本發(fā)明涉及用于昆蟲的條件致死性表達(dá)系統(tǒng)、它們的用途、以及采用以其轉(zhuǎn)化的昆蟲進(jìn)行種群控制的方法。

背景技術(shù)：

在野外控制昆蟲種群的重要方法涉及輻射不育昆蟲技術(shù)(sit)，其用作環(huán)境友好的昆蟲控制方法，包括大量飼養(yǎng)蠅并通過輻射讓雄性不育。但是，與其它的控制方法相比時，sit并非在所有區(qū)域都是有效或者經(jīng)濟上可行的，并且該輻射sit計劃的成功依賴于經(jīng)輻射的蠅與雄性的野外種群具有類似的行為模式。這種sit方法的更多限制為在蛹期分離雄性和雌性。所希望的是僅釋放雄性昆蟲，因為釋放雌性昆蟲可能在釋放區(qū)域?qū)е赂蟮淖魑飺p失。尤其是，該分離涉及勞動密集的和耗時的昆蟲手工分選。

備選的方法曾是引入溫度敏感致死(tsl)定性品系，借此地中海實蠅中自發(fā)突變的染色體易位使得能進(jìn)行溫度敏感的分離(caceres2002)；這種經(jīng)轉(zhuǎn)化的種系在除去雌性方面是99％有效(mumford2012)。但是，已證實tsl品系高度不穩(wěn)定，并由此在大量飼養(yǎng)的設(shè)施中需要費力的和昂貴的濾器聚居地設(shè)置(expensivefiltercolonyset-up)(caceres2002)。

另外的控制方法是使用引入昆蟲基因組中的可阻遏、顯性、致死基因系統(tǒng)。對這種方法的進(jìn)一步改進(jìn)曾是使用雌性特異的可阻遏、顯性、致死基因系統(tǒng)。這些系統(tǒng)提供了不存在阻遏物時致死基因產(chǎn)物的雌性特異性表達(dá)。開發(fā)了兩組分系統(tǒng)，其中反式激活因子基因產(chǎn)物通過激活致死基因的啟動子用作致死基因的反式激活因子。通過提供阻止反式激活因子基因產(chǎn)物對致死基因的啟動子的作用的阻遏物，該系統(tǒng)是可阻遏的。

在這種雌性特異的、可阻遏、顯性、致死基因系統(tǒng)的后來發(fā)展中，提供待表達(dá)的單個基因，該基因產(chǎn)物既為該基因的反式激活因子，也為致死基因產(chǎn)物，由此產(chǎn)生了導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因昆蟲死亡的正反饋回路。

gong等公開了帶有四環(huán)素反式激活因子(tta)的地中海實蠅品系，其在雜合后代的早期發(fā)育階段導(dǎo)致致死性，但對親本轉(zhuǎn)基因昆蟲的存活幾乎無影響。在該系統(tǒng)中，tta即是反式激活因子，也是致死的，由于高水平的tta被認(rèn)為是對細(xì)胞有害的。實際上，tta經(jīng)修飾以優(yōu)化在昆蟲中的表達(dá)，這種變體稱為ttav。但是，該文獻(xiàn)公開了一些昆蟲逃脫了ttav的致死效應(yīng)，并且對該致死效應(yīng)分子的生化抗性的可能性可能為該系統(tǒng)的缺點。其還公開了發(fā)育中的更早致死性是優(yōu)選的。

fu等公開了采用tta和cctra的地中海實蠅(c.capitata)中雌性特異的自殺基因系統(tǒng)。插入tta的cctra導(dǎo)致tta轉(zhuǎn)錄本在雄性剪接變體中的中斷，但在雌性剪接變體中不中斷(圖1)。此前，曾缺乏對能夠在早期發(fā)育階段賦予雌性特異表達(dá)的基因表達(dá)系統(tǒng)的表征。fu等的該系統(tǒng)提供了這種在早期發(fā)育階段的雌性特異表達(dá)。在gong等的正反饋回路中該cctra雌性特異內(nèi)含子插入該ttav編碼區(qū)，這提供了雌性特異的致死性。

但是，fu等獲得的數(shù)據(jù)表明，致死性發(fā)生在發(fā)育的晚幼蟲期/早蛹期，并且大部分的昆蟲種系不是100％外顯的。fu等還公開了該系統(tǒng)的潛在困難為響應(yīng)容量的飽和。調(diào)節(jié)可變剪接的因子被認(rèn)為是相對短缺的，所以如果產(chǎn)生了太多的前體mrna，則可變剪接途徑可能飽和。為了雌性特異的正反饋系統(tǒng)為致死性的，必須產(chǎn)生大量的ttav，所以需要高水平的f1型(雌性類型的)剪接。另一問題是低效率，由于相當(dāng)比例的前體mrna在雌性中以雄性形式(m1和m2)加工；這些不產(chǎn)生功能性蛋白，所以相對于非性別特異構(gòu)建體趨于減弱致死性。

因此，希望提供改進(jìn)的雌性特異的、可阻遏、顯性、致死基因系統(tǒng)，比之前看到的更早的發(fā)育中致死效應(yīng)發(fā)作，優(yōu)選具有改進(jìn)的外顯率，并優(yōu)選具有減弱的生化抗性。另外期望的改進(jìn)為一旦該系統(tǒng)插入宿主基因組后增加的穩(wěn)定性。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

令人驚訝的是，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)通過提供具有兩個雌性特異的、可阻遏、顯性、致死表達(dá)系統(tǒng)，改進(jìn)了這種轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)的外顯率。提供兩個這樣的表達(dá)系統(tǒng)令人驚訝地除了降低出現(xiàn)對致死產(chǎn)物的生化抗性的風(fēng)險，還具有誘導(dǎo)更早致死性發(fā)作的更多優(yōu)點。

因此，在第一方面，提供了包括第一和第二基因表達(dá)系統(tǒng)的多核苷酸序列，其中：

i)所述第一基因表達(dá)系統(tǒng)包括組分：可操作地連接至第一啟動子的第一顯性致死基因、編碼第一轉(zhuǎn)錄激活因子的基因、以及第一剪接控制序列，

ii)所述第二基因表達(dá)系統(tǒng)包括組分：可操作地連接至第二啟動子的第二顯性致死基因、編碼第二轉(zhuǎn)錄激活因子的基因、以及第二剪接控制序列，

其中

所述轉(zhuǎn)錄激活因子中的每一個能夠激活至少一個所述啟動子，條件是當(dāng)兩個所述轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)時兩個所述啟動子都被激活，

所述第一和第二剪接控制序列中的每一個通過可變剪接分別介導(dǎo)所述第一和第二顯性致死基因的雌性特異表達(dá)，

所述第一和第二轉(zhuǎn)錄激活因子中每一個的反式激活活性分別被第一和第二外源控制因子阻遏，其中所述第一外源控制因子與所述第二外源控制因子相同或不同，以及

所述第一基因表達(dá)系統(tǒng)中的所述組分的每一個與所述第二基因表達(dá)系統(tǒng)的所述組分相同或不同。

本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)能夠在昆蟲中表達(dá)，優(yōu)選至少在雙翅類、鞘翅類和/或鱗翅類中表達(dá)。

本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)選每個包括經(jīng)選擇的用于在昆蟲中表達(dá)的啟動子，優(yōu)選至少在雙翅類、鞘翅類和/或鱗翅類中表達(dá)。該啟動子可以為昆蟲啟動子，或者在目標(biāo)昆蟲的至少一個組織中可運轉(zhuǎn)的啟動子。

兩個或更多個條件性、顯性、致死基因表達(dá)系統(tǒng)已顯示出在昆蟲中提供高水平的外顯率。與單個昆蟲條件性、顯性、致死基因表達(dá)系統(tǒng)相比，通常在發(fā)育的較早期誘導(dǎo)致死性，并且降低了生化抗性風(fēng)險。本發(fā)明可用于控制昆蟲種群。

兩個系統(tǒng)中的每個包括待表達(dá)的顯性致死基因和激活該致死基因的表達(dá)的轉(zhuǎn)錄激活因子。該轉(zhuǎn)錄激活因子的作用可被阻遏，并且當(dāng)以足夠量表達(dá)時該顯性致死基因的產(chǎn)物對昆蟲具有致死效應(yīng)。每個表達(dá)系統(tǒng)也包括剪接控制序列，其提供該致死效應(yīng)的雌性特異性。兩個雌性特異的、可阻遏、顯性、致死表達(dá)系統(tǒng)的存在通過增加所表達(dá)的致死產(chǎn)物的量改進(jìn)了系統(tǒng)的外顯率，由此增加了有效致死性的概率。由于致死產(chǎn)物的積累，兩個表達(dá)系統(tǒng)的存在也在發(fā)育期間誘導(dǎo)了更早的致死性發(fā)作，并且因為出現(xiàn)對兩個表達(dá)系統(tǒng)的抗性的概率低，降低了抗性機制風(fēng)險。

用在本文時，術(shù)語“外顯率”指帶有特定基因變體的個體也表達(dá)與該變體相關(guān)的表型特征的比例。因此，與本發(fā)明相關(guān)的“外顯率”指經(jīng)轉(zhuǎn)化的生物體表達(dá)該致死表型的比例。

用在本文時，術(shù)語“構(gòu)建體”指用于插入宿主生物體的人工構(gòu)建的dna節(jié)段，用于在遺傳上修飾該宿主生物體。構(gòu)建體的至少一部分插入宿主生物體的基因組，并改變該宿主生物體的基因型。該構(gòu)建體可以形成為載體的一部分，或者為載體。

用在本文時，術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”指待插入宿主生物體基因組以改變宿主生物體表型的包括第一和第二基因表達(dá)系統(tǒng)的多核苷酸序列。

用在本文時，術(shù)語“基因表達(dá)系統(tǒng)”指待表達(dá)基因連同所述待表達(dá)基因的表達(dá)所需的任何基因和dna序列。

用在本文時，術(shù)語“剪接控制序列”指與基因關(guān)聯(lián)的dna序列，其中該dna序列和剪接體一起介導(dǎo)所述基因的rna產(chǎn)物的可變剪接。優(yōu)選地，該剪接控制序列和剪接體一起介導(dǎo)該關(guān)聯(lián)基因的rna轉(zhuǎn)錄本的剪接，以產(chǎn)生編碼功能性蛋白的mrna，并介導(dǎo)所述rna轉(zhuǎn)錄本的可變剪接，以產(chǎn)生至少一種編碼非功能性蛋白的可變mrna。

用在本文時，術(shù)語“反式激活活性”指轉(zhuǎn)錄激活因子的活性，其導(dǎo)致增加的基因表達(dá)速率。該轉(zhuǎn)錄激活因子可以結(jié)合可操作地連接至所述基因的啟動子，由此激活該啟動子，于是增強所述基因的表達(dá)。作為選擇，該轉(zhuǎn)錄激活因子可以結(jié)合與所述啟動子關(guān)聯(lián)的增強子，由此通過所述增強子提升所述啟動子的活性。

用在本文時，術(shù)語“致死基因”指其表達(dá)產(chǎn)物在足夠量時對在其中表達(dá)該致死基因的生物體具有致死效應(yīng)的基因。

用在本文時，術(shù)語“致死效應(yīng)”指有害或致不育效應(yīng)，例如能夠殺死該生物體自身或其后代、或者能夠減弱或破壞其某些組織的效應(yīng)，其中生殖組織是特別優(yōu)選地，以使得該生物體或其后代是不育的。因此，諸如毒性的一些致死效應(yīng)將在相對于它們壽命的短時間框架內(nèi)殺死生物體或組織，而其它的可以簡單地減弱該生物體發(fā)揮功能的能力，例如生殖。

用在本文時，術(shù)語“ttav基因變體”指編碼功能性tta蛋白但是其在核苷酸序列方面有差異的多核苷酸。

用在本文時，術(shù)語“啟動子”指通常直接在編碼序列上游的dna序列，為基因的基礎(chǔ)和/或受調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄所需。具體地，啟動子具有讓轉(zhuǎn)錄起始的足夠信息，通常具有轉(zhuǎn)錄開始的起始位點和用于聚合酶復(fù)合物的結(jié)合位點。

用在本文時，術(shù)語“最小啟動子”指上文定義的啟動子，通常具有轉(zhuǎn)錄開始的起始位點和用于聚合酶復(fù)合物的結(jié)合位點，還通常具有足夠的額外序列以允許這二者有效。例如，諸如決定組織特異性的其它序列信息一般是缺乏的。

用在本文時，術(shù)語“外源控制因子”指不在宿主生物體內(nèi)自然存在并且不存在于宿主生物體的自然棲息地的物質(zhì)，或者不存在于宿主生物體自然棲息地的環(huán)境條件。該外源控制因子的存在由經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主生物體的操作者來控制，以便控制基因表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)。

用在本文時，術(shù)語“teto元件”指串聯(lián)排列的一個或多個teto操作單元。

用在本文時，術(shù)語例如“tetox7”指由所指出數(shù)量的teto操作單元組成的teto元件。因此，提到“tetox7”表示由7個teto操作單元組成的teto元件。類似地，提到“tetox14”表示由14個teto操作單元組成的teto元件，依此類推。

用在本文時，術(shù)語“tra內(nèi)含子”指剪接控制序列，其中rna轉(zhuǎn)錄本的可變剪接由例如單獨或聯(lián)合tra2(即當(dāng)復(fù)合時)與其結(jié)合的tra蛋白調(diào)節(jié)。

用在本文時，術(shù)語“最小重復(fù)序列”指觀察到的為給定轉(zhuǎn)座酶的活性所需的高度保守的重復(fù)序列。

當(dāng)提及具體的核苷酸或蛋白序列，應(yīng)理解這包括提及具有與其基本上等同的生物學(xué)活性的其任何突變體或變體。優(yōu)選地，該突變體或變體與參照序列具有至少85％、優(yōu)選至少90％、優(yōu)選至少95％、優(yōu)選至少99％、優(yōu)選至少99.9％以及最優(yōu)選至少99.99％的序列一致性。

