專利名稱：用于獲得抗體的方法
用于獲得抗體的方法本發(fā)明涉及用于提高重組抗體(尤其是治療性抗體)的生產(chǎn)及分離過程中的產(chǎn)量的方法。這些方法尤其適合用于治療性抗體的大規(guī)模工業(yè)制造。重組DNA技術(shù)已經(jīng)得到迅速的發(fā)展，尤其可用于生產(chǎn)抗體，特別是治療性抗體。用于表達(dá)重組基因的系統(tǒng)是相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。這些系統(tǒng)包括在哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、真菌細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和植物中進(jìn)行表達(dá)。對(duì)表達(dá)系統(tǒng)的選擇取決于所編碼蛋白質(zhì)的特征，例如是否具有翻譯后修飾。其他的考慮因素包括生產(chǎn)所需量的具有所需質(zhì)量的材料所花費(fèi)的時(shí)間和特別是成本。后者的這些考慮對(duì)于生產(chǎn)具有注冊(cè)審批所需的質(zhì)量并具有治療大量患者所需的量的治療性抗體尤其重要。最廣泛使用的用于生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的系統(tǒng)基于在大腸埃希氏桿菌(Escherichiacoli，大腸桿菌(E.coli))中的表達(dá)。使用大腸桿菌所面對(duì)的一個(gè)具體的問題在于難以生 產(chǎn)量以治療所需的量的具有所需質(zhì)量的材料。具體而言，所需的時(shí)間和成本太過高昂。值得注意的一個(gè)具體的問題是從大腸桿菌中提取抗體的過程中抗體的產(chǎn)量會(huì)有損失。盡管在比例上純化成本是治療性抗體產(chǎn)品的總成本的一部分，然而，純化成本的比例會(huì)隨著上游生產(chǎn)成本變得更便宜而進(jìn)一步增加。因此，在抗體的回收和純化上的改進(jìn)會(huì)驅(qū)動(dòng)生產(chǎn)成本進(jìn)一步下降，不論是何種生產(chǎn)方式(Humphreys&Glover, Curr. Opin. Drug Disc/’overy&Development, 2001, 4:172-185)。這樣，就需要方法向治療性抗體的生產(chǎn)中(具體而言是在純化中)引入時(shí)間和/或成本的節(jié)約，例如通過增加產(chǎn)品回收及或提高產(chǎn)品流的質(zhì)量。
通過發(fā)酵或培養(yǎng)途徑的低產(chǎn)品產(chǎn)量常常是在初級(jí)提取階段注意到的一個(gè)突出的問題；抗體的表達(dá)在細(xì)胞內(nèi)很高但在初級(jí)提取階段很難達(dá)到高百分比的回收。有方法部分地解決了后者的問題并使得能夠生產(chǎn)治療性應(yīng)用可接受的抗體，其在US 5，655，866中有所描述。此方法涉及使用熱處理以幫助將抗體的功能性Fab’片段從非功能性抗體中隨后分離出來，熱處理可在發(fā)酵或培養(yǎng)期間的任何時(shí)間進(jìn)行，或在抗體的提取和純化期間的任何階段進(jìn)行。在溫度升高到室溫以上時(shí)，功能性抗體非常地穩(wěn)定，而許多其他蛋白質(zhì)包括宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)及游離的輕鏈重鏈種類以及抗體的非功能性片段形成沉淀物和/或聚集物，可容易地在初級(jí)純化步驟如過濾或離心或流化床色譜中與功能性抗體相分離。細(xì)胞提取物是以US 5，655，866中描述的方法通過將完整的細(xì)胞在含有IOmM EDTA的Tris HCl緩沖液(IOOmM, pH7. 4)中孵育而制備的。W02006/054063描述了通過引入一種非裂解性處理與熱處理相組合，提高了初級(jí)提取階段功能性抗體的產(chǎn)量。此方法的要點(diǎn)是在離心后，將細(xì)胞沉淀重懸于含有IOOmMEDTA的IM Tris (pH7. 4)，隨后進(jìn)行非裂解處理，然后進(jìn)行熱處理。W02005/019466描述了在發(fā)酵之后但在包括提取的下游加工之前引入在限定的溫度和PH條件下的中斷步驟，提高了重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。發(fā)明概述本文描述的本發(fā)明是基于如下令人驚奇及出乎意料的觀察事實(shí)在培養(yǎng)用編碼重組抗體分子的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞樣品后，初級(jí)回收過程中所得樣品的PH的增加對(duì)抗體的產(chǎn)量有顯著有益的影響。在加工(如加熱)之前，抗體的pH起始范圍為6-9的，而出乎意料的是甚至在有緩沖的情況下PH還是下降，可能是由于細(xì)胞代謝的結(jié)果。本發(fā)明人現(xiàn)在認(rèn)為這對(duì)于產(chǎn)量/回收是極為有害的，并提出通過在恰當(dāng)?shù)臅r(shí)候在加工之前和/或之中調(diào)整材料的PH以確保pH處于目標(biāo)范圍內(nèi)來解決這一問題。已經(jīng)出乎意料地發(fā)現(xiàn)在熱處理步驟之前，樣品的pH對(duì)細(xì)胞樣品中的抗體產(chǎn)量有顯著的影響。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)將樣品的PH調(diào)整至在熱處理步驟前樣品的pH為6-9將使抗體產(chǎn)量提高多達(dá)40%。這使得在生產(chǎn)大量具有治療性質(zhì)量的功能性抗體的時(shí)間和成本上有巨大的有益節(jié)省。事實(shí)上，可能不再需要其他常用于提高產(chǎn)量的步驟以達(dá)到高水平抗體產(chǎn)量，如均質(zhì)化和穩(wěn)定步驟。在先前所用的方法中，例如在US 5，655，866中，細(xì)胞提取物是通過將完整的細(xì)胞在PH 7. 4的緩沖液中孵育而制備的。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，盡管添加了預(yù)期維持樣品pH在恒定水平的緩沖液，細(xì)胞樣品的PH事實(shí)上卻隨著時(shí)間逐漸降低。在特定的環(huán)境下，如添加緩沖液后經(jīng)過長時(shí)間，發(fā)現(xiàn)樣品的PH在熱處理步驟之前低至pH 5.5。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在熱處理之前檢測并 任選地調(diào)整pH以確保樣品的pH為6-9之間導(dǎo)致抗體產(chǎn)量的驚人提高。不希望受到理論的束縛，認(rèn)為在加工步驟如熱處理期間將pH維持在6-9的范圍內(nèi)非常重要。在加工(如熱處理步驟)之前調(diào)整PH有助于將pH維持在適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)。因此，在一方面，提供了抗體提取步驟，其中PH在幾乎整個(gè)加工過程的幾乎全部持續(xù)期中基本上維持在6-9的范圍內(nèi)。不受理論的約束，認(rèn)為本發(fā)明提供的方法使得能夠在初級(jí)分離過程中從細(xì)胞周質(zhì)中回收在標(biāo)準(zhǔn)提取條件下不會(huì)釋放的重組蛋白質(zhì)。因此，在本發(fā)明的第一方面，提供了用于生產(chǎn)重組抗體分子的方法，包括培養(yǎng)用編碼重組抗體分子的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞樣品；將提取緩沖液添加至樣品；以及對(duì)樣品進(jìn)行熱處理步驟；其中在添加提取緩沖液后檢測樣品的PH并任選地對(duì)其進(jìn)行調(diào)整，以確保在熱處理步驟前樣品的pH為6-9。在此階段對(duì)pH的監(jiān)測對(duì)建立pH控制是至關(guān)重要的。在一個(gè)備選的方面，提供了用于從用編碼重組抗體分子的表達(dá)載體轉(zhuǎn)換的宿主細(xì)胞樣品中提取重組抗體分子的方法；其包括以下步驟將所述細(xì)胞的組合物的pH調(diào)整到6-9的范圍內(nèi)，使得pH在隨后的提取步驟中維持在此范圍內(nèi)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行提取步驟，如熱處理步驟，其中在提取步驟前及/或當(dāng)中的至少一個(gè)時(shí)間點(diǎn)監(jiān)測pH。還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)提取緩沖液的pH的提高使得樣品經(jīng)過熱處理步驟后的抗體產(chǎn)量的驚人提聞。因此，本發(fā)明的第二方面提供了用于制造重組抗體分子的方法，包括培養(yǎng)用編碼重組抗體分子的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞樣品；將PH為7. 5-9. 0的提取緩沖液添加至樣品；以及對(duì)樣品進(jìn)行熱處理步驟。