本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域并且更具體的是涉及可以被用于抵抗人乳頭瘤病毒類型16的治療性疫苗的核酸構(gòu)建體和多肽。發(fā)明背景人乳頭瘤病毒(hpv)家族由大于100種類型(也稱為亞型)組成，這些類型能夠感染皮膚或黏膜的角質(zhì)細(xì)胞。超過40種類型的hpv典型地通過性接觸進(jìn)行傳播，并且肛殖區(qū)的hpv感染在無論男女中都非常常見。一些性傳播的hpv類型可以引起生殖器疣。持續(xù)感染“高?！毙蚳pv(例如16、18、31、45型)-不同于引起皮膚疣的那些-可以發(fā)展成癌前病變和浸潤性癌，例如宮頸癌、外陰癌、陰道癌、陰莖癌、口咽癌和肛門癌。在感染后的一至兩年內(nèi)，大部分的hpv感染將自發(fā)清除。在健康個(gè)體中，當(dāng)抗原激發(fā)時(shí)，特異性針對hpv-16的病毒早期蛋白e2、e6和e7的循環(huán)的th1-和th2-型cd4+t-細(xì)胞連同e6特異性的cd8+t細(xì)胞遷移到皮膚中，表明針對針對hpv-16感染的成功防御通常與這些病毒早期抗原的系統(tǒng)效應(yīng)t-細(xì)胞應(yīng)答有關(guān)。在小部分(約1％)的感染個(gè)體中，hpv感染持續(xù)，最終導(dǎo)致生殖器腫瘤病變。在高危hpv中，hpv16和hpv18是宮頸癌的主要原因，一起造成了約70％的病例，并且這兩種類型還在其他hpv誘導(dǎo)的癌癥如肛門癌和口咽癌中起到了主要作用。在世界范圍內(nèi)，hpv是引起癌癥的最重要的傳染性病原體之一。抵抗hpv的疫苗接種被視為減少hpv感染發(fā)病率或影響的一種可行策略(凡德伯格(vanderburg)和梅列夫(melief)，2011，免疫學(xué)當(dāng)今觀點(diǎn)(curropinionimmunol)23:252-257)?；谟蒱pv16和18型的蛋白l1(包膜蛋白)所形成的病毒樣顆粒(vlp)的預(yù)防性hpv疫苗在預(yù)防hpv16和hpv18的持續(xù)感染和相關(guān)疾病的方面中非常有效。這些疫苗被認(rèn)為是通過誘導(dǎo)抵抗l1蛋白的中和抗體提供了無菌免疫。添加來自另外的高危hpv類型的基于l1的vlp可以進(jìn)一步增加此類疫苗賦予的保護(hù)寬度。然而，當(dāng)此類疫苗可以預(yù)防初始感染(即，它們引起了預(yù)防)時(shí)，不存在對由hpv16和hpv18引起的已形成的生殖器病變的有益作用的證明，因此它們不被認(rèn)為是抵抗hpv的治療性疫苗(希爾德斯海姆(hildesheim)等人，2007，美國醫(yī)學(xué)會(huì)雜志(jama)298:743-53)。盡管引入了這些預(yù)防性疫苗，但是大量人群已經(jīng)獲得或仍處于獲得持久性高危的hpv感染的風(fēng)險(xiǎn)，并且因此處于患上癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。用于根除已形成的hpv感染和相關(guān)疾病的治療性疫苗是一項(xiàng)緊急未滿足的醫(yī)療需要。已經(jīng)描述了一些解決這項(xiàng)需要的嘗試。例如，已經(jīng)用各種不同的疫苗接種策略進(jìn)行臨床試驗(yàn)，如，由來自牛型結(jié)核菌(mycobacteriumbovis)和hpv-16e7的熱休克蛋白(hsp)組成的或由來自hpv-16和hpv-18的e6、e7和l2的融合蛋白組成的融合蛋白，嵌合的l1-e7vlp，表達(dá)hpv-16和hpv-18的e6和e7或牛乳頭瘤病毒e2的重組牛痘病毒，表達(dá)hpv-16和hpv-18的e6和e7的ctl表位的dna疫苗，分泌hpv-16e7抗原的減活單核細(xì)胞增生李斯特菌(lm)，以及包括hpv-16e6和e7肽的合成長肽(slp)。雖然這些方法中的一些顯示出了一些但有限的臨床療效，但大多數(shù)失敗了，證實(shí)了需要改善當(dāng)前的策略。整合早期hpv蛋白e6和e7是從感染到癌癥的過程中一項(xiàng)必要的步驟，并且針對保持宮頸癌細(xì)胞的腫瘤表型，需要e6和e7的連續(xù)表達(dá)。因此，e6和e7被認(rèn)為是針對治療性疫苗接種的良好的靶標(biāo)。如提到的一些研究已經(jīng)顯示了感染了高危hpv的女性的治療性疫苗接種可以誘導(dǎo)現(xiàn)有病變的消退?？咸貭?kenter)等人顯示了使用衍生自hpv16e6和e7蛋白的slp以及佐劑作為一種治療性疫苗的在患有外陰上皮內(nèi)瘤樣病變(vin)的47％患者中的持久并完全消退(肯特爾(kenter)等人，2009，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志(nengljmed)361:1838-47)。類似地，一項(xiàng)研究，其中在vin2/3患者中將基于蛋白的疫苗(ta-cin，由hpv16e6、e7和l2的融合蛋白組成)與局部免疫調(diào)控結(jié)合，顯示出了在63％患者中的完全消退(戴雅娜(daayana)等人，2010，英國癌癥雜志(brjcancer)102:1129-36)。作為疫苗的合成長肽的可能缺陷包括大規(guī)模的生產(chǎn)及其相關(guān)成本、對潛在反應(yīng)佐劑的需要以及與免疫接種相關(guān)的有關(guān)不良反應(yīng)(尤其是疼痛和腫脹)。由于高度不適，當(dāng)自發(fā)清除率仍然很高的時(shí)候，slp將不可能被用于早期階段疾病。類似地，由于在ta-cin治療的情況下針對局部咪喹莫特治療的需要，耐受性是一個(gè)重要問題，因?yàn)榇蟛糠峙越?jīng)歷了持續(xù)咪喹莫特治療期間的局部或全身性副作用，這可能影響日?；顒?dòng)。一種可能的替代方案是使用基于核酸疫苗接種如編碼用于疫苗接種的hpve6和/或e7蛋白的dna疫苗或病毒疫苗。然而，hpve6和e7蛋白具有致癌的潛力，并且因此由于抗原的拖延表達(dá)的可能性，用包括編碼這些蛋白的核酸的疫苗接種造成了誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的風(fēng)險(xiǎn)。因此，在基因疫苗接種的情況下，可以使用無毒的/脫毒版本的e6和/或e7，以便排除因?yàn)橐呙缃臃N的任何細(xì)胞轉(zhuǎn)化風(fēng)險(xiǎn)。通常通過針對這些蛋白功能已知重要的殘基的缺失和/或取代來獲得野生型e6和e7的致癌潛能喪失(例如，斯馬海爾(smahel)等人，2001，病毒學(xué)(virology)281:231-38；揚(yáng)(yan)等人，2009，疫苗(vaccine)27:431-40；威金(wieking)等人，2012，癌癥基因治療(cancergenether)19:667-74；wo2009/106362)。然而，這些方法的缺點(diǎn)是它們會(huì)帶來從蛋白去除重要t-細(xì)胞表位和/或?qū)⑿碌牟幌Ｍ膖-細(xì)胞表位導(dǎo)入蛋白中，并且因此可能不會(huì)引起所希望的免疫應(yīng)答。在去除hpv16e6和e7的致癌潛能的可替代策略中，已經(jīng)構(gòu)建了e6和e7蛋白的改組版本(即，多肽，其中重新排序野生型蛋白的片段)(例如，奧施拉格等人，2006，疫苗(vaccine)24:2880-93；奧斯特惠斯(oosterhuis)等人，2011，國際癌癥雜志(intjcancer)129:397-406；奧斯特惠斯(oosterhuis)等人，2012，人類基因治療(humgenther)23:1301-12)。然而，這些方法將仍需要生產(chǎn)、配制并且給予多種分子以確保包括e6和e7蛋白的所有可能性表位，這導(dǎo)致了次優(yōu)的邏輯和相對的高成本，并且此外所描述的策略引入了不存在于e6和e7中的潛在強(qiáng)大的非天然表位，并且由于免疫應(yīng)答可以源自與此類非天然表位相關(guān)的e6/e7表位，因此所述構(gòu)建體可以不具有最優(yōu)的免疫學(xué)特性。因此，本領(lǐng)域仍需要抵抗hpv的治療性疫苗，優(yōu)選具有較少上述方法缺點(diǎn)的那些。發(fā)明概述本發(fā)明提供了編碼多肽的核酸分子，該多肽基本上包括hpv16癌蛋白e6和e7的所有可能的t-細(xì)胞表位，然而該核酸分子，通過包括已經(jīng)重新排序的e6和e7蛋白的片段，同時(shí)還包含最小化數(shù)量的不希望的新表位，具有大幅降低的(與wte6和e7相比)直至不能檢測到的轉(zhuǎn)化活性。這是與之前由其他所表示的分子相反。本發(fā)明提供了編碼多肽的核酸分子，該多肽包括如seqidno:1所示的序列。所編碼的多肽可以進(jìn)一步包括前導(dǎo)序列。在某些實(shí)施例中，所編碼的多肽進(jìn)一步包括人乳頭瘤病毒(hpv)e2蛋白的至少一個(gè)表位，例如hpv16e2蛋白?？梢允乖揺2蛋白突變以降低dna結(jié)合，例如通過在它的dna結(jié)合域中的缺失或突變。在某些實(shí)施例中，所編碼的多肽包括如seqidno:3或seqidno:5所示的序列。在某些實(shí)施例中，將該核酸序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，例如，用于人類細(xì)胞中的表達(dá)。在某些實(shí)施例中，該核酸序列包括如seqidno:2、seqidno:4、或seqidno:6中所示的序列。本發(fā)明還提供了一種包括根據(jù)本發(fā)明的核酸分子的載體，其中該編碼多肽的序列可操作地連接至啟動(dòng)子。在某些實(shí)施例中，該載體是dna載體例如質(zhì)粒。在其他實(shí)施例中，該載體是病毒栽體，例如，mva載體或重組腺病毒載體。在某些優(yōu)選的實(shí)施例中，該載體是重組腺病毒。在某些實(shí)施例中，載體中的啟動(dòng)子可操作地偶聯(lián)到阻遏物操縱基因序列上，阻遏蛋白可以結(jié)合至該阻遏物操縱基因序列上，以便在所述阻遏蛋白的存在下阻遏啟動(dòng)子的表達(dá)。在某些實(shí)施例中，該阻遏物操縱基因序列是teto序列或cuo序列。本發(fā)明還提供了疫苗組合物，該疫苗組合物包括根據(jù)本發(fā)明的載體、和藥學(xué)上可接受的賦形劑。本發(fā)明還提供了一種在受試者中誘導(dǎo)抵抗hpv(具體的是hpv16)的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向受試者給予根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物。本發(fā)明還提供了根據(jù)本發(fā)明的疫苗，用于誘導(dǎo)抵抗hpv(具體的是hpv16)的免疫應(yīng)答。在某些實(shí)施例中，向受試者不止一次給予該疫苗。本發(fā)明還提供了一種方法，用于治療受試者的以下任一項(xiàng)：持續(xù)性hpv感染(具體是持續(xù)性hpv16感染)、外陰上皮內(nèi)瘤樣病變(vin)、宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變(cin)、陰道上皮內(nèi)瘤樣病變(vain)、肛門上皮內(nèi)瘤樣病變(ain)、宮頸癌(例如宮頸鱗狀細(xì)胞癌(scc))、口咽癌、陰莖癌、陰道癌或肛門癌，該方法包括向受試者給予根據(jù)本發(fā)明的疫苗。本發(fā)明還提供了根據(jù)本發(fā)明的疫苗，用于治療受試者的以下任一項(xiàng)：持續(xù)性hpv感染(具體是持續(xù)性hpv16感染)、外陰上皮內(nèi)瘤樣病變(vin)、宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變(cin)、陰道上皮內(nèi)瘤樣病變(vain)、肛門上皮內(nèi)瘤樣病變(ain)、宮頸癌(如宮頸鱗狀細(xì)胞癌(scc))、口咽癌、陰莖癌、陰道癌或肛門癌。本發(fā)明還提供了包括如seqidno:1、seqidno:3或seqidno:5所示序列的多肽。附圖簡要說明圖1.hpv16e6和e7的融合蛋白的表達(dá)。將hek-293t細(xì)胞用dna載體進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，該dna載體表達(dá)圖之上所指示的轉(zhuǎn)基因。在轉(zhuǎn)染后24hr，收獲細(xì)胞并且通過sds-page和蛋白質(zhì)印跡法用hpv16e7的抗體(上圖)分析細(xì)胞抽提物。顯示了nf-kb的負(fù)載對照(下圖)確認(rèn)了所有泳道中細(xì)胞裂解物的相似的負(fù)載。分子量標(biāo)記在左側(cè)表明。這些融合蛋白的預(yù)期大?。篹6e7sh約38kda，e2e6e7sh和e6e7e2sh約75kda，lse2e6e7sh約78kda。圖2.軟瓊脂中的菌落形成。a)軟瓊脂測定設(shè)置的示意圖。b)在接種后六周的瓊脂中以細(xì)胞40x放大率的代表性顯微圖像。白色箭頭強(qiáng)調(diào)在e7wt轉(zhuǎn)染細(xì)胞中所觀察到的菌落。c)接種后六周，在瓊脂中使用gelcounttm和相關(guān)的軟件的菌落量化。*：p<0.05(泊松回歸模型)；**：非劣性(具有非劣性界限為5％的廣義線性模型)。圖3.e6e7sh已經(jīng)失去了e6和e7活性。a)代表性蛋白質(zhì)印跡證實(shí)了缺乏e6e7sh對p53的降解。將人類p53失效nci-h1299細(xì)胞用表達(dá)p53的質(zhì)粒連同表達(dá)hpv16e6野生型、e6e7sh的質(zhì)?；蚩蛰d體進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。非-tf表示非轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，制備細(xì)胞裂解物，并且將30μg的總蛋白裝載到凝膠上。上圖-p53染色，中圖-e6染色，下圖-nf-kb染色(裝載對照)。(b)在四種獨(dú)立的測定中p53水平的量化。將該p53信號標(biāo)準(zhǔn)化至nf-κb信號。c)蛋白質(zhì)印跡顯示缺乏e6e7sh對prb的降解。將prb失效saos-2細(xì)胞用表達(dá)prb的質(zhì)粒組合表達(dá)hpv16e7野生型、e6e7sh的質(zhì)?；蚩蛰d體進(jìn)行轉(zhuǎn)染。非-tf表示非轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，制備細(xì)胞裂解物，并且將10μg的總蛋白裝載到凝膠上。上圖-prb染色，中圖-e7染色，下圖-nf-κb染色(裝載對照)。d)在四種獨(dú)立的測定中prb水平的量化。將該prb信號標(biāo)準(zhǔn)化至nf-κb信號。*：p<0.05(anova模型)；**：非劣性(試驗(yàn)是基于源自anova模型的95％ci’s。非劣效性界限被設(shè)為75％)。圖4.e6e7sh不永生化原代人類表皮角質(zhì)形成細(xì)胞。將原代人類表皮角質(zhì)形成細(xì)胞用編碼hpv16(e6e7wt)的野生型e6-和e7-編碼開放閱讀框、e6e7sh序列或egfp的慢病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。非轉(zhuǎn)導(dǎo)供體細(xì)胞被用作對照。如通過約200天的延長壽命和的htert激活(未顯示)所示的，僅有e6e7wt的表達(dá)誘導(dǎo)原代角質(zhì)形成細(xì)胞的永生化。十字架標(biāo)志表示細(xì)胞在衰老過程中死亡并且不能進(jìn)一步培養(yǎng)。關(guān)于詳情，參見實(shí)例2。在兩個(gè)另外的供體中獲得相似的結(jié)果(未顯示)。圖5.在dna免疫之后由e6e7sh誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答-ifnγelispot分析。a.免疫接種方案。將cb6f1小鼠用表達(dá)e6e7sh的dna質(zhì)粒或表達(dá)非轉(zhuǎn)基因的質(zhì)粒(對照)進(jìn)行免疫。免疫接種后兩周，處死小鼠并且用對應(yīng)于e7的15mer肽池刺激分離的脾細(xì)胞過夜。b.給出了以點(diǎn)形成單位(sfu)/106脾細(xì)胞的如通過ifnγelispot測定所測量的個(gè)體小鼠中e7-特異性免疫應(yīng)答。圖6.e6e7sh的免疫原性-ifnγelispot分析。(a).免疫接種方案。將小鼠用具有如所示的插入片段的腺病毒載體進(jìn)行免疫。通過ifnγelispot分析處于兩周(b)和處于八周(c)的e7-特異性應(yīng)答(表示為點(diǎn)形成單位(sfu)/106脾細(xì)胞)。閉環(huán)代表用1*1010vp的劑量進(jìn)行免疫的小鼠，并且開環(huán)代表用5*109vp進(jìn)行免疫的小鼠。黑條代表應(yīng)答的幾何均數(shù)。點(diǎn)狀線表示在elispot測定中的檢測下限。anova事后邦弗朗尼(post-hocbonferroni)統(tǒng)計(jì)分析是在對數(shù)轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)上進(jìn)行的。*：p<0.05。關(guān)于詳情，參見實(shí)例3。圖7.e2e6e7sh的免疫原性-e7-四聚體染色。(a).免疫接種方案。將cb6f1小鼠用1*1010vp的表達(dá)如所表示的轉(zhuǎn)基因的腺病毒載體進(jìn)行免疫。免疫接種后兩周，處死該小鼠并且針對能夠與e749-57-h2-db四聚體(b)相互作用的cd8+細(xì)胞的存在分析分離的脾細(xì)胞。e7-四聚體陽性的cd8+t-細(xì)胞的百分比表示在y軸上。anova事后邦弗朗尼分析是在對數(shù)轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)上進(jìn)行的，在不同的e6e7sh變體之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖8.e2e6e7sh的免疫原性-ifnγelispot分析。(a).免疫接種方案。將cb6f1小鼠用表達(dá)圖b和c下方所表示的轉(zhuǎn)基因的腺病毒載體進(jìn)行免疫。免疫接種后兩周，處死該小鼠并且用對應(yīng)于e2(b)、e6(未顯示)或e7(c)的15mer肽池刺激分離的脾細(xì)胞過夜。以sfu/106脾細(xì)胞給出應(yīng)答。anova事后邦弗朗尼(post-hocbonferroni)統(tǒng)計(jì)分析是在對數(shù)轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)上進(jìn)行的。由僅編碼e2的腺病毒載體所誘導(dǎo)的e2應(yīng)答高于包括e6和e7片段的本發(fā)明多肽所誘導(dǎo)的應(yīng)答。差異對e2與e2e6e7sh和e2與e6e7e2sh是顯著的(*：p<0.05)。anova事后邦弗朗尼(post-hocbonferroni)統(tǒng)計(jì)分析是在對數(shù)轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)上進(jìn)行的。圖9.在免疫的小鼠中的持續(xù)應(yīng)答。(a)免疫接種方案。將cb6f1小鼠用1*1010vp的表達(dá)變體lse2e6e7sh、e2e6e7sh、e6e7sh的ad35載體、或用不表達(dá)轉(zhuǎn)基因的腺病毒載體(空白)進(jìn)行免疫。每兩周取血液樣品以利用四聚體染色確定e7-特異性的cd8+t-細(xì)胞的百分比。(b)免疫接種后兩周的免疫應(yīng)答。包括前導(dǎo)序列的載體誘導(dǎo)了比沒有前導(dǎo)序列的載體更高的應(yīng)答；lse2e6e7sh與e2e6e7sh(*：p<0.05)。(c)應(yīng)答的動(dòng)力學(xué)。anova事后邦弗朗尼(post-hocbonferroni)統(tǒng)計(jì)分析是在第2周數(shù)據(jù)集的對數(shù)轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)上進(jìn)行的。盡管這些結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但相比于沒有e2的分子，由包括e2的分子誘導(dǎo)的e7應(yīng)答傾向于更高。圖10.使用不同的腺病毒載體加強(qiáng)免疫應(yīng)答。(a).免疫接種方案。將cb6f1小鼠用表達(dá)hpv16e2e6e7sh(hpv16-tx)的ad26載體或用不表達(dá)轉(zhuǎn)基因的ad26載體(空白)進(jìn)行免疫。兩周后，用如圖的下方所表示的基于ad35的載體重復(fù)該免疫接種。在第二次免疫接種后四周，處死小鼠并且用血液樣品利用四聚體染色(b)來確定e7-特異性cd8+t-細(xì)胞的百分比。*表示ad26.hpv16-tx/ad35.hpv16-tx與ad26.hpv16-tx/ad35.空白的比較，p<0.05(在對數(shù)轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)上的學(xué)生t-檢驗(yàn)，針對多重比較，α＝0.01)。圖11.在獼猴中的e2e6e7sh的細(xì)胞免疫原性。(a)免疫接種方案。在第0天將獼猴進(jìn)行免疫：通過肌肉注射免疫接種(i.m)八只動(dòng)物獲得了ad26.hpv16-e2e6e7sh并且兩只對照動(dòng)物獲得了ad26.空白。在8周時(shí)給予加強(qiáng)免疫接種(ad26.hpv16-e2e6e7sh或ad26.空白)。在16周，動(dòng)物接受了具有表達(dá)相同e2e6e7sh的ad35載體的第二次加強(qiáng)免疫接種，同時(shí)對照動(dòng)物接受了ad35.空白。腺病毒載體的劑量為1*1011vp/免疫接種。在若干時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行抽血。(b)通過ifnγelispot測量pbmc中的細(xì)胞免疫應(yīng)答。用對應(yīng)于hpv16e2、e6或e7的肽池刺激pbmc，并且描繪在1*106pbmc中點(diǎn)形成單位(sfu)的數(shù)量?？瞻讓φ談?dòng)物(n＝2)顯示了沒有可檢測到的應(yīng)答。關(guān)于詳情，參見實(shí)例4。圖12.表達(dá)hpv16-e2e6e7sh的腺病毒載體的治療效果。(a)tc-1注射和免疫接種方案。在第0天用1*105tc-1細(xì)胞經(jīng)皮下注射cb6f1小鼠。在六天后，當(dāng)腫瘤明顯時(shí)，以在200μl0.9％鹽水(該鹽水補(bǔ)充以5nmolodn1826-cpg(b)或ad26.hpv16-e2e6e7sh(c))的最終體積中的150μg，將小鼠用覆蓋hpv16e6和e7免疫顯性表位(即，hpv16e6，aa41-65(kqqllrrevydfafrdlcivyrdgn；seqidno:18)和hpv16e7aa43-77(gqaepdrahynivtfcckcdstlrlcvqsthvdir；seqidno:19))的兩個(gè)slp進(jìn)行免疫。對照小鼠接收單獨(dú)的cpg(d)或ad26.空白(e)。在第20天，所有的小鼠接收了加強(qiáng)免疫接種。將在初次免疫接種中接收ad26載體的小鼠隨后用對應(yīng)的ad35載體進(jìn)行免疫。如在初次免疫接種中一樣，其他小鼠接收以單獨(dú)的cpg或cpg為佐劑的slp。(b-e)在注射了tc-1的小鼠中的腫瘤測量。腫瘤體積計(jì)算為(寬度2*長度)/2。當(dāng)腫瘤體積超過1000mm3時(shí)，處死小鼠。由于大于20％的重量損失，必須處死小鼠(用星號表示)。(f-g)針對頭35天的圖b和c的一個(gè)特寫。(h)在tc-1注射后的存活。相比于用slp和cpg進(jìn)行免疫的小鼠，用ad.hpv16-e2e6e7sh治療的小鼠的存活顯著增加(對數(shù)秩檢驗(yàn)p<0.05)。在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)(在第92天)，三只用ad.hpv16-e2e6e7sh進(jìn)行免疫的小鼠是無腫瘤的。圖13.攜帶編碼hpvag或lse2e6e7sh的轉(zhuǎn)基因的腺病毒載體顯示了關(guān)于在能夠阻遏轉(zhuǎn)基因表達(dá)的細(xì)胞上的增加的病毒產(chǎn)量。a)針對ad35載體的病毒產(chǎn)量測定。用攜帶編碼gfp-luc或hpvag的轉(zhuǎn)基因的ad35載體感染per.c6、per.c6/cymr、和per.c6/tetr細(xì)胞。用包含cuo或teto的cmv啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)這些轉(zhuǎn)基因。在感染后四天通過基于ad35六鄰體特異性qpcr的方法確定病毒產(chǎn)量。b)針對ad26載體的病毒產(chǎn)量測定。用攜帶編碼gfp-luc、hpvag、或lse2e6e7sh的轉(zhuǎn)基因的ad26載體感染per.c6和per.c6/tetr細(xì)胞，所有這些轉(zhuǎn)基因都通過包含teto的cmv啟動(dòng)子進(jìn)行驅(qū)動(dòng)。在感染后三天通過基于ad26六鄰體特異性qpcr的方法確定病毒產(chǎn)量。關(guān)于詳情，參見實(shí)例6。圖14.在載體生產(chǎn)過程中，使用阻遏轉(zhuǎn)基因表達(dá)的阻遏物系統(tǒng)防止攜帶編碼hpvag的轉(zhuǎn)基因的腺病毒載體中轉(zhuǎn)基因盒的不穩(wěn)定。通過對per.c6或per.c6/cymr細(xì)胞系的dna轉(zhuǎn)染，拯救在cmvcuo的控制下的表達(dá)hpvag的ad35載體。挑選所得的病毒噬斑—每細(xì)胞系五個(gè)—并且用于對各細(xì)胞系的連續(xù)感染循環(huán)。a)在10次病毒傳代后通過pcr分析載體轉(zhuǎn)基因盒區(qū)域的整合。將從per.c6和per.c6/cymr傳代的病毒分離株獲得的pcr產(chǎn)物分別示于中圖和右圖中。通過桑dna格測序分析針對per.c6傳代的病毒分離株1、2、4、和5所獲得的看似全長的pcr產(chǎn)物，以及針對per.c6/cymr傳代的分離株1至5所見到的那些。色譜圖跡線(未顯示)的分析揭示了在per.c6上生長的所有的分離株，而不是在per.c6/cymr上生長的那些，包含在hpvag的編碼序列內(nèi)的移碼小缺失或過早終止突變。b)在七次病毒傳代后分析載體表達(dá)hpvag的能力。用生長在per.c6和per.c6/cymr上的病毒分離株轉(zhuǎn)導(dǎo)a549細(xì)胞，并且通過蛋白質(zhì)印跡法使用hpv16e7-特異性抗體分析hpvag表達(dá)。針對hpvag的預(yù)測大小為83kda。關(guān)于詳情，參見實(shí)例6。發(fā)明詳細(xì)說明本發(fā)明提供了編碼多肽的核酸分子，該多肽包括seqidno:1。該多肽是一種融合多肽，并且有時(shí)在此稱為本發(fā)明的多肽，或本發(fā)明的融合多肽。使用該多肽產(chǎn)生對hpv16的e6和e7蛋白的免疫應(yīng)答，并且因此該核酸分子可以被用作預(yù)防持續(xù)性hpv16感染、以及其相關(guān)疾病的治療性疫苗。本發(fā)明的多肽是一種精心設(shè)計(jì)的分子，該分子事實(shí)上包含以片段形式的hpv16的完整的e6和e7氨基酸序列(它只缺少一個(gè)來自天然hpv16e6蛋白c-端的氨基酸)，該片段是重新排序的并且部分重疊的，這樣使得(實(shí)質(zhì)上)hpv16e6和e7蛋白的所有的t-細(xì)胞表位出現(xiàn)。已經(jīng)由其他人描述了具有一些作為hpv疫苗的潛能的早期分子(例如，肯特爾(kenter)等人2009，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志(nengljmed)361:1838-47；戴雅娜(daayana)等人，2010，英國癌癥雜志(brjcancer)102:1129-36；斯馬海爾(smahel)等人，2001，病毒學(xué)(virology)281:231-38；揚(yáng)(yan)等人，2009，疫苗(vaccine)27:431-40；奧施拉格等人，2006，疫苗(vaccine)24:2880-93；奧斯特惠斯(oosterhuis)等人，2011，國際癌癥雜志(intjcancer)129:397-406；ep1183368，wo2013/083287)，但是這些分子中的每個(gè)具有一個(gè)或多個(gè)缺點(diǎn)。在至少一個(gè)并且典型的是若干方面中，相對于早期描述的方法，本發(fā)明由設(shè)計(jì)師專門設(shè)計(jì)的多肽分子是有利的。具體而言，本發(fā)明的分子和/或載體的優(yōu)點(diǎn)包括：(i)它們具有所希望的安全譜，因?yàn)樵摵怂峋哂写蠓档偷?