專利名稱：共有輕鏈小鼠的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
提供了經(jīng)遺傳修飾的小鼠，其表達(dá)具有與多種人可變/小鼠恒定重鏈締合的共有人可變/小鼠恒定輕鏈的抗體。提供了從小鼠B細(xì)胞的人可變區(qū)基因序列制備人雙特異性抗體的方法。
背景技術(shù)：
抗體通常包含同二聚重鏈組分，其中每個重鏈單體與相同的輕鏈締合。需要具有異二聚重鏈組分的抗體(例如雙特異性抗體)作為治療性抗體。但是已證明了，制備具有能夠滿意地與雙特異性抗體的每個重鏈締合的合適的輕鏈組分的雙特異性抗體是有問題的。在一種方案中，可通過調(diào)查所有輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的使用統(tǒng)計學(xué)、鑒別出人抗體中最常采用的輕鏈來選擇輕鏈，并在體外將那種輕鏈與不同特異性的兩個重鏈進(jìn)行配對。
在另一種方案中，可通過觀察噬菌體展示文庫(例如，包含人輕鏈可變區(qū)序列的噬菌體展示文庫，例如人ScFv文庫)中的輕鏈序列并從所述文庫中選擇最常使用的輕鏈可變區(qū)而選擇輕鏈。然后，可在兩種不同的目的重鏈上測試所述輕鏈。在另一種方案中，可通過使用兩種目的重鏈的重鏈可變序列作為探針來測定輕鏈可變序列的噬菌體展示文庫而選擇輕鏈。與兩種重鏈可變序列都締合的輕鏈可被選作用于所述重鏈的輕鏈。在另一種方案中，可將候選輕鏈與重鏈的共有輕鏈進(jìn)行比對，并在所述輕鏈中進(jìn)行修飾以更緊密地匹配兩種重鏈的共有輕鏈共同的序列特征。如果需要使得免疫原性的機(jī)會最小化，則所述修飾優(yōu)選產(chǎn)生在已知人輕鏈序列中存在的序列，從而基于評估免疫原性可能性的領(lǐng)域中已知的參數(shù)和方法(即計算機(jī)模擬和濕測定)，蛋白水解加工不太可能產(chǎn)生T細(xì)胞表位。所有上述的方案都依賴于體外方法，其包含若干事先的約束，例如序列同一丨I"生，與特定的、預(yù)先選擇的重鏈相締合的能力等。本領(lǐng)域中需要這樣的組合物和方法，其不依賴于操控體外條件，而是采用更為生物學(xué)上可感知的方案，來制備包括共有輕鏈的人表位結(jié)合蛋白。


圖I描繪了用人Vk 1-39Jk 5基因區(qū)域替換內(nèi)源小鼠免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)基因區(qū)段的靶向策略。圖2描繪了用人Vk 3-20JK I基因區(qū)域替換內(nèi)源小鼠免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)基因區(qū)段的靶向策略。圖3描繪了用人VpreB/JX 5基因區(qū)域替換內(nèi)源小鼠免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)基因區(qū)段的靶向策略。發(fā)明概述提供了表達(dá)人免疫球蛋白重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的經(jīng)遺傳修飾的小鼠，其中小鼠具有有限的輕鏈可變集合(repertoire)。提供了用于產(chǎn)生人輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)系統(tǒng)，其中所述人輕鏈可變結(jié)構(gòu)域與眾多集合的親和-成熟的人重鏈可變結(jié)構(gòu)域相締合并一起表達(dá)。提供了用于制備包含免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合蛋白的方法，所述方法包括用目的抗原免疫接種具有有限的免疫球蛋白輕鏈集合的小鼠，和在特異性結(jié)合所述目的抗原的結(jié)合蛋白中采用小鼠的免疫球蛋白可變區(qū)基因序列。所述方法包括下列方法用于制備適于在制備多特異性抗原結(jié)合蛋白中使用的人免疫球蛋白重鏈可變結(jié)構(gòu)域的方法。提供了經(jīng)遺傳工程化的小鼠，其選擇源自未重排的人重鏈可變區(qū)基因區(qū)段的集合的、合適的親和-成熟的人免疫球蛋白重鏈可變結(jié)構(gòu)域，其中所述親和-成熟的人重鏈可變結(jié)構(gòu)域與源自一個人輕鏈可變區(qū)基因區(qū)段的單一人輕鏈可變結(jié)構(gòu)域相締合并一起表達(dá)。提供了經(jīng)遺傳工程化的小鼠，其提供兩種人輕鏈可變區(qū)基因區(qū)段的選擇。提供了經(jīng)遺傳工程化的小鼠，其表達(dá)人輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的有限的集合，或者來自人輕鏈可變區(qū)基因區(qū)段的有限的集合的單一人輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。所述小鼠經(jīng)遺傳工程化以包括單一的未重排的人輕鏈可變區(qū)基因區(qū)段(或兩個人輕鏈可變區(qū)基因區(qū)段)，其重排以形成表達(dá)單一輕鏈(或表達(dá)兩條輕鏈中的任一條或兩條)的、經(jīng)重排的人輕鏈可變區(qū)基因(或兩個重排的輕鏈可變區(qū)基因)。經(jīng)重排的人輕鏈可變結(jié)構(gòu)域能夠與由小鼠選擇的多個 親和-成熟的人重鏈配對，其中所述重鏈可變區(qū)特異性地結(jié)合不同的表位。一方面，提供了經(jīng)遺傳修飾的小鼠，其包括單一的人免疫球蛋白輕鏈可變(VL)區(qū)基因區(qū)段，所述基因區(qū)段能夠重排并編碼免疫球蛋白輕鏈的人VL結(jié)構(gòu)域。另一方面，所述小鼠包括不多于兩個人VL基因區(qū)段，所述區(qū)段能夠重排并編碼免疫球蛋白輕鏈的人VL結(jié)構(gòu)域。一方面，提供了經(jīng)遺傳修飾的小鼠，其包括單一經(jīng)重排的(V/J)人免疫球蛋白輕鏈可變(VL)區(qū)區(qū)段(即V/J區(qū)段)，所述區(qū)段編碼免疫球蛋白輕鏈的人VL結(jié)構(gòu)域。另一方面，所述小鼠包括不多于兩個重排的人VL基因區(qū)段，所述區(qū)段能夠編碼免疫球蛋白輕鏈的人VL結(jié)構(gòu)域。在一個實施方案中，所述VL基因區(qū)段是人VK 1-39J k 5基因區(qū)段或人Vk 3-20JK I基因區(qū)段。在一個實施方案中，所述小鼠具有人V K 1-39JK 5基因區(qū)段和人Vk 3-20JK I基因區(qū)段兩者。在一個實施方案中，所述人VL基因區(qū)段與人或小鼠前導(dǎo)序列可操作地連接。在一個實施方案中，所述前導(dǎo)序列是小鼠前導(dǎo)序列。在具體的實施方案中，所述小鼠前導(dǎo)序列是小鼠V K 3-7前導(dǎo)序列。在一個實施方案中，所述VL基因區(qū)段與免疫球蛋白啟動子序列可操作地連接。在一個實施方案中，所述啟動子序列是人啟動子序列。在具體的實施方案中，所述人免疫球蛋白啟動子是V K 3-15啟動子。在一個實施方案中，所述經(jīng)遺傳修飾的小鼠包含VL基因座，其不包含能夠重排以形成免疫球蛋白輕鏈基因的內(nèi)源小鼠VL基因區(qū)段，其中所述VL基因座包含能夠重排以編碼輕鏈基因的VL區(qū)的單一人VL基因區(qū)段。在具體的實施方案中，所述人VL基因區(qū)段是人Vk 1-3町1^5基因區(qū)段或人￥1^3-2(^1^ I基因區(qū)段。在一個實施方案中，所述VL基因座包括前導(dǎo)序列，其5’側(cè)翼(相對于VL基因區(qū)段的轉(zhuǎn)錄方向)是人免疫球蛋白啟動子，而3’側(cè)翼是人VL基因區(qū)段，所述人VL基因區(qū)段重排并編碼包含內(nèi)源小鼠輕鏈恒定區(qū)(CL)的反向嵌合輕鏈的VL結(jié)構(gòu)域。在具體的實施方案中，所述VL基因區(qū)段位于小鼠K VL基因座，且小鼠CL是小鼠kCL。在一個實施方案中，所述小鼠包括無功能的\免疫球蛋白輕鏈基因座。在具體的實施方案中，所述、基因座包括所述基因座的一個或多個序列的缺失，其中所述一個或多個缺失使得所述、基因座不能重排以形成輕鏈基因。在另一個實施方案中，所述、基因座的全部或其本上全部VL基因區(qū)段都缺失。在一個實施方案中，經(jīng)修飾的小鼠的VL基因座是K基因座，并且所述K基因座包括小鼠K內(nèi)含子增強(qiáng)子(intronic enhancer)，小鼠k 3’增強(qiáng)子，或內(nèi)含子增強(qiáng)子和3’
