp4.0:discriminatingsignalpeptidesfromtransmembraneregions.thomasnordahlpetersen,brunak,gunnarvonheijne&henriknielsen.naturemethods，8:785-786，2011)(除tri079和tri083之外)用來自于里氏木霉酸性真菌蛋白酶(afp)的分泌信號序列和來自于里氏木霉葡糖淀粉酶基因(trga1)的內含子替換(參見圖12下部圖)。使用lrclonasetm酶混合物(lifetechnologies)將合成基因引入目的載體pttt-pyrg13(如us8592194b2中所述，其教導以引用方式并入本文)中，從而導致本文的耐脯氨酸三肽基肽酶的表達載體pttt-pyrg13的構建。編碼seqidno1、2和29的表達載體示于圖11中，并且編碼seqidno12和39的表達載體示于圖12中。利用peg介導的原生質體轉化將5-10μg的表達載體各自轉化到合適的里氏木霉菌株中，實質上如(us8592194b2)所述。通過離心來收獲發(fā)芽孢子，洗滌并用45mg/ml的裂解酶溶液(哈茨木霉(trichodermaharzianum)，sigmal1412)處理以裂解真菌細胞壁。通過標準方法對原生質體進行進一步制備，如等人[gene61(1987)155-164]所述，其內容以引用方式并入本文。用0.85％nacl、0.015％tween80的溶液收獲孢子。使用孢子懸浮液來接種液體培養(yǎng)物。在180rpm振蕩下使培養(yǎng)物在28℃和80％濕度下生長7天。培養(yǎng)上清液通過真空過濾收獲并用于測量表達和酶性能。三肽基肽酶的純化在經20mm乙酸鈉，ph4.5(緩沖液a)平衡的pd10柱(gelifesciences，usa)上對樣品進行脫鹽。對sources15hr25/5(gelifesciences，usa)上的離子交換色譜而言，用緩沖液a對柱進行平衡。將經脫鹽的樣品(7ml)以6ml/min的流速施加到柱上并用緩沖液a洗滌柱。結合的蛋白用線性梯度為0-0.35m的nacl的20mm乙酸鈉(ph4.5)溶液洗脫(35min)。在整個運行期間，收集10ml級分。根據本文教導的測定(例如，ebsa測定)，分析所收集樣品的三肽基肽酶活性?；?80nm處的吸光度測量和使用expasyprotparam工具(http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam)計算的蛋白質理論吸光度計算蛋白質濃度。實施例53pp肽酶對乳酸發(fā)酵的影響凝結芽孢桿菌(bacilluscoagulans)為可在高達55℃的溫度下生長的強乳酸生產菌。在該研究中，對于乳酸(la)同時糖化和發(fā)酵(ssf)過程，在液化期間使用另外的3pp肽酶連同spezymealpha，以查看另外的肽酶是否可將更多的玉米蛋白質水解成作為氮源的氨基酸，并且產生更多的la。材料和方法凝結芽孢桿菌cicc20138可獲自chinacenterofindustrialculturecollection。spezymealpha：7201870341，14264aau/g，2014.09.05。trga濃度：805tgau/g，批號7202033738.3pp肽酶cedar2014-11-03液化條件在表9中示出。將15％ds玉米調節(jié)至ph5.7。一種樣品僅包含0.3kg/mtspezymealpha，作為對照；另兩種包含0.3kg/mtalpha和0.1kg/mt或0.5kg/mt的3pp肽酶。使所有樣品在65℃下以350rpm溫育30min，然后在87℃下以350rpm保持90min。在液化后，將液化物離心并過濾。種子培養(yǎng)基(每升)包含蛋白胨10.0g、酵母提取物5.0g、nacl5.0g和葡萄糖5.0g(ph6.0)。將培養(yǎng)基在121℃下滅菌20min。將種子在50℃下以130rpm培養(yǎng)約18小時。1l發(fā)酵罐的發(fā)酵培養(yǎng)基包含500g玉米液化物、50ml菌株種子。同時糖化和發(fā)酵(ssf)在如下條件進行：50℃，300rpm旋轉速度，經20％(m/v)nh4oh自動調節(jié)的ph6.5。添加0.75tgau/gdstrga，然后添加50ml種子開始發(fā)酵。使攪拌維持于300rpm，并且用20％(m/v)nh4oh使ph恒定保持于6.5。取樣進行hplc分析。表9：液化條件預處理液化1,65℃，30min，alpha@0.3kg/mt87℃，90min265℃，30min，alpha@0.3kg/mt+phytase@0.1kg/mt87℃，90min365℃，30min，alpha@0.3kg/mt+phytase@0.1kg/mt87℃，90min表10：發(fā)酵條件結果相比于對照，在玉米液化之前用3pp肽酶預處理導致：1)玉米液化物過濾速度更高，玉米粉餅中的殘余淀粉更少；2)lassf過程期間的乳酸產量更高并且殘余葡萄糖更少。顯而易見的是0.1kg/tds的劑量足以進行預處理。因為對于lassf并不存在外部的蛋白質營養(yǎng)，并且葡萄糖沒有在70小時完全被消耗，似乎肽酶添加物將一些玉米蛋白水解成氨基酸，原因是氮增大發(fā)酵速率并產生更高的la收率和更少的殘余葡萄糖。表11：液化性能表12：發(fā)酵性能表13：乳酸收率實施例63pp肽酶對檸檬酸發(fā)酵的影響材料和方法：制備ds＝20％的玉米面漿液?；诟晌镔|，添加0.2kg/tds的3pp肽酶并在60℃下溫育40min。對照測試在相同的條件下進行但無3pp肽酶。添加0.3kg/tds的spezymealpha，然后在90c下進行1.5小時液化。將漿液離心并將上清液用作發(fā)酵培養(yǎng)基。將培養(yǎng)基在115c下滅菌15min并且然后冷卻。使黑曲霉菌株在馬鈴薯右旋糖瓊脂(pda)斜面上于35℃生長5-7d，然后用無菌水洗滌孢子，將孢子懸浮液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中并在35℃下以300rpm/min溫育96小時。在發(fā)酵結束時取樣。使發(fā)酵液過濾通過濾紙，并且使用培養(yǎng)物濾出物進行分析。通過hplc分析檸檬酸濃度和dp1、dp2、dp3、dp4+濃度。結果：表14數據示出，在預處理過程中添加3pp肽酶，最終檸檬酸收率顯著增大，同時殘余的糖顯著減少。在液化和離心之后，我們發(fā)現(xiàn)上清液相比于對照更為澄清，其可在工業(yè)生產中導致更好的過濾性能。在發(fā)酵結束時，我們還發(fā)現(xiàn)粘度大幅度降低，這可改善下游工藝。上面說明書中提及的所有出版物以引用的方式并入本文。對本領域的技術人員將顯而易見的是，可在不脫離本發(fā)明的范圍和實質的情況下對所描述的本發(fā)明的方法和系統(tǒng)作出多種修改和變型。盡管本發(fā)明已結合特定的優(yōu)選實施方案進行了說明，但應該理解受權利要求書保護的本發(fā)明不應該不當地受限于這些特定的實施方案。實際上，對生物化學和生物技術或相關領域的技術人員明顯的用于執(zhí)行本發(fā)明的所述模式的多種修改旨在處于如下權利要求書的范圍內。當前第1頁12