相關(guān)專利申請(qǐng)本申請(qǐng)要求于2014年5月20日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)no.61/000,895的優(yōu)先權(quán)，其全文以引用方式并入本文。政府支持本發(fā)明是在國(guó)家衛(wèi)生研究院資助的11033、dk054759、ns050210和ns068099下由政府支持完成的。政府享有本發(fā)明的某些權(quán)利。發(fā)明背景rnai通過(guò)被加工成功能性的小的抑制性rna(~21nt)的雙鏈rna(dsrna)引導(dǎo)序列特異性基因沉默。在自然界中，用于調(diào)控基因表達(dá)的rnai主要通過(guò)被稱為微rna(mirna)的小rna進(jìn)行。成熟的微rna(~19-25個(gè)核苷酸)是由更大的含有莖-環(huán)區(qū)的初級(jí)mirna轉(zhuǎn)錄物(pri-mirna)加工而成。經(jīng)過(guò)由核糖核酸酶drosha和dicer催化的一系列加工事件，mirna雙鏈區(qū)被解開，而隨后一條單鏈(反義“引導(dǎo)”鏈)被并入到rna誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(risc)中，從而生成能夠與靶轉(zhuǎn)錄物堿基配對(duì)并使之沉默的功能性復(fù)合體。靶標(biāo)抑制的模式主要取決于互補(bǔ)程度；轉(zhuǎn)錄物裂解通常要求高度的堿基配對(duì)，而當(dāng)小rna不完全結(jié)合至靶轉(zhuǎn)錄物（最常在3′utr中）時(shí)發(fā)生翻譯抑制和mrna去穩(wěn)定。事實(shí)上對(duì)于后者而言，一小段的互補(bǔ)–短至6bp–可能足以引起基因沉默。發(fā)明概述本發(fā)明提供了分離的mirna穿梭載體，其表達(dá)具有有限的脫靶毒性的治療性sirna。在某些實(shí)施方案中，將具有脫靶毒性的sirna嵌入本發(fā)明的mirna穿梭載體的背景中會(huì)限制所述sirna的脫靶毒性。在某些實(shí)施方案中，所述mirna穿梭載體在腦中表達(dá)具有有限的脫靶毒性的治療性sirna。在某些實(shí)施方案中，所述mirna穿梭載體在紋狀體中表達(dá)具有有限的脫靶毒性的治療性sirna。在某些實(shí)施方案中，所述mirna穿梭載體在大腦中表達(dá)具有有限的脫靶毒性的治療性sirna。本發(fā)明提供了編碼初級(jí)轉(zhuǎn)錄物(pri-mirna)的分離的核酸，其包括，依位置順序：5′-側(cè)翼區(qū)、非引導(dǎo)(乘客)區(qū)、環(huán)區(qū)、引導(dǎo)區(qū)和3′-側(cè)翼區(qū)，其中所述引導(dǎo)區(qū)由seqidno:37(mihdss3)、seqidno:6(mihds1v5u)或seqidno:7(mihds1v6a)組成，并且所述非引導(dǎo)區(qū)與所述引導(dǎo)區(qū)至少80%互補(bǔ)。在某些實(shí)施方案中，所述非引導(dǎo)區(qū)與所述引導(dǎo)區(qū)至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%互補(bǔ)。在某些實(shí)施方案中，所述5′-側(cè)翼區(qū)連續(xù)連接至所述非引導(dǎo)區(qū)，所述環(huán)區(qū)位于所述非引導(dǎo)區(qū)和所述引導(dǎo)區(qū)之間，而所述引導(dǎo)區(qū)連續(xù)連接至所述3′-側(cè)翼區(qū)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“sirna引導(dǎo)區(qū)”是與靶序列互補(bǔ)的rna單鏈序列。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“sirna非引導(dǎo)區(qū)”是與“sirna引導(dǎo)區(qū)”互補(bǔ)的rna單鏈序列。因此，在適當(dāng)條件下，所述sirna引導(dǎo)區(qū)與所述sirna非引導(dǎo)區(qū)締合以形成rna雙鏈。如本文所用，按慣例，以5′至3′的方向列出了所有的核酸序列。在某些實(shí)施方案中，所述5′-側(cè)翼區(qū)含有連續(xù)連接至所述非引導(dǎo)區(qū)的5′-接合序列。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“接合位點(diǎn)”或“接合序列”是少于60個(gè)核苷酸的短核酸序列，其將兩個(gè)其它核酸序列連接起來(lái)。在某些實(shí)施方案中，接合位點(diǎn)的長(zhǎng)度為4至50之間的任意整數(shù)（包括端點(diǎn)）。在某些實(shí)施方案中，所述5′-接合序列由5-8個(gè)核苷酸組成（例如，由6個(gè)核苷酸組成）。在某些實(shí)施方案中，所述5′-接合序列編碼gugagcga(seqidno:13)或gugagcgc(seqidno:14)。在某些實(shí)施方案中，所述5′-側(cè)翼區(qū)還包含位于所述5′-接合序列上游的5′-凸序列。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“凸序列”是與在雙鏈中與之相對(duì)的核酸非互補(bǔ)的核酸區(qū)。例如，雙鏈將含有互補(bǔ)核酸區(qū)，然后是非互補(bǔ)核酸區(qū)，后接第二個(gè)互補(bǔ)核酸區(qū)。這些互補(bǔ)核酸區(qū)將彼此結(jié)合，而中間的非互補(bǔ)區(qū)將不結(jié)合，從而形成“凸起”。在某些實(shí)施方案中，位于所述兩個(gè)互補(bǔ)區(qū)之間的兩條核酸鏈將具有不同的長(zhǎng)度，從而形成“凸起”。在某些實(shí)施方案中，所述5′-凸序列將含有2至15個(gè)核苷酸。在某些實(shí)施方案中，所述5′-凸序列由約1-10個(gè)核苷酸組成。在某些實(shí)施方案中，所述5′-凸序列編碼uaaacucga(seqidno:15)。在某些實(shí)施方案中，所述5′-凸序列與3′-凸序列具有0-50%的互補(bǔ)性。在某些實(shí)施方案中，所述5′-側(cè)翼區(qū)還含有位于所述5′-凸序列上游的5′-間隔序列。在某些實(shí)施方案中，所述5′-間隔序列由9-12個(gè)核苷酸（如10-12個(gè)核苷酸）組成。在某些實(shí)施方案中，所述5′-間隔序列與3′-間隔序列具有60-100%的互補(bǔ)性。在某些實(shí)施方案中，所述5′-凸序列包含克隆位點(diǎn)，如xhoi位點(diǎn)。在某些實(shí)施方案中，所述5′-間隔序列是ugguaccguu(seqidno:16)。在某些實(shí)施方案中，所述5′-側(cè)翼區(qū)還含有位于所述5′-間隔序列上游的5′-上游序列。在某些實(shí)施方案中，所述5′-上游序列長(zhǎng)約5-5000個(gè)核苷酸（如30-2000個(gè)核苷酸）。在某些實(shí)施方案中，所述3′-側(cè)翼區(qū)含有連續(xù)連接至所述引導(dǎo)區(qū)的3′-接合序列。在某些實(shí)施方案中，接合位點(diǎn)的長(zhǎng)度為4至50之間的任意整數(shù)（包括端點(diǎn)）。在某些實(shí)施方案中，所述3′-接合序列由5-8個(gè)核苷酸組成（例如，由6個(gè)核苷酸組成）。在某些實(shí)施方案中，所述3′-接合序列與5′-接合序列至少約85%互補(bǔ)。在某些實(shí)施方案中，所述3′-接合序列編碼cgcyuac(seqidno:17)，其中y是c或u。在某些實(shí)施方案中，所述3′-接合序列編碼cgccuac(seqidno:18)。在某些實(shí)施方案中，所述3′-側(cè)翼區(qū)還包含位于所述3′-接合序列下游的3′-凸序列。在某些實(shí)施方案中，所述3′-凸序列包含克隆位點(diǎn)，如spei/xbai位點(diǎn)或spei位點(diǎn)。在某些實(shí)施方案中，所述3′-凸序列由約1-15個(gè)核苷酸（如2-15個(gè)核苷酸或1-10個(gè)核苷酸）組成。在某些實(shí)施方案中，所述3′-凸序列編碼uag(seqidno:30)。在某些實(shí)施方案中，所述5′-凸序列與所述3′-凸序列僅在位于序列兩端的各一個(gè)核苷酸處互補(bǔ)。在某些實(shí)施方案中，所述3′-側(cè)翼區(qū)還含有位于所述3′-凸序列下游的3′-間隔序列。在某些實(shí)施方案中，所述3′-間隔序列由9-12個(gè)核苷酸（如10-12個(gè)核苷酸）組成。在某些實(shí)施方案中，所述3′-間隔序列是agcggccgcca(seqidno:19)。在某些實(shí)施方案中，所述3′-間隔序列與5′-間隔序列至少約70%互補(bǔ)。在某些實(shí)施方案中，所述3′-側(cè)翼區(qū)還含有位于所述3′-間隔序列下游的3′-下游序列。在某些實(shí)施方案中，5′-上游序列不與3′-下游序列明顯配對(duì)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“不與…明顯配對(duì)”意指這兩條鏈的同源性低于20%。在某些實(shí)施方案中，所述3′-下游序列長(zhǎng)約5-5000個(gè)核苷酸（如30-2000個(gè)核苷酸）。在某些實(shí)施方案中，所述環(huán)區(qū)長(zhǎng)4-20個(gè)核苷酸（如15-19個(gè)核苷酸）。所述環(huán)區(qū)的0-50%可以與該環(huán)區(qū)的另一部分互補(bǔ)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“環(huán)區(qū)”是將兩條互補(bǔ)核酸鏈接合起來(lái)的序列。在某些實(shí)施方案中，所述環(huán)區(qū)的1-3個(gè)核苷酸緊接著可能與該環(huán)區(qū)的最后1-3個(gè)核苷酸互補(bǔ)的互補(bǔ)核酸鏈。例如，所述環(huán)區(qū)中頭兩個(gè)核酸可能與該環(huán)區(qū)的最后兩個(gè)核苷酸互補(bǔ)。在某些實(shí)施方案中，所述環(huán)區(qū)長(zhǎng)17個(gè)核苷酸。在某些實(shí)施方案中，所述環(huán)區(qū)編碼cunnnnnnnnnnnnnnngg(seqidno:20)或ccnnnnnnnnnnnnnnngg(seqidno:21)。在某些實(shí)施方案中，所述環(huán)區(qū)編碼cugugaagccacagauggg(seqidno:22)或ccgugaagccacagauggg(seqidno:23)。本發(fā)明還提供了由本文所述的核酸編碼的rna。本發(fā)明還提供了表達(dá)盒，其含有連續(xù)連接至本文所述的核酸的啟動(dòng)子。在某些實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子是polii或poliii啟動(dòng)子，如u6啟動(dòng)子（例如，小鼠u6啟動(dòng)子）。在某些實(shí)施方案中，所述表達(dá)盒還含有標(biāo)志物基因。在某些實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子是polii啟動(dòng)子。在某些實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子是組織特異性啟動(dòng)子。在某些實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。在某些實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子是poliii啟動(dòng)子。在某些實(shí)施方案中，所述表達(dá)盒還包含標(biāo)志物基因。本發(fā)明提供了含有本文所述的表達(dá)盒的載體。在某些實(shí)施方案中，所述載體是腺相關(guān)病毒（aav）載體。在某些實(shí)施方案中，所述aav是aav1、aav2、aav5、aav6和/或aav9。在某些實(shí)施方案中，所述aav是aav2。在某些實(shí)施方案中，所述aav是aav2/1。此類aav的實(shí)例可見(jiàn)于davidson等人，pnas(2000)97:3428-3432中。在某些實(shí)施方案中，所述aav是aav2/1。在某些實(shí)施方案中，所述aav是aav2/5。如本文所用，術(shù)語(yǔ)aav2/1被用于意指aav2itr和aav1衣殼，術(shù)語(yǔ)aav2/2是aav2itr和aav2衣殼，術(shù)語(yǔ)aav2/4是aav2itr和aav4衣殼，等。在某些實(shí)施方案中，所述aav是aav1、aav2、aav5、aav6和/或aav9。在某些實(shí)施方案中，所述aav是aav1。在某些實(shí)施方案中，所述aav是aav2。在某些實(shí)施方案中，所述aav是aav5。在某些實(shí)施方案中，所述aav是aav6。在某些實(shí)施方案中，所述aav是aav8。在某些實(shí)施方案中，所述aav是aav9。在某些實(shí)施方案中，所述aav是aavrh10。在某些實(shí)施方案中，所述aav衣殼與以下任何參考aav血清型衣殼蛋白vp1、vp2和/或vp3等具有至少80%的同源性，例如，與aav1衣殼蛋白vp1、vp2和/或vp3，或例如，與aav2衣殼蛋白vp1、vp2和/或vp3，或例如，與aav3衣殼蛋白vp1、vp2和/或vp3，或例如，與aav4衣殼蛋白vp1、vp2和/或vp3，或例如，與aav5衣殼蛋白vp1、vp2和/或vp3，或例如，與aav6衣殼蛋白vp1、vp2和/或vp3，或例如，與aav7衣殼蛋白vp1、vp2和/或vp3，或例如，與aav8衣殼蛋白vp1、vp2和/或vp3，或例如，與aav9衣殼蛋白vp1、vp2和/或vp3，或例如，與aavrh10衣殼蛋白vp1、vp2和/或vp3，或例如，與aavrh74衣殼蛋白vp1、vp2和/或vp3。在某些實(shí)施方案中，所述aav衣殼與以下任何參考aav血清型衣殼蛋白vp1、vp2和/或vp3等具有100%的同源性，例如，與aav1衣殼蛋白vp1、vp2和/或vp3，或例如，與aav2衣殼蛋白vp1、vp2和/或vp3，或例如，與aav3衣殼蛋白vp1、vp2和/或vp3，或例如，與aav4衣殼蛋白vp1、vp2和/或vp3，或例如，與aav5衣殼蛋白vp1、vp2和/或vp3，或例如，與aav6衣殼蛋白vp1、vp2和/或vp3，或例如，與aav7衣殼蛋白vp1、vp2和/或vp3，或例如，與aav8衣殼蛋白vp1、vp2和/或vp3，或例如，與aav9衣殼蛋白vp1、vp2和/或vp3，或例如，與aavrh10衣殼蛋白vp1、vp2和/或vp3，或例如，與aavrh74衣殼蛋白vp1、vp2和/或vp3。本發(fā)明提供了包含本文所述的核酸、表達(dá)盒、載體或雙鏈的非人動(dòng)物。本發(fā)明提供了長(zhǎng)80-4000個(gè)核苷酸的分離的核酸，其包含編碼人工初級(jí)mirna轉(zhuǎn)錄物(pri-mirna)的核酸，其由以下部分組成，依位置順序：5′-側(cè)翼區(qū)、非引導(dǎo)區(qū)、環(huán)區(qū)、引導(dǎo)區(qū)和3′-側(cè)翼區(qū)，其中所述引導(dǎo)區(qū)由seqidno:37(mihdss3)、seqidno:6(mihds1v5u)或seqidno:7(mihds1v6a)組成，并且所述非引導(dǎo)區(qū)與所述引導(dǎo)區(qū)至少80%互補(bǔ)。本發(fā)明提供了分離的核酸，其由pri-mihds1v5u(seqidno:8)、pri-mihds1v6a(seqidno:9)、pre-mihds1v5u(seqidno:10)或pre-mihds1v6a(seqidno:11)組成。在一個(gè)實(shí)施方案中，全長(zhǎng)mihds1(seqidno:12)具有如下序列：本發(fā)明提供了分離的rna雙鏈，其包含核酸引導(dǎo)區(qū)和核酸非引導(dǎo)區(qū)，其中所述引導(dǎo)區(qū)是seqidno:37(mihdss3)、seqidno:6(mihds1v5u)或seqidno:7(mihds1v6a)，并且所述非引導(dǎo)區(qū)與所述引導(dǎo)區(qū)至少80%互補(bǔ)。在某些實(shí)施方案中，所述分離的rna雙鏈長(zhǎng)19-30個(gè)堿基對(duì)。某些實(shí)施方案包括編碼上述分離的核酸的表達(dá)盒。在某些實(shí)施方案中，所述表達(dá)盒還包含標(biāo)志物基因。本發(fā)明提供了通過(guò)向個(gè)體施用本文所述的核酸、表達(dá)盒、載體或組合物來(lái)誘導(dǎo)rna干擾的方法。本發(fā)明提供了含有u6啟動(dòng)子的載體，所述u6啟動(dòng)子可操作地連接至編碼mirna的核酸。本發(fā)明的構(gòu)建體的預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)不同于研究人員過(guò)去所使用的那些。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，u6mirna具有延長(zhǎng)的5′端。如果類似于之前基于cmv的策略而將所述5′端截短，則沉默功效嚴(yán)重減弱。本發(fā)明還提供了改善的側(cè)翼序列，其相對(duì)于天然的mir-30側(cè)翼序列具有改善的功效。使用本發(fā)明的mirna策略似乎緩解了與傳統(tǒng)shrna方法相關(guān)的毒性。mirna策略通常不像u6shrna方法那樣生成過(guò)量的rnai。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“莖序列”是與同一分子中另一序列互補(bǔ)的序列，其中這兩條互補(bǔ)鏈退火以形成雙鏈（例如，所述非引導(dǎo)區(qū)和引導(dǎo)區(qū)）。所形成的雙鏈彼此可能完全互補(bǔ)或可能不完全互補(bǔ)，如99%、98%、97%、96%、95,%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、75%或70%互補(bǔ)。另外，在某些實(shí)施方案中，一條鏈可能比另一條鏈含有更多的核苷酸，使得能夠形成側(cè)環(huán)。本發(fā)明還提供了含有本文所述的表達(dá)盒的載體。合適的載體的實(shí)例包括腺病毒載體、慢病毒載體、腺相關(guān)病毒（aav）載體、脊髓灰質(zhì)炎病毒載體、單純皰疹病毒（hsv）載體或小鼠莫洛尼基（maloney-based）病毒載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體是腺相關(guān)病毒載體。這些盒和載體可被包含在細(xì)胞如哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。非人哺乳動(dòng)物可含有所述盒或載體。本發(fā)明提供了含有本文所述的核酸分子、表達(dá)盒或載體的細(xì)胞（如哺乳動(dòng)物細(xì)胞）。本發(fā)明還提供了含有本文所述的核酸分子、表達(dá)盒或載體的非人哺乳動(dòng)物。本發(fā)明提供了如本文所述的核酸、表達(dá)盒、載體或組合物，用于治療，如用于治療神經(jīng)退行性疾病。本發(fā)明提供了分離的rnai分子，其含有在3′端具有突出端的微rna。在某些實(shí)施方案中，所述突出端是2至5個(gè)核苷酸的重復(fù)序列。在某些實(shí)施方案中，所述突出端是uu(seqidno:24)、uuu(seqidno:25)、uuuu(seqidno:26)、cuu(seqidno:27)、cuuu(seqidno:28)或cuuuu(seqidno:29)序列。在某些實(shí)施方案中，所述微rna是天然存在的微rna。在某些實(shí)施方案中，微rna是人工微rna。在某些實(shí)施方案中，所述rnai分子產(chǎn)生降低水平的脫靶毒性。本發(fā)明提供了通過(guò)向個(gè)體施用如本文所述的核酸、表達(dá)盒、載體或組合物來(lái)誘導(dǎo)低毒性rna干擾的方法。在某些實(shí)施方案中，所述表達(dá)盒含有polii啟動(dòng)子。本發(fā)明提供了通過(guò)向個(gè)體施用編碼polii啟動(dòng)子的表達(dá)盒來(lái)誘導(dǎo)低毒性rna干擾的方法，所述表達(dá)盒可操作地連接至編碼mirna的核酸。在某些實(shí)施方案中，所述mirna包含2或3個(gè)核苷酸的5′或3′-突出端。在某些實(shí)施方案中，所述mirna包含2個(gè)核苷酸的3′-突出端。在某些實(shí)施方案中，所述mirna是人工mirna。本發(fā)明提供了治療患有亨廷頓氏病的個(gè)體的方法，其通過(guò)向所述個(gè)體施用如本文所述的核酸、表達(dá)盒、載體或組合物從而治療亨廷頓氏病。本發(fā)明提供了在細(xì)胞中抑制亨廷頓蛋白積聚的方法，其通過(guò)向所述細(xì)胞中引入一定量的本文所述的核酸分子（例如，核糖核酸(rna)）而實(shí)現(xiàn)，所述量足以抑制亨廷頓蛋白在該細(xì)胞中積聚。在某些實(shí)施方案中，所述亨廷頓蛋白的積聚被抑制至少10%。在某些實(shí)施方案中，所述亨廷頓蛋白的積聚被抑制至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%。在某些實(shí)施方案中，對(duì)所述蛋白積聚的抑制是以足以引起治療效果（例如，減少纏結(jié)形成）的量實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明提供了在細(xì)胞中預(yù)防突變型亨廷頓蛋白的細(xì)胞毒性作用的方法，其通過(guò)向所述細(xì)胞中引入一定量的本文所述的核酸分子（例如，核糖核酸(rna)）而實(shí)現(xiàn)，所述量足以抑制亨廷頓蛋白的積聚。在某些實(shí)施方案中，所述核酸分子例如在神經(jīng)元細(xì)胞中預(yù)防亨廷頓蛋白的細(xì)胞毒性作用。本發(fā)明提供了在細(xì)胞中抑制亨廷頓蛋白基因表達(dá)的方法，其通過(guò)向所述細(xì)胞中引入一定量的本文所述的核酸分子（例如，核糖核酸(rna)）而實(shí)現(xiàn)，所述量足以抑制亨廷頓蛋白的表達(dá)，并且其中所述rna抑制所述亨廷頓蛋白基因的表達(dá)。在某些實(shí)施方案中，亨廷頓蛋白被抑制至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%。本發(fā)明提供了在哺乳動(dòng)物（例如，人或非人哺乳動(dòng)物）中抑制亨廷頓蛋白基因表達(dá)的方法，其通過(guò)如下實(shí)現(xiàn)：(a)提供含有神經(jīng)元細(xì)胞的哺乳動(dòng)物，其中所述神經(jīng)元細(xì)胞含有所述亨廷頓蛋白基因并且所述神經(jīng)元細(xì)胞容易受rna干擾的影響，并且所述亨廷頓蛋白基因在所述神經(jīng)元細(xì)胞中表達(dá)；以及(b)使所述哺乳動(dòng)物與本文所述的核糖核酸(rna)或載體接觸，從而抑制所述亨廷頓蛋白基因的表達(dá)。在某些實(shí)施方案中，所述亨廷頓蛋白的積聚被抑制至少10%。在某些實(shí)施方案中，亨廷頓蛋白被抑制至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%。在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞位于哺乳動(dòng)物體內(nèi)。本發(fā)明提供了包含啟動(dòng)子和微rna(mirna)穿梭的病毒載體，其含有特異于靶序列的嵌入sirna。在某些實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。在某些實(shí)施方案中，所述載體是腺病毒載體、慢病毒載體、腺相關(guān)病毒（aav）載體、脊髓灰質(zhì)炎病毒載體、hsv載體或小鼠馬洛尼基病毒載體。在某些實(shí)施方案中，所述靶序列是與亨廷頓氏病相關(guān)的序列。所述靶序列，在某些實(shí)施方案中，是編碼亨廷頓蛋白的序列。本發(fā)明提供了在有需要的哺乳動(dòng)物中預(yù)防神經(jīng)退行性疾病的細(xì)胞毒性作用的方法，其通過(guò)向細(xì)胞中引入一定量的本文所述的編碼mirna的載體而實(shí)現(xiàn)，所述量足以抑制與亨廷頓氏病相關(guān)的蛋白質(zhì)的積聚，并且其中所述rna預(yù)防亨廷頓氏病（也稱為hd，而所涉及的蛋白質(zhì)是亨廷頓蛋白，也稱為htt）的細(xì)胞毒性作用。本發(fā)明還提供了在有需要的哺乳動(dòng)物中抑制與亨廷頓氏病相關(guān)的蛋白質(zhì)的表達(dá)的方法，其通過(guò)向細(xì)胞中引入一定量的本文所述的編碼mirna的載體而實(shí)現(xiàn)，所述量足以抑制所述亨廷頓蛋白的表達(dá)，其中所述rna抑制所述亨廷頓蛋白的表達(dá)。所述亨廷頓蛋白被抑制至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%。本發(fā)明涉及這樣的化合物、組合物和方法，其可用于使用短干擾核酸(sirna)分子調(diào)節(jié)亨廷頓氏病基因表達(dá)。本發(fā)明還涉及這樣的化合物、組合物和方法，其可用于使用小核酸分子通過(guò)rna干擾(rnai)調(diào)節(jié)涉及hd基因表達(dá)和/或活性的途徑的其它基因的表達(dá)和活性。具體地講，本發(fā)明涉及用于調(diào)節(jié)hd基因表達(dá)的小核酸分子（如短干擾核酸(sina)、短干擾rna(sirna)、雙鏈rna(dsrna)、微rna(mirna)和短發(fā)夾rna(shrna)分子）及方法。本發(fā)明的sirna分子可以是，例如，化學(xué)合成的、從載體表達(dá)的或酶促合成的。如本文所用，當(dāng)權(quán)利要求指示“對(duì)應(yīng)的”rna時(shí)，其意指與dna具有相同序列的rna，不同之處在于尿嘧啶取代了胸腺嘧啶。本發(fā)明還提供了基本上沉默目標(biāo)靶基因或目標(biāo)基因的靶向等位基因以提供治療效果的方法。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“基本上沉默”或“被基本上沉默”指代降低、減少或抑制靶基因或靶等位基因的表達(dá)至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%至100%。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“治療效果”指代：疾病狀態(tài)的相關(guān)異常的改變，包括病理和行為缺陷；疾病狀態(tài)的進(jìn)展時(shí)間的改變；疾病癥狀的減少、減輕或改變；或患者生活質(zhì)量的改善。治療效果可以由醫(yī)生定量測(cè)量或由具有sirna所靶向的疾病狀態(tài)的患者定性測(cè)量。在某些實(shí)施方案中，其中突變型和野生型等位基因被基本上沉默，術(shù)語(yǔ)治療效果定義了這樣的狀況，其中沉默該野生型等位基因的表達(dá)對(duì)正常功能沒(méi)有有害或不利影響，使得該患者將沒(méi)有治療效果。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于在個(gè)體或生物體中治療或預(yù)防亨廷頓氏病的方法，其包括：在合適條件下使所述個(gè)體或生物體與本發(fā)明的sirna接觸以調(diào)節(jié)所述個(gè)體或生物體中hd基因的表達(dá)，從而可以實(shí)現(xiàn)對(duì)亨廷頓氏病的治療或預(yù)防。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述hd基因靶標(biāo)包括兩種hd等位基因（例如，包含三核苷酸(cag)重復(fù)擴(kuò)展序列的等位基因和野生型等位基因）。