增強(qiáng)子二者。在一個實施方案中，小鼠制造這樣的輕鏈其包含源自人VL基因區(qū)段的、體細(xì)胞突變的VL結(jié)構(gòu)域。在一個實施方案中，所述輕鏈包含源自人VL基因區(qū)段的、體細(xì)胞突變的 VL結(jié)構(gòu)域，和小鼠K CL區(qū)域。在一個實施方案中,所述小鼠不表達(dá)\輕鏈。在一個實施方案中，所述遺傳修飾的小鼠能夠體細(xì)胞超突變?nèi)薞L區(qū)域序列。在具體的實施方案中，所述小鼠包括這樣的細(xì)胞其包含源自能夠重排和編碼VL結(jié)構(gòu)域的人VL基因區(qū)段的重排的免疫球蛋白輕鏈基因，并且所述重排的免疫球蛋白輕鏈基因包含體細(xì)胞突變的VL結(jié)構(gòu)域。在一個實施方案中，所述小鼠包括這樣的細(xì)胞其表達(dá)包含與小鼠K CL相連的體細(xì)胞突變的人VL結(jié)構(gòu)域的輕鏈，其中所述輕鏈與包含源自人VH基因區(qū)段的、體細(xì)胞突變的VH結(jié)構(gòu)域的重鏈相締合，并且其中所述重鏈包含小鼠重鏈恒定區(qū)(CH)。在一個實施方案中，所述小鼠包含用一個或多個人VH基因區(qū)段對內(nèi)源小鼠VH基因區(qū)段的替換，其中人VH基因區(qū)段與小鼠CH區(qū)基因可操作地連接，從而所述小鼠重排所述人VH基因區(qū)段并且表達(dá)包含人VH結(jié)構(gòu)域和小鼠CH的反向嵌合免疫球蛋白重鏈。在一個實施方案中，90-100%的未重排的小鼠VH基因區(qū)段被至少一個未重排的人VH基因區(qū)段替換。在具體的實施方案中，所有或基本上所有的內(nèi)源小鼠VH基因區(qū)段被至少一個未重排的人VH基因區(qū)段替換。在一個實施方案中，所述替換是用至少19，至少39，或者至少80或81個未重排的人VH基因區(qū)段進(jìn)行的。在一個實施方案中，所述替換是以至少12個有功能的未重排的人VH基因區(qū)段、至少25個有功能的未重排的人VH基因區(qū)段，或至少43個有功能的未重排的人VH基因區(qū)段進(jìn)行的。在一個實施方案中，所述小鼠包括用至少一個未重排的人D區(qū)段和至少一個未重排的人J區(qū)段替換所有的小鼠D和J區(qū)段。在一個實施方案中，所述至少一個未重排的人 D 區(qū)段選自 Dl-7, Dl-26, D3-3, D3-10，D3-16，D3-22，D5-5，D5-12，D6-6，D6-13，D7-27，以及它們的組合。在一個實施方案中，所述至少一個未重排的人J區(qū)段選自Jl，J3，J4，J5，J6，以及它們的組合。在具體的實施方案中，所述一個或多個人VH基因區(qū)段選自人 VH 基因區(qū)段的 1-2，1-8，1-24，2-5，3-7, 3-9, 3-11,3-13, 3-15, 3-20, 3-23,3-30,3-33, 3-48,4-31,4-39，4-59,5-51,6-1,以及它們的組合。在一個實施方案中，所述小鼠包含表達(dá)特異性結(jié)合目的抗原的結(jié)合蛋白的B細(xì)胞，其中所述結(jié)合蛋白包括源自人Vk I-39/Jk 5重排或人Vk 3-20/Jk I重排的輕鏈，并且其中所述細(xì)胞包括源自人基因區(qū)段的重排的經(jīng)重排的免疫球蛋白重鏈基因，所述人基因區(qū)段選自VH2-5，VH3-23, VH3-30, VH 4-39, VH4-59和VH5-51基因區(qū)段。在一個實施方案中，所述一種或多種人VH基因區(qū)段是以選自Jl，J3，J4，J5和J6的人重鏈J基因區(qū)段重排的。在一個實施方案中，所述一個或多個人VH和J基因區(qū)段是用選自Dl-7，Dl-26，D3-3，D3-10, D3-16, D3-22, D5-5，D5-12，D6-6，D6-13 和 D7-27 的人 D 基因區(qū)段重排的。在具體的實施方案中，所述輕鏈基因具有1，2，3，4或5或更多體細(xì)胞超突變。在一個實施方案中，所述小鼠包括包含重排的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)基因序列的B細(xì)胞，所述重排的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)基因序列包括選自下列的VH，JH和DH基因區(qū)段VH 2-5+JH1+D6-6, VH3-23+JH4+D3, VH3-23+JH4+D3-10, VH3-30+JH1+D6-6,VH3-30+JH3+D6-6, VH3-30+JH4+D1-7， VH3-30+JH4+D5-12, VH3-30+JH4+D6-13,VH3-30+JH4+D6-6, VH3-30+JH4+D7-27, VH3-30+JH5+D3-22, VH3-30+JH5+D6-6,VH3-30+JH5+D7-27, VH4-39+JH3+D1-26， VH4-59+JH3+D3-16， VH4-59+JH3+D3-22，VH4-59+JH4+D3-16，VH5-51+JH3+D5-5，VH5-51+JH5+D6-13 和 VH5-51+JH6+D3-16。在具體的實施方案中，所述B細(xì)胞表達(dá)結(jié)合蛋白，所述結(jié)合蛋白包括與小鼠重鏈恒定區(qū)融合的人免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，以及與小鼠輕鏈恒定區(qū)融合的人免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)。在一個實施方案中，所述人VL基因區(qū)段是人V K 1-39J K 5基因區(qū)段，且所述小鼠 表達(dá)包含下列的反向嵌合輕鏈(i)源自人VL基因區(qū)段的VL結(jié)構(gòu)域和(ii)小鼠CL;其中所述輕鏈與包含下列的反向嵌合重鏈相締合(i)小鼠CH和(ii)源自人VH基因區(qū)段的體細(xì)胞突變的人VH結(jié)構(gòu)域，所述人VH基因區(qū)段選自人VH基因區(qū)段的1-2，1-8，1-24，2-5,3-7，3-9，3-11，3-13，3-15，3-20，3-23，3-30，3-33，3-48，4-31，4-39，4-59，5-51 和 6-1,以及它們的組合。在一個實施方案中，所述小鼠表達(dá)經(jīng)體細(xì)胞突變的輕鏈。在一個實施方案中，所述CL是小鼠K CL。在一個實施方案中，所述人VL基因區(qū)段是人V K 3-20J K I基因區(qū)段，且所述小鼠表達(dá)包含下列的反向嵌合輕鏈(i)源自人VL基因區(qū)段的VL結(jié)構(gòu)域，和(ii)小鼠CL;其中所述輕鏈與包含下列的反向嵌合重鏈相締合(i)小鼠CHdP (ii)源自選自下列的人VH基因區(qū)段的體細(xì)胞突變的人VH :人VH基因區(qū)段的1-2，2-5，3-7，3-9, 3-11,3-20, 3-23, 3-30,3-33，4-59和5-51，以及它們的組合。在一個實施方案中，所述小鼠表達(dá)經(jīng)體細(xì)胞突變的輕鏈。在一個實施方案中，所述CL是小鼠K CL。在一個實施方案中，所述小鼠包括人V K 1-39JK 5基因區(qū)段和人Vk 3-20JK I基因區(qū)段兩者，并且所述小鼠表達(dá)包含下列的反向嵌合輕鏈(i)源自人Vk 1-39JK5基因區(qū)段或人Vk 3-20J K I基因區(qū)段的VL結(jié)構(gòu)域，和(ii)小鼠CL;其中所述輕鏈與包含下列的反向嵌合重鏈相締合(i)小鼠CHdP (ii)源自選自下列的人VH基因區(qū)段的體細(xì)胞突變的人 VH :人 VH 基因區(qū)段的 1-2，1-8，1-24，2-5，3-7，3-9，3-11，3-13，3-15，3-20，3-23，3-30，3-33，3-48，4-31，4-39，4-59，5-51,6-1,以及它們的組合。在一個實施方案中，所述小鼠表達(dá)經(jīng)體細(xì)胞突變的輕鏈。在一個實施方案中，所述CL是小鼠K CL。在一個實施方案中，90-100%的內(nèi)源未重排的小鼠VH基因區(qū)段被至少一個未重排的人VH基因區(qū)段替換。在具體的實施方案中，全部或基本上全部內(nèi)源未重排的小鼠VH基因區(qū)段被至少一個未重排的人VH基因區(qū)段替換。在一個實施方案中，所述替換是用至少18，至少39，至少80或81個未重排的人VH基因區(qū)段進(jìn)行的。在一個實施方案中，所述替換是用至少12個有功能的未重排的人VH基因區(qū)段、至少25個有功能的未重排的人VH基因區(qū)段或至少43個未重排的人VH基因區(qū)段進(jìn)行的。在一個實施方案中，所述經(jīng)遺傳修飾的小鼠是C57BL品系，在具體的實施方案中，其選自 C57BL/A，C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ,C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr, C57BL/01a。在具體的實施方案中，所述經(jīng)遺傳修飾的小鼠是前述129品系與前述C57BL/6品系的混合。