發(fā)明詳述如本文所使用的抗體分子意欲指代完全抗體或其結(jié)合片段，尤其是完全抗體或Fab片段。在本發(fā)明的第一個(gè)方面，在熱處理步驟前，樣品具有或被調(diào)整至pH為6-9。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，熱處理步驟之前的樣品具有pH6. 5-8. 5、pH 6. 5-8. O、pH 7. 0-9. 0、pH 7. 0-8. 5、pH 7. 0-8. 0、pH 7. 1-8. 0、pH 7. 5-8. 0、pH 7. 0-7. 8、pH 7. 1-7. 8、pH 7. 1-7. 7、pH 7. 2-7. 6、pH 7. 3-7. 5、pH 7. UpH 7. 2、pH 7. 3、pH 7. 4、pH 7. 5、pH 7. 6、pH 7. 7, pH 7. 8 或 pH 7. 9、如 pH 7. 4，尤其是 pH 6.8。本文提到的pH測量通常都標(biāo)準(zhǔn)化到20°C。本發(fā)明的方法中的熱處理步驟是在加熱期期間達(dá)到所需的高溫后，將樣品溫度維持在所需的高溫下的步驟。熱處理步驟的合適的溫度范圍包括30-70°C。在本發(fā)明的上下文中，詞句“熱處理步驟前”指的是在樣品達(dá)到所需 要的高溫及熱處理步驟(維持在高溫下)開始的時(shí)間點(diǎn)之前并包括此時(shí)間點(diǎn)。為了達(dá)到熱處理步驟所需的高溫，樣品會(huì)經(jīng)歷“加熱期”，其中樣品的溫度升高到所需的高溫。在一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的方法包括使樣品經(jīng)歷加熱期及熱處理步驟。在本發(fā)明的方法中，在熱處理步驟前，樣品具有pH 6-9，例如pH6. 8。在此上下文中，“熱處理步驟前”指的是在樣品達(dá)到熱處理步驟所需的高溫之前或在此時(shí)間點(diǎn)，樣品的PH處于所需的水平。在其中的方法包括在使樣品經(jīng)歷加熱期及熱處理步驟的實(shí)施方式中，樣品在加熱期開始之前可處于所需的PH水平和/或在加熱期期中處于所需pH水平。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，在加熱期開始之前樣品處于所需的pH水平，為pH
6-9。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于制造重組抗體分子的方法，包括培養(yǎng)用編碼重組抗體分子的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞樣品；將提取緩沖液添加至樣品；以及使樣品經(jīng)歷加熱期及熱處理步驟；其中在添加提取緩沖液后檢測樣品的PH，并任選地對(duì)其進(jìn)行調(diào)整，以確保在加熱期前樣品的PH為pH 6-9，例如為pH 7-9，如pH 7-8。在一個(gè)備選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于制造重組抗體分子的方法，包括培養(yǎng)用編碼重組抗體分子的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞樣品；將提取緩沖液添加至樣品；以及使樣品經(jīng)歷加熱期及熱處理步驟；其中在添加提取緩沖液后檢測樣品的PH并任選地對(duì)其進(jìn)行調(diào)整，以確保在加熱期中樣品的PH為6-9，優(yōu)選地為pH 6-8，更優(yōu)選地為pH6-7。在一個(gè)實(shí)施方式中，檢測樣品的pH并任選地對(duì)其進(jìn)行調(diào)整以確保樣品的pH在加熱期前為第一個(gè)pH,而在加熱期中處于第二個(gè)pH。優(yōu)選地,第一個(gè)和第二個(gè)pH水平優(yōu)選是不相同。優(yōu)選地，第二個(gè)PH低于第一個(gè)pH。因此，本發(fā)明提供了用于制造重組抗體分子的方法，包括培養(yǎng)用編碼重組抗體分子的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞樣品；將提取緩沖液添加至樣品；以及使樣品經(jīng)歷加熱期及熱處理步驟；其中在添加提取緩沖液后檢測樣品的PH并任選地對(duì)其進(jìn)行調(diào)整，以確保在加熱期前樣品的pH為7-9，優(yōu)選地為pH 7-8，并確保在加熱期中樣品的pH為pH 6-8，優(yōu)選地為pH 6-7。在此實(shí)施方式中，可在加熱期前檢測樣品pH并任選地加以調(diào)整，且任選地在加熱期中對(duì)其進(jìn)行調(diào)整。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，在加熱期前很短時(shí)間樣品具有pH 6-9，優(yōu)選地為pH
7-9，更優(yōu)選地為pH7-8。另外地或備選地，在加熱期中的熱處理步驟前很短時(shí)間(任選地包括樣品達(dá)到所需的高溫且熱處理步驟開始的時(shí)間點(diǎn))，樣品具有PH 6-9，優(yōu)選地為pH 6-8，更優(yōu)選地為pH 6-7。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在加熱期之前很短時(shí)間或熱處理步驟之前很短時(shí)間的樣品的pH對(duì)重組抗體的產(chǎn)量有顯著的影響。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“在……之前很短時(shí)間”優(yōu)選地指的是在加熱期或熱處理步驟之前30分鐘或更短、20分鐘或更短、15分鐘或更短、10分鐘或更短、5分鐘或更短、4分鐘或更短、3分鐘或更短、2分鐘或更短、I分鐘或更短、30秒鐘或更短、10秒鐘或更短、5秒鐘或更短、I秒鐘或更短的時(shí)間內(nèi)。術(shù)語“在……之前很短時(shí)間”還可包括在加熱期開始或熱處理步驟開始時(shí)的溶液pH為6-9。在添加提取緩沖液后檢測樣品的pH。樣品的pH可使用本領(lǐng)域已知的任何合適的pH測量設(shè)備檢測。樣品的pH可在所述方法中的一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立的時(shí)間點(diǎn)檢測，如在添加提取緩沖液的時(shí)間點(diǎn)、添加提取緩沖液之后很短時(shí)間、加熱期開始之前很短時(shí)間、加熱期開始的時(shí)間點(diǎn)、加熱期當(dāng)中(包括樣品達(dá)到熱處理步驟所需的高溫的時(shí)間點(diǎn))、熱處理步驟中及熱處理步驟之后。備選地，樣品的PH通過連續(xù)監(jiān)測而檢測。在其中對(duì)樣品pH進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測的實(shí)施方式中，優(yōu)選地，在培養(yǎng)細(xì)胞的步驟之后，優(yōu)選地從培養(yǎng)后的離心步驟之后直到熱處理步驟開始，對(duì)樣品的pH進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，從添加提取緩沖液的時(shí)間點(diǎn)直到熱處理步驟開始，對(duì)樣品的PH進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測。然而，還可在培養(yǎng)步驟中和 /或在熱處理步驟中對(duì)PH進(jìn)行監(jiān)測。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，加熱步驟的pH概況受到控制。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，檢測樣品的pH，并任選地對(duì)其進(jìn)行調(diào)整，然后當(dāng)樣品達(dá)到所需pH時(shí)，(優(yōu)選地自動(dòng))開始加熱期。在培養(yǎng)細(xì)胞樣品步驟后加入提取緩沖液。如果所述方法包括在培養(yǎng)步驟后進(jìn)行離心步驟，則可在離心步驟之前和/或之中和/或之后加入提取緩沖液。優(yōu)選地，在離心步驟之后加入提取緩沖液以重懸離心形成的細(xì)胞沉淀物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，提取緩沖液具有合適的pH，可確保在熱處理步驟前樣品的PH為pH 6-9，例如為pH 6-8。在其中提取緩沖液具有合適的pH以確保在熱處理步驟前樣品的PH為pH 6-9，例如為pH 6-8實(shí)施方式中，所述提取緩沖液例如具有的pH為pH7. 5-9. O、pH 7. 5-8. 8、pH 7. 5-8. 5、pH 8. 0-9. 0、pH 8. 5-9. 0、pH 8. 6-8. 9、pH 8. 0、pH8. I、pH 8. 2、pH 8. 3、pH 8. 4、pH 8. 5、pH 8. 6、pH 8. 7、pH 8. 8、pH 8. 9 或 pH 9. 0。優(yōu)選地，加熱期和熱處理步驟是在加入提取緩沖液后很快進(jìn)行，優(yōu)選地是隨后立即進(jìn)行，這樣確保樣品在熱處理步驟之前具有所需的pH。例如，加熱期或熱處理步驟可在加入提取緩沖液后4小時(shí)或更短、3小時(shí)或更短、2小時(shí)或更短、I小時(shí)或更短、30分鐘或更短、10分鐘或更短或5分鐘或更短的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行。因此，本發(fā)明的方法可能不需要樣品的pH調(diào)整的步驟。樣品pH可在加入提取緩沖液后檢測，維持在所需的pH 6-9范圍內(nèi)。這可能例如為如上文所描述的提取緩沖液的pH適合于將樣品PH調(diào)整到6-9的情況，例如，其中提取緩沖液具有pH 7. 5-9. 0而熱處理步驟隨后很快進(jìn)行。然而，通常由于加入提取緩沖液和熱處理步驟之間的時(shí)間間隔，除了添加提取緩沖液可能引起的任何PH的調(diào)整之外，根據(jù)本發(fā)明的方法還需要檢測并調(diào)整樣品pH的步驟以確保樣品的PH在熱處理步驟之前為6-9。在其中的方法包括pH檢測和調(diào)整的此實(shí)施方式中，提取緩沖液的pH可為低于pH8，如 pH 7. 4 或更低，例如為 pH 6. 0-7. 4, pH 6. 5-7. 4 或 pH 7. 0-7. 4，如 pH 6.8。
