抗pd1抗體及其作為治療劑與診斷劑的用圖
【專利說明】抗PD1抗體及其作為治療劑與診斷劑的用途
[0001] 發(fā)明背景
[0002] 程序性死亡-UProgrammed Death-1 ;PD-1，也稱為CD279)是一種與CD28/CTLA4共 同刺激/抑制受體家族相關(guān)的55KD受體蛋白質(zhì)（Blank等人，2005Cancer Immunol Immunother 54:307-314)。在小鼠及人類中克隆及表征了編碼PD-1的基因及cDNAQshida 等人，199沈MB0 J 11:3887-3395;Shinohara等人，1994Genomics 23:704-706)。全長PD-1 含有288個(gè)氨基酸殘基(NCBI登錄號(hào):NP_005009)。它的胞外域由氨基酸殘基1-167組成，而 胞質(zhì)C末端尾部包含殘基191-288,該尾部具有兩個(gè)假設(shè)性免疫調(diào)芐基序，一個(gè)是基于免疫 受體酪氨酸的抑制基序（ITIM;Vivier等人，1997Immunol Today 18:286-291 )，一個(gè)是免疫 受體酪氨酸轉(zhuǎn)換基序（ITSM;Chemnitz等人，2004J Immunol 173:945-954)。
[0003] 迄今為止，兩個(gè)序列相關(guān)配體PD-LUB7-H1)與PD-L2(B7-DC)已被鑒定為與PD-1特 異性相互作用，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，該細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制CD3及CD28介導(dǎo)的T細(xì)胞激活 (Ri 1巧，2009Immunol Rev 229:114-125)，繼而削弱T細(xì)胞活性(例如，減少細(xì)胞增殖、比-2 與IFN- γ分泌，W及其他生長因子及細(xì)胞因子分泌）。
[0004] 經(jīng)常在諸如Τ細(xì)胞、Β細(xì)胞、單核細(xì)胞及天然殺傷(ΝΚ)細(xì)胞等免疫細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)PD-1 的表達(dá)。PD-1很少在諸如肌肉、上皮、神經(jīng)元組織等其他人類組織中表達(dá)。此外，高水平的 PD-1表達(dá)常常與免疫細(xì)胞的激活關(guān)聯(lián)。舉例而言，當(dāng)藉由植物血球凝集素(ΡΗΑ)或佛波醇醋 (12-0-十四酷基佛波醇-13-乙酸醋或ΤΡΑ)激活人類Τ細(xì)胞系Jurkat時(shí)，在Western印跡中可 見PD-1的表達(dá)上調(diào)（Vibharka等人，1997EXP Cell Res 232:25-28)。在被抗CD3抗體刺激 后，在受刺激鼠類T淋己細(xì)胞及B淋己細(xì)胞中及在原代人類CD4巧細(xì)胞中觀察到相同現(xiàn)象 (Aga1:a等人，1996Int Immunol 8:765-772;Bennett等人，2003J Immunol 170:711-118)〇Τ 效應(yīng)細(xì)胞刺激后的PD-1表達(dá)增強(qiáng)使得朝耗竭及減少免疫活性方向再導(dǎo)向激活的Τ效應(yīng)細(xì) 胞。因此，PD-1介導(dǎo)的抑制信號(hào)在免疫耐受方面起到重要作用（Bour-Jordan等人， 2011Immunol Rev 241:180-205)〇