在另一個具體的實施方案中，所述小鼠是前述129品系的混合，或前述BL/6品系的混合。在具體的實施方案中，所述混合的129品系是129S6(129/SvEvTac)品系。在一個實施方案中，所述小鼠表達(dá)包括下列的反向嵌合抗體包含小鼠K CL和源自人Vk 1-39Jk 5基因區(qū)段或人Vk 3-20Jk I基因區(qū)段的體細(xì)胞突變的人VL結(jié)構(gòu)域的輕鏈，和包含小鼠CH和源自人VH基因區(qū)段的經(jīng)體細(xì)胞突變的人VH結(jié)構(gòu)域的重鏈，所述人VH基因區(qū)段選自人 VH 基因區(qū)段的 1-2，1-8，1-24，2-5，3-7, 3-9, 3-11,3-13, 3-15, 3-20, 3-23,3-30，3-33，3-48，4-31，4-39，4-59，5-51和6-1，其中所述小鼠不表達(dá)完全的小鼠抗體并且不表達(dá)完全的人抗體。在一個實施方案中，所述小鼠包括這樣的K輕鏈基因座，其包含用人Vk 1-39Jk 5基因區(qū)段或人Vk 3-20Jk I基因區(qū)段對內(nèi)源小鼠k VL基因區(qū)段的替換，并且包括用人VH基因區(qū)段的完整或基本上完整的集合對所有或基本上所有內(nèi)源小鼠VH基因區(qū)段的替換。 一方面，提供了分離自如本文中所描述的小鼠的小鼠細(xì)胞。在一個實施方案中，所述細(xì)胞是ES細(xì)胞。在一個實施方案中，所述細(xì)胞是淋巴細(xì)胞。在一個實施方案中，所述淋巴細(xì)胞是B細(xì)胞。在一個實施方案中，所述B細(xì)胞表達(dá)包含源自人基因區(qū)段的可變結(jié)構(gòu)域的嵌合重鏈；和源自重排的人Vk 1-39/J區(qū)段，重排的人Vk 3-20/J區(qū)段，或它們的組合的輕鏈；其中所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域與小鼠恒定區(qū)相融合，且所述輕鏈可變結(jié)構(gòu)域與小鼠或人的恒定區(qū)相融合?！矫妫峁┝穗s交瘤，其中所述雜交瘤是由如本文所描述的小鼠的B細(xì)胞制成的。在具體的實施方案中，所述B細(xì)胞來自如本文所描述的小鼠，所述小鼠經(jīng)包含目的表位的免疫原免疫接種，并且所述B細(xì)胞表達(dá)結(jié)合所述目的表位的結(jié)合蛋白，所述結(jié)合蛋白具有經(jīng)體細(xì)胞突變的人VH結(jié)構(gòu)域和小鼠CH，并且具有源自人V K 1-39J K 5或人V K 3-20J k I基因區(qū)段的人VL結(jié)構(gòu)域和小鼠CL。一方面，提供了小鼠胚胎，其中所述胚胎包含源自如本文中所描述的小鼠的供體ES細(xì)胞。一方面，提供了靶向載體，所述載體在轉(zhuǎn)錄方向中、參照所述載體的5’和3’小鼠同源臂的序列，從5’至3’包括5’小鼠同源臂，人或小鼠免疫球蛋白啟動子，人或小鼠前導(dǎo)序列，和選自人V K 1-39J K 5或人V K 3-20J K I基因區(qū)段的人LCVR基因區(qū)段，以及3’小鼠同源臂。在一個實施方案中，所述5’和3’同源臂使所述載體靶向增強(qiáng)子序列5’的序列，所述增強(qiáng)子序列存在于小鼠K恒定區(qū)基因的5’并臨近小鼠K恒定區(qū)基因。在一個實施方案中，所述啟動子是人免疫球蛋白可變區(qū)因區(qū)段啟動子。在具體的實施方案中，所述啟動子是人Vk 3-15啟動子。在一個實施方案中，所述前導(dǎo)序列是小鼠前導(dǎo)序列。在具體的實施方案中，所述小鼠前導(dǎo)序列是小鼠Vk 3-7前導(dǎo)序列。一方面，提供了如上文所述的靶向載體，但是替代5’小鼠同源臂，人或小鼠啟動子的5’側(cè)翼是位點特異性重組酶識別位點(SRRS)，并且替代3’小鼠同源臂，人LCVR基因區(qū)段的3’側(cè)翼是SRRS。一方面，提供了如本文所述的小鼠制備的反向嵌合抗體，其中所述反向嵌合抗體包含含有小鼠CL和人VL的輕鏈，以及含有人VH和小鼠CH的重鏈。一方面，提供了用于制備抗體的方法，所述方法包括在單細(xì)胞中表達(dá)(a)與人CH基因序列融合的、如本文所述經(jīng)免疫的小鼠的第一 VH基因序列；(b)與人CL基因序列融合的、如本文所述經(jīng)免疫的小鼠的VL基因序列；和(c)在足以表達(dá)完全人抗體的條件下維持所述細(xì)胞，和分離所述抗體。在一個實施方案中，所述細(xì)胞包含與人CH基因序列融合的、如本文所述第二經(jīng)免疫的小鼠的第二 VH基因序列，第一 VH基因序列編碼識別第一表位的VH結(jié)構(gòu)域，而第二 VH基因序列編碼識別第二表位的VH結(jié)構(gòu)域，其中所述第一表位和所述第二表位是不相同的。一方面，提供了用于制備表位結(jié)合蛋白的方法，所述方法包括使本文所述的小鼠暴露于包含目的表位的免疫原，在足以使所述小鼠產(chǎn)生特異性結(jié)合所述目的表位的免疫球蛋白分子的條件下維護(hù)所述小鼠，和分離特異性結(jié)合所述目的表位的免疫球蛋白分子；其中所述表位結(jié)合蛋白包括含有體細(xì)胞突變的人VH和小鼠CH的重鏈，所述重鏈與包含小鼠CL和源自人V K 1-39Jk5*AVk3-20Jk I基因區(qū)段的人VL的輕鏈相締合。
—方面，提供了表達(dá)表位結(jié)合蛋白的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞包括(a)編碼源自人Vk 1-39Jk 5或人Vk 3-20Jk I基因區(qū)段的人VL結(jié)構(gòu)域的人VL核苷酸序列，其中所述人VL核苷酸序列與人免疫球蛋白輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域cDNA序列(例如，人K恒定結(jié)構(gòu)域DNA序列)相融合(直接地或通過連接子)；和(b)第一人VH核苷酸序列，其編碼源自第一人VH核苷酸序列的人VH結(jié)構(gòu)域，其中所述第一人VH核苷酸序列與人免疫球蛋白重鏈恒定結(jié)構(gòu)域cDNA序列相融合(直接地或通過連接子);其中所述表位結(jié)合蛋白識別第一表位。在一個實施方案中，所述表位結(jié)合蛋白以下列解離常數(shù)結(jié)合所述第一表位低于10_6M，低于10_8M，低于1(T9M，低于10_10M，低于IO-11M或低于1(T12M。在一個實施方案中，所述細(xì)胞包含編碼第二人VH結(jié)構(gòu)域的第二人VH核苷酸序列，其中所述第二人VH序列與人免疫球蛋白重鏈恒定結(jié)構(gòu)域cDNA序列相融合(直接地或通過連接子)，并且其中所述第二人VH結(jié)構(gòu)域不特異性識別所述第一表位(例如顯示出下列解離常數(shù)例如10_6M，IO-5M, IO-4M或更高)，并且其中所述表位結(jié)合蛋白識別所述第一表位和所述第二表位，并且其中所述第一和所述第二免疫球蛋白重鏈每一個都與(a)的相同的輕鏈相締合。在一個實施方案中，所述第二 VH結(jié)構(gòu)域以下列解離常數(shù)結(jié)合所述第二表位所述解離常數(shù)低于1(T6M，低于101，低于1(T8M，低于1(T9M，低于10_10M，低于10_nM或低于1(T12M。在一個實施方案中，所述表位結(jié)合蛋白包含第一免疫球蛋白重鏈和第二免疫球蛋白重鏈，每一個都與源自選自人Vk 1-39Jk 5或人Vk 3-20Jk I基因區(qū)段的人VL基因區(qū)段的相同的輕鏈相締合，其中所述第一免疫球蛋白重鏈以納摩爾至皮摩爾范圍內(nèi)的解離常數(shù)結(jié)合第一表位，所述第二免疫球蛋白重鏈以納摩爾至皮摩爾范圍內(nèi)的解離常數(shù)結(jié)合第二表位，所述第一表位和所述第二表位不是完全相同的，所述第一免疫球蛋白重鏈不結(jié)合所述第二表位或者以弱于微摩爾范圍(例如毫摩爾范圍)的解離常數(shù)結(jié)合所述第二表位，所述第二免疫球蛋白重鏈不結(jié)合所述第一表位或以弱于微摩爾范圍(例如毫摩爾范圍)的解離常數(shù)結(jié)合所述第一表位，并且VL、所述第一免疫球蛋白重鏈的VH，以及所述第二免疫球蛋白重鏈的VH中的一個或多個是經(jīng)體細(xì)胞突變的。在一個實施方案中，所述第一免疫球蛋白重鏈包含蛋白A-結(jié)合殘基，且所述第二免疫球蛋白重鏈缺少蛋白A-結(jié)合殘基。在一個實施方案中，所述細(xì)胞選自CHO，COS, 293, HeLa，和表達(dá)病毒核酸序列的視網(wǎng)膜細(xì)胞(例如PERC. 6 細(xì)胞)。一方面，提供了反向嵌合抗體，其包含人VH和小鼠重鏈恒定結(jié)構(gòu)域，人VL和小鼠輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體是通過下列方法制備的，所述方法包括用包含表位的免疫原免疫接種本文所述的小鼠，且所述抗體特異性結(jié)合用于免疫接種小鼠的免疫原的所述表位。