附圖簡要說明

圖1(a)和(b)為雌性特異的致死性特征的示意圖。在四環(huán)素可阻遏的基因系統(tǒng)的tta組分中插入cctra雌性特異內(nèi)含子，使得僅雌性產(chǎn)生編碼功能性tta的mrna。(a)方框表示存在于雄性轉(zhuǎn)錄本中的含有終止密碼子的外顯子，產(chǎn)生截短的tra。(b)示意圖下面的箭頭表示用于rt-pcr分析的引物退火位置。(c)為凝膠照片，顯示對用于性別特異表達(dá)的tra剪接的pcr分析結(jié)果。cctra內(nèi)含子僅在雌性中正確剪接以產(chǎn)生ttav的f1轉(zhuǎn)錄本。

圖2為本發(fā)明的基因構(gòu)建體的一個實施方案的示意圖。

圖3(a)、(b)、(c)和(d)為來自4個pcr反應(yīng)的凝膠運行圖片，這些反應(yīng)橫跨構(gòu)建體區(qū)域，其中在ox3864a/ox3647q品系與品系ox3133(轉(zhuǎn)座酶來源，如dafa’alla等(2006)所描述的)雜交后應(yīng)通過盒式交換而已除去了piggybac序列。

圖4(a)為顯示經(jīng)轉(zhuǎn)化的地中海實蠅在“壓力試驗”即羽化后無食物或水條件下的存活率的圖。成體雄性和雌性存活率數(shù)據(jù)是合并的(n＝180)。(b)為顯示充足食物和水的非壓力條件下的存活率的圖(n＝180)。(c)為顯示單個的雌性終生產(chǎn)卵力的圖。(d)為顯示雌性終生卵產(chǎn)量的圖，顯示30只雌性的3個籠子在3周期間的平均產(chǎn)量。(e)為顯示插圖(c)中的雌性所產(chǎn)的卵的孵化率的圖。(f)為顯示經(jīng)轉(zhuǎn)化的品系ox3864a(右)和ox3647q(中)中的雄性的dsred2熒光與野生型雄性對比的照片。(g)為與(f)中相同的成體雄性在白光下的照片。

圖5為來自特異鑒定ox3864a的基于pcr分析的凝膠的照片。該凝膠顯示用經(jīng)ox3864特異的引物tg1和tg2以及adh引物擴增的x3864純合的、ox3864雜合的、野生型個體以及水陰性對照。標(biāo)記物(m)＝smart梯度(eurogentec)。

圖6為來自用于檢測ox3864a蠅樣品中質(zhì)粒骨架的基于pcr分析的凝膠的照片。泳道1至4：ox3864a純合蠅樣品；泳道5：陽性對照—其中插入了質(zhì)粒骨架的經(jīng)轉(zhuǎn)化的昆蟲；泳道6：wt-地中海實蠅野生型gdna。

圖7為來自用于檢測ox3864a蠅中沉默插入的基于pcr分析的凝膠的照片。陽性對照：9只野生型蛹摻雜有1只雜合蛹；陰性對照：水。(a)顯示了采用引物td539)diag3k10(caactcttctcgttttgaagtcagc；seqidno:22)和852)ttavdiagf(cgtcaggcaatcgagctgttc；seqidno:23)對轉(zhuǎn)基因序列的檢測(772bp)。(b)顯示了采用引物1351)med3864altf(ggataccgaattcatagcggcg；seqidno:24)和1366)med3864fldiagr2(ggtgagaagcatccattccaggc；seqidno:25)對野生型序列的檢測(852/952bp，基于之前觀察到的wt多態(tài)性)。標(biāo)記物(m)：smart梯度(eurogentec)。

圖8為通過引入ox3864a雄性改變地中海實蠅種群動態(tài)的圖。(a)為顯示處理和對照籠子中每個給定周的平均日產(chǎn)卵率的圖。最下面的線表示平均每周日間溫度(攝氏度)，取自每天中午溫度讀數(shù)。(b)顯示了來自處理和對照籠子的所計算的雌性數(shù)量。(c)顯示了從產(chǎn)卵陷阱返回每個處理籠子的后代顯示dsred2熒光表型的比例。

序列表簡要說明

seqidno:1顯示了昆蟲基因表達(dá)系統(tǒng)的核苷酸序列。

seqidno:2顯示了旁側(cè)有地中海實蠅基因組dna的基因表達(dá)系統(tǒng)的核苷酸序列。

seqidno:3顯示了旁側(cè)有地中海實蠅基因組dna的基因表達(dá)系統(tǒng)的核苷酸序列。

seqidno:4顯示了引物tg1-3864attpflr的核苷酸序列。

seqidno:5顯示了引物tg1-attpf2的核苷酸序列。

seqidno:6顯示了引物tg2-3864frtflf的核苷酸序列。

seqidno:7顯示了引物tg2-frtnhef的核苷酸序列。

seqidno:8顯示了引物ccadh2rtf的核苷酸序列。

seqidno:9顯示了引物ccadh2rtf的核苷酸序列。

seqidno:10顯示了引物cc3864frttaqf的核苷酸序列。

seqidno:11顯示了引物cc3864frttaqr的核苷酸序列。

seqidno:12顯示了cc3864frt探針的核苷酸序列。

seqidno:13顯示了引物pb5out的核苷酸序列。

seqidno:14顯示了引物pb3out的核苷酸序列。

seqidno:15顯示了引物diag-5pbmin的核苷酸序列。

seqidno:15顯示了引物diag-pb5的核苷酸序列。

seqidno:17顯示了引物amcydiagf的核苷酸序列。

seqidno:18顯示了引物dlag6-pb3的核苷酸序列。

seqidno:19顯示了引物dlag-k10-1的核苷酸序列。

seqidno:20顯示了引物diag7-pb3的核苷酸序列。

seqidno:21顯示了引物diag2-hr5的核苷酸序列。

seqidno:22顯示了引物diag3k10的核苷酸序列。

seqidno:23顯示了引物ttavdiagf的核苷酸序列。

seqidno:24顯示了引物med3864altf的核苷酸序列。

seqidno:25顯示了引物med3864fldiagr2的核苷酸序列。

seqidno:26顯示了ttav基因的核苷酸序列。

seqidno:27顯示了ttav2基因的核苷酸序列。

seqidno:28顯示了ttav3基因的核苷酸序列。

seqidno:29顯示了ttav蛋白的多肽序列。

seqidno:30顯示了包括5’itr的5’piggybac末端的核苷酸序列。

seqidno:31顯示了包括3’itr的3’piggybac末端的核苷酸序列。

seqidno:32顯示了包括3’itr的3’piggybac末端的核苷酸序列。

發(fā)明詳細(xì)說明

本發(fā)明使得能選擇性控制第一和/或第二顯性致死基因的表達(dá)，從而提供對致死表型的表達(dá)的控制。因此應(yīng)當(dāng)理解，每個致死基因編碼功能性蛋白。優(yōu)選的是，每個基因表達(dá)系統(tǒng)如wo2005/012534中所描述的。

每個致死基因都具有有條件的致死效應(yīng)。適合的條件的實例包括溫度，以使得致死在一個溫度下表達(dá)，而在另一溫度下不表達(dá)或表達(dá)程度較低。適合的條件的另一實例為一物質(zhì)的存在或不存在，由此致死在存在或不存在該物質(zhì)時表達(dá)，但不是都表達(dá)。優(yōu)選致死基因的效應(yīng)是有條件的，并且在需要一物質(zhì)(該物質(zhì)不存在于生物體的天然環(huán)境中)存在的許可條件下不表達(dá)，以使得該致死系統(tǒng)的致死效應(yīng)在生物體的天然環(huán)境中發(fā)生。

每個致死基因系統(tǒng)都可以對特定的細(xì)胞或組織起作用，或者對整個生物體施加影響。也考慮非嚴(yán)格致死但施加實質(zhì)性適合度代價的系統(tǒng)，例如導(dǎo)致失明、不能飛行(對于可正常飛行的生物體)、或者不育。也考慮干擾性別決定的系統(tǒng)，例如將生物體的全部或一部分從一種性別類型轉(zhuǎn)變或趨于轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪恍詣e類型。但是，優(yōu)選的是每個致死基因的產(chǎn)物導(dǎo)致絕育，因為這使得該生物體能夠在天然環(huán)境(“野外”)中與野生型生物體競爭，但不育生物體接著不能產(chǎn)生能存活的后代。以此方式，本發(fā)明在昆蟲中獲得了與諸如昆蟲不育技術(shù)(sit)的技術(shù)類似的結(jié)果，而沒有與sit相關(guān)的問題，例如成本、危害使用者、以及經(jīng)輻射生物體的減弱的競爭力。

在一些實施方案中，至少一個致死基因的產(chǎn)物優(yōu)選為凋亡誘導(dǎo)因子，例如在例如candéetal(journalofcellscience115,4727-4734(2002))中描述的aif蛋白或其同源物。aif同源物在哺乳動物和甚至無脊椎動物中有發(fā)現(xiàn)，包括昆蟲、線蟲、真菌和植物，表明aif基因在整個真核生物界是保守的。在其它實施方案中，至少一個致死基因的產(chǎn)物為hid(黑腹果蠅的頭部退化缺陷基因的蛋白產(chǎn)物)、或reaper(rpr，果蠅的reaper基因的產(chǎn)物)、或它們的突變體。heinrich和scott(proc.natlacad.sciusa97,8229-8232(2000))描述了hid的用途。horn和wimmer(naturebiotechnology21,64-70(2003))描述了突變體衍生物hidala5的用途。本文描述了rpr的突變體衍生物rprkr的用途(還參見whiteetal1996,wingetal.,2001,以及olsonetal.,2003)。rpr和hid都是促凋亡蛋白，被認(rèn)為結(jié)合iap1。iap1為充分保守的抗凋亡蛋白。因此預(yù)期hid和rpr橫跨廣泛的系統(tǒng)發(fā)生范圍起作用(huangetal.,2002,vernooyetal.,2000)，盡管它們自己的序列不是充分保守的。

在其它實施方案中，至少一個致死基因為nipp1dm，即哺乳動物nipp1的果蠅同源物(parkeretalbiochemicaljournal368,789-797(2002)；bennettetal.,genetics164,235-245(2003))。nipp1dm為若以適合水平表達(dá)時具有致死效應(yīng)的蛋白的另一實例，這為技術(shù)人員所理解。事實上，具有致死效應(yīng)的蛋白的很多其它實例為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。

優(yōu)選地，至少一個致死基因為tta或ttav基因變體。ttav為tta的類似物，其中tta的序列經(jīng)修飾以增強與期望的昆蟲種類的相容性。ttav的變體可能編碼tta蛋白，由此ttav變體基因產(chǎn)物與tta基因產(chǎn)物具有相同的功能。因此，與tta核苷酸序列相比以及相互比較，ttav基因的變體包括經(jīng)修飾的核苷酸序列，但編碼具有相同功能的蛋白。因此，ttav基因變體可用于替換tta。實際上，在本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因中優(yōu)選采用ttav基因變體。

可以使用致死基因的任何組合，并且在一些實施方案中，致死基因是相同，而在其它實施方案中，致死基因是不同的。致死基因的改善的外顯率以及致死性的更早發(fā)作通過致死產(chǎn)物的積累來實現(xiàn)。

在優(yōu)選的實施方案中，第一和第二致死基因中的每個獨立地為tta或ttav基因變體。在一些實施方案中，第一和第二致死基因中的每個獨立地為ttav(seqidno:26)、ttav2(seqidno:27)和ttav3(seqidno:28)之一。在其它實施方案中，第一和第二致死基因是相同的。在另外實施方案中，第一和第二致死基因的一個為ttav(seqidno:26)，另一個基因為ttav3(seqidno:28)。但是，可以使用ttav變體的任何組合；因此，在一些實施方案中，第一和第二基因中的一個為ttav(seqidno:26)，另一個為ttav2(seqidno:27)，而在另外的實施方案中，第一和第二基因中的一個為ttav2(seqidno:27)，另一個為ttav3(seqidno:28)。在其它實施方案中，第一致死基因為ttav(seqidno:26)，第二致死基因為ttav3(seqidno:28)。

每個致死基因可操作地連接至啟動子，其中所述啟動子能夠由也包括在至少一個基因表達(dá)系統(tǒng)中的基因所編碼的轉(zhuǎn)錄激活因子所激活。

該啟動子可以為大型或復(fù)雜啟動子，但在導(dǎo)入非宿主昆蟲中時這些啟動子經(jīng)常具有被很少利用或零散利用的缺點。因此，在一些實施方案中，優(yōu)選采用最小啟動子。應(yīng)當(dāng)理解，最小啟動子可以直接從已知的啟動子來源獲得，或者源自較大的天然出現(xiàn)的或以其它方式了解的啟動子。適合的最小啟動子以及如何獲得它們對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。例如，適合的最小啟動子包括源自hsp70的最小啟動子、p最小啟動子、cmv最小啟動子、基于act5c的最小啟動子、bma3啟動子片段、以及adh核心啟動子(bieschke,e.,wheeler,j.,andtower,j.(1998)。“doxycycline-inducedtransgeneexpressionduringdrosophiladevelopmentandaging”.molgengenet,258,571-579)。并非所有最小啟動子都必定在所有的物種中起作用，但是對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見的是如何保證該啟動子是有活性的。

優(yōu)選地，至少一個存在于本發(fā)明中的可操作地連接的啟動子在宿主生物體的早期發(fā)育期間是有活性的，特別優(yōu)選在胚胎階段，以便保證在生物體的早期發(fā)育期間該致死基因被表達(dá)。

在一些實施方案中，至少一個啟動子為最小啟動子為熱休克啟動子，例如hsp70。在其它實施方案中，至少一個啟動子為來自黑腹果蠅的sryα胚胎特異啟動子(horn&wimmer(2003))、或其同源物，或者來自其它胚胎特異或胚胎活性基因的啟動子，例如果蠅基因slowasmolasses(slam)的的啟動子，或者其來自其它物種的同源物。

在一些實施方案中，至少一個啟動子為最小啟動子。在一些實施方案中，每個啟動子獨立地為hsp70、hsp73或sryα。在優(yōu)選的實施方案中，第一和第二啟動子之一為hsp70，另一個為sryα。在一個實施方案中，第一啟動子為hsp70，第二啟動子為sryα。