[0005] 在各種設(shè)及不同類型組織及器官的癌癥方面，報(bào)告了腫瘤浸潤淋己細(xì)胞(TIL)中 的PD-1表達(dá)及腫瘤細(xì)胞中的PD-1配體表達(dá)的增強(qiáng)，所述組織及器官諸如肺化onisM等人， 2004Clin Cancer Res 10:5094-5100)、肝（Shi等人，2008Int J Cancer 128:887-896;Gao 等人，2009Clin Cancer Res 15:971-979)、胃（Wu等人，2006Acta Histochem 108:19-24)、 腎（Thompson等人，2004Proc 化tl Acad Sci 101:17174-17179;Thompson等人，2007Clin Cancer Res 13:1757-1761)、乳腺（Ghebeh 等人，2006Neoplasia 8:190-198)、卵巢 (化manisM等人，2007Proc 化tl Acad Sci 104:3360-3365)、膜腺（Nomi等人，2007Clin Cancer Res 13:2151-2157)、黑素細(xì)胞化ino等人，2010Cancer 116:1757-1766)及食道 (OhigasM等人，2005Clin Cancer Res 11: 2947-2953)。更經(jīng)常地，那些癌癥中的PD-1 及 PD-Ll增強(qiáng)表達(dá)與患者生存結(jié)果的不良預(yù)后關(guān)聯(lián)。具有抑制異體移植癌細(xì)胞生長的PD-1基 因敲除的轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)一步闡明在癌癥根治或耐受的免疫系統(tǒng)調(diào)控中PD-1信號(hào)傳導(dǎo)的重 要性（Zhang 等人，2009Blood 114:1545-1552)。
[0006] PD-1信號(hào)傳導(dǎo)上調(diào)不僅導(dǎo)致對癌生長的免疫耐受，而且導(dǎo)致人類中的病毒感染及 擴(kuò)充。流行性肝感染病毒皿V及HCV誘導(dǎo)肝細(xì)胞中的PD-1配體的過度表達(dá)及激活Τ效應(yīng)細(xì)胞 中的PD-1信號(hào)傳導(dǎo)，從而引起Τ細(xì)胞耗竭及對病毒感染的耐受(Boni等人，2007J Virol 81: 4215-4225 ;Golden-Mason等人，2008J Immunol 180:3637-3641)。同樣地，HIV感染常常藉 由類似機(jī)制避開人類免疫系統(tǒng)。括抗劑分子對PD-1信號(hào)傳導(dǎo)的治療性調(diào)控可從耐受中反轉(zhuǎn) 免疫細(xì)胞，并經(jīng)再激活W根治癌癥及慢性病毒感染（Blank等人，2005Cancer Immunol Immunother 54:307-314;0kazaki等人，2007Int Immunol 19:813-824)。
[0007] 發(fā)明概述
[0008] 本發(fā)明提供PD-1的免疫抑制的方法及組合物。在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供一種抗 體抗原結(jié)合域，該抗體抗原結(jié)合域特異性結(jié)合人類PD-1，且包含具有選自序列編號(hào)11-22、 31-42及59-63的序列的互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)。
[0009] CDR可經(jīng)歷重組成為重鏈可變區(qū)（Vh)及輕鏈可變區(qū)（VK)，所述區(qū)分別包含（CDR-H1、CDR-H2及CDR-冊）及（CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3)序列，且保持特異于PD-1的結(jié)合及/或功 能性。
[0010] 在特定實(shí)施方案中，域包含重鏈可變區(qū)(化)或輕鏈可變區(qū)(VK)，所述可變區(qū)包含：
[0011]
[0012] 在特定實(shí)施方案中，域包含重鏈可變區(qū)（化)及/或輕鏈可變區(qū)(VK)，所述可變區(qū)包 含：
[0013] a)mu317 CDR-HUCDR-肥及CDR-冊（序列編號(hào) 11-13);
[0014] CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3 (序列編號(hào) 14-16);