在一個實施方案中，所述VL結(jié)構(gòu)域是經(jīng)體細(xì)胞突變的。在一個實施方案中，所述VH結(jié)構(gòu)域是經(jīng)體細(xì)胞突變的。在一個實施方案中，VL結(jié)構(gòu)域和VH結(jié)構(gòu)域二者都是經(jīng)體細(xì)胞突變的。在一個實施方案中，VL與小鼠K恒定結(jié)構(gòu)域相連。一方面，提供了小鼠，所述小鼠包含在內(nèi)源小鼠基因座處用人重鏈可變基因區(qū)段替換所有或基本上所有小鼠重鏈可變基因區(qū)段；用不多于一個或兩個選自重排的Vk 1-39/J和重排的Vk 3-20/J區(qū)段或其組合的人輕鏈可變基因區(qū)段替換所有小鼠輕鏈可 變基因區(qū)段；其中所述人重鏈可變基因區(qū)段與小鼠恒定基因相連，且其中所述人輕鏈可變基因區(qū)段與人或小鼠恒定基因相連。一方面，小鼠ES細(xì)胞包含用人重鏈可變基因區(qū)段替換所有或基本上所有小鼠重鏈可變基因區(qū)段，以及不多于一個或兩個重排的人輕鏈V/J區(qū)段，其中所述人重鏈可變基因區(qū)段與小鼠免疫球蛋白重鏈恒定基因相連，并且所述人輕鏈V/J區(qū)段與小鼠或人免疫球蛋白輕鏈恒定基因相連。在具體的實施方案中，所述輕鏈恒定基因是小鼠恒定基因。一方面，提供了由本文所述的小鼠制備的抗原結(jié)合蛋白。在具體的實施方案中，所述抗原結(jié)合蛋白包括與小鼠恒定區(qū)相融合的人免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，和源自Vk 1-39基因區(qū)段或Vk 3-20基因區(qū)段的人免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈恒定區(qū)是小鼠恒定區(qū)。一方面，提供了由本文所述的小鼠的免疫球蛋白可變區(qū)基因序列制備的完全人抗原結(jié)合蛋白，其中所述抗原結(jié)合蛋白包含含有源自本文所述的小鼠的序列的人可變區(qū)的完全的人重鏈，和含有V K 1-39或Vk 3-20可變區(qū)的完全的人輕鏈。在一個實施方案中，所述輕鏈可變區(qū)包含一個至五個體細(xì)胞突變。在一個實施方案中，所述輕鏈可變區(qū)是在所述小鼠的B細(xì)胞中與重鏈可變區(qū)配對的共有輕鏈可變區(qū)。在一個實施方案中，所述完全的人抗原結(jié)合蛋白包含第一重鏈和第二重鏈，其中所述第一重鏈和所述第二重鏈包含非完全相同的可變區(qū)，它們獨立地源自本文所述的小鼠，并且其中從宿主細(xì)胞表達(dá)的所述第一和第二重鏈中的每一個與源自Vk 1-39基因區(qū)段或Vk 3-20基因區(qū)段的人輕鏈相締合。在一個實施方案中，所述第一重鏈包含特異性結(jié)合第一抗原的第一表位的第一重鏈可變區(qū)，且第二重鏈包含特異性結(jié)合第二抗原的第二表位的第二重鏈可變區(qū)。在具體的實施方案中，所述第一抗原和所述第二抗原是不同的。在具體的實施方案中，所述第一抗原和所述第二抗原是相同的，并且所述第一表位和所述第二表位不是完全相同的；在具體的實施方案中，所述結(jié)合蛋白的第一分子與所述第一表位的結(jié)合不阻礙所述結(jié)合蛋白的第二分子與所述第二表位的結(jié)合。一方面，源自本文所述的小鼠的人免疫球蛋白序列的完全人結(jié)合蛋白包含第一免疫球蛋白重鏈和第二免疫球蛋白重鏈，其中所述第一免疫球蛋白重鏈包含與第二免疫球蛋白重鏈的可變區(qū)不完全相同的第一可變區(qū)，并且其中所述第一免疫球蛋白重鏈包含野生型蛋白A結(jié)合決定簇，且所述第二重鏈缺少野生型蛋白A結(jié)合決定簇。在一個實施方案中，所述第一免疫球蛋白重鏈在分離條件下結(jié)合蛋白A，且所述第二免疫球蛋白重鏈不結(jié)合蛋白A或與第一免疫球蛋白重鏈在分離條件下與蛋白A的結(jié)合相比，對蛋白A的結(jié)合弱至少10倍，100倍，或1000倍。在具體的實施方案中，所述第一和第二重鏈?zhǔn)荌gGl同種型，其中所述第二重鏈包括選自95R(EU 435R)、96F(EU 436F)及其組合的修飾，并且其中所述第一重鏈缺少此種修飾。一方面，提供了制備雙特異性抗原結(jié)合蛋白的方法，所述方法包括使本文所述的第一小鼠暴露于包含第一表位的第一目的抗原，使本文所述的第二小鼠暴露于包含第二表位的第二目的抗原，允許所述第一和所述第二小鼠各自發(fā)動對于目的抗原的免疫應(yīng)答，在所述第一小鼠中鑒別出結(jié)合第一目的抗原的第一表位的第一人重鏈可變區(qū)，在所述第二小鼠中鑒別出結(jié)合第二目的抗原的第二表位的第二人重鏈可變區(qū)，制備編碼結(jié)合所述第一目的抗原的第一表位的第一重鏈的第一完全人重鏈基因，制備編碼結(jié)合所述第二目的抗原的第二表位的第二重鏈的第二完全人重鏈基因，在表達(dá)源自人Vk 1-39或人V K 3-20基因區(qū)段的單一完全人輕鏈的細(xì)胞中表達(dá)所述第一重鏈和所述第二重鏈，以形成雙特異性抗原結(jié)合蛋白，以及分離所述雙特異性抗原結(jié)合蛋白。 在一個實施方案中，所述第一抗原和所述第二抗原不是完全相同的。在一個實施方案中，所述第一抗原和所述第二抗原是完全相同的，且所述第一表位和所述第二表位不是完全相同的。在一個實施方案中，所述第一重鏈可變區(qū)與所述第一表位的結(jié)合不阻礙所述第二重鏈可變區(qū)與所述第二表位的結(jié)合。在一個實施方案中，所述第一抗原選自可溶性抗原和細(xì)胞表面抗原(例如腫瘤抗原)，且所述第二抗原包括細(xì)胞表面受體。在具體的實施方案中，所述細(xì)胞表面受體是免疫球蛋白受體。在具體的實施方案中，所述免疫球蛋白受體是Fe受體。在一個實施方案中，所述第一抗原和所述第二抗原是相同的細(xì)胞表面受體，并且所述第一重鏈與所述第一表位的結(jié)合不阻礙所述第二重鏈與所述第二表位的結(jié)合。在一個實施方案中，所述輕鏈的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域包含2至5個體細(xì)胞突變。在一個實施方案中，所述輕鏈可變結(jié)構(gòu)域是體細(xì)胞突變的共有輕鏈，其在所述第一或第二經(jīng)免疫的小鼠的B細(xì)胞中與所述第一或第二重鏈可變結(jié)構(gòu)域一起表達(dá)。在一個實施方案中，所述第一完全人重鏈攜帶減少其對于蛋白質(zhì)A的親和力的氨基酸修飾，且所述第二完全人重鏈不包含減少其對于蛋白質(zhì)A的親和力的修飾。一方面，提供了根據(jù)本發(fā)明制備的包含人重鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗體或雙特異性抗體。另一方面，提供了本文所述的小鼠在制備完全人抗體或完全人雙特異性抗體中的用途。本文所描述的任何實施方案和方面均可被用于與另一個相結(jié)合，除非另行指明或從上下文來看是顯然的。通過回顧隨后的描述，其它的實施方案對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將變得顯然。發(fā)明詳述本發(fā)明不限于特定的方法以及所描述的實驗條件，因為此種方法和條件可能變化。還將理解，本文中所使用的術(shù)語僅僅是用于描述具體實施方案的目的，而不意在是限制性的，因為本發(fā)明的范圍是由權(quán)利要求限定的。除非另外定義，本文中所使用的所有術(shù)語和短語包括所述術(shù)語和短語在本領(lǐng)域中所獲得的含義，除非從所述術(shù)語或短語所使用的上下文中清楚地顯示了或顯而易見是與此相反的。雖然與本文中所描述的那些方法和材料類似或等同的任何方法和材料均可被用于實施或測試本發(fā)明，現(xiàn)在描述了特定的方法和材料。所述及的所有出版物均在此通過引用而并入。如本文中所使用的，術(shù)語〃抗體〃包括包含四條多肽鏈的免疫球蛋白分子，兩條重鏈(H)和兩條輕鏈(L)通過二硫鍵相互連接。每條重鏈包含重鏈可變(VH)區(qū)和重鏈恒定區(qū)(CH)。所述重鏈恒定區(qū)包含三個結(jié)構(gòu)域CH1，CH2和CH3。每條輕鏈包含輕鏈可變(VL)區(qū)和輕鏈恒定區(qū)(CL)。所述VH和VL區(qū)域可被進(jìn)一步細(xì)分為高變區(qū)，稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，散布更為保守的被稱為框架區(qū)(FR)的區(qū)域穿插分布。每個VH和VL包含三個CDR和四個FR，以下列順序從氨基端至羧基端排列FR1，CDR1，F(xiàn)R2，CDR2，F(xiàn)R3，CDR3，F(xiàn)R4(重鏈CDR可被簡稱為HCDRl，HCDR2和HCDR3;輕鏈CDR可被簡稱為LCDRl，LCDR2和LCDR3)。