與天然e6和e7蛋白質(zhì)相比)直到不能檢測到的轉(zhuǎn)化活性；(ii)它們是單一核酸分子，該單核酸分子容易在工業(yè)規(guī)模上以經(jīng)濟(jì)上可行的手段進(jìn)行生產(chǎn)，并且不像多分子方法，不會(huì)造成邏輯上的挑戰(zhàn)；(iii)該編碼多肽基本上包括天然hpv16e6和e7蛋白的所有t-細(xì)胞表位；(iv)編碼多肽的設(shè)計(jì)已經(jīng)最小化所不希望的潛在強(qiáng)大的新表位的引入(即，即不存在于天然e6和e7蛋白的表位)；以及(v)在某些實(shí)施例中，它們不依賴于高度反應(yīng)性的佐劑以提升所希望的免疫應(yīng)答。因此，通過將各種有利特點(diǎn)結(jié)合在單一設(shè)計(jì)中，本發(fā)明的分子代表了一大步邁進(jìn)，并且是主要針對抵抗hpv16的治療性疫苗的優(yōu)秀的候選物。這些分子還可能作為抵抗hpv16的預(yù)防性疫苗，意指它們可能預(yù)防已接種疫苗的受試者的hpv16持續(xù)感染。在某些實(shí)施例中，通過精心設(shè)計(jì)，將針對20種最常見的hla-a等位基因、20種最常見的hla-b等位基因和20種最常見的hla-c等位基因具有<50nm的預(yù)計(jì)結(jié)合親和力的具有九個(gè)氨基酸長度的新表位的數(shù)量最小化至僅一個(gè)。這是超越其他人所描述的構(gòu)建體的一個(gè)顯著改進(jìn)，該改進(jìn)針對單次改組的e6蛋白已經(jīng)包含了超過30個(gè)此類新表位，并且改進(jìn)的構(gòu)建體將高度可能在序列中包括甚至更多的新表位，這些序列附加至這些構(gòu)建體以防止表位的丟失(奧施拉格等人，2006，疫苗(vaccine)24:2880-93)。因此，相比于其他人描述的方法，由于相比于天然e6和e7，改變的免疫應(yīng)答的偶然性已經(jīng)在本發(fā)明的分子中最小化，因此本發(fā)明的構(gòu)建體具有顯著改進(jìn)的免疫學(xué)譜。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用常規(guī)的技術(shù)進(jìn)行核苷酸取代，這些取代不影響多核苷酸編碼的多肽序列，這些多核苷酸被描述以反映有待表達(dá)這些多肽的任何具體的宿主生物體的密碼子使用。因此，除非另外說明，否則“編碼一種氨基酸序列的一種核苷酸序列”包括彼此呈簡并型式且編碼相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。編碼蛋白質(zhì)和rna的核苷酸序列可以包括內(nèi)含子。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，對編碼根據(jù)本發(fā)明的多肽的核酸進(jìn)行密碼子優(yōu)化，以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞、優(yōu)選地人類細(xì)胞中表達(dá)。密碼子優(yōu)化的方法已知并且已經(jīng)在先前描述(例如wo96/09378)。如與一種野生型序列相比，如果至少一個(gè)非優(yōu)選密碼子被更優(yōu)選的密碼子置換，那么認(rèn)為一種序列是密碼子優(yōu)化的。在此，一個(gè)非優(yōu)選密碼子是在一種生物體中不如另一個(gè)編碼相同氨基酸的密碼子經(jīng)常地使用的一個(gè)密碼子，并且一個(gè)更優(yōu)選的密碼子是在一種生物體中比一個(gè)非優(yōu)選密碼子更經(jīng)常地使用的一個(gè)密碼子。對于特定生物體的密碼子使用的頻率可見于密碼子頻率表中，如在http://www.kazusa.or.jp/codon中。優(yōu)選的是多于一個(gè)非優(yōu)選密碼子，例如，超過10％、40％、60％、80％的非優(yōu)選密碼子，優(yōu)選的是最多的(例如，至少90％)或所有非優(yōu)選密碼子，由更優(yōu)選的密碼子替代。優(yōu)選地，在一種生物體中最經(jīng)常使用的密碼子用于一種密碼子優(yōu)化序列。被優(yōu)選的密碼子置換一般引起更高表達(dá)。核酸序列可以使用常規(guī)的分子生物學(xué)技術(shù)克隆，或通過dna合成重新產(chǎn)生，這可以通過在dna合成和/或分子克隆領(lǐng)域具有業(yè)務(wù)的服務(wù)公司(例如基因藝術(shù)公司(geneart)、基斯奎思公司(genscripts)、英杰公司(invitrogen)、歐陸公司(eurofins))使用常規(guī)程序執(zhí)行。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，可以改變蛋白質(zhì)，例如，通過氨基酸取代、缺失、添加、等等，例如使用常規(guī)的分子生物學(xué)程序。一般來說，可以在多肽的功能性或免疫原性沒有損耗地應(yīng)用保守性氨基酸取代。這可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知常規(guī)程序進(jìn)行檢測。在某些實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的編碼的多肽進(jìn)一步包括一種前導(dǎo)序列，又稱為信號序列或信號肽。它是存在于大部分注定去往分泌通路的新合成的蛋白質(zhì)的n-端的短(典型地5-30個(gè)氨基酸長)肽。此種序列的存在可以導(dǎo)致表達(dá)和免疫原性的增加?？梢允褂玫姆窍拗菩詫?shí)例是ige前導(dǎo)肽(參見，例如，us6,733,994；例如具有序列mdwtwilflvaaatrvhs(seqidno:7))或havt20前導(dǎo)肽(例如，具有序列macpgflwalvistclefsma(seqidno:9))。可以將這些中的一個(gè)任選地添加至本發(fā)明多肽的n-端。在其他實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的多肽不包括前導(dǎo)序列。存在不同類型的hpv(已經(jīng)識別了超過120種類型并且以編號進(jìn)行指代)，并且盡管針對某些抗原可能存在一些交叉反應(yīng)性，但是一般針對每種需要被疫苗覆蓋的類型，類型特異性抗原可能需要被摻入疫苗中。類型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73、和82是致癌“高?！钡男詡鞑pv，并且可以導(dǎo)致發(fā)展為以下各項(xiàng)：宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變(cin)、外陰上皮內(nèi)瘤樣病變(vin)、陰道上皮內(nèi)瘤樣病變(vain)、陰莖上皮內(nèi)瘤病變(pin)和/或肛門上皮內(nèi)瘤樣病變(ain)。根據(jù)本發(fā)明的hpv(即，編碼的多肽中的e6和e7片段所源自的hpv)是hpv16。它可以被用于感染有hpv16的患者。在某些實(shí)施例中，它還可以適合與抵抗其他hpv類型的疫苗結(jié)合。在某些實(shí)施例中，該結(jié)合是與如上鑒定的抵抗高危類型的hpv的疫苗結(jié)合，例如與抵抗hpv18的疫苗結(jié)合。在其他實(shí)施例中，本發(fā)明的疫苗與抵抗hpv-18、hpv-31、hpv-33、hpv-35、hpv-39、hpv-45、hpv-51、hpv-52、hpv-56、hpv-58、hpv-59、hpv-68、hpv-73、或hpv-82中的一種或多種的疫苗結(jié)合。例如，如果還不確定hpv感染的具體類型，或如果希望具有預(yù)防作用的免疫應(yīng)答抵抗不止一種hpv類型，那么可以使用此類結(jié)合。還設(shè)想了將本發(fā)明的疫苗與抵抗引起生殖器疣的hpv類型的疫苗的組合，例如hpv6和/或hpv11。這些hpv類型的序列和由其編碼的蛋白(例如e6、e7、e2)可在公用數(shù)據(jù)庫中提供給技術(shù)人員，例如，由國家技術(shù)信息中心(nationalcenterforoftechnologyinformation)(ncbi)所提供的genbank序列數(shù)據(jù)庫。根據(jù)本發(fā)明的多肽包括seqidno:1，并且在一個(gè)實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的核酸分子包括seqidno:2。在此提供了從5’至3’方向的或從n-端至c-端的序列，如本領(lǐng)域中所習(xí)慣的。根據(jù)本發(fā)明的多肽包括hpv16e6和e7蛋白的表位。在某些實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的多肽進(jìn)一步包括(并且因此編碼該多肽的核酸進(jìn)一步編碼)至少一種另外的抗原或此類另外的抗原的一個(gè)或多個(gè)表位。此類另外的抗原優(yōu)選地是hpv抗原，優(yōu)選地是屬于在多肽中作為e6和e7蛋白的相同hpv類型，即，hpv16。因此，此種另外的抗原可以是hpv蛋白或其免疫原片段，并且在某些實(shí)施例中，包括e2蛋白或其包括hpv(優(yōu)選地是hpv16)的e2的至少一個(gè)表位的片段。此類另外的抗原或表位可以內(nèi)置于包括seqidno:1的多肽中的e6和/或e7的兩個(gè)片段之間，但是優(yōu)選是使n-端或c-端融合至包括seqidno:1的e6/e7多肽?？商娲鼗虼送?，可以存在刺激免疫應(yīng)答的氨基酸序列。因此，在某些實(shí)施例中，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的核酸分子，該核酸分子編碼包括seqidno:1的多肽，并且其中該多肽進(jìn)一步包括至少一種其他抗原，例如，hpve2蛋白或其至少一個(gè)表位，但是優(yōu)選是更多個(gè)表位。針對本發(fā)明，添加e2蛋白的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是已知在感染期間/在e6和e7表達(dá)仍然非常低的低度病變中e2是早期表達(dá)的。在向?qū)m頸癌發(fā)展期間，失去了e2表達(dá)并且其結(jié)果是e6和e7水平的提高(湯川村(yugawa)和清野(kiyono)，2009，醫(yī)學(xué)病毒學(xué)評論(revmedvirol)19:97-113)。將來自e2、e6和e7中的表位結(jié)合于一個(gè)疫苗中允許在一個(gè)廣泛標(biāo)靶群體的患者中治療，該患者范圍為患有持續(xù)感染至患有浸潤性宮頸癌(或其他hpv16引起的癌癥)。在某些實(shí)施例中，該e2蛋白是野生型e2蛋白。在某些其他實(shí)施例中，該e2蛋白在其dna結(jié)合域中具有已缺失或一個(gè)或多個(gè)突變(相比于野生型e2蛋白)。hpv16e2蛋白的序列(np_041328.1)可以發(fā)現(xiàn)于ncbi蛋白數(shù)據(jù)庫中(www.ncbi.nlm.nih.gov/protein)在編號np_041328.1下。已知該蛋白的c-端部分中的e2中若干單個(gè)氨基酸變化例如g293v、k299m、或c300r廢止了dna結(jié)合。使用缺少dna結(jié)合能力的e2的變體或片段的優(yōu)點(diǎn)是它能夠在其表達(dá)的細(xì)胞中通過直接結(jié)合至宿主細(xì)胞dna防止不可預(yù)測的轉(zhuǎn)錄變化。可以內(nèi)部添加該e2蛋白或其部分或片段，但是優(yōu)選的是添加至具有seqidno:1的本發(fā)明的多肽的n-端或c-端。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的核酸分子編碼包括seqidno:3的多肽。在其一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的核酸分子包括seqidno:4。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的核酸分子編碼包括seqidno:5的多肽。在其一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的核酸分子包括seqidno:6。還可以進(jìn)一步使本發(fā)明由設(shè)計(jì)師專門設(shè)計(jì)的多肽與另外的蛋白融合，例如，所謂的載體蛋白，例如鈣網(wǎng)蛋白、結(jié)核分枝桿菌熱休克蛋白-70、ip10、或破傷風(fēng)毒素片段c(參見奧斯特惠斯(oosterhuis)等人，人類基因治療(humangenether)，2012，見上文，如需更多實(shí)例)，這些另外的蛋白可以進(jìn)一步提高對hpve6和e7(和任選地e2)表位的免疫應(yīng)答。因此本發(fā)明還提供了此類另外的融合蛋白，以及對其進(jìn)行編碼的核酸。在某些實(shí)施例中，將根據(jù)本發(fā)明的核酸分子摻入載體中。如在此使用的“載體”典型地是人工運(yùn)載外源遺傳物質(zhì)到另一個(gè)細(xì)胞中的運(yùn)載體，其中可以對它進(jìn)行復(fù)制和/或表達(dá)，并且根據(jù)本發(fā)明它可以是任何包括根據(jù)本發(fā)明核酸分子的核酸分子。這些可以通過常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)例如克隆進(jìn)行制備。典型地，此類載體可以在至少一種類型的適合宿主中進(jìn)行繁殖，例如細(xì)菌、酵母菌、昆蟲細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、以及類似物。載體的四種主要類型是質(zhì)粒、病毒載體、粘粒、和人工染色體。該載體本身一般是由插入片段(轉(zhuǎn)基因，在本發(fā)明中編碼本發(fā)明融合多肽的核酸)和序列(該序列作為載體的“骨架”)組成的dna序列。轉(zhuǎn)移遺傳信息至另一個(gè)細(xì)胞的載體的目的典型地是為了分離、擴(kuò)增、或表達(dá)靶細(xì)胞中的插入片段。優(yōu)選的是，編碼多肽的序列可操作地連接至載體中的啟動(dòng)子。術(shù)語“可操作地連接”意指感興趣的核苷酸序列以一種方式連接至啟動(dòng)子，該方式允許該核苷酸序列(例如，當(dāng)該載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)，在宿主細(xì)胞中)表達(dá)。表達(dá)調(diào)節(jié)序列可以可操作地連接至轉(zhuǎn)基因上。在某些實(shí)施例中，設(shè)計(jì)載體用來在靶細(xì)胞中表達(dá)轉(zhuǎn)基因，并且該載體一般具有驅(qū)動(dòng)該轉(zhuǎn)基因表達(dá)的啟動(dòng)子序列。在某些實(shí)施例中，可以存在常規(guī)使用的載體元件(例如轉(zhuǎn)錄終止子序列、聚腺苷尾序列、kozak序列、utr、復(fù)制原點(diǎn)、多克隆位點(diǎn)、遺傳標(biāo)記、抗生素抗性、和另外的序列)中的一種或多種，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員可以設(shè)計(jì)一種載體，這樣使得其具有所希望的性質(zhì)，例如用于在某些細(xì)胞中復(fù)制以繁殖并擴(kuò)增載體，并且在引入該載體的靶細(xì)胞中用于載體中的轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。包括編碼根據(jù)本發(fā)明的融合多肽的核酸的載體，優(yōu)選的是被設(shè)計(jì)用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的載體，適于作為根據(jù)本發(fā)明的疫苗。在某些實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的載體是一種質(zhì)粒、粘粒、酵母人工染色體、細(xì)菌人工染色體、病毒載體、或諸如此類。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員知道不同的啟動(dòng)子可以用于獲得宿主細(xì)胞中一種基因的表達(dá)。在真核細(xì)胞中用于表達(dá)的一些熟知的并且常用的啟動(dòng)子包括源自病毒的啟動(dòng)子，如腺病毒，例如e1a啟動(dòng)子；源自巨細(xì)胞病毒(cmv)的啟動(dòng)子，如cmv立即早期(ie)啟動(dòng)子(在此稱為cmv啟動(dòng)子)(例如可從pcdna獲得，英杰公司(invitrogen))，源自猿猴病毒40(sv40)的啟動(dòng)子(例如可從pires獲得，目錄號631605，bd科學(xué))；以及類似物。適合的啟動(dòng)子還可以源自真核細(xì)胞，如金屬硫蛋白(mt)啟動(dòng)子、延長因子1α(ef-1α)啟動(dòng)子、泛素c或ub6啟動(dòng)子、肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、免疫球蛋白啟動(dòng)子、熱休克啟動(dòng)子、以及類似物(參見例如wo2006/048459)。用于獲得在真核細(xì)胞中的表達(dá)的一種適合的啟動(dòng)子的一個(gè)非限制性實(shí)例是一種cmv-啟動(dòng)子(us5,385,839)，例如cmv立即早期啟動(dòng)子，例如包括來自cmv立即早期基因增強(qiáng)子/啟動(dòng)子的nt.-735到+95，例如如在此所提供的具有如seqidno:13所示的序列的cmv啟動(dòng)子。一種聚腺苷酸化信號，例如牛生長激素polya信號(us5,122,458)可以存在于該(這些)轉(zhuǎn)基因后面。還可以添加其他調(diào)節(jié)序列。在此可以將術(shù)語“調(diào)節(jié)序列”與“調(diào)節(jié)元件”互換地使用，并且是指核酸的區(qū)段，典型地但不限于dna，該核酸的區(qū)段調(diào)節(jié)它可操作地連接的核酸序列的轉(zhuǎn)錄，并且因此作為轉(zhuǎn)錄調(diào)諧子。調(diào)節(jié)序列通常包括作為轉(zhuǎn)錄結(jié)合域的核酸序列，該轉(zhuǎn)錄結(jié)合域被轉(zhuǎn)錄蛋白和/或轉(zhuǎn)錄因子、增強(qiáng)子或阻遏物等等的核酸結(jié)合域進(jìn)行識別。例如，可能使阻遏物序列與啟動(dòng)子可操作地偶聯(lián)，該阻遏物序列可以被阻遏蛋白限制，該阻遏蛋白可以降低或阻止表達(dá)該阻遏蛋白的生產(chǎn)細(xì)胞系中的轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。當(dāng)傳代時(shí)和/或當(dāng)其在生產(chǎn)細(xì)胞系中大量生產(chǎn)時(shí)，這可以改進(jìn)核酸分子的遺傳穩(wěn)定性和/或表達(dá)水平。本領(lǐng)域已經(jīng)描述了此類系統(tǒng)。例如，調(diào)節(jié)序列可以包括一種或多種四環(huán)素操縱基因操縱基因序列(teto)，這樣使得在四環(huán)素操縱基因阻遏蛋白(tetr)存在下抑制表達(dá)。在不存在四環(huán)素下，該tetr蛋白能夠結(jié)合至teto位點(diǎn)并且阻遏可操作地連接至teto位點(diǎn)的基因的轉(zhuǎn)錄。然而，在四環(huán)素的存在下，tetr蛋白質(zhì)中構(gòu)象變化阻止其結(jié)合至操縱基因序列，允許發(fā)生可操作連接的基因的轉(zhuǎn)錄。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的核酸分子，例如當(dāng)存在于重組腺病毒載體中，可以任選地包括可操作地連接至啟動(dòng)子的teto，這樣使得在重組腺病毒中抑制了一種或多種轉(zhuǎn)基因的表達(dá)，這些重組腺病毒產(chǎn)生在表達(dá)tetr蛋白的生產(chǎn)細(xì)胞系中。隨后，如果將重組腺病毒引入受試者或不表達(dá)tetr蛋白的細(xì)胞中，那么將不能抑制表達(dá)(例如，國際專利申請wo07/073513)。在某些其他實(shí)施例中，本發(fā)明的核酸分子，例如當(dāng)存在于重組腺病毒中時(shí)，可以任選地包括cumate基因開關(guān)系統(tǒng)，其中調(diào)節(jié)表達(dá)是通過將阻遏物(cymr)結(jié)合至操縱基因位點(diǎn)(cuo)，置于啟動(dòng)子下游進(jìn)行介導(dǎo)(例如，穆立克(mullick)等人，bmc生物技術(shù)(bmcbiotechnol.)20066:43)。在此使用的，術(shù)語“阻遏物”是指具有抑制、干擾、延遲和/或阻遏重組表達(dá)載體的異源蛋白產(chǎn)物的產(chǎn)生的能力的實(shí)體(例如，蛋白或其他分子)。例如，通過干擾表達(dá)載體中(如在表達(dá)盒中)處于適當(dāng)位置的結(jié)合位點(diǎn)。阻遏物的實(shí)例包括tetr、cymr、乳糖阻遏物、trp阻遏物、半乳糖阻遏物、λ阻遏物、以及其他本領(lǐng)域中已知的適當(dāng)?shù)淖瓒粑?。在此提供了使用teto/tetr操縱基因/阻遏物系統(tǒng)和使用cuo/cymr操縱基因/阻遏物系統(tǒng)的實(shí)例。阻遏在載體繁殖期間載體轉(zhuǎn)基因表達(dá)可以防止轉(zhuǎn)基因的不穩(wěn)定性，并且可以在生產(chǎn)期間增加具有本發(fā)明轉(zhuǎn)基因的載體的產(chǎn)量。因此，在一些實(shí)施例中，本發(fā)明載體具有一種啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子可以通過阻遏蛋白的結(jié)合被阻遏，例如通過具有可操作地偶聯(lián)到阻遏物操縱基因序列上的啟動(dòng)子(例如，在非限制性實(shí)施例中，一種包含teto的序列，例如表示為seqidno:11的一個(gè)序列，或者包含cuo的序列，例如例如表示為seqidno:12的一個(gè)序列)，阻遏蛋白(例如，tetr蛋白，例如具有表示為seqidno:15的氨基酸序列，或著cymr蛋白，例如具有表示為seqidno:17的氨基酸序列)可以結(jié)合至該阻遏物操縱基因序列。在某些實(shí)施例中，該載體是質(zhì)粒dna分子，或其片段。這些可以用于dna疫苗接種。其他平臺可以用作載體，例如減毒活雙缺失的單核細(xì)胞增生李斯特菌菌株。在其他實(shí)施例中，該載體是重組病毒載體，該重組病毒載體可以是可復(fù)制型或復(fù)制缺陷型的。在某些實(shí)施例中，一種病毒載體包括重組dna基因組。在某些實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的載體例如是重組腺病毒、重組反轉(zhuǎn)錄病毒、重組痘病毒如牛痘病毒(例如修飾的安卡拉痘苗(mva))、重組α病毒如塞姆利基森林病毒、重組副粘病毒，如重組麻疹病毒、或其他重組病毒。在某些實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的載體是mva載體。在優(yōu)選的實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的載體是重組腺病毒。腺病毒用作疫苗的優(yōu)點(diǎn)包括操作簡單、優(yōu)良的大規(guī)?？芍圃煨浴⒁约傲己玫陌踩涗?，該良好的安全記錄基于使用已經(jīng)報(bào)道過的多種腺病毒載體在研究、開發(fā)、生產(chǎn)和臨床試驗(yàn)中的多年經(jīng)驗(yàn)。被用作疫苗的腺病毒載體通常提供了對轉(zhuǎn)基因所編碼的蛋白的良好的免疫應(yīng)答，該免疫應(yīng)答包括細(xì)胞免疫應(yīng)答。根據(jù)本發(fā)明的腺病毒載體可以基于任何類型的腺病毒，并且在某些實(shí)施例中，是可以為任何血清型的人類腺病毒。在其他實(shí)施例中，它是一種猿猴腺病毒，如可以為任何血清型的黑猩猩或大猩猩腺病毒。在某些實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的載體是人類腺病毒血清型5、26或35的。重組腺病毒載體的制備在本領(lǐng)域中是熟知的。在某些實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的腺病毒載體在腺病毒基因組的e1區(qū)域(例如，e1a區(qū)域和/或e1b區(qū)域)的至少一個(gè)必需基因功能中是有缺陷的，e1區(qū)域?qū)儆趯Σ《緩?fù)制的必需腺病毒基因組。在某些實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的腺病毒載體在非必須e3區(qū)域的至少部分中是有缺陷的。在某些實(shí)施例中，該載體在e1區(qū)域的至少一個(gè)必需基因功能中以及在非必須e3區(qū)域的至少部分中是有缺陷的。腺病毒載體、其構(gòu)建方法和其繁殖方法是本領(lǐng)域所熟知的，并且被描述于，例如，美國專利號5,559,099、5,837,511、5,846,782、5,851,806、5,994,106、5,994,128、5,965,541、5,981,225、6,040,174、6,020,191、和6,113,913，和托馬斯申克(thomasshenk)，“(腺病毒及其復(fù)制)adenoviridaeandtheirreplication”，m.s.霍維茨(horwitz)，“腺病毒(adenoviruses)”，分別第67和68章，在病毒學(xué)(virology)中，b.n.菲爾茨(fields)等人，編輯，第3版，雷文出版社有限公司(ravenpress,ltd.)，紐約(1996)，以及在此提及的其他參考資料。典型地，腺病毒載體的構(gòu)建涉及使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物技術(shù)，如在以下描述的那些，例如，薩姆布魯克(sambrook)等人，分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(molecularcloninga,laboratorymanual)，第2版，冷泉港出版社(coldspringharborpress)，冷泉港，紐約，(1989)，沃森(watson)等人，重組dna(recombinantdna)，第2版，科學(xué)美國人書刊(scientificamericanbooks)(1992)，和奧蘇貝爾(ausubel)等人，分子生物學(xué)現(xiàn)代方法(currentprotocolsinmolecularbiology)，威利國際科學(xué)出版社(wileyintersciencepublishers)，紐約(1995)，和在此提及的其他參考資料。針對重組腺病毒的具體優(yōu)選的血清型是人類血清型35或人類血清型26。例如在wo2007/104792中和在阿賓克(abbink)等人，2007病毒學(xué)(virology)81:4654-63中描述了rad26載體的制備。ad26的示例性基因組序列發(fā)現(xiàn)于genbank登錄號ef153474中和wo2007/104792的seqidno:1中。例如，在美國專利號7,270,811中、在wo00/70071中、和在沃格爾(vogels)等人，2003，病毒學(xué)雜志(jvirol)77:8263-71中，描述了rad35載體的制備。ad35的示例性基因組序列發(fā)現(xiàn)于genbank登錄號ac_000019中和wo00/70071的圖6中。在某些實(shí)施例中，該腺病毒是復(fù)制缺陷的，例如，因?yàn)樗诨蚪M的e1區(qū)域中的缺失。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，在缺失來自腺病毒基因組的必須區(qū)域的情況下，由這些區(qū)域編碼的功能必須由菌株反式提供，優(yōu)選的是由生產(chǎn)細(xì)胞提供，即，當(dāng)e1、e2和/或e4區(qū)域的部分或全部從腺病毒中刪除時(shí)，這些必須存在于生產(chǎn)細(xì)胞中，例如整合到其基因組中，或以所謂的輔助腺病毒或輔助質(zhì)粒形式。這些腺病毒還可以具有在e3區(qū)域中的缺失，該缺失針對復(fù)制是非必要的，并且因此不必補(bǔ)充此種缺失?？梢允褂玫纳a(chǎn)細(xì)胞(有時(shí)在本領(lǐng)域中以及在此還稱為‘包裝細(xì)胞’或‘補(bǔ)充細(xì)胞’)可以是任何生產(chǎn)細(xì)胞，其中可以繁殖所希望的腺病毒。例如，在生產(chǎn)細(xì)胞中完成重組腺病毒載體的繁殖，該生產(chǎn)細(xì)胞補(bǔ)充了腺病毒中的缺陷。此類生產(chǎn)細(xì)胞優(yōu)選在其基因組中具有至少一個(gè)腺病毒e1序列，并且從而能夠補(bǔ)充在e1區(qū)域中具有缺失的重組腺病毒?？梢允褂萌魏窝a(bǔ)充e1的生產(chǎn)細(xì)胞，如由e1永生化的人類網(wǎng)膜細(xì)胞，例如911或per.c6細(xì)胞(參見美國專利5,994,128)、e1轉(zhuǎn)化的羊水細(xì)胞(參見歐洲專利1230354)、e1轉(zhuǎn)化的a549細(xì)胞(參見例如wo98/39411，美國專利5,891,690)、gh329：海拉細(xì)胞(高(gao)等人，2000，人類基因治療(humgenether)11:213-19)、293、以及類似物。