備選地，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，提取緩沖液的為pH 7. 5-9. O、pH 7. 5-8. 8、pH
7.5-8. 5、pH 8. 0-9. 0、pH 8. 5-9. 0、pH 8. 6-8. 9、pH 8. 0、pH 8. UpH 8. 2、pH 8. 3、pH 8. 4、pH 8. 5, pH 8. 6, pH 8. 7, pH 8. 8、pH、8. 9、pH 9.0，最優(yōu)選地為 pH 8.0。在此實(shí)施方式中，樣品pH可通過任何合適的方式在所述方法的任何合適的時(shí)間得到調(diào)整。樣品PH可在加入提取緩沖液之前和/或之后進(jìn)行調(diào)整。
在一個(gè)實(shí)施方式中，樣品的pH在加入提取緩沖液之前進(jìn)行調(diào)整。在此實(shí)施方式中，如果所述方法包括培養(yǎng)步驟后的離心步驟，則可在離心步驟之前和/或之后進(jìn)行PH調(diào)整步驟。在培養(yǎng)細(xì)胞之后，任選地在離心后，樣品PH—般較低。例如，樣品可能具有的pH為大約pH5. 5。因此，在培養(yǎng)細(xì)胞后和任選地在一個(gè)或多個(gè)附加的步驟如離心后，可調(diào)整樣品的pH。例如，樣品的pH可在加入提取緩沖液前調(diào)整到pH 6. 5-8. O、優(yōu)選地為pH 7. 0-8. O、pH 6. 5-7. 5、pH 6. 6-7. 4、pH 6. 7-7. 3、pH 6. 8-7. 2、pH 6. 9-7. 1，最優(yōu)選地為 pH 6. 9。在一個(gè)其中加入提取緩沖液前的樣品pH低于pH 7 (如，為pH6. 9)而所要求的熱處理步驟前的樣品PH為pH 7-9的實(shí)施方式中，樣品pH需要通過添加提取緩沖液和/或通過添加提取緩沖液后進(jìn)行其他的PH調(diào)整而進(jìn)一步提高，使得樣品pH在熱處理步驟之前為
7-9。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，在加入提取緩沖液后、熱處理步驟前將樣品pH調(diào)整到pH6-9。在此階段，優(yōu)選地將樣品調(diào)整到pH 7. 0-9. O、pH 7. 0-8. 5、pH 7. 0-8. O、pH 7. 1-8. 0、pH 7. 5-8. 0、pH 7. 0-7. 8、pH 7. 1-7. 8、pH 7. 1-7. 7、pH 7. 2-7. 6、pH 7. 3-7. 5、pH 7. 1、7. 2、7. 3、7. 4、7. 5、7. 6、7. 7、7. 8 或 7. 9，最優(yōu)選的為 pH 7. 4。在一個(gè)實(shí)施方式中，在加熱期前調(diào)整樣品的pH。優(yōu)選地，在加熱期前將樣品pH調(diào)整至pH 7-9、優(yōu)選地為pH 7-8。備選地或另外地，在加熱期中調(diào)整樣品的pH調(diào)整。優(yōu)選地，在加熱期中將樣品pH調(diào)整到pH6-8，優(yōu)選地為pH 6-7。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，在熱處理步驟前，優(yōu)選地在加熱期前，更優(yōu)選地是在加熱期前很短時(shí)間將具有pH為7. 4或pH 8的提取緩沖液加入樣品并檢測樣品pH，隨后將其調(diào)整到PH 7. 4。在其中樣品的pH是在加入提取緩沖液后進(jìn)行檢測并在熱處理步驟前進(jìn)行調(diào)整的實(shí)施方式中，可在加熱期開始前檢測和調(diào)整樣品pH。另外地或備選地，可在加熱期中檢測和調(diào)整樣品pH。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，樣品的pH是在加熱期前立即檢測和調(diào)整的。另外地或備選地，在加熱期的熱處理步驟前(任選地包括樣品達(dá)到所需的高溫且熱處理步驟開始的時(shí)間點(diǎn))立刻對(duì)樣品的PH進(jìn)行檢測和調(diào)整。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“在……前很短時(shí)間”優(yōu)選地表示在加熱期之前或在熱處理步驟之前30分鐘或更短、20分鐘或更短、15分鐘或更短、10分鐘或更短、5分鐘或更短、4分鐘或更短、3分鐘或更短、2分鐘或更短、I分鐘或更短、30秒鐘或更短、10秒鐘或更短、5秒鐘或更短、I秒鐘或更短的時(shí)間內(nèi)檢測樣品的pH并將其調(diào)整至pH 6-9。術(shù)語“在……之前很短時(shí)間”還可包括在加熱期開始或熱處理步驟開始時(shí)進(jìn)行檢測和調(diào)整的溶液pH。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，在檢測到樣品PH為pH 6-9時(shí)，(優(yōu)選地自動(dòng))引發(fā)加熱期和/或熱處理步驟。樣品的pH可通過如上文所述的任何單一或多重pH調(diào)整步驟進(jìn)行檢測和調(diào)整。因此，pH可在以下階段進(jìn)行調(diào)整 只在加入提取緩沖液前； 只在加入提取緩沖液后而在熱處理步驟前；或 在加入提取緩沖液前以及在加入提取緩沖液后而在熱處理步驟前。在加入提取緩沖液后可多次調(diào)整pH，例如調(diào)整1、2、3、4或更多次。在一個(gè)實(shí)施方式中，對(duì)樣品的pH進(jìn)行連續(xù)調(diào)整，優(yōu)選地在加入提取緩沖液和熱處理步驟前之間進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方式中，可在熱處理步驟中另外地檢測樣品的pH并任選地對(duì)其進(jìn)行調(diào)整。因此，根據(jù)本發(fā)明的方法可進(jìn)一步包括在熱處理步驟中調(diào)整樣品PH的步驟。優(yōu)選地， 在熱處理步驟中將樣品的 pH 調(diào)整到 pH 6. 0-9. 0、pH 6. 5-8. 5、pH 6. 5-8. 0、pH 7. 0-9. 0、pH
7.0-8. 5、pH 7. 0-8. 0、pH 7. 1-8. 0、pH 7. 5-8. 0、pH 7. 0-7. 8、pH 7. 1-7. 8、pH 7. 1-7. 7、pH
7.2-7. 6、pH 7. 3-7. 5、pH 7. 1、7. 2、7. 3、7. 4、7. 5、7. 6、7. 7、7. 8 或 7. 9。在根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了用于制造重組抗體分子的方法，包括培養(yǎng)用編碼重組抗體分子的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞樣品；將具有pH 7. 5-9. 0的提取緩沖液添加至樣品；以及對(duì)樣品進(jìn)行熱處理步驟。如上文本文第一方面所描述的，提取緩沖液優(yōu)選地具有pH7. 5-9. O、pH 7. 5-8. 8、pH 7. 5-8. 5、pH 8. 0-9. 0、pH 8. 5-9. 0、pH 8. 6-8. 9、pH 8. 0、pH 8. I、pH 8. 2、pH 8. 3、pH
8.4, pH 8. 5, pH 8. 6, pH 8. 7, pH 8. 8、pH、8. 9或pH 9.0。在本發(fā)明的這個(gè)方面，檢測樣品的pH不那么重要。根據(jù)本發(fā)明的第二方面的方法可包括如本發(fā)明第一方面中描述地檢測樣品PH進(jìn)行并調(diào)整樣品pH。然而，包括檢測pH或調(diào)整pH的步驟并不緊要。在一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明第二方面的方法不包括檢測樣品PH的步驟或調(diào)整pH的步驟。以下的本發(fā)明詳述適用于本發(fā)明第一和第二方面的實(shí)施方式。pH調(diào)整試劑及提取緩沖液對(duì)pH的調(diào)整必須使得熱處理步驟中的pH保持/維持在所需的pH6_9的范圍內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方式中，pH是用堿進(jìn)行調(diào)整的，如無機(jī)堿，例如氫氧化鈉，或有機(jī)堿如