術(shù)語“高親和力”抗體是指這樣的抗體其相關(guān)于其靶表位具有的Kd為約KT9M或更低(例如，約Ix10_9M，1x 10_10M，1x 10_nM，或約Ix 10_12M)。在一個實施方案中，Kd是通過表面等離子共振(例如BIAC0RE )測量的；在另一個實施方案中，Kd是通過ELISA測量的。 短語“雙特異性抗體”包括能夠選擇性地結(jié)合兩個或更多個表位的抗體。雙特異性抗體通常包含兩條不完全相同的重鏈，其中每條重鏈特異性地結(jié)合不同的表位一在兩種不同的分子上(例如兩個不同免疫原上的不同表位)或在相同的分子上(例如同一免疫原上的不同表位)。如果雙特異性抗體能夠選擇性地結(jié)合兩個不同的表位(第一表位和第二表位)，則與所述第一重鏈對所述第二表位的親和力相比，所述第一重鏈對所述第一表位的親和力將通常低至少一至二或三或四或更多個數(shù)量級，反之亦然。所述雙特異性抗體所特異性結(jié)合的表位可以在相同或不同的靶標(biāo)上(例如，在相同或不同的蛋白上)?？衫纾ㄟ^將識別同一免疫原上的不同表位的重鏈相結(jié)合來制備雙特異性抗體。例如，編碼識別同一免疫原的不同表位的重鏈可變序列的核酸序列可與編碼相同或不同重鏈恒定區(qū)的核酸序列相融合，并且這種序列可在表達(dá)免疫球蛋白輕鏈的細(xì)胞中表達(dá)。典型的雙特異性抗體具有兩條重鏈，其中每一條具有三個重鏈⑶R，隨后是(N-末端至C-末端)CHl結(jié)構(gòu)域，鉸鏈，CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域；和免疫球蛋白輕鏈，其不賦予表位結(jié)合的特異性但是能夠與每條重鏈締合，或者能夠與每條重鏈締合并且能夠結(jié)合重鏈表位結(jié)合區(qū)所結(jié)合的一個或多個表位，或者能夠與每條重鏈締合并且使得所述重鏈中的一條或者兩條能夠與一個或兩個表位相結(jié)合。術(shù)語“細(xì)胞”包括適于表達(dá)重組核酸序列的任何細(xì)胞。細(xì)胞包括下列的細(xì)胞原核和真核(單細(xì)胞或多細(xì)胞)，細(xì)菌細(xì)胞(例如大腸桿菌的菌株、芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬等)，分枝桿菌細(xì)胞，真菌細(xì)胞，酵母細(xì)胞(例如，釀酒酵母，裂殖酵母，畢赤酵母，甲醇畢赤酵母等)，植物細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞(例如SF-9，SF-21，桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞，粉紋夜蛾等)，非人動物細(xì)胞，人細(xì)胞，或細(xì)胞融合物例如，雜交瘤或四價體瘤(quadroma)。在一些實施方案中，所述細(xì)胞是人，猴，猿，倉鼠，大鼠或小鼠細(xì)胞。在一些實施方案中，所述細(xì)胞是真核的并且選自下列細(xì)胞CHO (例如CHO Kl，DXB-11CH0，Veggie-CHO)，COS (例如C0S-7)，視網(wǎng)膜細(xì)胞，Vero, CVl，腎(例如 HEK293，293EBNA, MSR 293，MDCK, HaK, BHK)，HeLa, H印G2，WI38，MRC5，Colo205, HB 8065，HL-60，(例如 BHK21)，Jurkat, Daudi，A431 (表皮)，CV-1，U937，3T3,L細(xì)胞，C127細(xì)胞，SP2/0, NS-O, MMT 060562，塞爾托利氏細(xì)胞，BRL 3A細(xì)胞，HT1080細(xì)胞，骨髓瘤細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞，和源自前述細(xì)胞的細(xì)胞系。在一些實施方案中，所述細(xì)胞包含一個或多個病毒基因，例如表達(dá)病毒基因的視網(wǎng)膜細(xì)胞(例如PER. C6 細(xì)胞)。短語“互補(bǔ)決定區(qū)”或術(shù)語“⑶R”包括由生物體的免疫球蛋白基因的核酸序列編碼的氨基酸序列，其通常(即在野生型動物中)出現(xiàn)在免疫球蛋白分子(例如抗體或T細(xì)胞受體)的輕鏈或重鏈的可變區(qū)中的兩個框架區(qū)之間。CDR可由例如下列編碼種系序列或者經(jīng)重排或未重排的序列，以及例如由幼稚或成熟的B細(xì)胞或T細(xì)胞編碼。CDR可以是經(jīng)體細(xì)胞突變的(例如與動物種系中所編碼的序列不同)，人源化的，和/或以氨基酸置換、添加或缺失進(jìn)行修飾的。在一些情形中(例如，對于CDR3)，CDR可由兩個或更多個序列(例如種系序列)編碼，所述兩個或更多個序列是不連續(xù)的(例如，在未重排的核酸序列中)但是在B細(xì)胞核酸序列中是連續(xù)的，例如作為剪接或連接所述序列的結(jié)果(例如V-D-J重組以形成重鏈⑶R3)。當(dāng)用于描述保守的氨基酸置換時，術(shù)語"保守的”包括一個氨基酸殘基被含有具有相似化學(xué)特性(例如電荷或疏水性)的側(cè)鏈R基團(tuán)的另一個氨基酸殘基所置換。通常，保守 的氨基酸置換將不會實質(zhì)上改變目的蛋白的功能特性，例如，可變區(qū)以所需的親和力特異性結(jié)合靶表位的能力。含有具有相似化學(xué)特性的側(cè)鏈的氨基酸的組的實例包括脂肪族側(cè)鏈，例如甘氨酸，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸和異亮氨酸；脂肪族-羥基側(cè)鏈，例如絲氨酸和蘇氨酸；含有酰胺的側(cè)鏈，例如天冬酰胺和谷氨酰胺；芳香族側(cè)鏈，例如苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸；堿性側(cè)鏈，例如賴氨酸，精氨酸和組氨酸；酸性側(cè)鏈，例如天冬氨酸和谷氨酸；以及含硫的側(cè)鏈，例如半胱氨酸和甲硫氨酸。保守性氨基酸置換組包括例如，纈氨酸/亮氨酸/異亮氨酸，苯丙氨酸/酪氨酸，賴氨酸/精氨酸，丙氨酸/纈氨酸，谷氨酸/天冬氨酸，天冬酰胺/谷氨酰胺。在一些實施方案中，保守性氨基酸置換可以是用丙氨酸置換蛋白中的任何天然殘基，如在例如丙氨酸掃描誘變中所使用的。在一些實施方案中，進(jìn)行的保守性置換在 PAM2501og-可能性矩陣(在 Gonnet 等人(1992) Exhaustive Matching of the EntireProtein Sequence Database, Science 256:1443-45中公開,在此通過引用而并入)中具有正值。在一些實施方案中，所述置換是中等保守的置換，其中所述置換在PAM2501og-可能性矩陣中具有非負(fù)值。在一些實施方案中，免疫球蛋白輕鏈或重鏈中的殘基位置以一個或多個保守性氨基酸置換而不同。在一些實施方案中，免疫球蛋白輕鏈或其功能性片段(例如允許從例如B細(xì)胞表達(dá)和分泌的片段)中的殘基位置與那些在本文中列出了其氨基酸序列的輕鏈不完全相同，但是以一個或多個保守性氨基酸置換而不同。短語“表位結(jié)合蛋白”包括具有至少一個⑶R并且能夠選擇性地識別表位的蛋白，例如，能夠以約I微摩爾或更低的Kd (例如約Ix 10_6M，Ix 10_7M，Ix 10_9M，Ix 10_9M，IxIO^10M, Ix 10_nM，或約Ix 10_12M的KD)結(jié)合表位。治療性的表位結(jié)合蛋白(例如治療性抗體)通常要求納摩爾或皮摩爾范圍內(nèi)的KD。短語“功能性片段”包括表位結(jié)合蛋白的片段，所述片段能夠被表達(dá)、分泌并且以微摩爾、納摩爾或皮摩爾范圍內(nèi)的Kd特異性地結(jié)合表位。特異性識別包括具有至少在微摩爾范圍、納摩爾范圍或皮摩爾范圍內(nèi)的KD。術(shù)語“種系”包括指非體細(xì)胞突變的細(xì)胞(例如非體細(xì)胞突變的B細(xì)胞或pre-B細(xì)胞或造血細(xì)胞)中的免疫球蛋白核酸序列。