本發(fā)明的sirna分子可以從如本文所述或本領(lǐng)域已知另外的載體表達(dá)以靶向所述個(gè)體或生物體中適當(dāng)?shù)慕M織或細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于在個(gè)體或生物體中治療或預(yù)防亨廷頓氏病的方法，其包括：經(jīng)由向相關(guān)組織或細(xì)胞如腦細(xì)胞和組織（例如，基底節(jié)、紋狀體或皮質(zhì)）局部施用而使所述個(gè)體或生物體與本發(fā)明的sirna分子接觸，例如，通過(guò)向相關(guān)細(xì)胞（例如，基底節(jié)、紋狀體或皮質(zhì)）施用提供本發(fā)明的sirna分子的本發(fā)明的載體或表達(dá)盒。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)對(duì)腦部立體定位或?qū)α髟鰪?qiáng)遞送而向所述個(gè)體或生物體施用所述sirna、載體或表達(dá)盒。例如，美國(guó)專利no.5,720,720提供了可用于對(duì)腦部立體定位和對(duì)流增強(qiáng)遞送試劑的方法和裝置。此類方法和裝置可以容易地用于將本發(fā)明的sirna、載體或表達(dá)盒遞送至個(gè)體或生物體，而美國(guó)專利no.5,720,720以引用方式全文并入本文。美國(guó)專利申請(qǐng)no.2002/0141980、2002/0114780和2002/0187127均提供了可用于立體定位和對(duì)流增強(qiáng)遞送試劑的方法和裝置，所述方法和裝置可以容易地適用于將本發(fā)明的sirna、載體或表達(dá)盒遞送至個(gè)體或生物體，而這些專利申請(qǐng)均以引用方式全文并入本文?？捎糜趯⒈景l(fā)明的sirna、載體或表達(dá)盒遞送至個(gè)體或生物體的具體裝置在例如美國(guó)專利申請(qǐng)no.2004/0162255中有述，其以引用方式全文并入本文。本發(fā)明的sirna分子可以從如本文所述或本領(lǐng)域已知另外的載體表達(dá)以靶向所述個(gè)體或生物體中適當(dāng)?shù)慕M織或細(xì)胞。病毒載體的遞送方法包括但不限于：動(dòng)脈內(nèi)、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、鼻內(nèi)以及口腔途徑。通常，可使用體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)將aav病毒粒子引入到cns的細(xì)胞中。如果經(jīng)體外轉(zhuǎn)導(dǎo)，則所需的受體細(xì)胞將從個(gè)體中被移除，用aav病毒粒子轉(zhuǎn)導(dǎo)并被重新引入到該個(gè)體中。作為另外一種選擇，可以使用同種或異種細(xì)胞，其中這些細(xì)胞將不會(huì)在該個(gè)體中生成不恰當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答。已經(jīng)描述了合適的用于將經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞遞送和引入個(gè)體中的方法。例如，細(xì)胞可以通過(guò)如下進(jìn)行體外轉(zhuǎn)導(dǎo)：例如，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)液中將重組aav病毒粒子與cns細(xì)胞結(jié)合，并篩選那些攜帶目標(biāo)dna的細(xì)胞，可以使用常規(guī)技術(shù)如southern印跡和/或pcr或通過(guò)使用選擇標(biāo)志物進(jìn)行篩選。隨后可以將經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞配制成藥物組合物（詳述于下），并通過(guò)各種技術(shù)將所述組合物引入個(gè)體中，如通過(guò)移植、肌內(nèi)注射、靜脈內(nèi)注射、皮下注射和腹腔內(nèi)注射。對(duì)于體內(nèi)遞送而言，在一個(gè)實(shí)施方案中，aav病毒粒子被配制成藥物組合物并將通常腸胃外施用，例如，通過(guò)直接肌內(nèi)注射入骨骼肌或心肌或通過(guò)注射入cns。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的病毒載體經(jīng)由對(duì)流增強(qiáng)遞送（ced）系統(tǒng)被遞送至cns，該系統(tǒng)可以將病毒載體例如aav有效地遞送至個(gè)體腦部的大片區(qū)域（例如，紋狀體和/或皮質(zhì)）。如下詳述并舉例說(shuō)明，這些方法適用于各種病毒載體，例如攜帶治療基因（例如，sirna）的aav載體。任何對(duì)流增強(qiáng)遞送裝置均可適用于遞送病毒載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述裝置是滲透泵或輸液泵。滲透泵和輸液泵均可從多個(gè)供應(yīng)商處商購(gòu)獲得，例如alzetcorporation、hamiltoncorporation、aiza,inc.(paloalto,calif.)。通常，病毒載體經(jīng)由ced裝置遞送如下。將導(dǎo)管、套管或其它注射裝置插入所選個(gè)體的cns組織中。根據(jù)本文的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定cns的哪個(gè)一般區(qū)域是適當(dāng)?shù)陌袠?biāo)。例如，當(dāng)遞送編碼治療基因的aav載體以治療hd時(shí)，紋狀體是適合靶向的腦區(qū)。立體定位作圖和定位裝置可得自例如asiinstruments,warren,mich.。還可通過(guò)使用由ct和/或mri成像獲得的個(gè)體腦部解剖圖進(jìn)行定位以幫助將注射裝置引導(dǎo)至所選靶標(biāo)。此外，因?yàn)閷?shí)施本文所述的方法可以使得相對(duì)大的腦區(qū)吸收病毒載體，所以需要更少的輸液套管。由于手術(shù)并發(fā)癥與穿刺的次數(shù)有關(guān)，本文所述的方法還會(huì)減輕見(jiàn)于常規(guī)遞送技術(shù)中的副作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物將包含足夠的遺傳物質(zhì)以產(chǎn)生治療有效量的目標(biāo)sirna，即，所述量足以減輕或改善所考慮的疾病狀態(tài)的癥狀或足以賦予所需的益處。所述藥物組合物還可含有藥學(xué)上可接受的賦形劑。此類賦形劑包括任何藥物試劑，其自身不會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生對(duì)接受該組合物的個(gè)體有害的抗體，并且其可被施用而無(wú)異常毒性。藥學(xué)上可接受的賦形劑包括但不限于：山梨糖醇、tween80以及液體如水、鹽水、甘油和乙醇。其中可以包括藥學(xué)上可接受的鹽，例如，礦物酸鹽如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽等；以及有機(jī)酸鹽如醋酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽、苯甲酸鹽等。另外，此類媒介物中可含有輔料，如潤(rùn)濕劑或乳化劑、ph緩沖劑等。有關(guān)藥學(xué)上可接受的賦形劑的全面討論可參見(jiàn)remington'spharmaceuticalsciences(mackpub.co.,n.j.1991)。正如根據(jù)本說(shuō)明書的教導(dǎo)而對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，必須添加的病毒載體的有效量可以憑經(jīng)驗(yàn)確定?？梢栽谡麄€(gè)治療過(guò)程中連續(xù)地或間歇地以一個(gè)劑量施用。確定最有效的施用方式和劑量的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，并且將隨病毒載體、治療組成、靶細(xì)胞和接受治療的個(gè)體而變化?？梢圆捎糜芍髦吾t(yī)生選擇的劑量水平和模式進(jìn)行單次和多次施用。應(yīng)當(dāng)理解，可以通過(guò)所遞送的病毒載體表達(dá)不止一個(gè)轉(zhuǎn)基因。作為另外一種選擇，各自表達(dá)一個(gè)或多個(gè)不同轉(zhuǎn)基因的單獨(dú)的載體也可以如本文所述被遞送至cns。此外，還預(yù)期將由本發(fā)明的方法遞送的病毒載體與其它合適的組合物和療法結(jié)合。本發(fā)明還提供了如本文所述的mirna或shrna、表達(dá)盒和/或載體，用于醫(yī)學(xué)治療或診斷。本發(fā)明提供了如本文所述的mirna或shrna、表達(dá)盒和/或載體在制備藥物上的用途，所述藥物可用于在動(dòng)物中治療適合rnai的狀況，例如可用于治療亨廷頓氏病。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的核酸、表達(dá)盒、載體或組合物，用于治療。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的核酸、表達(dá)盒、載體或組合物，用于治療，例如，用于預(yù)防性或治療性治療亨廷頓氏病。在某些實(shí)施方案中，所述試劑被施用至個(gè)體的腦部。在某些實(shí)施方案中，所述試劑被直接施用至腦部或經(jīng)由血液施用。在某些實(shí)施方案中，顱內(nèi)施用所述治療劑。在某些實(shí)施方案中，所述治療劑被施用至個(gè)體的枕大池、紋狀體、皮質(zhì)或腦室、蛛網(wǎng)膜下腔間隙和/或鞘內(nèi)間隙。在某些實(shí)施方案中，所述個(gè)體是人。在某些實(shí)施方案中，所述個(gè)體是非人哺乳動(dòng)物。在某些實(shí)施方案中，所述試劑被注射至腦部的1-5個(gè)位置，如腦部的一、二或三個(gè)位置。在某些實(shí)施方案中，所述方法還包括另外施用raav至非人靈長(zhǎng)類的腦室、蛛網(wǎng)膜下腔間隙和/或鞘內(nèi)間隙。更具體地講，本發(fā)明提供了將核酸遞送至與循環(huán)csf接觸的細(xì)胞（如室管膜細(xì)胞、軟腦膜細(xì)胞、腦膜細(xì)胞、腦血管內(nèi)皮細(xì)胞）的方法，其包括：向所述細(xì)胞施用含有載體的aav顆粒，所述載體包含插入到一對(duì)aav末端反向重復(fù)序列之間的核酸，從而將所述核酸遞送至所述細(xì)胞。本發(fā)明還提供了使細(xì)胞與本文所述的核酸、表達(dá)盒、載體或雙鏈接觸從而治療亨廷頓氏病的方法，其中所述細(xì)胞是室管膜細(xì)胞、軟腦膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、腦室細(xì)胞和/或腦膜細(xì)胞。附圖簡(jiǎn)述圖1a-1g:過(guò)表達(dá)mihds1引起小鼠腦部的不良反應(yīng)。a)mihds1與小鼠和人亨廷頓蛋白mrna的配對(duì)(mihds1是seqidno:1；小鼠htt是seqidno:2；而人htt是seqidno:3)。b)含有mihds1和mictl表達(dá)盒的aav/填充序列穿梭載體的圖示。c)評(píng)價(jià)mihds1體內(nèi)耐受性的實(shí)驗(yàn)策略。d)來(lái)自注射了mihds1(n=13)或mictl(n=11)的小鼠的轉(zhuǎn)桿數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)顯示為在7周（基礎(chǔ)）、16周和24周時(shí)所測(cè)試的連續(xù)四天中每只小鼠/天的最好的兩次試驗(yàn)的平均值。延遲掉落顯示為平均值±s.e.m.。(*p>0.05，在指定時(shí)間的非配對(duì)t檢驗(yàn))。e)注射了mihds1和mictl的小鼠的重量增加分析。數(shù)據(jù)顯示為在7周時(shí)相對(duì)于基礎(chǔ)時(shí)間點(diǎn)的重量增加。f)注射了mihds1和mictl的小鼠的抱握分析。數(shù)據(jù)顯示為在指定的時(shí)間點(diǎn)表現(xiàn)出抱握的小鼠的百分比和數(shù)量。g)u6/mihds1載體的鏈偏好。測(cè)量報(bào)告基因構(gòu)建體的螢光素酶活性來(lái)評(píng)估鏈偏好，所述報(bào)告基因構(gòu)建體含有與乘客（有義）或引導(dǎo)（反義）mihds1鏈互補(bǔ)的靶序列。結(jié)果是3次不同實(shí)驗(yàn)(n=4/組)中的代表性實(shí)驗(yàn)。數(shù)據(jù)顯示為相對(duì)于用mictl轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的平均值±sem，并證實(shí)，mihds1優(yōu)先裝載引導(dǎo)mihds1鏈。圖2a-2d:mihds1脫靶基因的表征。a)在預(yù)測(cè)的mihds1脫靶基因的25百分位數(shù)內(nèi)的基因的列表。顯示的信息：基因id、參考序列、mirna結(jié)合位點(diǎn)類型、核苷酸3’utr位置、預(yù)測(cè)的靶掃描背景分?jǐn)?shù)、由pita算法預(yù)測(cè)的ddg分?jǐn)?shù)。b)在預(yù)測(cè)的脫靶基因上的mihds1:mrna結(jié)合位點(diǎn)的圖示(mihds1是seqidno:1)(bcl2是seqidno:31；smad9是seqidno:32；sdf4是seqidno:33；map2k6是seqidno:34)。c)mihds1注射后4個(gè)月的紋狀體樣品中htt、bcl2、smad9、sdf4和map2k6mrna水平的定量q-pcr分析。所有樣品均針對(duì)?-肌動(dòng)蛋白進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化，并且結(jié)果是相對(duì)于注射了mictl的小鼠的平均值±sem。(n=6只小鼠/組；*p<0.05,**p<0.01,mannwhitney檢驗(yàn))d)mihds1電穿孔后的sthdhq7細(xì)胞中htt、bcl2、smad9、sdf4和map2k6mrna水平的定量q-pcr分析。所有樣品均針對(duì)?-肌動(dòng)蛋白進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化，并且結(jié)果是相對(duì)于用含有u6啟動(dòng)子或mictl表達(dá)盒的質(zhì)粒電穿孔的細(xì)胞的平均值±sem。(n=8個(gè)電穿孔的孔；**p<0.01,單因素anova后接bonferroni事后檢驗(yàn))圖3a-3c:生成單核苷酸mihds1種變體。a)mihds1序列的種區(qū)內(nèi)單核苷酸修飾的位置的圖示(pri-mihds1是seqidno:4；pre-mihds1是seqidno:5；risc裝載的mirna序列是seqidno:1)。b)對(duì)sps分?jǐn)?shù)的影響取決于mihds1脫靶上核苷酸錯(cuò)配的位置。c)圖表顯示了mihds1和mihds1-變體的預(yù)測(cè)的脫靶基因的數(shù)量(總體以及紋狀體特異的)，以及共享的脫靶的數(shù)量。圖4a-4i:單核苷酸mihds1種變體的沉默功效。a)用u6/mihds1表達(dá)盒轉(zhuǎn)染的hek293細(xì)胞中hhttmrna水平的定量分析。在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)收集總rna，并通過(guò)q-pcr測(cè)定hhtt水平。所有樣品均針對(duì)?-肌動(dòng)蛋白進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化，并且結(jié)果是相對(duì)于用mihds1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的平均值±sem(n=12個(gè)孔；**p<0.01,***p<0.001,單因素anova后接bonferroni事后檢驗(yàn))。b)將mihds1、mihds1v5u、mihds1v6a和mihds1v7u表達(dá)盒轉(zhuǎn)染到人hek293細(xì)胞中，并在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)測(cè)定內(nèi)源性亨廷頓蛋白水平。mictl被用作無(wú)沉默對(duì)照而β-連環(huán)蛋白充當(dāng)裝載對(duì)照。c)在mihds1、mihds1v5u、mihds1v6a和mihds1v7u轉(zhuǎn)染后48小時(shí)對(duì)hhtt蛋白水平進(jìn)行定量。數(shù)據(jù)是相對(duì)于用mictl轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的平均值±sem(n=6,三次不同的western印跡，*p<0.01,mannwhitney檢驗(yàn))。d)mihds1v5u和mihds1v6a與小鼠亨廷頓蛋白mrna的配對(duì)(mihds1v5u是seqidno:6；小鼠htt是seqidno:2；mihds1v6a是seqidno:7)。e)將mihds1、mihds1v5u和mihds1v6a表達(dá)盒電穿孔到小鼠sthdhq7細(xì)胞中，并在電穿孔48小時(shí)后測(cè)定內(nèi)源性亨廷頓蛋白水平。mictl被用作無(wú)沉默對(duì)照而β-連環(huán)蛋白充當(dāng)裝載對(duì)照。f)在mihds1、mihds1v5u和mihds1v6a電穿孔后48小時(shí)對(duì)mhtt蛋白水平進(jìn)行定量。數(shù)據(jù)是相對(duì)于用mictl轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的平均值±sem(n=6,三次不同的western印跡，*p<0.01,mannwhitney檢驗(yàn))。g-h-i)用u6/mihds1、u6/mihds1v5u和u6/mihds1v6a表達(dá)盒電穿孔的sthdhq7細(xì)胞中mhtt、bcl2和smad9mrna水平的定量分析。在電穿孔后24小時(shí)收集總rna，并通過(guò)q-pcr測(cè)定mhtt、bcl2和smad9水平。所有樣品均針對(duì)?-肌動(dòng)蛋白進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化，并且結(jié)果是相對(duì)于用含有啟動(dòng)子和u6/mictl表達(dá)盒的u6轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的平均值±sem(n=12個(gè)孔；#p<0.01,單因素anova后接bonferroni事后檢驗(yàn))。圖5a-5f:生成mihdss1-4序列以靶向人亨廷頓蛋白表達(dá)。a)生成了含有mictl種序列的四種人工mirna觸發(fā)序列，允許種區(qū)與所靶向的人httmrna之間的單核苷酸錯(cuò)配。mihdss1和mihdss4結(jié)合位點(diǎn)位于3’utr，而mihdss2和3分別結(jié)合hhttmrna的外顯子7-8的交界和外顯子33。b)mirna/mrna在mihdss1-4與人亨廷頓蛋白mrna之間結(jié)合配對(duì)。單核苷酸錯(cuò)配分別存在于mihdss1、2、3和4序列各自的種區(qū)位置7、6、5和4處(mihdss1是seqidno:35；mihdss2是seqidno:36；mihdss3是seqidno:37；mihdss4是seqidno:38)。圖還按出現(xiàn)順序分別公開了seqidnos40-43。c)用u6/mihdss1-4表達(dá)盒轉(zhuǎn)染的hek293細(xì)胞中hhttmrna水平的定量分析。在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)收集總rna，并通過(guò)q-pcr測(cè)定hhtt水平。所有樣品均針對(duì)?-肌動(dòng)蛋白進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化，并且結(jié)果是相對(duì)于用mictl轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的平均值±sem(n=8個(gè)孔；*p<0.001，單因素anova后接bonferroni事后檢驗(yàn))。d)將mihdss3表達(dá)盒轉(zhuǎn)染到人hek293細(xì)胞中，并在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)測(cè)定內(nèi)源性亨廷頓蛋白水平。mictl被用作無(wú)沉默對(duì)照而β-連環(huán)蛋白充當(dāng)裝載對(duì)照。e)在mihdss3轉(zhuǎn)染后48小時(shí)對(duì)hhtt蛋白水平進(jìn)行定量。數(shù)據(jù)是相對(duì)于用mictl轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的平均值±sem(n=6，兩次不同的western印跡，*p<0.01,mannwhitney檢驗(yàn))。f)使用pita算法確定mihdss3(seqidno:37)和mictl(seqidno:39)在預(yù)測(cè)的非預(yù)期mrna結(jié)合位點(diǎn)上的結(jié)合穩(wěn)定性。mictl和mihdss3的種區(qū)以粗體標(biāo)記。數(shù)據(jù)顯示為各個(gè)脫靶基因相對(duì)于mictl或mihdss3的ddg(kcal/mol)分?jǐn)?shù)。我們的預(yù)測(cè)表明，相比mictl，mihdss3的3’序列提供更好的脫靶基因結(jié)合穩(wěn)定性。圖6a-6e:mihds1-變體和mihdss3序列的體內(nèi)耐受性。a)評(píng)價(jià)新mirna序列設(shè)計(jì)的體內(nèi)耐受性的實(shí)驗(yàn)策略。b)含有mihds1變體和mihdss3表達(dá)盒的aav/填充序列穿梭載體的圖示。c)來(lái)自注射了制劑緩沖液(n=7)、mictl(n=8)、mihds1(n=9)、mihds1v5u(n=10)、mihds1v6a(n=11)或mihdss3(n=10)的小鼠的轉(zhuǎn)桿數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)顯示為在7周（基礎(chǔ)）、16周和24周時(shí)所測(cè)試的連續(xù)四天中每只小鼠/天的最好的兩次試驗(yàn)的平均值。延遲掉落顯示為相對(duì)于注射了mictl的小鼠的平均值±s.e.m.。(*p<0.05，單因素anova后接bonferroni事后檢驗(yàn))。d)注射了制劑緩沖液、mictl、mihds1、mihds1v5u、mihds1v6a或mihdss3的小鼠的重量增加分析。數(shù)據(jù)顯示為在7周時(shí)相對(duì)于基礎(chǔ)時(shí)間點(diǎn)的重量增加。e)注射了mihds1和mictl的小鼠的抱握分析。數(shù)據(jù)顯示為在指定的時(shí)間點(diǎn)表現(xiàn)出抱握的小鼠的百分比和數(shù)量。發(fā)明詳述rna干擾(rnai)是由小dsrna介導(dǎo)的基因調(diào)控方法。rnai被用作研究基因功能的常用生物學(xué)工具，并且正在研究其作為治療手段以治療各種疾病。rnai的遞送或表達(dá)可以通過(guò)施用外源性sirna（瞬時(shí)基因沉默）或通過(guò)施用表達(dá)莖-環(huán)rna的載體（持續(xù)基因沉默）。rnai的絕對(duì)特異性值得懷疑。必須解決的問(wèn)題包括：對(duì)dsrna(ifn-b、pkr、oas1)的細(xì)胞應(yīng)答和由于rnai機(jī)制的飽和或經(jīng)由與非預(yù)期mrna的部分互補(bǔ)而造成的脫靶效應(yīng)。需要不斷優(yōu)化rnai載體并潛在地開發(fā)組織特性性且受調(diào)控的表達(dá)策略。使用rnai作為治療劑取決于對(duì)若干因素的闡明，這些因素包括：i)rnai構(gòu)建體的遞送和持續(xù)性，用于有效沉默靶基因序列；ii)sirna的設(shè)計(jì)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)靶序列的有效下調(diào)或基因抑制，和iii)最佳sirna表達(dá)系統(tǒng)(shrna或mirna)，用于遞送治療性sirna。雖然許多研究已經(jīng)評(píng)價(jià)了以化學(xué)合成的寡核苷酸結(jié)構(gòu)遞送的rnai在許多臨床狀況和疾病狀態(tài)如亨廷頓氏病上的用途，但是據(jù)信，為了實(shí)現(xiàn)治療益處，需要通過(guò)內(nèi)源生產(chǎn)表達(dá)的sirna而實(shí)現(xiàn)治療性sirna的長(zhǎng)期和/或持續(xù)的高水平表達(dá)。迄今為止，已經(jīng)比較了基于shrna和基于人工mirna的策略，得到矛盾的結(jié)果。由于對(duì)dsrna(ifn-b、pkr、oas1)的細(xì)胞應(yīng)答、rnai機(jī)制的飽和或經(jīng)由與非預(yù)期mrna部分互補(bǔ)而沉默脫靶基因所產(chǎn)生的脫靶毒性，使得出于安全性顧慮，表達(dá)的rnai的治療實(shí)用性尚未解決。因此，需要不斷優(yōu)化安全有效的表達(dá)的rnai載體。shrna由莖-環(huán)結(jié)構(gòu)構(gòu)成，其被設(shè)計(jì)為含有5′側(cè)翼區(qū)、sirna區(qū)節(jié)段、環(huán)區(qū)、3′sirna區(qū)和3′側(cè)翼區(qū)。大多數(shù)rnai表達(dá)策略利用由基于poliii的強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的短發(fā)夾rna(shrna)。許多shrna已經(jīng)表現(xiàn)出體外及體內(nèi)有效下調(diào)靶序列，然而，一些表現(xiàn)出有效下調(diào)靶基因的shrna也發(fā)現(xiàn)具有體內(nèi)毒性。新近發(fā)現(xiàn)的替代方法是使用人工mirna(pri-mirna支架穿梭sirna序列)作為rnai載體。人工mirna更天然類似于內(nèi)源性rnai底物并且更適合pol-ii轉(zhuǎn)錄(例如，允許組織特異性表達(dá)rnai)和多順?lè)醋硬呗?例如，允許遞送多個(gè)sirna序列)。迄今為止，基于mirna的載體系統(tǒng)的功效相比shrna始終混雜著矛盾的結(jié)果。重要的是，這兩種系統(tǒng)所產(chǎn)生的脫靶毒性的問(wèn)題尚未得到評(píng)價(jià)。開發(fā)表達(dá)的sirna的重要考量是用所述表達(dá)的sirna構(gòu)建體向宿主細(xì)胞“給藥”的概念。表達(dá)的sirna的“給藥”，在本發(fā)明的上下文中，指代并且可以取決于遞送媒介物(例如，病毒的或非病毒的)、遞送媒介物的相對(duì)量或濃度、以及用于驅(qū)動(dòng)sirna序列表達(dá)的啟動(dòng)子的強(qiáng)度和特異性。本發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)了人工mirna穿梭載體，其并入了包含在shrna中的莖環(huán)序列并且修飾天然存在的人微rna30序列或mi30序列用于運(yùn)送這些小干擾rna(sirna)序列。參見(jiàn)，例如，pct公布wo2008/150897，其以引用方式并入本文。