三乙胺或三甲胺。任何合適的試劑可用于調(diào)整樣品的pH。所述試劑可以為提取緩沖液，或者可在提取緩沖液之前和/或之后加入。典型的可用于調(diào)整PH的試劑包含或由一種或多種以下物質(zhì)組成Na0H、NH40H、硫酸、EDTA、Tris緩沖液。優(yōu)選地，樣品的pH是使用堿(如氫氧化鈉或氫氧化銨)進(jìn)行調(diào)整的。在一個(gè)實(shí)施方式中，提取緩沖液為Tris (羥甲基)甲胺/無水乙二胺四乙酸二鈉鹽(Tris/EDTA)緩沖液，一般通過加入HCl將其調(diào)整至所需的pH。不受任何理論的約束，人們認(rèn)為Tris和EDTA協(xié)同作用使脂多糖(LPS)從大腸桿菌外膜中釋放出來。EDTA移除穩(wěn)定化外膜中的LPS的二價(jià)陽離子。人們認(rèn)為Tris結(jié)合于LPS并取代Ca2+和Mg2+。這使LPS分子之間的相互作用降低，因此導(dǎo)致外膜產(chǎn)生通透性增加(Vaara，M. 1992. AgentsThat Increase the Permeability of the Outer Membrane. American Society forMicrobiology56:395-411)。熱處理步驟優(yōu)選地，本發(fā)明的方法中的熱處理步驟如US 5，665，866 (其內(nèi)容通過引用并入本文)中詳細(xì)描述的。熱處理步驟通過有助于其他抗體相關(guān)材料的移除使得有可能獲得可溶的、正確折疊及裝配的抗體樣品?！罢_折疊和裝配”的抗體表現(xiàn)為非還原性SDS PAGE上出現(xiàn)的對(duì)應(yīng)于裝配的重鏈和輕鏈的預(yù)期分子量的單一條帶。其他抗體相關(guān)材料一般為游離的重鏈和輕鏈或其部分，以及正確折疊和裝配的抗體的部分降解的片段。熱處理步驟是通過使樣品達(dá)到所需的高溫而進(jìn)行。最優(yōu)選地，熱處理步驟是在30°C-70°C的范圍內(nèi)進(jìn)行的。溫度可根據(jù)需要或根據(jù)進(jìn)行純化的抗體的穩(wěn)定性而選擇。在另一個(gè)實(shí)施方式中，溫度在40°C _65°C的范圍內(nèi)，或優(yōu)選地在40°C _60°C的范圍內(nèi)，更優(yōu)選地在45°C _60°C的范圍內(nèi)，甚至更優(yōu)選地在50°C -60°C的范圍內(nèi)，最優(yōu)選地為在55°C _60°C、58°C -60°C或?yàn)?9°C。因此，最低的溫度為30°C、35°C或40°C，最高溫度為60°C、65°C或70。。。優(yōu)選地，熱處理步驟會(huì)持續(xù)一段長期的時(shí)間。熱處理的時(shí)間長度優(yōu)選地在1-24小時(shí)之間，更優(yōu)選地為4-18小時(shí)之間，甚至更優(yōu)選地在6-16小時(shí)之間，最優(yōu)選地在10-14小 時(shí)或10-12小時(shí)之間，例如為12小時(shí)。因此，熱處理的最短時(shí)間為1、2或3小時(shí)，最長為20,22或24小時(shí)。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，熱處理在50°C -60°C下進(jìn)行10-16小時(shí)，更優(yōu)選地在59°C下進(jìn)行10-12小時(shí)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解的是，溫度和時(shí)間可為適應(yīng)要處理的樣品及生產(chǎn)中的抗體的特征而選擇。在一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本公開的方法不包括在進(jìn)行熱處理步驟之前的將細(xì)胞維持在控制條件下的預(yù)處理步驟。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于制造重組抗體分子的方法，包括培養(yǎng)用編碼重組抗體分子的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞樣品及將提取緩沖液添加至樣品，以及在40°C _70°C的范圍內(nèi)(優(yōu)選地為59°C)對(duì)樣品進(jìn)行長達(dá)15小時(shí)(優(yōu)選地為10-12小時(shí))的熱處理步驟；其中在熱處理步驟前(優(yōu)選地為在加熱期前很短時(shí)間)監(jiān)視并調(diào)整樣品的PH以使樣品的pH為pH 7-8，優(yōu)選地為pH 7.4。優(yōu)選地，將具有pH為7. 4或8. 0的提取緩沖液加入樣品。優(yōu)選地，熱處理步驟在設(shè)定為合適的RPM的搖床上進(jìn)行，如200RPM。然而，合適的RPM要根據(jù)所述方法的規(guī)模而變化。發(fā)酵培養(yǎng)宿主細(xì)胞樣品的步驟可包括任何所需規(guī)模的發(fā)酵。在本發(fā)明的方法中，樣品可以為發(fā)酵產(chǎn)物包括細(xì)菌，尤其是革蘭氏陰性細(xì)菌，或酵母、細(xì)胞培養(yǎng)物，例如但不限于哺乳動(dòng)物或昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)物。最優(yōu)選地，樣品為發(fā)酵產(chǎn)物，包括表達(dá)重組抗體的大腸桿菌，其中產(chǎn)生的所述抗體可以為功能性和非功能性抗體的混合物。如有需要,宿主細(xì)胞可從發(fā)酵培養(yǎng)基中收集，例如，宿主細(xì)胞可通過離心、過濾或通過濃縮收集自樣品。具體而言，本發(fā)明的方法適合于具有治療性質(zhì)量的抗體的大規(guī)模工業(yè)制造。其他步驟根據(jù)本發(fā)明的方法可包括一個(gè)或多個(gè)其他步驟。在一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的方法包括培養(yǎng)步驟后的離心步驟，隨后通過加入提取緩沖液重懸細(xì)胞。所述方法可以另外包括初級(jí)純化方法如過濾及/或離心。流化床色譜也包括在內(nèi)。優(yōu)選的下游純化方法包括離子交換色譜、微濾、超濾、滲濾以及固定床捕獲和膨脹床捕獲，以及這些的任何組合。非裂解性處理步驟所述方法可進(jìn)一步包括在使樣品進(jìn)行熱處理步驟之前對(duì)樣品進(jìn)行非裂解性處理步驟。此步驟還可稱為均質(zhì)化步驟(均化步驟)。非裂解性處理步驟可進(jìn)一步增加所分離或獲得的功能性抗體的產(chǎn)量并簡化大規(guī)模的樣品處理。裂解導(dǎo)致粘稠度的增加，這可在對(duì)功能性抗體的下游加工和純化中產(chǎn)生問題。具體而言，宿主細(xì)胞的裂解導(dǎo)致宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的釋放，使得純化變得更耗費(fèi)時(shí)間和金錢，因?yàn)榭赡苄枰嗟募兓襟E且/或需要更大量的色譜材料以達(dá)到所需的純度。宿主細(xì)胞DNA幾乎全部釋放增加了樣品的粘稠度，引起過濾和離心的困難，這是澄清過程中蛋白質(zhì)損失的主要原因。裂解的樣品(即，含有宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)和DNA的樣品)還可引起色譜材料的阻塞。優(yōu)選地，如WO 2006/054063(其內(nèi)容通過引用并入本文)中所描述的方法進(jìn)行非裂解性處理步驟。如WO 2006/054063所描述的，非裂解性處理步驟包括不產(chǎn)生細(xì)菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母、昆蟲細(xì)胞或其他用于重組抗體表達(dá)的生物體(如大腸桿菌)的相當(dāng)大的比例的裂解的任何處理。在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方式中，·非裂解性處理包括壓力處理。備選地，非裂解性處理包括搖動(dòng)或攪拌等預(yù)調(diào)節(jié)步驟。“相當(dāng)大的比例”包括發(fā)酵物或培養(yǎng)物中80%或更多比例的生物體以完整形式存在，更優(yōu)選地為超過85%，甚至更優(yōu)選地為超過90%，最優(yōu)選地為95%或更多為完整形式。裂解可以以任何本領(lǐng)域已知的方式進(jìn)行判斷，包括通過顯微鏡下觀察、熒光激活細(xì)胞分選(FACS)分析及對(duì)總蛋白質(zhì)相比于上清和/或生物體(細(xì)胞)沉淀中的蛋白質(zhì)的測定。在一個(gè)實(shí)施方式中，可在非裂解性處理后通過比較處理前后的樣品中總蛋白質(zhì)而判斷是否有裂解發(fā)生。如果處理引起了裂解，經(jīng)處理的樣品上清中存在的總蛋白質(zhì)相比于所述未處理樣品中存在的總蛋白質(zhì)的量會(huì)增加，例如使用Bradford測定法進(jìn)行測量。