改變亨廷頓蛋白突變體降解的單鏈胞內(nèi)抗體的制作方法
【專利說明】改變亨廷頓蛋白突變體降解的單鏈胞內(nèi)抗體
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2013年8月28日提交的美國臨時申請?zhí)?1/871,288和2013年5月29日 提交的美國臨時申請?zhí)?1/828,625的權(quán)益，其各自特此W引用的方式整體并入。
[0003] 發(fā)明背景 發(fā)明領(lǐng)域
[0004] 本發(fā)明總體上設(shè)及用于改變聚谷氨酸相關(guān)疾病（如亨廷頓氏病化untington's disease))的不利作用和疾病進展的組合物和方法。
[000引相關(guān)技術(shù)描述
[0006] 亨廷頓氏病是引起腦中的神經(jīng)細胞的漸進式分解(退化）、從而導(dǎo)致認知和運動功 能下降的遺傳性疾病[1，2]。細胞中的突變體亨廷頓蛋白化tt)的聚集改變蛋白質(zhì)功能和基 因調(diào)控，運引起運動、思想(認知)和精神病癥連同神經(jīng)元死亡?；加泻嗤㈩D氏病的大多人在 他們20歲或30歲時發(fā)展病征和癥狀，但是疾病發(fā)作可在生命早期或晚期，其中患者死亡通 常在診斷的10-15年內(nèi)發(fā)生。亨廷頓氏病的幼年型在大約6%的患者中發(fā)生，其特征在于癥 狀的快速發(fā)作和和疾病進展在兒童早期開始。
[0007] 引起亨廷頓氏病的遺傳突變在亨廷頓蛋白的氨基末端附近的氨基酸谷氨酷胺(Q) 的重復(fù)中發(fā)現(xiàn)，其被稱為化t聚Q或化化Q。重復(fù)的數(shù)量通常預(yù)測受試者中的發(fā)病年齡和進展 速率。超過38Q的重復(fù)導(dǎo)致亨廷頓氏病病理學(xué)。亨廷頓蛋白的功能未良好表征，但是它似乎 參與含有細胞和組織功能所需的神經(jīng)遞質(zhì)和其他分子的囊泡的轉(zhuǎn)運功能[3，4]。雖然突變 在所有細胞中發(fā)現(xiàn)，但亨廷頓氏病主要顯現(xiàn)在腦中。
[0008] HttpQ的聚集導(dǎo)致亨廷頓蛋白的異常和捕獲降解W及毒性降解產(chǎn)物的產(chǎn)生，所述 毒性降解產(chǎn)物似乎進入細胞的細胞核并且在基因失調(diào)中起作用[5]。細胞核中的化化Q片段 結(jié)合驅(qū)動細胞功能的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白質(zhì)[4-6]。此外，HttpQ的積聚在細胞核中的毒性片段通 過直接結(jié)合DNA且通過改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)來改變基因表達[7,引。一些證據(jù)證明半脫天冬酶6 裂解片段積聚在細胞核中并且阻斷半脫天冬酶6裂解消除毒性細胞核片段的產(chǎn)生，從而導(dǎo) 致在化化Q動物中不存在疾病[9-11 ]?；蚴д{(diào)的模式被良好表征并且在基于細胞的系統(tǒng) 中、在表現(xiàn)HttpQ聚集的動物模型中W及在尸體剖檢時取得的患者樣品中一致。主要受影響 的基因家族是調(diào)控蛋白質(zhì)合成和降解、蛋白質(zhì)折疊(也稱為熱休克途徑及線粒體功能的 基因家族，其為細胞提供能量。
[0009] 調(diào)控運動功能和認知的神經(jīng)元的隨后損失導(dǎo)致進行性癡呆和運動控制的損失。因 此，需要改善降解過程的組合物和方法。具體地說，疾病改善療法必須展示預(yù)防基因失調(diào)和 防止化化Q聚集的能力，其似乎是疾病進展中的主要因素。迄今為止，還未鑒別防止化化Q的 聚集且改善基因失調(diào)的疾病改善性治療劑。常規(guī)藥劑和治療減輕運動和精神病癥的癥狀。 例如，用于亨廷頓氏病的唯一 FDA批準(zhǔn)的藥物(Xenazil巧愈)提供舞蹈病的暫時緩解，所述 舞蹈病是導(dǎo)致此疾病的初始表征的運動功能障礙的一個診斷部分。