在某些實(shí)施例中，這些生產(chǎn)細(xì)胞是，例如，hek293細(xì)胞、或per.c6細(xì)胞、或911細(xì)胞、或it293sf細(xì)胞等。在(科夫斯迪(kovesdi)等人，2010，病毒2:1681-703)中評論了生產(chǎn)細(xì)胞中腺病毒載體的生產(chǎn)。在某些實(shí)施例中，e1缺陷的腺病毒包括亞組c的腺病毒(ad5)的e4-orf6編碼序列。這允許在表達(dá)ad5的e1基因的熟知的補(bǔ)充細(xì)胞系中此類腺病毒的繁殖，如例如293細(xì)胞或per.c6細(xì)胞(參見，例如哈文格(havenga)等人，2006，普通病毒學(xué)雜志(jgenvirol)87:2135-43；wo03/104467，將其通過引用以其全文結(jié)合在此)。在本發(fā)明的載體中“異源核酸”(在此還稱為‘轉(zhuǎn)基因’)是非天然存在于載體中的核酸，并且根據(jù)本發(fā)明，編碼本發(fā)明融合多肽的核酸當(dāng)存在于載體中時(shí)被認(rèn)為是異源核酸。例如，通過標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)將其引入載體中。例如，可以將其克隆至腺病毒載體的缺失的e1或e3區(qū)域，或在e4區(qū)域和ritr之間的區(qū)域中。一種轉(zhuǎn)基因通常可操作地連接到表達(dá)控制序列。在優(yōu)選的實(shí)施例中，將轉(zhuǎn)基因克隆至腺病毒載體的e1區(qū)域中?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的各種方法進(jìn)行載體的生產(chǎn)，如dna載體、或重組腺病毒載體。一般來說，生產(chǎn)需要在培養(yǎng)細(xì)胞中繁殖來產(chǎn)生大量的載體材料，隨后從細(xì)胞培養(yǎng)物中獲得載體，并且典型的是隨后進(jìn)一步純化載體以去除其他物質(zhì)并且獲得純化的載體，可以將該載體配制到藥用組合物中(例如，霍根森(hoganson)等人，2002，生物工藝雜志(bioprocessingj)1:43-8；埃文斯(evans)等人，2004，藥物科學(xué)雜志(jpharmsci)93:2458-75)。例如，用于從生產(chǎn)細(xì)胞的培養(yǎng)物中獲得腺病毒的方法已經(jīng)例如廣泛描述于wo2005/080556中。例如wo2010/060719、和wo2011/098592，二者通過引用結(jié)合在此，描述了用于獲得并純化大量重組腺病毒的適合的方法。在某些方面，本發(fā)明還提供了由根據(jù)本發(fā)明所述的核酸分子編碼的多肽。此種多肽包括seqidno:1。在某些實(shí)施例中，此種多肽可以包括seqidno:3或seqidno:5。此種多肽的特征如上所述。此種多肽可以例如直接用作抵抗hpv的疫苗。本發(fā)明進(jìn)一步提供了包括根據(jù)本發(fā)明的核酸分子、載體或多肽的疫苗，其中針對這些方面中的每個(gè)的實(shí)施例可以包括如以上所描述的那些。在優(yōu)選的實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明所述的疫苗包括根據(jù)本發(fā)明的所述的核酸分子。在本發(fā)明的其他優(yōu)選實(shí)施例中，該疫苗包括根據(jù)本發(fā)明所述的載體，優(yōu)選是dna載體、mva載體、或重組腺病毒載體。在某些實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明所述的疫苗進(jìn)一步包括活性成分，例如，編碼不同于hpv16的至少一種hpv類型的e6和/或e7蛋白的至少一個(gè)表位的核酸，例如高危的hpv類型如hpv18、hpv-31、hpv-33、hpv-35、hpv-39、hpv-45、hpv-51、hpv-52、hpv-56、hpv-58、hpv-59、hpv-68、hpv-73、或hpv-82。術(shù)語“疫苗”是指一種試劑或組合物，該試劑或組合物包含在受試者中有效誘導(dǎo)預(yù)防程度和/或治療程度的免疫性抵抗某種病原體或疾病的活性組分，在此是治療性地針對hpv。根據(jù)本發(fā)明，該疫苗典型地包括核酸分子、或載體、以及藥學(xué)上可接受的賦形劑。當(dāng)向受試者給予的時(shí)候，由根據(jù)本發(fā)明的核酸分子所編碼的多肽將在該受試者中表達(dá)，該表達(dá)將導(dǎo)致對存在于該多肽中的e6和/或e7抗原片段的免疫應(yīng)答。瞬時(shí)分子(instantmolecule)的優(yōu)點(diǎn)是hpv16e6和e7的基本上所有t-細(xì)胞表位是存在的，并且因此存在于野生型e6或e7中的任何表位的t-細(xì)胞應(yīng)答可以配備到疫苗中。此外，針對根據(jù)本發(fā)明的核酸分子該疫苗具有如上所述的安全性和有效性的優(yōu)點(diǎn)。針對向人給予，本發(fā)明可以使用包括載體和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑的藥用組合物。在本上下文中，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”意指該載劑或賦形劑在所采用的劑量和濃度下不會(huì)在它們給予的受試者中引起任何不必要或不良的影響。這些藥學(xué)上可接受的賦形劑是本領(lǐng)域中眾所周知的(參見雷明登氏制藥科學(xué)(remington’spharmaceuticalsciences)，第18版，a.r.熱納羅(gennaro)編，馬克出版社(mackpublishingcompany)[1990]；肽和蛋白質(zhì)的醫(yī)藥配制品發(fā)展(pharmaceuticalformulationdevelopmentofpeptidesandproteins)，s.弗羅加爾(frokjaer)和l.霍夫高(hovgaard)編，泰勒弗朗西斯集團(tuán)(taylor&francis)[2000]；以及醫(yī)藥賦形劑手冊(handbookofpharmaceuticalexcipients)，第3版，a.凱博(kibbe)編，英國醫(yī)藥出版社(pharmaceuticalpress)[2000])。賦形劑通常是用藥物的活性成分配制的、藥學(xué)上無活性的物質(zhì)。賦形劑通常被用來增大包含有效活性成分(因此通常稱為“膨脹劑”、“填料”、“稀釋劑”)的配制品，以允許當(dāng)生產(chǎn)劑型時(shí)方便并準(zhǔn)確的分配藥品。它們還可以服務(wù)各種增強(qiáng)治療的目的，如促進(jìn)藥物吸收或溶解、或其他藥物動(dòng)力學(xué)考慮。賦形劑還可以在制造過程中使用，除幫助體外穩(wěn)定性如在預(yù)期的保質(zhì)期中防止變性以外，還來幫助處理所關(guān)心的活性物質(zhì)如通過促進(jìn)粉末流動(dòng)性或不黏性。適當(dāng)?shù)馁x形劑的選擇還取決于給予途徑和劑型，連同活性成分及其他因素。盡管還可以運(yùn)用凍干制品，但該純化的核酸分子、載體或多肽優(yōu)選地是作為一種無菌溶液進(jìn)行配制和給予。無菌溶液是通過無菌過濾或通過本領(lǐng)域中自身已知的其他方法制備。這些溶液接著凍干或填充到醫(yī)藥劑量容器中。溶液的ph值一般在ph3.0到9.5的范圍內(nèi)，例如ph5.0到7.5。該核酸分子或載體或多肽典型地是在具有適合緩沖液的溶液中，并且該載體的溶液還可以包含一種鹽。任選地穩(wěn)定劑可以存在，如白蛋白。在某些實(shí)施例中，添加清潔劑。在某些實(shí)施例中，疫苗可以被配制為可注射制品。這些配制品包含有效量的核酸分子、載體或多肽(這些有效量的核酸分子、載體或多肽是無菌液體溶液、液體懸浮液或凍干的版本)，并且可任選地包含穩(wěn)定劑或賦形劑。例如，重組腺病毒載體可以儲存于緩沖液中，該緩沖液還可以用于腺病毒世界標(biāo)準(zhǔn)(adenovirusworldstandard)(霍根森(hoganson)等人，2002，生物工藝雜志(bioprocessingj)1:43-8)：20mmtrisph8，25mmnacl，2.5％甘油。適用于向人類給予的另一種有用的配制品緩沖液是20mmtris、2mmmgcl2、25mmnacl、蔗糖10％w/v、聚山梨酯-800.02％w/v。適用于重組腺病毒的另一種配制品緩沖液包括10-25mm檸檬酸鹽緩沖液ph5.9-6.2，4％-6％(w/w)羥丙基-β-環(huán)糊精(hbcd)、70-100mmnacl、0.018％-0.035％(w/w)聚山梨酯-80、以及任選地包括0.3％-0.45％(w/w)乙醇。顯而易見地，可以使用許多其他緩沖液，并且已知針對存儲和針對純化載體的藥用給予的適合的配制品的若干實(shí)例。在某些實(shí)施例中，包括載體的組合物進(jìn)一步包括一種或多種佐劑。佐劑在本領(lǐng)域中已知來進(jìn)一步提高對一種所施加的抗原決定簇的免疫應(yīng)答。術(shù)語“佐劑”和“免疫刺激劑”在此可互換地使用，并且被定義為引起免疫系統(tǒng)刺激的一種或多種物質(zhì)。在此上下文中，一種佐劑用來增強(qiáng)對由本發(fā)明載體中核酸分子編碼的多肽的免疫應(yīng)答。適合佐劑的實(shí)例包括鋁鹽，如氫氧化鋁和/或磷酸鋁和/或磷酸鋁鉀；油-乳液組合物(或水包油型組合物)，包括角鯊烯-水乳液，如mf59(參見例如wo90/14837)；皂苷配制品，例如像qs21和免疫刺激復(fù)合物(iscoms)(參見例如us5,057,540；wo90/03184、wo96/11711、wo2004/004762、wo2005/002620)；細(xì)菌或微生物衍生物，其實(shí)例是單磷?；|(zhì)a(mpl)、3-o-脫酰基mpl(3dmpl)、包含cpg-基序的寡核苷酸、adp-核糖基化細(xì)菌毒素或其突變體，如大腸桿菌熱不穩(wěn)定的腸毒素lt、霍亂毒素ct等等。還可以使用載體編碼的佐劑，例如，通過使用編碼感興趣的抗原與c4-結(jié)合蛋白(c4bp)的低聚反應(yīng)域的融合物的異源核酸(例如，索拉波米(solabomi)等人，2008，感染與免疫(infectimmun)76:3817-23)，或通過使用編碼感興趣的轉(zhuǎn)基因和tlr-3激動(dòng)劑如異源性dsrna(例如wo2007/100908)的載體，或諸如此類。在其他實(shí)施例中，本發(fā)明的組合物不包括佐劑。可以將藥用組合物給予受試者，例如人類受試者。在一次給予期間向受試者提供的疫苗活性組分的總劑量可以按照技術(shù)從業(yè)人員已知的進(jìn)行改變，并且針對腺病毒通常是在1x107病毒顆粒(vp)和1x1012vp之間，優(yōu)選地是在1x108vp和1x1011vp之間，例如在3x108和5x1010vp之間，例如在109和3x1010vp之間。針對dna疫苗，每次給予的dna的總量可以例如是在1μg和10mg之間。如果將基因槍用于給予，典型的是使用低劑量，例如10μg。針對肌肉注射，典型地是使用較高劑量，例如高達(dá)5mg。藥用組合物的給予可以使用標(biāo)準(zhǔn)給予途徑執(zhí)行。非限制性實(shí)施例包括不經(jīng)腸給予，如通過注射，如皮內(nèi)、肌肉內(nèi)等，或者皮下或經(jīng)皮、或粘膜給予，例如鼻內(nèi)、經(jīng)口、陰道內(nèi)、直腸等等。在一個(gè)實(shí)施例內(nèi)，通過肌肉注射給予組合物，例如向手臂的三角肌、或大腿的股外側(cè)肌。在某些實(shí)施例中，該疫苗是一種dna疫苗，并且這可以例如經(jīng)皮內(nèi)給予，例如通過dna紋身法(dnatattooing)(參見，例如，奧斯特惠斯(oosterhuis)等人，2012，微生物學(xué)和免疫學(xué)的當(dāng)前主題(currtopmicrobiolimmunol)351:221-50)。該途徑還可用于腺病毒載體。在某些實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的組合物包括腺病毒載體并且是通過肌肉注射給予。本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知給予一種組合物，如一種疫苗的不同的可能性，以誘發(fā)對疫苗中的一種或多種抗原的免疫應(yīng)答。如在此所使用的受試者優(yōu)選地是哺乳動(dòng)物，例如嚙齒動(dòng)物，例如小鼠、或非人類靈長類動(dòng)物或人類。優(yōu)選地，該受試者為一個(gè)人類受試者。可以將本發(fā)明的疫苗用來治療患有由hpv引起的疾病的各種階段之一的患者(特別是類型16)，從這樣的事件和持續(xù)性hpv感染(例如，如通過hpvdna測試所檢測的)，因此在形成(預(yù))癌病變之前，連同宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變(cin；又稱宮頸非典型增生和宮頸間質(zhì)瘤，該cin是在宮頸表面上扁平細(xì)胞的可能癌變前轉(zhuǎn)換和異常生長(發(fā)育異常))至多且包括子宮頸癌(如宮頸鱗狀細(xì)胞癌(scc))。此外，可以靶向其他hpv誘導(dǎo)的瘤形成，如外陰上皮內(nèi)瘤樣病變(vin)、陰道上皮內(nèi)瘤樣病變(vain)、陰莖上皮內(nèi)瘤病變(pin)、肛門上皮內(nèi)瘤樣病變(ain)，連同口咽癌(又稱頭頸癌)、陰莖癌、陰道腫瘤、外陰癌以及肛門癌的晚期。因此，本發(fā)明的疫苗可以靶向廣泛的hpv誘導(dǎo)的病變，并且可能對hpv誘導(dǎo)的疾病的癌前階段最有效，例如在(持續(xù))感染和/或瘤形成階段，其中e2、e6和/或e7的表達(dá)最高。還可以將使用本發(fā)明的疫苗來的治療與在晚期癌細(xì)胞中可以抵消或克服免疫逃逸機(jī)制的化合物(例如，抗pd1/pd-l1抗體、抗ctla-4抗體如伊匹木單抗、抗lag-3抗體、抗cd25抗體、ido抑制劑、cd40激動(dòng)性抗體、cd137激動(dòng)性抗體等等)結(jié)合(參見例如哈米德(hamid)和卡瓦哈爾(carvajal)，2013，生物治療專家意見(expertopinionbiolther)13:847-861；梅爾曼(mellman)等人，2011，自然綜述(naturerev)480:480-89)。治療性疫苗接種方法還可以在原則上，在疫苗進(jìn)一步包括引起外生殖器疣的hpv類型的(序列編碼的)e6和/或e7的情況下，用來治療外生殖器疣或其前體，并且向由此種hpv類型感染的受試者給予。在此使用的，‘治療’意指給予疫苗來誘導(dǎo)患者中對表達(dá)(hpv16e6和/或e7的表位)hpv16e6和/或e7的細(xì)胞的治療性免疫應(yīng)答，該免疫應(yīng)答導(dǎo)致至少降低hpv16感染的水平并且優(yōu)選的是完全去除hpv16感染，這導(dǎo)致了至少減緩并優(yōu)選的是停止hpv16引起的疾病(如瘤形成和/或其癥狀)的進(jìn)展。優(yōu)選地，用疫苗治療也導(dǎo)致了hpv誘導(dǎo)的癌癥的更晚期階段的緩和。優(yōu)選的是向患有已經(jīng)分型的已形成的hpv感染的患者給予疫苗，這樣使得可以給予編碼對應(yīng)的hpv類型的多肽的疫苗。在篩選不存在下，該疫苗還可以在部分可能被hpv感染的人群中給予，即性行為活躍的人。還可能向沒有被hpv16感染的受試者給予本發(fā)明的疫苗，例如用于預(yù)防性使用，可以與抵抗患者已經(jīng)感染的另一種hpv類型的疫苗結(jié)合，或可替代地在非感染的受試者中。本發(fā)明的疫苗還可以向通過其他方法經(jīng)受過另外的治療的受試者給予，例如外科手術(shù)(去除了由hpv16感染引起的病變部位)、或用咪喹莫特治療(包括tlr-7/8激動(dòng)劑，參見例如戴雅娜(dayaana)等人，2010，英國癌癥雜志(brjcancer)102:1129-36)?？梢酝ㄟ^細(xì)胞學(xué)或通過hpv測試測量治療的效果。疫苗接種包括向受試者或患者至少給予一次本發(fā)明的疫苗。還可以提供一種或多種另外疫苗的一次或多次的加強(qiáng)給予。如果執(zhí)行一種加強(qiáng)疫苗接種，那么典型地，此類加強(qiáng)疫苗接種將在具有相同抗原的免疫原性組合物第一次給予受試者(在這些情況下這被稱為‘初免接種’)后一周與一年之間，優(yōu)選地在兩周與四個(gè)月之間的一個(gè)時(shí)刻給予相同的受試者。在可替代的加強(qiáng)方案中，還可以向受試者給予不同的載體，例如一種或多種不同血清型的腺病毒、或其他載體如mva、或dna、或蛋白，作為初次和增強(qiáng)疫苗接種。在某些實(shí)施例中，在初次-加強(qiáng)方案中向同一位患者給予至少兩次本發(fā)明相同形式的疫苗，例如，用根據(jù)本發(fā)明的相同的重組腺病毒(如ad26)。在某些實(shí)施例中，在初次-加強(qiáng)方案中至少給予兩次本發(fā)明的疫苗，但是疫苗的載體不同，例如使用兩種不同血清型的腺病毒載體，例如用重組ad26初免并且用重組ad35加強(qiáng)，或反之亦然；或用dna初免并且用腺病毒載體加強(qiáng)，或反之亦然；或用腺病毒載體初免并且用mva載體加強(qiáng)，或反之亦然。在某些實(shí)施例中，在初次-加強(qiáng)-加強(qiáng)方案中，至少給予三次根據(jù)本發(fā)明的疫苗?？梢詫⒘硗獾募訌?qiáng)給予添加至方案中。本發(fā)明的一個(gè)方面還在受試者中誘導(dǎo)了抵抗hpv16的ctl應(yīng)答，該方面包括向受試者給予根據(jù)本發(fā)明的疫苗。本發(fā)明還提供了以下非限制性實(shí)施例：1)一種編碼多肽的核酸分子，該多肽包括seqidno:1；2)根據(jù)實(shí)施例1所述的核酸，其中該多肽進(jìn)一步包括至少部分的hpve2蛋白；3)根據(jù)實(shí)施例2所述的核酸，其中該至少部分的hpve2蛋白是來自hpv16的e2蛋白；4)根據(jù)實(shí)施例2所述的核酸，其中該多肽包括融合到具有seqidno:1的多肽的n-端側(cè)的至少部分的e2蛋白；5)根據(jù)實(shí)施例2所述的核酸，其中該多肽包括融合到具有seqidno:1的多肽的c-端側(cè)的至少部分的e2蛋白；6)根據(jù)實(shí)施例3所述的核酸，其中該多肽包括融合到具有seqidno:1的多肽的n-端側(cè)的至少部分的e2蛋白；7)根據(jù)實(shí)施例3所述的核酸，其中該多肽包括融合到具有seqidno:1的多肽的c-端側(cè)的至少部分的e2蛋白；8)根據(jù)實(shí)施例2所述的核酸，其中該至少部分的e2蛋白包括具有突變的e2蛋白變體，該突變廢止了e2的dna結(jié)合；9)根據(jù)實(shí)施例3所述的核酸，其中該至少部分的e2蛋白包括具有突變的e2蛋白變體，該突變廢止了e2的dna結(jié)合；10)根據(jù)實(shí)施例4所述的核酸，其中該至少部分的e2蛋白包括具有突變的e2蛋白變體，該突變廢止了e2的dna結(jié)合；11)根據(jù)實(shí)施例5所述的核酸，其中該至少部分的e2蛋白包括具有突變的e2蛋白變體，該突變廢止了e2的dna結(jié)合；12)根據(jù)實(shí)施例6所述的核酸，其中該至少部分的e2蛋白包括具有突變的e2蛋白變體，該突變廢止了e2的dna結(jié)合；13)根據(jù)實(shí)施例7所述的核酸，其中該至少部分的e2蛋白包括具有突變的e2蛋白變體，該突變廢止了e2的dna結(jié)合；14)一種包括根據(jù)實(shí)施例1所述的核酸的載體，其中編碼該多肽的序列可操作地連接至啟動(dòng)子；15)一種包括根據(jù)實(shí)施例2所述的核酸的載體，其中編碼該多肽的序列可操作地連接至啟動(dòng)子；16)一種包括根據(jù)實(shí)施例3所述的核酸的載體，其中編碼該多肽的序列可操作地連接至啟動(dòng)子；17)一種包括根據(jù)實(shí)施例4所述的核酸的載體，其中編碼該多肽的序列可操作地連接至啟動(dòng)子；18)一種包括根據(jù)實(shí)施例5所述的核酸的載體，其中編碼該多肽的序列可操作地連接至啟動(dòng)子；19)一種包括根據(jù)實(shí)施例6所述的核酸的載體，其中編碼該多肽的序列可操作地連接至啟動(dòng)子；20)一種包括根據(jù)實(shí)施例7所述的核酸的載體，其中編碼該多肽的序列可操作地連接至啟動(dòng)子；21)一種包括根據(jù)實(shí)施例8所述的核酸的載體，其中編碼該多肽的序列可操作地連接至啟動(dòng)子；22)一種包括根據(jù)實(shí)施例9所述的核酸的載體，其中編碼該多肽的序列可操作地連接至啟動(dòng)子；23)一種包括根據(jù)實(shí)施例10所述的核酸的載體，其中編碼該多肽的序列可操作地連接至啟動(dòng)子；24)一種包括根據(jù)實(shí)施例11所述的核酸的載體，其中編碼該多肽的序列可操作地連接至啟動(dòng)子；25)一種包括根據(jù)實(shí)施例12所述的核酸的載體，其中編碼該多肽的序列可操作地連接至啟動(dòng)子；26)一種包括根據(jù)實(shí)施例13所述的核酸的載體，其中編碼該多肽的序列可操作地連接至啟動(dòng)子；27)根據(jù)實(shí)施例14所述的載體，其中該載體是一種腺病毒；28)根據(jù)實(shí)施例15所述的載體，其中該載體是一種腺病毒；29)根據(jù)實(shí)施例16所述的載體，其中該載體是一種腺病毒；30)根據(jù)實(shí)施例17所述的載體，其中該載體是一種腺病毒；31)根據(jù)實(shí)施例18所述的載體，其中該載體是一種腺病毒；32)根據(jù)實(shí)施例19所述的載體，其中該載體是一種腺病毒；33)根據(jù)實(shí)施例20所述的載體，其中該載體是一種腺病毒；34)根據(jù)實(shí)施例21所述的載體，其中該載體是一種腺病毒；35)根據(jù)實(shí)施例22所述的載體，其中該載體是一種腺病毒；36)根據(jù)實(shí)施例23所述的載體，其中該載體是一種腺病毒；37)根據(jù)實(shí)施例24所述的載體，其中該載體是一種腺病毒；38)根據(jù)實(shí)施例25所述的載體，其中該載體是一種腺病毒；39)根據(jù)實(shí)施例26所述的載體，其中該載體是一種腺病毒；40)根據(jù)實(shí)施例27所述的載體，其中該腺病毒是一種血清型26的人類腺病毒；41)根據(jù)實(shí)施例28所述的載體，其中該腺病毒是一種血清型26的人類腺病毒；42)根據(jù)實(shí)施例29所述的載體，其中該腺病毒是一種血清型26的人類腺病毒；43)根據(jù)實(shí)施例30所述的載體，其中該腺病毒是一種血清型26的人類腺病毒；44)根據(jù)實(shí)施例31所述的載體，其中該腺病毒是一種血清型26的人類腺病毒；45)根據(jù)實(shí)施例32所述的載體，其中該腺病毒是一種血清型26的人類腺病毒；46)根據(jù)實(shí)施例33所述的載體，其中該腺病毒是一種血清型26的人類腺病毒；47)根據(jù)實(shí)施例34所述的載體，其中該腺病毒是一種血清型26的人類腺病毒；48)根據(jù)實(shí)施例35所述的載體，其中該腺病毒是一種血清型26的人類腺病毒；49)根據(jù)實(shí)施例36所述的載體，其中該腺病毒是一種血清型26的人類腺病毒；50)根據(jù)實(shí)施例37所述的載體，其中該腺病毒是一種血清型26的人類腺病毒；51)根據(jù)實(shí)施例38所述的載體，其中該腺病毒是一種血清型26的人類腺病毒；52)根據(jù)實(shí)施例39所述的載體，其中該腺病毒是一種血清型26的人類腺病毒；53)根據(jù)實(shí)施例28所述的載體，其中該腺病毒是一種血清型35的人類腺病毒；54)根據(jù)實(shí)施例29所述的載體，其中該腺病毒是一種血清型35的人類腺病毒；55)根據(jù)實(shí)施例30所述的載體，其中該腺病毒是一種血清型35的人類腺病毒；56)根據(jù)實(shí)施例31所述的載體，其中該腺病毒是一種血清型35的人類腺病毒；57)根據(jù)實(shí)施例32所述的載體，其中該腺病毒是一種血清型35的人類腺病毒；58)根據(jù)實(shí)施例33所述的載體，其中該腺病毒是一種血清型35的人類腺病毒；59)根據(jù)實(shí)施例34所述的載體，其中該腺病毒是一種血清型35的人類腺病毒；60)根據(jù)實(shí)施例35所述的載體，其中該腺病毒是一種血清型35的人類腺病毒；61)根據(jù)實(shí)施例36所述的載體，其中該腺病毒是一種血清型35的人類腺病毒；62)根據(jù)實(shí)施例37所述的載體，其中該腺病毒是一種血清型35的人類腺病毒；63)根據(jù)實(shí)施例38所述的載體，其中該腺病毒是一種血清型35的人類腺病毒；64)根據(jù)實(shí)施例39所述的載體，其中該腺病毒是一種血清型35的人類腺病毒；65)一種包括根據(jù)實(shí)施例14所述的載體、和一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的疫苗組合物；66)一種包括根據(jù)實(shí)施例15所述的載體、和一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的疫苗組合物；67)一種包括根據(jù)實(shí)施例16所述的載體、和一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的疫苗組合物；68)一種包括根據(jù)實(shí)施例17所述的載體、和一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的疫苗組合物；69)一種包括根據(jù)實(shí)施例18所述的載體、和一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的疫苗組合物；70)一種包括根據(jù)實(shí)施例19所述的載體、和一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的疫苗組合物；71)一種包括根據(jù)實(shí)施例20所述的載體、和一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的疫苗組合物；72)一種包括根據(jù)實(shí)施例21所述的載體、和一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的疫苗組合物；73)一種包括根據(jù)實(shí)施例22所述的載體、和一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的疫苗組合物；74)一種包括根據(jù)實(shí)施例23所述的載體、和一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的疫苗組合物；75)一種包括根據(jù)實(shí)施例24所述的載體、和一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的疫苗組合物；76)一種包括根據(jù)實(shí)施例25所述的載體、和一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的疫苗組合物；77)一種包括根據(jù)實(shí)施例26所述的載體、和一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的疫苗組合物；78)一種包括根據(jù)實(shí)施例27所述的載體、和一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的疫苗組合物；79)一種包括根據(jù)實(shí)施例28所述的載體、和一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的疫苗組合物；80)一種包括根據(jù)實(shí)施例29所述的載體、和一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的疫苗組合物；81)一種包括根據(jù)實(shí)施例30所述的載體、和一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的疫苗組合物；82)一種包括根據(jù)實(shí)施例31所述的載體、和一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的疫苗組合物；83)一種包括根據(jù)實(shí)施例32所述的載體、和一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的疫苗組合物；84)一種包括根據(jù)實(shí)施例33所述的載體、和一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的疫苗組合物；85)一種包括根據(jù)實(shí)施例34所述的載體、和一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的疫苗組合物；86)一種包括根據(jù)實(shí)施例35所述的載體、和一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的疫苗組合物；87)一種包括根據(jù)實(shí)施例36所述的載體、和一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的疫苗組合物；88)一種包括根據(jù)實(shí)施例37所述的載體、和一