短語“重鏈”或“免疫球蛋白重鏈”包括來自任何生物體的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)序列。除非另行指明，重鏈可變結(jié)構(gòu)域包括三個重鏈CDR和四個FR區(qū)域。重鏈的片段包括⑶R，⑶R和FR，以及它們的組合。在可變結(jié)構(gòu)域之后，典型的重鏈具有(從N-末端至C-末端)CHl結(jié)構(gòu)域，鉸鏈，CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域。重鏈的功能性片段包括這樣的片段其能夠特異性地識別表位(例如，以微摩爾、納摩爾或皮摩爾范圍內(nèi)的Kd識別表位)，能夠表達(dá)并從細(xì)胞分泌，和包含至少一個CDR。當(dāng)與序列相關(guān)聯(lián)而使用時，術(shù)語“同一性”包括如由本領(lǐng)域中已知的、可被用于測量核苷酸和/或氨基酸序列同一'I"生的多個不同的算法確定的同一'I"生。在本文中所描述的一些實施方案中，同一'I"生是使用下列確定的ClustalW V. I. 83 (slow)比對(采用10.0的開放缺口處罰，O. I的延伸缺口處罰)，和使用Gonnet相似性矩陣(MacVector 10.0.2，MacVector Inc.，2008)。關(guān)于序列同一性所比較的序列的長度將取決于特定的序列，但是在輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域的情形中，所述長度應(yīng)該含有這樣的序列其長度足以折疊成為能夠自我締合以形成典型輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域的輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域，例如能夠形成兩個包含β鏈的β片并且能夠與人或小鼠的至少一個CHl結(jié)構(gòu)域相互作用。在CHl結(jié)構(gòu)域的情形中，序列的 長度應(yīng)當(dāng)含有這樣的序列其長度足以折疊成為CHl結(jié)構(gòu)域，所述CHl結(jié)構(gòu)域能夠形成兩個包含β鏈的β片并且能夠與小鼠或人的至少一個輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域相互作用。短語“免疫球蛋白分子”包括兩條免疫球蛋白重鏈和兩條免疫球蛋白輕鏈。所述重鏈可以相同或不同，且所述輕鏈可以相同或不同。短語“輕鏈”包括來自任何生物體的免疫球蛋白輕鏈序列，并且除非另行指明，其包括人K和λ輕鏈，VpreB以及替代輕鏈(surrogate light chain)。除非另行指明，輕鏈可變(VL)結(jié)構(gòu)域通常包括三個輕鏈CDR和四個框架(FR)區(qū)。通常，全長輕鏈從氨基端到羧基端包括VL結(jié)構(gòu)域(其包括FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4)，和輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域。輕鏈包括，例如不選擇性地結(jié)合表位結(jié)合蛋白(它們出現(xiàn)在所述表位結(jié)合蛋白中)所選擇性地結(jié)合的第一或第二表位的那些。輕鏈也包括結(jié)合和識別、或者協(xié)助重鏈結(jié)合和識別表位結(jié)合蛋白(它們出現(xiàn)在所述表位結(jié)合蛋白中)所選擇性地結(jié)合的一個或多個表位的那些。常見的輕鏈?zhǔn)窃醋匀薞k 1-39JK5基因區(qū)段或人Vk3-20Jk I基因區(qū)段的那些，并且包括它們的體細(xì)胞突變的版本(例如，親和成熟的)。短語“微摩爾范圍”意在指1-999微摩爾；短語“納摩爾范圍”意在指1-999納摩爾；短語“皮摩爾范圍”意在指1-999皮摩爾。短語“體細(xì)胞突變的”包括指來自經(jīng)歷了類別轉(zhuǎn)換的B細(xì)胞的核酸序列，其中所述經(jīng)類別轉(zhuǎn)換的B細(xì)胞中的免疫球蛋白可變區(qū)的核酸序列(例如，重鏈可變結(jié)構(gòu)域或包括重鏈CDR或者FR序列)與類別轉(zhuǎn)換之前的B細(xì)胞中的核酸序列不完全相同，例如未經(jīng)歷類別轉(zhuǎn)換的B細(xì)胞和經(jīng)歷了類別轉(zhuǎn)換的B細(xì)胞之間在CDR或框架核酸序列中的差異?！绑w細(xì)胞突變的”包括指來自與非親和-成熟的B細(xì)胞中的相應(yīng)免疫球蛋白可變區(qū)序列(即，種系細(xì)胞的基因組中的序列)不完全相同的親和-成熟的B細(xì)胞的核酸序列。短語“體細(xì)胞突變的”也包括指使B細(xì)胞暴露于目的表位之后來自所述B細(xì)胞的免疫球蛋白可變區(qū)核酸序列，其中所述核酸序列區(qū)別于使所述B細(xì)胞暴露于目的表位之前的相應(yīng)核酸序列。短語“體細(xì)胞突變的”是指來自如下抗體的序列所述抗體是響應(yīng)于免疫原刺激而在具有人免疫球蛋白可變區(qū)核酸序列的動物(例如小鼠)中產(chǎn)生的，并且其產(chǎn)生自所述動物中固有運(yùn)行的選擇過程。當(dāng)指核酸序列時，術(shù)語“未重排的”包括在動物細(xì)胞的種系中存在的核酸序列。短語“可變結(jié)構(gòu)域”包括免疫球蛋白輕鏈或重鏈(按所需進(jìn)行修飾)的氨基酸序列，所述序列以從N-末端至C-末端的順序包含下列氨基酸區(qū)域(除非另行指明)FR1，CDRl，F(xiàn)R2, CDR2, FR3, CDR3, FR4。共有輕鏈(commonlight chain)之前的制備有用的多特異性表位結(jié)合蛋白(例如雙特異性抗體)的努力被通常有共同范式的多種問題所阻礙序列的體外選擇或操控以合理地工程化，或者通過嘗試-和-錯誤(適于配對異二聚雙特異性人免疫球蛋白的形式)進(jìn)行工程化。不幸地，大多數(shù)(如果不是所有的)體外工程化方法主要提供適于(如果有的話)個體分子的即時定位。另 一方面，未曾實現(xiàn)采用復(fù)雜生物體來選擇能夠產(chǎn)生人類治療劑的適當(dāng)配對的體外方法。一般地，幼稚小鼠序列常常不是用于人治療序列的良好來源。至少由于這一原因，產(chǎn)生與共有人輕鏈配對的小鼠重鏈免疫球蛋白可變區(qū)具有有限的實際用處。更多的體外工程化努力將花費(fèi)在嘗試-和-錯誤方法上，以試圖人源化小鼠重鏈可變序列，同時希望保留表位特異性和親和力而維持與共有人輕鏈偶聯(lián)的能力，這具有不確定的結(jié)果。在此種過程結(jié)束時，終產(chǎn)物可保持某些特異性和親和力，并與共有輕鏈締合，但是在人中的最終免疫原性將有可能仍是嚴(yán)重的風(fēng)險。因此，用于制備人治療劑的合適的小鼠將包括人重鏈可變區(qū)基因區(qū)段的適當(dāng)大的集合，替代內(nèi)源小鼠重鏈可變區(qū)基因區(qū)段。所述人重鏈可變區(qū)基因區(qū)段應(yīng)當(dāng)能夠與內(nèi)源小鼠重鏈恒定結(jié)構(gòu)域重排及重組以形成反向嵌合重鏈(即，包含人可變結(jié)構(gòu)域和小鼠恒定區(qū)的重鏈)。所述重鏈應(yīng)當(dāng)能夠進(jìn)行類別轉(zhuǎn)換和體細(xì)胞超突變，從而可獲得重鏈可變結(jié)構(gòu)域的適當(dāng)大的集合，以使小鼠選擇能夠與人輕鏈可變區(qū)的有限的集合相締合的重鏈。針對多個重鏈選擇共有輕鏈的小鼠具有實際的用處。在多種實施方案中，在只能表達(dá)共有輕鏈的小鼠中表達(dá)的抗體將具有能夠與完全相同或基本上完全相同的輕鏈締合且一起表達(dá)的重鏈。這在制備雙特異性抗體中是特別有用的。例如，可用第一免疫原免疫接種此類小鼠以產(chǎn)生表達(dá)特異性結(jié)合第一表位的抗體的B細(xì)胞?？捎玫诙庖咴庖呓臃N所述小鼠(或遺傳學(xué)上相同的小鼠)以產(chǎn)生表達(dá)特異性結(jié)合第二表位的抗體的B細(xì)胞?？蓮乃鯞細(xì)胞克隆可變重鏈區(qū)域并使其與相同的重鏈恒定區(qū)域以及相同的輕鏈一起表達(dá)，并在細(xì)胞中表達(dá)以制備雙特異性抗體，其中所述雙特異性抗體的輕鏈組分經(jīng)小鼠選擇以與所述輕鏈組分締合并一起表達(dá)。本發(fā)明人對小鼠進(jìn)行了工程化以產(chǎn)生將與相當(dāng)多樣的重鏈家族適當(dāng)配對的免疫球蛋白輕鏈，所述重鏈家族包括其可變區(qū)偏離種系序列(例如親和成熟的或體細(xì)胞突變的可變區(qū))的重鏈。在多種實施方案中，小鼠被設(shè)計為使人輕鏈可變結(jié)構(gòu)域與包含體細(xì)胞突變的人重鏈可變結(jié)構(gòu)域配對，因此使得能夠產(chǎn)生適于用作人治療劑的高親和力結(jié)合蛋白的途徑。經(jīng)過生物體內(nèi)長且復(fù)雜的抗體選擇過程，所述經(jīng)遺傳工程化的小鼠在使人重鏈可變結(jié)構(gòu)域的多樣集合與有限數(shù)目的人輕鏈選擇配對方面產(chǎn)生了生物學(xué)上適當(dāng)?shù)倪x擇。為了實現(xiàn)這一點，小鼠被工程化以展示有限數(shù)目的人輕鏈可變結(jié)構(gòu)域選擇連同廣泛的人重鏈可變結(jié)構(gòu)域選擇。當(dāng)用免疫原刺激后，所述小鼠使其集合中的解決方案數(shù)目最大化，以產(chǎn)生針對所述免疫原的抗體，主要或唯一地受到其集合中的輕鏈選擇數(shù)目的限制。