[0010] 本公開尋求滿足此需求且提供其他相關(guān)優(yōu)點。
[001。 發(fā)明概述
[0012] 本文提供使用胞內(nèi)抗體來改變亨廷頓氏病的疾病進展的組合物和方法。在一個實 施方案中，提供一種包含單鏈胞內(nèi)抗體的組合物。所述單鏈胞內(nèi)抗體包含氨基酸序列，其包 含:可變重鏈互補決定區(qū)3(CDR3)序列、可變輕鏈CDR3序列W及插入在所述可變重鏈CDR3序 列與所述可變輕鏈CDR3序列之間的接頭序列，其中所述可變重鏈CDR3序列包含 Xi拉X3X4X5X6X7X8X9X10,其中Xi是H、I、A或無氨基酸，其中X2是W、T或A，其中X3是P、G或V，其中X4 是R、G或C，其中X5是L、Y、E或N，其中X6是W、R、C或G，其中X?是R或無氨基酸，其中X8是F、P或無 氨基酸，其中X9是P、K、D或無氨基酸，其中Χ?ο是L、A或T，并且其中所述胞內(nèi)抗體能夠結(jié)合聚 脯氨酸序列并且減少細胞中的聚谷氨酸串蛋白（tract protein)的聚集。
[0013] 在一個實施方案中，所述胞內(nèi)抗體包含可變重鏈CDR3序列，所述可變重鏈CDR3序 列包含WPGY服A(SEQ ID N0:6)。在另一個實施方案中，所述胞內(nèi)抗體包含可變重鏈CDR3序 列，所述可變重鏈CDR3序列包含HWPRLWRF化(SEQ ID N0:7)。在另一個實施方案中，所述胞 內(nèi)抗體包含可變重鏈CDR3序列，所述可變重鏈CDR3序列包含ITGCECT(SEQ ID N0:8)。在其 他實施方案中，所述胞內(nèi)抗體包含可變重鏈CDR3序列，所述可變重鏈CDR3序列包含 AAVCNGP畑T(沈Q ID N0:9)。
[0014] 在一些實施方案中，所述可變輕鏈CDR3序列包含X戍2X3X4X5X6X7X8姑XioXii，其中Xi是 S或無氨基酸，其中拉是Y或無氨基酸，其中X3是C或無氨基酸，其中X4是V、A、I或無氨基酸，其 中X5是L、S、R或Y，其中X6是N、K、G或S，其中X7是M、G或L，其中X8是H、K或L，其中X9是W、A或P，其 中Χ?ο是A、L或V，并且其中Xii是N、Y、L或無氨基酸。在一個實施方案中，所述可變輕鏈CDR3序 列包含SYCASKGHWUSEQ ID肋：10)。在另一個實施方案中，所述可變輕鏈〔033序列包含 化NMHWAN(SEQ ID顯：11)。在另一個實施方案中，所述可變輕鏈〔033序列包含5(：11?；〇(八八￥ (569 10^:12)。在一些實施方案中，所述可變輕鏈〔01?序列包含6￥化1^^化（569 10顯： 13)。
[0015] 在一個實施方案中，所述可變重鏈〔01?序列包含￥?6￥1?1(4(569 10^:6)，并且其 中所述可變輕鏈〔01?序列包含5￥〔451?麗1^56〇10顯：10)。在另一個實施方案中，所述可 變重鏈CDR3序列包含HWPRLWRF化（SEQ ID ^:7)，并且其中所述可變輕鏈〔033序列包含 VLNMHWAN(SEQ ID ^:11)。在另一個實施方案中，所述可變重鏈〔01?序列包含1了6〔6口'(569 IDN0:8)，并且其中所述可變輕鏈CDR3序列包含SCIRGLKAAY(SEQIDN0:12)。在其他實施 方案中，所述可變重鏈CDR3序列包含AAVCNGP畑T(SEQ ID N0:9)，并且所述可變輕鏈CDR3序 列包含GY化LP化(SEQ ID N0:13)。