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，進(jìn)行FACS分析，其中將樣品用熒光染料進(jìn)行標(biāo)記隨后進(jìn)行非裂解性處理及FACS分析。最優(yōu)選地，在處理前進(jìn)行FACS分析以給出用于比較的基線值。因此，非裂解性處理可包括在例如緩沖液中，通過在一段時(shí)間內(nèi)進(jìn)行輕柔的重懸進(jìn)行預(yù)調(diào)節(jié)，例如通過搖動(dòng)或攪拌，或通過手動(dòng)重懸如通過槍頭吹打。在一個(gè)實(shí)施方式中，預(yù)調(diào)節(jié)要進(jìn)行1-24小時(shí)，更優(yōu)選地為I小時(shí)-20小時(shí)，更優(yōu)選地為2小時(shí)-18小時(shí)、4小時(shí)-16小時(shí)、6小時(shí)-16小時(shí)，最優(yōu)選地為12、14或16小時(shí)。因此，預(yù)調(diào)節(jié)的最短時(shí)間為1、2或4小時(shí)而最長時(shí)間為16、18或24小時(shí)。預(yù)調(diào)節(jié)可通過以50-250rpm旋轉(zhuǎn)而進(jìn)行、優(yōu)選地以60rpm-100rpm，并且最優(yōu)選地進(jìn)行14或16小時(shí)。在預(yù)調(diào)節(jié)過程中，細(xì)胞維持在4°C -30°C的溫度范圍內(nèi)，更優(yōu)選地為4°C -20°C之間，最優(yōu)選地為維持在室溫。在一個(gè)實(shí)施方式中，預(yù)調(diào)節(jié)步驟不包括加工的部分。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，非裂解性處理包括使宿主細(xì)胞經(jīng)受高壓，例如使用法式壓濾或氮減壓。在一個(gè)特異性實(shí)施例中，樣品為大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)物，所述大腸桿菌表達(dá)重組抗體，其在法式壓濾中受到壓力處理。壓力范圍可為750psi或附近到5000psi或附近。在一個(gè)實(shí)施方式中，壓力處理是在 IOOOpsi 或 1250psi、1500psi、1750psi、2000psi、2250psi、2500psi、2750psi、3000psi、3250psi、3500psi、4000psi、4250psi、4500psi 或 4750psi 下進(jìn)行的。更優(yōu)選地，壓力處理是在1000psi-3000psi進(jìn)行的，最優(yōu)選地在2000psi下進(jìn)行。壓力處理幾乎是非裂解性的(即，少于20%的裂解)，可通過簡單的實(shí)驗(yàn)而確定，取決于緩沖液和包含樣品的細(xì)胞類型，以及壓力。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法不包括如上文所描述的非裂解處理步驟，如使宿主細(xì)胞受到增加的壓力或在一段時(shí)間內(nèi)通過輕柔的重懸進(jìn)行預(yù)調(diào)節(jié)。已知包括這樣的非裂解性處理步驟能夠提高重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)量(W0 2006/054063)。然而，我們驚人地發(fā)現(xiàn)是通過包括或不包括這種非裂解性處理步驟的本發(fā)明的方法達(dá)到抗體產(chǎn)量的提高。因此，在其中的方法不包括非裂解性處理步驟的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了制造重組抗體的更簡化節(jié)約的方式。穩(wěn)定步驟在一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的方法包括在培養(yǎng)宿主樣品步驟和加入提取緩沖液之間中斷所述方法的步驟。在中斷步驟中，將樣品穩(wěn)定在合適的溫度下。優(yōu)選地，按WO2005/019466中所描述的方法進(jìn)行中斷所述方法的該步驟。此步驟還可稱為細(xì)胞漿穩(wěn)定步驟(CSH)。優(yōu)選地，所述方法至少被中斷一個(gè)小時(shí)、I小時(shí)-72小時(shí)、12小時(shí)-48小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、33小時(shí)或48小時(shí)的階段。 優(yōu)選地，在所述方法的中斷過程中將樣品穩(wěn)定在合適的溫度下，如18°C。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法不包括在培養(yǎng)宿主細(xì)胞樣品步驟后的中斷步驟，如WO 2005/019466中所描述的。已知包括這樣的中斷能提高重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)量(W02005/019466 )。我們驚人地發(fā)現(xiàn)是通過包括或不包括這種中斷步驟的本發(fā)明的方法達(dá)到抗體產(chǎn)量上類似的提高，即當(dāng)在所述方法中包括中斷步驟時(shí)沒有觀察到產(chǎn)量的進(jìn)一步增加。因此，在其中的方法不包括中斷步驟的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了制造重組抗體的更簡化節(jié)約的方式。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，培養(yǎng)宿主細(xì)胞樣品的步驟和加入提取緩沖液的步驟之間的時(shí)間段少于12小時(shí)，優(yōu)選地為10小時(shí)或更少、5小時(shí)或更少、4小時(shí)或更少、3小時(shí)或更少、2小時(shí)或更少、I小時(shí)或更少或少于I小時(shí)。抗體如本文所使用的，“功能性抗體”包括保留了特異性識(shí)別或結(jié)合于同源抗原(這些抗體是針對(duì)其而產(chǎn)生的)的能力的抗體分子。功能性抗體的產(chǎn)生表現(xiàn)為非還原性SDS-PAGE上出現(xiàn)的對(duì)應(yīng)于所述抗體的預(yù)期分子量的單一條帶或通過使用BIAcore或其他本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行直接測定，例如但不限于ELISA。非功能性抗體包括不識(shí)別其同源抗原的片段，并包括不正確折疊或不正確裝配的抗體、游離重鏈和輕鏈及其片段，包括抗體的不識(shí)別或結(jié)合于其同源抗原的部分降解片段。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，重組抗體分子為至少部分的抗體輕鏈和至少部分的抗體重鏈，這樣使得至少一些所表達(dá)的輕鏈和重鏈抗體分子能夠組合形成功能性抗體。如本文所使用的，“抗體”包括具有全長重鏈和輕鏈的抗體；其功能性活性片段、衍生物或類似物，并可以為但不限于VH、VL、VHH、Fab、修飾的Fab、變化的鉸鏈區(qū)Fab、Fab’、F(ab’)2 *Fv片段；輕鏈或重鏈單體或二聚體；單鏈抗體如單鏈Fv，其中重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域通過肽連接子相連，或雙特異性抗體，如Fab-dAb，如PCT/GB2008/003331中所描述?？贵w可為多克隆、單克隆、二價(jià)、三價(jià)或四價(jià)抗體、人源化或嵌合抗體。這些抗體及其片段可以是天然發(fā)生的、人源化的、嵌合的或CDR移植抗體，如有需要，可使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)修飾、添加或刪除氨基酸或結(jié)構(gòu)域。人源化抗體為來自非人物種的抗體，其具有一個(gè)或多個(gè)來自所述非人物種的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)以及來自人的免疫球蛋白分子的骨架區(qū)(見，例如US 5，585，089)。使用本發(fā)明的方法純化的抗體分子可為免疫球蛋白分子的任何類別(例如，IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)或亞類。用于產(chǎn)生這些抗體分子的方法在本領(lǐng)域已知(見例如，Shrader等人，WO 92/02551 ;Ward 等人，1989，Nature, 341: 544 ; Orlandi 等人，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:3833;Riechmann 等人，1988，Nature, 322:323;Bird etal,1988，Science,242:423;Queen 等人，US5,585，089;Adair, W091/09967;Mountainand Adair, 1992，Biotechnol. Genet. Eng. Rev, 10:1-142;Verma 等人，1998，Journal ofImmunological Methods, 216:165-181)。