每個基因表達(dá)系統(tǒng)還包括編碼轉(zhuǎn)錄激活因子的基因，其中每個轉(zhuǎn)錄激活因子激活轉(zhuǎn)基因的致死基因的表達(dá)。因此，每個編碼轉(zhuǎn)錄激活因子的基因能夠被宿主生物體表達(dá)，產(chǎn)生功能性蛋白。具體地，每個轉(zhuǎn)錄激活因子能夠激活至少一個啟動子，其中該啟動子可操作地連接至致死基因。結(jié)果，當(dāng)轉(zhuǎn)錄激活因子激活啟動子時，上調(diào)了可操作地連接至該啟動子的致死基因的表達(dá)。每個轉(zhuǎn)錄激活因子都可以作用于第一或第二啟動子，或者每個轉(zhuǎn)錄激活因子可以作用于第一和第二啟動子二者。優(yōu)選地，當(dāng)不止一個轉(zhuǎn)錄激活因子表達(dá)時，不止一個啟動子被激活。因此，當(dāng)?shù)谝缓偷诙D(zhuǎn)錄激活因子都表達(dá)時，第一和第二啟動子都被激活。

起轉(zhuǎn)錄激活因子作用的基因產(chǎn)物可以以任何適合的方式工作。例如，轉(zhuǎn)錄激活因子可以結(jié)合位于至少一個啟動子附近的增強子，由此增強聚合酶在啟動子處的結(jié)合?？梢圆捎闷渌臋C制，例如阻遏抗衡機制，例如阻斷轉(zhuǎn)錄或翻譯抑制劑。可以例如通過使用阻斷編碼抑制劑的mrna的翻譯的發(fā)夾rna's或核酶來阻斷轉(zhuǎn)錄抑制劑，或者產(chǎn)物可直接結(jié)合抑制劑，從而防止對轉(zhuǎn)錄或翻譯的抑制。

在優(yōu)選的實施方案中，轉(zhuǎn)錄激活因子對致死基因的表達(dá)的影響可由技術(shù)人員控制，優(yōu)選通過使用外源控制因子。特別優(yōu)選的是，轉(zhuǎn)錄激活因子的反式激活活性可被外源控制因子所遏制。因此，有可能通過控制轉(zhuǎn)錄激活因子的反式激活活性來控制致死基因的表達(dá)。由技術(shù)人員施用的外源控制因子的存在減弱了轉(zhuǎn)錄激活因子對相關(guān)啟動子的活性。結(jié)果，對啟動子的激活被阻遏，使得可操作地連接的致死基因的表達(dá)減弱。

在每個或任一個基因表達(dá)系統(tǒng)中都可以使用其反式激活活性可被控制的任何轉(zhuǎn)錄激活因子。例如，轉(zhuǎn)錄激活因子可以為四環(huán)素可阻遏的轉(zhuǎn)錄激活子(tta)蛋白，在表達(dá)時，其結(jié)合teto操縱序列，并驅(qū)動從附近的最小啟動子表達(dá)。可控轉(zhuǎn)錄激活因子的其它實例包括gal4。

編碼轉(zhuǎn)錄激活因子的基因可以相同或不同。在優(yōu)選的實施方案中，編碼轉(zhuǎn)錄激活因子的每個基因獨立地為tta或ttav基因變體。在特別優(yōu)選的實施方案中，編碼轉(zhuǎn)錄激活因子的每個基因獨立地為ttav基因變體，并且可以為相同的或不同的ttav基因變體?？梢允褂胻ta和ttav基因變體的任何組合。在一些實施方案中，每個編碼轉(zhuǎn)錄激活因子的基因獨立地為ttav(seqidno:26)、ttav2(seqidno:27)和ttav3(seqidno:28)，并且這些基因可以相同或不同。在一些實施方案中，每個編碼轉(zhuǎn)錄激活因子的基因獨立地為ttav(seqidno:26)、ttav2(seqidno:27)和ttav3(seqidno:28)之一。在另外實施方案中，編碼轉(zhuǎn)錄激活因子的第一和第二基因中的一個為ttav(seqidno:26)，另一個基因為ttav3(seqidno:28)?？梢允褂胻tav變體的任何組合；因此，在一些實施方案中，編碼轉(zhuǎn)錄激活因子的第一和第二基因中的一個為ttav(seqidno:26)，另一個為ttav2(seqidno:27)；而在另外的實施方案中，編碼轉(zhuǎn)錄激活因子的第一和第二基因中的一個為ttav2(seqidno:27)，另一個為ttav3(seqidno:28)。在其它實施方案中，編碼第一轉(zhuǎn)錄激活因子的基因為ttav(seqidno:26)，編碼第二轉(zhuǎn)錄激活因子的基因為ttav3(seqidno:28)。

如上所述，轉(zhuǎn)錄激活因子是可控的，優(yōu)選可通過外源控制因子阻遏?？梢酝ㄟ^任何適合的手段控制轉(zhuǎn)錄激活因子，以及可以在任何水平上有效。例如，該控制可以有效的，或者是阻斷編碼該轉(zhuǎn)錄激活因子的基因的轉(zhuǎn)錄，或者是阻斷其rna產(chǎn)物的翻譯，或者防止或抑制該基因的翻譯產(chǎn)物的作用。

應(yīng)當(dāng)理解，所用的外源控制因子將取決于轉(zhuǎn)基因中所編碼的轉(zhuǎn)錄激活因子的。例如，在至少一個編碼轉(zhuǎn)錄激活因子的基因編碼gal4的實施方案中，控制因子可以為溫度(由于gal4有些冷敏感)和/或gal80或其變體。在至少一個編碼轉(zhuǎn)錄激活因子的基因為tta或ttav變體的實施方案中，外源控制因子為四環(huán)素。四環(huán)素結(jié)合tta或ttav基因變體產(chǎn)物(i.e.tta)，因此防止tta具有反式激活活性。當(dāng)使用tta或其類似物時，如tav，可將四環(huán)素的存在或不存在，或者濃度的調(diào)整，用于控制該系統(tǒng)。

轉(zhuǎn)基因的顯性致死基因的表達(dá)可以是性別特異的，或者是性別特異與階段特異、生殖系特異或組織特異的組合，由于在每個基因表達(dá)系統(tǒng)中存在至少一個剪接控制序列。在優(yōu)選的實施方案中，該性別特異的表達(dá)為雌性特異的。每個基因表達(dá)序列中的剪接控制序列使得能夠在除啟動子之外有額外水平的蛋白表達(dá)控制。例如，僅在胚胎中組織或性別特異的表達(dá)對于傳統(tǒng)方法而言是極其困難的。

第一和第二致死基因包含蛋白或多肽的編碼序列，即至少一個能夠編碼多肽(例如蛋白或其片段)的外顯子，優(yōu)選兩個或多個外顯子。優(yōu)選地，不同的外顯子有差異的剪接在一起以提供可變mrna。優(yōu)選地，所述可變剪接mrna具有不同的編碼潛能，即編碼不同的蛋白或多肽序列。因此，該編碼序列的表達(dá)是通過可變剪接調(diào)節(jié)的。

系統(tǒng)中的每個剪接控制序列包含至少一個剪接受體位點和至少一個剪接供體位點。供體和受體位點的數(shù)量可以隨準(zhǔn)備剪接在一起的序列的節(jié)段的數(shù)量而變化。

在一些實施方案中，一個或兩個剪接控制序列通過內(nèi)含子和外顯子核苷酸來調(diào)節(jié)可變剪接。在其它實施方案中，一個或兩個剪接控制序列為內(nèi)含子剪接控制序列。換言之，優(yōu)選所述剪接控制序列基本上源自形成一部分內(nèi)含子的多核苷酸，因此通過剪接被從初級轉(zhuǎn)錄本切除，使得這些核苷酸不保留在成熟的mrna序列中。

應(yīng)當(dāng)理解，在可變剪接中，在一些情況下(即在一些可變剪接變體中)，序列可以為內(nèi)含子，但在其它情況下為外顯子(即在其它變體中)。因此，在至少一個剪接變體中，本發(fā)明的至少一個剪接控制序列優(yōu)選基本上源自形成內(nèi)含子的一部分的多核苷酸，即無論是在第一剪接mrna產(chǎn)物中，還是在至少一個可變剪接mrna產(chǎn)物中。因此，可在至少一個轉(zhuǎn)錄本或轉(zhuǎn)錄類型中觀察到內(nèi)含子或內(nèi)含子序列被剪接掉。

在“正常的”(非可變的)剪接和可變剪接中，內(nèi)含子一般是從前rna去除以形成剪接的mrna，其接著可翻譯為具有氨基酸序列的多肽，例如蛋白或蛋白片段。因此，對技術(shù)人員顯而易見的是如何確定本系統(tǒng)的這些序列被認(rèn)為是內(nèi)含子，而不是外顯子。

如上所述，外顯子序列可以參與介導(dǎo)可變剪接的控制，但優(yōu)選的是至少一些內(nèi)含子控制序列參與介導(dǎo)可變剪接。換言之，每個基因表達(dá)系統(tǒng)還可以包括存在于外顯子中的剪接控制序列，只要存在一些內(nèi)含子參與控制。在一些實施方案中，一個或兩個剪接控制序列源自或者含有dsx基因的元件，其中，無需被理論束縛，可認(rèn)為外顯子序列有助于可變剪接機制。

因此，在一些實施方案中，該至少一個剪接控制序列包括外顯子序列，并且，應(yīng)當(dāng)理解，這由用于描述本發(fā)明的定義所預(yù)想。因此，顯而易見地，有可能一些核苷酸被涵蓋在該至少一個剪接控制序列的定義內(nèi)，并且還處于編碼功能性蛋白的多核苷酸序列的定義內(nèi)。換言之，這些元件的定義可以交疊，使得某些核苷酸可被不止一個元件的定義所覆蓋。但是，技術(shù)人員會意識到，這在分子生物學(xué)中并非罕見的，因為核苷酸通?？蓤?zhí)行不止一個角色。在其它實施方案中，至少一個剪接控制序列為純內(nèi)含子的，即沒有外顯子影響。

優(yōu)選至少一個剪接控制序列能夠通過剪接從前rna去除。優(yōu)選地，所述至少一個剪接控制序列在至少一個所產(chǎn)生的剪接變體中不導(dǎo)致移碼。優(yōu)選地，這為編碼全長功能性蛋白的剪接變體。換言之，至少一個剪接控制序列優(yōu)選不介導(dǎo)形成或打算形成編碼功能性蛋白的多核苷酸序列(定義在起始密碼子和終止密碼子之間，準(zhǔn)備在生物體中表達(dá))的一部分的核苷酸的去除。為此，這意味著在至少一個剪接變體中通過剪接切除的核苷酸不為編碼野生型形式的蛋白的核苷酸或基因。一個或多個剪接變體可以將所述核苷酸切除，但是至少一個變體必須保留這些核苷酸，以使得在該至少一個變體中沒有誘導(dǎo)移碼。這些移除的核苷酸為在正常剪接出的序列(如內(nèi)含子)之外被移除的核苷酸。

該至少一個剪接控制序列與細(xì)胞剪接機構(gòu)如剪接體的相互作用導(dǎo)致或介導(dǎo)了一系列優(yōu)選至少50個連續(xù)核苷酸從初級轉(zhuǎn)錄本的移除以及在初級轉(zhuǎn)錄本中不連續(xù)的核苷酸的連接(剪接)一起(因為它們，或如果考慮反義序列的話則是它們的互補序列，在初始轉(zhuǎn)錄本從其轉(zhuǎn)錄而來的原始模板序列中是不連續(xù)的)。所述至少50個連續(xù)核苷酸的系列包括內(nèi)含子。這種介導(dǎo)優(yōu)選以性別特異的、更優(yōu)選雌性特異的方式起作用，以使得等量的初級轉(zhuǎn)錄本在不同的性別、以及任選地還在不同的階段、組織類型等中趨于去除不同大小或序列的內(nèi)含子，或者在某些情況下可以在一種情況下去除內(nèi)含子，而另一種情況則不去除。這種在不同情形下去除不同大小或序列的內(nèi)含子、或者在不同情形下指定大小或序列的內(nèi)含子的差異化去除的現(xiàn)象，稱為可變剪接?？勺兗艚釉谧匀唤缡枪默F(xiàn)象，并且很多實例是已知的，見上文。

在可變剪接的介導(dǎo)是性別特異時，優(yōu)選編碼準(zhǔn)備在有機體中表達(dá)的功能性蛋白的剪接變體為f1剪接變體，即僅在或主要在雌性中發(fā)現(xiàn)的剪接變體，并優(yōu)選為雌性中發(fā)現(xiàn)的最豐富的變體，盡管這不是必要的。

如上所述，在一些實施方案中，可變剪接的方式或機制為性別特異的，優(yōu)選雌性特異的，并且任何適合的剪接控制序列都是可以使用的。在優(yōu)選的實施方案中，至少一個剪接控制序列源自tra內(nèi)含子。來自transformer基因的地中海實蠅tra內(nèi)含子最初由上文pane等(2002)表征。在昆蟲中，例如tra蛋白在不同性別中是差異表達(dá)的。具體地，已知tra蛋白主要存在于雌性中，并因此如此介導(dǎo)可變剪接，以使得編碼序列以性別特異的方式表達(dá)，即在一些情況下蛋白僅在雌性中表達(dá)或者以比在雄性中高得多的水平在雌性中表達(dá)，或者，在其它情況下，蛋白僅在雄性中表達(dá)或者以比在雌性中高得多的水平在雄性中表達(dá)。實現(xiàn)這種tra蛋白或tra/tra-2復(fù)合體介導(dǎo)的性別特異的可變剪接的機制是已知的，并且例如在paneetal(development129,3715-3725(2002))中有討論。

應(yīng)當(dāng)理解，來自transformer基因的地中海實蠅tra內(nèi)含子的同源物存在于其它物種中，并且可容易地在所述物種以及也在它們的各屬中鑒定這些同源物。因此，當(dāng)提及tra時，應(yīng)當(dāng)理解這也涉及其它物種中的tra同源物。因此，在一些實施方案中，可變剪接機制的每一個獨立的源自地中海實蠅tra內(nèi)含子、或源自另一直系同源物或同源物。在一些實施方案中，該直系同源物或同源物來自節(jié)肢動物，優(yōu)選實蠅科。在其它實施方案中，該直系同源物或同源物來自蠟實蠅屬(ceratitis)、果實蠅屬(bactrocera)、實蠅屬(anastrepha)或繞實蠅屬(rhagoletis)。在其它實施方案中，該直系同源物或同源物來自納塔爾實蠅(c.rosa)或桃實蠅(b.zonata)。在另外的實施方案中，該直系同源物或同源物來自桃實蠅，并且這種直系同源物或同源物在本文中稱為bztra(genbank登記號bztrakj397268)。