[0015] b)mu326 CDR-HUCDR-肥及CDR-冊（序列編號(hào) 17-19);
[0016] CDR-LUCDR-L2及CDR-L3(序列編號(hào)20-22);
[0017] c)317-4B6 CDR-HUCDR-肥及CDR-冊（序列編號(hào)31-33);
[0018] CDR-LUCDR-L2及CDR-L3(序列編號(hào):34-36);
[0019] d)326-4A3 CDR-HUCDR-肥及CDR-冊（序列編號(hào)37-39);
[0020] CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3(序列編號(hào)40-42);
[0021] e)317-l CDR-HUCDR-肥及CDR-冊（序列編號(hào) 11、59、13);
[0022] CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3(序列編號(hào) 14-16);
[0023] f)317-4B2 CDR-HUCDR-肥及CDR-冊（序列編號(hào) 11、60、13);
[0024] 〔03-1^、〔01?-1^2及〔01?-1^3(序列編號(hào)61、15、16);
[00巧]g)317-4B5 CDR-HUCDR-肥及CDR-冊（序列編號(hào) 11、60、13);
[00%] 〔03-1^、〔01?-1^2及〔01?-1^3(序列編號(hào)61、15、16);
[0027] 11)317-486〔01?-化、〔01?-肥及〔01?-冊（序列編號(hào)11、32、13);
[0028] 〔03-1^、〔01?-1^2及〔01?-1^3(序列編號(hào)61、15、16);
[0029] 1)326-1〔03-化、〔01?-肥及〔01?-冊(序列編號(hào)17、62、19);
[0030] CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3(序列編號(hào)20-22);
[0031] j)326-3Bl CDR-HUCDR-肥及CDR-冊（序列編號(hào) 17、62、19);
[0032] CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3(序列編號(hào)20-22);
[0033] k)326-3Gl CDR-HUCDR-肥及CDR-冊（序列編號(hào) 17、62、19);及
[0034] CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3(序列編號(hào)20-22)。
[0035] 在特定實(shí)施方案中，域包含重鏈可變區(qū)(化)及輕鏈可變區(qū)(VK)，所述可變區(qū)包含：
[0036] (a)CDR-Hl (序列編號(hào)31)、CDR-H2(序列編號(hào)12、32、59或60)及〔03寸3(序列編號(hào) 33)，
[0037] CDR-L1(序列編號(hào)14、34或61)、CDR-L2(序列編號(hào)35)及CDR-L3(序列編號(hào)36);或
[0038] (b)CDR-Hl (序列編號(hào)37)、CDR-肥(序列編號(hào)18、38或62)及CDR-冊(序列編號(hào)39)，
[0039] CDR-L1 (序列編號(hào)40)、CDR-L2(序列編號(hào)41)及CDR-L3(序列編號(hào)42)。
[0040] 在特定實(shí)施方案中，域包含重鏈可變區(qū)(化)或輕鏈可變區(qū)(VK)，所述可變區(qū)包含：
[0041]
[0042]
[0043] 在特定實(shí)施方案中，域特異性結(jié)合PDl殘基：（a化45及193(基于2008PNAS，105: 10483進(jìn)行AA編號(hào);相當(dāng)于序列編號(hào)2中的K58及1106);或(b)I93、L95及P97(基于2008PNAS， 105:10483進(jìn)行44編號(hào);相當(dāng)于序列編號(hào)2中的1106、1^08及口110)。