單克隆抗體可通過本領(lǐng)域已知的任何方法制備，如雜交瘤技術(shù)(Kohler&Milstein, 1975, Nature, 256:495-497)、三源雜交瘤技術(shù)、人B-細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等人，1983, Immunology Today, 4:72)及 EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole 等人,Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy, pp77-96, Alan R Liss, Inc.，1985)。嵌合抗體為由經(jīng)過遺傳改造的免疫球蛋白基因編碼的那些抗體，所述遺傳改造使 得輕鏈和重鏈基因由屬于不同物種的免疫球蛋白基因片段組成。這些嵌合抗體的抗原性可能較低。二價(jià)抗體可通過本領(lǐng)域已知的方法產(chǎn)生(Milstein等人，1983，Nature 305:537-539;TO93/08829, Traunecker 等人，1991，EMBO J. 10:3655-3659)。二價(jià)、三價(jià)和四價(jià)抗體可包括多重特異性，或?yàn)閱翁禺愋?見例如W092/22853)。抗體序列還可使用單一淋巴細(xì)胞抗體法生成，其基于產(chǎn)生自被選擇用于生產(chǎn)特異性抗體的單一淋巴細(xì)胞的免疫球蛋白可變區(qū)cDNA的分子克隆和表達(dá)，如Babcook，J.等人，1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(15) :7843-7848及TO 92/02551 中所描述的。后者的方法依賴于個(gè)別產(chǎn)生抗體的細(xì)胞的分離，然后將其進(jìn)行克隆擴(kuò)增，隨后篩選出產(chǎn)生識(shí)別其同源抗原的抗體的克隆，如果需要，隨后對(duì)其可變重鏈(Vh)和輕鏈(')基因的序列進(jìn)行鑒定。備選地，可在篩選后將產(chǎn)生識(shí)別其同源抗原的抗體的細(xì)胞一起培養(yǎng)。使用本發(fā)明的方法制備的抗體最優(yōu)選地為人源化抗體，其隨后可連接于毒素、藥物、細(xì)胞毒性化合物或多聚體或其他化合物，這些可延長抗體在施用于患者后的半衰期?？贵w可特異于任何靶標(biāo)抗原?？乖梢詾榧?xì)胞結(jié)合的蛋白質(zhì)，例如細(xì)胞(如細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、T-細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞)上的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)或可溶性蛋白質(zhì)。目的抗原還可為任何醫(yī)療相關(guān)蛋白質(zhì)，如在疾病或感染中上調(diào)的蛋白質(zhì)，例如受:體和/或其對(duì)應(yīng)的配體。細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的具體實(shí)例包括粘附分子，例如整合素如P I整合素，例如VLA-4、E-選擇素、P 選擇素或 L-選擇素、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CDlla、CDllb、CD18、CD19、CD20、CD23、CD25、CD33、CD38、CD40、CD40L、CD45、CDW52、CD69、CD134 (0X40)、I COS, BCMP7、CD137、CD27L、CDCPU CSFl 或 CSFl-受體、DPCRU DPCRU dudulin2、FLJ20584、FLJ40787、HEK2、KIAA0634、KIAA0659、KIAA1246、KIAA1455、LTBP2、LTK, MAL2、MRP2、nectin_like2、NKCCI、PTK7、RA IGI、TCAMI、SC6、BCMP101、BCMP84、BCMP11、DTD、甲胎蛋白抗原(CEA )、人乳脂肪球蛋白(HMFGl和2)、I型MHC和II型MHC抗原、KDR和VEGF，恰當(dāng)時(shí)還包括其受體?？扇苄钥乖ò捉樗厝鏘L-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12、IL-13、IL-14、IL-16或IL-17如IL17A和/或IL17F，病毒抗原如呼吸道合胞體病毒或巨細(xì)胞病毒抗原，免疫球蛋白如IgE、干擾素如a干擾素干擾素或Y干擾素，腫瘤壞死因子TNF(先前稱為腫瘤壞死因子-a )，腫瘤壞死因子，集落刺激因子如G-CSF或GM-CSF,及血小板衍生生長因子如H)GF-a和TOGF-P，在恰當(dāng)時(shí)還包括其受體。其他抗原包括細(xì)菌細(xì)胞表面抗原，細(xì)菌毒素，病毒如流感病毒，EBV, HepA, B和C，生物恐怖主義試劑、放射性核素和重金屬，以及蛇和蜘蛛的毒液和毒素。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗體可用于功能性地改變目的抗原的活性。例如，抗體可以直接或間接地中和、拮抗或激動(dòng)所述抗原的活性。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，抗體為抗-TNF抗體，更優(yōu)選地為抗-TNF Fab’，如W001/094585中所描述的(其內(nèi)容通過引用并入本文)。用于表達(dá)重組蛋白質(zhì)的方法在本領(lǐng)域已知。用于表達(dá)重組抗體分子的宿主細(xì)胞合適的實(shí)例包括細(xì)菌如革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細(xì)菌，例如大腸桿菌，或酵母細(xì)胞，例如啤酒酵母(S. Cerevisiae)或哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如CHO細(xì)胞和骨髓瘤或雜交瘤細(xì)胞系，例如NSO細(xì)胞。最優(yōu)選地，在本發(fā)明的方法中，重組抗體在細(xì)菌如大腸桿菌中生產(chǎn)(見Verma等人，1988，J. Immunol. Methods 216:165-181;Simmons 等人，2002，J. Immunol. Methods263:133-147)。
細(xì)胞本發(fā)明中所使用的術(shù)語“樣品”指的是用編碼重組抗體分子的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的群體。樣品可具有任何合適的規(guī)模，從小規(guī)?？贵w生產(chǎn)到用于商業(yè)目的的大規(guī)?？贵w制造。本發(fā)明中所使用的細(xì)胞可以為例如但不限于細(xì)菌(尤其是革蘭氏陰性細(xì)菌)、酵母、哺乳動(dòng)物或昆蟲。最優(yōu)選地，細(xì)胞為大腸桿菌。細(xì)胞可以為野生型細(xì)胞或經(jīng)過遺傳工程改造的重組細(xì)胞。大腸桿菌宿主細(xì)胞可以為天然發(fā)生的大腸桿菌菌株或能夠產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的突變菌株。具體的宿主大腸桿菌菌株的實(shí)例包括此4100、了61、了62、0耶4、0冊(cè)[1、0111、BL2UK12,XLlBlue和JM109。一個(gè)實(shí)例為大腸桿菌W3110 (ATCC 27，325)，一種常用的用于重組蛋白質(zhì)發(fā)酵的宿主菌株。實(shí)例還包括修飾的大腸桿菌菌株，例如代謝突變體和蛋白酶缺陷菌株。使用本發(fā)明的方法生產(chǎn)的重組抗體通常在大腸桿菌宿主細(xì)胞的細(xì)胞周質(zhì)中或在宿主細(xì)胞培養(yǎng)物上清中表達(dá)，取決于蛋白質(zhì)性質(zhì)及生產(chǎn)規(guī)模。用于使蛋白質(zhì)靶向這些區(qū)室的方法在本領(lǐng)域已知，綜述見 Makrides, Microbiological Reviews, 1996,60,512-538。將蛋白質(zhì)引入大腸桿菌細(xì)胞周質(zhì)的合適信號(hào)序列的實(shí)例包括大腸桿菌PhoA、OmpA、OmpT、LamB和OmpF信號(hào)序列?？赏ㄟ^依賴于天然分泌途徑或通過誘導(dǎo)外膜的限制性滲漏引起蛋白質(zhì)分泌將蛋白質(zhì)靶向上清，實(shí)例為使用PelB前導(dǎo)序列，蛋白質(zhì)A前導(dǎo)序列，與菌素釋放蛋白質(zhì)，表達(dá)絲裂霉素誘導(dǎo)的菌素釋放蛋白質(zhì)共表達(dá)并向培養(yǎng)基中加入甘氨酸，以及與膜通透性相關(guān)的kil基因共表達(dá)。最優(yōu)選地，在本發(fā)明的方法中，重組蛋白質(zhì)表達(dá)于大腸桿菌的細(xì)胞周質(zhì)中。重組蛋白質(zhì)在大腸桿菌宿主細(xì)胞中的表達(dá)還可以受到可誘導(dǎo)系統(tǒng)的控制，從而重組蛋白質(zhì)在大腸桿菌宿主細(xì)胞中的表達(dá)還可以受到可誘導(dǎo)啟動(dòng)子的控制。