[0016] 在另一個實施方案中，所述胞內(nèi)抗體包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含圖2中 的SEQ ID N0:5的位置1-99、110-225和237-256的氨基酸。在一些實施方案中，所述可變重 鏈CDR3區(qū)包含XiWPCXsXsX巧8X9T，并且其中Xi是H、I、A或無氨基酸，枯是1、￥、6或N，Xs是W、R、C 或G，X7是R或無氨基酸，姑是無氨基酸，姑是Ρ、Κ或D，并且XiQ是L、A或T(SEQ ID N0:14)。
[0017] 在其他實施方案中，所述可變輕鏈CDR3區(qū)包含SX2X3X4X日XsLHWAXio,其中X2是無氨基 酸，恥是(：或無氨基酸，X4是V、A、I或無氨基酸，X5是L、S、R或Y，并且X6是N、K、G或S(SEQ ID NO: 15)。所述接頭序列可包括富含甘氨酸的序列。在一個實施方案中，所述序列包含 SSGGGGSGGGGSGGGGS(沈Q ID N0:16)。
[0018]在另一個實施方案中，所述單鏈胞內(nèi)抗體的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 1。在一個 實施方案中，所述單鏈胞內(nèi)抗體的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 2。在另一個實施方案中，所 述單鏈胞內(nèi)抗體的氨基酸序列包含SEQ ID NO:3。在一些實施方案中，所述氨基酸序列包含 SEQ ID N0:4。在另一個實施方案中，所述單鏈胞內(nèi)抗體的氨基酸序列由SEQ ID NO: 1組成。 在一個實施方案中，所述單鏈胞內(nèi)抗體的氨基酸序列由SEQ ID NO:2組成。在其他實施方案 中，所述單鏈胞內(nèi)抗體的氨基酸序列由SEQ ID NO:3組成。在其他實施方案中，所述單鏈胞 內(nèi)抗體的氨基酸序列由SEQ ID NO:4組成。
[0019] 在一些實施方案中，所述單鏈胞內(nèi)抗體包含氨基酸序列，其包含:可變重鏈互補決 定區(qū)（CDR)序列、可變輕鏈CDR序列W及插入在所述可變重鏈CDR序列與所述可變輕鏈CDR序 列之間的接頭序列，其中所述可變輕鏈CDR序列包含Xi拉X3X4X5X6X巧8X巧loXii，其中Xi是S或無 氨基酸，其中X2是Y或無氨基酸，其中X3是C或無氨基酸，其中X4是V、A、I或無氨基酸，其中X5 是L、S、R或Y，其中X6是N、K、G或S，其中X7是M、G或L，其中X8是H、K或L，其中X9是W、A或P，其中 Χ?ο是A、L或V，并且其中Xii是N、Y、L或無氨基酸，并且其中所述胞內(nèi)抗體能夠結(jié)合聚脯氨酸 序列并且減少細胞中的聚谷氨酸串蛋白的聚集。
[0020] 在一個實施方案中，所述可變輕鏈〔01?序列包含5￥〔45撕冊1^569 10^:10)。在另 一個實施方案中，所述可變輕鏈〔03序列包含￥^#冊4則569 10^:11)。在另一個實施方案 中，所述可變輕鏈〔03序列包含5(：11?；〇^4￥(560 10顯：12)。在一些實施方案中，所述可變 輕鏈〔03序列包含6￥化1^^化(569 10^:13)。所述可變重鏈〔01?序列可包含'?^￥服4(569 10 N0:6)。在其他實施方案中，所述可變重鏈CDR序列包含HWPRLWRF化(SEQIDN0:7)。所述可 變重鏈CDR序列可包含ITGCECT(SEQ ID ^:8)。在其他實施方案中，所述可變重鏈〔03序列 包含AAVCNGP畑T(SEQ ID N0:9)。在一個實施方案中，所述可變重鏈CDR序列包含WPGY服A (沈Q ID N0:6)，并且其中所述可變輕鏈CDR序列包含SYCASKGHWL(SEQ ID N0:10)。