在多種實施方案中，這包括允許小鼠實現(xiàn)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的合適的和相容的體細(xì)胞突變，然而所述突變將與種類相對多樣的人重鏈可變結(jié)構(gòu)域(特別包括體細(xì)胞突變的人重鏈可變結(jié)構(gòu)域)相容。為了實現(xiàn)輕鏈選擇的有限的集合，對小鼠進(jìn)行工程化以使其在制備或重排幼稚小鼠輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的能力方面是無功能的或基本上無功能的。這可通過例如缺失小鼠的輕鏈可變區(qū)基因區(qū)段來實現(xiàn)。然后，內(nèi)源小鼠基因座可被所選擇的外源的合適的人輕鏈可變區(qū)基因區(qū)段修飾，所述人輕鏈可變區(qū)基因區(qū)段與內(nèi)源小鼠輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域可操作地連接，連接的方式使得所述外源人可變區(qū)基因區(qū)段能夠與內(nèi)源小鼠輕鏈恒定區(qū)基因重排及重組并形成經(jīng)重排的反向嵌合輕鏈基因(人可變，小鼠恒定)。在多種實施方案中，輕鏈可變區(qū)能夠成為經(jīng)體細(xì)胞突變的。在多種實施方案中，為了使輕鏈可變區(qū)獲得體細(xì)胞突變的能力最大化，在小鼠中保留了適當(dāng)?shù)脑鰪?qiáng)子。例如，當(dāng)修飾小鼠K基因座，以用人K可變區(qū)基因區(qū)段替代內(nèi)源小鼠K可變區(qū)基因區(qū)段時，有功能地保留了小鼠K內(nèi)含子增強(qiáng)子和小鼠K 3’增強(qiáng)子，或者使得它們不被干擾。

提供了經(jīng)遺傳工程化的小鼠，其表達(dá)與多種反向嵌合(人可變，小鼠恒定)重鏈締合的反向嵌合(人可變，小鼠恒定)輕鏈的有限的集合。在多種實施方案中，內(nèi)源小鼠K輕鏈可變區(qū)基因區(qū)段缺失并被與內(nèi)源小鼠K恒定區(qū)基因可操作地連接的單個(或兩個)人輕鏈可變區(qū)基因區(qū)段替換。在使得人輕鏈可變區(qū)基因區(qū)段的體細(xì)胞超突變最大化的實施方案中，保留了小鼠K內(nèi)含子增強(qiáng)子和小鼠K 3’增強(qiáng)子。在多種實施方案中，小鼠還包含無功能的λ輕鏈基因座，或者其缺失，或者使得所述基因座不能產(chǎn)生λ輕鏈的缺失。提供了經(jīng)遺傳工程化的小鼠，在多種實施方案中，所述小鼠包含缺少內(nèi)源小鼠輕鏈可變基因區(qū)段且包含人可變基因區(qū)段的輕鏈可變區(qū)基因座，在一個實施方案中，是與小鼠恒定區(qū)可操作地連接的重排的人V/J序列，其中所述基因座能夠進(jìn)行體細(xì)胞超突變，且其中所述基因座表達(dá)包含與小鼠恒定區(qū)相連的人V/J序列的輕鏈。因此，在多種實施方案中，所述基因座包含與正常的或野生型水平的體細(xì)胞超突變相關(guān)聯(lián)的小鼠K 3’增強(qiáng)子。在多種實施方案中，當(dāng)用目的抗原免疫接種時，經(jīng)遺傳工程化的小鼠產(chǎn)生展現(xiàn)出人免疫球蛋白重鏈可變區(qū)的多種重排的B細(xì)胞，所述重鏈可變區(qū)與一種或兩種重排的輕鏈一起表達(dá)及行使功能，這包括下述實施方案其中所述一種或兩種輕鏈包含含有例如I至5個體細(xì)胞突變的人輕鏈可變區(qū)。在多種實施方案中，如此表達(dá)的人輕鏈能夠與在所述小鼠中表達(dá)的任何人免疫球蛋白重鏈可變區(qū)締合并一起表達(dá)。結(jié)合多于一個表位的表位結(jié)合蛋白本文所述的組合物和方法可用于制備以高親和力結(jié)合多于一個表位的結(jié)合蛋白，例如雙特異性抗體。本發(fā)明的優(yōu)勢包括選擇適當(dāng)高的結(jié)合(例如親和成熟的)重鏈免疫球蛋白鏈的能力，每種所述重鏈免疫球蛋白鏈都將與單一的輕鏈締合。合成和表達(dá)雙特異性結(jié)合蛋白是有問題的，這一部分是由于與鑒別能夠與兩種不同的重鏈締合并一起表達(dá)的合適的輕鏈相關(guān)的問題，一部分是由于分離的問題。本文中所描述的方法和組合物允許經(jīng)遺傳修飾的小鼠通過其它方面為天然的過程來選擇能夠與多于一種重鏈(包括經(jīng)體細(xì)胞突變的(例如親和成熟的)重鏈)締合及一起表達(dá)的合適的輕鏈?？设b別來自如本文所述的經(jīng)免疫接種的小鼠[其表達(dá)具有反向嵌合重鏈(即，人可變和小鼠恒定)的親和成熟的抗體]的合適的B細(xì)胞的人VL和VH序列，并將其與合適的人恒定區(qū)基因序列(例如，人IgGl)符合讀框地克隆到表達(dá)載體中，其中所述經(jīng)免疫接種的小鼠?？芍苽鋬煞N此類構(gòu)建體，其中每種構(gòu)建體編碼結(jié)合不同表位的人重鏈可變結(jié)構(gòu)域。種系序列中的或者來自B細(xì)胞(所述B細(xì)胞中的序列經(jīng)體細(xì)胞突變)的人VL之一(例如，人Vk 1-39JK5或人Vk3-20Jk I)可符合讀框地與合適的人恒定區(qū)基因(例如，人κ恒定基因)融合?？蓪⑦@三種完全人重鏈和輕鏈構(gòu)建體置于合適的細(xì)胞中用于表達(dá)。所述細(xì)胞將表達(dá)兩個主要的種類具有完全相同的輕鏈的同二聚重鏈，和具有完全相同的輕鏈的異二聚重鏈。為了允許將這些主要的種類容易地分離，對所述重鏈之一進(jìn)行修飾以省略蛋白A-結(jié)合決定簇，這產(chǎn)生了同二聚結(jié)合蛋白與異二聚結(jié)合蛋白的不同親和力。解決這一問題的組合物和方法被描述于USSN 12/832,838中，其于2010年6月25日遞交，題目為“Readily Isolated Bispecific Antibodies with Native Immunoglobulin Format，，,作為US 2010/0331527A1被公開，在此通過引用而并入。一方面，提供了如本文所述的表位結(jié)合蛋白，其中人VL和VH序列源自本文所述 的、經(jīng)包含目的表位的抗原免疫接種的小鼠。在一個實施方案中，提供了表位結(jié)合蛋白，其包含第一和第二多肽，所述第一多肽從N-末端至C-末端包含選擇性地結(jié)合第一表位的第一表位結(jié)合區(qū)，隨后是恒定區(qū)，所述恒定區(qū)包含選自IgGl、IgG2、IgG4及其組合的人IgG的第一 CH3區(qū)；所述第二多肽從N-末端至C-末端包含選擇性地結(jié)合第二表位的第二表位結(jié)合區(qū)，隨后是恒定區(qū)，所述恒定區(qū)包含選自IgGl、IgG2、IgG4及其組合的人IgG的第二 CH3區(qū)，其中所述第二 CH3區(qū)包含減少或消除所述第二 CH3結(jié)構(gòu)域與蛋白A的結(jié)合的修飾。在一個實施方案中，所述第二 CH3區(qū)包含H95R修飾(根據(jù)MGT外顯子編號；根據(jù)EU編號為H435R)。在另一個實施方案中，所述第二 CH3區(qū)還包含Y96F稀釋(MGT;根據(jù)EU為 Y436F)。在一個實施方案中，所述第二 CH3區(qū)來自經(jīng)修飾的人IgGl，并進(jìn)一步包含選自下列的修飾D16E, L18M, N44S, K52N, V57M 和 V82I (MGT;根據(jù) EU 為 D356E，L358M, N384S,K392N, V397M 和 V422I)。在一個實施方案中，所述第二 CH3區(qū)來自經(jīng)修飾的人IgG2，并進(jìn)一步包含選自下列的修飾N44S，K52N 和 V82I(IMGT;根據(jù) EU 為 N384S，K392N 和 V422I)。在一個實施方案中，所述第二 CH3區(qū)來自經(jīng)修飾的人IgG4，并且進(jìn)一步包含選自下列的修飾Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q 和 V82I (IMGT;根據(jù) EU 為 Q355R, N384S,K392N, V397M, R409K, E419Q 和 V422I)。用于制備結(jié)合多于一個表位的表位結(jié)合蛋白的一種方法是用包含第一目的表位的抗原免疫接種根據(jù)本發(fā)明的第一小鼠，其中所述小鼠包含不含有能夠重排并形成輕鏈的內(nèi)源小鼠VL的內(nèi)源免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)基因座，其中在所述內(nèi)源小鼠免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)基因座處，單一的人VL基因區(qū)段與小鼠內(nèi)源輕鏈恒定區(qū)基因可操作地連接，并且所述人VL基因區(qū)段選自人Vk 1-39JK 5和人Vk 3-20JK 1，所述內(nèi)源小鼠VH基因區(qū)段全部或部分地被人VH基因區(qū)段替代，從而使得由所述小鼠制備的免疫球蛋白重鏈僅僅或基本上是包含人可變結(jié)構(gòu)域和小鼠恒定結(jié)構(gòu)域的重鏈。