基因表達(dá)系統(tǒng)的剪接控制序列可以相同或不同。在一些實施方案中，優(yōu)選該剪接控制序列源自不同的物種，以便減少重組風(fēng)險。因此，在優(yōu)選的實施方案中，第一和第二剪接控制系列之一為cctra，另一個源自不同的物種。在特別優(yōu)選的實施方案中，第一和第二剪接控制系列之一為cctra，另一個為bztra(genbank登記號bztrakj397268)。在另一實施方案中，該第一剪接控制序列為cctra，該第二剪接控制系列為bztra(genbank登記號bztrakj397268)。

源自tra內(nèi)含子的剪接控制序列的精確長度不是關(guān)鍵的，只要能夠介導(dǎo)可變剪接。就此而言，對于經(jīng)修飾的tra內(nèi)含子認(rèn)為約55至60個核苷酸為最小長度，盡管來自地中海實蠅(c.capitata)的野生型tra內(nèi)含子(f1剪接變體)在1345核苷酸長的區(qū)域內(nèi)。

在其它實施方案中，至少一個剪接控制序列源自源于節(jié)肢動物(優(yōu)選實蠅科)的actin-4基因的可變剪接機制。在不止一個剪接序列源自actin-4的實施方案中，它們可以源自相同或不同的實蠅科物種。在一些實施方案中，每個actin-4基因獨立地源自蠟實蠅屬、果實蠅屬、實蠅屬或繞實蠅屬的物種。在其它實施方案中，該第一和第二actin-4基因獨立地源自地中海實蠅、橄欖果蠅(troceraoleae)、納塔爾實蠅(ceratitisrosa)或桃實蠅(bactrocerazonata)。在一些實施方案中，第一和第二actin-4基因的至少一個源自地中海實蠅。在不止一個剪接控制序列源自actin-4的實施方案中，剪接控制序列可以源自相同的物種。但是，優(yōu)選該剪接控制序列源自不同的物種，以便減少重組風(fēng)險。

在一些實施方案中，至少一個剪接控制序列包括源自節(jié)肢動物(優(yōu)選實蠅科)的doublesex(dsx)基因的至少一片段。在一些實施方案中，不止一個剪接控制序列(例如，第一和第二剪接控制序列二者)源自dsx，并且該dsx基因源自相同或不同的實蠅科物種。在一些實施方案中，每個dsx基因獨立地源自蠟實蠅屬、果實蠅屬、實蠅屬或繞實蠅屬的物種。在一些實施方案中，該dsx基因獨立地源自地中海實蠅、橄欖果蠅、納塔爾實蠅或桃實蠅。在一些實施方案中，第一和第二dsx基因的至少一個源自地中海實蠅。在不止一個剪接控制序列源自dsx的實施方案中，剪接控制序列可以源自相同的物種。但是，優(yōu)選該剪接控制序列源自不同的物種，以便減少重組風(fēng)險。

盡管在一些實施方案中設(shè)想剪接控制序列源自相同的基因或內(nèi)含子起源，但在其它實施方案中該剪接控制序列源自不同的基因或內(nèi)含子起源。例如，在一些實施方案中，剪接控制序列之一源自tra內(nèi)含子，其它的剪接控制序列源自actin-4基因或dsx基因。

在一些實施方案中，該第一和第二基因表達(dá)系統(tǒng)的至少一個還包括與所述基因表達(dá)系統(tǒng)關(guān)聯(lián)的增強子。在第一和/或第二基因表達(dá)系統(tǒng)中編碼的至少一個轉(zhuǎn)錄激活因子結(jié)合該增強子，使得轉(zhuǎn)錄激活因子的結(jié)合用于增強所述關(guān)聯(lián)的啟動子的活性，例如通過促進(jìn)聚合酶在啟動子處的結(jié)合。

在基因表達(dá)系統(tǒng)的啟動子與增強子關(guān)聯(lián)的實施方案中，在缺乏活性增強子時該啟動子基本上無活性。這些啟動子優(yōu)選最小啟動子，例如上文描述的那些。

本領(lǐng)域技術(shù)人員會意識到哪些增強子適合用在本發(fā)明中。具體地，該增強子必須適合于被轉(zhuǎn)錄激活因子結(jié)合，如上所述(即其可由外源控制因子控制)。

因此，在一個或多個顯性、致死基因為tta或ttav基因變體的實施方案中，增強子為teto元件，包括一個或多個teto操縱單元。在啟動子上游，當(dāng)被tta基因或ttav基因變體的產(chǎn)物結(jié)合時，任一方向的teto能夠增強與其臨近的啟動子的轉(zhuǎn)錄水平。在一些實施方案中，每個增強子獨立地為tetox1、tetox2、tetox3、tetox4、tetox5、tetox6、tetox7、tetox8、tetox9、tetox10、tetox11、tetox12、tetox13、tetox14、tetox15、tetox16、tetox17、tetox18、tetox19、tetox20和tetox21之一。在一些實施方案中，每個增強子獨立地為tetox7、tetox14和tetox21之一。在包括不止一個增強子的實施方案中，第一增強子與第二增強子相同或不同。

在優(yōu)選的實施方案中，第一和第二基因表達(dá)系統(tǒng)二者還分別包括增強子，即第一和第二增強子。在一些實施方案中，第一和第二增強子之一為tetox7，另一個增強子為tetox14。在另一實施方案中，第一增強子為tetox7，第二增強子為tetox14。

在一些實施方案中，在給定的基因表達(dá)系統(tǒng)中，優(yōu)選將所述基因表達(dá)系統(tǒng)的顯性、致死基因與該相同基因表達(dá)系統(tǒng)的編碼轉(zhuǎn)錄激活因子的基因連接。這可以通過將兩個基因串聯(lián)設(shè)置來實現(xiàn)，包括將二者提供為融合產(chǎn)物的可能性，或者例如通過將每個基因連同其自己的啟動子提供在相反方向，但是與該增強子位點毗鄰。

在一些實施方案中，至少一個基因表達(dá)系統(tǒng)形成線性表達(dá)系統(tǒng)。因此，當(dāng)編碼轉(zhuǎn)錄激活因子的基因被表達(dá)時，所述轉(zhuǎn)錄激活因子激活可操作地連接至致死基因的啟動子，由此上調(diào)該致死基因的表達(dá)。在一些實施方案中，該轉(zhuǎn)錄激活因子僅激活表達(dá)了所述轉(zhuǎn)錄激活因子的基因表達(dá)系統(tǒng)的啟動子。在其它實施方案中，該轉(zhuǎn)錄激活因子還可以激活其它基因表達(dá)系統(tǒng)的啟動子。

在更優(yōu)選的實施方案中，特定基因表達(dá)系統(tǒng)的顯性、致死基因與也是所述基因表達(dá)系統(tǒng)的一部分的編碼轉(zhuǎn)錄激活因子的基因就是同一個。因此，致死產(chǎn)物對于至少該基因表達(dá)系統(tǒng)也起轉(zhuǎn)錄激活因子的作用。結(jié)果，該致死基因產(chǎn)物激活所述基因表達(dá)系統(tǒng)的啟動子，由此上調(diào)所述致死基因的表達(dá)，產(chǎn)生正反饋回路。換言之，所述顯性、致死基因也為編碼所述基因表達(dá)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄激活因子的基因。因此，啟動子的增強不僅有助于增加轉(zhuǎn)錄激活因子的轉(zhuǎn)錄，還導(dǎo)致該基因表達(dá)系統(tǒng)的致死產(chǎn)物的積累，對宿主生物體產(chǎn)生致死效應(yīng)。就此而言，在一個實施方案中，尤其優(yōu)選第一和/或第二基因表達(dá)系統(tǒng)的正反饋回路如wo2005/012534中所公開的。

優(yōu)選地，該第一和/或第二致死基因為tta或ttav基因變體，如上所述。在這些實施方案中，相關(guān)的基因表達(dá)系統(tǒng)還包括如上文所述的作為增強子的teto元件。編碼轉(zhuǎn)錄激活因子的基因與所述致死基因就是同一個。該外源控制因子為四環(huán)素。因此，由四環(huán)素是否存在來對該正反饋機制加以控制，而四環(huán)素的存在阻遏tta或ttav基因變體產(chǎn)物對啟動子的反式激活活性。

在至少一個基因表達(dá)系統(tǒng)為正反饋回路時，所述正反饋回路的轉(zhuǎn)錄激活因子激活所述基因表達(dá)系統(tǒng)的啟動子，但在一些實施方案中，該轉(zhuǎn)錄激活因子還同時激活其它基因表達(dá)系統(tǒng)的啟動子。

在一些實施方案中，基因表達(dá)系統(tǒng)之一為如上所述的線性基因表達(dá)系統(tǒng)，另一個為如上所述的正反饋回路。

在一些實施方案中，第一和第二基因表達(dá)系統(tǒng)二者都起正反饋回路的作用。第一和第二基因表達(dá)系統(tǒng)的每一個表達(dá)不同的致死基因產(chǎn)物，以使得第一基因表達(dá)系統(tǒng)的致死基因產(chǎn)物僅對第一基因表達(dá)系統(tǒng)起轉(zhuǎn)錄激活因子的作用，反之亦然。

在優(yōu)選的實施方案中，第一和第二基因表達(dá)系統(tǒng)二者都起正反饋回路的作用，并表達(dá)相同或類似的致死產(chǎn)物。因此，由第一基因表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的致死基因產(chǎn)物對第一和第二基因表達(dá)系統(tǒng)都起轉(zhuǎn)錄激活因子的作用，反之亦然。相應(yīng)地，在一些實施方案中，第一和第二基因表達(dá)系統(tǒng)都包括作為致死基因和編碼轉(zhuǎn)錄激活因子的基因的tta或ttav基因變體。相應(yīng)地，兩個基因表達(dá)系統(tǒng)包括如上所述的增強子teto元件，其驅(qū)動從關(guān)聯(lián)啟動子的表達(dá)。第一轉(zhuǎn)錄激活因子(即第一致死基因產(chǎn)物)可結(jié)合第一和第二增強子，并且第二轉(zhuǎn)錄激活因子可結(jié)合第一和第二增強子。

在一些實施方案中，基因表達(dá)系統(tǒng)之一還包括可操作地連接第三啟動子的第三顯性、致死基因。能夠激活相關(guān)基因表達(dá)系統(tǒng)的啟動子的轉(zhuǎn)錄激活因子也能夠激活該第三啟動子，由此增強該第三致死基因的表達(dá)。因此，該第三致死基因的表達(dá)也可以被作用于所述轉(zhuǎn)錄激活因子的外源控制因子所控制，優(yōu)選所阻遏。

在一些實施方案中，該相關(guān)基因表達(dá)系統(tǒng)還包括如上所述的增強子，以及任選地第三致死基因和第三啟動子。在一些這樣的實施方案中，所述基因表達(dá)系統(tǒng)的啟動子和該第三啟動子都與所述增強子關(guān)聯(lián)。優(yōu)選地，所述基因表達(dá)系統(tǒng)的啟動子與增強子的一端相關(guān)聯(lián)，而第三啟動子與增強子的另一端相關(guān)聯(lián)。具體地，如上所述，一些增強子能夠增強任一方向的轉(zhuǎn)錄水平。

第三致死基因表達(dá)致死產(chǎn)物，并由于總致死產(chǎn)物的積累而由此增加轉(zhuǎn)基因的致死效應(yīng)。但是，甚至在轉(zhuǎn)基因中沒有該第三致死基因時，觀察到上文描述的由轉(zhuǎn)基因提供的改進(jìn)。

該第三致死基因可以為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何致死基因。在一些實施方案中，該第三致死基因為上文涉及第一和第二致死基因時提到的那些中的任一個。在一些實施方案中，該第三致死基因為tta、ttav基因變體或vp16。在優(yōu)選的實施方案中，該第三致死基因為vp16。

第三啟動子可以為涉及轉(zhuǎn)基因的第一和第二啟動子時先前描述的那些中的任一個。在一些實施方案中，該第三啟動子為最小啟動子。在優(yōu)選的實施方案中，該第三啟動子在生物體的早期發(fā)育中表達(dá)，優(yōu)選至少在胚胎期期間表達(dá)。優(yōu)選地，該第三啟動子為hsp70或sryα。在優(yōu)其它實施方案中，該第三啟動子為hsp70。

在一些實施方案中，轉(zhuǎn)基因還包括基因標(biāo)記物。在一些實施方案中，這種標(biāo)記物為熒光標(biāo)記物，即編碼熒光蛋白的基因。適合的基因標(biāo)記物對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。在優(yōu)選的實施方案中，該熒光標(biāo)記物為dsred2，其編碼dsred2熒光蛋白。在其它實施方案中，該基因標(biāo)記物為綠色熒光蛋白，或其變體。這些基因標(biāo)記物可用在對成功轉(zhuǎn)化的生物體的篩選中。此外，這些標(biāo)記物可用于將例如轉(zhuǎn)基因蠅類與野外野生型蠅類或在野外捕捉的那些區(qū)分開。

本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在包括這些基因標(biāo)記物的實施方案中，表達(dá)該標(biāo)記物所需的組件也包括在所述實施方案中。例如，因此可設(shè)想熒光標(biāo)記物將可操作地連接至啟動子。可以使用任何適合的啟動子，例如hr5/ie1。