本發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)了用于治療亨廷頓氏病的人工mirna、pri-mirna、pre-mirna、表達(dá)載體、雙鏈及方法。參見(jiàn)，例如，pct公布wo2012/109667，其以引用方式并入本文。用于rnai的微rna穿梭mirna是小的細(xì)胞rna(~22nt)，其由前體莖環(huán)轉(zhuǎn)錄物加工而成。已知的mirna莖環(huán)可以經(jīng)修飾以含有特異于目標(biāo)基因的rnai序列。mirna分子可以較shrna分子優(yōu)選，因?yàn)閙irna是內(nèi)源表達(dá)的。因此，mirna分子不太可能誘導(dǎo)dsrna-反應(yīng)性干擾素途徑，相比shrna，其被更高效地加工，并且其已經(jīng)被證明80%更有效地沉默。相比shrna分子，mirna分子的啟動(dòng)子作用也不同。shrna的組織特異性誘導(dǎo)型表達(dá)涉及針對(duì)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的polii啟動(dòng)子的截短。相比之下，mirna可以從任何polii啟動(dòng)子表達(dá)，因?yàn)檗D(zhuǎn)錄起始和終止位點(diǎn)可以是相對(duì)隨意的。治療亨廷頓氏病主要的多谷氨酰胺擴(kuò)增疾病，包括1型脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)(sca1)和亨廷頓氏病(hd)，是進(jìn)行性、無(wú)法治療的神經(jīng)退行性疾病。在誘導(dǎo)型小鼠模型hd中，抑制突變型等位基因表達(dá)改善了疾病表型。因此，經(jīng)設(shè)計(jì)以抑制疾病基因表達(dá)的療法將是有益的。本發(fā)明提供了體內(nèi)使用rnai以治療亨廷頓氏病的方法。如本文所用的“治療”指代改善疾病或狀況的至少一種癥狀、治愈疾病或狀況和/或預(yù)防其發(fā)展。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，采用rnai分子以抑制靶基因的表達(dá)。所謂“抑制表達(dá)”意指減少、減弱或抑制靶基因的表達(dá)。靶基因的表達(dá)可經(jīng)由“基因沉默”而抑制?；虺聊复种苹虮磉_(dá)，例如，轉(zhuǎn)基因、異源基因和/或內(nèi)源基因表達(dá)，其可通過(guò)影響轉(zhuǎn)錄的方法和/或通過(guò)影響轉(zhuǎn)錄后機(jī)制的方法來(lái)介導(dǎo)。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)rnai分子啟動(dòng)經(jīng)由rna干擾以序列特異性方式抑制或降解從目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄的mrna，從而阻止該基因產(chǎn)物的翻譯時(shí)，發(fā)生基因沉默。本文涉及的sirna意在包括shrna及其它小rna，其可以或能夠例如經(jīng)由rna干擾而調(diào)節(jié)靶基因（例如，hd基因）的表達(dá)。此類小rna包括但不限于shrna和微rna(mirnas)。本文公開了經(jīng)由rnai而導(dǎo)致靶基因基本沉默的策略。使用此策略導(dǎo)致靶基因的體外和體內(nèi)表達(dá)明顯減弱。此策略可用于減少靶基因表達(dá)以建模生物學(xué)過(guò)程或提供針對(duì)人類疾病的療法。例如，此策略可以應(yīng)用于亨廷頓氏病。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“基本沉默”意指由于所引入sirna的存在而抑制和/或降解靶基因的mrna，使得相比當(dāng)不存在所述sirna時(shí)所觀察到的表達(dá)水平，該靶基因的表達(dá)減少約10%至100%。通常，當(dāng)基因被基本上沉默時(shí)，相比當(dāng)不存在所述sirna時(shí)，其將具有至少40%、50%、60%至70%，例如71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%至79%，通常至少80%，例如81%-84%、至少85%，例如86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或甚至100%減少的表達(dá)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“基本正常的活性”意指當(dāng)sirna尚未被引入細(xì)胞中時(shí)基因的表達(dá)水平。亨廷頓氏病(hd)是基于sirna的療法的強(qiáng)力候選者。hd是由在疾病蛋白質(zhì)中編碼polyq的cag重復(fù)序列擴(kuò)增引起的。polyq擴(kuò)增賦予了突變型蛋白質(zhì)主要的毒性特性，所述毒性特性與該疾病蛋白質(zhì)在神經(jīng)元中的異常積聚相關(guān)。hd是進(jìn)行性、最終致命的疾病，其通常始于成年期。cag重復(fù)序列/polyq結(jié)構(gòu)域的擴(kuò)增賦予了所編碼蛋白質(zhì)主要的毒性特性。因此，作為治療策略，在細(xì)胞死亡之前努力降低突變基因產(chǎn)物的表達(dá)可對(duì)患者高度有利。rna干擾(rnai)分子“rna干擾”、“rnai”、“小干擾rna”或“短干擾rna”或“sirna”或“短發(fā)夾rna”或“shrna”分子或“mirna”是rna雙鏈核苷酸，其靶向目標(biāo)核酸序列，例如，亨廷頓蛋白(htt)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“sirna”是通用術(shù)語(yǔ)，其涵蓋了shrna和mirna的子集?！皉na雙鏈”指代由rna分子的兩個(gè)區(qū)之間的互補(bǔ)配對(duì)而形成的結(jié)構(gòu)。sirna“靶向”基因，其中sirna的雙鏈部分的核苷酸序列與靶基因的核苷酸序列互補(bǔ)。在某些實(shí)施方案中，所述sirna靶向編碼共濟(jì)失調(diào)蛋白-1（ataxin-1）或亨廷頓蛋白的序列。在一些實(shí)施方案中，sirna雙鏈的長(zhǎng)度小于30個(gè)堿基對(duì)。在一些實(shí)施方案中，所述雙鏈可以長(zhǎng)29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10個(gè)堿基對(duì)。在一些實(shí)施方案中，所述雙鏈的長(zhǎng)度為19至25個(gè)堿基對(duì)。在某些實(shí)施方案中，所述雙鏈的長(zhǎng)度為19或21個(gè)堿基對(duì)。所述sirna的rna雙鏈部分可以是發(fā)夾結(jié)構(gòu)的一部分。除了所述雙鏈部分之外，所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)可含有位于形成所述雙鏈的兩個(gè)序列之間的環(huán)部分。所述環(huán)的長(zhǎng)度可以是變化的。在一些實(shí)施方案中，所述環(huán)的長(zhǎng)度為5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個(gè)核苷酸。在某些實(shí)施方案中，所述環(huán)長(zhǎng)18個(gè)核苷酸。所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)還可以含有3′和/或5′突出端部分。在一些實(shí)施方案中，所述突出端是長(zhǎng)0、1、2、3、4或5個(gè)核苷酸的3′和/或5′突出端?！皊hrna”的轉(zhuǎn)錄單元由通過(guò)非配對(duì)核苷酸的環(huán)連接的有義和反義序列構(gòu)成。shrna由輸出蛋白-5從細(xì)胞核輸出，并且一旦處于細(xì)胞質(zhì)中，即由dicer加工以生成功能性sirna?！癿irna”莖-環(huán)由通過(guò)非配對(duì)核苷酸的環(huán)連接的有義和反義序列構(gòu)成，其通常表達(dá)為更大的初級(jí)轉(zhuǎn)錄物(pri-mirna)的一部分，其由drosha-dgcr8復(fù)合體剪切而生成被稱為pre-mirna的中間體，該中間體隨后由輸出蛋白-5從細(xì)胞核輸出，并且一旦處于細(xì)胞質(zhì)中，即由dicer加工以生成功能性sirna?！叭斯irna”或“人工mirna穿梭載體”，如本文所互換使用，指代曾經(jīng)具有雙鏈莖環(huán)區(qū)（至少約9-20個(gè)核苷酸）的初級(jí)mirna轉(zhuǎn)錄物，所述雙鏈莖環(huán)區(qū)經(jīng)由drosha和dicer加工而替換以針對(duì)靶基因的sirna序列，同時(shí)在所述莖環(huán)內(nèi)保留有效drosha加工所必需的結(jié)構(gòu)元件。術(shù)語(yǔ)“人工的”基于這樣的事實(shí)：側(cè)翼序列（~35個(gè)上游核苷酸和~40個(gè)下游核苷酸）產(chǎn)生于sirna的多個(gè)克隆位點(diǎn)內(nèi)的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“mirna”同時(shí)涵蓋了天然存在的mirna序列以及人工生成的mirna穿梭載體。sirna可以由核酸序列編碼，并且所述核酸序列還可以包含啟動(dòng)子。所述核酸序列還可以包含多腺苷酸化信號(hào)。在一些實(shí)施方案中，所述多腺苷酸化信號(hào)是合成的最小多腺苷酸化信號(hào)或六t序列?！懊摪卸拘浴敝复磉_(dá)或含有sirna的宿主細(xì)胞的有害的、不期望的或非預(yù)期的表型變化。脫靶毒性可導(dǎo)致在細(xì)胞或生物體水平上喪失所需功能、得到非期望功能、或甚至死亡。脫靶毒性可在sirna表達(dá)時(shí)立刻發(fā)生或可隨時(shí)間推移逐漸發(fā)生。脫靶毒性可作為表達(dá)sirna的直接結(jié)果而發(fā)生或可作為誘導(dǎo)針對(duì)表達(dá)該sirna的細(xì)胞的宿主免疫應(yīng)答的結(jié)果而發(fā)生。不希望受理論的約束，脫靶毒性被認(rèn)為產(chǎn)生于細(xì)胞內(nèi)高水平或過(guò)多的rnai底物。這些過(guò)多或過(guò)表達(dá)的rnai底物（包括但不限于pre-rnai或pri-rnai底物以及過(guò)多的成熟反義-rna）可能競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)源rnai機(jī)制，因而破壞天然mirna的生物發(fā)生和功能。脫靶毒性還可能產(chǎn)生于由于序列的部分互補(bǔ)造成的沉默非預(yù)期mrna（即，脫靶）的增加的可能性。脫靶毒性的發(fā)生還可能是由于對(duì)非引導(dǎo)區(qū)的不正確的鏈偏好，使得優(yōu)先于rnai的靶向或引導(dǎo)區(qū)而裝配非引導(dǎo)區(qū)。脫靶毒性還可能產(chǎn)生于針對(duì)dsrna（包括dsrna(ifn-b、pkr、oas1)）的細(xì)胞應(yīng)答的刺激?！敖档偷拿摪卸拘浴敝复摪卸拘缘慕档汀p少、消除或減弱，使得治療效果相比有限或有害的毒性更有利于宿主，其通過(guò)持續(xù)時(shí)間或生活質(zhì)量的改善或sirna所靶向的疾病或狀況的病征或癥狀的改善來(lái)量度?！坝邢薜拿摪卸拘浴被颉暗兔摪卸拘浴北挥糜谥复鷮?duì)細(xì)胞或生物體的非預(yù)期的不期望的表型變化，無(wú)論是否可檢測(cè)到，其不排除或超過(guò)或限制對(duì)用sirna治療的宿主的治療益處并且可被視為所述療法的“副作用”。降低的或有限的脫靶毒性可通過(guò)如下測(cè)定或推斷：比較體外分析（如sirna底物水平的northern印跡或qpcr）或比較等價(jià)的shrna載體與本發(fā)明的mirna穿梭載體的體內(nèi)作用?！跋抡{(diào)”、“下調(diào)技術(shù)”指代基因沉默技術(shù)，其中靶基因的表達(dá)相比引入sirna之前的基因表達(dá)有所減少，其可以導(dǎo)致對(duì)靶基因產(chǎn)物生產(chǎn)的抑制。術(shù)語(yǔ)“減少的”在本文中用于表明靶基因表達(dá)被降低了1-100%。換句話講，可用于翻譯成多肽或蛋白質(zhì)的rna的量被最小化。例如，蛋白質(zhì)的量可減少10、20、30、40、50、60、70、80、90、95或99%。在一些實(shí)施方案中，表達(dá)減少了約90%（即，相比其中尚未施用sirna分子的細(xì)胞，在細(xì)胞中僅觀察到約10%的蛋白質(zhì)的量）?？梢酝ㄟ^(guò)使用dsrna或sirna來(lái)指導(dǎo)基因表達(dá)的下調(diào)?！皉na干擾(rnai)”是由sirna啟動(dòng)的序列特異性、轉(zhuǎn)錄后基因沉默的方法。在rnai過(guò)程中，sirna誘導(dǎo)靶mrna降解從而導(dǎo)致基因表達(dá)的序列特異性抑制。根據(jù)本發(fā)明的方法，亨廷頓蛋白的表達(dá)可以經(jīng)由rnai修飾。例如，可以抑制細(xì)胞中亨廷頓蛋白的積聚。術(shù)語(yǔ)“抑制”指代減少、降低或消除具體細(xì)胞中存在的轉(zhuǎn)錄物的數(shù)目或量。例如，可以通過(guò)rna干擾(rnai)抑制細(xì)胞中編碼亨廷頓蛋白的mrna的積聚，例如，通過(guò)序列特異性雙鏈rna(dsrna)，也被稱為短干擾rna(sirna)，而沉默所述基因。這些sirna可以是已經(jīng)雜交在一起的兩個(gè)單獨(dú)的rna分子，或其可能是單個(gè)發(fā)夾，其中rna分子的兩個(gè)部分已經(jīng)雜交在一起以形成雙鏈。突變型蛋白質(zhì)指代由具有突變的基因編碼的蛋白質(zhì)，例如，亨廷頓蛋白中的錯(cuò)義或無(wú)義突變。突變型亨廷頓蛋白可能是致病的，即，可能導(dǎo)致與動(dòng)物體內(nèi)存在具有一個(gè)或兩個(gè)突變型等位基因的亨廷頓蛋白相關(guān)的疾病。術(shù)語(yǔ)“基因”廣義地用于指代與生物學(xué)功能相關(guān)的任何核酸節(jié)段。因此，基因包括編碼序列和/或其表達(dá)所需的調(diào)控序列。例如，“基因”指代這樣的核酸片段，其表達(dá)mrna、功能性rna或特定蛋白質(zhì)，包括調(diào)控序列?！盎颉边€包括非表達(dá)dna節(jié)段，其例如形成其它蛋白質(zhì)的識(shí)別序列?！盎颉笨梢缘米愿鞣N來(lái)源，包括從目標(biāo)來(lái)源克隆或從已知或預(yù)測(cè)的序列信息合成，并且可包括設(shè)計(jì)成具有所需參數(shù)的序列。“等位基因”是占據(jù)染色體上給定基因座的基因的若干種可選形式之一。術(shù)語(yǔ)“核酸”指代由單體（核苷酸）構(gòu)成的單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)及其聚合物，所述單體含有糖、磷酸和堿基（嘌呤或嘧啶）。除非特別限定，否則該術(shù)語(yǔ)涵蓋含有天然核苷酸的已知類似物的核酸，其具有與參照核酸相似的結(jié)合特性，并且以類似于天然存在的核苷酸的方式被代謝。除非另外指明，否則具體的核酸序列還涵蓋其經(jīng)保守修飾的變體（例如，簡(jiǎn)并密碼子置換）和互補(bǔ)序列以及所明示的序列。具體地講，簡(jiǎn)并密碼子置換可通過(guò)生成如下序列而實(shí)現(xiàn)，其中一個(gè)或多個(gè)選定（或全部）密碼子的第三位被混合的堿基和/或脫氧肌苷殘基置換?！昂怂崞巍笔墙o定核酸分子的一部分?！昂塑账嵝蛄小笔莇na或rna聚合物，其可以是單鏈的或雙鏈的，任選地含有能夠摻入到dna或rna聚合物中的合成的、非天然的或經(jīng)改變的核苷酸堿基。術(shù)語(yǔ)“核酸”、“核酸分子”、“核酸片段”、“核酸序列或節(jié)段”或“多核苷酸”可互換使用，并且還可與基因、cdna、基因編碼的dna和rna互換使用。本發(fā)明涵蓋了分離的或基本上純化的核酸、核酸分子以及含有這些分子的組合物。在本發(fā)明的上下文中，“分離的”或“純化的”dna分子或rna分子是脫離其原生環(huán)境而存在的dna分子或rna分子，并且因此是非天然產(chǎn)物。分離的dna分子或rna分子可以純化形式存在或可存在于非原生環(huán)境中，如例如，在轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞中。例如，“分離的”或“純化的”核酸分子或其生物活性部分基本上不含其它細(xì)胞物質(zhì)或培養(yǎng)基（當(dāng)通過(guò)重組技術(shù)生產(chǎn)時(shí)），或基本上不含化學(xué)前體或其它化學(xué)物質(zhì)（當(dāng)化學(xué)合成時(shí)）。在一個(gè)實(shí)施方案中，“分離的”核酸不含在所述核酸來(lái)源的生物體的基因組dna中天然側(cè)接于該核酸的序列（即，位于所述核酸的5′與3′端的序列）。例如，在各種實(shí)施方案中，所述分離的核酸分子可以含有小于約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，其在所述核酸來(lái)源的細(xì)胞的基因組dna中天然側(cè)接于該核酸分子。本發(fā)明還涵蓋了本公開的核苷酸序列的片段和變體。所謂“片段”或“部分”意指全長(zhǎng)或小于全長(zhǎng)的核苷酸序列?！疤烊淮嬖诘摹薄ⅰ疤烊坏摹被颉耙吧汀北挥糜诿枋霾煌谌斯ぎa(chǎn)生的、可見(jiàn)于自然界中的對(duì)象。例如，這樣的蛋白質(zhì)或核苷酸序列是天然存在的：其存在于生物體（包括病毒）中、可以從天然來(lái)源中分離并且尚未在實(shí)驗(yàn)室中經(jīng)過(guò)有意的人工修飾。分子的“變體”是與天然分子的序列基本上類似的序列。對(duì)于核苷酸序列而言，變體包括由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而編碼與天然蛋白質(zhì)相同的氨基酸序列的那些序列。天然存在的等位變體是如可以使用分子生物學(xué)技術(shù)例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)和雜交技術(shù)識(shí)別的那些。變體核苷酸序列還包括合成衍生的核苷酸序列，如例如通過(guò)使用定點(diǎn)誘變生成的編碼天然蛋白質(zhì)的那些，以及編碼具有氨基酸置換的多肽的那些。通常，本發(fā)明的核苷酸序列變體將與天然（內(nèi)源性）核苷酸序列具有至少40%、50%、60%至70%，例如71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%至79%，通常至少80%，例如81%-84%，至少85%，例如86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%至98%的序列同一性?！稗D(zhuǎn)基因”指代已經(jīng)通過(guò)轉(zhuǎn)化而被引入到基因組中的基因。轉(zhuǎn)基因包括，例如，與待轉(zhuǎn)化的具體細(xì)胞的dna異源或同源的dna。另外，轉(zhuǎn)基因可包括被插入到非原生生物體中的天然基因，或嵌合基因。術(shù)語(yǔ)“內(nèi)源性基因”指代處于其在生物體的基因組中的天然位置的天然基因。術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”、“肽”和“多肽”在本文中可互換使用?！耙吧汀敝复嬖谟谧匀唤缰械恼；蚧蛏矬w?！盎蚪M”指代生物體的完整遺傳物質(zhì)?！拜d體”被定義為特別包括任何病毒載體以及雙鏈或單鏈的線性或環(huán)形的任何質(zhì)粒、粘粒、噬菌體或雙元載體，其可能是或可能不是自轉(zhuǎn)移或可移動(dòng)的，并且其可以通過(guò)整合進(jìn)細(xì)胞基因組或存在于染色體外（例如，具有復(fù)制起點(diǎn)的自主復(fù)制質(zhì)粒）而轉(zhuǎn)化原核或真核宿主。如本文所用的“表達(dá)盒”意指能夠指導(dǎo)具體核苷酸序列在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)的核酸序列，其可包含可操作地連接至目標(biāo)核苷酸序列的啟動(dòng)子，所述目標(biāo)核苷酸序列可被可操作地連接至終止信號(hào)。編碼區(qū)通常編碼目標(biāo)功能性rna，例如sirna。包含目標(biāo)核苷酸序列的表達(dá)盒可能是嵌合的。所述表達(dá)盒也可能是天然存在的，但已經(jīng)以可用于異源表達(dá)的重組形式獲得。表達(dá)盒中核苷酸序列的表達(dá)可能處于組成型啟動(dòng)子或僅當(dāng)宿主細(xì)胞暴露于一些特定刺激時(shí)才啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的可調(diào)控啟動(dòng)子的控制之下。就多細(xì)胞生物體而言，所述啟動(dòng)子還可以特異于具體組織或器官或發(fā)育階段。此類表達(dá)盒可以包含連接至目標(biāo)核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)。此類表達(dá)盒具有多個(gè)限制性位點(diǎn)，用于插入目標(biāo)基因以將其置于調(diào)控區(qū)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控之下。所述表達(dá)盒可另外含有選擇標(biāo)志物基因?！熬幋a序列”指代編碼特定氨基酸序列的dna或rna序列。其可構(gòu)成“不間斷的編碼序列”，即，缺少內(nèi)含子，如在cdna中，或其可包含由合適的剪接位點(diǎn)限定的一個(gè)或多個(gè)內(nèi)含子?！皟?nèi)含子”是這樣的rna序列，其被包含在初級(jí)轉(zhuǎn)錄物中但通過(guò)在細(xì)胞內(nèi)切割和重連接rna而被移除，以產(chǎn)生可以被翻譯成蛋白質(zhì)的成熟的mrna。術(shù)語(yǔ)“開放閱讀框”(orf)指代編碼序列的翻譯起始和終止密碼子之間的序列。術(shù)語(yǔ)“起始密碼子”和“終止密碼子”指代編碼序列中三個(gè)相鄰核苷酸的單元（“密碼子”），其分別指定蛋白質(zhì)合成（mrna翻譯）的起始和鏈終止?！肮δ苄詒na”指代有義rna、反義rna、核酶rna、sirna或可能不翻譯但依然對(duì)至少一種細(xì)胞加工有影響的其它rna。術(shù)語(yǔ)“rna轉(zhuǎn)錄物”或“轉(zhuǎn)錄物”指代由rna聚合酶催化的dna序列的轉(zhuǎn)錄所得的產(chǎn)物。當(dāng)rna轉(zhuǎn)錄物是dna序列的完全互補(bǔ)拷貝時(shí)，其被稱為初級(jí)轉(zhuǎn)錄物，或其可能是衍生自初級(jí)轉(zhuǎn)錄物的轉(zhuǎn)錄后加工的rna序列并且被稱為成熟的rna。“信使rna”(mrna)指代不含內(nèi)含子并可以由細(xì)胞翻譯成蛋白質(zhì)的rna?！癱dna”指代與mrna互補(bǔ)并衍生自mrna的單鏈或雙鏈dna。“調(diào)控序列”是位于編碼序列上游(5′非編碼序列)、內(nèi)或下游(3′非編碼序列)的核苷酸序列，并且其影響相關(guān)編碼序列的轉(zhuǎn)錄、rna加工或穩(wěn)定性、或翻譯。調(diào)控序列包括增強(qiáng)子、啟動(dòng)子、翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子和多腺苷酸化信號(hào)序列。其包括天然序列和合成序列以及可能是合成與天然序列的組合的序列。正如本文所提到的,術(shù)語(yǔ)“合適的調(diào)控序列”不限于啟動(dòng)子。然而，可用于本發(fā)明的一些合適的調(diào)控序列將包括但不限于：組成型啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng)子、發(fā)育特異性啟動(dòng)子、可調(diào)控啟動(dòng)子和病毒啟動(dòng)子?！?′非編碼序列”指代位于編碼序列的5′(上游)的核苷酸序列。其存在于起始密碼子上游的完全加工的mrna中并可影響將初級(jí)轉(zhuǎn)錄物加工成mrna、mrna穩(wěn)定性或翻譯效率?！?′非編碼序列”指代位于編碼序列的3′(下游)的核苷酸序列，并且可包括多腺苷酸化信號(hào)序列及編碼能夠影響mrna加工或基因表達(dá)的調(diào)控信號(hào)的其它序列。多腺苷酸化信號(hào)通常特征在于影響將多腺苷酸區(qū)添加至mrna前體的3′端。術(shù)語(yǔ)“翻譯前導(dǎo)序列”指代啟動(dòng)子與編碼序列之間的基因的dna序列部分，其被轉(zhuǎn)錄成rna并存在于翻譯起始密碼子上游(5′)的完全加工的mrna中。翻譯前導(dǎo)序列可影響將初級(jí)轉(zhuǎn)錄物加工成mrna、mrna穩(wěn)定性或翻譯效率。術(shù)語(yǔ)“成熟的”蛋白質(zhì)指代經(jīng)翻譯后加工的不含其信號(hào)肽的多肽?！扒绑w”蛋白質(zhì)指代mrna翻譯的初級(jí)產(chǎn)物?！靶盘?hào)肽”指代多肽的氨基末端伸出部，其與多肽一同翻譯形成前體肽并且是進(jìn)入分泌途徑所必需的。術(shù)語(yǔ)“信號(hào)序列”指代編碼信號(hào)肽的核苷酸序列?！皢?dòng)子”指代通常位于其編碼序列上游(5′)的核苷酸序列，其通過(guò)提供rna聚合酶識(shí)別以及正確轉(zhuǎn)錄所需的其它因素來(lái)指導(dǎo)和/或控制編碼序列的表達(dá)。“啟動(dòng)子”包括最小啟動(dòng)子，其是由tata框和用于指定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的其它序列構(gòu)成的短dna序列，向其上添加調(diào)控元件以控制表達(dá)?！皢?dòng)子”還指代包含最小啟動(dòng)子外加調(diào)控元件的核苷酸序列，其能夠控制編碼序列或功能性rna表達(dá)。此類型的啟動(dòng)子序列由近端和更遠(yuǎn)端的上游元件組成，后者元件通常被稱為增強(qiáng)子。因此，“增強(qiáng)子”是可以刺激啟動(dòng)子活性的dna序列并且可能是啟動(dòng)子的固有元件或被插入以增強(qiáng)啟動(dòng)子水平或組織特異性的異源元件。其能夠在兩個(gè)取向（正常或反轉(zhuǎn)）上操作，并且甚至當(dāng)被移向啟動(dòng)子的上游或下游時(shí)，依然能夠起作用。增強(qiáng)子和其它上游啟動(dòng)子元件均結(jié)合介導(dǎo)其效應(yīng)的序列特異性dna結(jié)合蛋白。啟動(dòng)子可整個(gè)來(lái)源于天然基因，或由來(lái)源于天然存在的不同啟動(dòng)子的不同元件構(gòu)成，或甚至由合成的dna節(jié)段構(gòu)成。啟動(dòng)子還可含有涉及蛋白因子結(jié)合的dna序列，所述蛋白因子響應(yīng)于生理或發(fā)育條件而控制轉(zhuǎn)錄起始的有效性?？捎糜诒景l(fā)明的啟動(dòng)子的實(shí)例包括：小鼠u6rna啟動(dòng)子、合成的人h1rna啟動(dòng)子、sv40、cmv、rsv、rna聚合酶ii及rna聚合酶iii啟動(dòng)子?！捌鹗嘉稽c(diǎn)”是圍繞第一個(gè)核苷酸的位置，其是被轉(zhuǎn)錄序列的一部分，也被定義為位置+1。該基因及其控制區(qū)的所有其它序列均相對(duì)于此位點(diǎn)進(jìn)行編號(hào)。將下游序列(即，在3′方向上另外的蛋白質(zhì)編碼序列)定為正，而將上游序列(在5′方向上的大多數(shù)控制區(qū))定為負(fù)。在缺少上游活化的情況下而失活或具有大幅降低的啟動(dòng)子活性的啟動(dòng)子元件，尤其是tata元件，被稱為“最小或核心啟動(dòng)子”。在存在合適的轉(zhuǎn)錄因子的情況下，最小啟動(dòng)子發(fā)揮作用以允許轉(zhuǎn)錄。