[0021 ] 在某些方面，所述可變重鏈CDR序列包含HWPRLWRFPL(沈QIDN0:7)，并且其中所 述可變輕鏈CDR序列包含化NMHWAN(SEQ ID NO: 11)。在其他方面，所述可變重鏈CDR序列包 含ITGCECT(沈Q ID N0:8)，并且其中所述可變輕鏈CDR序列包含SCIR化KAAY(沈Q ID NO: 12)。在一個方面，所述可變重鏈CDR序列包含AAVCNGPRDT(SEQ ID NO:9)，并且其中所述可 變輕鏈CDR序列包含GY化LP化(SEQ ID NO: 13)。
[0022]在其他實施方案中，所述胞內(nèi)抗體包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含圖2中的 沈Q ID NO:5的位置1-99、110-225和237-256的氨基酸。
[002引在一些方面，所述可變重鏈CDR區(qū)包含XiWPCXsXsX巧8X9T，并且其中Xi是H、I、A或無 氨基酸，X5是L、Y、E或N，X6是W、R、C或G，X7是R或無氨基酸，X8是無氨基酸，X9是Ρ、Κ或D，并且 Χ?ο是L、A或Τ(SEQ ID NO: 14)。在其他方面，所述可變輕鏈CDR區(qū)包含SX2X3X4X5X6LHWAX10，其 中拉是無氨基酸，X3是C或無氨基酸，X4是V、A、I或無氨基酸，X5是L、S、R或Y，并且X6是N、K、G或 S(沈Q ID NO: 15)。
[0024] 在一個實施方案中，所述接頭序列包含富含甘氨酸的序列。在另一個實施方案中， 所述序列包含SSGGGGSGGGGSGGGGS(沈Q ID N0:16)。
[0025] 在另一個實施方案中，所述單鏈胞內(nèi)抗體的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 1。所述單 鏈胞內(nèi)抗體的氨基酸序列包含SEQ ID N0:2。在一些實施方案中，所述單鏈胞內(nèi)抗體的氨基 酸序列包含SEQ ID N0:3。在一個實施方案中，所述單鏈胞內(nèi)抗體的氨基酸包含SEQ ID NO: 4。
[0026] 在一些實施方案中，所述單鏈胞內(nèi)抗體的氨基酸序列由SEQ ID NO: 1組成。在其他 實施方案中，所述單鏈胞內(nèi)抗體的氨基酸序列由SEQ ID NO: 2組成。在另一個實施方案中， 所述單鏈胞內(nèi)抗體的氨基酸序列由SEQ ID N0:3組成。在其他實施方案中，所述單鏈胞內(nèi)抗 體的氨基酸序列由SEQ ID NO:4組成。
[0027] 在一個方面，所述胞內(nèi)抗體能夠結(jié)合亨廷頓蛋白化ttpQ)蛋白質(zhì)。在一個實施方案 中，所述聚谷氨酸串是亨廷頓蛋白化ttpQ)蛋白質(zhì)。在另一個實施方案中，所述胞內(nèi)抗體降 低由所述化化Q蛋白的聚集引起的過度表達基因的表達。在一些實施方案中，所述胞內(nèi)抗體 增加由所述化化Q蛋白的聚集引起的表達不足基因的表達。
[0028] 在另一方面，所述聚脯氨酸序列包含?91^^???949?(569 10^:17)。在某些方面， 所述聚脯氨酸序列包含?6?4￥4邸化皿?6(569 10顯：18)。在其他方面，所述聚脯氨酸序列 包含PXP，并且其中X是任何氨基酸。
[0029] 在一個實施方案中，所述胞內(nèi)抗體預(yù)防由聚谷氨酸串蛋白的聚集引起的基因失 調(diào)。在另一個實施方案中，所述胞內(nèi)抗體阻斷突變體亨廷頓蛋白的毒性片段由于基因失調(diào) 而結(jié)合染色質(zhì)的能力。在一個實施方案中，INT41減少轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子與細胞核中的染色質(zhì)的 結(jié)合。在另一個實施方案中，所述胞內(nèi)抗體防止聚谷氨酸串蛋白在細胞膜上的積聚。