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的疫苗組合物；89)一種包括根據(jù)實(shí)施例38所述的載體、和一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的疫苗組合物；90)一種包括根據(jù)實(shí)施例39所述的載體、和一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的疫苗組合物；91)一種包括根據(jù)實(shí)施例40所述的載體、和一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的疫苗組合物；92)一種包括根據(jù)實(shí)施例41所述的載體、和一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的疫苗組合物；93)一種包括根據(jù)實(shí)施例42所述的載體、和一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的疫苗組合物；94)一種包括根據(jù)實(shí)施例43所述的載體、和一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的疫苗組合物；95)一種包括根據(jù)實(shí)施例44所述的載體、和一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的疫苗組合物；96)一種包括根據(jù)實(shí)施例45所述的載體、和一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的疫苗組合物；97)一種包括根據(jù)實(shí)施例46所述的載體、和一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的疫苗組合物；98)一種包括根據(jù)實(shí)施例47所述的載體、和一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的疫苗組合物；99)一種包括根據(jù)實(shí)施例48所述的載體、和一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的疫苗組合物；100)一種包括根據(jù)實(shí)施例49所述的載體、和一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的疫苗組合物；101)一種包括根據(jù)實(shí)施例50所述的載體、和一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的疫苗組合物；102)一種包括根據(jù)實(shí)施例51所述的載體、和一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的疫苗組合物；103)一種包括根據(jù)實(shí)施例52所述的載體、和一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的疫苗組合物；104)一種包括根據(jù)實(shí)施例53所述的載體、和一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的疫苗組合物；105)一種包括根據(jù)實(shí)施例54所述的載體、和一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的疫苗組合物；106)一種包括根據(jù)實(shí)施例55所述的載體、和一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的疫苗組合物；107)一種包括根據(jù)實(shí)施例56所述的載體、和一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的疫苗組合物；108)一種包括根據(jù)實(shí)施例57所述的載體、和一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的疫苗組合物；109)一種包括根據(jù)實(shí)施例58所述的載體、和一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的疫苗組合物；110)一種包括根據(jù)實(shí)施例59所述的載體、和一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的疫苗組合物；111)一種包括根據(jù)實(shí)施例60所述的載體、和一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的疫苗組合物；112)一種包括根據(jù)實(shí)施例61所述的載體、和一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的疫苗組合物；113)一種包括根據(jù)實(shí)施例62所述的載體、和一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的疫苗組合物；114)一種包括根據(jù)實(shí)施例63所述的載體、和一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的疫苗組合物；115)一種包括根據(jù)實(shí)施例64所述的載體、和一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的疫苗組合物；116)一種用于在受試者中誘導(dǎo)抵抗hpv的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向該受試者給予根據(jù)實(shí)施例65-115中任一項(xiàng)所述的疫苗組合物；117)一種用于治療持續(xù)性hpv(類型16)感染的的方法，該方法包括向受到持續(xù)性hpv感染的受試者給予根據(jù)實(shí)施例65-115中任一項(xiàng)所述的疫苗；118)一種用于治療外陰上皮內(nèi)瘤樣病變(vin)(具有潛在的hpv類型16感染)的方法，該方法包括向患有vin的受試者給予根據(jù)實(shí)施例65-115中任一項(xiàng)所述的疫苗；119)一種用于治療外陰癌(具有潛在的hpv類型16感染)的方法，該方法包括向患有外陰癌的受試者給予根據(jù)實(shí)施例65-115中任一項(xiàng)所述的疫苗；120)一種用于治療宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變(cin)(具有潛在的hpv類型16感染)的方法，該方法包括向患有cin的受試者給予根據(jù)實(shí)施例65-115中任一項(xiàng)所述的疫苗；121)一種用于治療宮頸癌(具有潛在的hpv類型16感染)的方法，該方法包括向患有宮頸癌的受試者給予根據(jù)實(shí)施例65-115中任一項(xiàng)所述的疫苗；122)一種用于治療口咽癌(具有潛在的hpv類型16感染)的方法，該方法包括向患有口咽癌的受試者給予根據(jù)實(shí)施例65-115中任一項(xiàng)所述的疫苗；123)一種用于治療陰莖上皮內(nèi)瘤病變(pin)(具有潛在的hpv類型16感染)的方法，該方法包括向患有pin的受試者給予根據(jù)實(shí)施例65-115中任一項(xiàng)所述的疫苗；124)一種用于治療陰莖癌(具有潛在的hpv類型16感染)的方法，該方法包括向患有陰莖癌的受試者給予根據(jù)實(shí)施例65-115中任一項(xiàng)所述的疫苗；125)一種用于治療陰道上皮內(nèi)瘤樣病變(vain)(具有潛在的hpv類型16感染)的方法，該方法包括向患有vain的受試者給予根據(jù)實(shí)施例65-115中任一項(xiàng)所述的疫苗；126)一種用于治療陰道癌(具有潛在的hpv類型16感染)的方法，該方法包括向患有陰道癌的受試者給予根據(jù)實(shí)施例65-115中任一項(xiàng)所述的疫苗；127)一種用于治療肛門上皮內(nèi)瘤樣病變(ain)(具有潛在的hpv類型16感染)的方法，該方法包括向患有ain的受試者給予根據(jù)實(shí)施例65-115中任一項(xiàng)所述的疫苗；128)一種用于治療肛門癌(具有潛在的hpv類型16感染)的方法，該方法包括向患有肛門癌的受試者給予根據(jù)實(shí)施例65-115中任一項(xiàng)所述的疫苗；129)一種包括seqidno:1的多肽；130)根據(jù)實(shí)施例129所述的多肽，其中該多肽進(jìn)一步包括至少部分的hpve2蛋白；131)根據(jù)實(shí)施例130所述的多肽，其中該至少部分的hpve2蛋白是來自hpv16的e2蛋白；132)根據(jù)實(shí)施例130所述的多肽，其中至少部分的e2蛋白融合到具有seqidno:1的多肽的n-端側(cè)；133)根據(jù)實(shí)施例130所述的多肽，其中至少部分的e2蛋白融合到具有seqidno:1的多肽的c-端側(cè)；134)根據(jù)實(shí)施例131所述的多肽，其中至少部分的e2蛋白融合到具有seqidno:1的多肽的n-端側(cè)；135)根據(jù)實(shí)施例131所述的多肽，其中至少部分的e2蛋白融合到具有seqidno:1的多肽的c-端側(cè)；136)根據(jù)實(shí)施例130所述的多肽，其中該至少部分的e2蛋白包括具有突變的e2蛋白變體，該突變廢止了e2的dna結(jié)合；137)根據(jù)實(shí)施例131所述的多肽，其中該至少部分的e2蛋白包括具有突變的e2蛋白變體，該突變廢止了e2的dna結(jié)合；138)根據(jù)實(shí)施例132所述的多肽，其中該至少部分的e2蛋白包括具有突變的e2蛋白變體，該突變廢止了e2的dna結(jié)合；139)根據(jù)實(shí)施例133所述的多肽，其中該至少部分的e2蛋白包括具有突變的e2蛋白變體，該突變廢止了e2的dna結(jié)合；140)根據(jù)實(shí)施例134所述的多肽，其中該至少部分的e2蛋白包括具有突變的e2蛋白變體，該突變廢止了e2的dna結(jié)合；141)根據(jù)實(shí)施例135所述的多肽，其中該至少部分的e2蛋白包括具有突變的e2蛋白變體，該突變廢止了e2的dna結(jié)合；142)根據(jù)實(shí)施例3所述的核酸，該核酸編碼根據(jù)seqidno:3的多肽；143)根據(jù)實(shí)施例3所述的核酸，該核酸編碼根據(jù)seqidno:5的多肽；144)一種編碼根據(jù)實(shí)施例142所述的核酸的載體，其中編碼該多肽的序列可操作地連接至啟動(dòng)子；145)一種編碼根據(jù)實(shí)施例143所述的核酸的載體，其中編碼該多肽的序列可操作地連接至啟動(dòng)子；146)根據(jù)實(shí)施例144所述的載體，其中該載體是一種腺病毒；147)根據(jù)實(shí)施例145所述的載體，其中該載體是一種腺病毒；148)根據(jù)實(shí)施例146所述的載體，其中該腺病毒是一種血清型26的人類腺病毒；149)根據(jù)實(shí)施例147所述的載體，其中該腺病毒是一種血清型26的人類腺病毒；150)根據(jù)實(shí)施例146所述的載體，其中該腺病毒是一種血清型35的人類腺病毒；151)根據(jù)實(shí)施例147所述的載體，其中該腺病毒是一種血清型35的人類腺病毒；152)一種包括根據(jù)實(shí)施例144所述的載體、和一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的疫苗組合物；153)一種包括根據(jù)實(shí)施例145所述的載體、和一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的疫苗組合物；154)一種包括根據(jù)實(shí)施例146所述的載體、和一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的疫苗組合物；155)一種包括根據(jù)實(shí)施例147所述的載體、和一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的疫苗組合物；156)一種包括根據(jù)實(shí)施例148所述的載體、和一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的疫苗組合物；157)一種包括根據(jù)實(shí)施例149所述的載體、和一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的疫苗組合物；158)一種包括根據(jù)實(shí)施例150所述的載體、和一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的疫苗組合物；159)一種包括根據(jù)實(shí)施例151所述的載體、和一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的疫苗組合物；160)一種用于在受試者中誘導(dǎo)抵抗hpv的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向該受試者給予根據(jù)實(shí)施例152-159中任一項(xiàng)所述的疫苗組合物；161)一種用于治療外陰上皮內(nèi)瘤樣病變(vin)的方法，該方法包括向患有vin的受試者給予根據(jù)實(shí)施例152-159中任一項(xiàng)所述的疫苗；162)一種用于治療外陰癌的方法，該方法包括向患有外陰癌的受試者給予根據(jù)實(shí)施例152-159中任一項(xiàng)所述的疫苗；163)一種用于治療宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變(cin)的方法，該方法包括向患有cin的受試者給予根據(jù)實(shí)施例152-159中任一項(xiàng)所述的疫苗；164)一種用于治療宮頸癌的方法，該方法包括向患有宮頸癌的受試者給予根據(jù)實(shí)施例152-159中任一項(xiàng)所述的疫苗；165)一種用于治療口咽癌的方法，該方法包括向患有口咽癌的受試者給予根據(jù)實(shí)施例152-159中任一項(xiàng)所述的疫苗；166)一種用于治療陰莖上皮內(nèi)瘤病變(pin)的方法，該方法包括向患有pin的受試者給予根據(jù)實(shí)施例152-159中任一項(xiàng)所述的疫苗；167)一種用于治療陰莖癌的方法，該方法包括向患有陰莖癌的受試者給予根據(jù)實(shí)施例152-159中任一項(xiàng)所述的疫苗；168)一種用于治療陰道上皮內(nèi)瘤樣病變(vain)的方法，該方法包括向患有vain的受試者給予根據(jù)實(shí)施例152-159中任一項(xiàng)所述的疫苗；169)一種用于治療陰道癌的方法，該方法包括向患有陰道癌的受試者給予根據(jù)實(shí)施例152-159中任一項(xiàng)所述的疫苗；170)一種用于治療肛門上皮內(nèi)瘤樣病變(ain)的方法，該方法包括向患有ain的受試者給予根據(jù)實(shí)施例152-159中任一項(xiàng)所述的疫苗；171)一種用于治療肛門癌的方法，該方法包括向患有肛門癌的受試者給予根據(jù)實(shí)施例152-159中任一項(xiàng)所述的疫苗。除非另有說明，本發(fā)明的實(shí)踐采用免疫學(xué)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、和重組dna的常規(guī)技術(shù)，這些在本領(lǐng)域的技能之內(nèi)。參見例如薩姆布魯克(sambrook)、弗里奇(fritsch)和馬尼亞蒂斯(maniatis)，分子克?。簩?shí)驗(yàn)手冊(molecularcloning:alaboratorymanual)，第2版，1989；分子生物學(xué)現(xiàn)代方法(currentprotocolsinmolecularbiology)，奧蘇貝爾(ausubel)fm等人編輯，1987；酶學(xué)方法(methodsinenzymology)系列(學(xué)術(shù)出版社有限公司(academicpress,inc.))；pcr2：一種實(shí)用的方法(pcr2:apracticalapproach)，麥克弗森(macpherson)mj、海姆斯(hams)bd、泰勒(taylor)gr編輯，1955；抗體：實(shí)驗(yàn)手冊(antibodies:alaboratorymanual)，哈洛(harlow)和拉內(nèi)(lane)編輯，1988。在以下實(shí)例中將進(jìn)一步解釋本發(fā)明。這些實(shí)例不以任何方式限制本發(fā)明。它們僅僅用以闡明本發(fā)明。實(shí)例實(shí)例1：構(gòu)建設(shè)計(jì)的多肽，該多肽基本上包括所有的hpv16e6和e7ctl表位我們設(shè)計(jì)了一種新穎的、非致瘤的多肽(和編碼這種多肽的核酸)，該多肽基本上包含所有的hpv16e6和e7蛋白的所有的ctl表位，并且具有最小數(shù)量的預(yù)計(jì)的/預(yù)測的強(qiáng)大的新表位(新表位意指不存在于野生型hpv16e6和e7蛋白中的表位)。本發(fā)明的多肽(有時(shí)還在此稱為‘e6e7sh’)包括如在seqidno:1中所提供的序列。以seqidno:2提供編碼該多肽的密碼子優(yōu)化的核酸。本發(fā)明的分子是單分子，該單分子提供了超過了使用多分子的策略的生產(chǎn)優(yōu)點(diǎn)。此外，本發(fā)明的多肽包括存在于hpv16的野生型e6和e7中的基本上所有假定的ctl表位，并且同時(shí)具有最小數(shù)量的預(yù)期的/預(yù)測的強(qiáng)大的新表位，這些新表位可以潛在地可能是免疫顯性的并且因此可以從相關(guān)的野生型ctl表位轉(zhuǎn)移免疫應(yīng)答。因此本發(fā)明的構(gòu)建體是比其他人所描述的分子(缺少可能的ctl表位和/或包含更多或更強(qiáng)的新表位)在免疫學(xué)上更有利。例如，seqidno:1的構(gòu)建體針對如下各項(xiàng)包含具有預(yù)測結(jié)合親和力<50nm的九個(gè)氨基酸長度的僅一個(gè)新表位：20種最常見的hla-a、20種最常見的hla-b和20種最常見的hla-c等位基因(hla-a*01:01、hla-a*02:01、hla-a*02:03、hla-a*02:06、hla-a*02:07、hla-a*03:01、hla-a*11:01、hla-a*23:01、hla-a*24:02、hla-a*26:01、hla-a*29:02、hla-a*30:01、hla-a*30:02、hla-a*31:01、hla-a*32:01、hla-a*33:01、hla-a*33:03、hla-a*34:01、hla-a*68:01、hla-a*68:02、hla-b*07:02、hla-b*07:04、hla-b*08:01、hla-b*13:01、hla-b*15:01、hla-b*18:01、hla-b*35:01、hla-b*37:01、hla-b*39:01、hla-b*40:01、hla-b*40:02、hla-b*40:06、hla-b*44:02、hla-b*44:03、hl-b*46:01、hla-b*48:01、hla-b*51:01、hla-b*52:01、hla-b*53:01、hla-b*58:01、hla-c*07:02、hla-c*04:01、hla-c*03:04、hla-c*01:02、hla-c*07:01、hla-c*06:02、hla-c*03:03、hla-c*08:01、hla-c*15:02、hla-c*12:02、hla-c*02:02、hla-c*05:01、hla-c*14:02、hla-c*03:02、hla-c*16:01、hla-c*08:02、hla-c*12:03、hla-c*04:03、hla-c*17:01、hla-c*14:03)，如在iedb網(wǎng)站(http://tools.immuneepitope.org/analyze/html/mhc_binding.html，2009-09-01b版)針對hla-a和hla-b使用ann(倫德高(lundegaard)等人，2008，核酸研究(nuclacidsres)36:w509-12)smm方法(彼得斯(peters)等人，2003，生物信息學(xué)(bioinformatics)19:1765-72)以及針對用于肽結(jié)合至mhc類別i分子的預(yù)測工具的hla-c的netmhcpan方法(霍夫(hoof)等人，2009，免疫遺傳學(xué)(immunogenetics)61:1-13)。作為一種非限制性實(shí)例，使用在iedb網(wǎng)站的smm預(yù)測工具，該改組的e6和e7序列如由奧斯特惠斯(oosterhuis)等人，2011，國際癌癥雜志(intjcancer)129:397-406和奧施拉格等人，2006，疫苗(vaccine)24:2880-93所描述的在核心部分針對20種最常見的hla-a和-b包含每一個(gè)九氨基酸的潛在的強(qiáng)大的獨(dú)特的新表位(ann或smmic50<50nm)。這甚至不包括用于那種途徑的附加物(其中附加物將進(jìn)一步有助于另外的新表位，并且可能由于限制長度的‘重疊’錯(cuò)過了更多的天然mhcii表位)。事實(shí)上，據(jù)報(bào)道，改進(jìn)的分子(包含具有改組的e6和e7蛋白(被描述于wo2013/083287中)的變體)包含針對20種最常見的hla-a、20種最常見的hla-b和20種最常見的hla-c等位基因具有預(yù)測的ic50<50nm的九個(gè)氨基酸長度的22個(gè)獨(dú)特的新表位(ann、smm或netmhcpan)。因此，本發(fā)明的設(shè)計(jì)的分子相比于改組的e6和e7以去除功能性的其他已公布的方法，顯然有利于具有更低數(shù)量的預(yù)測的新表位。合成編碼我們由此設(shè)計(jì)的hpv16e6e7sh分子(即，具有如在seqidno:1中所提供的氨基酸序列的多肽)的核酸，該核酸序列包括seqidno:2，并且側(cè)翼為在5’端的hindiii位點(diǎn)和kozak序列以及在3’位點(diǎn)的xbai位點(diǎn)(在英杰生命技術(shù)公司(invitrogenlifetechnologies)的委托合成以及標(biāo)準(zhǔn)分子克隆，德國)。使用hindiii和xbai將該合成的片段克隆到標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)載體，pcdna2004.neo中，該載體具有細(xì)菌抗藥性標(biāo)志物(氨比西林)和哺乳類動(dòng)物抗藥性標(biāo)志物(新霉素)，以獲得編碼本發(fā)明分子的質(zhì)粒載體，例如用于基于(瞬時(shí))轉(zhuǎn)染的試驗(yàn)?？梢园凑者@樣使用這些分子，但是還可以用作為包含附加特征的另外的分子的基礎(chǔ)。作為非限制性實(shí)例，如下描述制備一些另外的變體。可以將hpv16e6e7sh融合蛋白質(zhì)序列與其他hpv16早期蛋白的序列結(jié)合，以靶向患有持續(xù)感染的個(gè)體，并且以擴(kuò)展免疫個(gè)體中的免疫系統(tǒng)全部。已經(jīng)提出，抵抗e2的免疫應(yīng)答在清除hpv16感染中起到了重要作用(德容(dejong)等人，2002，癌癥研究(cancerres)62:472-479)。e2與e6e7sh的融合將給出疫苗組分，該疫苗組分具有抵抗從持續(xù)感染到浸潤性癌或在leep手術(shù)后的復(fù)發(fā)/難治性疾病的hpv相關(guān)癌癥的各階段的抗原。因此，作為此類實(shí)施例的非限制性實(shí)例，我們制備了編碼e6e7sh與e2在它的n-端的融合蛋白的序列。在e2序列中，可以使修飾廢止dna結(jié)合活性，該dna結(jié)合活性可能在表達(dá)融合蛋白的細(xì)胞中影響基因表達(dá)。我們使wthpv16e2蛋白的位置293的甘氨酸、位置299的賴氨酸和位置300的半胱氨酸分別突變成纈氨酸、蛋氨酸和精氨酸。每個(gè)突變在于其自身已經(jīng)完全廢止了e2與具有e2的結(jié)合域的dna序列的結(jié)合(普拉卡什(prakash)等人，1992，基因與發(fā)育(genesdev)6:105-16)。所產(chǎn)生的多肽稱為hpv16e2e6e7sh并且包括seqidno:3。制備編碼該多肽的密碼子優(yōu)化序列并且在seqidno:4中提供。我們還構(gòu)建了變體，其中將相同的e2突變蛋白融合至hpv16e6e7sh融合多肽的c-端，產(chǎn)生了稱為hpv16e6e7e2sh的多肽，該多肽包括seqidno:5。將編碼該構(gòu)建體的序列提供為seqidno:6。出于對照的目的，我們還構(gòu)建了編碼多肽的序列，該序列包含針對作為一種融合蛋白的全長hpv16e6和e7的野生型序列(將從aa1至158的e6直接融合到從aa1至98的e7，在此命名為e6e7wt)。我們還測試了向該多肽添加前導(dǎo)序列的影響。作為一種非限制性實(shí)例，在這些構(gòu)建體中的一些的n-端處融合編碼ige前導(dǎo)序列的序列(參見例如us6,733,994)[前導(dǎo)肽的序列提供于seqidno:7]，例如在e6e7wt構(gòu)建體中，該e6e7wt構(gòu)建體導(dǎo)致了lse6e7wt，并且在e2e6e7sh構(gòu)建體中，該e2e6e7sh構(gòu)建體導(dǎo)致了lse2e6e7sh。在免疫小鼠中如通過e7四聚體分析所測的，相比于不具有l(wèi)s序列的相同抗原，其作用顯著(p<0.05)提高了免疫原性(例如，可以如在圖9中所見)。在具有或不具有e2的情況下，編碼本發(fā)明e6e7sh多肽的序列可以，例如從dna構(gòu)建體、從rna或從病毒載體進(jìn)行表達(dá)。圖1證實(shí)了當(dāng)如上所述用表達(dá)轉(zhuǎn)基因的dna載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后在hek-293t細(xì)胞中的表達(dá)。在轉(zhuǎn)染之后，收獲細(xì)胞并且用抵抗hpv16e7的抗體通過sds-page和蛋白質(zhì)印跡法分析細(xì)胞提取物。該試驗(yàn)證實(shí)了當(dāng)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染后，適當(dāng)大小的預(yù)期融合蛋白的表達(dá)。在具有或不具有e2的情況下，并且在具有或不具有增強(qiáng)所編碼的融合蛋白的免疫原性的附加序列的情況下，可以使用腺病毒載體來表達(dá)e6e7。由基因藝術(shù)公司(geneart)，將編碼hpv16e6e7wt對照的基因或上述的hpv設(shè)計(jì)序列針對人類表達(dá)進(jìn)行基因優(yōu)化并且合成。kozak序列(5’gccacc3’)直接包含于atg起始密碼子的前面，并且將兩個(gè)終止密碼子(5’tgataa3’)添加至各自的編碼序列的末端。將這些基因通過hindiii和xbai位點(diǎn)插入padapt35bsu質(zhì)粒和padapt26質(zhì)粒中(哈文格(havenga)等人，2006，普通病毒學(xué)雜志(jgenvirol)87,2135-43)。通過單同源重組，所有的腺病毒生產(chǎn)于per.c6細(xì)胞中，并且如之前所述進(jìn)行生產(chǎn)(針對rad35：哈文格(havenga)等人，2006，普通病毒學(xué)雜志(jgenvirol)87:2135-43；針對rad26：阿賓克(abbink)等人，2007，病毒學(xué)雜志(jvirol)81:4654-63)。將per.c6細(xì)胞(法勞科斯(fallaux)等人，1998，人類基因治療(humgenether)9:1909-17)維持在具有10％胎牛血清(fbs)、補(bǔ)充以10mmmgcl2的杜氏改良培養(yǎng)基(dmem)中。簡言之，根據(jù)制造商(美國生命技術(shù)公司(lifetechnologies))提供的說明書使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，用ad載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染per.c6細(xì)胞。在到達(dá)完全的細(xì)胞病變效應(yīng)(cpe)后一天收獲細(xì)胞，凍融，在3,000rpm下離心5min，并且存儲在-20℃下。將病毒進(jìn)行噬斑純化并且在培養(yǎng)于多孔24組織培養(yǎng)板的單孔中的per.c6細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增。進(jìn)一步擴(kuò)增在培養(yǎng)于t25組織培養(yǎng)燒瓶并隨后養(yǎng)于t175組織培養(yǎng)燒瓶中的per.c6細(xì)胞中進(jìn)行。將從在t175燒瓶后所獲得的細(xì)胞制備的粗裂解物的3到5ml用來接種包含per.c6細(xì)胞的70％融合層的24×t1000五層組織培養(yǎng)燒瓶。使用兩步cscl凈化法純化該病毒。最終，將該病毒以等分儲存在-85℃下。