[0044] 在特定實(shí)施方案中，域誘導(dǎo)與肥K293/0S8/PD-L1細(xì)胞或與肥K293/0S8/PD-L2細(xì)胞 共同培養(yǎng)的化T78/PD-1細(xì)胞中的化-2釋放，及/或抑制與皿K293/PD-L1細(xì)胞或與皿K293/ PD-L2細(xì)胞共同培養(yǎng)的化T78/P3Z細(xì)胞中的比-2分泌。
[0045] 本發(fā)明還提供一種抗體IgG4重鏈效應(yīng)器或恒定域，該效應(yīng)器或恒定域包含序列編 號(hào)83-88中的任一者，尤其是序列編號(hào)87或88。
[0046] 本發(fā)明還提供包含專屬PD-1結(jié)合域的抗體、F (ab)或F (ab) 2。
[0047] 本發(fā)明還提供抗體，所述抗體包含專屬PD-1結(jié)合域及IgG4重鏈效應(yīng)器或恒定域， 該效應(yīng)器或恒定域包含序列編號(hào)83-88中的任一者，尤其是序列編號(hào)87或88。
[004引本發(fā)明還提供一種編碼專屬PD-1結(jié)合域的多核巧酸，尤其是cDNA序列。
[0049] 本發(fā)明提供使用該專屬域的方法，該方法藉由向確定患有癌癥或病毒感染或確定 另外需要PD-1括抗作用的個(gè)人施用該域。
[0050] 本發(fā)明還提供融合蛋白，所述融合蛋白包含：（a)融合至小鼠 CD8a的C末端域（113-220)的抗人類CD3單抗0KT3的單鏈可變片段(scFv)(序列編號(hào)89);或(b)融合至人類CD3a連 的胞質(zhì)域的人類PD-1的胞外域及跨膜域(序列編號(hào)90)。
[0051] 本發(fā)明還提供使用該專屬融合蛋白的方法，該方法包含用表達(dá)融合蛋白的細(xì)胞系 檢定、篩選或選擇抗PD-1抗體。
[0化2] 附圖簡述
[0053] 圖1:PD-1/Fc(上圖）及PD-1/His(下圖）的示意性呈現(xiàn)。ECD:胞外域心接頭。H:His 標(biāo)簽。Fc:人類IgG4中的丫 4Fc片段。N:N末端。C:C末端。
[0054] 圖2:在化ISA中結(jié)合至人類PD-1的鼠類單抗的劑量依賴型反應(yīng)曲線。各圖的左上 角指示鼠類單抗。單抗317及517共享重鏈及輕鏈的可變區(qū)的高度同源性。藉由直接OD450讀 數(shù)指示結(jié)合信號(hào)強(qiáng)度?？乖璓D-l/HisW50微升的體積中增加濃度，至高達(dá)每孔70納克來包 被。在實(shí)施例1中描述該方法。
[0055] 圖3:藉由FACS分析產(chǎn)生的結(jié)合至活細(xì)胞上所表達(dá)的人類PD-1的鼠類單抗的劑量 依賴型反應(yīng)曲線。在各個(gè)小圖上指示鼠類抗體代碼及ECsodMFI代表巧光強(qiáng)度均值。使化T78/ PD-1細(xì)胞W每孔5xl04個(gè)細(xì)胞懸浮于96孔板中用于FACS。如實(shí)施例1中所描述執(zhí)行PD-1單抗 結(jié)合至細(xì)胞表面祀點(diǎn)及FACS檢測。
[0056] 圖4:用于檢定抗PD-1單抗的功能活性的細(xì)胞共同培養(yǎng)系統(tǒng)的示意性表示。T細(xì)胞 (CD4+或CD8+)表示HUT78/PD-1或PBMC中的原代T細(xì)胞。TCR: T細(xì)胞受體。N:細(xì)胞核。C:細(xì)胞質(zhì)。
[0057] 圖5:與肥K293/0S8/PD-L1細(xì)胞共同培養(yǎng)的HUT78/PD-1細(xì)胞中鼠類單抗誘導(dǎo)的IL-2分泌的劑量依賴型反應(yīng)曲線?；€:在所有受測試濃度下由mIgG所誘導(dǎo)的平均IL-2釋放。 頂線:基于Prizm Software回歸計(jì)算所得的最高IL-2釋放。