[0030] 本發(fā)明的方面包括一種用于減少受試者中的聚谷氨酷胺串蛋白的聚集的藥物組 合物，所述藥物組合物包含如本文所描述的所述胞內(nèi)抗體和藥學(xué)上可接受的載體。在一個 實施方案中，所述藥學(xué)上可接受的載體包含遞送劑。在另一個實施方案中，所述聚谷氨酷胺 串蛋白是號廷頓蛋白化ttpQ)蛋白質(zhì)。
[0031] 本發(fā)明的其他方面包括一種載體，所述載體包含編碼如本文所描述的所述胞內(nèi)抗 體的核酸序列。在一個方面，所述載體是病毒載體。在另一方面，所述載體是重組腺相關(guān)病 毒。本發(fā)明的另一方面包括一種分離的細胞，所述分離的細胞包含如本文所描述的所述胞 內(nèi)抗體。
[0032] 本發(fā)明包括防止細胞中的聚谷氨酷胺（聚Q)蛋白的聚集的方法，所述方法包括： (a)將如本文所描述的所述胞內(nèi)抗體引入所述細胞；（b)使在步驟(a)中產(chǎn)生的所述細胞維 持足W使所述胞內(nèi)抗體結(jié)合所述聚Q蛋白的一段時間，從而防止所述細胞中的聚Q蛋白的聚 集。
[0033] 在一些實施方案中，本發(fā)明包括一種預(yù)防由細胞中的聚谷氨酷胺(聚Q)蛋白的聚 集引起的基因失調(diào)的方法，所述方法包括：（a)將如本文所描述的所述胞內(nèi)抗體引入所述細 胞；（b)使在步驟(a)中產(chǎn)生的所述細胞維持足W使所述胞內(nèi)抗體結(jié)合所述聚Q蛋白或其片 段的一段時間，從而預(yù)防所述細胞中的一種或多種基因的基因失調(diào)。在一些方面，所述一種 或多種基因包括在表2中列出的基因。在另一個實施方案中，所述聚Q蛋白是亨廷頓蛋白 化ttpQ)蛋白質(zhì)。
[0034] 本發(fā)明的另一方面包括一種治療或管理患有與細胞中的聚谷氨酷胺蛋白的聚集 相關(guān)的疾病的受試者的方法，所述方法包括向需要所述治療或管理的受試者施用治療有效 量的如本文所描述的所述胞內(nèi)抗體。在一個實施方案中，所述疾病包括亨廷頓氏病、脊髓延 髓肌萎縮癥（SBMA)、齒狀核紅核蒼白球路易體萎縮癥（den tat or ubr a 1 and pallidoluysian atro曲y)或脊髓小腦共濟失調(diào)。在另一個實施方案中，所述聚谷氨酷胺蛋 白是亨廷頓蛋白化ttpQ)蛋白質(zhì)。在另一個實施方案中，所述受試者是哺乳動物。在其他實 施方案中，所述受試者是人。
[0035] 本發(fā)明包括一種包含氨基酸序列的單鏈胞內(nèi)抗體，其包含:可變重鏈互補決定區(qū)3 (CDR3)序列、可變輕鏈CDR3序列W及插入在所述可變重鏈CDR3序列與所述可變輕鏈CDR3序 列之間的接頭序列，其中所述可變重鏈CDR3序列包含SEQ ID NO:6,其中所述可變輕鏈CDR3 序列包含SEQ ID NO: 10,并且其中所述胞內(nèi)抗體能夠結(jié)合人化U蛋白的蛋白質(zhì)序列。在一些 實施方案中，所述可變重鏈CDR序列包含WPGYRKA(SEQ ID N0:6)。在其他實施方案中，所述 可變輕鏈CDR序列包含SYCASKGHWL(SEQ ID ^:10)。在其他實施方案中，所述可變重鏈〔01? 序列包含WPGY服A(SEQ ID N0:6)，并且其中所述可變輕鏈CDR序列包含SYCASKGHWL(SEQ ID NO: 10)。在一個實施方案中，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 1。在另一個實施方案中，所述 氨基酸序列由SEQ ID NO: 1組成。在另一個實施方案中，所述胞內(nèi)抗體結(jié)合化U蛋白中的一 個或多個表位。
[0036] 本發(fā)明還包括一種治療或管理患有阿爾茨海默氏病或其他化U病狀的受試者的方 法，所述方法包括向需要所述治療或管理的受試者施用治療有效量的本文所描述的胞內(nèi)抗 體。在一個實施方案中，所述胞內(nèi)抗體防止Tau片段與引起神經(jīng)元功能障礙的神經(jīng)元的結(jié) 厶 1=1 〇