因此，“最小或核心啟動(dòng)子”僅由轉(zhuǎn)錄起始所需的所有基本元件（例如，tata框和/或起始子）組成?！敖M成型表達(dá)”指代使用組成型或受調(diào)控的啟動(dòng)子表達(dá)?！坝袟l件的”和“受調(diào)控表達(dá)”指代由受調(diào)控的啟動(dòng)子控制的表達(dá)?！翱刹僮鞯剡B接”指代單個(gè)核酸片段上核酸序列間的關(guān)聯(lián)，使得其中一個(gè)序列的功能受到另一個(gè)的影響。例如，調(diào)控dna序列被稱為“可操作地連接至”編碼rna或多肽的dna序列或“與之相關(guān)聯(lián)”，如果這兩個(gè)序列的位置關(guān)系使得調(diào)控dna序列影響編碼dna序列的表達(dá)（即，編碼序列或功能性rna處于啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制之下）。編碼序列可以有義或反義取向而被可操作地連接至調(diào)控序列?！氨磉_(dá)”指代細(xì)胞中內(nèi)源基因、異源基因或核酸節(jié)段、或轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。例如，就sirna構(gòu)建體而言，表達(dá)可僅指代該sirna的轉(zhuǎn)錄。另外，表達(dá)指代有義(mrna)或功能性rna的轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定積聚。表達(dá)還可指代蛋白質(zhì)生產(chǎn)?！案淖兊乃健敝复D(zhuǎn)基因細(xì)胞或生物體中的表達(dá)水平，其不同于正?；蛭崔D(zhuǎn)化細(xì)胞或生物體中的表達(dá)水平?！斑^(guò)表達(dá)”指代轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或生物體中的表達(dá)水平，其超出正?；蛭崔D(zhuǎn)化細(xì)胞或生物體中的表達(dá)水平?！胺戳x抑制”指代產(chǎn)生反義rna轉(zhuǎn)錄物，其能夠抑制內(nèi)源基因或轉(zhuǎn)基因的蛋白質(zhì)表達(dá)。“轉(zhuǎn)錄終止片段”指代含有一種或多種能夠終止轉(zhuǎn)錄的調(diào)控信號(hào)（如多腺苷酸化信號(hào)序列）的核苷酸序列。實(shí)例包括編碼胭脂堿合成酶的基因的3′非調(diào)控區(qū)和二磷酸核酮糖羧化酶的小亞單元?！胺g終止片段”指代含有一種或多種能夠終止翻譯的調(diào)控信號(hào)（如在所有三個(gè)框架中的一種或多種終止密碼子）的核苷酸序列。在編碼序列5′端的起始密碼子相鄰處或附近插入翻譯終止片段將導(dǎo)致沒(méi)有翻譯或不正確的翻譯。通過(guò)位點(diǎn)特異性重組切除翻譯終止片段將在編碼序列內(nèi)留下位點(diǎn)特異性序列，該序列不會(huì)妨礙使用起始密碼子的正確翻譯。術(shù)語(yǔ)“順式作用序列”和“順式作用元件”指代這樣的dna或rna序列，其功能要求其位于同一分子上。復(fù)制子上的順式作用序列的實(shí)例是病毒復(fù)制起點(diǎn)。術(shù)語(yǔ)“反式作用序列”和“反式作用元件”指代這樣的dna或rna序列，其功能不要求其位于同一分子上?！叭旧w整合的”指代通過(guò)共價(jià)鍵將外來(lái)基因或核酸構(gòu)建體整合到宿主dna中。當(dāng)基因不是“染色體整合的”時(shí)，其可被“瞬時(shí)表達(dá)”?；虻乃矔r(shí)表達(dá)指代未被整合到宿主染色體中但例如作為自主復(fù)制質(zhì)?；虮磉_(dá)盒的一部分，或作為另一種生物系統(tǒng)如病毒的一部分而獨(dú)立起作用的基因的表達(dá)。下列術(shù)語(yǔ)用于描述兩種或更多種核酸或多核苷酸之間的序列關(guān)系：(a)“參考序列”、(b)“比較窗口”、(c)“序列同一性”、(d)“序列同一性百分比”和(e)“基本同一性”。(a)如本文所用，“參考序列”是限定的序列，用作序列比較的基礎(chǔ)。參考序列可能是指定序列的子集或全部；例如，作為全長(zhǎng)cdna或基因序列的節(jié)段，或整個(gè)cdna或基因序列。(b)如本文所用，“比較窗口”指代多核苷酸序列的連續(xù)且指定的節(jié)段，其中相比參考序列(其不包含添加或缺失)，所述比較窗口中的多核苷酸序列可包含添加或缺失(即，空位)，用于這兩個(gè)序列的最佳比對(duì)。通常，比較窗口長(zhǎng)至少20個(gè)連續(xù)核苷酸，并且任選地可以是30、40、50、100或更長(zhǎng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，為了避免由于在多核苷酸序列中包含空位而造成的與參考序列的高度相似性，通常會(huì)引入空位罰分并且將其從匹配數(shù)目中減去。用于比較的序列比對(duì)方法是本領(lǐng)域眾所周知的。因此，確定任意兩個(gè)序列之間的百分比同一性可以使用數(shù)學(xué)算法完成。這些數(shù)學(xué)算法的計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)可以用于比較序列以確定序列同一性。此類實(shí)現(xiàn)包括但不限于：pc/gene程序中的clustal(可得自intelligenetics,mountainview,california)；align程序(版本2.0)以及wisconsingeneticssoftwarepackage，版本8中的gap、bestfit、blast、fasta和tfasta(可得自geneticscomputergroup(gcg),575sciencedrive,madison,wisconsin,usa)。使用這些程序的比對(duì)可以使用默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行。用于進(jìn)行blast分析的軟件可通過(guò)國(guó)家生物技術(shù)信息中心公開獲得。此算法涉及首先通過(guò)在查詢序列中識(shí)別長(zhǎng)度為w的短字串來(lái)識(shí)別高分序列對(duì)(hsp)，當(dāng)與數(shù)據(jù)庫(kù)序列中相同長(zhǎng)度的字串比對(duì)時(shí)，其匹配或滿足某個(gè)正值閾限分?jǐn)?shù)t。t被稱為相鄰字串分?jǐn)?shù)閾值。這些最初的相鄰字串命中用作種子用于啟動(dòng)搜索以找到包含其的更長(zhǎng)的hsp。隨后沿著每個(gè)序列使字串命中在兩個(gè)方向上延伸，只要累積的比對(duì)分?jǐn)?shù)可以增加。對(duì)于核苷酸序列，使用參數(shù)m(匹配殘基對(duì)的獎(jiǎng)分；總是>0)和n(錯(cuò)配殘基的罰分；總是<0)計(jì)算累積分?jǐn)?shù)。對(duì)于氨基酸序列，使用評(píng)分矩陣計(jì)算累積分?jǐn)?shù)。當(dāng)累積比對(duì)分?jǐn)?shù)從其所達(dá)到的最大值回落數(shù)量x、累積分?jǐn)?shù)由于累積一個(gè)或多個(gè)負(fù)分殘基比對(duì)而降至零或以下、或到達(dá)任一序列的末端時(shí)，則在各個(gè)方向上的字串命中的延伸停止。除了計(jì)算百分比序列同一性，blast算法還進(jìn)行兩個(gè)序列之間相似性的統(tǒng)計(jì)分析。blast算法提供的對(duì)相似性的一種量度是最小和概率(p(n))，其提供對(duì)兩個(gè)核苷酸序列之間將偶然發(fā)生匹配的概率的指示。例如，如果測(cè)試核酸序列與參考核酸序列的比較中的最小和概率小于約0.1，更優(yōu)選地小于約0.01，并且最優(yōu)選地小于約0.001，則該測(cè)試核酸序列被認(rèn)為與該參考序列相似。為了獲得空位比對(duì)以用于比較目的，可以使用gappedblast(在blast2.0中)。作為另外一種選擇，可以使用psi-blast(在blast2.0中)進(jìn)行迭代搜索以檢測(cè)分子間的遠(yuǎn)親關(guān)系。當(dāng)使用blast、gappedblast、psi-blast時(shí)，可以使用相應(yīng)程序的默認(rèn)參數(shù)(例如，blastn用于核苷酸序列)。blastn程序(用于核苷酸序列)使用以下默認(rèn)值：字串長(zhǎng)度(w)為11、期望值(e)為10、截?cái)嘀禐?00、m=5、n=-4、以及比較兩條鏈。還可以通過(guò)檢測(cè)手動(dòng)進(jìn)行比對(duì)。對(duì)于本發(fā)明的目的而言，優(yōu)選使用采用其默認(rèn)參數(shù)的blastn程序(版本1.4.7或更新)或任何等同程序進(jìn)行用于確定與本文公開的啟動(dòng)子序列的百分比序列同一性的核苷酸序列比較。所謂“等同程序”意為任何序列比較程序，對(duì)于所考慮的任何兩個(gè)序列而言，當(dāng)相比由優(yōu)選程序所生成的對(duì)應(yīng)比對(duì)結(jié)果時(shí)，其生成具有相同核苷酸匹配和相同百分比序列同一性的比對(duì)結(jié)果。(c)如本文所用，“序列同一性”或“同一性”在兩個(gè)核酸序列的上下文中指代當(dāng)比對(duì)在指定比較窗口上的最大對(duì)應(yīng)時(shí)，這兩個(gè)序列中相同核苷酸的特定百分比，正如通過(guò)序列比較算法或通過(guò)視覺(jué)檢測(cè)所測(cè)量的。(d)如本文所用，“序列同一性百分比”指代通過(guò)在比較窗口上比較兩個(gè)最佳比對(duì)序列而確定的值，其中相比參考序列(其不包含添加或缺失)，所述比較窗口中的多核苷酸序列的部分可包含添加或缺失(即，空位)，用于這兩個(gè)序列的最佳比對(duì)。所述百分比通過(guò)如下計(jì)算：確定兩個(gè)序列中存在相同核酸堿基或氨基酸殘基的位置的數(shù)目以得到匹配位置的數(shù)目，用匹配位置的數(shù)目除以比較窗口中的位置總數(shù)，并將結(jié)果乘以100以得到序列同一性百分比。(e)術(shù)語(yǔ)多核苷酸序列的“基本同一性”意指多核苷酸包含這樣的序列，使用采用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)的所述比對(duì)程序之一而與參考序列相比，所述序列具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%或79%，優(yōu)選至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%或89%，更優(yōu)選至少90%、91%、92%、93%或94%，并且最優(yōu)選至少95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。核苷酸序列基本上相同的另一個(gè)指標(biāo)是在嚴(yán)格條件下兩種分子是否彼此雜交。通常，嚴(yán)格條件被選為：在限定的離子強(qiáng)度和ph下，比特定序列的熱力學(xué)熔點(diǎn)(tm)低約5°c。然而，嚴(yán)格條件涵蓋約1°c至約20°c范圍內(nèi)的溫度，取決于其它符合本文所需的嚴(yán)格程度。對(duì)于序列比較，通常一個(gè)序列充當(dāng)參考序列以供測(cè)試序列進(jìn)行比較。當(dāng)使用序列比較算法時(shí)，將測(cè)試和參考序列輸入計(jì)算機(jī)中，確定子序列坐標(biāo)（如果有必要），并確定序列算法程序參數(shù)。序列比較算法隨后基于所確定的程序參數(shù)計(jì)算測(cè)試序列相對(duì)于參考序列的百分比序列同一性。正如本文所提到的，兩個(gè)核酸序列基本上相同的另一個(gè)指標(biāo)是在嚴(yán)格條件下這兩種分子彼此雜交。短語(yǔ)“特異性雜交至”指代在嚴(yán)格條件下分子僅與特定核苷酸序列結(jié)合、成雙鏈或雜交，當(dāng)該序列存在于復(fù)雜混合物（例如，總細(xì)胞dna或rna）中時(shí)?！盎旧辖Y(jié)合”指代探針核酸與靶核酸之間的互補(bǔ)雜交，并包含可以通過(guò)降低雜交介質(zhì)的嚴(yán)格性而容忍的少量錯(cuò)配以實(shí)現(xiàn)對(duì)靶核酸序列的所需檢測(cè)?！皣?yán)格雜交條件”和“嚴(yán)格雜交洗滌條件”在核酸雜交實(shí)驗(yàn)如southern和northern雜交的背景中是序列依賴性的，并且在不同環(huán)境參數(shù)下而有所不同。更長(zhǎng)的序列在更高的溫度下特異性雜交。tm是當(dāng)50%的靶序列雜交至完全匹配的探針時(shí)的溫度（在限定的離子強(qiáng)度和ph下）。特異性通常是雜交后洗滌的函數(shù)，關(guān)鍵因素是最終洗滌溶液的離子強(qiáng)度和溫度。對(duì)于dna-dna雜交，tm可以由以下公式近似得出：tm81.5°c+16.6(logm)+0.41(%gc)-0.61(%form)-500/l；其中m是單價(jià)陽(yáng)離子的摩爾濃度，%gc是dna中鳥嘌呤和胞嘧啶核苷酸的百分比，%form是雜交溶液中甲酰胺的百分比，而l是雜交產(chǎn)物的堿基對(duì)長(zhǎng)度。對(duì)于每1%的錯(cuò)配，tm降低約1°c；因此，可以調(diào)整tm、雜交和/或洗滌條件以雜交至具有所需同一性的序列。例如，如果尋求具有>90%同一性的序列，可以將tm降低10°c。通常，嚴(yán)格條件被選為：在限定的離子強(qiáng)度和ph下，比特定序列及其補(bǔ)體的熱力學(xué)熔點(diǎn)(tm)低約5°c。然而，特別嚴(yán)格條件可以低于熱力學(xué)熔點(diǎn)(tm)1、2、3或4°c使用雜交和/或洗滌；中等嚴(yán)格條件可以低于熱力學(xué)熔點(diǎn)(tm)6、7、8、9或10°c使用雜交和/或洗滌；低嚴(yán)格條件可以低于熱力學(xué)熔點(diǎn)(tm)11、12、13、14、15或20°c使用雜交和/或洗滌。使用此公式、雜交和洗滌組成以及所需t，普通技術(shù)人員將理解，雜交和/或洗滌溶液的嚴(yán)格性的變化已經(jīng)被固有地描述。如果所需錯(cuò)配程度導(dǎo)致t小于45°c(水溶液)或32°c(甲酰胺溶液)，則優(yōu)選地增加ssc濃度使得可以使用更高的溫度。通常，高度嚴(yán)格雜交和洗滌條件被選為：在限定的離子強(qiáng)度和ph下，比特定序列的熱力學(xué)熔點(diǎn)(tm)低約5°c。高度嚴(yán)格洗滌條件的實(shí)例是：0.15mnacl、72°c、約15分鐘。嚴(yán)格洗滌條件的實(shí)例是：0.2xssc在65°c洗滌15分鐘(參見(jiàn)，sambrook和russell2001，對(duì)ssc緩沖液的說(shuō)明)。通常，在高嚴(yán)格性洗滌之前會(huì)有低嚴(yán)格性洗滌以移除背景探針信號(hào)。對(duì)于短核酸序列(例如，約10至50個(gè)核苷酸)，嚴(yán)格條件通常涉及：鹽濃度在ph7.0至8.3時(shí)低于約1.5m，更優(yōu)選地約0.01至1.0m的na離子濃度(或其它鹽類)，而溫度通常為至少約30°c。嚴(yán)格條件還可通過(guò)加入去穩(wěn)定劑如甲酰胺而實(shí)現(xiàn)。通常，信噪比為在具體雜交測(cè)定中所觀察到的不相關(guān)探針的信噪比的2x(或更高)表明檢測(cè)到特定雜交。非常嚴(yán)格條件被選為：等于特定核酸分子的tm。非常嚴(yán)格條件被選為：等于特定探針的tm。在southern或northern印跡的過(guò)濾器上具有超過(guò)100個(gè)互補(bǔ)殘基的互補(bǔ)核酸的雜交的嚴(yán)格條件的實(shí)例是50%甲酰胺，例如，在50%甲酰胺、1mnacl、1%sds中于37°c雜交，并且在0.1xssc中于60至65°c洗滌。示例性低嚴(yán)格性條件包括：用30至35%甲酰胺、1mnacl、1%sds(十二烷基硫酸鈉)的緩沖溶液于37°c雜交，并且在1x至2xssc(20xssc=3.0mnacl/0.3m檸檬酸三鈉)中于50至55°c洗滌。示例性中等嚴(yán)格性條件包括：在40至45%甲酰胺、1.0mnacl、1%sds中于37°c雜交，并且在0.5x至1xssc中于55至60°c洗滌。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”指代將核酸片段轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞的基因組中，得到基因上穩(wěn)定的遺傳?！八拗骷?xì)胞”是已經(jīng)或能夠被外源核酸分子轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。含有轉(zhuǎn)化的核酸片段的宿主細(xì)胞被稱為“轉(zhuǎn)基因”細(xì)胞?！稗D(zhuǎn)化的”、“轉(zhuǎn)導(dǎo)的”、“轉(zhuǎn)基因的”和“重組的”指代其中已經(jīng)引入了異源核酸分子的宿主細(xì)胞。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)染”指代將dna遞送到真核（例如，哺乳動(dòng)物）細(xì)胞中。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”在本文中用于指代將dna遞送到原核（例如，大腸桿菌）細(xì)胞中。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)導(dǎo)”在本文中用于指代用病毒顆粒感染細(xì)胞。核酸分子可以被穩(wěn)定地整合到本領(lǐng)域眾所周知的基因組中。已知的pcr方法包括但不限于使用下列引物的方法：配對(duì)引物、嵌套引物、單特異性引物、簡(jiǎn)并引物、基因特異性引物、載體特異性引物、部分錯(cuò)配引物等。例如，“轉(zhuǎn)化的”、“轉(zhuǎn)化子”和“轉(zhuǎn)基因的”細(xì)胞已經(jīng)經(jīng)過(guò)了轉(zhuǎn)化過(guò)程并且含有被整合到其染色體中的外來(lái)基因。術(shù)語(yǔ)“未轉(zhuǎn)化的”指代尚未經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化過(guò)程的正常細(xì)胞?！斑z傳學(xué)上改變的細(xì)胞”指代已經(jīng)通過(guò)引入重組或異源核酸（例如，一種或多種dna構(gòu)建體或其rna相對(duì)物）而修飾的細(xì)胞，并且還包括保留部分或全部此類基因修飾的此類細(xì)胞的子代。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“衍生自”或“涉及”在針對(duì)核苷酸分子時(shí)意指該分子與特定的目標(biāo)分子具有互補(bǔ)的序列同一性。本發(fā)明的sirna可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法生成，例如，通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄、重組生成，或通過(guò)合成方法生成。在一個(gè)實(shí)例中，sirna可以通過(guò)使用重組酶（如t7rna聚合酶）和dna寡核苷酸模板體外生成。本發(fā)明的核酸分子術(shù)語(yǔ)“分離的和/或純化的”指代在體外將核酸（例如，dna或rna分子）從其天然細(xì)胞環(huán)境，并從與細(xì)胞的其它組分（如核酸或多肽）的締合中分離，使得其可以被測(cè)序、復(fù)制和/或表達(dá)。rna或dna是“分離的”，如果其不含在該rna或dna的天然來(lái)源中其通常締合的至少一種污染核酸，并且優(yōu)選地基本上不含任何其它哺乳動(dòng)物rna或dna。短語(yǔ)“不含其通常締合的至少一種污染來(lái)源核酸”包括這樣的情況：其中所述核酸被重新引入到來(lái)源或天然細(xì)胞中但是在不同的染色體位置，或其側(cè)接通常不存在于來(lái)源細(xì)胞中的核酸序列（例如，在載體或質(zhì)粒中）。除了編碼sirna的dna序列之外，本發(fā)明的核酸分子包括雙鏈干擾rna分子，其也可用于抑制靶基因的表達(dá)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“重組核酸”，例如，“重組dna序列或節(jié)段”指代這樣的核酸（例如，dna），其已經(jīng)衍生自或分離自任何適當(dāng)?shù)募?xì)胞來(lái)源，其可隨后被體外化學(xué)改變，使得其序列并非天然存在的，或?qū)?yīng)于不位于其將在尚未用外源dna轉(zhuǎn)化的基因組中所處位置的天然存在的序列。“衍生”自來(lái)源的預(yù)選dna的實(shí)例將是這樣的dna序列，其被鑒別為給定生物體內(nèi)的有用片段，并且其隨后以基本上純的形式被化學(xué)合成?！胺蛛x”自來(lái)源的此類dna的實(shí)例將是有用的dna序列，其通過(guò)化學(xué)方法（例如，通過(guò)使用限制性核酸內(nèi)切酶）而從來(lái)源被切除或移除，使得其可以通過(guò)基因工程方法被進(jìn)一步操縱（例如，擴(kuò)增）而用于本發(fā)明?！爸亟Mdna”包括：完全合成的dna序列、半合成的dna序列、分離自生物來(lái)源的dna序列和衍生自rna的dna序列以及其混合物。本發(fā)明的表達(dá)盒為了制備表達(dá)盒，重組dna序列或節(jié)段可以是環(huán)狀或線性、雙鏈或單鏈的。通常，dna序列或節(jié)段為嵌合dna的形式，如質(zhì)粒dna或載體，其還可以含有側(cè)接控制序列的編碼區(qū)，所述控制序列促進(jìn)存在于所得轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的重組dna的表達(dá)?！扒逗稀陛d體或表達(dá)盒，如本文所用，意指這樣的載體或盒，其包含來(lái)自至少兩個(gè)不同物種的核酸序列，或具有來(lái)自同一物種的核酸序列，該序列以不存在于“天然”或野生型物種中的方式連接或締合。除了用作rna轉(zhuǎn)錄物或其部分的轉(zhuǎn)錄單元的重組dna序列之外，該重組dna的一部分可能未轉(zhuǎn)錄，起到調(diào)控或結(jié)構(gòu)功能。例如，所述重組dna可具有在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有活性的啟動(dòng)子。宿主細(xì)胞中的其它功能性元件，如內(nèi)含子、增強(qiáng)子、多腺苷酸化序列等，也可能是該重組dna的一部分。此類元件可能是或可能不是所述dna功能所必要的，但可通過(guò)影響轉(zhuǎn)錄、sirna的穩(wěn)定性等而提供該dna的改善的表達(dá)。此類元件可根據(jù)需要而被包含在dna中以在細(xì)胞中獲得sirna的最佳性能。控制序列是在特定宿主生物體中表達(dá)經(jīng)可操作連接的編碼序列所必需的dna序列。適用于原核細(xì)胞的控制序列，例如，包括啟動(dòng)子和任選地操縱子序列以及核糖體結(jié)合位點(diǎn)。已知真核細(xì)胞使用啟動(dòng)子、多聚腺苷酸化信號(hào)和增強(qiáng)子。可操作連接的核酸是與另一核酸序列處于功能關(guān)系的核酸。例如，啟動(dòng)子或增強(qiáng)子被有效連接至編碼序列，如果其影響了該序列的轉(zhuǎn)錄；或者核糖體結(jié)合位點(diǎn)被有效連接至編碼序列，如果其被布置成便于翻譯。通常，可操作連接的dna序列是連續(xù)連接的dna序列。然而，增強(qiáng)子不必是連續(xù)的。連接通過(guò)在便利的限制性位點(diǎn)處的連接反應(yīng)而完成。如果不存在此類位點(diǎn)，則根據(jù)常規(guī)操作使用合成的寡核苷酸接頭（adaptor）或連接基（linker）。待引入細(xì)胞中的重組dna可含有選擇標(biāo)志物基因或報(bào)道基因或二者皆有以有助于從試圖通過(guò)病毒載體轉(zhuǎn)染或感染的細(xì)胞群體中識(shí)別和選擇表達(dá)細(xì)胞。在其它實(shí)施方案中，所述選擇標(biāo)志物可由單獨(dú)的dna片斷攜帶并用于共轉(zhuǎn)染程序。選擇標(biāo)志物和報(bào)道基因均可側(cè)接合適的調(diào)控序列以允許在宿主細(xì)胞中表達(dá)?？捎玫倪x擇標(biāo)志物是本領(lǐng)域已知的并且包括，例如，抗生素抗性基因如neo等。報(bào)道基因被用于識(shí)別潛在的轉(zhuǎn)染細(xì)胞并被用于評(píng)價(jià)調(diào)控序列的功能性。編碼容易測(cè)定的蛋白質(zhì)的報(bào)道基因是本領(lǐng)域熟知的。通常，報(bào)道基因是不存在于受體生物體或組織中或不由其表達(dá)的基因，并且該基因編碼這樣的蛋白質(zhì)，其表達(dá)表現(xiàn)出一些容易檢測(cè)到的特性，例如，酶活性。例如，報(bào)道基因包括來(lái)自大腸桿菌的tn9的氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶基因(cat)和來(lái)自螢火蟲（photinuspyralis）的螢光素酶基因。在dna已經(jīng)被引入受體細(xì)胞后的合適時(shí)間測(cè)定報(bào)道基因的表達(dá)。用于構(gòu)建可以轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞的重組dna的一般方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，并且可使用相同的構(gòu)建組成和方法以生產(chǎn)可用于本文的dna。重組dna可以通過(guò)用由編碼sirna的dna構(gòu)成的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染，通過(guò)任何可用于引入特定細(xì)胞的程序，例如，物理或生物方法，而被容易地引入宿主細(xì)胞，例如，哺乳動(dòng)物、細(xì)菌、酵母或昆蟲細(xì)胞，以得到含有該重組dna的細(xì)胞，所述重組dna被穩(wěn)定整合至該細(xì)胞基因組中或以附加元件存在，使得本發(fā)明的dna分子或序列被該宿主細(xì)胞表達(dá)。優(yōu)選地，dna經(jīng)由載體被引入到宿主細(xì)胞中。宿主細(xì)胞優(yōu)選為真核來(lái)源，例如，植物、哺乳動(dòng)物、昆蟲、酵母或真菌來(lái)源，但也可采用非真核來(lái)源的宿主細(xì)胞。將預(yù)選dna引入宿主細(xì)胞的物理方法包括：磷酸鈣沉淀、微脂粒感染、粒子轟擊、微注射、電穿孔等。將目標(biāo)dna引入宿主細(xì)胞的生物方法包括使用dna和rna病毒載體。對(duì)于哺乳動(dòng)物基因療法而言，如下文所述，希望使用有效的方法將基因拷貝插入到宿主基因組中。病毒載體，并且尤其是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，已經(jīng)成為最廣泛使用的用于將基因插入到哺乳動(dòng)物（例如，人類）細(xì)胞中的方法。其它病毒載體可以來(lái)源于痘病毒、單純皰疹病毒i、腺病毒和腺相關(guān)病毒等。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利no.5,350,674和5,585,362。如本文所述，“轉(zhuǎn)染的”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)的”宿主細(xì)胞或細(xì)胞系中的基因組已經(jīng)由于至少一個(gè)異源或重組核酸序列的存在而改變或擴(kuò)大。本發(fā)明的宿主細(xì)胞通常由dna序列轉(zhuǎn)染產(chǎn)生，所述dna序列是在質(zhì)粒表達(dá)載體、病毒表達(dá)載體中，或作為分離的線性dna序列。轉(zhuǎn)染的dna可以成為染色體整合的重組dna序列，其由編碼sirna的序列構(gòu)成。