ad35.hpv16-e6e7wt、和ad35.hpv16-e6e7sh是重組腺病毒血清型35(ad35)載體，這些載體包括密碼子優(yōu)化的核苷酸序列，分別用于表達(dá)野生型hpv16e6和e7蛋白(e6e7wt)的融合蛋白、以及如上所述的設(shè)計(jì)的融合蛋白變體(e6e7sh，具有提供于seqidno:1中的氨基酸序列)。該組合的e6和e7序列置于e1、e3缺失的腺病毒基因組的e1區(qū)域中的cmv啟動(dòng)子控制下。ad26.hpv16-e6e7wt、和ad26.hpv16-e6e7sh是基于重組腺病毒血清型26的等效載體。類似地，產(chǎn)生基于ad26和ad35的重組腺病毒載體，這些載體編碼hpv16e2e6e7sh(seqidno:3)變體。類似地，產(chǎn)生編碼hpv16e6e7e2sh(seqidno:5)變體的ad26和ad35。此外，產(chǎn)生編碼在n-端具有ige前導(dǎo)序列的e2e6e7sh融合蛋白的ad35載體，該載體命名為ad35.hpv16-lse2e6e7sh。還生產(chǎn)具有在n-端融合至ige前導(dǎo)序列的e6e7wt的對照腺病毒。用per.c6細(xì)胞產(chǎn)生重組腺病毒，并且在氯化銫梯度上通過離心進(jìn)行純化。在以下實(shí)例中提供了偶聯(lián)至阻遏物系統(tǒng)的本發(fā)明的構(gòu)建體的另外的實(shí)例。實(shí)例2.缺少設(shè)計(jì)的構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化活性野生型hpv16e6和e7蛋白具有致瘤潛能，該致瘤潛能在某些測定中表現(xiàn)為轉(zhuǎn)化活性，如在軟瓊脂測定中的菌落形成(馬西斯米(massimi)和班克斯(banks)，2005，分子醫(yī)學(xué)方法(methodsmolmed)119:381-395)。如在實(shí)例1中所描述的e6e7sh多肽包括以重新排序方式的e6和e7蛋白的片段。與在此類測定中wte6和e7蛋白之一相比，預(yù)測這可以去除致瘤潛能(例如通過顯著降低的轉(zhuǎn)化活性測量的)。其他文獻(xiàn)報(bào)道了hpv16e6和e7的基因改組變體確實(shí)已經(jīng)失去了它們的致癌潛能(奧施拉格等人，2006，疫苗(vaccine)24:2880-93；漢肯(henken)等人，2012，疫苗(vaccine)30:4259-66)，證實(shí)了基因改組破壞了e6和e7蛋白的野生型功能。為了評估致瘤性的喪失，我們評估了我們的e6e7sh構(gòu)建體賦予nih3t3細(xì)胞在軟瓊脂中生長能力的能力(由例如馬西斯米(massimi)和班克斯(banks)，2005，分子醫(yī)學(xué)方法(methodsmolmed)119:381-395所描述的)。具有表達(dá)野生型hpv16e7的質(zhì)粒的nih3t3細(xì)胞的轉(zhuǎn)染一致地導(dǎo)致菌落形成。在這些測定中，僅野生型hpv16e6的表達(dá)不引起在背景上的菌落形成。這與所公布的觀察一致，在該測定中e7wt比e6wt更有效(賽德曼(sedman)等人，1991，病毒學(xué)雜志(jvirol)65:4860-66)。在四個(gè)獨(dú)立的試驗(yàn)中用我們的e6e7sh構(gòu)建體進(jìn)行的轉(zhuǎn)染并不會(huì)導(dǎo)致在軟瓊脂(圖2)中細(xì)胞的菌落的生長，證實(shí)了編碼本發(fā)明多肽的核酸e6e7sh已經(jīng)失去了與e7相關(guān)的轉(zhuǎn)化能力。e6和e7的致瘤潛能分別是與他們降低細(xì)胞蛋白p53和prb水平的能力有關(guān)。進(jìn)行p53和prb降解測定來證實(shí)編碼本發(fā)明多肽的核酸e6e7sh構(gòu)建體不具有與野生型e6和e7有關(guān)的、處于分子水平的生物活性。簡言之，hpv16e6wt和我們的e6e7sh構(gòu)建體表達(dá)于nci-h1299細(xì)胞中，這些nci-h1299細(xì)胞針對于p53降解測定缺少內(nèi)源p53。針對prb降解測定，hpv16e7wt和e6e7sh構(gòu)建體表達(dá)于prb失效saos-2細(xì)胞中。正如在圖3中可見的，p53與e6wt但不是與e6e7sh的共同表達(dá)，導(dǎo)致了p53水平的降低(圖a和b)。類似地，圖3c和3d顯示出了prb與e7wt但不是與e6e7sh的共同表達(dá)，導(dǎo)致了prb水平的降低。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了編碼本發(fā)明多肽的核酸沒有能力在軟瓊脂中形成菌落并且不包含野生型e6和e7多肽的主要生物活性，即p53和prb的分別失活。為了進(jìn)一步證實(shí)編碼本發(fā)明多肽的核酸構(gòu)建體的安全性，我們使用了原代人類包皮角質(zhì)形成細(xì)胞,該原代人類包皮角質(zhì)形成細(xì)胞是hpv介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的天然靶細(xì)胞。原代人類角質(zhì)形成細(xì)胞的永生化需要e6和e7二者野生型的作用(芒格(munger)等人，1989，病毒學(xué)雜志(jvirol)63:4417-21)。這種測定可能是生理學(xué)上最相關(guān)的體外測定，來證實(shí)我們構(gòu)建體的安全性(馬西斯米(massimi)和班克斯(banks)，2005，分子醫(yī)學(xué)方法(methodsmolmed)119:381-395)。與非轉(zhuǎn)導(dǎo)的對照細(xì)胞(圖4)和激活htert、端粒酶催化亞單位(數(shù)據(jù)未示出)相比，用表達(dá)來自hpv16(e6e7wt)的野生型e6和e7的慢病毒所轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞誘導(dǎo)了原代角質(zhì)形成細(xì)胞的永生化，如通過它們壽命的延長所表明的。與gfp轉(zhuǎn)導(dǎo)的或非轉(zhuǎn)導(dǎo)的角質(zhì)形成細(xì)胞相比，本發(fā)明多肽(e6e7sh)的表達(dá)不能延長壽命。在兩個(gè)另外獨(dú)立的供體中獲得相似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。總之，這些數(shù)據(jù)證實(shí)了我們的構(gòu)建體已經(jīng)失去了誘導(dǎo)原代人類角質(zhì)形成細(xì)胞永生化的能力，這些原代人類角質(zhì)形成細(xì)胞被認(rèn)為是高度具有生理意義的模型。hpv16e6和e7的片段以另一種順序重組的另一種構(gòu)建體也不能夠永生化原代人類包皮角質(zhì)形成細(xì)胞。然而，針對那種構(gòu)建體觀察到了長達(dá)約120-150天的延長的壽命。這表明了這一領(lǐng)域的一些不可預(yù)測性，并且證實(shí)了在安全性相關(guān)的方面中根據(jù)本發(fā)明的設(shè)計(jì)的分子的優(yōu)越性。該實(shí)例中的所有實(shí)驗(yàn)一起提供了編碼根據(jù)本發(fā)明多肽的核酸缺少轉(zhuǎn)化活性的強(qiáng)有力的證據(jù)，并且因此比hpv16e6和e7wt構(gòu)建體大大提高了安全性。實(shí)例3.對e6e7sh設(shè)計(jì)構(gòu)建體的免疫應(yīng)答如在實(shí)例1中所述，我們已經(jīng)制備了dna載體和腺病毒載體。基于小鼠用編碼野生型e2、或者e6或e7的dna質(zhì)粒免疫的初始試驗(yàn)，我們使用cb6f1小鼠菌株用于測量免疫應(yīng)答，并且用hpv16e2、e6和e7抗原進(jìn)行免疫在cb6f1中比在c57bl/6小鼠或balb/c小鼠中誘導(dǎo)出更廣泛的細(xì)胞免疫應(yīng)答。在一個(gè)單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中，將小鼠用編碼本發(fā)明分子的dna載體進(jìn)行免疫，并且測量細(xì)胞免疫應(yīng)答。可以在用表達(dá)e6e7sh的dna質(zhì)粒免疫的小鼠中測量hpv16e7特異性免疫應(yīng)答(圖5)。示于該實(shí)例中的以下數(shù)據(jù)是來自用腺病毒載體進(jìn)行的小鼠實(shí)驗(yàn)。為了評估疫苗誘導(dǎo)的免疫原性，用表達(dá)e6e7wt、lse6e7wt、e6e7sh的腺病毒載體(ad35)或不編碼轉(zhuǎn)基因的腺病毒載體(空白)對cb6f1小鼠進(jìn)行免疫。測試向小鼠給予的兩種劑量：5*109病毒顆粒(vp)和1*1010vp。免疫接種后兩周和八周，處死這些小鼠并且用hpv16e715mer肽池刺激分離的脾細(xì)胞過夜。通過ifnγelispot分析兩周和八周的e7特異性應(yīng)答。數(shù)據(jù)見圖6。這顯示了用ad35.hpv16-e6e7sh免疫小鼠誘導(dǎo)了如通過elispot分析所測量的e7特異性免疫應(yīng)答。此外，圖6中的結(jié)果證實(shí)了通過向轉(zhuǎn)基因添加n-端前導(dǎo)序列提高抵抗腺病毒表達(dá)的轉(zhuǎn)基因的免疫應(yīng)答的可能性。其次，對于免疫原性，測試向e6e7sh多肽添加e2的作用。ad35載體編碼具有融合至n-端(e2e6e7sh)或融合至c-端(e6e7e2sh)的e2的多肽。將cb6f1小鼠用1x1010vp的劑量進(jìn)行免疫。圖7(e7四聚體染色)和圖8(圖c，ifnγelispot)顯示了抵抗e7的免疫應(yīng)答，盡管差異并不是統(tǒng)計(jì)學(xué)上有義意的，但是相比于不具有e2的構(gòu)建體，包括e2的設(shè)計(jì)的構(gòu)建體的免疫應(yīng)答往往更高。相比于具有融合至e6e7sh設(shè)計(jì)多肽的e2的腺病毒載體的應(yīng)答，針對只編碼e2的腺病毒載體具有更高的對e2的應(yīng)答(圖8b)，其中e2與e2e6e7sh和e2與e6e7e2sh的差異是顯著的(p值：<0.05)?？梢酝茢噙M(jìn)一步包括e2的設(shè)計(jì)的構(gòu)建體仍可以提供抵抗e7的免疫應(yīng)答，并且此外還提供了對e2的免疫應(yīng)答，因此比不包括e2的構(gòu)建體增大了免疫應(yīng)答的寬度。當(dāng)融合至野生型e6和e7的融合蛋白的n-端的時(shí)候，顯示出了前導(dǎo)序列的添加導(dǎo)致更高的e7特異性應(yīng)答(圖6c)。類似地，確定前導(dǎo)序列對e2e6e7sh融合蛋白的免疫原性的作用。因此，在具有或不具有n-端e2的情況下，將編碼設(shè)計(jì)的多肽的ad35載體和編碼lse2e6e7sh的ad35載體用來對小鼠進(jìn)行免疫，并且每隔兩周取血液樣品來測量e7特異性的免疫應(yīng)答(圖9)。如圖7和8所示，存在n-或c-端融合至e6e7sh的e2往往增加了免疫應(yīng)答。ige前導(dǎo)序列的添加進(jìn)一步增加了e7特異性應(yīng)答(圖9b)。隨著時(shí)間，針對所有三種編碼根據(jù)本發(fā)明的設(shè)計(jì)的分子的腺病毒載體，觀察到了持續(xù)免疫應(yīng)答，并且在免疫之后的最高應(yīng)答與在試驗(yàn)期間的最高應(yīng)答一致。推斷出可以通過添加特異性序列可以增加設(shè)計(jì)的構(gòu)建體(該構(gòu)建體進(jìn)一步包括n-端e2)所誘導(dǎo)的應(yīng)答，例如，ige前導(dǎo)序列，該ige前導(dǎo)序列是將所編碼的蛋白靶向特異性細(xì)胞區(qū)室。可以用不同類型的腺病毒載體誘導(dǎo)抵抗本發(fā)明肽的細(xì)胞免疫應(yīng)答。在先前的實(shí)驗(yàn)中，我們使用了ad35載體，然而在圖10的試驗(yàn)中，用表達(dá)e2e6e7sh的ad26腺病毒載體對小鼠進(jìn)行免疫。數(shù)據(jù)顯示了用基于ad26的疫苗的免疫也誘導(dǎo)了e7特異性t細(xì)胞。此外，這些結(jié)果證實(shí)了用表達(dá)e2e6e7sh的ad35腺病毒載體的第二次免疫進(jìn)一步增強(qiáng)了細(xì)胞免疫應(yīng)答(圖10)。實(shí)例4.獼猴中設(shè)計(jì)的構(gòu)建體的免疫原性為了評估表達(dá)本發(fā)明的設(shè)計(jì)的序列的腺病毒載體誘導(dǎo)非人類靈長動(dòng)物中免疫應(yīng)答的能力，以1*1011vp的劑量，用表達(dá)e2e6e7sh的腺病毒載體(ad26)或不編碼轉(zhuǎn)基因的腺病毒載體(空白)通過肌肉注射對獼猴進(jìn)行免疫。在免疫后八周，用表達(dá)相同抗原的ad26載體通過免疫加強(qiáng)該免疫應(yīng)答。在第16周時(shí)，該動(dòng)物接受了又一次的表達(dá)相同抗原的ad35的注射。在若干時(shí)間點(diǎn)取血液樣品并且用對應(yīng)于hpv16e2、e6或e7的肽池刺激分離的白細(xì)胞過夜。通過ifnγelispot測量特異性應(yīng)答。數(shù)據(jù)見圖11。此外，在初次免疫后的第10周和第18周，評估對本發(fā)明中的跨新穎連接的肽具有特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答。在所有的動(dòng)物中ifnγ應(yīng)答的誘導(dǎo)是在<50sfu/1*106pbmc的檢測極限以下進(jìn)行的(數(shù)據(jù)未顯示)。數(shù)據(jù)顯示了用ad26.hpv16-e2e6e7sh的非人類靈長動(dòng)物的免疫導(dǎo)致了針對出現(xiàn)于編碼轉(zhuǎn)基因中的所有三種hpv16蛋白的細(xì)胞免疫應(yīng)答，但是不是針對新穎的連接?？梢杂胊d26.hpv16-e2e6e7sh通過另外的免疫加強(qiáng)應(yīng)答，并且在第16周用對應(yīng)ad35載體的另外加強(qiáng)進(jìn)一步增加了hpv16e2、e6和e7特異性免疫應(yīng)答。在第72周再一次用ad26.hpv16-e2e6e7sh的后期加強(qiáng)給予導(dǎo)致了hpv16細(xì)胞免疫應(yīng)答的增加，該增加在幾周后下降(未顯示)。在一個(gè)單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中(未顯示)，用兩種腺病毒載體(一種表達(dá)hpv16e6e7sh并且另一種表達(dá)hpv16l1蛋白)的組合通過陰道給予對獼猴進(jìn)行免疫。在外周血單核細(xì)胞中測量到針對e6和e7的低的但是可測量的細(xì)胞應(yīng)答。在這些試驗(yàn)中，檢測到了針對l1的強(qiáng)大的細(xì)胞免疫應(yīng)答。實(shí)例5.在小鼠腫瘤模型中的治療效果本發(fā)明的多肽能夠誘導(dǎo)動(dòng)物中的hpv16特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答，該細(xì)胞免疫應(yīng)答可以對表達(dá)hpv16e6和/或e7的細(xì)胞施加治療效果。治療性免疫，即在腫瘤已經(jīng)開始生長后的免疫，可以被用來證實(shí)治療性hpv疫苗候選物的效果。在用tc-1細(xì)胞(表達(dá)hpv16e6和e7的小鼠細(xì)胞)注射的小鼠中測試ad26和ad35載體的治療效果(林(lin)等人，1996，癌癥研究(cancerres)56:21-6)。在小鼠中經(jīng)皮下注射后的幾天至幾周內(nèi)tc-1細(xì)胞將形成實(shí)體瘤。在沒有疫苗的情況下，腫瘤快速生長并且在30天內(nèi)達(dá)到1000mm3的預(yù)定大小(圖d和e)。當(dāng)達(dá)到這種大小時(shí)，出于倫理原因處死小鼠。在具有slp(被用作陽性對照；肯特爾(kenter)等人，2009，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志(nengljmed)361:1838-47；茲韋弗令(zwaveling)等人，2002，免疫學(xué)雜志(jimmunol)169:350-8)或表達(dá)hpv16-e2e6e7sh的腺病毒載體的初次-加強(qiáng)免疫接種時(shí)間表下，觀察到了tc-1誘導(dǎo)的腫瘤生長的明顯降低(圖12，圖b和c)。在初次免疫后的第一個(gè)30天的仔細(xì)檢查(圖f和g)顯示出了用表達(dá)e2e6e7sh的腺病毒載體的免疫比用slp的免疫對腫瘤生長具有本質(zhì)上更大的影響。初始生長速率更低并且在大多數(shù)情況下這些腫瘤縮小了。在用腺病毒載體免疫的小鼠中的11只中的3只中，完全消除了腫瘤，這體現(xiàn)在存活圖中(圖h)。結(jié)論，在良好建立的激發(fā)模型中，針對hpv16誘導(dǎo)的癌癥，用表達(dá)本發(fā)明多肽的腺病毒載體進(jìn)行免疫顯著降低了腫瘤生長或完全消除了已形成的腫瘤。實(shí)例6：使用阻遏物系統(tǒng)來改進(jìn)表達(dá)hpv衍生抗原的腺病毒載體的生產(chǎn)率和遺傳穩(wěn)定性之前已經(jīng)報(bào)道了在強(qiáng)大組成型活性啟動(dòng)子的控制下，插入的腺病毒載體的轉(zhuǎn)基因取決于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的性質(zhì)，可以負(fù)面影響載體生產(chǎn)(吉田(yoshida)&山田(yamada)，1997，生物化學(xué)與生物物理學(xué)集刊(biochembiophysrescommun)230:426-30；魯賓琪珂(rubinchik)等人，2000，基因治療(genether)7:875-85；馬修斯(matthews)等人，1999，普通病毒學(xué)雜志(jgenvirol)80:345-53；艾德爾摩(edholm)等人，2001，病毒學(xué)雜志(jvirol)75:9579-84；加爾(gall)等人，2007，分子生物技術(shù)(molbiotechnol)35:263-73)。轉(zhuǎn)基因依賴型載體生產(chǎn)率問題的實(shí)例包括低效載體挽救和生長，低最終載體產(chǎn)量，和，在嚴(yán)重的情況下，具有缺陷轉(zhuǎn)基因盒的病毒突變體的快速過度生長。為了解決這些問題，多項(xiàng)研究探索了在生產(chǎn)細(xì)胞中，在載體復(fù)制期間，沉默載體轉(zhuǎn)基因表達(dá)的可能性(馬修斯(matthews)等人，1999，普通病毒學(xué)雜志(jgenvirol)80:345-53；艾德爾摩(edholm)等人，2001，病毒學(xué)雜志(jvirol)75:9579-84了加爾(gall)等人，2007，分子生物技術(shù)(molbiotechnol)35:263-73；柯丁罕(cottingham)等人，2012，生物技術(shù)與生物工程(biotechnolbioeng)109:719-28；吉爾伯特(gilbert)等人，2014，病毒學(xué)方法雜志(jvirolmethods)208:177-88)。在此方面，在ad載體的背景下，之前已經(jīng)執(zhí)行了不同的阻遏系統(tǒng)，并且事實(shí)上已經(jīng)顯示出了改進(jìn)了編碼不同類型的(抑制性)轉(zhuǎn)基因的載體生產(chǎn)率和遺傳穩(wěn)定性。已經(jīng)觀察到在此描述的腺病毒載體中的一些，連同一些編碼某些hpv抗原變體的其他腺病毒載體顯示出了在此所述的轉(zhuǎn)基因依賴型載體生產(chǎn)率問題中的一些，并且因此可能在這一方面進(jìn)一步改善。因此，我們力圖調(diào)研使用系統(tǒng)來阻遏載體轉(zhuǎn)基因表達(dá)是否可以如在此所述的那些改進(jìn)表達(dá)hpv衍生抗原的ad載體的生產(chǎn)特性。為此目的，我們實(shí)施了兩種存在的阻遏物操縱基因系統(tǒng)，即tetr/teto(堯(yao)&埃里克松(eriksson)，1999，人類基因治療(humgenether)10:419-22，ep0990041b1)和cymr/cuo(穆里克(mullick)等人，2006，bmc生物技術(shù)(bmcbiotechnol)6:43)，進(jìn)入我們的腺病毒載體平臺。之前已經(jīng)有其他人使用tetr/teto和cymr/cuo系統(tǒng)在載體復(fù)制期間通過載體轉(zhuǎn)基因沉默來改善腺病毒載體生產(chǎn)率(加爾(gall)等人，2007，分子生物技術(shù)(molbiotechnol)35:263-73；柯丁罕(cottingham)等人，2012，生物技術(shù)與生物工程(biotechnolbioeng)109:719-28；吉爾伯特(gilbert)等人，2014，病毒學(xué)方法雜志(jvirolmethods)208:177-88)。這兩種系統(tǒng)的實(shí)施涉及了在包含teto或cuo序列的cmv啟動(dòng)子的控制下產(chǎn)生表達(dá)感興趣基因的腺病毒載體。此外，該實(shí)施需要產(chǎn)生穩(wěn)定表達(dá)各自同源阻遏蛋白(即，tetr或cymr)的細(xì)胞系。產(chǎn)生若干e1缺失、基于ad26-和ad35-的載體，其中編碼異源多肽的序列可操作地連接至包含teto或cuo操縱基因序列的cmv啟動(dòng)子。首先，將某些包含teto-或cuo-的序列(分別是seqidno:11和seqidno:12)插入padapt26和padapt35.bsu質(zhì)粒的cmv啟動(dòng)子(eqidno:13)的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(tss)附近(阿賓克(abbink)等人，2007，病毒學(xué)雜志(jvirol)81:4654-63；哈文格(havenga)等人，2006，普通病毒學(xué)雜志(jgenvirol)87:2135-43)。針對兩種系統(tǒng)，將包含操縱基因的序列插入之前所述的cmv啟動(dòng)子的完全相同的位置(堯(yao)&埃里克松(eriksson)，1999，人類基因治療(humangenether)10:419-22；ep0990041b1；穆里克(mullick)等人，2006，bmc生物技術(shù)(bmcbiotechnol)6:43；ep1385946b1)。確切地，相對于tss(按原設(shè)計(jì)；斯坦伯格(stenberg)等人，1984，病毒學(xué)雜志(j.virol.)49:190-9)，分別將包含teto-和cuo-的序列直接插入位置-20和+7的下游。在seqidno:13中，這兩個(gè)位置分別對應(yīng)于位置716和742。分別將得到的包含操縱基因的cmv啟動(dòng)子稱為cmvteto和cmvcuo。其次，使用hindiii和xbai限制性位點(diǎn)，將不同的轉(zhuǎn)基因插入得到的構(gòu)建體的(修改的)cmv啟動(dòng)子的下游。這些轉(zhuǎn)基因包括編碼綠色熒光蛋白和螢蟲素酶(gfp-luc)、來自本發(fā)明的lse2e6e7sh、和另一種具有與lse2e6e7sh一些類似性的的多肽(在該實(shí)例中構(gòu)建體稱為‘hpvag’)的融合蛋白的基因。hpvag包括呈現(xiàn)于lse2e6e7sh中的相同的前導(dǎo)序列，連同hpv16的e2、e6、和e7序列。使用在此所述的方法，在cmvteto或cmvcuo啟動(dòng)子的控制下，將得到的修飾的padapt26和padapt35.bsu質(zhì)粒用于產(chǎn)生表達(dá)上述報(bào)告基因和hpv轉(zhuǎn)基因的腺病毒載體。通過per.細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，分別使用質(zhì)粒pcdnatm6/tr(生命技術(shù)公司(lifetechnologies)，v1025-20)和pcdnatm6/tr的衍生物產(chǎn)生表達(dá)tetr或cymr的細(xì)胞系，在pcdnatm6/tr的衍生物中tetr編碼序列(seqidno:14，編碼多肽seqidno:15)被密碼子優(yōu)化的cymr編碼序列(seqidno:16，編碼多肽seqidno:17)替代。如通過pcdnatm6/tr的供應(yīng)商所述的，使用基于瞬間轉(zhuǎn)染的測定大規(guī)模產(chǎn)生穩(wěn)定的細(xì)胞系，來篩選能夠阻遏cmvteto-或cmvcuo-驅(qū)動(dòng)的基因的表達(dá)的細(xì)胞克隆。在這些細(xì)胞中，在載體復(fù)制期間，針對其阻遏轉(zhuǎn)基因表達(dá)的能力，分析得到的per.c6/tetr和per.c6/cymr細(xì)胞系。在包含操縱基因的cmv啟動(dòng)子的控制下，在表達(dá)對應(yīng)于各自操縱基因序列的阻遏物的細(xì)胞系中，用表達(dá)gfp-luc的載體進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)顯示了整個(gè)完整的病毒復(fù)制周期中熒光素酶基因表達(dá)減少至少10倍(數(shù)據(jù)未顯示)。這證實(shí)了在復(fù)制腺病毒載體的背景下per.c6/tetr和per.c6/cymr細(xì)胞系能夠阻遏載體轉(zhuǎn)基因表達(dá)。針對表達(dá)hpvag的基于ad35的載體，調(diào)研腺病毒載體轉(zhuǎn)基因表達(dá)的tetr-和cymr-介導(dǎo)的阻遏對載體產(chǎn)量的影響(圖13a)。為此，通過從cmvteto或cmvcuo啟動(dòng)子表達(dá)hpvag的載體，以1000病毒顆粒/細(xì)胞并且持續(xù)三小時(shí)的持續(xù)時(shí)間，使于在24孔板中以3*105細(xì)胞/孔接種的per.c6、per.c6/tetr、和per.c6/cymr細(xì)胞系經(jīng)受一式四份感染。作為對照，用表達(dá)gfp-luc而不是hpvag的對應(yīng)載體進(jìn)行平行感染。在感染后四天，通過使孔的內(nèi)容物(即，受感染細(xì)胞和介質(zhì))經(jīng)受兩次凍融循環(huán)來制備粗病毒裂解物。隨后通過基于ad35六鄰體序列特異性定量pcr方案確定腺病毒載體效價(jià)，該方案用已知的病毒顆粒效價(jià)作為標(biāo)準(zhǔn)使用純化的ad35載體。結(jié)果顯示出包含teto-和cuo-的編碼hpvag的ad35載體，相比于表達(dá)gfp-luc的對照載體，顯示出了在正常per.c6細(xì)胞上降低的載體產(chǎn)量。相比之下，當(dāng)在表達(dá)它們同源阻遏物的細(xì)胞上生產(chǎn)時(shí)(即分別是tetr和cymr)，這些相同的載體給出了與用對照載體所獲得的那些一樣高的產(chǎn)量。這些數(shù)據(jù)表明，在載體生產(chǎn)期間，在生產(chǎn)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)基因表達(dá)的阻遏針對攜帶作為轉(zhuǎn)基因的hpvag的ad35載體的生產(chǎn)是有益的。針對源自腺病毒血清型26(ad26)的載體，還調(diào)研了阻遏腺病毒載體轉(zhuǎn)基因表達(dá)可能對載體產(chǎn)量具有的影響(圖13b)。在基本上如針對ad35載體所述進(jìn)行的測定中，將攜帶cmvteto啟動(dòng)子控制的轉(zhuǎn)基因(該轉(zhuǎn)基因編碼gfp-luc、hpvag、或lse2e6e7sh)的ad26載體以1500病毒顆粒/細(xì)胞用來感染per.c6和per.c6/tetr細(xì)胞。三天后獲得感染，并且通過基于ad26六鄰體序列特異性定量pcr方法確定病毒顆粒效價(jià)。這些結(jié)果顯示出了對于per.c6細(xì)胞，編碼hpvag和lse2e6e7sh的載體的產(chǎn)量比用編碼gfp-luc的對照載體所獲得的更低。相比之下，對于per.c6/tetr細(xì)胞，這兩種載體顯示出了與對照載體所獲得的一樣高的效價(jià)。與以上結(jié)果一起(針對ad35載體)，這些數(shù)據(jù)表明在腺病毒載體生產(chǎn)期間遏制轉(zhuǎn)基因表達(dá)增加了表達(dá)hpvag和lse2e6e7sh的載體的產(chǎn)量。我們已經(jīng)觀察到了關(guān)于腺病毒載體的遺傳穩(wěn)定性的主要問題，該腺病毒載體攜帶了針對hpvag的cmv啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)基因。例如，已經(jīng)觀察到在per.c6上該載體的若干傳代后，大部分的載體群由突變載體組成，該突變載體攜帶在hpvag編碼序列中的一個(gè)大的缺失(數(shù)據(jù)未顯示)。我們推斷使用轉(zhuǎn)基因表達(dá)阻遏系統(tǒng)，如上述兩種之一，可以防止與轉(zhuǎn)基因有關(guān)的遺傳穩(wěn)定性問題，如抑制載體生長的hpvag。為了測試這一項(xiàng)，當(dāng)在per.c6或per.c6/cymr細(xì)胞上的載體生長后，針對轉(zhuǎn)基因盒穩(wěn)定性評估具有cmvcuo啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的hpvag表達(dá)的基于ad35的載體(圖14)。