在優(yōu)選的實施方案中，ttav(seqidno:26)為第一顯性致死基因，hsp70為第一啟動子，以及cctra為第一剪接控制序列。如上所述，該第一基因表達(dá)系統(tǒng)為正反饋回路，使得該第一致死基因也為編碼第一轉(zhuǎn)錄激活因子的基因。該第一基因表達(dá)系統(tǒng)還包括第一增強子，其中該第一增強子為tetox7。第二基因表達(dá)系統(tǒng)包括作為第二顯性、致死基因的ttav3(seqidno:28)，作為第二啟動子的sryα以及作為第二剪接控制序列的bztra(genbank登記號bztrakj397268)。該第二基因表達(dá)系統(tǒng)也形成正反饋回路，使得該第二致死基因為編碼第二轉(zhuǎn)錄激活因子的基因。該第二基因表達(dá)系統(tǒng)還包括第二增強子，其中該第二增強子為tetox14。該第二基因表達(dá)系統(tǒng)還包括與第三啟動子可操作地連接的第三致死基因，其中該第三致死基因為vp16，第三啟動子為hsp70。該第三啟動子與第二增強子相關(guān)聯(lián)，第二啟動子與該增強子的一端相關(guān)聯(lián)，而第三啟動子與該第二增強子的另一端相關(guān)聯(lián)。該轉(zhuǎn)基因還包括基因標(biāo)記物和為其所用的啟動子，其中該基因標(biāo)記物為dsred2，啟動子因此為hr5/ie1。在另一實施方案中，該轉(zhuǎn)基因為具有seqidno:1表示的序列的多核苷酸序列。

該第一和第二基因表達(dá)系統(tǒng)串聯(lián)排列，形成轉(zhuǎn)基因，并且該轉(zhuǎn)基因可以在每個基因表達(dá)系統(tǒng)之間包含或不包含接頭核苷酸序列。在基因表達(dá)系統(tǒng)之間不包含接頭序列的實施方案中，第一和第二基因表達(dá)系統(tǒng)為連續(xù)的。在第一和第二基因表達(dá)系統(tǒng)之間包含接頭序列的實施方案中，該接頭序列為1bp至10kbp長。

還應(yīng)當(dāng)理解，在轉(zhuǎn)基因還包括基因標(biāo)記物和其關(guān)聯(lián)啟動子的實施方案中，在基因標(biāo)記物(或其啟動子)和臨近的基因表達(dá)系統(tǒng)之間可以有或沒有接頭核苷酸序列。如上所述，在不存在接頭序列的實施方案中，基因標(biāo)記物或其啟動子與該轉(zhuǎn)基因的基因表達(dá)系統(tǒng)之一連續(xù)。在轉(zhuǎn)基因在基因標(biāo)記物和相關(guān)基因表達(dá)系統(tǒng)之間包括接頭序列的實施方案中，該接頭序列為1bp至10kbp長。

但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員也應(yīng)當(dāng)理解，優(yōu)選轉(zhuǎn)基因中不存在接頭序列，以使得轉(zhuǎn)基因的元件是連續(xù)的。這是為了減小隨機突變引入該轉(zhuǎn)基因的風(fēng)險以及減小重組的風(fēng)險。

包括基因表達(dá)系統(tǒng)的多核苷酸序列即轉(zhuǎn)基因可以形成基因構(gòu)建體的一部分。因此，在本發(fā)明的另一方面，提供了包括如上所述的第一和第二基因表達(dá)系統(tǒng)的基因構(gòu)建體。該基因構(gòu)建體還可以包括不形成該轉(zhuǎn)基因的一部分的其它組件。這些組件可以存在或不存在于以其轉(zhuǎn)化的生物體內(nèi)。

在一些實施方案中，該基因構(gòu)建體還包括至少4個反向重復(fù)序列，形成至少兩對相對的反向重復(fù)序列。該轉(zhuǎn)基因位于兩對反向重復(fù)序列之間。這意味著，成對的反向重復(fù)序列的原位切除有效地讓基因表達(dá)系統(tǒng)插入宿主基因組中，而沒有旁側(cè)轉(zhuǎn)座子來源的重復(fù)序列存在于宿主基因組中。該至少4個反向重復(fù)序列如wo2005/003364中所描述的，并提供對可轉(zhuǎn)座末端的消除，如dafa’alla等(2006)中所描述。

在一些實施方案中，該基因構(gòu)建體包括4個反向重復(fù)序列，形成至少兩對相對的反向重復(fù)序列。在一些這樣的實施方案中，優(yōu)選該4個反向重復(fù)序列為piggybac反向末端重復(fù)序列(itr)。兩個反向重復(fù)序列遠(yuǎn)離該轉(zhuǎn)基因，即它們?yōu)橥獠糠聪蛑貜?fù)序列，而剩余的反向重復(fù)序列為內(nèi)部反向重復(fù)序列。具體地，這意味著一個內(nèi)部反向重復(fù)序列在一個外部反向重復(fù)序列和該轉(zhuǎn)基因之間。這4個反向重復(fù)序列因此形成4個不同的可轉(zhuǎn)座元件，其中兩個可轉(zhuǎn)座元件不包含該轉(zhuǎn)基因。不包括該基因表達(dá)系統(tǒng)的可轉(zhuǎn)座元件比另兩個可轉(zhuǎn)座元件短得多。通常，轉(zhuǎn)座酶對切出較短的序列更有效，使得例如在轉(zhuǎn)座子具有一個5’重復(fù)序列和兩個3’重復(fù)序列時，將觀察到的轉(zhuǎn)移至另一基因座的最常見轉(zhuǎn)座子為較短的，由5’重復(fù)序列和兩個3’重復(fù)序列中更臨近的一起形成。因此，由于不含有該轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)座子比含有該轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)座子更短，因此對不包括轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)座子的切除以比對含有轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)座子的切除更高的頻率發(fā)生。

在一些實施方案中，兩個內(nèi)部iggybacitrs經(jīng)修飾以包括約160堿基對的額外亞末端piggybac序列。可以添加這種額外的序列以便確保在隨后的多輪暴露于轉(zhuǎn)座酶期間較短的轉(zhuǎn)座子(即不包含該轉(zhuǎn)基因的那些)被切除。

在優(yōu)選的實施方案中，該構(gòu)建體包括4個piggybac反向重復(fù)序列，形成至少兩對相對的反向重復(fù)序列。這4個piggybac反向重復(fù)序列由seqidno:30-32表示的核苷酸序列組成，其中seqidno:30表示的序列用于兩個piggybac反向重復(fù)序列。具體地，一個外部反向重復(fù)序列由seqidno:30表示的核苷酸序列組成，另外的外部反向重復(fù)序列由seqidno:31表示的核苷酸序列組成。一個內(nèi)部piggybac重復(fù)序列由seqidno:30表示的核苷酸序列組成，另外的內(nèi)部piggybac反向重復(fù)序列由seqidno:32表示的核苷酸序列組成。更具體地，5'外部piggybac重復(fù)序列由seqidno:30表示的核苷酸序列組成，由seqidno:32表示的核苷酸序列組成3'內(nèi)部piggybac反向重復(fù)序列位于該5'外部piggybac反向重復(fù)序列和該轉(zhuǎn)基因之間。3'外部piggybac重復(fù)序列由seqidno:31表示的核苷酸序列組成，由seqidno:30表示的核苷酸序列組成5'內(nèi)部piggybac反向重復(fù)序列位于該3'外部piggybac反向重復(fù)序列和該轉(zhuǎn)基因之間。

因此，在這種實施方案中可能的4個轉(zhuǎn)座子位于：

i)5’外部和3’外部piggybac反向重復(fù)序列之間，

ii)5’外部和3’內(nèi)部piggybac反向重復(fù)序列之間，

iii)3’外部和5’內(nèi)部piggybac反向重復(fù)序列之間，以及

iv)5’內(nèi)部和3’內(nèi)部piggybac反向重復(fù)序列之間。

如上所述，轉(zhuǎn)座子ii)和iii)不含有該轉(zhuǎn)基因，并短于轉(zhuǎn)座子i)和iv)。

在一些具有四個反向重復(fù)序列的實施方案中，該構(gòu)建體還包括至少一個與至少一個可能的轉(zhuǎn)座子關(guān)聯(lián)的基因標(biāo)記物，以便讓使用者能夠跟蹤轉(zhuǎn)座和切除的各個步驟的進(jìn)展，并確定哪些個體中所述步驟是成功的。在一些實施方案中，至少一個基因標(biāo)記物與轉(zhuǎn)座子/切除過程中的可鑒定步驟相關(guān)聯(lián)，更優(yōu)選地，該標(biāo)記物與轉(zhuǎn)基因相關(guān)聯(lián)。這些與轉(zhuǎn)基因關(guān)聯(lián)的標(biāo)記物可以為如上文所述的。

優(yōu)選地，至少一個基因標(biāo)記物與每一個可能的轉(zhuǎn)座子相關(guān)聯(lián)。因此，至少一個基因標(biāo)記物置于每對反向重復(fù)序列之間。應(yīng)當(dāng)理解，任何適合的基因標(biāo)記物都可以使用，這些標(biāo)記物的實例包括dsred2、amcyan和zsgreen。在一些實施方案中，構(gòu)建體包括三個基因標(biāo)記物，其中一個標(biāo)記物置于每對反向重復(fù)序列之間。應(yīng)當(dāng)理解，為了在轉(zhuǎn)座子之間進(jìn)行區(qū)分，每個標(biāo)記物必須是不同的。

本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，包括至少一個基因標(biāo)記物的實施方案還可以包括驅(qū)動該基因標(biāo)記物表達(dá)的啟動子。在一些實施方案中，該啟動子為hr5/ie1(choi&guarino,1995)，而在其它實施方案中，該啟動子為polyubiquitin(handler&harrel,2001)。但是，與這些基因標(biāo)記物一起使用的啟動子不限于這兩個實例，可以使用其它的。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到哪些啟動子是適合的。

在優(yōu)選的實施方案中，該構(gòu)建體包括seqidno:1表示的轉(zhuǎn)基因，還包括4個如上文所述的piggybac反向重復(fù)序列。該構(gòu)建體還在5'外部piggybac重復(fù)序列和3'內(nèi)部piggybac重復(fù)序列之間包括基因標(biāo)記物，以及在3'外部piggybac重復(fù)序列和5'內(nèi)部piggybac重復(fù)序列之間包括基因標(biāo)記物，其中基因標(biāo)記物之一為amcyan，另外的為zsgreen。在特別優(yōu)選的實施方案中，該構(gòu)建體如圖2所示，其中5'外部piggybac重復(fù)序列和3'內(nèi)部piggybac重復(fù)序列之間的標(biāo)記物為zsgreen，3'外部piggybac重復(fù)序列和5'內(nèi)部piggybac重復(fù)序列之間的標(biāo)記物為amcyan。

如上文提到的，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因和基因構(gòu)建體可用在野外生物體種群的控制中。確切地，經(jīng)該轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化的節(jié)肢動物顯示出性別特異的致死性，與之前公開的轉(zhuǎn)移昆蟲相比具有改善的轉(zhuǎn)基因外顯率和更早的致死性發(fā)作。如果發(fā)生生化抗性，以上述任何轉(zhuǎn)基因或構(gòu)建體轉(zhuǎn)化節(jié)肢動物還提供了安全機制。如上文所述的還包括至少4個反向重復(fù)序列的構(gòu)建體提供了進(jìn)一步的優(yōu)點：所有的轉(zhuǎn)座子序列整合后消除是可能的，導(dǎo)致大量飼養(yǎng)和野外條件下的穩(wěn)定性。

因此，在本發(fā)明的另一方面，提供了以上述轉(zhuǎn)基因或構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的生物體。在一些實施方案中，該生物體為節(jié)肢動物。在一些實施方案中，該生物體為昆蟲。在一些實施方案中，該生物體屬于鱗翅目(lepidoptera)、蚤目(siphonaptera)、雙翅目(diptera)、膜翅目(hymenoptera)、鞘翅目(coleoptera)、纓翅目(thysanoptera)、半翅目(hemiptera)、直翅目(orthoptera)或中氣門目(mesostigmata)。在其它實施方案中，該生物體屬于實蠅科(tephritidae)、果蠅科(drosophilidae)、尖尾蠅科(lonchaeidae)、草蠅科(pallopteridae)、扁口蠅科(platystomatidae)、蜣蠅科(pyrogotidae)、粗股蠅科(richardiidae)或小金蠅科(ulidiidae)。在優(yōu)選的實施方案中，該生物體屬于實蠅科或果蠅科。在優(yōu)選的實施方案中，該生物體屬于蠟實蠅屬(ceratitis)、果蠅屬(drosophila)、果實蠅屬(bactrocera)、實蠅屬(anastrepha)或繞實蠅屬(rhagoletis)。更優(yōu)選地，該生物體屬于蠟實蠅屬。在特別優(yōu)選的實施方案中，該生物體為地中海實蠅(ceratitiscapitata)。

應(yīng)當(dāng)理解，可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何手段施用該轉(zhuǎn)基因或構(gòu)建體，但通常在整合進(jìn)基因組后測試。可通過本領(lǐng)域已知的方法施用，例如胃腸外、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、口服、透皮、經(jīng)粘膜等等。注射進(jìn)胚胎是特別優(yōu)選的。在一些實施方案中，該轉(zhuǎn)基因或構(gòu)建體作為質(zhì)粒施用。

在優(yōu)選的實施方案中，經(jīng)轉(zhuǎn)化的生物體為地中海實蠅，并且該經(jīng)轉(zhuǎn)化的昆蟲包括seqidno:2或3表示的序列。在特別優(yōu)選的實施方案中，經(jīng)轉(zhuǎn)化的地中海實蠅包括seqidno:2表示的序列，并且包括該序列的地中海實蠅在本文稱作ox3864a。在其它實施方案中，經(jīng)轉(zhuǎn)化的地中海實蠅包括seqidno:3表示的序列，并且包括該序列的經(jīng)轉(zhuǎn)化的地中海實蠅在本文稱作ox3647q。