[005引圖6:(A)圖示與細(xì)胞系肥K293/0S8/PD-L1共同培養(yǎng)的PBMC(供體19)中抗PD-1單抗 所誘導(dǎo)的IFN- 丫分泌的直方圖。（B)圖示與細(xì)胞系肥K293/0S8/PD-L1共同培養(yǎng)的PBMC(供體 20)中抗PD-1單抗所誘導(dǎo)的IFN- 丫分泌的直方圖。
[0059] 圖7:(A)與(B)藉由共同培養(yǎng)效應(yīng)細(xì)胞(NK92MI/PD-1)及祀細(xì)胞化UT78/PD-1)所得 的抗PD-1單抗的ADCC活性。由代表性實(shí)驗(yàn)的兩個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)計(jì)算均值。將單抗添加到10μg/ml的 濃度。如實(shí)施例9中所描述執(zhí)行實(shí)驗(yàn)。
[0060] 圖8:藉由化ISA(上圖）及Western印跡(下圖）定位抗PD-1單抗的結(jié)合表位。使用含 有WT或Mt PD-1的條件培養(yǎng)基藉由化ISA及Western印跡評估結(jié)合活性。**指示單抗結(jié)合活 性降低至WT PD-1的25-50%的AA殘基。***指示單抗結(jié)合活性降低至WT PD-1的25% W下的 AA殘基。
[0061] 圖9:來自不同健康供體的原代人類PBMC中由人源化抗PD-1單抗所誘導(dǎo)的IFN-丫 釋放，原代人類PBMC與HEK293/0S8/PD-L1細(xì)胞共同培養(yǎng)。
[0062] 圖10:由人源化抗PD-1單抗hu317(A)及hu326(B)增強(qiáng)的NK92MI/PD-1細(xì)胞的細(xì)胞 毒性。祀肺癌細(xì)胞SK-MES-1/PD-L1與效應(yīng)細(xì)胞Wl:2的（T比E)比率共同培養(yǎng)，W及如實(shí)施例 12所述進(jìn)行檢定。
[0063] 圖11:Ξ個(gè)治療群組：媒劑（PBS)、人類IgG(huIgG)及抗PD-1單抗化U317-1/ IgG4mt2)中的個(gè)體腫瘤生長曲線。各個(gè)曲線表示腫瘤生長路徑，藉由各小圖右側(cè)指示數(shù)字 對負(fù)有腫瘤小鼠編代碼。在第1天時(shí)接種化P3B/0S8/PD-L1細(xì)胞（自肝細(xì)胞癌系化p3B建立）， 在第15天時(shí)植入PBMC，及在第18天、第28天及第38天時(shí)分別注射Ξ劑hu317-l/IgG4mt2。在 實(shí)施例12中描述方法。
[0064] 發(fā)明詳述
[0065] 當(dāng)被PD-1的配體PD-L1或PD-L2接合時(shí)，PD-1啟動(dòng)免疫細(xì)胞中的抑制性信號(hào)傳導(dǎo)。 在癌長出及病毒感染的情況下，PD-1信號(hào)傳導(dǎo)的激活促進(jìn)了免疫耐受，導(dǎo)致癌癥或病毒感 染細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視及癌癥轉(zhuǎn)移或病毒負(fù)荷增長。藉由治療劑抑制PD-1介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)傳 導(dǎo)可激活包括T細(xì)胞、B細(xì)胞及NK細(xì)胞在內(nèi)的免疫細(xì)胞，并因此增強(qiáng)抑制癌細(xì)胞生長或病毒 感染的免疫細(xì)胞功能，及恢復(fù)免疫監(jiān)視及免疫記憶功能W治療此類人類疾病。
[0066] 本發(fā)明提供抗體，運(yùn)些抗體的功能括抗免疫細(xì)胞中配體誘導(dǎo)及PD-1介導(dǎo)的細(xì)胞信 號(hào)傳導(dǎo)。鼠類抗PD-1抗體經(jīng)人源化為在框架區(qū)中高度類似于人類抗體。W經(jīng)修飾的人類 IgG4變體形式產(chǎn)生的全抗體在效應(yīng)器功能及物理化學(xué)特性的方面中具有獨(dú)特的特征集合。 所掲露抗PD-1抗體適合于癌癥治療、控制病毒感染及機(jī)制上設(shè)及加劇免疫耐