很多可用于大腸桿菌的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子在本領(lǐng)域已知，根據(jù)啟動(dòng)子的性質(zhì)，重組蛋白質(zhì)的表達(dá)可由不同因子誘導(dǎo)，如溫度或生長培養(yǎng)基中特定物質(zhì)的濃度(Baneyx, Current Opinion in Biotechnology, 1999, 10:411-421;Goldstein and Doi, 1995, Biotechnol. Annu. Rev, 105-128)。可誘導(dǎo)啟動(dòng)子的實(shí)例包括大腸桿菌lac、tac和trc啟動(dòng)子，其受到乳糖或不可水解的乳糖類似物，異丙基-D-I-硫代半乳糖苷(IPTG)的誘導(dǎo)，以及phoA、trp和araBAD啟動(dòng)子，其分別受到磷酸、色氨酸和L-阿拉伯糖的誘導(dǎo)。表達(dá)可由例如加入誘導(dǎo)子或溫度變化(當(dāng)誘導(dǎo)依賴于溫度時(shí))而誘導(dǎo)。在向培養(yǎng)物添加誘導(dǎo)子而實(shí)現(xiàn)重組蛋白質(zhì)表達(dá)的誘導(dǎo)的情況下，可通過任何合適的方法加入誘導(dǎo)子，取決于發(fā)酵系統(tǒng)和誘導(dǎo)子，例如，通過單次或多次添加或通過給料逐步加入誘導(dǎo)子。應(yīng)當(dāng)理解的是，在加入誘導(dǎo)子和蛋白質(zhì)表達(dá)的實(shí)際誘導(dǎo)之間可能有延遲，例如誘導(dǎo)子是乳糖時(shí)，當(dāng)任何已存在的碳源都在乳糖之前被使用時(shí)可能在對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)的誘導(dǎo)前發(fā)生延遲。大腸桿菌宿主細(xì)胞培養(yǎng)物(發(fā)酵物)可在任何支持大腸桿菌生長及重組蛋白質(zhì)表達(dá)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)基可以為任何化學(xué)限定培養(yǎng)基，如Pirt S. J. (1975)在Principlesof Microbe and Cell Cultivation, Blackwell Scientific Publications 中提供的那些培養(yǎng)基，在恰當(dāng)?shù)臅r(shí)候可加以修飾以控制生長速率，如本文所描述的。合適的培養(yǎng)基的實(shí)例為 “SM6E”,如 Humphreys 等人，2002，Protein Expression and Purification, 26:309-320所描述的。大腸桿菌宿主細(xì)胞的培養(yǎng)可在任何合適的容器如搖瓶或發(fā)酵罐中進(jìn)行，取決于所 需的生產(chǎn)規(guī)模。有多種大規(guī)模發(fā)酵罐可用，具有的容積為超過1，000升直到大約100，000升。優(yōu)選地，使用的是1，000-50, 000升的發(fā)酵罐，更優(yōu)選地為1，000-10, 000或12，000升。還可使用較小規(guī)模的發(fā)酵罐，容積為0. 5-1，000升。大腸桿菌的發(fā)酵可在任何合適的系統(tǒng)中進(jìn)行，例如在連續(xù)、批式或料批式發(fā)酵系統(tǒng)(Thiry&Cingolani, 2002, Trends in Biotechnology, 20:103-105),取決于所需的蛋白質(zhì)及產(chǎn)量。使用批式發(fā)酵時(shí)，可在需要的時(shí)候一次性加入營養(yǎng)物質(zhì)或誘導(dǎo)子。備選地，可使用料批式培養(yǎng)，在誘導(dǎo)前以批式發(fā)酵生長的培養(yǎng)物具有最大的特異性生長速率，可使用發(fā)酵罐中起始存在的營養(yǎng)物質(zhì)以及用于控制生長速率的一種或多種加料規(guī)則維持培養(yǎng)物生長直到發(fā)酵完成。還可在誘導(dǎo)前使用料批式發(fā)酵以控制大腸桿菌宿主細(xì)胞的代謝，并可以達(dá)到較高的細(xì)胞密度(Lee, 1996, Tibtech, 14:98-105)。本發(fā)明的各個(gè)實(shí)施方式的優(yōu)選特征為其他實(shí)施方式加上必要的變更的結(jié)果。所有出版物，包括但不限于本說明書中引用的專利和專利申請(qǐng)都通過引用并入本文，對(duì)每項(xiàng)出版物都具體地、分別地提到并通過引用并入本文，雖然在前面已經(jīng)整體地提到這一點(diǎn)。在一方面，提供了從所述方法中獲得或可獲得的抗體。在一方面，提供了 pH控制工具如緩沖液的用途，用于改善抗體的提取，例如初級(jí)提取的用途，尤其是在其中所述控制確保提取步驟如熱提取步驟中的PH維持在pH 6-9的的范圍內(nèi)。如本文所采用的pH控制工具為緩沖液、堿和/或酸。本發(fā)明現(xiàn)在將參考以下實(shí)施例進(jìn)行描述，這些實(shí)施例僅僅是說明性的，不在任何意義上被認(rèn)為會(huì)限制本發(fā)明的范圍。圖I的圖顯示了重懸于pH 7. 4和pH 8的Tris/EDTA提取緩沖液的細(xì)胞在一段時(shí)間內(nèi)的pH。圖2a為直方圖，顯示了提取緩沖液的pH對(duì)抗體A的產(chǎn)量的影響。圖2b為直方圖，顯示了剛剛加入具有pH 7. 4-9. 0的提取緩沖液后細(xì)胞樣品(重懸的細(xì)胞漿)的PH以及細(xì)胞樣品在加入所述緩沖液I小時(shí)后而在加熱期前的pH。
圖3a為直方圖，顯示了在熱處理步驟前調(diào)整樣品pH對(duì)抗體A產(chǎn)量的影響。每條上方的數(shù)字表示相比于無PH調(diào)整步驟的對(duì)照的產(chǎn)量的增加百分比。圖3b的圖顯示了樣品在所述方法的多個(gè)階段的pH變化細(xì)胞漿(培養(yǎng)和離心后)；添加緩沖液后(剛剛添加提取緩沖液后);PH調(diào)整前；pH調(diào)整后，加熱期前；以及熱處理步驟后。圖4顯示了熱處理后提取自細(xì)胞的抗體A樣品的SDS-PAGE分析。泳道I為分子量標(biāo)記物，泳道2為抗體A樣品，泳道3為無pH調(diào)整的樣品，泳道4-8顯示了熱處理步驟前pH分別調(diào)整至7. O、7. 2、7. 4、7. 6和7. 8后的樣品。圖5為直方圖，顯示了使用pH 8的提取緩沖液并在熱處理步驟前將樣品pH調(diào)整至pH 7. 4對(duì)抗體A的產(chǎn)量的影響。圖5還顯示了包括有均質(zhì)化步驟或細(xì)胞漿穩(wěn)定步驟的 影響。每條上方的數(shù)字表示相比于有均質(zhì)化但無PH調(diào)整步驟的對(duì)照的產(chǎn)量的增加百分比。圖6顯示了熱處理后提取自細(xì)胞的抗體A樣品的SDS-PAGE分析。泳道I為分子量標(biāo)記物；泳道2為抗體A樣品；泳道3為均質(zhì)化步驟后但不經(jīng)pH調(diào)整也不經(jīng)細(xì)胞漿穩(wěn)定的樣品；泳道4為用pH 8的提取緩沖液處理后并在熱處理前調(diào)整到pH7. 4，并且經(jīng)過均質(zhì)化步驟而不經(jīng)過細(xì)胞漿穩(wěn)定的樣品；泳道5為不經(jīng)pH調(diào)整、不經(jīng)均質(zhì)化、不經(jīng)細(xì)胞漿穩(wěn)定的樣品；泳道6為用pH 8的提取緩沖液處理后并在熱處理前調(diào)整到pH7. 4，并且不經(jīng)過和均質(zhì)化和細(xì)胞漿穩(wěn)定的樣品；泳道7為細(xì)胞漿穩(wěn)定步驟后但不經(jīng)pH調(diào)整、不經(jīng)均質(zhì)化的樣品；泳道8為用pH 8的提取緩沖液處理后并在熱處理前調(diào)整到pH7. 4，并且經(jīng)過細(xì)胞漿穩(wěn)定而不經(jīng)過均質(zhì)化的樣品。圖7為圖，顯不了一段時(shí)間內(nèi)的樣品的pH,分別為未經(jīng)pH調(diào)整的對(duì)照樣品、用pH8的提取緩沖液的處理的樣品、用pH 7. 4的提取緩沖液處理并在熱處理步驟前將樣品pH調(diào)整到PH 7. 4的樣品以及用pH 8的提取緩沖液處理并在熱處理步驟前將樣品pH調(diào)整到pH7. 4的樣品。第一個(gè)峰表示加入提取緩沖液的點(diǎn)，第二個(gè)峰顯示兩個(gè)樣品的pH在熱處理步驟之前受到調(diào)整的點(diǎn)。圖8為直方圖，顯示未經(jīng)pH調(diào)整的對(duì)照樣品、用pH 7. 4的提取緩沖液處理并在熱處理步驟前將樣品PH調(diào)整到pH 7. 4的樣品、用pH8的提取緩沖液處理的樣品以及用pH 8的提取緩沖液處理并在熱處理步驟之前將樣品PH調(diào)整到pH 7. 4的樣品對(duì)抗體A的產(chǎn)量的影響。每條上方的數(shù)字表示相比于未經(jīng)PH調(diào)整的對(duì)照的產(chǎn)量的增加百分比。圖9為直方圖，顯示未經(jīng)pH調(diào)整的對(duì)照樣品、用pH 7. 4的提取緩沖液處理并在熱處理步驟之前在加熱期中將樣品pH調(diào)整到pH 7. 4的樣品以及用pH 8的提取緩沖液處理并在熱處理步驟之前在加熱期中將樣品PH調(diào)整到pH 7. 4的樣品對(duì)抗體A產(chǎn)量的影響。每條上方的數(shù)字表示相比于未經(jīng)PH調(diào)整的對(duì)照的產(chǎn)量的增加百分比。