在一些實施方案中，包括seqidno:2表示的序列的經(jīng)轉(zhuǎn)化的地中海實蠅(即ox3864a)是特別優(yōu)選的，原因如下：

i)在一個拷貝時該轉(zhuǎn)基因外顯率為100％；即如實施例中看到的，甚至在雜合狀態(tài)下，所有的雌性在幼蟲培養(yǎng)基中無四環(huán)素時死亡；

ii)在幼蟲飲食中摻有四環(huán)素時，雄性：雌性比例為50:50，表明了對雌性中轉(zhuǎn)基因表達(dá)的良好阻遏(這對于飼養(yǎng)機構(gòu)中該品系有成本效益的繁殖是重要的)；

iii)不存在四環(huán)素時ox3864a顯示了完全的蛹前雌性致死性；

v)紅色標(biāo)記物(dsred2)的表達(dá)是強勁并可持續(xù)的。該標(biāo)記物在所有的發(fā)育期都是明顯的，使得能在大量飼養(yǎng)的機構(gòu)中進(jìn)行質(zhì)量控制(qc)規(guī)程以及在野外可靠監(jiān)測；

vi)生活史參數(shù)與用于轉(zhuǎn)化的野生型的那些具有可比性，如實施例中所顯示的，表明在四環(huán)素上飼養(yǎng)時o3864a具有近似野生型適合度；

vii)所插入的構(gòu)建體通過除去載體piggybac末端已在插入后穩(wěn)定化，這樣該轉(zhuǎn)基因是固定的并且在昆蟲基因組中可遺傳。

鑒定經(jīng)上述轉(zhuǎn)基因或構(gòu)建體成功轉(zhuǎn)化的生物體也是有用的。因此，在本發(fā)明的另一方面，提供了檢測經(jīng)上文所述的轉(zhuǎn)基因或構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的生物體的方法，以及用于所述方法的引物。該方法包括用于檢測經(jīng)轉(zhuǎn)化的生物體的基于pcr的測定法，通過擴增覆蓋所插入的轉(zhuǎn)基因的旁側(cè)生物體基因組dna以及該轉(zhuǎn)基因自身的dna序列來進(jìn)行。該方法包括讓從生物體獲得的樣品dna與特異于插入昆蟲基因組的如上文所述的轉(zhuǎn)基因的引物對接觸，其中引物對中的一個引物特異于該轉(zhuǎn)基因的核苷酸序列，引物對中的另一引物特異于所插入的轉(zhuǎn)基因旁側(cè)的基因組核苷酸序列，以及擴增該樣品dna。因此，引物對中的一個引物與旁側(cè)基因組dna退火，引物對中另外的引物與該轉(zhuǎn)基因退火。然后可觀察擴增產(chǎn)物，并且通常可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)檢測。

對dna樣品的擴增采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的pcr技術(shù)進(jìn)行。如上所述，引物對中的引物特異于所轉(zhuǎn)化的生物體，使得當(dāng)轉(zhuǎn)基因整合進(jìn)相關(guān)的基因組位置時才會擴增出合適的帶。

本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，各種引物可以用在本發(fā)明的方法中，并且這些引物可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)制備。所用的引物將定義待觀察的或者更經(jīng)常地是檢測的pcr擴增產(chǎn)物的大小。

在一些實施方案中，該方法用于檢測經(jīng)轉(zhuǎn)基因或基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的生物體。在一些實施方案中，該生物體為節(jié)肢動物。在一些實施方案中，該生物體為昆蟲。在一些實施方案中，該生物體屬于鱗翅目、蚤目、雙翅目、膜翅目、鞘翅目、纓翅目、半翅目、直翅目或中氣門目。在另外的實施方案中，該生物體屬于實蠅科、果蠅科、尖尾蠅科、草蠅科、扁口蠅科、蜣蠅科、粗股蠅科或小金蠅科。在優(yōu)選的實施方案中，該生物體屬于實蠅科或果蠅科。在其它實施方案中，該生物體屬于蠟實蠅屬、果蠅屬、果實蠅屬、實蠅屬或繞實蠅屬。在優(yōu)選的實施方案中，該生物體屬于蠟實蠅屬。在特別優(yōu)選的實施方案中，該生物體為地中海實蠅。

在優(yōu)選的實施方案中，該方法采用特異于轉(zhuǎn)化的地中海實蠅。在一些實施方案中，特異于地中海實蠅的引物包括seqidno:2表示的核苷酸序列。在本實施方案中，提供了第一引物對(tg1)、第二引物對(tg2)或第三引物對。tg1由引物tg1-3864attpflr(seqidno:4)和tg1-attpf2,(seqidno:5)組成。在這對引物中，tg1-3864attpflr特異于轉(zhuǎn)基因旁側(cè)基因組dna，tg1-attpf2特異于轉(zhuǎn)基因本身。tg2由seqidno:6和7表示的引物組成。tg2由引物tg2-3864frtflf(seqidno:6)和tg2-frtnhef(seqidno:7)組成。在tg2中，tg2-3864frtflf特異于所插入轉(zhuǎn)基因旁側(cè)的基因組dna，tg2-frtnhef特異于轉(zhuǎn)基因本身。第三引物對由cc3864frttaqf(seqidno:10)和cc3864frttaqr(seqidno:11)組成。在第三引物對中，cc3864frttaqf特異于轉(zhuǎn)基因，cc3864frttaqr特異于旁側(cè)基因組dna。

在其它實施方案中，以上公開的特異于轉(zhuǎn)基因的引物的任何一個可以與特異于旁側(cè)基因組dna的引物的任何一個配對，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，pcr擴增產(chǎn)物的大小將取決于所用的引物對。

在其它實施方案中，用于檢測經(jīng)上述轉(zhuǎn)基因或構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的生物體的方法還包括在擴增步驟期間使用雙標(biāo)記探針。

所整合的轉(zhuǎn)基因和生物體基因組dna接合處的序列代表了唯一指紋。因此，采用三種特異的寡核苷酸檢測唯一接合處是可能的。用在該方法中的兩種寡核苷酸為使得能擴增所插入的轉(zhuǎn)基因和旁側(cè)基因組dna的預(yù)定片段的引物，而第三、雙標(biāo)記寡核苷酸即探針與該預(yù)定片段退火，在一些實施方案中，該探針包括淬滅分子和5'報告分子。

在一些實施方案中，該方法包括以下步驟：讓從生物體獲得的樣品dna與特異于插入生物體基因組的上述轉(zhuǎn)基因的引物對接觸，其中引物對的一個引物特異于該轉(zhuǎn)基因，引物對的另一個引物特異于所插入的轉(zhuǎn)基因旁側(cè)的基因組核苷酸序列，以及擴增該樣品dna。該方法的步驟大致如上所述。探針與引物一起添加至擴增混合物。該探針特異地橫跨所擴增的pcr產(chǎn)物中的轉(zhuǎn)基因與旁側(cè)dna的接合處，需要這種邊界用于陽性輸出。在pcr擴增的每個步驟中，taq聚合酶的5'-3'外切酶活性從退火的探針釋放5'報告分子(fam)，導(dǎo)致在含有整合的轉(zhuǎn)基因的樣品中積累性發(fā)射，這在實時pcr儀器中可檢測。因此，該方法還包括讓dna樣品在該dna樣品的pcr擴增期間與探針接觸的步驟。

在一些實施方案中，該生物體為節(jié)肢動物，優(yōu)選上文已討論的節(jié)肢動物。在優(yōu)選的實施方案中，該生物體為昆蟲，優(yōu)選實蠅科，更優(yōu)選屬于蠟實蠅屬。在特別優(yōu)選的實施方案中，該昆蟲屬于物種地中海實蠅。因此，在這些實施方案中，引物特異于所轉(zhuǎn)化的地中海實蠅。優(yōu)選地，該引物特異于包括seqidno:2表示的序列的地中海實蠅(即ox3864a)。在本實施方案中，使得能擴增預(yù)定片段的引物為分別由seqidno:10和11表示的cc3864frttaqf和cc3864frttaqr。cc3864frttaqf特異于旁側(cè)基因組dna，cc3864frttaqr特異于轉(zhuǎn)基因。在這些實施方案中，探針為cc3864frt探針，如seqidno:12所表示的。

在本發(fā)明的另外方面，提供了生物體的種群控制的方法。在優(yōu)選的實施方案中，該方法包括以上文描述的轉(zhuǎn)基因或構(gòu)建體轉(zhuǎn)化一個或多個生物體的步驟。在一些實施方案中，該方法還包括將所述轉(zhuǎn)化的生物體釋放進(jìn)待控制的種群中。在另外實施方案中，該方法還包括監(jiān)測待控制種群的步驟。所釋放的生物體與待控制種群一起繁育，由該基因表達(dá)系統(tǒng)賦予的雌性特異的致死性意味著通過這種雜交繁育產(chǎn)生的雌性后代將在發(fā)育的早期階段死亡。繼承了該基因表達(dá)系統(tǒng)的雄性后代存活，以將致死表型傳至后續(xù)各代。

在一些實施方案中，該待控制種群為節(jié)肢動物種群。在一些實施方案中，該種群為昆蟲種群。在一些實施方案中，該種群屬于鱗翅目、蚤目、雙翅目、膜翅目、鞘翅目、纓翅目、半翅目、直翅目或中氣門目。在其它實施方案中，該種群屬于實蠅科、果蠅科、尖尾蠅科、草蠅科、扁口蠅科、蜣蠅科、粗股蠅科或小金蠅科。在優(yōu)選的實施方案中，該種群屬于實蠅科或果蠅科。在其它實施方案中，該種群屬于蠟實蠅屬、果蠅屬、果實蠅屬、實蠅屬或繞實蠅屬。在優(yōu)選的實施方案中，該種群屬于蠟實蠅屬。在一些實施方案中，該種群為地中海實蠅種群。

生物體的釋放可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法，例如通過籠子釋放或紙袋釋放，例如simmons等(2011)或harris等(2011)中所描述的那些。

監(jiān)測生物體種群的步驟可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法。在一些實施方案中，插進(jìn)所轉(zhuǎn)化的生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)基因包括基因標(biāo)記物，例如dsred2。因此，對待控制種群的監(jiān)測可以通過在釋放所轉(zhuǎn)化的生物體后捕獲來自該種群的昆蟲，并觀察或更通常是檢測所捕獲種群中的基因標(biāo)記物來進(jìn)行。

現(xiàn)在將參照以下的非限定性實例來闡述本發(fā)明。

實施例

實施例1：主導(dǎo)產(chǎn)品地中海實蠅品系的選擇

采用圖2所示的構(gòu)建體通過piggybac介導(dǎo)的對定居toliman(起源：危地馬拉)的地中海實蠅品系的轉(zhuǎn)化來產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的品系。回交野生型蠅產(chǎn)生多個轉(zhuǎn)基因種系(表1)。對于ox3864獲得49個g0成體(存活率21％)，對于ox3647是950個(35％存活率)。

將這兩種飲食條件下的性別比例用于在兩個關(guān)鍵參數(shù)中評估構(gòu)建體的功能：1)飼喂四環(huán)素時對雌性致死性的總抑制，和2)不存在四環(huán)素時的完全致死性。對種系進(jìn)行篩選，以便基于它們滿足這些參數(shù)的能力和熒光強度進(jìn)一步試驗。

11個種系在單拷貝的該轉(zhuǎn)基因時未能提供完全的外顯率，被舍棄。一個種系證實為不完全的四環(huán)素阻遏，也被舍棄。兩個種系不產(chǎn)生足夠的后代，可能是由于該轉(zhuǎn)基因插入所施加的適合度懲罰，并由此而終止。在產(chǎn)生的所有種系中熒光都是良好的；但是，構(gòu)建體ox3864通常提供更強和更清晰的熒光表型?？稍趫D4f和4g中看到ox3864a和ox3647q成體雄蠅的照片。盡管這兩個品系與wt雄性相比都顯示出可識別的表型，但明顯的是ox3864a熒光表型(+++)強于ox3647q的(++)。

表1.對來自不同ox種系的雄性和雌性的g2存活分析。在與tolimanwt雜交之前合并了四環(huán)素開和四環(huán)素關(guān)的微注射存活者(g0)(或者10個雄性，或者20個雌性)。根據(jù)編號和字母后綴對種系命名(例如ox3647q)，以表示從其收集g1子代的合并池。因為極大數(shù)量的ox3647存活者，所以再次使用了字母系統(tǒng)，并通過該字母后綴之前的括號內(nèi)的編號標(biāo)注，例如ox3647(2)b。將額外的編號給予了來自相同合并池的多個g1子代(例如，ox3647l1、l2)，這些在最初是作為可能的分開的插入事件來處理。單個的轉(zhuǎn)基因g1雄性每個與幾個野生型處女雌性雜交。在含四環(huán)素(t,100μg/ml)或不含四環(huán)素(nt)培養(yǎng)基上，對g2后代按性別進(jìn)行熒光(f)或無熒光(nf)評分。

對所產(chǎn)生的品系的進(jìn)一步分析包括：

·在g2中最初測量為標(biāo)記等位基因分離的單一轉(zhuǎn)基因插入，

·當(dāng)相同種系的雄性和雌性一起雜交時測量為標(biāo)記等位基因分離的純合潛能，

·通過雜交至提供了轉(zhuǎn)座酶來源的品系ox3133對piggybac末端的去除，按照dafa’alla等(2006)描述的方法進(jìn)行。

5個種系顯示出多個插入，3個種系該轉(zhuǎn)基因插入發(fā)現(xiàn)是性別連鎖的。因此，舍棄了全部8個種系。品系ox3864e含有沉默插入(通過旁側(cè)序列分析證實)，被舍棄。所有剩余的品系對于純合潛能而言都是陽性的，因此雜交至地中海實蠅(medfly)品系ox3133，用于piggybac切除(dafa’alla等，2006)。僅品系ox3864a和ox3647q證實完全去除所有的piggybac序列，因而選為可能的產(chǎn)品品系。

然后，通過同系交配衍生ox3864a和ox3647q每一個的純合種系，以產(chǎn)生推測的純合子，通過pcr證實。通過pcr提供piggybac序列的完全去除的進(jìn)一步的證據(jù)(圖3)。如圖3中可看到，沒有piggybac序列存在于品系ox3864a和ox3647q中，如所顯示的，當(dāng)采用4種設(shè)計的用來在piggybac存在于構(gòu)建體中時產(chǎn)生產(chǎn)物的pcr時，所解析的泳道缺乏凝膠產(chǎn)物。為了產(chǎn)生該凝膠，采用purelink基因組dna試劑盒(invitrogen)，按制造商的說明書從單個成體提取基因組dna。采用biotaq(pcrbiosystems)，按制造商的說明書進(jìn)行pcr。pcr條件為：在94℃預(yù)變性2min，接著是10個循環(huán)的4℃15s、60℃30s(每個循環(huán)降低0.5℃)、以及72℃15s，然后25個循環(huán)的94℃15s、55℃30s、72℃15s，最后72℃延伸7min。