簡言之，將載體dna轉(zhuǎn)染到兩種不同的細(xì)胞系中，并且允許得到的病毒噬斑生長在瓊脂糖層下。從兩種轉(zhuǎn)染中的每個(gè)，分離五個(gè)病毒噬斑，并且分別在相同細(xì)胞系(即，用于轉(zhuǎn)染)上進(jìn)一步傳代，持續(xù)連續(xù)10次病毒傳代。在病毒傳代數(shù)10(vpn10)時(shí)，通過轉(zhuǎn)基因盒的pcr擴(kuò)增評估轉(zhuǎn)基因完整性，并且產(chǎn)生的pcr產(chǎn)物的進(jìn)一步分析是通過凝膠電泳和桑格測序進(jìn)行。此外，在vpn7時(shí)，針對它們表達(dá)hpvag的能力評估傳代的病毒克隆。這通過使用傳代的病毒分離株來進(jìn)行，以1000病毒顆粒/細(xì)胞來感染a549細(xì)胞，在感染后的48小時(shí)裂解這些細(xì)胞，并且隨后使用針對hpv16e7(圣克魯斯生物技術(shù)(santa-cruzbiotechnology))的單克隆抗體通過蛋白質(zhì)印跡法分析hpvag的表達(dá)。凝膠電泳和序列分析的結(jié)果顯示了已經(jīng)在per.c6上傳代的所有五種病毒分離株每種在轉(zhuǎn)基因盒內(nèi)攜帶了小移碼缺失或過早終止突變。相比之下，此類缺失或突變不能在任何已經(jīng)在表達(dá)cymr(per.c6/cymr)的細(xì)胞系上傳代的載體分離株中檢測到。與這些數(shù)據(jù)相同，所有的per.c6/cymr繁殖的載體分離株能夠表達(dá)hpvag，然而所有的per.c6生長的載體完全丟失了這項(xiàng)能力，暗示這些載體的缺陷轉(zhuǎn)基因盒?？傊覀兊臄?shù)據(jù)證實(shí)了使用阻遏物系統(tǒng)，舉例來說cymr/cuo系統(tǒng)，在載體增殖期間來阻遏載體轉(zhuǎn)基因表達(dá)是一種有效的手段來防止嚴(yán)重的轉(zhuǎn)基因盒不穩(wěn)定性，如針對攜帶表達(dá)hpvag的轉(zhuǎn)基因的載體所見到的那種。參考文獻(xiàn)阿賓克(abbink)p，萊姆科特(lemckert)aa，埃瓦爾德(ewald)ba，林奇(lynch)dm，丹霍茲(denholtz)m，史密茨(smits)s，霍特曼(holterman)l，達(dá)曼(damen)i，沃格爾(vogels)r，索納(thorner)ar，奧布賴恩(o’brienkl)，卡維爾(carville)a，曼斯菲爾德(mansfield)kg，古德斯密特(goudsmit)j，哈文格(havenga)mj，巴魯什(barouch)dh(2007)來自亞組b和d的六種罕見血清型重組腺病毒疫苗載體的比較血清陽性率和免疫原性(comparativeseroprevalenceandimmunogenicityofsixrareserotyperecombinantadenovirusvaccinevectorsfromsubgroupsbandd)，病毒學(xué)雜志(jvirol)81:4654-4663奧蘇貝爾(ausubel)fm(1995)分子生物學(xué)的短方案：來自分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)指南的方法概要(shortprotocolsinmolecularbiology:acompendiumofmethodsfromcurrentprotocolsinmolecularbiology)，威利(wiley)，[奇切斯特]柯丁罕(cottingham)mg，卡羅爾(carroll)f，莫里斯(morris)sj，特納(turner)av，沃恩(vaughan)am，卡普路(kapulu)mc，科洛卡(colloca)s，夏尼(siani)l，吉爾伯特(gilbert)sc，希爾(hill)av(2012)在腺病毒載體的轉(zhuǎn)基因盒中防止自發(fā)性基因重排(preventingspontaneousgeneticrearrangementsinthetransgenecassettesofadenovirusvectors)，生物技術(shù)與生物工程(biotechnolbioeng)109:719-728戴雅娜(daayana)s，艾克德(elkord)e，溫特斯(winters)u，鮑力塔(pawlita)m，羅登(roden)r，斯特恩(stern)pl，基奇納(kitchener)hc(2010)在患有外陰上皮內(nèi)瘤樣病變的患者中咪喹莫特和hpv治療性疫苗接種的ii期試驗(yàn)(phaseiitrialofimiquimodandhpvtherapeuticvaccinationinpatientswithvulvalintraepithelialneoplasia)，英國癌癥雜志(brjcancer)102:1129-1136德容(dejong)a，凡德伯格(vanderburg)sh，夸本伯格(kwappenberg)km，凡德赫爾斯特(vanderhulst)jm，弗蘭肯(franken)kl，格魯派(geluk)a，凡梅加登(vanmeijgaarden)ke，德瑞胡特(drijfhout)jw，肯特爾(kenter)g，韋梅耶(vermeij)p，梅列夫(melief)cj，奧夫倫加(offringa)r(2002)在健康受試者中頻繁檢測人乳頭瘤病毒16e2特異性t-輔助細(xì)胞免疫(frequentdetectionofhumanpapillomavirus16e2-specifict-helperimmunityinhealthysubjects)，癌癥研究(cancerres)62:472-479艾德爾摩(edholm)d，莫林(molin)m，巴耶克(bajak)e，阿庫斯賈維(akusjarvi)g(2001)針對毒性蛋白表達(dá)涉及的腺病毒載體(adenovirusvectordesignedforexpressionoftoxicproteins)，病毒學(xué)雜志(jvirol)75:9579-9584埃文斯(evans)rk、拿羅基(nawrocki)dk、伊索皮(isopi)la、威廉姆斯(williams)dm、卡西米羅(casimiro)dr、金(chin)s、陳(chen)m、朱(zhu)dm、希弗(shiver)jw、沃金(volkin)db(2004)基于腺病毒載體疫苗的穩(wěn)定液體配制品的發(fā)展(developmentofstableliquidformulationsforadenovirus-basedvaccines)，藥學(xué)科學(xué)雜志(jpharmsci)93:2458-2475法勞科斯(fallaux)fj，布特(bout)a，凡德威爾德(vandervelde)i，凡德沃倫伯格(vandenwollenberg)dj，海赫(hehir)km，基根(keegan)j，奧格(auger)c，克拉默(cramer)sj，凡奧蒙德(vanormondt)h，凡德愛博(vandereb)aj，瓦萊里奧(valerio)d，胡本(hoeben)rc(1998)新輔助細(xì)胞和早期匹配區(qū)域1-缺失的腺病毒載體預(yù)防產(chǎn)生有復(fù)制能力的腺病毒(newhelpercellsandmatchedearlyregion1-deletedadenovirusvectorspreventgenerationofreplication-competentadenoviruses)，人類基因治療(humgenether)9:1909-1917s，霍夫高(hovgaard)l(2000)肽和蛋白的藥學(xué)配制品發(fā)展(pharmaceuticalformulationdevelopmentofpeptidesandproteins)，泰勒和弗朗西斯(taylor&francis)，倫敦加爾(gall)jg，利奧諾拉(lizonova)a，埃蒂雷迪(ettyreddy)d，麥克威(mcvey)d，朱伯(zuber)m，科夫斯迪(kovesdi)i，奧特曼(aughtman)b，金(king)cr，布拉夫(brough)de(2007)挽救并生產(chǎn)表達(dá)抑制性轉(zhuǎn)基因的疫苗和治療性腺病毒載體(rescueandproductionofvaccineandtherapeuticadenovirusvectorsexpressinginhibitorytransgenes)，分子生物技術(shù)(molbiotechnol)35:263-273高(gao)gp，恩達(dá)爾(engdahl)rk，威爾遜(wilson)jm(2000)用于大量生產(chǎn)沒有出現(xiàn)復(fù)制能力的病毒的e1缺失的腺病毒載體的細(xì)胞系(acelllineforhigh-yieldproductionofe1-deletedadenovirusvectorswithouttheemergenceofreplication-competentvirus)，人類基因治療(humgenether)11:213-219熱納羅(gennaro)ar(1990)雷明頓藥學(xué)大全(remington’spharmaceuticalsciences)，馬克出版公司(mack)吉爾伯特(gilbert)r，吉爾博特(guilbault)c，加尼翁(gagnon)d，伯尼爾(bernier)a，布爾熱(bourget)l，伊拉希(elahi)sm，卡門(kamen)a，馬西(massie)b(2014)在無血清懸浮培養(yǎng)中用于生產(chǎn)e1缺失的腺病毒載體的新補(bǔ)充細(xì)胞的建立與評價(jià)(establishmentandvalidationofnewcomplementingcellsforproductionofe1-deletedadenovirusvectorsinserum-freesuspensionculture)，病毒學(xué)方法雜志(jvirolmethods)208:177-188哈米德(hamid)o，卡瓦哈爾(carvajal)rd(2013)在癌癥治療中的抗程序性死亡-1和抗程序性死亡-配體1抗體(anti-programmeddeath-1andanti-programmeddeath-ligand1antibodiesincancertherapy)，生物治療專家意見(expertopinbiolther)13:847-861哈洛(harlow)e，拉內(nèi)(lane)d(1988)抗體：實(shí)驗(yàn)手冊(antibodies:alaboratorymanual)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，紐約哈文格(havenga)m，沃格爾(vogels)r，祖迪吉斯特(zuijdgeest)d，拉托塞維克(radosevic)k，繆勒(mueller)s，蘇沃特(sieuwerts)m，韋肖爾德(weichold)f，達(dá)曼(damen)i，卡斯帕斯(kaspers)j，萊姆科特(lemckert)a，凡米倫登克(vanmeerendonk)m，凡德魯格(vandervlugt)r，霍特曼(holterman)l，霍恩(hone)d，史凱奇(skeiky)y，敏塔喬(mintardjo)r，吉利森(gillissen)g，巴魯什(barouch)d，薩多夫(sadoff)j，古德斯密特(goudsmit)j(2006)新穎沒有復(fù)制能力的腺病毒b組載體：per.c6細(xì)胞中高載體穩(wěn)定性和產(chǎn)量(novelreplication-incompetentadenoviralb-groupvectors:highvectorstabilityandyieldinper.c6cells)，普通病毒學(xué)雜志(jgenvirol)87:2135-2143漢肯(henken)fe，奧斯特惠斯(oosterhuis)k，奧施拉格(ohlschlager)p，博世(bosch)l，霍伊博格(hooijberg)e，哈能(haanen)jb，史丁柏根(steenbergen)rd(2012)編碼修飾的hpv16e6和e7的dna疫苗的臨床前安全評價(jià)(preclinicalsafetyevaluationofdnavaccinesencodingmodifiedhpv16e6ande7)，疫苗(vaccine)30:4259-4266希爾德斯海姆(hildesheim)a，埃雷羅(herrero)r，瓦肖爾德(wacholder)s，羅德里格斯(rodriguez)ac，所羅門(solomon)d，布拉蒂(bratti)mc，席勒(schiller)jt，岡薩雷斯(gonzalez)p，杜賓(dubin)g，波拉斯(porras)c，吉梅內(nèi)斯(jimenez)se，羅伊(lowy)dr(2007)在患有事先存在的感染的青年女性中人乳頭瘤病毒16/18l1病毒樣顆粒疫苗的作用：隨機(jī)試驗(yàn)(effectofhumanpapillomavirus16/18l1viruslikeparticlevaccineamongyoungwomenwithpreexistinginfection:arandomizedtrial)，美國醫(yī)學(xué)會(huì)雜志(jama)298:743-753霍根森(hoganson)dk，馬(ma)jc，阿薩多(asato)l，翁(ong)m，普林茨(printz)ma，惠格(huyghe)bg，索斯諾施(sosnowshi)ba，d安德里亞(d’andrea)mj(2002)研發(fā)穩(wěn)定腺病毒載體配制品(developmentofastableadenoviralvectorformulation)，生物工藝雜志(bioprocessj)1:43-48霍夫(hoof)i，彼得斯(peters)b，西德尼(sidney)j，佩德森(pedersen)le，塞特(sette)a，隆德(lund)o，布斯(buus)s，尼耳森(nielsen)m(2009)netmhcpan，一種超越人類用于mhc類別i結(jié)合預(yù)測的方法(amethodformhcclassibindingpredictionbeyondhumans)，免疫遺傳學(xué)(immunogenetics)61:1-13霍維茨(horwitz)ms(1996)腺病毒(adenoviruses)。其中：菲爾茨(fields)bn，奈普(knipe)dm，貝恩斯(baines)jd(編輯)病毒學(xué)(virology)，雷文出版社有限公司(ravenpressltd)，紐約肯特爾(kenter)gg，沃爾特斯(welters)mj，瓦倫坦泰因(valentijn)ar，盧威克(lowik)mj，貝蘭德-凡德米爾(berends-vandermeer)dm，沃魯(vloon)ap，伊斯薩撒(essahsah)f，法瑟斯(fathers)lm，奧夫倫加(offringa)r，德瑞胡特(drijfhout)jw，韋弗曼(wafelman)ar，奧斯滕多普(oostendorp)j，弗雷倫(fleuren)gj，凡德伯格(vanderburg)sh，梅列夫(melief)cj(2009)針對外陰上皮內(nèi)瘤樣病變的抵抗hpv-16癌蛋白的疫苗接種(vaccinationagainsthpv-16oncoproteinsforvulvarintraepithelialneoplasia)，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志(nengljmed)361:1838-1847凱博(kibbe)ah(2000)藥用輔料手冊(handbookofpharmaceuticalexcipients)，英國醫(yī)藥出版社(pharmaceuticalpress)，倫敦科夫斯迪(kovesdi)i，赫德利(hedley)sj(2010)腺病毒生產(chǎn)細(xì)胞(adenoviralproducercells)，病毒(viruses)2:1681-1703林(lin)ky，瓜尼埃里(guarnieri)fg，士迪佛立-奧卡羅爾(staveley-o’carroll)kf，列維茨基(levitsky)hi，奧古斯特(august)jt，帕多爾(pardoll)dm，吳(wu)tc(1996)用新穎的疫苗治療以形成的腫瘤，該疫苗提高腫瘤抗原的主要組織相容性類型ii的呈遞(treatmentofestablishedtumorswithanovelvaccinethatenhancesmajorhistocompatibilityclassiipresentationoftumorantigen)，癌癥研究(cancerres)56:21-26倫德高(lundegaard)c，蘭伯思(lamberth)k，哈恩達(dá)爾(harndahl)m，布斯(buus)s，隆德(lund)o，尼耳森(nielsen)m(2008)netmhc-3.0：精確網(wǎng)站可以預(yù)測人、小鼠和猴子mhc類型i的長度為8-11的肽的親和力(accuratewebaccessiblepredictionsofhuman,mouseandmonkeymhcclassiaffinitiesforpeptidesoflength8-11)，核酸研究(nucleicacidsres)36:w509-512馬西斯米(massimi)p，班克斯(banks)l(2005)針對hpv癌蛋白的轉(zhuǎn)化測定(transformationassaysforhpvoncoproteins)。其中：戴維(davy)c，道芭(doorbar)j(編輯)人乳頭瘤病毒：方法和方案(humanpapillomaviruses:methodsandprotocols)，第119卷：分子醫(yī)學(xué)施普林格中的方法(methodsinmolecularmedicinespringer)，柏林，pp381-395馬修斯(matthews)da，卡明斯(cummings)d，伊芙莉(evelegh)c，格雷厄姆(graham)fl，普瑞夫斯(prevec)l(1999)開發(fā)和利用表達(dá)乳糖阻遏物的293細(xì)胞系用于挽救表達(dá)高水平狂犬病毒糖蛋白的重組腺病毒(developmentanduseofa293celllineexpressinglacrepressorfortherescueofrecombinantadenovirusesexpressinghighlevelsofrabiesvirusglycoprotein)，普通病毒學(xué)雜志(jgenvirol)80(pt2):345-353麥克弗森(mcpherson)mj，黑姆斯(hames)bd，泰勒(taylor)gr(1995)pcr2：實(shí)用方法(pcr2:apracticalapproach)，在牛津大學(xué)出版社的irl出版社，牛津梅爾曼(mellman)i，古科斯(coukos)g，德拉諾夫(dranoff)g(2011)癌癥免疫療法的年齡(cancerimmunotherapycomesofage)。自然(nature)480:480-489穆里克(mullick)a，許(xu)y，沃倫(warren)r，考徹曼尼斯(koutroumanis)m，吉爾博特(guilbault)c，布魯薩(broussau)s，馬朗方(malenfant)f，布爾熱(bourget)l，拉穆勒(lamoureux)l，洛(lo)r，卡洛(caron)aw，碧洛媞(pilotte)a，馬西(massie)b(2006)cumate基因開關(guān)：在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中用于可調(diào)型表達(dá)的系統(tǒng)(thecumategene-switch:asystemforregulatedexpressioninmammaliancells)，bmc生物技術(shù)(bmcbiotechnol)6:43芒格(munger)k，費(fèi)爾普斯(phelps)wc，巴布(bubb)v，豪利(howley)pm，施萊格爾(schlegel)r(1989)針對原代人類角質(zhì)形成細(xì)胞的轉(zhuǎn)化人乳頭瘤病毒16型的e6和e7一起是必需的并且是足夠的(thee6ande7genesofthehumanpapillomavirustype16togetherarenecessaryandsufficientfortransformationofprimaryhumankeratinocytes)，病毒學(xué)雜志(jvirol)63:4417-4421奧貢(ogun)sa，杜蒙-賽格諾非特(dumon-seignovert)l，馬錢德(marchand)jb，霍爾德(holder)aa，希爾(hill)f(2008)c4結(jié)合蛋白(c4bp)的低聚反應(yīng)域作為一種佐劑，并且由與小鼠c4bp域融合的19千道爾頓裂體性孢子表面蛋白1組成的融合蛋白保護(hù)小鼠抵抗瘧疾(theoligomerizationdomainofc4-bindingprotein(c4bp)actsasanadjuvant,andthefusionproteincomprisedofthe19-kilodaltonmerozoitesurfaceprotein1fusedwiththemurinec4bpdomainprotectsmiceagainstmalaria)，感染與免疫(infectimmun)76:3817-3823奧斯特惠斯(oosterhuis)k，艾麗迪(aleyd)e，傅里蘭德(vrijland)k，舒馬赫(schumacher)tn，(哈能(haanen)jb(2012a)用于誘導(dǎo)人乳頭瘤病毒16型e6-和e7-特異性細(xì)胞毒性t-細(xì)胞應(yīng)答的dna疫苗的理性設(shè)計(jì)(rationaldesignofdnavaccinesfortheinductionofhumanpapillomavirustype16e6-ande7-specificcytotoxict-cellresponses)，人類基因治療(humgenether)23:1301-1312奧斯特惠斯(oosterhuis)k，奧施拉格(ohlschlager)p，凡德伯格(vandenberg)jh，托貝斯(toebes)m，戈麥斯(gomez)r，舒馬赫(schumacher)tn，哈能(haanen)jb(2011)針對hpv16e6和e7的高效性和高安全性的dna疫苗的臨床前發(fā)展(preclinicaldevelopmentofhighlyeffectiveandsafednavaccinesdirectedagainsthpv16e6ande7)，國際癌癥雜志(intjcancer)129:397-406奧斯特惠斯(oosterhuis)k，凡德伯格(vandenberg)jh，舒馬赫(schumacher)tn，哈能(haanen)jb(2012b)dna疫苗和通過紋身的皮內(nèi)疫苗接種(dnavaccinesandintradermalvaccinationbydnatattooing)，微生物學(xué)和免疫學(xué)的當(dāng)前主題(currtopmicrobiolimmunol)351:221-250彼得斯(peters)b，唐(tong)w，西德尼(sidney)j，塞特(sette)a，翁(weng)z(2003)檢測針對肽與mhc-i分子結(jié)合的獨(dú)立結(jié)合假設(shè)(examiningtheindependentbindingassumptionforbindingofpeptideepitopestomhc-imolecules)，生物信息學(xué)(bioinformatics)19:1765-1772普拉卡什(prakash)ss，格羅斯曼(grossman)sr，比賓斯基(pepinsky)rb，萊米恩斯(laimins)la，安德羅非(androphy)ej(1992)在乳頭瘤病毒e2反式激活蛋白中針對接觸新穎基序的dna和蘊(yùn)涵新穎基序的二聚作用必須的氨基酸(aminoacidsnecessaryfordnacontactanddimerizationimplynovelmotifsinthepapillomaviruse2trans-activator)，基因與發(fā)育(genesdev)6:105-116魯賓琪珂(rubinchik)s，丁(ding)r，邱(qiu)aj，張(zhang)f，董(dong)j(2000)遞送由tet-誘導(dǎo)表達(dá)型系統(tǒng)調(diào)節(jié)的fasl-gfp融合蛋白的腺病毒載體(adenoviralvectorwhichdeliversfasl-gfpfusionproteinregulatedbythetet-inducibleexpressionsystem)，基因治療(genether)7:875-885薩姆布魯克(sambrook)jfefmt(1989)分子克?。簩?shí)驗(yàn)手冊(molecularcloning:alaboratorymanual)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約賽德曼(sedman)sa，巴爾博薩(barbosa)ms，瓦什(vass)wc，哈伯特(hubbert)nl，哈斯(haas)ja，羅伊(lowy)dr，席勒(schiller)jt(1991)人乳頭瘤病毒16型的全長e6蛋白具有轉(zhuǎn)化和反式激活活性并且與e7合作來永生化培養(yǎng)物中的角質(zhì)形成細(xì)胞(thefull-lengthe6proteinofhumanpapillomavirustype16hastransformingandtrans-activatingactivitiesandcooperateswithe7toimmortalizekeratinocytesinculture)，病毒學(xué)雜志(jvirol)65:4860-4866申克(shenk)t(1996)腺病毒及其復(fù)制(adenoviridaeandtheirreplication)。其中：菲爾茨(fields)bn，奈普(knipe)dm，貝恩斯(baines)jd(編輯)病毒學(xué)(virology)，雷文出版社有限公司(ravenpressltd)，紐約斯馬海爾(smahel)m，西瑪(sima)p，路得維科瓦(ludvikova)v，馮卡(vonka)v(2001)自拍問哦dna疫苗抵抗包含e7的致癌細(xì)胞的修飾hpv16e7基因(modifiedhpv16e7genesasdnavaccineagainste7-containingoncogeniccells)，病毒學(xué)(virology)281:231-238凡德伯格(vanderburg)sh，梅列夫(melief)cj(2011)抵抗人乳頭瘤病毒誘導(dǎo)的惡性腫瘤的治療性疫苗接種(therapeuticvaccinationagainsthumanpapillomavirusinducedmalignancies)，免疫學(xué)目前的觀點(diǎn)(curropinimmunol)23:252-257沃森(watson)jd(1992)重組dna(recombinantdna)?？茖W(xué)美國人書刊(scientificamericanbooks)，紐約威金(wieking)bg，維梅爾(vermeer)dw，諾斯(spanos)wc，李(lee)km，維梅爾(vermeer)p，李(lee)wt，許(xu)y，蓋彼茨(gabitzsch)es，拜耳凱提斯(balcaitis)s，巴林特(balint)jp，jr.，瓊斯(jones)fr，李(lee)jh(2012)一種非致瘤hpv16e6/e7疫苗提高表達(dá)腫瘤的hpv的治療(anon-oncogenichpv16e6/e7vaccineenhancestreatmentofhpvexpressingtumors)，癌癥基因治療(cancergenether)19:667-674揚(yáng)(yan)j，賴興巴赫(reichenbach)dk，科比特(corbitt)n，胡奇(hokey)da，拉馬納坦(ramanathan)mp，麥金尼(mckinney)ka，魏納(weiner)db，休厄爾(sewell)d(2009)隨著編碼e6/e7融合蛋白的新穎hpv-16dna疫苗的遞送誘導(dǎo)體內(nèi)抗腫瘤免疫(inductionofantitumorimmunityinvivofollowingdeliveryofanovelhpv-16dnavaccineencodingane6/e7fusionantigen)，疫苗(vaccine)27:431-440堯(yao)f，埃里克松(eriksson)e(1999)一種新穎的四環(huán)素誘導(dǎo)的病毒復(fù)制開關(guān)(anoveltetracycline-inducibleviralreplicationswitch)。