圖10為直方圖，顯示pH調(diào)整到6. 6,7. 0、7. 4和7. 8單位相比于非pH調(diào)整的對(duì)照對(duì)Fab’滴度的影響。該實(shí)驗(yàn)用(提取前)的三種不同預(yù)處理步驟(分別為無預(yù)處理、細(xì)胞漿穩(wěn)定和均質(zhì)化)進(jìn)行重復(fù)。
圖11為直方圖，顯示以下條件下的平均Fab’滴度無pH調(diào)整、無預(yù)處理并進(jìn)行pH調(diào)整(至6. 6-7. 8單位的范圍)、均質(zhì)化和pH調(diào)整(至6. 6-7. 8單位的范圍)以及所有的pH調(diào)整條件(均質(zhì)化且無預(yù)處理)。誤差線顯示平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。一般方法在以下實(shí)施例中，除非另有說明，所述方法按如下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)步驟和離心使用具有編碼抗體A的DNA插入的載體pTTOD在大腸桿菌W3110細(xì)胞中表達(dá)抗體A (Fab’)。在用乳糖誘導(dǎo)后于25°C下進(jìn)行30小時(shí)的發(fā)酵以備收獲。50ml或IL的收獲培養(yǎng)物試樣在4°C下以4200RPM離心I小時(shí)。棄去上清，為模擬生產(chǎn)規(guī)模的澄清過程，將一小部分上清加入細(xì)胞使得產(chǎn)生的細(xì)胞將樣品占收獲重量的35%。 細(xì)胞漿穩(wěn)定步驟(CSH):在一些實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行細(xì)胞漿穩(wěn)定步驟，其中在加入提取緩沖液前將樣品在18°C及200RPM下穩(wěn)定33小時(shí)。提取緩沖液的添加將300mM Tris和30mM EDTA的儲(chǔ)備液配制成終濃度為IOOmMTris和IOmM EDTA,用鹽酸調(diào)整至PH7. 4，用其重懸所產(chǎn)生的細(xì)胞漿樣品(此后稱為樣品)。在下文描述的試驗(yàn)中，將該提取緩沖液的PH從對(duì)照的pH 7. 4調(diào)整到更高的pH水平，為pH 7. 4-9. 0之間。均質(zhì)化步驟(均化)在一些實(shí)驗(yàn)中，在加入提取緩沖液后通過使樣品在1500psi下單次通過以進(jìn)行均質(zhì)化步驟。加熱期前的pH調(diào)整在一些實(shí)驗(yàn)中，在加熱期開始之前用5M NaOH將樣品的pH調(diào)整到所需的水平，在7. 0-7. 8 之間。加熱期使樣品經(jīng)受加熱期，其中樣品的溫度從18°C升高到所需的59°C高溫，在此溫度下開始熱處理步驟。加熱期期間的pH調(diào)整在一些實(shí)驗(yàn)中，在加熱期中用5M NaOH將樣品的pH調(diào)整到所需的水平，為7. 4±0. 02，直到達(dá)到的所需的59°C高溫。熱處理步驟將樣品在59°C、200RPM下穩(wěn)定10-12小時(shí)。在熱處理后，通過在4°C下以4200rpm離心I小時(shí)澄清重懸的細(xì)胞沉淀。在20mM的磷酸緩沖液中使用蛋白質(zhì)G HPLC分析對(duì)含有功能性抗體A的上清中的Fab’進(jìn)行測定。使用注射時(shí)pH 7. 0減少到pH2. 5的pH梯度溶液洗脫抗體A。還原的提取樣品在Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝膠上分析，上樣濃度為大約I U g。實(shí)施例I:加入提取緩沖液后對(duì)樣品pH的影響如一般方法部分中描述的，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)步驟和添加提取緩沖液步驟，其中的緩沖液具有PH 8.0或pH 7.4。從添加提取緩沖液時(shí)就對(duì)樣品的pH進(jìn)行檢測。圖I顯示了在加入緩沖液后樣品pH迅速下降，并且pH很快降低到pH 7以下，尤其在緩沖液具有pH為7. 4 時(shí)。實(shí)施例2:提取緩沖液pH對(duì)抗體產(chǎn)量的影響如一般方法部分中描述的，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)步驟、添加提取緩沖液步驟、加熱期及熱處理步驟。未在加熱前或加熱中進(jìn)行細(xì)胞漿穩(wěn)定步驟、均質(zhì)化步驟及pH調(diào)整步驟。提取緩沖液的pH 不同值如下:7. 4,8. 0. 8. 1,8. 2,8. 3,8. 4,8. 5,8. 6,8. 7,8. 8,8. 9和9. O。結(jié)果顯示于圖2a，顯示了熱提取后的Fab’濃度?？梢娞崛【彌_液的pH升高到7. 4以上導(dǎo)致Fab’回收的顯著增加，高至pH 8. 8都可使產(chǎn)量增加。8.8以上時(shí)Fab’的濃度開始下降。表I
權(quán)利要求
1.用于制造重組抗體分子的方法，包括培養(yǎng)用編碼重組抗體分子的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞樣品；將提取緩沖液添加至樣品；以及使樣品經(jīng)歷加熱期及熱處理步驟；其中在添加提取緩沖液后檢測樣品的PH并任選地對(duì)其進(jìn)行調(diào)整，以確保在熱處理步驟前樣品的pH為 6-9。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中熱處理步驟是在30°C_70°C的范圍內(nèi)進(jìn)行的。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2的方法，其中提取緩沖液選自NaOH、NH4OH、硫酸、EDTA、Tris緩沖液及其組合。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任何一項(xiàng)的方法，其中抗體選擇性針對(duì)選自以下分子的抗原整合素如P I整合素，例如VLA-4、E-選擇素、P選擇素或L-選擇素、⑶2、⑶3、⑶4、⑶5、⑶7、CD8、CDlla、CDllb、CD18、CD19、CD20、CD23、CD25、CD33、CD38、CD40、CD40L、CD45、CDW52、CD69、CD 134 (0X40)、I COS、BCMP7、CD137、CD27L、CDCPl、CSFl 或 CSFl-受體、DPCRl、DPCRl、dudulin2、FLJ20584、FLJ40787、HEK2、KIAA0634、KIAA0659、KIAA1246、KIAA1455、LTBP2、LTK、MAL2、MRP2、nectin-like2、NKCCl、PTK7、RAIGl、TCAMl、SC6、BCMP101、BCMP84、BCMPll、DTD、甲胎蛋白抗原(CEA)、人乳脂肪球蛋白(HMFG1和2)、1型MHC和II型MHC抗原、KDR和VEGF0
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任何一項(xiàng)的方法，其中抗體分子選自VH、VL、VHH、Fab、修飾的Fab、變化的鉸鏈區(qū)Fab、Fab’、F(ab’)2或Fv片段；輕鏈或重鏈單體或二聚體；單鏈抗體如單鏈Fv,其中重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域通過肽連接子相連，以及雙特異性抗體,如Fab-dAb。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任何一項(xiàng)的方法，其中將pH調(diào)整至確保樣品的pH在熱處理步驟前為6-9。
7.由權(quán)利要求1-6中任何一項(xiàng)限定的方法獲得或可獲得的抗體。
8.pH控制工具如緩沖液用于改善抗體提取，例如初級(jí)提取的用途，尤其是在其中所述控制確保提取步驟，如熱提取步驟之前很短時(shí)間和/或之中的pH在pH 6-9的范圍內(nèi)。
全文摘要
本發(fā)明公開涉及用于制造重組抗體分子的方法，包括培養(yǎng)用編碼重組抗體分子的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞樣品；將提取緩沖液添加至樣品；以及使樣品經(jīng)歷熱處理步驟；其中在添加提取緩沖液后檢測樣品的pH，并任選地對(duì)其進(jìn)行調(diào)整，以確保在熱處理步驟前樣品的pH為6-9。
文檔編號(hào)C07K16/00GK102812042SQ201180014155
公開日2012年12月5日 申請(qǐng)日期2011年2月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月3日
發(fā)明者J-P·P·比爾基斯舍爾, P·J·巴塞特, M·R·皮爾斯-黑金斯, A·J·肯尼 申請(qǐng)人:Ucb醫(yī)藥有限公司