[0037] 在一些實施方案中，本發(fā)明包括一種包含氨基酸序列的單鏈胞內(nèi)抗體，其包含:可 變重鏈互補決定區(qū)3(CDR3)序列、可變輕鏈CDR3序列W及插入在所述可變重鏈CDR3序列與 所述可變輕鏈CDR3序列之間的接頭序列，其中所述可變重鏈CDR3序列包含SEQ ID N0:6,其 中所述可變輕鏈CDR3序列包含SEQ ID NO: 10,并且其中所述胞內(nèi)抗體能夠結(jié)合人化U蛋白 的蛋白質(zhì)序列。
[0038] 在一個實施方案中，所述可變重鏈CDR序列包含WPGYRKA(SEQ ID N0:6)。在另一個 實施方案中，所述可變輕鏈〔03序列包含5￥〔45撕麗1^56〇10顯：10)。在一些實施方案中， 所述可變重鏈CDR序列包含WPGYRKA(SEQ ID ^):6)，并且其中所述可變輕鏈〔01?序列包含 5￥〔45撕麗1^569 10^:10)。在某些實施方案中，所述氨基酸序列包含569 10^:1。在另 一個實施方案中，所述氨基酸序列由SEQ ID NO: 1組成。在另一個實施方案中，所述胞內(nèi)抗 體結(jié)合Tau蛋白中的一個或多個表位。
[0039] 本發(fā)明包括一種治療或管理患有阿爾茨海默氏病或其他Tau病狀的受試者的方 法，所述方法包括向需要所述治療或管理的受試者施用治療有效量的本文所描述的胞內(nèi)抗 體。在一個實施方案中，所述胞內(nèi)抗體防止Tau片段與引起神經(jīng)元功能障礙的神經(jīng)元的結(jié) 厶 1=1 〇
[0040] 附圖的若干視圖的簡述
[0041] 根據(jù)W下說明和附圖將更好地理解本發(fā)明的運些和其他特征、方面和優(yōu)點，在附 圖中：
[0042] 圖（FIG. )la-ld示出選定胞內(nèi)抗體與聚脯氨酸膚的結(jié)合?？v軸被表示為在A = 404nM下的0D單位，并且橫軸是純化的胞內(nèi)抗體的濃度(nM)。圖la示出對INT4USEQ ID NO: 1)的結(jié)合。圖化示出對A2(SEQ ID N0:2)的結(jié)合。圖Ic示出對E10(SEQ ID N0:3)的結(jié)合。圖 Id示出對冊(SEQ ID N0:4)的結(jié)合。INT41是最強結(jié)合物，從而示出在較高胞內(nèi)抗體濃度下 的較高光密度。
[0043] 圖2示出使用LaserGene比對的選定scFv的序列W便確定關(guān)鍵和共有氨基酸。共有 序列（SEQ ID N0:5)被示出與INT4USEQ ID N0:1)、A2(SEQ ID N0:2)、E10(SEQ ID N0:3) 和冊（SEQ ID N0:4)比對。
[0044]圖3示出圖2中比對的胞內(nèi)抗體序列的可變重鏈序列和可變輕鏈序列。
[004引圖4示出INT41和類似的PRP特異性胞內(nèi)抗體的流式細胞術(shù)圖顯示對化化Q聚集的 抑制（未轉(zhuǎn)染的293T細胞(293T)的對照組；用非聚集化化Q30-GFP(PQ30)轉(zhuǎn)染的293T細胞； 用聚集化化Q103-GFP(PQ103)轉(zhuǎn)染的293T細胞；W及用聚集化化Q103-GFP(PQ103)和胞內(nèi)抗 體(INT41)轉(zhuǎn)染的293T細胞）。
[0046] 圖5示出通過GFP巧光測量的針對所測試的組(對照、PQ30、PQ103、PQ103+化pplt和 PQ103+INT41)制成表格的流式細胞術(shù)數(shù)據(jù)。
[0047] 圖6示出INT41對表現(xiàn)由化化Q引起的過度表達的基因的表達的作用。
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