采用引物916)attpf2(gtcatgtcggcgaccctacgc；seqidno:5)和td935)diag-5pbmin(gccaccgagtatgaccggtag；seqidno:15)的pcr反應(yīng)產(chǎn)生了圖3插圖a中顯示的凝膠。piggybac基序的存在生成了512bp的dna片段。采用引物td222)diag-pb5(ctgattttgaactataacgaccgcgtg；seqidno:16)和432)amcydiagf(tcacctacgaggacggcgg；seqidno:17)的pcr反應(yīng)產(chǎn)生了圖3插圖b中顯示的凝膠。piggybac基序的存在生成了820bp的dna片段。采用引物td1445)diag6-pb3(gtgccaaagttgtttctgactgac；seqidno:18)和td154)diag-k10-1(cacttaagcgacaagtttggccaac；seqidno:19)的pcr反應(yīng)產(chǎn)生了圖3插圖c中顯示的凝膠。piggybac基序的存在生成了972bp的dna片段。采用引物td1312)diag7-pb3(ccctagaaagataatcatattgtgacg；seqidno:20)和td677)diag2-hr5(catacttgattgtgttttacgcgtag；seqidno:21)的pcr反應(yīng)產(chǎn)生了圖3插圖d中顯示的凝膠，piggybac基序的存在生成了470bp的dna片段。來自ox3864a、ox3647q、未解析的陽性對照ox3647以及兩個陰性對照(wttoliman和水)的pcr產(chǎn)物在帶有smart梯度(eurogentec，從上往下的帶尺寸：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、800bp、600bp、400bp、200bp)的1％凝膠上跑膠。

在插入和切除分析后，進(jìn)一步試驗了品系ox3864a和ox3647q的生活史參數(shù)，與它們的來源toliman野生型品系以及溫度敏感的致死性(tsl)vienna8品系(參照)比較。tsl為遺傳定性品系(geneticsexingstrain)t(y；5)101，也稱為vienna-8(無臂間倒位d53)(caceres,2002)，基因滲入目前在全世界用在很多昆蟲不育技術(shù)(sit)計劃中的tolimanwt。所進(jìn)行的試驗的細(xì)節(jié)在下文給出。圖4中顯示了曲線圖。表2中給出了適合度指數(shù)(fitnessindice)。

壽命

在21℃和相對濕度(r.h.)50％下在6個重復(fù)塑料籠子(9cmx9cmx9cm)中進(jìn)行壽命試驗，每個籠子含有相同基因型的30個雄性和30個雌性(1只昆蟲/8.1cm²)。三只籠子隨機分配給無食物和無水的“壓力”試驗。這用來評估對羽化時可獲得的營養(yǎng)物儲量的相對測量，一個在釋放條件下重要的潛在壽命指示者。剩余的籠子具有充分供應(yīng)的食物和水。每天監(jiān)測籠子，移除死亡成體并辨識性別，直至所有的蠅都死亡，符合fao/iaea/usda指南。

與提供食物和水的那些相比，保持在壓力條件下的蠅具有顯著縮短的生命期(logrank檢驗χ²1＝1307,p<0.001)；所有的壓力蠅在6天內(nèi)死亡(圖4d)。在給予食物和水的非壓力籠子中，基因型對存活有顯著影響(即ridl對比野生型和tsl；χ²3＝15.6,p<0.001；圖4b)。性別對壽命沒有顯著影響(χ²1＝0.17,p＝0.68)，因此組合兩種性別的存活數(shù)據(jù)。在壓力條件下，與wt相比，兩性別中ox3647q都顯示了顯著更高的存活率(均值±標(biāo)準(zhǔn)差：wt＝4.1天±0.054；ox3647q＝4.38天±0.066；cox比例風(fēng)險：z＝-2.1,p＝0.035)。但是，充足食物、非壓力條件下該模式是反轉(zhuǎn)的(wt＝18.9天±0.52；ox3647q＝13.7天±0.53；z＝5.92,p<0.01)。與wt相比，ox3864a和tsl蠅平均生命期無顯著差異，無論是壓力還是非壓力處理(壓力處理:ox3864a＝4.13天±0.055；z＝0.59,p＝0.55,tsl＝4.13天±0.064；z＝0.53,p＝0.33；充足食物，非壓力處理：ox3864a＝17.2天±0.53；z＝1.13,p＝0.26,tsl＝17.0天±0.52；z＝0.7,p＝0.49)。

雌性終身產(chǎn)卵力

從上述的非壓力籠子中，在24小時期間收集卵并在解剖顯微鏡下計數(shù)。然后將卵樣品在濕潤的whatman濾紙(fisherscientific)上孵育，并用封口膜封在培養(yǎng)皿中(每個培養(yǎng)皿200個卵，每個種系一共600個卵)。在收集卵72小時后，打開培養(yǎng)皿并在解剖顯微鏡下檢查，以便對空卵殼和未孵化卵殼計數(shù)并比較。

來自“非壓力”籠子的每個籠子每天的卵產(chǎn)量隨時間顯著下降(重復(fù)測量anova：f1.6,12.9＝253.04,p<0.001)并且基因型有顯著影響(f4.8,12.9＝5.19,p＝0.008)。用bonferroni校正的成對比較揭示，與wt比較，ridl和tsl種系二者終身產(chǎn)生了顯著更少的卵(wt平均終身卵產(chǎn)量＝4315±48.51；ox3864a＝3470±226,p<0.014；ox3647q＝2593±147,p<0.001；tsl＝2465±93.29,p<0.001)。與ox3864a相比，ox3647q和tsl品系也產(chǎn)生了顯著更少的卵(ox3647q對比wt,p<0.001；tsl對比wt,p＝0.005，圖4d)。

通過記錄每天死亡率，也可能估計每只雌性年齡特異的卵產(chǎn)量。與上文一致，也顯示產(chǎn)卵力隨時間顯著下降(重復(fù)測量anova:f1.9,15.2＝131.85,p<0.001)。但是，基因型對這種下降無顯著影響(f5.7,15.2＝2.19,p＝0.104,圖4c)。在峰值產(chǎn)卵力(第10天)時產(chǎn)下的卵的數(shù)量的單因素anova也揭示任何種系之間在每只雌性產(chǎn)卵方面無顯著差異(f3,8＝0.029,p＝0.97)，支持了這一點。

卵孵化率

年齡對孵化率有顯著影響(重復(fù)測量anovaf5,40＝207.3,p<0.001)，基因型也有顯著影響(f15,40＝4.52,p<0.001，圖4e)。用bonferroni校正的成對比較顯示，ox3647q和tsl，而不是ox3864a，具有顯著低于wt的平均卵孵化率百分比(wt＝89.56％±0.84；ox3647q＝79.11％±0.84,p<0.001；tsl＝78.33％±0.84,p<0.001；ox3864a＝87.11％±0.84,p＝0.247)。

成體羽化率

來自每個種系的300個蛹保持單個，并監(jiān)測羽化。在記錄前檢測成體性別和可見的畸形。對未羽化或部分羽化的蛹?xì)び嫈?shù)，并舍棄。

種系間在成體羽化率方面也有顯著差異(anova::f3,10＝9.89,p<0.001)。tukeyhsd事后檢驗揭示，這可主要歸因于與wt相比ox3647q中顯著較低的成體羽化率(wt＝86.1％±0.69；ox3647q＝75.7％±2.43,p<0.01；ox3864a＝84.7％±0.91,p＝0.9；tsl＝81.2％±1.04,p＝0.25)?；蛐蛯Τ审w性別比例有顯著影響(f3,10＝5.06,p＝0.036)，可歸因于ox3647q中而不是其它種系中雄性與雌性性別比例的差異(tukeyhsd事后檢驗：wt＝47％±1.8；ox3647q＝54％±1,p＝0.035；ox3864a＝55％±2.3,p＝0.055；tsl＝50％±1.5,p＝0.83)。

適合度指數(shù)

從各個生活史部分，計算了每只雌性(r0)的凈繁殖率和平均時代時間(g)(從一代到下一代跨雌性繁殖力峰值)(表2)。然后從這些評估衍生每只雌性的適合度指數(shù)(r)。wt的r值為0.195，這等于每只雌性每天平均貢獻(xiàn)0.195只雌性到下一代。其它的種系具有較低的適合度指數(shù)(ox3864a:r＝0.187，ox3647q:r＝0.176，tsl:r＝0.165)。

表2.從生活史數(shù)據(jù)計算的品系ox3864a、ox3647q、野生型和tsl的適合度指數(shù)。

ox3864a和ox3647與野生型toliman蠅的交配競爭力

成體ox3864a、ox3647q、tolimanwt從無tet、低密度(1個幼蟲/0.5g培養(yǎng)基)飼養(yǎng)的幼蟲獲得。在牛津大學(xué)動物學(xué)系(oxford,uk)的溫室內(nèi)構(gòu)建了野外籠子(1.25m高，底部0.5m²)，內(nèi)部放置有小橘子樹(～1m高)，實驗在8月進(jìn)行(日出06.00)，采用自然光和穩(wěn)定的溫度和濕度(25℃，50％r.h.)。來自ox3864a或ox3647q的30個雄性與30個wt雄性在06:30放置在一起，30分鐘后引入30個雌性。

在地中海實蠅中求偶和交尾的基本順序是被充分表征的，遵循獨特的雄性行為模式順序(cayol等，2002)，由“信息素呼叫”和翅膀快速震動組成。在求愛之后，雄性將跳至雌性上，如果發(fā)生了成功的插入，則該對將通常保持靜止。交尾通常持續(xù)90至195分鐘。在插入后從籠子中移除交配對，并小心地引入水平放置的1.5mleppendorf管中。記錄交尾起始時間，并且僅在轉(zhuǎn)移至eppendorf管后該對交配>30分鐘時才將交尾評分為成功的。從數(shù)據(jù)中除去短交尾(<15分鐘)，因為它們經(jīng)常未產(chǎn)生精子轉(zhuǎn)移。該交配實驗在起始后9小時結(jié)束(16:00)或者所有的雌性都已交尾時結(jié)束，以較早者為準(zhǔn)。對交配雄性的鑒別是通過在熒光顯微鏡下是否存在dsred2熒光標(biāo)記物而對雄性評分來確定的。每個種系進(jìn)行10次重復(fù)試驗。分別對ox3864a和ox3647q評估了167和237對配偶。

將相對不育指數(shù)(rsi)用作對雄性性競爭力的衡量(mcinnis等，2002；fao/iaea/usda，2003)。rsi的范圍在0到1之間，rsi為1表示100％的轉(zhuǎn)基因雄性交配，值為0表示100％的wt，0.5表示相等數(shù)量的交配。結(jié)果顯示，相對于wt雄性，轉(zhuǎn)基因品系在都沒有顯示出顯著的競爭力降低(t檢驗:ox3864a:rsi0.46±0.08,t18＝-2.09,ox3864a交配的雄性n＝77，wt交配的雄性n＝90,p＝0.05；ox3647q:rsi0.47±0.09,t18＝-1.72,ox3647q交配的雄性n＝112,wt交配的雄性n＝125,p＝0.1)。

起初與wt或fsridl雄性交配的雌性之間在雌性再交配頻率方面未看到顯著差異(fisher精確檢驗:ox3864a:χ²1＝0.82,n＝40,p＝0.775；7只先與ox3864a雄性交配的雌性再交配，8只先與wt雄性交配的雌性再交配；ox3647q:χ²1＝0,n＝40,p＝1,12只先與ox3647q雄性交配的雌性再交配，12只先與wt雄性交配的雌性再交配)。對于那些先與ridl雄性交配而再交配的雌性而言，第二雄性的基因型對再交配頻率無影響(ox3864a:χ²1＝0.58,p＝0.4(先與ox3864a交配接著與wt再交配的雌性n＝3，與ox3864a再交配的雌性n＝4；先與wt交配接著與wt再交配的雌性n＝5，與ox3864a再交配的雌性n＝3)；ox3647q:χ²1＝0.17,p＝0.5(先與ox3647q交配接著與wt再交配的雌性n＝6，與ox3647q再交配的雌性n＝6，先與wt交配接著與wt再交配的雌性n＝7，與ox3647q再交配的雌性n＝5))。

盡管兩種地中海實蠅品系與tslvienna8品系和wttoliman品系相比都顯示出良好的飼養(yǎng)和交配特征，但品系ox3864a表現(xiàn)超過品系ox3647q，因此選為主導(dǎo)地中海實蠅產(chǎn)品品系。

實施例2：品系ox3864a的分子表征

用于特異鑒定品系ox3864a的基于pcr分析

為了對ox3864a品系進(jìn)行質(zhì)量控制并監(jiān)測野外使用，開發(fā)了事件特異的、基于pcr的核苷酸檢測測定。這種測定的規(guī)程顯示在以下實施例4中，所用的引物描述在表3中。

表3.

每個轉(zhuǎn)基因檢測引物對包括一個在轉(zhuǎn)基因內(nèi)退火的引物和一個在ox3864的旁側(cè)基因組dna內(nèi)退火的引物。因此，只有當(dāng)轉(zhuǎn)基因整合進(jìn)為ox3864描述的基因組位置，才會擴增適當(dāng)大小的帶。引物對tg1和tg2靶向轉(zhuǎn)基因相反末端處的旁側(cè)dna。將擴增內(nèi)源adh基因的片段的引物對用作陽性對照，以確保用在測定中的基因組dna的質(zhì)量。

來自基于pcr測定的結(jié)果顯示在圖5中。ox3864樣品顯示了對tg1和tg2所預(yù)期的591bp和523bp帶，而wt和水樣品為陰性的。所有的基因組樣品都顯示了使用adh引物所預(yù)期的的491bp產(chǎn)物，顯示基因組dna對于pcr擴增有足夠的質(zhì)量。

特異檢測所整合的轉(zhuǎn)基因和旁側(cè)序列的接合處的taqman測定

這種測定被開發(fā)來檢測所整合的轉(zhuǎn)基因與地中海實蠅gdna的接合處的序列，其代表了用于ox3864的獨特指紋。這種測定被開發(fā)為采用3種特異寡核苷酸來檢測一個接合處(表4)。引物中的兩個使得能擴增98bp(52bp的旁側(cè)gdna+46bp的轉(zhuǎn)基因)的片段，第三、雙標(biāo)記的[5’報告物(fam)-3’淬滅物(bhq1)]寡核苷酸即探針與該片段退火。該探針特異地橫跨所擴增的pcr產(chǎn)物中的整合序列與旁側(cè)dna的接合處，需要這種邊界用于陽性輸出。在pcr擴增的每個步驟中，taq聚合酶的5'-3'外切酶活性從退火的探針釋放5'熒光報告物(fam)，導(dǎo)致在帶有ox3864dna的樣品中積累性發(fā)射，這在實時pcr儀器中可檢測到。用在該測定中的引物和探針顯示在表4中。

表4.