為了確認(rèn)宿主細(xì)胞中存在重組dna，可進(jìn)行各種測(cè)定。此類測(cè)定包括，例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的“分子生物學(xué)”測(cè)定，如southern和northern印跡、rt-pcr和pcr；“生物化學(xué)”測(cè)定，如檢測(cè)是否存在特定肽，例如，通過(guò)免疫學(xué)方法(elisa和western印跡)或通過(guò)本文所述的測(cè)定，以識(shí)別落入本發(fā)明范圍內(nèi)的試劑。為了檢測(cè)并定量引入的重組dna節(jié)段所產(chǎn)生的rna，可采用rt-pcr。在這種pcr應(yīng)用中，首先需要使用酶如逆轉(zhuǎn)錄酶將rna反轉(zhuǎn)錄成dna，并隨后通過(guò)使用常規(guī)pcr技術(shù)擴(kuò)增dna。在大多數(shù)情況下，pcr技術(shù)（盡管有用）將無(wú)法證明rna產(chǎn)物的完整性。有關(guān)rna產(chǎn)物性質(zhì)的另外信息可通過(guò)northern印跡獲得。此技術(shù)證明rna物質(zhì)的存在并提供有關(guān)該rna完整性的信息。rna物質(zhì)的存在與否還可以使用點(diǎn)印跡或狹縫印跡northern雜交確定。這些技術(shù)是northern印跡的修改形式并且僅證明rna物質(zhì)的存在與否。雖然southern印跡和pcr可用于檢測(cè)所考慮的重組dna節(jié)段，但其無(wú)法提供諸如預(yù)選dna節(jié)段是否被表達(dá)的信息?？赏ㄟ^(guò)特異性識(shí)別所引入的重組dna序列的肽產(chǎn)物或評(píng)價(jià)由于在宿主細(xì)胞中表達(dá)所引入的重組dna節(jié)段而引起的表型變化來(lái)評(píng)價(jià)表達(dá)。本發(fā)明提供了用于在哺乳動(dòng)物受體中表達(dá)外源核酸物質(zhì)的細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。所述表達(dá)系統(tǒng)，也被稱為“基因修飾的細(xì)胞”，包括細(xì)胞和用于表達(dá)所述外源核酸物質(zhì)的表達(dá)載體。所述基因修飾的細(xì)胞適用于向哺乳動(dòng)物受體施用，其中所述細(xì)胞取代該受體的內(nèi)源細(xì)胞。因此，優(yōu)選的基因修飾的細(xì)胞是非永生化并且非致瘤性的。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，所述細(xì)胞被轉(zhuǎn)染或以其它方式離體基因修飾。所述細(xì)胞分離自哺乳動(dòng)物（優(yōu)選人類），用載體引入核酸（即，體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染）用于表達(dá)編碼治療劑的異源（例如，重組）基因，并隨后施用于哺乳動(dòng)物受體以原位遞送所述治療劑。所述哺乳動(dòng)物受體可以是人，而所述待修飾的細(xì)胞是自體細(xì)胞，即，所述細(xì)胞分離自所述哺乳動(dòng)物受體。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，所述細(xì)胞被轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)以其它方式體內(nèi)基因修飾。用含有外源核酸物質(zhì)的載體體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染來(lái)自哺乳動(dòng)物受體的細(xì)胞，用于表達(dá)編碼治療劑的異源（例如，重組）基因，并原位遞送所述治療劑。如本文所用，“外源核酸物質(zhì)”指代這樣的天然或合成的核酸或寡核苷酸，其并非天然存在與細(xì)胞中；或如果其天然存在于細(xì)胞中，則在其原始或天然形式上經(jīng)過(guò)修飾。因此，“外源核酸物質(zhì)”包括，例如，可以被轉(zhuǎn)錄成反義rna、sirna的非天然存在的核酸以及“異源基因”（即，編碼在同一類型的天然存在的細(xì)胞中不表達(dá)或以生物學(xué)上不顯著的水平表達(dá)的蛋白質(zhì)的基因）。譬如，相對(duì)于人腹膜間皮細(xì)胞，編碼人促紅細(xì)胞生成素(epo)的合成或天然基因?qū)⒈灰暈椤巴庠春怂嵛镔|(zhì)”，因?yàn)樵摷?xì)胞不天然表達(dá)epo。“外源核酸物質(zhì)”的仍另一個(gè)實(shí)例是僅引入基因的一部分以生成重組基因，如經(jīng)由同源重組將可調(diào)控啟動(dòng)子與內(nèi)源編碼序列結(jié)合。適合基因抑制療法的狀況可能是預(yù)防方法，即，用于預(yù)防疾病或不期望的醫(yī)療狀況的方法。因此，本發(fā)明包括用于遞送sirna的系統(tǒng)，其對(duì)哺乳動(dòng)物受體具有預(yù)防功能（即，預(yù)防劑）。用于將本發(fā)明的表達(dá)盒引入細(xì)胞中的方法可以通過(guò)基因轉(zhuǎn)移方法（如轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)）將抑制性核酸物質(zhì)（例如，編碼針對(duì)目標(biāo)基因的sirna的表達(dá)盒）離體或體內(nèi)引入細(xì)胞中，以提供基因修飾的細(xì)胞。各種表達(dá)載體（即，有助于將外源核酸遞送至靶細(xì)胞中的媒介物）是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。如本文所用，“細(xì)胞轉(zhuǎn)染”指代細(xì)胞通過(guò)并入所添加的dna而獲得新的核酸物質(zhì)。因此，轉(zhuǎn)染指代使用物理或化學(xué)方法將核酸插入到細(xì)胞中。若干轉(zhuǎn)染技術(shù)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的，包括：磷酸鈣dna共沉淀、deae-葡聚糖、電穿孔、陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、鎢粒子促進(jìn)的微粒轟擊以及磷酸鍶dna共沉淀。相比之下，“細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)”指代使用dna或rna病毒將核酸轉(zhuǎn)移至細(xì)胞中的方法。用于將核酸轉(zhuǎn)移至細(xì)胞中的rna病毒（即，逆轉(zhuǎn)錄病毒）在本文中指代轉(zhuǎn)導(dǎo)嵌合逆轉(zhuǎn)錄病毒。包含在逆轉(zhuǎn)錄病毒內(nèi)的外源核酸物質(zhì)被整合到轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的基因組中。已經(jīng)用嵌合dna病毒（例如，攜帶編碼治療劑的cdna的腺病毒）轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞將不會(huì)把該外源核酸物質(zhì)整合到其基因組中但將能夠表達(dá)該外源核酸物質(zhì)，所述外源核酸物質(zhì)以染色體外的形式保留在細(xì)胞內(nèi)。所述外源核酸物質(zhì)可以包含編碼sirna的核酸連同控制轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。所述啟動(dòng)子的特征在于具有啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄所必需的特定核苷酸序列。所述外源核酸物質(zhì)還可包含獲得所需基因轉(zhuǎn)錄活性所要求的另外的序列（即，增強(qiáng)子）。對(duì)于本討論的目的而言，“增強(qiáng)子”只是任何非翻譯dna序列，其與編碼序列一同作用（順式）以改變由啟動(dòng)子決定的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄水平。所述外源核酸物質(zhì)可被引入到細(xì)胞基因組中緊接著啟動(dòng)子的下游，使得啟動(dòng)子與編碼序列可操作地連接從而允許編碼序列的轉(zhuǎn)錄。表達(dá)載體可以包含外源啟動(dòng)子元件以控制所插入外源基因的轉(zhuǎn)錄。此類外源啟動(dòng)子既包括組成型啟動(dòng)子也包括可調(diào)控啟動(dòng)子。天然存在的組成型啟動(dòng)子控制基本細(xì)胞功能的表達(dá)。因此，處于組成型啟動(dòng)子控制之下的核酸序列在所有細(xì)胞生長(zhǎng)條件下均表達(dá)。組成型啟動(dòng)子包括下列基因（其編碼某些組成型或“持家”功能）的啟動(dòng)子：次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(hprt)、二氫葉酸還原酶(dhfr)、腺苷脫氨酶、磷酸甘油激酶(pgk)、丙酮酸激酶、磷酸甘油變位酶，β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它組成型啟動(dòng)子。另外，許多病毒啟動(dòng)子在真核細(xì)胞中組成性地起作用。這些包括：sv40的早期和晚期啟動(dòng)子；莫洛尼白血病病毒及其它逆轉(zhuǎn)錄病毒的長(zhǎng)末端重復(fù)序列(ltr)；和單純皰疹病毒的胸苷激酶啟動(dòng)子，以及許多其它啟動(dòng)子。處于可調(diào)控啟動(dòng)子控制之下的核酸序列僅在存在誘導(dǎo)劑或抑制劑的情況下表達(dá)或以更高或更低程度表達(dá)（例如，金屬硫蛋白啟動(dòng)子控制下的轉(zhuǎn)錄在存在某些金屬離子的情況下大幅提高）。可調(diào)控啟動(dòng)子包括當(dāng)其誘導(dǎo)因子結(jié)合時(shí)刺激轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)元件(re)。例如，存在針對(duì)下列物質(zhì)的re：血清因子、類固醇激素、視黃酸、環(huán)腺苷酸（camp）和四環(huán)素以及多西環(huán)素?？梢赃x擇含有特定re的啟動(dòng)子以獲得可調(diào)控的反應(yīng)，并且在一些情況下，所述re本身可被附接至不同的啟動(dòng)子，從而給所編碼的核酸序列賦予可調(diào)控性。因此，通過(guò)選擇適當(dāng)?shù)膯?dòng)子（組成型對(duì)可調(diào)控；強(qiáng)對(duì)弱），有可能控制核酸序列在基因修飾細(xì)胞中的存在和表達(dá)水平。如果核酸序列處于可調(diào)控啟動(dòng)子的控制下，則通過(guò)將基因修飾的細(xì)胞原位暴露于允許該核酸序列轉(zhuǎn)錄的條件以觸發(fā)治療劑的原位遞送，例如，通過(guò)腹腔內(nèi)注射控制所述試劑轉(zhuǎn)錄的所述可調(diào)控啟動(dòng)子的特定誘導(dǎo)物。例如，在基因修飾的細(xì)胞中處于金屬硫蛋白啟動(dòng)子控制下的核酸序列的原位表達(dá)通過(guò)將所述基因修飾的細(xì)胞與含有適當(dāng)（即，誘導(dǎo)）金屬離子的溶液原位接觸而增強(qiáng)。因此，原位生成的sirna的量通過(guò)控制諸如以下的因素來(lái)調(diào)控：用于指導(dǎo)核酸序列轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子的性質(zhì)（即，該啟動(dòng)子是組成型還是可調(diào)控的、是強(qiáng)還是弱）以及細(xì)胞中編碼sirna序列的外源核酸序列的拷貝數(shù)。除了至少一個(gè)啟動(dòng)子和至少一個(gè)編碼sirna的異源核酸序列之外，表達(dá)載體可包含選擇基因，例如，新霉素抗性基因，以有助于選擇已經(jīng)用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。還可以用兩種或多種表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，至少一種載體含有編碼sirna的核酸序列，另一種載體含有選擇基因。選擇合適的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、選擇基因和/或信號(hào)序列被視為在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)而無(wú)需過(guò)度實(shí)驗(yàn)。以下討論涉及本發(fā)明的各種實(shí)用價(jià)值。例如，本發(fā)明作為適用于沉默目標(biāo)基因表達(dá)的表達(dá)系統(tǒng)而具有實(shí)用性。本發(fā)明還提供了用于體內(nèi)基因修飾哺乳動(dòng)物受體的細(xì)胞的方法。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，所述方法包括引入用于在所述哺乳動(dòng)物受體的細(xì)胞中原位表達(dá)sirna序列的表達(dá)載體，通過(guò)，例如，將所述載體注射到所述受體內(nèi)。本發(fā)明的表達(dá)盒的遞送媒介物將化合物遞送到組織中并穿過(guò)血腦屏障可受限于所述化合物的大小和生物化學(xué)性質(zhì)。目前，只有當(dāng)分子較?。ㄍǔＰ∮?00道爾頓）時(shí)，才可以將化合物有效體內(nèi)遞送到細(xì)胞中。已經(jīng)使用重組腺病毒載體完成了基因轉(zhuǎn)移，所述基因轉(zhuǎn)移是用于矯正先天性代謝缺陷和中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)的神經(jīng)退行性疾病，以及用于治療癌癥。選擇和優(yōu)化用于在細(xì)胞中表達(dá)特定sirna的特定表達(dá)載體可以通過(guò)如下實(shí)現(xiàn)：獲得該sirna的核酸序列，有可能的話，連同一個(gè)或多個(gè)適當(dāng)?shù)目刂茀^(qū)（例如，啟動(dòng)子、插入序列）；制備包含載體的載體構(gòu)建體，所述載體中插入了編碼所述sirna的核酸序列；用所述載體構(gòu)建體體外轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞；并且確定所述sirna是否存在于所培養(yǎng)的細(xì)胞中。用于細(xì)胞基因療法的載體包括病毒，如復(fù)制缺陷型病毒（詳述于下）。示例性病毒載體來(lái)源于哈維肉瘤病毒、勞氏肉瘤病毒、（mpsv）、莫洛尼小鼠白血病病毒和dna病毒（例如，腺病毒）。復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒能夠指導(dǎo)所有病毒粒子蛋白質(zhì)的合成，但不能制造感染性顆粒。因此，這些基因上改變的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體對(duì)于核酸序列在培養(yǎng)細(xì)胞中的高效轉(zhuǎn)導(dǎo)具有一般實(shí)用性，而對(duì)于用在本發(fā)明的方法中具有特別實(shí)用性。此類逆轉(zhuǎn)錄病毒還對(duì)于將核酸序列有效體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞中具有實(shí)用性。逆轉(zhuǎn)錄病毒已經(jīng)被廣泛用于將核酸物質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞中。用于生產(chǎn)復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒的方案（包括以下步驟：將外源核酸物質(zhì)并入質(zhì)粒中，用所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞系，由所述包裝細(xì)胞系生產(chǎn)重組逆轉(zhuǎn)錄病毒，從組織培養(yǎng)液中收集病毒顆粒，以及用所述病毒顆粒感染靶細(xì)胞）是本領(lǐng)域眾所周知的。將逆轉(zhuǎn)錄病毒用于基因療法的優(yōu)點(diǎn)在于：病毒將編碼sirna的核酸序列插入到宿主細(xì)胞基因組中，從而允許編碼sirna的核酸序列在細(xì)胞分裂時(shí)被傳遞給該細(xì)胞的子代。ltr區(qū)內(nèi)的啟動(dòng)子序列可以在各種細(xì)胞類型中增強(qiáng)所插入編碼序列的表達(dá)。使用逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體的一些缺點(diǎn)在于：(1)插入誘變，即，將編碼sirna的核酸序列插入到靶細(xì)胞基因組中不期望的位置，其例如導(dǎo)致不受調(diào)控的細(xì)胞生長(zhǎng)；以及(2)需要靶細(xì)胞增殖以使得載體攜帶的編碼sirna的核酸序列被整合到靶基因組中。可用作表達(dá)載體以轉(zhuǎn)化細(xì)胞的另一病毒候選是腺病毒，一種雙鏈dna病毒。腺病毒可感染廣泛的細(xì)胞類型，包括，例如，肌肉細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。腺病毒(ad)是雙鏈線性dna病毒，其基因組為36kb。腺病毒的若干特征已使其可用作轉(zhuǎn)基因遞送媒介物，用于治療應(yīng)用，如促進(jìn)體內(nèi)基因遞送。已經(jīng)證明，重組腺病毒載體能夠有效原位基因轉(zhuǎn)移至各種器官（包括肺、腦、胰腺、膽囊和肝）的實(shí)質(zhì)細(xì)胞。這已允許在用于治療遺傳的基因疾?。ㄈ缒倚岳w維化）的方法中使用這些載體，其中載體可被遞送至靶器官。另外，腺病毒載體實(shí)現(xiàn)原位腫瘤轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力已經(jīng)允許開發(fā)出針對(duì)非播散性疾病的各種抗癌基因治療方法。在這些方法中，載體控制有利于腫瘤細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)導(dǎo)。類似于逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒基因組適于用作基因療法的表達(dá)載體，即，通過(guò)移除控制病毒自身生產(chǎn)的基因信息。因?yàn)橄俨《疽匀旧w外的方式起作用，所以重組腺病毒理論上沒(méi)有插入誘變的問(wèn)題。在傳統(tǒng)上已經(jīng)使用了若干種方法生成重組腺病毒。一種方法涉及將含有目標(biāo)核酸序列的限制性核酸內(nèi)切酶片段直接連接至腺病毒基因組的部分。作為另外一種選擇，可通過(guò)同源重組結(jié)果將目標(biāo)核酸序列插入缺陷型腺病毒中。通過(guò)篩選在互補(bǔ)細(xì)胞的菌苔上生成的單獨(dú)菌斑而識(shí)別出所需重組。大多數(shù)腺病毒載體是基于5型腺病毒(ad5)的骨架，其中含有目標(biāo)核酸序列的表達(dá)盒已經(jīng)被引入以替代早期區(qū)1(e1)或早期區(qū)3(e3)。其中e1已缺失的病毒具有復(fù)制缺陷，并且在人互補(bǔ)細(xì)胞(例如，293或911細(xì)胞)中傳播，所述人互補(bǔ)細(xì)胞以反式提供了缺失的基因e1和pix。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將希望在腦細(xì)胞或腦組織中生成sirna。適用于本申請(qǐng)的載體是fiv載體或aav載體。例如，可使用aav5。也可應(yīng)用脊髓灰質(zhì)炎病毒或hsv載體。通常通過(guò)轉(zhuǎn)染合成的sirna、體外合成的rna或表達(dá)shrna或mirna的質(zhì)粒來(lái)實(shí)現(xiàn)sirna的應(yīng)用。近來(lái)，病毒已經(jīng)被用于體外研究并用于生成轉(zhuǎn)基因小鼠的靶基因下調(diào)。重組腺病毒、腺相關(guān)病毒(aav)和貓免疫缺陷病毒(fiv)可以被用于體外和體內(nèi)遞送基因。各有各的優(yōu)缺點(diǎn)。腺病毒是具有大基因組(36kb)的雙鏈dna病毒，并且已經(jīng)由本人和其它的實(shí)驗(yàn)室工程改造以在不同區(qū)域包含表達(dá)盒。腺相關(guān)病毒具有包被的基因組，類似于ad，但尺寸和包裝容量更?。▇30nm對(duì)~100nm；包裝極限~4.5kb）。aav含有+或-鏈的單鏈dna基因組。已經(jīng)充分研究了aav的八種血清型(1-8)，其中三種已經(jīng)在腦中進(jìn)行了評(píng)價(jià)。本申請(qǐng)的一個(gè)重要考量是aav5轉(zhuǎn)導(dǎo)紋狀體和皮質(zhì)神經(jīng)元，并且不與任何已知病理相關(guān)。腺相關(guān)病毒(aav)是細(xì)小病毒科的小型非致病性病毒。aav不同于此科的其它成員，因?yàn)槠鋸?fù)制依賴于輔助病毒。在不存在輔助病毒的情況下，aav可以基因座特異性方式整合到染色體19的q-臂中。aav的大約5kb的基因組由正或負(fù)極性的單鏈dna的一個(gè)節(jié)段組成?；蚪M的端部是短的末端反向重復(fù)序列，其可以折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)并充當(dāng)病毒dna復(fù)制的起點(diǎn)。在物理上，細(xì)小病毒病毒粒子是無(wú)包膜的并且其二十面體衣殼的直徑為大約20nm。本發(fā)明還提供了嵌合病毒，其中aav可以與皰疹病毒、皰疹病毒擴(kuò)增子、桿狀病毒或其它病毒結(jié)合以實(shí)現(xiàn)與另一種病毒相關(guān)的所需嗜性。例如，可將aav4itr插入皰疹病毒中并可感染細(xì)胞。感染后，在系統(tǒng)中或單獨(dú)媒介物中提供的aav4rep可作用于aav4的itr以從基因組中拯救aav4。因此，單純皰疹病毒的細(xì)胞嗜性可以與aav4rep介導(dǎo)的靶向整合相結(jié)合?？梢杂糜跇?gòu)建嵌合病毒的其它病毒包括：慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和腺病毒載體。本發(fā)明還提供了變體aav載體。例如，可以在單個(gè)核苷酸水平修飾天然aav（如aav5）的序列。本發(fā)明包括天然和突變型aav載體。本發(fā)明還包括所有的aav血清型。fiv是在人類中具有強(qiáng)安全概況的有包膜病毒；被fiv感染的貓咬傷或抓傷的個(gè)體不會(huì)血清轉(zhuǎn)化并且尚未報(bào)道表現(xiàn)出任何病征。類似于aav，fiv在小鼠和非人靈長(zhǎng)類的神經(jīng)元中提供持續(xù)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，并且轉(zhuǎn)導(dǎo)可以通過(guò)假型化（將病毒的天然包膜替換成另一種病毒的包膜的方法）而指向不同的細(xì)胞類型。因此，正如對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將是顯而易見(jiàn)的，多種合適的病毒表達(dá)載體可用于將外源核酸物質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中。選擇適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體以表達(dá)針對(duì)適于基因沉默療法的特定狀況的治療劑并且優(yōu)化將所選表達(dá)載體插入細(xì)胞中的條件，是在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)而無(wú)需過(guò)度實(shí)驗(yàn)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體是質(zhì)粒的形式，其通過(guò)下列各種方法之一被轉(zhuǎn)移至靶細(xì)胞中：物理的（例如，微注射、電穿孔、劃痕負(fù)載、微粒轟擊）或作為化學(xué)復(fù)合物（例如，鈣或鍶共沉淀、與脂質(zhì)復(fù)合、與配體復(fù)合）由細(xì)胞吸收。若干商業(yè)產(chǎn)品可用于陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合，包括lipofectin?(gibco-brl,gaithersburg,md.)和transfectam?(promega?,madison,wis.)。然而，這些方法的轉(zhuǎn)染效率高度依賴于靶細(xì)胞的性質(zhì)，并因此，使用本文提及的程序?qū)⒑怂徂D(zhuǎn)染到細(xì)胞中的最佳條件必須經(jīng)過(guò)優(yōu)化。此類優(yōu)化是在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)而無(wú)需過(guò)度實(shí)驗(yàn)。腺相關(guān)病毒(aav)腺相關(guān)病毒(aav)是細(xì)小病毒科的小型非致病性病毒。aav不同于此科的其它成員，因?yàn)槠鋸?fù)制依賴于輔助病毒。在不存在輔助病毒的情況下，aav可以基因座特異性方式整合到染色體19的q臂中。aav的大約5kb的基因組由正或負(fù)極性的單鏈dna的一個(gè)節(jié)段組成?；蚪M的端部是短的末端反向重復(fù)序列，其可以折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)并充當(dāng)病毒dna復(fù)制的起點(diǎn)。在物理上，細(xì)小病毒病毒粒子是無(wú)包膜的并且其二十面體衣殼的直徑為大約20nm。迄今為止，已經(jīng)識(shí)別出許多血清學(xué)上不同的aav，并且超過(guò)一打已經(jīng)從人類或靈長(zhǎng)類中被分離出。aav2的基因組長(zhǎng)4680個(gè)核苷酸并且含有兩個(gè)開放閱讀框(orf)。左邊的orf編碼非結(jié)構(gòu)rep蛋白：rep40、rep52、rep68和rep78，其除了生產(chǎn)單鏈子代基因組之外還涉及調(diào)控復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。此外，這些rep蛋白中的兩種已經(jīng)與aav基因組被優(yōu)先整合到人類染色體19的q臂的區(qū)中相關(guān)聯(lián)。還已證明，rep68/78具有ntp結(jié)合活性以及dna和rna解旋酶活性。rep蛋白具有核定位信號(hào)以及若干潛在的磷酸化位點(diǎn)。這些激酶位點(diǎn)之一的突變導(dǎo)致復(fù)制活性的喪失?；蚪M的端部是短的末端反向重復(fù)序列(itr)，其有可能折疊成t形發(fā)夾結(jié)構(gòu)而充當(dāng)病毒dna復(fù)制的起點(diǎn)。在itr區(qū)內(nèi)，已經(jīng)描述了對(duì)itr功能至關(guān)重要的兩種元件：gagc重復(fù)基序和末端拆分位點(diǎn)(trs)。已經(jīng)證明，當(dāng)itr處于線性或發(fā)夾構(gòu)象時(shí)，重復(fù)基序結(jié)合rep。這種結(jié)合起到定位rep68/78的作用，用于在trs的裂解，該裂解以位點(diǎn)和鏈特異性方式進(jìn)行。除了其在復(fù)制中的作用，這兩種元件似乎也是病毒整合的關(guān)鍵。包含在染色體19內(nèi)的整合基因座是rep結(jié)合位點(diǎn)連同相鄰的trs。已經(jīng)證明，這些元件是功能性的并且是基因座特異性整合所必需的。aav病毒粒子是無(wú)包膜的、直徑約25nm的二十面體顆粒，由被稱為vp1、vp2和vp3的三種相關(guān)蛋白質(zhì)組成。右邊的orf編碼衣殼蛋白vp1、vp2和vp3。這些蛋白質(zhì)分別以1:1:10的比率存在，并且均來(lái)源于右手邊的orf。衣殼蛋白的彼此不同之處在于：使用選擇性剪接和不尋常的起始密碼子。