人類基因治療(humgenether)10:419-427吉田(yoshida)y，哈馬達(dá)(hamada)h(1997)通過四環(huán)素控制的具有核定位信號的反式激活蛋白腺病毒調(diào)節(jié)的可誘導(dǎo)的基因表達(dá)(adenovirus-mediatedinduciblegeneexpressionthroughtetracycline-controllabletransactivatorwithnuclearlocalizationsignal)，生物化學(xué)與生物物理學(xué)集刊(biochembiophysrescommun)230:426-430湯川村(yugawa)t，清野(kiyono)t(2009)通過高危人乳頭瘤病毒的宮頸腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制：e6和e7癌蛋白的新穎功能(molecularmechanismsofcervicalcarcinogenesisbyhigh-riskhumanpapillomaviruses:novelfunctionsofe6ande7oncoproteins)，醫(yī)學(xué)病毒學(xué)評論(revmedvirol)19:97-113茲韋弗令(zwaveling)s，費(fèi)約翰遜雷拉莫塔(ferreiramota)sc，諾塔(nouta)j，約翰遜(johnson)m，利普福德(lipford)gb，奧夫倫加(offringa)r，凡德伯格(vanderburg)sh，梅列夫(melief)cj(2002)隨著長肽的疫苗接種有效消除了已形成的人乳頭瘤病毒16型表達(dá)的腫瘤(establishedhumanpapillomavirustype16-expressingtumorsareeffectivelyeradicatedfollowingvaccinationwithlongpeptides)，免疫學(xué)雜志(jimmunol)169:350-358表i.序列seqidno:1(hpv16-e6e7sh，hpv16e6/e7設(shè)計(jì)多肽的氨基酸序列)seqidno:2(hpv16-e6e7sh，編碼hpv16e6/e7設(shè)計(jì)多肽的氨基酸序列的核苷酸序列)seqidno:3(hpv16e2e6e7sh，hpv16e2/e6/e7設(shè)計(jì)多肽的氨基酸序列)metlcqrlnvcqdkilthyendstdlrdhidywkhmrlecaiyykaremgfkhinhqvvptlavsknkalqaielqltletiynsqysnekwtlqdvslevyltaptgcikkhgytvevqfdgdicntmhytnwthiyiceeasvtvvegqvdyyglyyvhegirtyfvqfkddaekysknkvwevhaggqvilcptsvfssnevsspeiirqhlanhpaathtkavalgteetqttiqrprsepdtgnpchttkllhrdsvdsapiltafnsshkgrincnsnttpivhlkvdantlmrlryrfkkhctlytavsstwhwtghnvkhksaivtltydsewqrdqflsqvkipktitvstgfmsimhqkrtamfqdpqerprklpqlctelqttihdiilecvyckqqledeidgpagqaepdrahynivtfcckcdstlrlcvqsthvdirtledllmgtlgivcpicsqkpgttleqqynkplcdllircincqkplcpeekqrhldkkqrfhnirgrwtgrcmsccrssrtrretqmhgdtptlheymldlqpettdlycyeqlndsseeedeidgpagqaepdrahynivtfccqlctelqttihdiilecvyckqqllrrevydfafrdlcivyrdgnpyavcdkclkfyskiseyrhycyslygttleqqynkplcdllircincqkseqidno:4(hpv16e2e6e7sh，編碼hpv16e2/e6/e7設(shè)計(jì)多肽的核苷酸序列)atggaaaccctgtgccagcggctgaacgtgtgccaggacaagatcctgacccactacgagaacgacagcaccgacctgcgggaccacatcgactactggaagcacatgcggctggaatgcgccatctactacaaggccagagagatgggcttcaagcacatcaaccaccaggtggtgcccaccctggccgtgtccaagaacaaggccctgcaggccatcgagctgcagctgaccctggaaaccatctacaacagccagtacagcaacgagaagtggaccctgcaggacgtgtccctggaagtgtacctgaccgctcccaccggctgcatcaagaaacacggctacaccgtggaagtgcagttcgacggcgacatctgcaacaccatgcactacaccaactggacccacatctacatctgcgaagaggccagcgtgaccgtggtggaaggccaggtggactactacggcctgtactacgtgcacgagggcatccggacctacttcgtgcagttcaaggacgacgccgagaagtacagcaagaacaaagtgtgggaggtgcacgctggcggccaggtcatcctgtgccccaccagcgtgttcagcagcaacgaggtgtccagccccgagatcatccggcagcacctggccaatcaccctgccgccacccacacaaaggccgtggccctgggcaccgaggaaacccagaccaccatccagcggcccagaagcgagcccgacaccggcaatccctgccacaccaccaagctgctgcaccgggacagcgtggacagcgcccctatcctgaccgccttcaacagcagccacaagggccggatcaactgcaacagcaacaccacccccatcgtgcacctgaaggtggacgccaacaccctgatgcggctgcggtacagattcaagaagcactgcaccctgtacaccgccgtgtcctccacctggcactggaccggccacaacgtgaagcacaagagcgccatcgtgaccctgacctacgacagcgagtggcagcgggaccagttcctgagccaggtcaaaatccccaagaccatcaccgtgtccaccggcttcatgagcatcatgcaccagaaacggaccgccatgttccaggacccccaggaacggcccagaaagctgccccagctgtgcaccgagctgcagaccaccatccacgacatcatcctggaatgcgtgtactgcaagcagcagctggaagatgagatcgacggccctgctggccaggccgaacccgacagagcccactacaatatcgtgaccttctgctgcaagtgcgacagcaccctgcggctgtgcgtgcagagcacccacgtggacatccggaccctggaagatctgctgatgggcaccctgggcatcgtgtgccccatctgcagccagaagcccggcaccaccctggaacagcagtacaacaagcccctgtgcgacctgctgatccggtgcatcaactgccagaaacccctgtgccccgaggaaaagcagcggcacctggacaagaagcagcggttccacaacatccggggcagatggacaggcagatgcatgagctgctgcagaagcagccggaccagacgggaaacccagatgcacggcgacacccccaccctgcacgagtacatgctggacctgcagcccgagacaaccgacctgtactgctacgagcagctgaacgacagcagcgaggaagaggacgagattgacggacccgctggacaggccgagcctgaccgggctcactataacatcgtgacattttgctgtcagctctgtactgaactccagacaacaattcacgatattattctcgaatgtgtgtattgtaaacagcagctcctgcggagagaggtgtacgacttcgccttccgggacctctgcatcgtgtatcgggacggcaacccctacgccgtgtgcgacaagtgcctgaagttctacagcaagatcagcgagtaccggcactactgctacagcctgtacggaacaacactcgaacagcagtataacaaaccactctgtgatctgctgattcgctgtatcaattgtcagaagtgataaseqidno:5(hpv16e6e7e2sh，編碼hpv16e6/e7/e2設(shè)計(jì)多肽的氨基酸序列)mhqkrtamfqdpqerprklpqlctelqttihdiilecvyckqqledeidgpagqaepdrahynivtfcckcdstlrlcvqsthvdirtledllmgtlgivcpicsqkpgttleqqynkplcdllircincqkplcpeekqrhldkkqrfhnirgrwtgrcmsccrssrtrretqmhgdtptlheymldlqpettdlycyeqlndsseeedeidgpagqaepdrahynivtfccqlctelqttihdiilecvyckqqllrrevydfafrdlcivyrdgnpyavcdkclkfyskiseyrhycyslygttleqqynkplcdllircincqkmetlcqrlnvcqdkilthyendstdlrdhidywkhmrlecaiyykaremgfkhinhqvvptlavsknkalqaielqltletiynsqysnekwtlqdvslevyltaptgcikkhgytvevqfdgdicntmhytnwthiyiceeasvtvvegqvdyyglyyvhegirtyfvqfkddaekysknkvwevhaggqvilcptsvfssnevsspeiirqhlanhpaathtkavalgteetqttiqrprsepdtgnpchttkllhrdsvdsapiltafnsshkgrincnsnttpivhlkvdantlmrlryrfkkhctlytavsstwhwtghnvkhksaivtltydsewqrdqflsqvkipktitvstgfmsiseqidno:6(hpv16e6e7e2sh，編碼hpv16e6/e7/e2設(shè)計(jì)多肽的核苷酸序列)atgcaccagaaacggaccgccatgttccaggacccccaggaacggcccagaaagctgccccagctgtgcaccgagctgcagaccaccatccacgacatcatcctggaatgcgtgtactgcaagcagcagctggaagatgagatcgacggccctgctggccaggccgaacccgacagagcccactacaatatcgtgaccttctgctgcaagtgcgacagcaccctgcggctgtgcgtgcagagcacccacgtggacatccggaccctggaagatctgctgatgggcaccctgggcatcgtgtgccccatctgcagccagaagcccggcaccaccctggaacagcagtacaacaagcccctgtgcgacctgctgatccggtgcatcaactgccagaaacccctgtgccccgaggaaaagcagcggcacctggacaagaagcagcggttccacaacatccggggcagatggacaggcagatgcatgagctgctgcagaagcagccggaccagacgggaaacccagatgcacggcgacacccccaccctgcacgagtacatgctggacctgcagcccgagacaaccgacctgtactgctacgagcagctgaacgacagcagcgaggaagaggacgagattgacggacccgctggacaggccgagcctgaccgggctcactataacatcgtgacattttgctgtcagctctgtactgaactccagacaacaattcacgatattattctcgaatgtgtgtattgtaaacagcagctcctgcggagagaggtgtacgacttcgccttccgggacctctgcatcgtgtatcgggacggcaacccctacgccgtgtgcgacaagtgcctgaagttctacagcaagatcagcgagtaccggcactactgctacagcctgtacggaacaacactcgaacagcagtataacaaaccactctgtgatctgctgattcgctgtatcaattgtcagaagatggaaaccctgtgccagcggctgaacgtgtgccaggacaagatcctgacccactacgagaacgacagcaccgacctgcgggaccacatcgactactggaagcacatgcggctggaatgcgccatctactacaaggccagagagatgggcttcaagcacatcaaccaccaggtggtgcccaccctggccgtgtccaagaacaaggccctgcaggccatcgagctgcagctgaccctggaaaccatctacaacagccagtacagcaacgagaagtggaccctgcaggacgtgtccctggaagtgtacctgaccgctcccaccggctgcatcaagaaacacggctacaccgtggaagtgcagttcgacggcgacatctgcaacaccatgcactacaccaactggacccacatctacatctgcgaagaggccagcgtgaccgtggtggaaggccaggtggactactacggcctgtactacgtgcacgagggcatccggacctacttcgtgcagttcaaggacgacgccgagaagtacagcaagaacaaagtgtgggaggtgcacgctggcggccaggtcatcctgtgccccaccagcgtgttcagcagcaacgaggtgtccagccccgagatcatccggcagcacctggccaatcaccctgccgccacccacacaaaggccgtggccctgggcaccgaggaaacccagaccaccatccagcggcccagaagcgagcccgacaccggcaatccctgccacaccaccaagctgctgcaccgggacagcgtggacagcgcccctatcctgaccgccttcaacagcagccacaagggccggatcaactgcaacagcaacaccacccccatcgtgcacctgaaggtggacgccaacaccctgatgcggctgcggtacagattcaagaagcactgcaccctgtacaccgccgtgtcctccacctggcactggaccggccacaacgtgaagcacaagagcgccatcgtgaccctgacctacgacagcgagtggcagcgggaccagttcctgagccaggtcaaaatccccaagaccatcaccgtgtccaccggcttcatgagcatctgataaseqidno:7(ige前導(dǎo)肽氨基酸序列)mdwtwilflvaaatrvhsseqidno:8(編碼ige前導(dǎo)肽的核苷酸序列)atggactggacctggatcctgttcctggtggctgccgcaacccgggtgcacagcseqidno:9(aahavt20前導(dǎo)肽氨基酸序列)macpgflwalvistclefsmaseqidno:10(編碼havt20前導(dǎo)肽的核苷酸序列)atggcctgccccggctttctgtgggccctggtcatcagcacctgtctggaattcagcatggccseqidno:11(包含2xteto的序列)gagctctccctatcagtgatagagatctccctatcagtgatagagatcgtcgacseqidno:12(包含cuo的序列)aacaaacagacaatctggtctgtttgtaseqidno:13(存在于padapt26和padapt35質(zhì)粒中的cmv啟動(dòng)子)tcaatattggccattagccatattattcattggttatatagcataaatcaatattggctattggccattgcatacgttgtatccatatcataatatgtacatttatattggctcatgtccaacattaccgccatgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctccgcggccgggaacggtgcattggaseqidno:14(tetr，編碼由pcdnatm6/tr表達(dá)的tetr多肽的氨基酸序列的核苷酸序列)atgtctagattagataaaagtaaagtgattaacagcgcattagagctgcttaatgaggtcggaatcgaaggtttaacaacccgtaaactcgcccagaagctaggtgtagagcagcctacattgtattggcatgtaaaaaataagcgggctttgctcgacgccttagccattgagatgttagataggcaccatactcacttttgccctttagaaggggaaagctggcaagattttttacgtaataacgctaaaagttttagatgtgctttactaagtcatcgcgatggagcaaaagtacatttaggtacacggcctacagaaaaacagtatgaaactctcgaaaatcaattagcctttttatgccaacaaggtttttcactagagaatgcattatatgcactcagcgctgtggggcattttactttaggttgcgtattggaagatcaagagcatcaagtcgctaaagaagaaagggaaacacctactactgatagtatgccgccattattacgacaagctatcgaattatttgatcaccaaggtgcagagccagccttcttattcggccttgaattgatcatatgcggattagaaaaacaacttaaatgtgaaagtgggtccgcgtacagcggatcccgggaattcagatcttattaaseqidno:15(tetr，由pcdnatm6/tr表達(dá)的tetr多肽的氨基酸序列)msrldkskvinsalellnevgieglttrklaqklgveqptlywhvknkralldalaiemldrhhthfcplegeswqdflrnnaksfrcallshrdgakvhlgtrptekqyetlenqlaflcqqgfslenalyalsavghftlgcvledqehqvakeeretpttdsmppllrqaielfdhqgaepaflfgleliicglekqlkcesgsaysgsrefrsyseqidno:16(cymr，編碼cymr多肽的氨基酸序列的核苷酸序列)atgtctcccaaacgacggactcaagcggaaagggcaatggaaactcagggtaagctgattgccgcggctctgggagtgctgcgagagaaagggtatgccgggtttcgcatagccgacgttcctggagctgcaggcgtaagcagaggagcccaatctcatcactttccgaccaagctggagcttttgctggctaccttcgaatggctgtacgagcagatcacggaaaggagtcgtgctaggctggccaagctgaaacccgaggatgatgtcattcagcagatgctggacgatgcagccgagttcttcctggacgacgacttcagcatcagtctcgacctcatcgtagccgcagatcgcgatccagctttgcgcgagggcatacagagaacagtcgagcggaatcggtttgtggtggaggacatgtggcttggtgttctggtgagcagaggcctctcacgggatgatgccgaggacatcctgtggctgatctttaactccgtcagagggttggcagtgaggtccctttggcagaaggacaaagaacggtttgaacgtgtgcgaaactcaacactcgagattgctagggaacgctacgccaagttcaagagatgaseqidno:17(cymr，cymr多肽的氨基酸序列)mspkrrtqaerametqgkliaaalgvlrekgyagfriadvpgaagvsrgaqshhfptklelllatfewlyeqitersrarlaklkpeddviqqmlddaaeffldddfsisldlivaadrdpalregiqrtvernrfvvedmwlgvlvsrglsrddaedilwlifnsvrglavrslwqkdkerfervrnstleiareryakfkrseqidno:18(hpv16e6，aa41-65)kqqllrrevydfafrdlcivyrdgnseqidno:19(hpv16e7aa43-77)gqaepdrahynivtfcckcdstlrlcvqsthvdir序列表<110>荷蘭庫賽爾私人公司（crucellhollandb.v.）邦尼克，艾薇琳·瑪格麗莎（bunnik,evelienmargaretha）卡斯特，杰羅姆·胡波蒂娜·亨里克斯·維克多（custers,jeromehubertinahenricusvictor）舍佩爾，格里特·克里斯蒂安（scheper,gerritchristiaan）奧斯特惠斯，科恩（oosterhuis,koen）尤里，吉爾·塔克（uil,tacogilles）卡恩，賽琳娜（khan,selina）<120>治療性hpv16疫苗<130>0248wo00ord<160>19<170>patentin版本3.5<210>1<211>328<212>prt<213>人工序列<220><223>hpv16-e6e7sh設(shè)計(jì)的多肽<400>1methisglnlysargthralametpheglnaspproglngluargpro151015arglysleuproglnleucysthrgluleuglnthrthrilehisasp202530ileileleuglucysvaltyrcyslysglnglnleugluaspgluile354045aspglyproalaglyglnalagluproaspargalahistyrasnile505560valthrphecyscyslyscysaspserthrleuargleucysvalgln65707580serthrhisvalaspileargthrleugluaspleuleumetglythr859095leuglyilevalcysproilecysserglnlysproglythrthrleu100105110gluglnglntyrasnlysproleucysaspleuleuileargcysile115120125asncysglnlysproleucysprogluglulysglnarghisleuasp130135140lyslysglnargphehisasnileargglyargtrpthrglyargcys145150155160metsercyscysargserserargthrargarggluthrglnmethis165170175glyaspthrprothrleuhisglutyrmetleuaspleuglnproglu180185190thrthraspleutyrcystyrgluglnleuasnaspsersergluglu195200205gluaspgluileaspglyproalaglyglnalagluproaspargala210215220histyrasnilevalthrphecyscysglnleucysthrgluleugln225230235240thrthrilehisaspileileleuglucysvaltyrcyslysglngln245250255leuleuargarggluvaltyraspphealapheargaspleucysile260265270valtyrargaspglyasnprotyralavalcysasplyscysleulys275280285phetyrserlysileserglutyrarghistyrcystyrserleutyr290295300glythrthrleugluglnglntyrasnlysproleucysaspleuleu305310315320ileargcysileasncysglnlys325<210>2<211>990<212>dna<213>人工序列<220><223>編碼hpv16-e6e7sh設(shè)計(jì)的多肽的nt序列<400>2atgcaccagaaacggaccgccatgttccaggacccccaggaacggcccagaaagctgccc60cagctgtgcaccgagctgcagaccaccatccacgacatcatcctggaatgcgtgtactgc120aagcagcagctggaagatgagatcgacggccctgctggccaggccgaacccgacagagcc180cactacaatatcgtgaccttctgctgcaagtgcgacagcaccctgcggctgtgcgtgcag240agcacccacgtggacatccggaccctggaagatctgctgatgggcaccctgggcatcgtg300tgccccatctgcagccagaagcccggcaccaccctggaacagcagtacaacaagcccctg360tgcgacctgctgatccggtgcatcaactgccagaaacccctgtgccccgaggaaaagcag420cggcacctggacaagaagcagcggttccacaacatccggggcagatggacaggcagatgc480atgagctgctgcagaagcagccggaccagacgggaaacccagatgcacggcgacaccccc540accctgcacgagtacatgctggacctgcagcccgagacaaccgacctgtactgctacgag600cagctgaacgacagcagcgaggaagaggacgagattgacggacccgctggacaggccgag660cctgaccgggctcactataacatcgtgacattttgctgtcagctctgtactgaactccag720acaacaattcacgatattattctcgaatgtgtgtattgtaaacagcagctcctgcggaga780gaggtgtacgacttcgccttccgggacctctgcatcgtgtatcgggacggcaacccctac840gccgtgtgcgacaagtgcctgaagttctacagcaagatcagcgagtaccggcactactgc900tacagcctgtacggaacaacactcgaacagcagtataacaaaccactctgtgatctgctg960attcgctgtatcaattgtcagaagtgataa990<210>3<211>693<212>prt<213>人工序列<220><223>hpv16e2e6e7sh設(shè)計(jì)的多肽<400>3metgluthrleucysglnargleuasnvalcysglnasplysileleu151015thrhistyrgluasnaspserthraspleuargasphisileasptyr202530trplyshismetargleuglucysalailetyrtyrlysalaargglu354045metglyphelyshisileasnhisglnvalvalprothrleualaval505560serlysasnlysalaleuglnalailegluleuglnleuthrleuglu65707580thriletyrasnserglntyrserasnglulystrpthrleuglnasp859095valserleugluvaltyrleuthralaprothrglycysilelyslys100105110hisglytyrthrvalgluvalglnpheaspglyaspilecysasnthr115120125methistyrthrasntrpthrhisiletyrilecysgluglualaser130135140valthrvalvalgluglyglnvalasptyrtyrglyleutyrtyrval145150155160hisgluglyileargthrtyrphevalglnphelysaspaspalaglu165170175lystyrserlysasnlysvaltrpgluvalhisalaglyglyglnval180185190ileleucysprothrservalpheserserasngluvalserserpro195200205gluileileargglnhisleualaasnhisproalaalathrhisthr210215220lysalavalalaleuglythrglugluthrglnthrthrileglnarg225230235240proargsergluproaspthrglyasnprocyshisthrthrlysleu245250255leuhisargaspservalaspseralaproileleuthralapheasn260265270serserhislysglyargileasncysasnserasnthrthrproile275280285valhisleulysvalaspalaasnthrleumetargleuargtyrarg290295300phelyslyshiscysthrleutyrthralavalserserthrtrphis305310315320trpthrglyhisasnvallyshislysseralailevalthrleuthr325330335tyraspserglutrpglnargaspglnpheleuserglnvallysile340345350prolysthrilethrvalserthrglyphemetserilemethisgln355360365lysargthralametpheglnaspproglngluargproarglysleu370375380proglnleucysthrgluleuglnthrthrilehisaspileileleu385390395400glucysvaltyrcyslysglnglnleugluaspgluileaspglypro405410415alaglyglnalagluproaspargalahistyrasnilevalthrphe420425430cyscyslyscysaspserthrleuargleucysvalglnserthrhis435440445valaspileargthrleugluaspleuleumetglythrleuglyile450455460valcysproilecysserglnlysproglythrthrleugluglngln465470475480tyrasnlysproleucysaspleuleuileargcysileasncysgln485490495lysproleucysprogluglulysglnarghisleuasplyslysgln500505510argphehisasnileargglyargtrpthrglyargcysmetsercys515520525cysargserserargthrargarggluthrglnmethisglyaspthr530535540prothrleuhisglutyrmetleuaspleuglnprogluthrthrasp545550555560leutyrcystyrgluglnleuasnaspsersergluglugluaspglu565570575ileaspglyproalaglyglnalagluproaspargalahistyrasn580585590ilevalthrphecyscysglnleucysthrgluleuglnthrthrile595600605hisaspileileleuglucysvaltyrcyslysglnglnleuleuarg610615620arggluvaltyraspphealapheargaspleucysilevaltyrarg625630635640aspglyasnprotyralavalcysasplyscysleulysphetyrser645650655lysileserglutyrarghistyrcystyrserleutyrglythrthr660665670leugluglnglntyrasnlysproleucysaspleuleuileargcys675680685ileasncysglnlys690<210>4<211>2085<212>dna<213>人工序列<220><223>編碼hpv16e2e6e7sh設(shè)計(jì)的多肽的nt序列<400>4atggaaaccctgtgccagcggctgaacgtgtgccaggacaagatcctgacccactacgag60aacgacagcaccgacctgcgggaccacatcgactactggaagcacatgcggctggaatgc120gccatctactacaaggccagagagatgggcttcaagcacatcaaccaccaggtggtgccc180accctggccgtgtccaagaacaaggccctgcaggccatcgagctgcagctgaccctggaa240accatctacaacagccagtacagcaacgagaagtggaccctgcaggacgtgtccctggaa300gtgtacctgaccgctcccaccggctgcatcaagaaacacggctacaccgtggaagtgcag360ttcgacggcgacatctgcaacaccatgcactacaccaactggacccacatctacatctgc420gaagaggccagcgtgaccgtggtggaaggccaggtggactactacggcctgtactacgtg480cacgagggcatccggacctacttcgtgcagttcaaggacgacgccgagaagtacagcaag540aacaaagtgtgggaggtgcacgctggcggccaggtcatcctgtgccccaccagcgtgttc600agcagcaacgaggtgtccagccccgagatcatccggcagcacctggccaatcaccctgcc660gccacccacacaaaggccgtggccctgggcaccgaggaaacccagaccaccatccagcgg720cccagaagcgagcccgacaccggcaatccctgccacaccaccaagctgctgcaccgggac780agcgtggacagcgcccctatcctgaccgccttcaacagcagccacaagggccggatcaac840tgcaacagcaacaccacccccatcgtgcacctgaaggtggacgccaacaccctgatgcgg900ctgcggtacagattcaagaagcactgcaccctgtacaccgccgtgtcctccacctggcac960tggaccggccacaacgtgaagcacaagagcgccatcgtgaccctgacctacgacagcgag1020tggcagcgggaccagttcctgagccaggtcaaaatccccaagaccatcaccgtgtccacc1080ggcttcatgagcatcatgcaccagaaacggaccgccatgttccaggacccccaggaacgg1140cccagaaagctgccccagctgtgcaccgagctgcagaccaccatccacgacatcatcctg1200gaatgcgtgtactgcaagcagcagctggaagatgagatcgacggccctgctggccaggcc1260gaacccgacagagcccactacaatatcgtgaccttctgctgcaagtgcgacagcaccctg1320cggctgtgcgtgcagagcacccacgtggacatccggaccctggaagatctgctgatgggc1380accctgggcatcgtgtgccccatctgcagccagaagcccggcaccaccctggaacagcag1440tacaacaagcccctgtgcgacctgctgatccggtgcatcaactgccagaaacccctgtgc1500cccgaggaaaagcagcggcacctggacaagaagcagcggttccacaacatccggggcaga1560tggacaggcagatgcatgagctgctgcagaagcagccggaccagacgggaaacccagatg1620cacggcgacacccccaccctgcacgagtacatgctggacctgcagcccgagacaaccgac1680ctgtactgctacgagcagctgaacgacagcagcgaggaagaggacgagattgacggaccc1740gctggacaggccgagcctgaccgggctcactataacatcgtgacattttgctgtcagctc1800tgtactgaactccagacaacaattcacgatattattctcgaatgtgtgtattgtaaacag1860cagctcctgcggagagaggtgtacgacttcgccttccgggacctctgcatcgtgtatcgg1920gacggcaacccctacgccgtgtgcgacaagtgcctgaagttctacagcaagatcagcgag1980taccggcactactgctacagcctgtacggaacaacactcgaacagcagtataacaaacca2040ctctgtgatctgctgattcgctgtatcaattgtcagaagtgataa2085<210>5<211>693<212>prt<213>人工序列<220><223>hpv16e6e7e2sh設(shè)計(jì)的多肽<400>5methisglnlysargthralametpheglnaspproglngluargpro151015arglysleuproglnleucysthrgluleuglnthrthrilehisasp202530ileileleuglucysvaltyrcyslysglnglnleugluaspgluile354045aspglyproalaglyglnalagluproaspargalahistyrasnile505560valthrphecyscyslyscysaspserthrleuargleucysvalgln65707580serthrhisvalaspileargthrleugluaspleuleumetglythr859095leuglyilevalcysproilecysserglnlysproglythrthrleu100105110gluglnglntyrasnlysproleucysaspleuleuileargcysile115120125asncysglnlysproleucysprogluglulysglnarghisleuasp130135140lyslysglnargphehisasnileargglyargtrpthrglyargcys145150155160metsercyscysargserserargthrargarggluthrglnmethis165170175glyaspthrprothrleuhisglutyrmetleuaspleuglnproglu180185190thrthraspleutyrcystyrgluglnleuasnaspsersergluglu195200205gluaspgluileaspglyproalaglyglnalagluproaspargala210215220histyrasnilevalthrphecyscysglnleucysthrgluleugln225230235240thrthrilehisaspileileleuglucysvaltyrcyslysglngln245250255leuleuargarggluvaltyraspphealapheargaspleucysile260265270valtyrargaspglyasnprotyralavalcysasplyscysleulys275280285phetyrserlysileserglutyrarghistyrcystyrserleutyr290295300glythrthrleugluglnglntyrasnlysproleucysaspleuleu305310315320ileargcysileasncysglnlysmetgluthrleucysglnargleu325330335asnvalcysglnasplysileleuthrhistyrgluasnaspserthr340345350aspleuargasphisileasptyrtrplyshismetargleuglucys355360365alailetyrtyrlysalaargglumetglyphelyshisileasnhis370375380glnvalvalprothrleualavalserlysasnlysalaleuglnala385390395400ilegluleuglnleuthrleugluthriletyrasnserglntyrser405410415asnglulystrpthrleuglnaspvalserleugluvaltyrleuthr420425430alaprothrglycysilelyslyshisglytyrthrvalgluvalgln435440445pheaspglyaspilecysasnthrmethistyrthrasntrpthrhis450455460iletyrilecysgluglualaservalthrvalvalgluglyglnval465470475480asptyrtyrglyleutyrtyrvalhisgluglyileargthrtyrphe485490495valglnphelysaspaspalaglulystyrserlysasnlysvaltrp500505510gluvalhisalaglyglyglnvalileleucysprothrservalphe515520525serserasngluvalserserprogluileileargglnhisleuala530535540asnhisproalaalathrhisthrlysalavalalaleuglythrglu545550555560gluthrglnthrthrileglnargproargsergluproaspthrgly565570575asnprocyshisthrthrlysleuleuhisargaspservalaspser580585590alaproileleuthralapheasnserserhislysglyargileasn595600605cysasnserasnthrthrproilevalhisleulysvalaspalaasn610615620thrleumetargleuargtyrargphelyslyshiscysthrleutyr625630635640thralavalserserthrtrphistrpthrglyhisasnvallyshis645650655lysseralailevalthrleuthrtyraspserglutrpglnargasp660665670glnpheleuserglnvallysileprolysthrilethrvalserthr675680685glyphemetserile690<210>6<211>2085<212>dna<213>人工序列<220><223>編碼hpv16e6e7e2sh設(shè)計(jì)的多肽的nt序列<400>6atgcaccagaaacggaccgccatgttccaggacccccaggaacggcccagaaagctgccc60cagctgtgcaccgagctgcagaccaccatccacgacatcatcctggaatgcgtgtactgc120aagcagcagctggaagatgagatcgacggccctgctggccaggccgaacccgacagagcc180cactacaatatcgtgaccttctgctgcaagtgcgacagcaccctgcggctgtgcgtgcag240agcacccacgtggacatccggaccctggaagatctgctgatgggcaccctgggcatcgtg300tgccccatctgcagccagaagcccggcaccaccctggaacagcagtacaacaagcccctg360tgcgacctgctgatccggtgcatcaactgccagaaacccctgtgccccgaggaaaagcag420cggcacctggacaagaagcagcggttccacaacatccggggcagatggacaggcagatgc480atgagctgctgcagaagcagccggaccagacgggaaacccagatgcacggcgacaccccc540accctgcacgagtacatgctggacctgcagcccgagacaaccgacctgtactgctacgag600cagctgaacgacagcagcgaggaagaggacgagattgacggacccgctggacaggccgag660cctgaccgggctcactataacatcgtgacattttgctgtcagctctgtactgaactccag720acaacaattcacgatattattctcgaatgtgtgtattgtaaacagcagctcctgcggaga780gaggtgtacgacttcgccttccgggacctctgcatcgtgtatcgggacggcaacccctac840gccgtgtgcgacaagtgcctgaagttctacagcaagatcagcgagtaccggcactactgc900tacagcctgtacggaacaacactcgaacagcagtataacaaaccactctgtgatctgctg960attcgctgtatcaattgtcagaagatggaaaccctgtgccagcggctgaacgtgtgccag1020gacaagatcctgacccactacgagaacgacagcaccgacctgcgggaccacatcgactac1080tggaagcacatgcggctggaatgcgccatctactacaaggccagagagatgggcttcaag1140cacatcaaccaccaggtggtgcccaccctggccgtgtccaagaacaaggccctgcaggcc1200atcgagctgcagctgaccctggaaaccatctacaacagccagtacagcaacgagaagtgg1260accctgcaggacgtgtccctggaagtgtacctgaccgctcccaccggctgcatcaagaaa1320cacggctacaccgtggaagtgcagttcgacggcgacatctgcaacaccatgcactacacc1380aactggacccacatctacatctgcgaagaggccagcgtgaccgtggtggaaggccaggtg1440gactactacggcctgtactacgtgcacgagggcatccggacctacttcgtgcagttcaag1500gacgacgccgagaagtacagcaagaacaaagtgtgggaggtgcacgctggcggccaggtc1560atcctgtgccccaccagcgtgttcagcagcaacgaggtgtccagccccgagatcatccgg1620cagcacctggccaatcaccctgccgccacccacacaaaggccgtggccctgggcaccgag1680gaaacccagaccaccatccagcggcccagaagcgagcccgacaccggcaatccctgccac1740accaccaagctgctgcaccgggacagcgtggacagcgcccctatcctgaccgccttcaac1800agcagccacaagggccggatcaactgcaacagcaacaccacccccatcgtgcacctgaag1860gtggacgccaacaccctgatgcggctgcggtacagattcaagaagcactgcaccctgtac1920accgccgtgtcctccacctggcactggaccggccacaacgtgaagcacaagagcgccatc1980gtgaccctgacctacgacagcgagtggcagcgggaccagttcctgagccaggtcaaaatc2040cccaagaccatcaccgtgtccaccggcttcatgagcatctgataa2085<210>7<211>18<212>prt<213>人工序列<220><223>ige前導(dǎo)肽<400>7metasptrpthrtrpileleupheleuvalalaalaalathrargval151015hisser<210>8<211>54<212>dna<213>人工序列<220><223>編碼ige前導(dǎo)肽的nt序列<400>8atggactggacctggatcctgttcctggtggctgccgcaacccgggtgcacagc54<210>9<211>21<212>prt<213>人工序列<220><223>havt20前導(dǎo)肽<400>9metalacysproglypheleutrpalaleuvalileserthrcysleu151015gluphesermetala20<210>10<211>63<212>dna<213>人工序列<220><223>編碼havt20前導(dǎo)肽的nt序列<400>10atggcctgccccggctttctgtgggccctggtcatcagcacctgtctggaattcagcatg60gcc63<210>11<211>54<212>dna<213>人工序列<220><223>含有2xteto的序列<400>11gagctctccctatcagtgatagagatctccctatcagtgatagagatcgtcgac54<210>12<211>28<212>dna<213>人工序列<220><223>含有cuo的序列<400>12aacaaacagacaatctggtctgtttgta28<210>13<211>829<212>dna<213>人工序列<220><223>cmv啟動(dòng)子<400>13tcaatattggccattagccatattattcattggttatatagcataaatcaatattggcta60ttggccattgcatacgttgtatccatatcataatatgtacatttatattggctcatgtcc120aacattaccgccatgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggg180gtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggccc240gcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccat300agtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgc360ccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatga420cggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttg480gcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacat540caatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgt600caatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactc660cgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagc720tcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatag780aagacaccgggaccgatccagcctccgcggccgggaacggtgcattgga829<210>14<211>657<212>dna<213>人工序列<220><223>編碼tetr多肽的nt序列<400>14atgtctagattagataaaagtaaagtgattaacagcgcattagagctgcttaatgaggtc60ggaatcgaaggtttaacaacccgtaaactcgcccagaagctaggtgtagagcagcctaca120ttgtattggcatgtaaaaaataagcgggctttgctcgacgccttagccattgagatgtta180gataggcaccatactcacttttgccctttagaaggggaaagctggcaagattttttacgt240aataacgctaaaagttttagatgtgctttactaagtcatcgcgatggagcaaaagtacat300ttaggtacacggcctacagaaaaacagtatgaaactctcgaaaatcaattagccttttta360tgccaacaaggtttttcactagagaatgcattatatgcactcagcgctgtggggcatttt420actttaggttgcgtattggaagatcaagagcatcaagtcgctaaagaagaaagggaaaca480cctactactgatagtatgccgccattattacgacaagctatcgaattatttgatcaccaa540ggtgcagagccagccttcttattcggccttgaattgatcatatgcggattagaaaaacaa600cttaaatgtgaaagtgggtccgcgtacagcggatcccgggaattcagatcttattaa657<210>15<211>218<212>prt<213>人工序列<220><223>tetr多肽<400>15metserargleuasplysserlysvalileasnseralaleugluleu151015leuasngluvalglyilegluglyleuthrthrarglysleualagln202530lysleuglyvalgluglnprothrleutyrtrphisvallysasnlys354045argalaleuleuaspalaleualaileglumetleuasparghishis505560thrhisphecysproleugluglyglusertrpglnasppheleuarg65707580asnasnalalysserpheargcysalaleuleuserhisargaspgly859095alalysvalhisleuglythrargprothrglulysglntyrgluthr100105110leugluasnglnleualapheleucysglnglnglypheserleuglu115120125asnalaleutyralaleuseralavalglyhisphethrleuglycys130135140valleugluaspglngluhisglnvalalalysglugluarggluthr145150155160prothrthraspsermetproproleuleuargglnalailegluleu165170175pheasphisglnglyalagluproalapheleupheglyleugluleu180185190ileilecysglyleuglulysglnleulyscysgluserglyserala195200205tyrserglyserargglupheargsertyr210215<210>16<211>612<212>dna<213>人工序列<220><223>編碼cymr多肽的nt序列<400>16atgtctcccaaacgacggactcaagcggaaagggcaatggaaactcagggtaagctgatt60gccgcggctctgggagtgctgcgagagaaagggtatgccgggtttcgcatagccgacgtt120cctggagctgcaggcgtaagcagaggagcccaatctcatcactttccgaccaagctggag180cttttgctggctaccttcgaatggctgtacgagcagatcacggaaaggagtcgtgctagg240ctggccaagctgaaacccgaggatgatgtcattcagcagatgctggacgatgcagccgag300ttcttcctggacgacgacttcagcatcagtctcgacctcatcgtagccgcagatcgcgat360ccagctttgcgcgagggcatacagagaacagtcgagcggaatcggtttgtggtggaggac420atgtggcttggtgttctggtgagcagaggcctctcacgggatgatgccgaggacatcctg480tggctgatctttaactccgtcagagggttggcagtgaggtccctttggcagaaggacaaa540gaacggtttgaacgtgtgcgaaactcaacactcgagattgctagggaacgctacgccaag600ttcaagagatga612<210>17<211>203<212>prt<213>人工序列<220><223>cymr多肽<400>17metserprolysargargthrglnalagluargalametgluthrgln151015glylysleuilealaalaalaleuglyvalleuargglulysglytyr202530alaglypheargilealaaspvalproglyalaalaglyvalserarg354045glyalaglnserhishispheprothrlysleugluleuleuleuala505560thrpheglutrpleutyrgluglnilethrgluargserargalaarg65707580leualalysleulysprogluaspaspvalileglnglnmetleuasp859095aspalaalagluphepheleuaspaspasppheserileserleuasp100105110leuilevalalaalaaspargaspproalaleuarggluglyilegln115120125argthrvalgluargasnargphevalvalgluaspmettrpleugly130135140valleuvalserargglyleuserargaspaspalagluaspileleu145150155160trpleuilepheasnservalargglyleualavalargserleutrp165170175glnlysasplysgluargphegluargvalargasnserthrleuglu180185190ilealaarggluargtyralalysphelysarg195200<210>18<211>25<212>prt<213>人工序列<220><223>hpv16e6aa41-65<400>18lysglnglnleuleuargarggluvaltyraspphealapheargasp151015leucysilevaltyrargaspglyasn2025<210>19<211>35<212>prt<213>人工序列<220><223>hpv16e7aa43-77<400>19glyglnalagluproaspargalahistyrasnilevalthrphecys151015cyslyscysaspserthrleuargleucysvalglnserthrhisval202530aspilearg35當(dāng)前第1頁12當(dāng)前第1頁12