品系ox3864a上的質(zhì)粒骨架分析

質(zhì)粒骨架在本品系基因組中的存在通過采用退火至piggybac元件的引物的pcr來核實：

pb5out(ctctggacgtcatcttcacttacgtg)(seqidno:13)和

pb3out(ctcgatatacagaccgataaaacacatgc)(seqidno:14)，如果質(zhì)粒骨架存在，這產(chǎn)生4045bp的片段。結(jié)果顯示在圖6中。在所有試驗的蠅樣品中都證實完全不存在任何質(zhì)粒骨架序列。

品系ox3864a中沉默轉(zhuǎn)基因插入

通過pcr分析研究本品系中沉默插入的可能性。將野生型雄性與ox3864a雜合雌性雜交，反之亦然，比例為1:3(雄性：雌性)。將下一代飼養(yǎng)成蛹，并篩選熒光。將1000個非熒光個體保持在-20并通過pcr分析。

結(jié)果顯示在圖7中。使用用于擴增野生型序列的引物以確保所分析的dna樣品的質(zhì)量。包括摻雜有1只雜合蛹的9只野生型蛹陽性對照，連同陰性對照水。將pcr產(chǎn)物在帶有smart梯度(eurogentec，從上往下的帶尺寸：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、800bp、600bp、400bp、200bp)的1％瓊脂糖凝膠上跑膠。

實施例3：品系ox3864a的野外試驗

與來自地中海地區(qū)的野生地中海實蠅的交配競爭

根據(jù)fao/iaea/usda指南(fao/iaea/usda,2003)，進(jìn)行了各品系和wt雄性競爭性交配wt雌性試驗。為了試驗雄性在雌性中誘導(dǎo)再交配不應(yīng)性的能力，基于它們的最初交配選擇(wt或oxitec雄性)將交配過的雌性分開成40只的兩組，然后在第二天將它們再暴露于相等數(shù)量的wt和oxitec雄性。該過程進(jìn)行3天，針對籠子每天9小時對交配評分。如上文所述，在交配期間將交配對移出，再次通過篩選熒光對雄性進(jìn)行基因分型。為了與野外來源的蠅的交配競爭試驗，從克里特伊拉克利翁省(heraklionprovince,crete)的無殺蟲劑橘子樹收集的受侵襲橘子回收蛹。在羽化后立即將野外來源的成體按性別分開。野外來源的蠅保持在25℃,50％相對濕度(r.h.)10至13天，以達(dá)到性成熟。開始試驗前，讓所有的蠅都適應(yīng)溫室的自然光和溫度條件至少24小時。每個實驗在日出后1小時開始，持續(xù)至少9小時。在克里特大學(xué)(universityofcrete)溫室設(shè)施中進(jìn)行交配試驗。ox3864a交配競爭試驗重復(fù)進(jìn)行7次，評估了89對。

當(dāng)與來自克里特的野外來源地中海實蠅交配時，ox3864a蠅的平均rsi值為0.45±0.13(t檢驗:t12＝-0.9,n＝89,p＝0.38)，在ox3864a和野外來源雄性之間的交配競爭沒有給出顯著差異的證據(jù)。

穩(wěn)定野生型種群的籠內(nèi)抑制

在4個大的野外籠子中建立了穩(wěn)定的wt地中海實蠅種群，隨機選擇兩個籠子作為“處理”籠子，除了向籠子添加正常數(shù)量的蛹之外，還每周釋放大約1500只ridl雄性。該規(guī)程是基于wisedevaldez等人的。該基于溫室的野外籠子每個為8m³，每個含有1.5m高的檸檬樹，被設(shè)置在伊拉克利翁的克里特大學(xué)，利用自然光和穩(wěn)定的溫度和濕度(c.25℃,50％r.h.,)?；\子含有3種食物和水源，以及兩個裝有去離子水的產(chǎn)卵盆(每天清空)，每個帶有兩個40cm²的產(chǎn)卵表面。

在8周期間，通過每周將固定數(shù)量的蛹引入每個籠子建立wt種群(第一周200個，第二周300個，第三周180個，之后的第4至8周230個)。前4周的蛹添加源自wt儲備群，之后所有的蛹添加來自在產(chǎn)卵盆中獲得的卵并在作為蛹再引入野外籠子之前在實驗室以低密度飼養(yǎng)(1只幼蟲/0.5g培養(yǎng)基)。每天從產(chǎn)卵盆對卵數(shù)量計數(shù)，而成體數(shù)量每周計算一次。

在第7周時，籠子隨機的分為處理或?qū)φ?。從?周往后，ridl處理籠子每周接收1700個無tet飼養(yǎng)ox3864a蛹(導(dǎo)致每周添加大約1,500只成體雄性)?；趯\子種群的估計(1500只雄性釋放進(jìn)具有大約220只wt雄性的種群的籠子)以及每周補充比例大概15:1(ox3864a對wt雄性)，這產(chǎn)生了在第8周～7ox3864a雄性對1只wt雄性的最初比例。一旦開始引入ox3864a，讓返回至處理籠子的蛹與其蛹產(chǎn)生速率成比例，而對照籠子為此計算提供穩(wěn)定的每周蛹返回系數(shù)。例如，在第16周從對照籠子回收的蛹的平均數(shù)量為300。因為返回至對照籠子設(shè)置為恒定的每周230個，所以返回至所有籠子的蛹的數(shù)量占所發(fā)育的所有蛹的比例通過(230/300＝0.76)的系數(shù)設(shè)置。例如，在相同周，處理籠子之一產(chǎn)生了一共126個蛹。返回至該籠子的蛹的數(shù)量(采用該系數(shù))因此為96個(126×0.76)。這種方法使得能依賴于產(chǎn)卵量和蛹存活率進(jìn)行動態(tài)蛹返回，并反映了所產(chǎn)卵的數(shù)量和ridl對雌性幼蟲存活率的作用。結(jié)果顯示在圖8中。

與對照籠子中卵產(chǎn)量的持續(xù)穩(wěn)定的速率相比，在處理籠子中到ridl釋放后(pr)7周前觀察到每周卵產(chǎn)量的突然下降，并持續(xù)至22周前最終兩個處理籠子中野生型種群的最終消失(如通過兩周無卵產(chǎn)量來評估的)(圖8a)。這是由于返回的帶有ox3864a轉(zhuǎn)基因的后代的比例在處理籠子中增加，導(dǎo)致雌性種群的快速下降(圖8b)。通過對返回蛹篩選存在dsred2熒光標(biāo)記物(從所有產(chǎn)生的蛹中隨機選擇)來監(jiān)測處理籠子種群中的轉(zhuǎn)基因頻率。在pr8周前處理籠子的返回后代中轉(zhuǎn)基因的頻率為100％(圖8c)，在pr14周前認(rèn)為兩個籠子是滅絕的(滅絕定義為兩個連續(xù)周0卵產(chǎn)量)。

實施例4：ox3864轉(zhuǎn)基因的檢測規(guī)程

該測定用于檢測各種ox3864昆蟲樣品(野外的、大量飼養(yǎng)的以及實驗室的)中是否存在ox3864轉(zhuǎn)基因。該相同規(guī)程也可用于提供ox3864轉(zhuǎn)基因隨時間而穩(wěn)定的證據(jù)。隨時間成功擴增ox3864轉(zhuǎn)基因提供了其穩(wěn)定性的證據(jù)，因為一個引物退火至該轉(zhuǎn)基因，另外的退火至旁側(cè)基因組序列，所以該轉(zhuǎn)基因的變動會導(dǎo)致陰性pcr。

a.材料

purelink基因組提取試劑盒(invitrogen提供)

biotaqdna聚合酶(pcrbiosystems)

c部分描述的引物(由lifetechnologies合成)

10x牛血清白蛋白(bsa,newenglandbiolabs)

smart梯度200bp-10kb(eurogentec)

milli-q去離子純化水

瓊脂糖(webscientific)

tris-乙酸-edta溶液(10xtae)

溴化乙錠

6xgel上樣溶液(包含30％甘油，0.25％溴酚藍(lán))

b.設(shè)備

biometra熱循環(huán)儀(t3000)

gilson移液搶，

槍頭，

96孔微量滴定板或0.2mlpcr管，adhesive蓋板或8孔條狀蓋，

2ml微量離心管，

凝膠電泳槽，電源組，灌膠架和梳子。

紫外線(uv)觀察系統(tǒng)。

c.方法

i.基因組dna的提取

采用以下的規(guī)程(在td/sop/00142中也可找到)，使用invitrogenpurelink基因組提取試劑盒從單個的昆蟲分離基因組dna。

1.根據(jù)每個標(biāo)簽上的說明，向purelink^tm基因組洗滌緩沖液1和purelink^tm基因組洗滌緩沖液2添加96-100％乙醇。充分混合。在標(biāo)簽上標(biāo)記所添加的乙醇。將兩種含有乙醇的洗滌緩沖液保存在室溫。

2.將水浴或恒溫儀設(shè)為55℃。

3.將180μlpurelink^tm基因組消化緩沖液和20μl蛋白酶k添加至腹部池。用無菌研磨棒破碎昆蟲樣品。使用后，在洗滌和高壓滅菌之前將研磨棒置于衛(wèi)康(irkon)杯中至少24小時。確保組織完全浸沒在緩沖液混合物中。

4.在55℃溫浴，不時渦旋振蕩，直至完全裂解(1至4小時)。你可以進(jìn)行消化過夜。

5.為了除去任何顆粒物質(zhì)，室溫下以最大速度離心裂解液3分鐘。將上清液轉(zhuǎn)移至新微粒離心管。

6.向裂解液添加20μlrna酶，通過短暫渦旋振蕩充分混合，并在室溫下溫浴2分鐘。

7.添加200μlpurelink^tm基因組裂解/結(jié)合緩沖液，并通過渦旋振蕩充分混合以得到均一溶液。

8.向裂解液添加200μl的96-100％乙醇。通過渦旋振蕩充分混合以得到均一溶液。裂解/結(jié)合緩沖液和100％乙醇可在添加前混合。

9.取出來自試劑盒的收集管(collectiontube)中的purelink^tm離心柱。向該離心柱添加以purelink^tm基因組裂解/結(jié)合緩沖液和乙醇制備的裂解液(～640μl)。

10.室溫下將該柱以10,000×g離心1分鐘。棄去收集管，將離心柱放進(jìn)試劑盒內(nèi)提供的清潔purelink^tm收集管內(nèi)。

11.向該柱添加用乙醇制備的500μl洗滌緩沖液1。室溫下將該柱以10,000×g離心1分鐘。棄去收集管，將離心柱放進(jìn)試劑盒內(nèi)提供的清潔purelink^tm收集管內(nèi)。

12.向該柱添加用乙醇制備的500μl洗滌緩沖液2。室溫下以最大速度離心該柱3分鐘。棄去流出液并再以10,000xg再旋轉(zhuǎn)1分鐘。

13.將該離心柱置于無菌1.5-ml微量離心管中。向該柱添加100μlpurelink^tm基因組洗脫緩沖液。

14.室溫下溫浴1分鐘。室溫下以最大速度離心該柱1分鐘。

16.取出并棄去該柱。將dna用于希望的下游應(yīng)用或者在4℃(短期)或-20℃(長期)保存該純化的dna。

17.在實驗室記錄本中記下所有細(xì)節(jié)。

ii.pcr規(guī)程

引物來自oxitec目錄；編號指oxitec內(nèi)部引物目錄，由lifetechnologies非現(xiàn)場合成

采用pcrbio聚合酶通過pcr如下擴增轉(zhuǎn)基因特異的和actin4內(nèi)源基因序列：

ox3864轉(zhuǎn)基因引物：

1087)frtnhef(ggtgtggctagctcgaagaagttcctattccgaagttcc；seqidno:7)和1272)3864frtflf(caacgagtgacagcaatgatattccttac；seqidno:6)產(chǎn)生532bp的產(chǎn)物。frtnhef退火至該轉(zhuǎn)基因，而3864frtflf退火至該轉(zhuǎn)基因的旁側(cè)基因組序列。這種引物對僅擴增含有ox3864轉(zhuǎn)基因的樣品。

adh對照引物：

包括進(jìn)引物對以檢查對地中海實蠅基因組dna的擴增，作為內(nèi)部對照。引物為1131)ccadh2rtf(gaaagctgttcgggcttcaggc；seqidno:8)和1132)ccadh2rtr(cttggaggtgatgtcgaatttggtg；seqidno:9)，產(chǎn)生491bp的產(chǎn)物。

按它們在下面出現(xiàn)的順序添加以下成分至微量離心管，制備pcr主混合物(mastermix)(對于樣品數(shù)加額外的1至5個是足夠的，以便允許有移液錯誤)：

將18μl主混合物移液進(jìn)每個pcr管或86孔板的孔中。

添加2μlgdna模板。

模板包括已知的ox3864純合gdna樣品陽性對照(來自大量飼養(yǎng)的儲備，或之前已知為陽性的)、野生型gdna樣品陰性對照和milli-q水陰性對照。

采用以下程序在biometrat3000熱循環(huán)儀上運行pcr：

1.94℃2min

2.94℃15s

3.60℃30s(每個循環(huán)降溫0.5℃)

4.72℃15s轉(zhuǎn)至步驟2x10個循環(huán)

5.94℃15s

6.55℃30s

7.72℃15s轉(zhuǎn)至步驟5x25個循環(huán)

8.72℃7mins

9.4℃保持

將8μl的pcr產(chǎn)物與1.5μl凝膠上樣緩沖液(30％甘油，含0.25％溴酚藍(lán))混合，在1％瓊脂糖凝膠上(見下文)以120v跑膠25分鐘，用于觀察。在凝膠的每一端加樣eurogentecsmart梯度。采用uvitec凝膠觀察系統(tǒng)觀察凝膠并拍照。

iii.瓊脂糖凝膠制備

將1g瓊脂糖與100ml1xtae緩沖液混合，微波溶解約2分鐘，在冷流動水下冷卻30秒，添加1.5μl1％溴化乙錠，然后倒入灌膠架，讓其凝固。

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