缺失分析已經(jīng)表明，移除或改變從選擇性剪接的信息翻譯而來(lái)的vp1，導(dǎo)致感染顆粒的產(chǎn)率降低。vp3編碼區(qū)內(nèi)的突變導(dǎo)致無(wú)法產(chǎn)生任何單鏈子代dna或感染顆粒。aav顆粒是包含aav衣殼蛋白的病毒顆粒。aav衣殼多肽可以編碼整個(gè)vp1、vp2和vp3多肽。所述顆粒可以是包含aav2和其它aav衣殼蛋白(即，嵌合蛋白，如aav1和aav2)的顆粒。本文設(shè)想了aav2衣殼蛋白的氨基酸序列的變型形式，只要所得到的包含aav2衣殼的病毒顆粒保持在抗原或免疫學(xué)上不同于aav1，正如可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法常規(guī)測(cè)定的。具體地講，例如，elisa和western印跡可以用于測(cè)定病毒顆粒是否在抗原或免疫學(xué)上不同于aav1。此外，aav2病毒顆粒優(yōu)選地保持不同于aav1的組織嗜性。aav2顆粒是包含aav2衣殼蛋白的病毒顆粒。編碼整個(gè)vp1、vp2和vp3多肽的aav2衣殼多肽可以與具有由nc_001401中所示的核苷酸(編碼aav2衣殼蛋白的核苷酸序列)編碼的氨基酸序列的多肽在總體上具有至少約63%的同源性(或同一性)。衣殼蛋白可以與由nc_001401中所示的核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)具有約70%同源性、約75%同源性、80%同源性、85%同源性、90%同源性、95%同源性、98%同源性、99%同源性或甚至100%同源性。衣殼蛋白可以與由nc_001401中所示的核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)具有約70%同一性、約75%同一性、80%同一性、85%同一性、90%同一性、95%同一性、98%同一性、99%同一性或甚至100%同一性。所述顆?？梢允前硪环Naav和aav2衣殼蛋白（即，嵌合蛋白）的顆粒。本文設(shè)想了aav2衣殼蛋白的氨基酸序列的變型形式，只要所得到的包含aav2衣殼的病毒顆粒保持在抗原或免疫學(xué)上不同于aav4，正如可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法常規(guī)測(cè)定的。具體地講，例如，elisa和western印跡可以用于測(cè)定病毒顆粒是否在抗原或免疫學(xué)上不同于aav1。此外，aav2病毒顆粒優(yōu)選地保持不同于aav1的組織嗜性，正如本文實(shí)例中所示例的，然而包含至少一種aav2外殼蛋白的aav2嵌合顆粒可具有不同于僅由aav2外殼蛋白組成的aav2顆粒的組織嗜性。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了aav2顆粒，其含有（即，包被）包含一對(duì)aav2末端反向重復(fù)序列的載體。aav2itr的核苷酸序列是本領(lǐng)域已知的。此外，所述顆?？梢允峭瑫r(shí)包含aav1和aav2衣殼蛋白（即，嵌合蛋白）的顆粒。此外，所述顆粒可以是包被載體的顆粒，所述載體包含一對(duì)來(lái)自其它aav（例如，aav1-aav9以及aavrh10）的aav末端反向重復(fù)序列。所述包被在顆粒中的載體還可以包含被插入到所述末端反向重復(fù)序列之間的外源核酸。aav的下列特征已使其成為用于基因轉(zhuǎn)移的有吸引力的載體。已經(jīng)體外證明，aav載體穩(wěn)定整合到細(xì)胞基因組中；具有寬廣的宿主范圍；體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂中和非分裂中的細(xì)胞并且維持轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的高水平表達(dá)。病毒顆粒是熱穩(wěn)定的，對(duì)溶劑、去垢劑、ph變化、溫度具有抗性，并且可以在cscl梯度上或通過(guò)其它方式濃縮。本發(fā)明提供了施用aav顆粒、重組aav載體和重組aav病毒粒子的方法。例如，aav2顆粒是包含aav2衣殼蛋白的病毒顆粒，或aav1顆粒是包含aav1衣殼蛋白的病毒顆粒。重組aav2載體是核酸構(gòu)建體，其包含至少一種獨(dú)特的aav2核酸。重組aav2病毒粒子是含有重組aav載體的顆粒。要想被納入術(shù)語(yǔ)“aav2itr”的范疇，核苷酸序列必須保持本文所述的區(qū)別aav2itr與aav1itr的特征或之一：(1)三個(gè)(而非aav1中的四個(gè))"gagc"重復(fù)序列以及(2)在aav2itrrep結(jié)合位點(diǎn)，頭兩個(gè)"gagc"重復(fù)序列中的第四個(gè)核苷酸是c而非t。驅(qū)動(dòng)所述蛋白質(zhì)或編碼另一種待遞送試劑的序列的表達(dá)的啟動(dòng)子可以是任何所需啟動(dòng)子，其通過(guò)已知考量進(jìn)行選擇，如功能連接至所述啟動(dòng)子的核酸的表達(dá)水平以及載體將要被用于的細(xì)胞類型。啟動(dòng)子可以是外源或內(nèi)源啟動(dòng)子。啟動(dòng)子可以包括，例如，已知的強(qiáng)啟動(dòng)子如sv40或誘導(dǎo)型金屬硫蛋白啟動(dòng)子，或aav啟動(dòng)子如aavp5啟動(dòng)子。啟動(dòng)子的另外的實(shí)例包括來(lái)源于以下的啟動(dòng)子：肌動(dòng)蛋白基因、免疫球蛋白基因、細(xì)胞巨化病毒(cmv)、腺病毒、牛乳頭狀瘤病毒、腺病毒啟動(dòng)子如腺病毒主要晚期啟動(dòng)子（一種誘導(dǎo)型熱休克啟動(dòng)子）、呼吸道合胞病毒、勞氏肉瘤病毒(rsv)等。另外的實(shí)例包括受調(diào)控的啟動(dòng)子。aav載體還可以包含功能連接至啟動(dòng)子的外源(異源)核酸。所謂“異源核酸”是指任何異源或外源核酸，其可以被插入到載體中用于轉(zhuǎn)移到細(xì)胞、組織或生物體中。所述核酸可以編碼例如多肽或蛋白質(zhì)或反義rna。所謂“功能連接”是指使得啟動(dòng)子可以促進(jìn)所述異源核酸的表達(dá)，正如本領(lǐng)域已知的，如啟動(dòng)子相對(duì)于所述異源核酸適當(dāng)定位。此外，異源核酸優(yōu)選地具有如本領(lǐng)域已知的用于核酸表達(dá)的所有適當(dāng)序列，以功能性編碼，即，允許核酸被表達(dá)。所述核酸可以包含，例如，表達(dá)控制序列（如增強(qiáng)子）和必要的信息加工位點(diǎn)（如核糖體結(jié)合位點(diǎn)、rna剪接位點(diǎn)、多腺苷酸化位點(diǎn)）以及轉(zhuǎn)錄終止序列。所述核酸可以編碼不止一種基因產(chǎn)物，僅受限于可以被包裝的核酸的大小。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，所述異源核酸可以編碼有益蛋白，其取代載體所轉(zhuǎn)移進(jìn)入的個(gè)體所需的缺失或缺陷蛋白，如rheb或rhes。aav1顆粒是包含aav1衣殼蛋白的病毒顆粒。本文設(shè)想了aav1衣殼蛋白的氨基酸序列的變型形式，只要所得到的包含aav1衣殼的病毒顆粒保持在抗原或免疫學(xué)上不同于其它aav衣殼，正如可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法常規(guī)測(cè)定的。具體地講，例如，elisa和western印跡可以用于測(cè)定病毒顆粒是否在抗原或免疫學(xué)上不同于其它aav血清型。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“多肽”指代氨基酸聚合物并且包括全長(zhǎng)蛋白質(zhì)及其片段。因此，“蛋白質(zhì)”和“多肽”在本文中通?？苫Q使用?？梢酝ㄟ^(guò)已知參數(shù)選擇中性置換。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到的，本發(fā)明還包括在氨基酸序列或其它性質(zhì)上具有些微變化的那些多肽。此類變化可以等位基因變化的形式自然產(chǎn)生（例如，由于基因多態(tài)性）或可通過(guò)人為干預(yù)產(chǎn)生（例如，通過(guò)誘變克隆的dna序列），如經(jīng)誘導(dǎo)的點(diǎn)、缺失、插入和置換突變體。通常優(yōu)選的是氨基酸序列中的微小變化，如保守氨基酸替換、小的內(nèi)部缺失或插入、以及分子端部的添加或缺失。這些修飾可以導(dǎo)致氨基酸序列變化、提供沉默突變、修飾限制性位點(diǎn)或提供其它特定突變。本發(fā)明提供了將核酸遞送至細(xì)胞的方法，其包括：向所述細(xì)胞施用含有載體的aav顆粒，所述載體包含插入到一對(duì)aav末端反向重復(fù)序列之間的核酸，從而將所述核酸遞送至所述細(xì)胞。向所述細(xì)胞的施用可以通過(guò)任何方式實(shí)現(xiàn)，包括簡(jiǎn)單地使顆粒與所述細(xì)胞接觸，所述顆粒任選地被包含在所需液體（如組織培養(yǎng)液或緩沖鹽溶液）中。可以允許所述顆粒保持與所述細(xì)胞接觸任意所需長(zhǎng)度的時(shí)間，并且通常施用并允許所述顆粒無(wú)限期保持。對(duì)于此類體外方法，可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)方法向細(xì)胞施用病毒，如本領(lǐng)域已知并且如本文所例示的。施用的病毒效價(jià)可以變化，具體取決于細(xì)胞類型，但通常將是一般用于aav轉(zhuǎn)導(dǎo)的那類型。另外，可以使用用于轉(zhuǎn)導(dǎo)本發(fā)明的實(shí)例中的特定細(xì)胞的效價(jià)。所述細(xì)胞可以包括人類以及其它大型（非嚙齒類）哺乳動(dòng)物（如靈長(zhǎng)類、馬、綿羊、山羊、豬和狗）中的任何所需細(xì)胞。更具體地講，本發(fā)明提供了將核酸遞送至腦部細(xì)胞（特別是中型多棘神經(jīng)元）的方法，其包括：插入到一對(duì)aav末端反向重復(fù)序列之間的核酸，從而將所述核酸遞送至所述細(xì)胞。本發(fā)明還提供了將核酸遞送至個(gè)體內(nèi)細(xì)胞的方法，其包括：向所述個(gè)體施用aav顆粒，所述aav顆粒包含插入到一對(duì)aav末端反向重復(fù)序列之間的核酸，從而將所述核酸遞送至所述個(gè)體內(nèi)的細(xì)胞。還提供了將核酸遞送至腦細(xì)胞（如個(gè)體的紋狀體或皮質(zhì)中的神經(jīng)元）的方法，其包括：向所述個(gè)體施用aav顆粒，所述aav顆粒包含插入到一對(duì)aav末端反向重復(fù)序列之間的核酸，從而將所述核酸遞送至所述神經(jīng)元或所述個(gè)體內(nèi)的其它細(xì)胞。本公開的某些實(shí)施方案提供了細(xì)胞，其包含如本文所述的病毒載體。aav載體在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開的病毒載體是aav載體。“aav”載體指代腺相關(guān)病毒，并且可被用于指代天然存在的野生型病毒本身或其衍生物。該術(shù)語(yǔ)涵蓋了所有的亞型、血清型和假型，以及天然存在的和重組形式，除非其中另有要求。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“血清型”指代這樣的aav，其基于與限定的抗血清的衣殼蛋白反應(yīng)性而被識(shí)別并與其它aav區(qū)分，例如，存在八種已知的靈長(zhǎng)類aav血清型、aav-1至aav-9以及aavrh10。例如，血清型aav2被用于指代這樣的aav，其含有aav2的cap基因所編碼的衣殼蛋白和來(lái)自同一aav2血清型的含有5'和3’itr序列的基因組。如本文所用，例如，raav1可被用于指代同時(shí)具有來(lái)自同一血清型的衣殼蛋白和5'-3'itr的aav，或其可指代這樣的aav，其具有來(lái)自一種血清型的衣殼蛋白和來(lái)自不同aav血清型的5'-3'itr，例如，來(lái)自aav血清型2的衣殼蛋白和來(lái)自aav血清型5的itr。對(duì)于本文所示的每個(gè)實(shí)例，對(duì)載體設(shè)計(jì)和生產(chǎn)的說(shuō)明描述了衣殼和5'-3'itr序列的血清型?？s寫“raav”指代重組腺相關(guān)病毒，也被稱為重組aav載體（或“raav載體”）?！癮av病毒”或“aav病毒顆粒”指代由至少一種aav衣殼蛋白(優(yōu)選由野生型aav的所有衣殼蛋白)和包被的多核苷酸構(gòu)成的病毒顆粒。如果所述顆粒包含異源多核苷酸（即，不同于野生型aav基因組的多核苷酸，如待遞送至哺乳動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因），則其通常被稱為“raav”。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用已知技術(shù)構(gòu)建aav表達(dá)載體以至少在轉(zhuǎn)錄方向上操作性連接的組分的形式提供，控制元件包括轉(zhuǎn)錄起始區(qū)、目標(biāo)dna和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。所述控制元件被選為在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中起作用。所得的含有操作性連接組分的構(gòu)建體側(cè)接（5'和3’）功能性aavitr序列。所謂“腺相關(guān)病毒末端反向重復(fù)序列”或“aavitr”是指存在于aav基因組的各端部的本領(lǐng)域公認(rèn)的區(qū)，其作為dna復(fù)制起點(diǎn)并作為病毒的包裝信號(hào)共同順式作用。aavitr，連同aavrep編碼序列，提供了有效的剪切和拯救以及將置于兩個(gè)側(cè)翼itr之間的核苷酸序列整合至哺乳動(dòng)物基因組中。aavitr區(qū)的核苷酸序列是已知的。如本文所用，“aavitr”不必具有所述野生型核苷酸序列，但可例如通過(guò)核苷酸的插入、缺失或置換而改變。另外，aavitr可來(lái)源于若干aav血清型中的任一種，包括但不限于：aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav7等。此外，在aav載體中側(cè)接選定核苷酸序列的5'和3'itr不必一定相同或來(lái)源于同一aav血清型或分離物，只要其發(fā)揮預(yù)期功能，即，當(dāng)細(xì)胞中存在aavrep基因產(chǎn)物時(shí)，允許從宿主細(xì)胞基因組或載體剪切和拯救目標(biāo)序列，并且允許將異源序列整合到受體細(xì)胞基因組中。在一個(gè)實(shí)施方案中，aavitr可來(lái)源于若干aav血清型中的任一種，包括但不限于：aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav7等。此外，在aav表達(dá)載體中側(cè)接選定核苷酸序列的5'和3'itr不必一定相同或來(lái)源于同一aav血清型或分離物，只要其發(fā)揮預(yù)期功能，即，當(dāng)細(xì)胞中存在aavrep基因產(chǎn)物時(shí)，允許從宿主細(xì)胞基因組或載體剪切和拯救目標(biāo)序列，并且允許將dna分子整合到受體細(xì)胞基因組中。在一個(gè)實(shí)施方案中，aav衣殼可以來(lái)源于aav2。適合用于aav載體中的dna分子將在尺寸上小于約5千堿基對(duì)(kb)、小于約4.5kb、小于約4kb、小于約3.5kb、小于約3kb、小于約2.5kb并且是本領(lǐng)域已知的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所選核苷酸序列被可操作地連接至在個(gè)體內(nèi)指導(dǎo)其體內(nèi)轉(zhuǎn)錄或表達(dá)的控制元件。此類控制元件可以包含通常與所選基因關(guān)聯(lián)的控制序列。作為另外一種選擇，可以采用異源控制序列?？捎玫漠愒纯刂菩蛄型ǔ０▉?lái)源于編碼哺乳動(dòng)物或病毒基因的序列的那些。實(shí)例包括但不限于：sv40早期啟動(dòng)子、小鼠乳腺腫瘤病毒ltr啟動(dòng)子；腺病毒主要晚期啟動(dòng)子(admlp)；單純皰疹病毒(hsv)啟動(dòng)子、細(xì)胞巨化病毒(cmv)啟動(dòng)子如cmv立即早期啟動(dòng)子區(qū)(cmvie)、勞氏肉瘤病毒(rsv)啟動(dòng)子、polii啟動(dòng)子、poliii啟動(dòng)子、合成啟動(dòng)子、雜交啟動(dòng)子等。另外，來(lái)源于非病毒基因（如小鼠金屬硫蛋白基因）的序列也將用于本文中。此類啟動(dòng)子序列可商購(gòu)自例如stratagene(sandiego,calif.)。在一個(gè)實(shí)施方案中，異源啟動(dòng)子和其它控制元件，如cns-特異性啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等，均將具有特定用途。異源啟動(dòng)子的實(shí)例包括cmv啟動(dòng)子。cns特異性啟動(dòng)子的實(shí)例包括分離自髓鞘堿性蛋白(mbp)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(gfap)和神經(jīng)元特異性烯醇化酶(nse)的基因的那些。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的實(shí)例包括針對(duì)蛻皮激素、四環(huán)素、缺氧和生長(zhǎng)素的dna反應(yīng)元件。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過(guò)將所選序列直接插入aav基因組中來(lái)構(gòu)建包含由aavitr結(jié)合的目標(biāo)dna分子的aav表達(dá)載體，所述aav基因組已經(jīng)切除了主要aav開放閱讀框（“orf”）。所述aav基因組的其它部分也可以缺失，只要保留足夠的itr部分以允許復(fù)制和包裝功能。此類構(gòu)建體可使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)設(shè)計(jì)。作為另外一種選擇，aavitr可以從病毒基因組中或從含有它的aav載體中被切除并使用標(biāo)準(zhǔn)連接技術(shù)而被融合至存在于另一載體中的所選核酸構(gòu)建體的5'和3'。例如，連接可以在以下中實(shí)現(xiàn)：20mmtris-clph7.5、10mmmgcl2、10mmdtt、33μg/mlbsa、10mm-50mmnacl、以及40umatp、0.01-0.02(weiss)單位t4dna連接酶于0°c(對(duì)于“粘端”連接)或1mmatp、0.3-0.6(weiss)單位t4dna連接酶于14°c(對(duì)于“平端”連接)。分子間“粘端”連接通常在30-100μg/ml的總dna濃度(5-100nm的總最終濃度)下進(jìn)行。含有itr的aav載體。另外，可以合成產(chǎn)生嵌合基因以在一個(gè)或多個(gè)所選核酸序列的5'和3'包含aavitr序列?？梢允褂迷诓溉閯?dòng)物cns細(xì)胞中表達(dá)嵌合基因序列的優(yōu)選密碼子。從通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法制備的重疊寡核苷酸裝配出完整的嵌合序列。為了生產(chǎn)raav病毒粒子，使用已知技術(shù)（如通過(guò)轉(zhuǎn)染）將aav表達(dá)載體引入到合適的宿主細(xì)胞中。許多轉(zhuǎn)染技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的。參見(jiàn)，例如，sambrook等人(1989)molecularcloning,alaboratorymanual,coldspringharborlaboratories,newyork。特別合適的轉(zhuǎn)染方法包括：磷酸鈣共沉淀、直接微注射入培養(yǎng)細(xì)胞中、電穿孔、脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)以及使用高速微粒的核酸遞送。在一個(gè)實(shí)施方案中，適用于生產(chǎn)raav病毒粒子的宿主細(xì)胞包括微生物、酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其可以或已經(jīng)被用作異源dna分子的受體。該術(shù)語(yǔ)包括已經(jīng)轉(zhuǎn)染的原始細(xì)胞的子代。因此，如本文所用的“宿主細(xì)胞”通常指代已經(jīng)用外源dna序列轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。來(lái)自穩(wěn)定人類細(xì)胞系293（可容易地從例如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心以登錄號(hào)atcccrl1573獲得）的細(xì)胞可以被用在本公開的實(shí)踐中。具體地講，人類細(xì)胞系293是已經(jīng)用5型腺病毒dna片段轉(zhuǎn)化的人胚腎細(xì)胞系，并表達(dá)腺病毒e1a和e1b基因。293細(xì)胞系易于轉(zhuǎn)染，并提供了特別便利的平臺(tái)以生產(chǎn)raav病毒粒子。所謂“aavrep編碼區(qū)”是指本領(lǐng)域公認(rèn)的aav基因組的區(qū)，其編碼復(fù)制蛋白rep78、rep68、rep52和rep40。已經(jīng)證明，這些rep表達(dá)產(chǎn)物具有許多功能，包括識(shí)別、結(jié)合并缺刻aav的dna復(fù)制起點(diǎn)、dna解旋酶活性以及調(diào)節(jié)來(lái)自aav（或其它異源）啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。復(fù)制aav基因組需要全體的rep表達(dá)產(chǎn)物。aavrep編碼區(qū)的合適的同源物包括人皰疹病毒6(hhv-6)rep基因，已知其還介導(dǎo)aav-2dna復(fù)制。所謂“aavcap編碼區(qū)”是指本領(lǐng)域公認(rèn)的aav基因組的區(qū)，其編碼衣殼蛋白vp1、vp2和vp3或其功能性同源物。這些cap表達(dá)產(chǎn)物提供了包裝功能，其整體是包裝病毒基因組所需的。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)在aav表達(dá)載體轉(zhuǎn)染之前或同時(shí)用aav輔助構(gòu)建體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞而將aav輔助功能引入宿主細(xì)胞中。aav輔助構(gòu)建體因此被用于提供aavrep和/或cap基因的至少瞬時(shí)表達(dá)以彌補(bǔ)缺失的生產(chǎn)性aav感染所必需的aav功能。aav輔助構(gòu)建體不含aavitr并且不可以自行復(fù)制或包裝。這些構(gòu)建體可以是質(zhì)粒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、粘粒、病毒或病毒粒子的形式。已經(jīng)描述了許多aav輔助構(gòu)建體，如常用的質(zhì)粒paav/ad和pim29+45，其同時(shí)編碼rep和cap表達(dá)產(chǎn)物。已經(jīng)描述了許多編碼rep和/或cap表達(dá)產(chǎn)物的其它載體。病毒載體的遞送方法包括將aav注射到個(gè)體中。通常，可使用體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)將raav病毒粒子引入到cns的細(xì)胞中。如果經(jīng)體外轉(zhuǎn)導(dǎo)，則所需的受體細(xì)胞將從個(gè)體中被移除，用raav病毒粒子轉(zhuǎn)導(dǎo)并被重新引入到該個(gè)體中。作為另外一種選擇，可以使用同種或異種細(xì)胞，其中這些細(xì)胞將不會(huì)在該個(gè)體中生成不恰當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答。已經(jīng)描述了合適的用于將經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞遞送和引入個(gè)體中的方法。例如，細(xì)胞可以通過(guò)如下進(jìn)行體外轉(zhuǎn)導(dǎo)：例如，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)液中將重組aav病毒粒子與cns細(xì)胞結(jié)合，并篩選那些攜帶目標(biāo)dna的細(xì)胞，可以使用常規(guī)技術(shù)如southern印跡和/或pcr或通過(guò)使用選擇標(biāo)志物進(jìn)行篩選。隨后可以將經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞配制成藥物組合物（詳述于下），并通過(guò)各種技術(shù)將所述組合物引入個(gè)體中，如通過(guò)移植、肌內(nèi)注射、靜脈內(nèi)注射、皮下注射和腹腔內(nèi)注射。在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物將包含足夠的遺傳物質(zhì)以產(chǎn)生治療有效量的目標(biāo)核酸，即，所述量足以減輕或改善所考慮的疾病狀態(tài)的癥狀或足以賦予所需的益處。所述藥物組合物還將含有藥學(xué)上可接受的賦形劑。此類賦形劑包括任何藥物試劑，其自身不會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生對(duì)接受該組合物的個(gè)體有害的抗體，并且其可被施用而無(wú)異常毒性。藥學(xué)上可接受的賦形劑包括但不限于：山梨糖醇、tween80以及液體如水、鹽水、甘油和乙醇。其中可以包括藥學(xué)上可接受的鹽，例如，礦物酸鹽如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽等；以及有機(jī)酸鹽如醋酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽、苯甲酸鹽等。另外，此類媒介物中可含有輔料，如潤(rùn)濕劑或乳化劑、ph緩沖劑等。有關(guān)藥學(xué)上可接受的賦形劑的全面討論可參見(jiàn)remington'spharmaceuticalsciences(mackpub.co.,n.j.1991)。應(yīng)當(dāng)理解，可以通過(guò)所遞送的病毒載體表達(dá)不止一個(gè)轉(zhuǎn)基因。作為另外一種選擇，各自表達(dá)一個(gè)或多個(gè)不同轉(zhuǎn)基因的單獨(dú)的載體也可以如本文所述被遞送至個(gè)體。此外，還預(yù)期將由本公開的方法遞送的病毒載體與其它合適的組合物和療法結(jié)合。正如根據(jù)本說(shuō)明書的教導(dǎo)而對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，必須添加的病毒載體的有效量可以憑經(jīng)驗(yàn)確定。可以在整個(gè)治療過(guò)程中連續(xù)地或間歇地以一個(gè)劑量施用。確定最有效的施用方式和劑量的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，并且將隨病毒載體、治療組成、靶細(xì)胞和接受治療的個(gè)體而變化?？梢圆捎糜芍髦吾t(yī)生選擇的劑量水平和模式進(jìn)行單次和多次施用。在某些實(shí)施方案中，raav以約0.3-2ml的1x105-1x1016vg/ml的劑量施用。在某些實(shí)施方案中，raav以約1-3ml的1x107-1x1014vg/ml的劑量施用。在某些實(shí)施方案中，raav以約1-2ml的1x108-1x1013vg/ml的劑量施用。含有raav顆粒的制劑將在媒介物中含有有效量的raav顆粒，所述有效量可由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。raav顆粒可通常占組合物的約1%至約95%(w/w)或甚至更高或更低（如果合適）。待施用的量取決于諸如考慮治療的動(dòng)物或人類個(gè)體的年齡、重量和身體狀況等因素。有效劑量可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過(guò)常規(guī)試驗(yàn)建立劑量反應(yīng)曲線而確立。通過(guò)施用一個(gè)或多個(gè)劑量的raav顆粒來(lái)治療個(gè)體?？砂葱枋┯枚鄠€(gè)劑量以維持充足的酶活性。本發(fā)明可以采用的媒介物包括：水、鹽水、人工csf或其它已知物質(zhì)。為了制備制劑，可以分離、凍干并穩(wěn)定經(jīng)純化的組合物。隨后可將組合物調(diào)整至合適的濃度，任選地與抗炎劑組合，并包裝備用。本發(fā)明提供了提高細(xì)胞中靶蛋白水平的方法，其通過(guò)將一定量的上述蛋白質(zhì)或編碼蛋白質(zhì)的核酸分子引入到細(xì)胞中而實(shí)現(xiàn)，所述量足以提高所述細(xì)胞中所述靶蛋白的水平。在某些實(shí)施方案中，靶蛋白的積聚被提高至少10%。靶蛋白的積聚被提高至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%。此外，可根據(jù)所需施用途徑（例如且不限于，用于全身施用）選擇/設(shè)計(jì)aav載體，可使用能夠穿過(guò)血腦屏障的aav載體（例如，aav9或含有aav9衣殼蛋白的嵌合aav載體）。本發(fā)明還提供了向血液中施用aav的方法，因?yàn)橐恍┭逍湍軌虼┻^(guò)血腦屏障。靶向肽已經(jīng)識(shí)別出這樣的肽，其起到將試劑如病毒載體靶向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用。本公開描述了使用這些新型肽以將例如病毒衣殼重定向至目標(biāo)細(xì)胞類型的方法。在這種情況下，識(shí)別出的肽靶向腦血管內(nèi)襯的內(nèi)皮細(xì)胞。經(jīng)修飾以包含此類肽的包含衣殼蛋白的載體可以被用于提供針對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)（例如，腦）的治療劑。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“靶向”意指病毒（如腺相關(guān)病毒（aav））的衣殼蛋白結(jié)合一種類型的組織（例如，腦組織）優(yōu)先于另一種類型的組織（例如，肝組織），并且/或者結(jié)合處于某種狀態(tài)下的組織（例如，野生型或病變的）。在某些實(shí)施方案中，基因修飾的衣殼蛋白可通過(guò)以高于可比較的未修飾的衣殼蛋白10%至1000%的水平結(jié)合而“靶向”腦血管上皮組織。例如，具有基因修飾的衣殼蛋白的aav可以大于未修飾的aav病毒50%至100%的水平結(jié)合腦血管上皮組織。在某些實(shí)施方案中，編碼病毒的衣殼蛋白的核酸經(jīng)過(guò)修飾使得所述病毒衣殼在患有溶酶體貯積癥的哺乳動(dòng)物中優(yōu)先結(jié)合腦血管內(nèi)皮細(xì)胞，或使用不同的序列，在同一物種的腦中優(yōu)先結(jié)合野生型腦血管內(nèi)皮細(xì)胞。本發(fā)明提供了含有靶向肽的經(jīng)修飾的腺相關(guān)病毒（aav）衣殼蛋白，其中所述靶向肽長(zhǎng)3至10個(gè)氨基酸，并且其中所述靶向肽將aav靶向至腦血管內(nèi)皮細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述靶向肽長(zhǎng)3、4、5、6或7個(gè)氨基酸。在某些實(shí)施方案中，所述aav是aav2，但嗜性按照以下原則經(jīng)過(guò)修飾：此類修飾將改變?nèi)魏蝍av的嗜性。本公開的某些實(shí)施方案提供了包含經(jīng)修飾的衣殼的病毒載體，其中所述經(jīng)修飾的衣殼包含將所述病毒載體靶向至腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的至少一個(gè)氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，所述病毒載體是腺相關(guān)病毒載體（aav）。在某些實(shí)施方案中，所述aav是aav2。在某些實(shí)施方案中，所述靶向肽靶向野生型腦血管內(nèi)皮細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述靶向肽是pxxps(seqidno:44)、spxxp(seqidno:45)、tlh(seqidno:46)或qsxy(seqidno:47)，按氨基至羧基取向或羧基至氨基取向表達(dá)。在某些實(shí)施方案中，所述靶向肽是pyfpsls(seqidno:48)、yapltps(seqidno:49)、plspsay(seqidno:50)、dspahps(seqidno:51)、gtpthps(seqidno:52)、pdapsnh(seqidno:53)、tephwps(seqidno:54)、spplppk(seqidno:55)、spkpppg(seqidno:56)、nwspwdp(seqidno:57)、dspahps(seqidno:58)、gwtlhnk(seqidno:59)、kipptlh(seqidno:60)、isqtlhg(seqidno:61)、qsfyilt(seqidno:62)或ttqseyg(seqidno:63)，按氨基至羧基取向或羧基至氨基取向表達(dá)。應(yīng)當(dāng)指出的是，序列的取向并不重要。例如，所述肽按所述肽的氨基末端至羧基末端取向可能是ttqseyg(seqidno:63)或按所述肽的氨基末端至羧基末端取向可能是gyesqtt(seqidno:65)。在某些實(shí)施方案中，所述靶向肽靶向病變的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述靶向肽靶向患有溶酶體貯積癥的個(gè)體的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述靶向肽靶向粘多糖(mps)vii腦血管內(nèi)皮細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述靶向肽是lxss(seqidno:66)、pfxg(seqidno:67)或sixa(seqidno:68)，按氨基至羧基取向或羧基至氨基取向表達(dá)。在某些實(shí)施方案中，所述靶向肽是mlvsspa(seqidno:69)、lpsslqk(seqidno:70)、ppllkss(seqidno:71)、pxkldss(seqidno:72)、awtlass(seqidno:73)、wpfygtp(seqidno:74)、gtfpflg(seqidno:75)、gqvpfmg(seqidno:76)、anfsila(seqidno:77)、gsiwapa(seqidno:78)或siaasfs(seqidno:79)，按氨基至羧基取向或羧基至氨基取向表達(dá)。在某些實(shí)施方案中，所述靶向肽靶向tpp1腦血管內(nèi)皮細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述靶向肽是gmnafra(seqidno:64)，按氨基至羧基取向或羧基至氨基取向表達(dá)。在某些實(shí)施方案中，所述靶向腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的氨基酸序列包含seqidno44-47中的至少一個(gè)。在某些實(shí)施方案中，所述靶向腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的氨基酸序列包含seqidno66-68中的至少一個(gè)。在某些實(shí)施方案中，所述靶向腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的氨基酸序列包含seqidno48-63中的至少一個(gè)。在某些實(shí)施方案中，所述靶向腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的氨基酸序列包含seqidno69-79中的至少一個(gè)。在某些實(shí)施方案中，所述靶向腦組織的氨基酸序列選自下表1中所列的那些：表1：靶向腦的pm-aav名稱序列seqidno.靶向thrthrppmwspvwp80轉(zhuǎn)鐵蛋白crtcrtigpsvc81轉(zhuǎn)鐵蛋白bx2ghkvkrpkg82轉(zhuǎn)鐵蛋白bx3kdkikmdkk83轉(zhuǎn)鐵蛋白bx6ghkakgprk84轉(zhuǎn)鐵蛋白bx8kwktpkvrv85轉(zhuǎn)鐵蛋白aav-ppsdspahps51野生型pyfpsls48野生型yapltps49野生型plspsay50野生型gtpthps52野生型pdapsnh53野生型tephwps54野生型spplppk55野生型spkpppg56野生型nwspwdp57野生型aav-tlhgwtlhnk59野生型kipptlh60野生型isqtlhg61野生型qsfyilt62野生型ttqseyg63野生型aav-pfgwpfygtp74mpsviigtfpflg75mpsviigqvpfmg76mpsviippllkss71mpsviimlvsspa69mpsviiawtlass73mpsviiaav-lsslpsslqk70mpsviipxkldss72mpsviigsiwapa78mpsviianfsila77mpsviisiaasfs79mpsviiaav-gmngmnafra64cln2在某些實(shí)施方案中，所述靶向腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的氨基酸序列靶向患?。ɡ缛苊阁w貯積癥）個(gè)體的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述靶向腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的氨基酸序列靶向不患有溶酶體貯積癥的個(gè)體的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述病毒載體包含編碼治療劑的核酸序列。在某些實(shí)施方案中，所述治療劑是β-葡糖苷酸酶。在某些實(shí)施方案中，所述靶向腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的氨基酸序列至多長(zhǎng)十個(gè)氨基酸。在某些實(shí)施方案中，所述靶向腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的氨基酸序列長(zhǎng)3、4、5、6或7個(gè)氨基酸。本公開的某些實(shí)施方案提供了核酸序列，其編碼如本文所述的病毒載體。本公開的某些實(shí)施方案提供了核酸序列，其編碼如本文所述的經(jīng)修飾的衣殼。本公開的某些實(shí)施方案提供了經(jīng)修飾的衣殼，其由本文所述的核酸序列編碼。本公開的某些實(shí)施方案提供了細(xì)胞，其包含如本文所述的病毒載體。本公開的某些實(shí)施方案提供了細(xì)胞，其由如本文所述的病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)。在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是人類細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是非人細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞在體外。在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞在體內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是內(nèi)皮細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是血管內(nèi)皮細(xì)胞。本發(fā)明的試劑的劑量、制劑和施用途徑優(yōu)選施用本發(fā)明的試劑以導(dǎo)致減少至少一種與疾病相關(guān)的癥狀。施用量將根據(jù)各種因素而變化，所述因素包括但不限于：所選組合物、具體疾病、哺乳動(dòng)物的重量、身體狀況和年齡、以及想要實(shí)現(xiàn)預(yù)防還是治療。此類因素可以由臨床醫(yī)生采用本領(lǐng)域熟知的動(dòng)物模型或其它測(cè)試系統(tǒng)容易地確定。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“治療性sirna”指代對(duì)接受者具有有益效果的任何sirna。因此，“治療性sirna”同時(shí)包括治療性和預(yù)防性sirna。sirna的施用可通過(guò)施用編碼該sirna的核酸分子而實(shí)現(xiàn)。核酸的藥物制劑、劑量和施用途徑是眾所周知的。本發(fā)明設(shè)想了通過(guò)施用本發(fā)明的試劑（例如，核酸組合物、表達(dá)載體或病毒顆粒）在哺乳動(dòng)物中治療亨廷頓氏病。根據(jù)本發(fā)明施用治療劑可以是連續(xù)的或間歇的，取決于例如接受者的身體狀況、施用目的是治療性還是預(yù)防性、以及技術(shù)人員已知的其它因素。施用本發(fā)明的試劑可以是在預(yù)選的時(shí)間段上基本上連續(xù)的或可以是一系列間隔的劑量。設(shè)想了局部和全身施用。含有本發(fā)明的治療劑的一種或多種合適的單位劑型，如下所述，可任選地被配制成持續(xù)釋放（例如使用微膠囊化，參見(jiàn)wo94/07529和美國(guó)專利no.4,962,091，其公開內(nèi)容以引用方式并入本文），其可以通過(guò)各種途徑施用，包括胃腸外，包括通過(guò)靜脈內(nèi)和肌內(nèi)途徑，以及通過(guò)直接注射到病變組織中。例如，治療劑可被直接注射到腦部中。作為另外一種選擇，針對(duì)腦和脊髓狀況，治療劑可被鞘內(nèi)引入。又如，針對(duì)從肌肉回運(yùn)至受影響神經(jīng)元的病毒，如aav、慢病毒和腺病毒，治療劑可被肌內(nèi)引入。所述制劑（在適當(dāng)情況下）可以離散單位劑型方便地制備，并且可通過(guò)藥劑學(xué)領(lǐng)域熟知的任何方法制備。此類方法可包括以下步驟：使治療劑與液體載體、固體基質(zhì)、半固體載體、細(xì)分的固體載體或其組合締合，并隨后，如果有必要，將產(chǎn)物引入或適形至所需遞送系統(tǒng)中。當(dāng)制備本發(fā)明的治療劑用于施用時(shí)，優(yōu)選地將其與藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑組合以形成藥物制劑或單位劑型。此類制劑中包含的總活性成分按制劑的重量計(jì)在0.1至99.9%?！八帉W(xué)上可接受的”是指載體、稀釋劑、賦形劑和/或鹽與制劑的其它成分相容并且對(duì)其接受者無(wú)害。用于施用的活性成分可以粉末或顆粒、溶液、懸浮液或乳液的形式提供。含有本發(fā)明的治療劑的藥物制劑可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的程序使用熟知并容易獲得的成分制備。本發(fā)明的治療劑還可以被配制成適于胃腸外施用的溶液，例如通過(guò)肌內(nèi)、皮下或靜脈內(nèi)途徑。本發(fā)明的治療劑的藥物制劑還可以采取水溶液或無(wú)水溶液或分散液的形式，或作為另外一種選擇，采取乳液或懸浮液的形式。因此，所述治療劑可被配制成用于胃腸外施用（例如，通過(guò)注射，例如，推注或連續(xù)輸注）并且可以單位劑型在安瓿、預(yù)裝填注射器、小容量輸液容器或含有添加的防腐劑的多劑量容器中提供。所述活性成分可采取如在油性或水性媒介物中的懸浮液、溶液或乳液的形式，并且可含有配方試劑如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。作為另外一種選擇，所述活性成分可以是粉末形式，其通過(guò)無(wú)菌分離滅菌固體或通過(guò)凍干溶液而獲得，用于在使用前與合適的媒介物（例如，滅菌的、無(wú)熱原的水）組構(gòu)。應(yīng)當(dāng)理解，各劑型的單個(gè)氣溶膠劑量中所含的單位活性成分含量其本身不必構(gòu)成用于治療特定指征或疾病的有效量，因?yàn)楸匾挠行Я靠梢酝ㄟ^(guò)施用多個(gè)劑量單位而達(dá)到。此外，所述有效量可使用小于劑型中的劑量單獨(dú)地或在一連串施用中達(dá)到。本發(fā)明的藥物制劑可包含藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑、增溶劑或乳化劑以及本領(lǐng)域熟知類型的鹽作為任選成分。可用于本發(fā)明的藥物制劑中的載體和/或稀釋劑的具體非限制性實(shí)例包括：水和生理上可接受的緩沖鹽水溶液（如磷酸鹽緩沖鹽水溶液）、ph7.0-8.0的鹽水溶液和水?，F(xiàn)在將通過(guò)以下非限制性實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)施例1單核苷酸種修飾恢復(fù)小鼠腦中毒性mirna序列的體內(nèi)耐受性亨廷頓氏病(hd)是由于亨廷頓蛋白(htt)的多谷氨酰胺擴(kuò)增形式的表達(dá)所引起的致命的神經(jīng)退行性疾病。近來(lái)的研究表明，包括rna干擾(rnai)在內(nèi)的基因沉默方法改善hd小鼠模型中的疾病指示數(shù)據(jù)。為了將靶向htt的rnai應(yīng)用于臨床上，我們?cè)O(shè)計(jì)了rnai構(gòu)建體，hds1，其具有穩(wěn)健的對(duì)靶標(biāo)的沉默功效和最小化的非預(yù)期人轉(zhuǎn)錄物沉默(mcbride等人，molther.dec2011;19(12):2152-2162)。在恒河猴中，將aav.mihds1遞送至殼核降低了htt表達(dá)而在注射后6周對(duì)神經(jīng)功能狀態(tài)（包括精細(xì)和粗放運(yùn)動(dòng)技能）沒(méi)有不利影響、無(wú)免疫活化并且無(wú)神經(jīng)病理發(fā)生。其他人證明了，注射后6個(gè)月，另一不同的靶向htt的rnai在猴子中的安全性。將hds1應(yīng)用于hd患者需要在嚙齒類動(dòng)物中進(jìn)行進(jìn)一步的安全測(cè)試，盡管其是針對(duì)人類進(jìn)行優(yōu)化的。為了滿足這一監(jiān)管要求，我們?cè)u(píng)價(jià)了接受aav.mihds1注射后的小鼠。與猴子不同，小鼠腦中發(fā)生了急性神經(jīng)功能缺損并且可以歸咎于mihds1與其它轉(zhuǎn)錄物的3’未翻譯區(qū)的相互作用所造成的脫靶沉默。雖然我們解決了mihds1在小鼠腦中的毒性并保持了mihds1沉默功效，但這些研究凸顯了，優(yōu)化基于核酸的藥物的人類使用安全性在嚙齒類動(dòng)物或其它遠(yuǎn)親物種的安全性測(cè)試上面臨挑戰(zhàn)。hd是由亨廷頓蛋白的第一個(gè)外顯子內(nèi)的cag重復(fù)擴(kuò)增(>36個(gè)重復(fù))引起的。盡管突變型亨廷頓蛋白(mhtt)廣泛表達(dá)，但腦部并且尤其是紋狀體顯示出穩(wěn)健并更早的退化。hd在歐洲和美國(guó)的發(fā)病率為~5-10/100,000人，其通常在三十或四十歲左右發(fā)作。迄今為止，hd的管理包括可以減少運(yùn)動(dòng)或精神癥狀的藥物。使用可誘導(dǎo)的hd模型的更早期的研究表明，一旦關(guān)閉mhtt表達(dá)，則疾病癥狀得以改善，甚至在疾病發(fā)作許多周之后以及紋狀體萎縮之后也是如此。這意味著，存在一個(gè)在早期癥狀發(fā)作后治療hd的時(shí)機(jī)。因此，使用基因沉默技術(shù)（包括rnai）降低基因表達(dá)的方法應(yīng)當(dāng)作為備選的治療手段加以研究。rnai是進(jìn)化上保守的轉(zhuǎn)錄后基因沉默方法，通過(guò)這種方法，雙鏈小型非編碼rna(例如，mirna)引起靶mrna序列的序列特異性降解。內(nèi)源rnai途徑始于表達(dá)較大的初級(jí)rna轉(zhuǎn)錄物(pri-mirna)，其隨后在細(xì)胞核中被drosha（微處理器復(fù)合物的組分）切割，以生成前體mirna(pre-mirna)。pre-mirna被輸出至細(xì)胞質(zhì)中并隨后被dicer切割以釋放成熟的mirna。mirna序列的兩條鏈之一(反義“引導(dǎo)”鏈)通常被優(yōu)先并入到rna誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(risc)中，其中其將指導(dǎo)結(jié)合靶mrna并抑制表達(dá)。mirna通常通過(guò)部分互補(bǔ)而抑制mrna表達(dá)。當(dāng)由dicer切割產(chǎn)生的dsrna的一條鏈與其靶標(biāo)完全互補(bǔ)時(shí)，所得到的小型干擾rna(sirna)指導(dǎo)該靶標(biāo)在所述“引導(dǎo)”鏈的核苷酸10和11對(duì)面的堿基處進(jìn)行核酸內(nèi)切割，觸發(fā)mrna破壞?？茖W(xué)家已經(jīng)開發(fā)了不同的基于表達(dá)的系統(tǒng)以利用內(nèi)源rnai途徑并抑制特定基因的表達(dá)。例如，rnai表達(dá)系統(tǒng)可以經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)以表達(dá)小型發(fā)夾rna序列，其中其鏈之一與靶mrna互補(bǔ)，并且在pre-mirna(短發(fā)夾rna；shrna)或pri-mirna(人工mirna)步驟進(jìn)入所述途徑。對(duì)于急性轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中的表達(dá)系統(tǒng)或sirna而言，有活性的引導(dǎo)鏈被設(shè)計(jì)成盡可能特異的并具有最小的偏離序列的沉默。由于引導(dǎo)與其它具有完全互補(bǔ)性的轉(zhuǎn)錄物的相互作用而產(chǎn)生的偏離序列的沉默可以使用標(biāo)準(zhǔn)搜索算法而得以避免。更難以避免的脫靶類型是由于rnai種序列（裝載鏈的5’端的堿基2-7）與其它mrna3’utr序列的部分互補(bǔ)而發(fā)生的那種。在這種情況下，表達(dá)抑制經(jīng)由mirna樣機(jī)制進(jìn)行。在之前的研究中，我們開發(fā)了算法sispotr以設(shè)計(jì)強(qiáng)力rnai序列，其對(duì)risc裝載具有強(qiáng)烈的鏈偏好，并且對(duì)未預(yù)期的人轉(zhuǎn)錄物具有最小化的脫靶沉默潛力。當(dāng)sispotr被用于設(shè)計(jì)htt沉默的觸發(fā)物時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)，mihds1（由aav載體表達(dá)）在被遞送至非人靈長(zhǎng)類的殼核后在多個(gè)水平上顯示出安全性。作為人類應(yīng)用的先決條件，我們進(jìn)行了后續(xù)實(shí)驗(yàn)以評(píng)估在正常嚙齒類動(dòng)物中的安全性。值得注意的是，我們發(fā)現(xiàn)，在紋狀體注射后，hds1誘導(dǎo)了穩(wěn)健的運(yùn)動(dòng)缺陷，其可以歸咎于未預(yù)期的bcl2沉默。我們還證明，可以在保持htt沉默功效的同時(shí)通過(guò)若干策略解決脫靶毒性?？偠灾@些研究凸顯了優(yōu)化基于核酸的藥物在人類中的特異性和安全性的困難：當(dāng)其用在遠(yuǎn)親物種中時(shí)將表現(xiàn)不同，并且可能具有誘導(dǎo)疾病、脫靶的概況。結(jié)果mihds1在小鼠腦中誘導(dǎo)神經(jīng)功能缺損。在之前的研究中，我們?cè)O(shè)計(jì)了mihds1，一種針對(duì)亨廷頓蛋白的人工mirna序列，其具有高靶標(biāo)沉默功效和最小化的脫靶可能性(圖1a)。當(dāng)表達(dá)mihds1的aav載體被注射到非人靈長(zhǎng)類的殼核中時(shí)，htt水平顯著降低并且不存在神經(jīng)元變性、免疫應(yīng)答或運(yùn)動(dòng)缺陷的病征?？偠灾@些研究凸顯了mihds1作為hd治療劑的潛力。然而，作為人類應(yīng)用的先決條件，需要在其它物種如嚙齒類動(dòng)物中進(jìn)一步測(cè)試。因此，我們著手在正常小鼠中進(jìn)行aav.mihsd1的安全性測(cè)試，盡管其事實(shí)上是針對(duì)人類細(xì)胞中的安全性設(shè)計(jì)的。作為建立臨床前構(gòu)建體的第一步，我們重新設(shè)計(jì)了aav.mihsd1載體以包含填充序列而非egfp表達(dá)盒，其在我們的早期研究中被用于轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)域的可視化。所述填充序列經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)以缺少增強(qiáng)子或阻遏子序列、剪接活化因子或阻遏子以及反義或其它非編碼rna，并具有足夠的大小用于小型rnai表達(dá)盒的最優(yōu)包裝。最終的aav2/1載體表達(dá)mihds1或mictl（在我們?cè)缙诘脑S多體內(nèi)研究中使用的對(duì)照）(圖1b)。在7周齡，對(duì)野生型小鼠進(jìn)行稱重并評(píng)估基本轉(zhuǎn)桿表現(xiàn)，之后將動(dòng)物分配到具有同等能力的組中(以避免組間的治療前差異)。在8周齡時(shí)，采用aavmihds1/填充序列(n=13)和aavmictl/填充序列(n=11)病毒將aav.mihds1或aav.mictl雙側(cè)注射到紋狀體中(圖1c、d)。早在aav遞送2個(gè)月后，表達(dá)mihds1的小鼠就具有顯著的轉(zhuǎn)桿缺陷并相比用對(duì)照治療的同窩小鼠顯示出縮短的掉落延遲時(shí)間(圖1d)。并且，雖然在研究期間所有動(dòng)物均增重，但用hds1治療的小鼠的增重明顯低于用mictl治療的小鼠(圖1e)。在小鼠腦中表征mihds1脫靶基因。mihds1被設(shè)計(jì)成具有最小化的人轉(zhuǎn)錄物脫靶沉默，但并未針對(duì)在小鼠中的安全性進(jìn)行優(yōu)化，并且我們之前并未從生物信息學(xué)上評(píng)價(jià)所述序列針對(duì)小鼠轉(zhuǎn)錄物的潛在毒性。盡管早先在猴子中使用的aav.mihds1.egfp構(gòu)建體顯示出正確的鏈裝載，但我們接下來(lái)測(cè)試了mihds1.填充序列表達(dá)盒的鏈偏好的保真度，因?yàn)槿我粭l鏈，如果裝載，都可能誘發(fā)脫靶沉默。為此，我們?cè)O(shè)計(jì)了由克隆到螢光素酶報(bào)道基因的下游的mihds1靶標(biāo)組成的報(bào)道構(gòu)建體。我們發(fā)現(xiàn)，引導(dǎo)鏈?zhǔn)艿揭种?，而非引?dǎo)鏈未受抑制(圖1g)。這與我們?cè)缦葘?duì)hds1.egfp表達(dá)盒的體外表達(dá)分析是一致的，并且得到了以下事實(shí)的支持：我們?cè)O(shè)計(jì)出具有低的5’端熱力學(xué)穩(wěn)定性的mihds1序列以促進(jìn)將引導(dǎo)“反義”鏈正確裝載到risc復(fù)合體中。因此，由mihds1表達(dá)所觀察到的神經(jīng)功能缺損很可能是由于引導(dǎo)“反義”鏈與未預(yù)期的mrna的3’utr結(jié)合以及通過(guò)mirna樣機(jī)制的沉默表達(dá)造成的。因?yàn)橹暗难芯勘砻?，大多?shù)脫靶效應(yīng)是由于種介導(dǎo)的與其它mrna3’utr的結(jié)合造成的，所以我們首先使用常用的生物信息學(xué)方法識(shí)別出可能的mihds1脫靶。已經(jīng)描述了許多不同的靶標(biāo)預(yù)測(cè)程序以識(shí)別推測(cè)的mirna結(jié)合位點(diǎn)，如targetscan(ts)和pita算法。targetscan通過(guò)搜索3’utr序列中與mirna種序列互補(bǔ)的8聚體和7聚體位點(diǎn)的存在來(lái)預(yù)測(cè)該特定mirna的生物靶標(biāo)。該算法通過(guò)優(yōu)先考慮已知有利于mirna介導(dǎo)的調(diào)控的具有補(bǔ)償性3’堿基配對(duì)、本地序列背景和強(qiáng)序列保守性的靶位點(diǎn)而提高了靶標(biāo)預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。因?yàn)橹暗难芯恳呀?jīng)顯示，種介導(dǎo)的脫靶效應(yīng)是物種特異性的，所以我們基于小鼠3’utr轉(zhuǎn)錄物組中的種序列互補(bǔ)性使用了targetscan以預(yù)測(cè)靶標(biāo)。pita算法結(jié)合了靶位點(diǎn)可及性以預(yù)測(cè)mirna結(jié)合位點(diǎn)。對(duì)于給定的靶位點(diǎn)，pita確定ddg分值，即mirna與靶標(biāo)結(jié)合(dg雙鏈)和與靶位點(diǎn)核苷酸失配(dg開放)之間的自由能差異。根據(jù)pita，ddg分?jǐn)?shù)低于-10更有可能對(duì)內(nèi)源mirna靶標(biāo)具有功能性，但針對(duì)過(guò)表達(dá)的mirna序列的閾值可能更高(0至-10之間)。因此，在我們的方法中，我們使用了targetscan以識(shí)別所有可能的種結(jié)合位點(diǎn)，然后采用pita算法以確定ddg分?jǐn)?shù)，并對(duì)所有可能的mihds1位點(diǎn)進(jìn)行排序。使用我們的方法針對(duì)小鼠3’utr組，我們預(yù)測(cè)了197種轉(zhuǎn)錄物作為潛在的mihds1脫靶，其中170種在紋狀體中表達(dá)(圖3c)。正如所預(yù)計(jì)的，對(duì)直系同源的人和恒河猴的3’utr中mihds1脫靶的預(yù)測(cè)顯示，小鼠中的mihds1脫靶不是保守的。我們?cè)诿摪谢蛄斜淼那?5百分位數(shù)中識(shí)別出了bcl2、sdf4、smad9、bmi1、mettl2、lancl1和map2k6(圖2a、b)。我們通過(guò)q-pcr分析了得自用mictl或mihds1治療的小鼠的紋狀體樣品中的這些預(yù)測(cè)的脫靶和小鼠htt。正如所預(yù)計(jì)的，相比用mictl治療的小鼠，在用mihds1治療的小鼠中的小鼠htt表達(dá)顯著降低(最多達(dá)70%)(圖2c)。在所評(píng)估的這組脫靶轉(zhuǎn)錄物中，bcl2、sdf4和map2k6在得自用aav.mihds1治療的小鼠的組織樣品中顯著降低(圖2c)。這些轉(zhuǎn)錄物無(wú)一預(yù)測(cè)受mictl影響。我們使用具有正常htt等位基因的永生化小鼠神經(jīng)元紋狀體細(xì)胞系(sthdhq7細(xì)胞)確認(rèn)了這些結(jié)果。用表達(dá)mihds1、mictl或不表達(dá)轉(zhuǎn)錄物(僅含有u6啟動(dòng)子)的質(zhì)粒對(duì)sthdhq7細(xì)胞進(jìn)行電穿孔，并在24小時(shí)后，通過(guò)q-pcr分析轉(zhuǎn)錄物。正如在小鼠腦中所觀察到的，bcl2的表達(dá)在表達(dá)mihds1的細(xì)胞中降低，但在用表達(dá)mictl或?qū)φ誹6的質(zhì)粒處理的那些細(xì)胞中并未降低(圖2d)。相比之下，通過(guò)mihds1的過(guò)表達(dá)并未降低sdf4和map2k6的表達(dá)(圖2d)，表明這些基因可能并非體內(nèi)直接脫靶，并且可能反映了htt抑制隨時(shí)間推移的間接效應(yīng)或在非神經(jīng)元細(xì)胞中的脫靶抑制；盡管aav2/1主要轉(zhuǎn)導(dǎo)神經(jīng)元。有趣的是，smad9的表達(dá)在sthdhq7細(xì)胞中顯著升高，并且在用mihds1處理的紋狀體中升高，盡管并非如此顯著。(圖2d)。因此，我們的篩查顯示，在小鼠的3’utr組中，bcl2是hds1的潛在的有害脫靶。針對(duì)在小鼠腦中的安全性拯救mihds1。當(dāng)mirna序列被裝載到含有催化argonaute蛋白(ago2)的risc中時(shí)，需要mirna與其靶序列之間的完全結(jié)合互補(bǔ)性以介導(dǎo)mrna核酸內(nèi)切割。然而，由mirna序列上的單點(diǎn)突變產(chǎn)生的錯(cuò)配是可以容忍的。因此，為了調(diào)整mihds1的脫靶概況（其主要由種區(qū)控制），我們引入了單點(diǎn)突變，其經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)以改變種而不影響沉默功效(圖3a)。為了識(shí)別哪些種突變(i)有效改變脫靶概況，(ii)保持低的總脫靶可能性并且(iii)沉默人htt，作為第一步，我們使用mihds1的所有單核苷酸種變體(位置2-7)重復(fù)了脫靶預(yù)測(cè)分析(圖3c)。拋棄了位置8的突變體，因?yàn)槠涿摪懈艣r與mihds1充分重疊。這是在意料之中的，因?yàn)閷?duì)于mirna介導(dǎo)的沉默而言，位置8的配對(duì)不是必要的。還拋棄了位置3和4的種突變體，因?yàn)檫@些突變顯著增加了預(yù)測(cè)脫靶的數(shù)目。對(duì)于剩下的種變體而言，總脫靶可能性與mihds1相當(dāng)，其中小于10%的mihds1脫靶在mihds1變體間共享(圖3c)。因此，我們?cè)趍ihds1種區(qū)的位置2、5、6和7引入了單點(diǎn)突變以生成mihds1變體。由于我們的目標(biāo)是沉默人htt，所以我們首先在來(lái)源于人的hek293細(xì)胞系中篩查了所有變體并通過(guò)q-pcr確定了沉默功效(圖4a)。并非所有mihds1變體均等同原始mihds1般降低htt表達(dá)。相比mihds1，在位置2和7具有錯(cuò)配的mihds1變體破壞了mihds1沉默功效。然而，在位置5或6含有錯(cuò)配的mihds1變體并未觀察到顯著差異。值得注意的是，在不同的于位置7具有錯(cuò)配的mihds1變體中，僅具有c>u置換的變體與mihds1具有等同的沉默功效，這可能是由于g:u擺動(dòng)的熱力學(xué)穩(wěn)定性造成的。我們選擇mihds1v6a和mihds1v5u用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，其根據(jù)是：(1)其更高的沉默功效，相對(duì)于在相同種位置含有錯(cuò)配的其它mirna變體，和(2)所生成的核苷酸錯(cuò)配類型(u:u，mihds1v5u；a:g，mihds1v6a，圖4d)，其具有與hds1充分不同的中等脫靶概況(圖4b、4c、4e、4f)。risc裝載的mirna序列如下(備注:3’→5’):pri-mihds1如下(5’→3’):pre-mihds1如下(5’→3’):正如所預(yù)計(jì)的，mihds1v6a和mihds1v5u的表達(dá)降低了htt蛋白在小鼠(sthdhq7)和人(hek293)細(xì)胞系中的水平，而與mihds1沒(méi)有顯著差異(圖4a-4e)。接下來(lái)，我們?cè)u(píng)價(jià)了mihds1v6a和mihds1v5u對(duì)經(jīng)驗(yàn)證的mihds1脫靶小鼠轉(zhuǎn)錄物的影響。種配對(duì)穩(wěn)定性(sps)，即mirna種與其靶mrna之間結(jié)合的自由能，影響mirna序列是否產(chǎn)生脫靶沉默效應(yīng)。盡管mihds1變體與原始mihds1（針對(duì)其自己的靶標(biāo)）具有相似的sps值，但是mihds1變體的種區(qū)內(nèi)的錯(cuò)配降低了針對(duì)mihds1脫靶的sps值(圖3b)。根據(jù)pita，在種區(qū)內(nèi)引入錯(cuò)配降低了所有的hds1預(yù)測(cè)脫靶基因上的ddg分值，而mihds1v6a比mihds1v5u更顯著。有趣的是，mihds1變體的種序列在一些相同的mihds1脫靶上生成了不同的靶位點(diǎn)。我們之前證實(shí)了mihds1對(duì)bcl2的體內(nèi)和體外沉默。根據(jù)targetscan，mihds1v6a和mihds1v5u將不再靶向bcl23’utr，并且pita預(yù)測(cè)了在mihds1位點(diǎn)的降低的ddg分?jǐn)?shù)，暗示mihds1v6a或mihds1v5u將削弱bcl2沉默。為了測(cè)試這一點(diǎn)，用含有mirna表達(dá)盒的質(zhì)?；騼H含u6啟動(dòng)子的對(duì)照質(zhì)粒對(duì)sthdhq7細(xì)胞進(jìn)行電穿孔，并在24小時(shí)后，通過(guò)q-pcr確定bcl2、htt和smad9的表達(dá)。相對(duì)于對(duì)照(mictl和u6)，httmrna水平在用mihds1和mihds1變體電穿孔的細(xì)胞中均顯著降低(圖4g)。但重要的是，盡管mihds1顯著降低bcl2的表達(dá)（降幅達(dá)40%），但用mihds1v6a電穿孔后未觀察到沉默。mihds1v5u的表達(dá)依然針對(duì)bcl2有活性，將沉默水平保持在20%(圖4h)。有趣的是，在用mihds1v5u或mihds1v6電穿孔的細(xì)胞中未觀察到與mihds1表達(dá)相關(guān)的smad9過(guò)表達(dá)(圖4i)。重定向mictl以針對(duì)人亨廷頓蛋白mrna。我們之前的實(shí)驗(yàn)披露了mihds1的由于其脫靶效應(yīng)造成的毒性，但也凸顯了mictl當(dāng)在小鼠腦中表達(dá)時(shí)是可容忍的。mictl被設(shè)計(jì)成具有低脫靶沉默概況，但并非旨在靶向亨廷頓蛋白mrna。因此，我們測(cè)試了我們是否可以利用mictrl種在小鼠紋狀體中的相對(duì)安全性并且圍繞該種來(lái)設(shè)計(jì)靶向htt的rnai觸發(fā)物。作為第一步，我們篩選了人httmrna或臨床靶標(biāo)，尋找與mictl種區(qū)完全互補(bǔ)的序列，但沒(méi)有任何發(fā)現(xiàn)。遵循與設(shè)計(jì)mihds1變體相同的策略，我們重復(fù)了這一生物信息學(xué)分析，允許mirna序列的核苷酸2至7之間的單個(gè)錯(cuò)配。我們發(fā)現(xiàn)了四個(gè)互補(bǔ)序列(mihdss1-4)：mihdss1(在位置7的錯(cuò)配)和mihdss4(在位置4的錯(cuò)配)靶向htt的3’utr，而mihdss2(在位置6的錯(cuò)配)和mihdss3(在位置5的錯(cuò)配)分別靶向htt的跨越外顯子7-8的接合區(qū)域或外顯子33內(nèi)的編碼區(qū)(圖5a、b)。當(dāng)在hek293細(xì)胞中測(cè)試時(shí)，僅mihdss3將htt表達(dá)沉默至用對(duì)照處理的細(xì)胞的40-50%，如通過(guò)q-pcr(圖5c)和western印跡所確定(圖5d、e)。因?yàn)閙ictl與mihdss3共享相同的種序列，所以我們預(yù)計(jì)這兩種mirna將具有相同的脫靶概況。然而，正如在來(lái)自特定mirna家族的內(nèi)源mirna上所觀察到的，沉默功效可能由于各個(gè)mirna的3’區(qū)的序列差異而變化。我們使用了pita算法以比較mictl脫靶與mihdss3脫靶的mirna結(jié)合穩(wěn)定性和沉默潛力。通過(guò)我們的生物信息學(xué)方法，我們預(yù)測(cè)了針對(duì)mictl和mihdss3兩者的89個(gè)脫靶位點(diǎn)，其中67個(gè)在紋狀體中表達(dá)。有趣的是，相比mictl，mihdss3的3’區(qū)提高了脫靶-mirna結(jié)合穩(wěn)定性(圖5f)。在小鼠腦中表征mihds1變體和mihdss3的耐受性。為了確定新序列的體內(nèi)耐受性，將mirna表達(dá)盒克隆到我們的aav穿梭載體中(圖6b)。根據(jù)同等重量和基本轉(zhuǎn)桿表現(xiàn)，將七周齡的野生型小鼠分組，并隨后用病毒表達(dá)的mihds1v6a、mihds1v5u、mihdss3或mihds1在紋狀體雙側(cè)注射，將mictl和配制緩沖液(fb)作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照。在注射后兩個(gè)月和四個(gè)月，記錄小鼠重量，并通過(guò)使用加速轉(zhuǎn)桿、抱握和開放場(chǎng)地測(cè)試來(lái)確定神經(jīng)系統(tǒng)不良反應(yīng)(圖6a)。與我們之前的結(jié)果一致，表達(dá)mihds1的小鼠在加速轉(zhuǎn)桿裝置上表現(xiàn)出運(yùn)動(dòng)缺陷(圖6c)。同樣，在僅注射fb緩沖液或mictl的小鼠中未觀察到差異。此結(jié)果很重要，因?yàn)槠浔砻鞑涣挤磻?yīng)并非利用內(nèi)源途徑的結(jié)果，而是特定的mihds1脫靶效應(yīng)。有趣的并且與我們的體外研究一致的是，mihds1v5u也顯示出轉(zhuǎn)桿缺陷。這可能反映了嘧啶:嘧啶錯(cuò)配(u:u,mirna:mrna)顯示出中等辨識(shí)力并且此變體依然部分沉默bcl2(圖4h)。從我們的體外研究中還預(yù)測(cè)，在aav注射后2或4個(gè)月，mihds1v6a改善了mihds1介導(dǎo)的毒性，同時(shí)未在mihds1v6a與mictl之間觀察到顯著差異。除了沉默人亨廷頓蛋白之外，mihdss3還與mictl共享相同的脫靶概況。然而，pita算法暗示，mihdss3更容易通過(guò)提高mirna:mrna對(duì)的結(jié)合穩(wěn)定性而沉默mictl脫靶庫(kù)(圖5f)。然而，在2或4個(gè)月時(shí)，在加速轉(zhuǎn)桿上并未觀察到顯著差異(圖6c)。除了用mihds1v5u注射的小鼠隨時(shí)間推移發(fā)生了減重(-1.7g，在4個(gè)月時(shí)減少了8%)以外，在所有其它組中均記錄了體重增加。與之前一樣，用mihds1治療時(shí)，重量增加也顯著降低。在4個(gè)月時(shí)，注射了mihds1的小鼠的體重增加了1.3克(5%)，而其它組的重量增加了3.6至5.2克(在4個(gè)月時(shí)增加了15-22%)(圖6d)。討論?在本研究中，我們著手測(cè)試了rnai觸發(fā)物在正常小鼠中的安全性，所述rnai觸發(fā)物是針對(duì)人類安全性設(shè)計(jì)的并在早前研究中被證明對(duì)于非人靈長(zhǎng)類是安全的。在兩個(gè)物種（通常一種嚙齒類動(dòng)物和一種更大型的哺乳動(dòng)物）中測(cè)試人用藥物是用于監(jiān)管審批以進(jìn)入早期研究的標(biāo)準(zhǔn)程序。雖然我們未在猴子中發(fā)現(xiàn)顯著毒性（這也由他人在更近期的研究中報(bào)道），但是當(dāng)預(yù)期構(gòu)建體在嚙齒類動(dòng)物中進(jìn)行測(cè)試時(shí)，發(fā)現(xiàn)了急性毒性。我們發(fā)現(xiàn)，通過(guò)在種內(nèi)制造點(diǎn)突變以改變脫靶概況，我們可以降低所測(cè)試序列（mihds1）的毒性。單個(gè)種序列修飾改變了原始mihds1的脫靶概況，同時(shí)保持了沉默功效。mihds1v6而非mihds1v5恢復(fù)了mihds1在小鼠腦中的耐受性。mihds1v5u生成了u:u錯(cuò)配（一種嘧啶:嘧啶錯(cuò)配），而mihds1v6a生成了a:g（一種嘌呤:嘧啶錯(cuò)配），并據(jù)發(fā)現(xiàn)是能最有效區(qū)分的。作為改變hds1的種的備選方式，我們?cè)缦劝l(fā)現(xiàn)，我們的控制序列（也是針對(duì)低脫靶可能性而設(shè)計(jì)的）可以經(jīng)過(guò)重新工程改造以靶向人htt。當(dāng)在小鼠中測(cè)試時(shí)，這兩種序列均耐受良好并且不會(huì)誘導(dǎo)神經(jīng)病理或神經(jīng)功能缺損，正如之前在親本hds1中發(fā)現(xiàn)的。這些發(fā)現(xiàn)凸顯了傳統(tǒng)藥物開發(fā)與基于核酸的藥物的新興領(lǐng)域之間的反差。雖然所有人用藥物開發(fā)的目標(biāo)都是安全性和在目標(biāo)人群中的功效，但就基于核酸的藥物而言，預(yù)期的藥物直接與基因組和/或所表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物相互作用。因此，依靠序列特異性并針對(duì)人類安全性優(yōu)化的藥物將很可能與其它物種（并且特別是那些遠(yuǎn)親物種如嚙齒類動(dòng)物）的基因組發(fā)生不同的相互作用。另一方面，如果針對(duì)嚙齒類動(dòng)物安全性進(jìn)行序列優(yōu)化，則在人類基因組的背景中出現(xiàn)問(wèn)題的風(fēng)險(xiǎn)會(huì)更大?？偨Y(jié)本結(jié)果凸顯：(1)mirna的安全性和耐受性概況是物種特異的，強(qiáng)調(diào)了對(duì)使用小鼠疾病模型的初步研究的謹(jǐn)慎解釋，以及(2)單一種序列修飾是解決mirna序列的脫靶毒性并同時(shí)保持沉默功效的有效策略。材料和方法細(xì)胞系和轉(zhuǎn)染。hek293得自atcc并在制造商提供的條件下培養(yǎng)。sthdhq7幸運(yùn)地得自marcymacdonald。hek293上的所有質(zhì)粒dna轉(zhuǎn)染均采用lipofectamine2000(invitrogen)使用制造商提供的指南完成。sthdhq7細(xì)胞的dna轉(zhuǎn)染使用invitrogenneon轉(zhuǎn)染系統(tǒng)采用電穿孔條件并按照制造商提供的指南完成。載體設(shè)計(jì)和aav生產(chǎn)。人工mirna序列(mictl、mihdss變體、mihds1及mihds1變體)通過(guò)重疊dna寡核苷酸的聚合酶延伸而生成(idt,coralville)。使用qiaquickpcr純化試劑盒純化聚合酶延伸產(chǎn)物，用xhoi-spei消化并克隆到pol-iii表達(dá)盒上的xhoi-xbai位點(diǎn)，所述pol-iii表達(dá)盒含有小鼠u6啟動(dòng)子、mcs和pol-iii-終止子(6t)。使用psicheck2載體(promega)構(gòu)建了rnai螢光素酶報(bào)道載體。將有尾的dna寡核苷酸（其含有針對(duì)mihds1的有義或反義鏈的單個(gè)、完全互補(bǔ)的rnai靶位點(diǎn)）退火并克隆到海腎螢光素酶cdna序列的終止子下游的xhoi-noti位點(diǎn)。對(duì)于體內(nèi)研究而言，將mirna表達(dá)盒移入aav穿梭質(zhì)粒中dna填充序列的上游。所述mirna表達(dá)盒和填充序列的各端側(cè)接aav血清型2145-bp的末端反向重復(fù)序列。體外螢光素酶測(cè)定法。將在24-孔板中生長(zhǎng)至70%匯合度的hek293細(xì)胞與表達(dá)mirna的質(zhì)粒和rnai螢光素酶報(bào)道質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染。在24小時(shí)，用冰冷的pbs沖洗細(xì)胞，并使用雙螢光素酶報(bào)道分子測(cè)定系統(tǒng)(promega)根據(jù)制造商說(shuō)明使用20μl的細(xì)胞裂解產(chǎn)物評(píng)估海腎和螢火蟲螢光素酶的活性。發(fā)光讀數(shù)由monolight3010光度計(jì)(pharmigen,usa)獲得。相對(duì)光單位被計(jì)算為所表達(dá)的海腎/螢火蟲的相對(duì)光單位和結(jié)果相對(duì)于對(duì)照mirna的商。western印跡分析。如上所示，用mirna表達(dá)盒轉(zhuǎn)染hek293細(xì)胞。在48小時(shí)，用冰冷的pbs沖洗細(xì)胞一次，并用passive裂解緩沖液(pbl,promega)裂解。通過(guò)bradford-lowry法(biorad)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，并將10μg的蛋白質(zhì)上樣到nupage3-8%tris-acetate凝膠上(novexlifetechnologies)。將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到pvdf膜上，并與小鼠抗-htt(1:5000,millipore,ca)或兔抗β-肌動(dòng)蛋白(1:40000,sigma)抗體然后是辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)抗體(1:10,000,小鼠；或1:50,000,兔;jacksonimmunoresearch,westgrove,pa)溫育。用ecl-plus試劑(amershampharmacia)沖顯出印跡。用versadoctm成像系統(tǒng)(biorad)和quantityoner分析軟件通過(guò)相對(duì)于β肌動(dòng)蛋白的蛋白質(zhì)水平密度測(cè)定(n=4個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn))來(lái)確定沉默功效。rna提取和qpcr分析。使用trizol(lifetechnologies,grandisland,ny)根據(jù)制造商方案提取總rna分離物，不同的是在異丙醇沉淀步驟時(shí)向水相中加入1μlglycoblue和用冷的70%乙醇單次洗滌。通過(guò)分光光度法對(duì)rna樣品進(jìn)行定量，并隨后用隨機(jī)六聚體(taqmanrt試劑,appliedbiosystems)從500ng的總rna生成cdna。使用實(shí)時(shí)pcr定制測(cè)定設(shè)計(jì)網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器(idt,coralville)設(shè)計(jì)針對(duì)小鼠脫靶基因的sybrgreenq-pcr引物對(duì)。完成最終熔化曲線測(cè)定的七點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)曲線以驗(yàn)證每個(gè)引物對(duì)。只有具有100±5%的擴(kuò)增效率和單一擴(kuò)增產(chǎn)物的引物對(duì)才被用于使用ddct法確定相對(duì)基因表達(dá)。小鼠研究所有動(dòng)物方案均得到了愛(ài)荷華大學(xué)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)的批準(zhǔn)。野生型fbv和bachd小鼠得自jacksonlaboratories(barharbor,me,usa)。使用特異于側(cè)接cag重復(fù)的突變型人亨廷頓蛋白轉(zhuǎn)基因的引物對(duì)小鼠進(jìn)行基因分型，并將轉(zhuǎn)基因且年齡匹配的野生型同窩小鼠用于指示的實(shí)驗(yàn)。小鼠被安置于控溫環(huán)境、12-h光/暗周期中。隨意供應(yīng)食物和水。在指示的時(shí)間，為小鼠注射aav2/1-mu6-mirna/填充序列病毒。對(duì)于aav注射，將小鼠用開他敏和甲苯噻嗪的混合物麻醉，并將5μl的aav以0.2μl/min的速率兩側(cè)注射到紋狀體中(坐標(biāo)：+0.86mm前囟吻側(cè)，+/-1.8mm外側(cè)向內(nèi)側(cè)，-2.5mm腦面腹側(cè))。將用于基因表達(dá)分析的小鼠用開他敏和甲苯噻嗪的混合物麻醉，并用18ml0.9%冷鹽水與2mlrnalater(ambion)的混合溶液灌注。在指示的時(shí)間，處死小鼠并將腦部移除、阻斷并切成1-mm厚的冠狀切片。通過(guò)使用組織取樣器(直徑1.4-mm;zivicinstruments,pittsburgh,pa,usa)從紋狀體取得組織環(huán)切片。將所有的組織環(huán)切片在液氮中速凍并保存于-80c備用。行為分析使用轉(zhuǎn)桿裝置(型號(hào)47,600;ugobasile,comerio,italy)測(cè)定經(jīng)注射小鼠的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力。在7周齡時(shí)進(jìn)行基本轉(zhuǎn)桿測(cè)試，并在aav注射后2和4個(gè)月再次進(jìn)行。小鼠在連續(xù)四天中每天測(cè)試三次，測(cè)試間有30分鐘的休息時(shí)間，并且在每天的第一次測(cè)試前六十分鐘開始有5分鐘的適應(yīng)期。通過(guò)將每只小鼠在連續(xù)四天的測(cè)試中每天最好的兩次測(cè)試結(jié)果取平均值來(lái)計(jì)算每只小鼠的延遲掉落時(shí)間。對(duì)于抱握測(cè)試，將每只小鼠以尾部懸垂一分鐘，而如果小鼠將其前爪一起抱在其軀干附近，則記分為抱握。所有出版物、專利和專利申請(qǐng)均通過(guò)引用并入本文中。雖然在上述說(shuō)明書中，本發(fā)明已經(jīng)聯(lián)系其某些優(yōu)選實(shí)施方案進(jìn)行了描述，并且已經(jīng)出于說(shuō)明目的而示出了許多細(xì)節(jié)，但對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將顯而易見(jiàn)的是，本發(fā)明容易具有另外的實(shí)施方案并且本文所述的某些細(xì)節(jié)可發(fā)生相當(dāng)大的變化而不脫離本發(fā)明的基本原理。術(shù)語(yǔ)“一個(gè)（種）”（“a”和“an”）和“該”（“the”）以及類似指稱的使用在描述本發(fā)明的上下文中應(yīng)當(dāng)被理解為同時(shí)涵蓋單數(shù)和復(fù)數(shù)形式，除非本文另外指明或上下文有明顯抵觸。除非另有說(shuō)明，否則術(shù)語(yǔ)“包含”、“具有”、“包括”和“含有”應(yīng)當(dāng)被理解為開放式術(shù)語(yǔ)（即，意味著“包括但不限于”）。除非本文另外指明，否則本文中數(shù)值范圍的表述僅僅旨在作為便捷方式以分別指代落入該范圍內(nèi)的各個(gè)單獨(dú)的值，并且各個(gè)單獨(dú)的值被并入本說(shuō)明書中如同其在本文中被分別列舉。本文所述的所有方法均可以任何合適的順序進(jìn)行，除非本文另外指明或上下文有其它明顯的抵觸。除非另行聲明，否則本文提供的任何及所有實(shí)例或示例性語(yǔ)言（例如，“諸如”）的使用僅僅旨在更好地說(shuō)明本發(fā)明并且對(duì)本發(fā)明的范圍不產(chǎn)生限制作用。本說(shuō)明書中的語(yǔ)言不應(yīng)當(dāng)被理解為指示任何未要求保護(hù)的要素是實(shí)施本發(fā)明所必需的。本文描述了本發(fā)明的實(shí)施方案，包括本發(fā)明人已知的實(shí)施本發(fā)明的最佳方式。這些實(shí)施方案的變型形式對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言在閱讀上述說(shuō)明后可能變得顯而易見(jiàn)。本發(fā)明人預(yù)計(jì)技術(shù)人員會(huì)酌情采用此類變型形式，并且本發(fā)明人預(yù)期本發(fā)明會(huì)以不同于本文所具體描述的方式實(shí)施。因此，本發(fā)明在適用法律所允許的情況下包括本文所附權(quán)利要求書中列舉的主題的所有修改形式和等同形式。此外，本發(fā)明涵蓋了上述要素以其所有可能的變型形式的任何組合，除非本文另外指明或上下文有其它明顯的抵觸。當(dāng)前第1頁(yè)12