當(dāng)被免疫接種時，此類小鼠將制備反向嵌合抗體，其僅包含兩個人輕鏈可變結(jié)構(gòu)域之一(例如，人Vk 1-39JK 5和人Vk 3-20JK I之一)。一旦鑒別了編碼結(jié)合目的表位的VH的B細(xì)胞，可找回所述VH(以及任選地VL)的核苷酸序列(例如，通過PCR)并將其與合適的人免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域符合讀框地克隆到表達(dá)構(gòu)建體中。可重復(fù)此過程以鑒別出結(jié)合第二表位的第二 VH結(jié)構(gòu)域，并且可找回第二 VH基因序列并將其與第二合適的免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域符合讀框地克隆到表達(dá)載體中。所述第一和第二免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域可以是相同或不同的同種型，并且所述免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域之一(但另一個不是)可以如本文中或US 2010/0331527A1中所述被修飾，且所述表位結(jié)合蛋白可在合適的細(xì)胞中被表達(dá)并基于其與同二聚表位結(jié)合蛋白相比對于蛋白A的不同的親和力而被分離，例如，如US2010/0331527A1中所描述的。在一個實施方案中，提供了用于制備雙特異性表位結(jié)合蛋白的方法，所述方法包括鑒別來自如本文所描述的小鼠的第一親和-成熟的(例如，包含一個或多個體細(xì)胞超突變)人VH核苷酸序列(VHl)，鑒別來自如本文所描述的小鼠的第二親和-成熟的(例如，包含一個或多個體細(xì)胞超突變)人VH核苷酸序列(VH2) JfVHl與缺少如US2010/0331527A1中所描述的蛋白A-決定簇修飾的人重鏈符合讀框地克隆以形成重鏈I (HCl)，將VH2與含有如US 2010/0331527A1中所描述的蛋白A-決定簇的人重鏈符合讀框地克隆以形成重鏈 2 (HC2)，將包含HCl的表達(dá)載體以及包含HC2的相同或不同的表達(dá)載體引入細(xì)胞中，其中所述細(xì)胞還表達(dá)人免疫球蛋白輕鏈，所述人免疫球蛋白輕鏈包含與人輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域融合的人V K 1-39/人J K 5或人V K 3-20/人Jk 1，允許所述細(xì)胞表達(dá)包含由VHl編碼的VH結(jié)構(gòu)域和由VH2編碼的VH結(jié)構(gòu)域的雙特異性表位結(jié)合蛋白，以及基于其與單特異性同二聚表位結(jié)合蛋白相比結(jié)合蛋白A的不同能力來分離所述雙特異性表位結(jié)合蛋白。在具體的實施方案中，HCl為IgGl，HC2為包含修飾H95RaMGT;根據(jù)EU為H435R)且進(jìn)一步包含修飾Y96F(IMGT;根據(jù)EU為Y436F)的IgGl。在一個實施方案中，所述由VHl編碼的VH結(jié)構(gòu)域，所述由VH2編碼的VH結(jié)構(gòu)域，或者兩者，是經(jīng)體細(xì)胞突變的。與共有人VL—起表達(dá)的人VH基因使來自針對四種不同的抗原產(chǎn)生的親和-成熟的抗體的多種人可變區(qū)與它們的共有輕鏈一起表達(dá)，或者與選自人Vk 1-39JK 5、人Vk 3-20JK I或人VpreBJ λ 5中的至少一種的人輕鏈一起表達(dá)(見實施例I)。對于針對所述抗原中的每一個的抗體，使來自不同基因家族的經(jīng)體細(xì)胞突變的高親和力重鏈與重排的人種系V K 1-39JK 5和Vk 3-20JK I區(qū)域成功地配對并從表達(dá)所述重鏈和輕鏈的細(xì)胞中分泌。對于V K 1-39JK 5和Vk 3-20JK 1，VH結(jié)構(gòu)域源自下列有利地表達(dá)的人VH家族1-2，1-8，1-24，2-5, 3-7, 3-9, 3-11,3-13,3-15，3-20，3-23，3-30, 3-33, 3-48，4-31，4-39，4-59，5-51 和 6-1。因此，被工程化以表達(dá)來自Vk 1-39JK 5和Vk 3-20JK I之一或兩者的人VL結(jié)構(gòu)域的有限的集合的小鼠將產(chǎn)生多樣的體細(xì)胞突變的人VH結(jié)構(gòu)域群體，所述VH結(jié)構(gòu)域來自經(jīng)修飾以用人VH基因區(qū)段替代小鼠VH基因區(qū)段的VH基因座。小鼠被遺傳工程化以表達(dá)與單一的經(jīng)重排的輕鏈(例如，V K 1-39/J或V K 3-20/J)締合的反向嵌合(人可變，小鼠恒定)的免疫球蛋白重鏈，當(dāng)所述小鼠被目的抗原免疫接種時，其產(chǎn)生包含多種人V區(qū)段重排且表達(dá)多種高親和力抗原特異性抗體的B細(xì)胞，所述抗體關(guān)于其阻礙抗原與其配體相結(jié)合的能力方面，以及關(guān)于其結(jié)合所述抗原的變體的能力方面具有多樣的特性(見實施例5至10)。因此，本文所述的小鼠和方法可用于制備和選擇人免疫球蛋白重鏈可變結(jié)構(gòu)域，這包括體細(xì)胞突變的人重鏈可變結(jié)構(gòu)域，所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生自多樣的重排，其展現(xiàn)出廣泛的親和力(包括展現(xiàn)出約為納摩爾或更少的Kd)，廣泛的特異性(這包括結(jié)合至同一抗原的不同表位)，并且與相同或基本上相同的人免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)締合及一起表達(dá)。提供了下列實施例以向本領(lǐng)域普通技術(shù)人員描述如何制備和使用本發(fā)明的方法和組合物，而并不意在限制發(fā)明人所認(rèn)為的發(fā)明的范圍。進(jìn)行了努力以確保關(guān)于所使用的數(shù)字(例如，含量、溫度等)的準(zhǔn)確性，但是應(yīng)當(dāng)將一些實驗錯誤和偏差計算在內(nèi)。除非另外指明，份數(shù)是重量份數(shù)，分子量是平均分子量，溫度是以攝氏度顯示的，且壓力是或接近大氣的壓力。
實施例實施例I.鑒別與所選的人輕鏈可變區(qū)相締合的人重鏈可變區(qū)構(gòu)建了體外表達(dá)系統(tǒng)以確定單一經(jīng)重排的人種系輕鏈?zhǔn)欠衲軌蚺c來自抗原特異性人抗體的人重鏈共表達(dá)。用于在經(jīng)遺傳修飾的小鼠中產(chǎn)生人抗體的方法是已知的(見例如，US 6，596，541， Regeneron Pharmaceuticals, VELOCIMMUNE )。VELOCIMMUNE 技術(shù)涉及產(chǎn)生經(jīng)遺傳修飾的小鼠，所述小鼠具有包含與內(nèi)源小鼠恒定區(qū)基因座可操作地連接的人重鏈和輕鏈可變區(qū)的基因組，從而所述小鼠響應(yīng)于抗原刺激而產(chǎn)生包含人可變區(qū)和小鼠恒定區(qū)的抗體。編碼由VELOCIMMUNE 小鼠產(chǎn)生的抗體的重鏈和輕鏈的可變區(qū)的DNA完全是人類的。起初，分離了具有人可變區(qū)和小鼠恒定區(qū)的高親和力嵌合抗體。如下文中所描述的，表征了所述抗體并且就所需的特征對抗體進(jìn)行選擇，所述特征包括親和力、選擇性、表位等。用所需的人恒定區(qū)替代小鼠恒定區(qū)以產(chǎn)生完全的人抗體，其含有非-IgM同種型，例如，野生型或者經(jīng)修飾的IgGl，IgG2，IgG3或IgG4。雖然所選擇的恒定區(qū)可根據(jù)具體的應(yīng)用而變化，高親和性抗原結(jié)合以及靶特異性特征保留在可變區(qū)中。用促進(jìn)血管生成的生長因子(抗原c)免疫接種VELOCIMMUNE 小鼠并且分離抗原特異性人抗體，使用本領(lǐng)域中認(rèn)可的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)就V基因使用進(jìn)行測序。將所選的抗體克隆至人重鏈和輕鏈恒定區(qū)，并且選擇了 69種重鏈用于與下列三種人輕鏈之一進(jìn)行配對(1)與人K恒定區(qū)相連的共有K輕鏈，(2)與人K恒定區(qū)相連的經(jīng)重排的人種系Vk 1-39JK 5，或(3)與人κ恒定區(qū)相連的經(jīng)重排的人種系V κ 3-20J κ I。使用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)將每一對重鏈和輕鏈共轉(zhuǎn)染到CHO-Kl細(xì)胞中。在ELISA測定中，通過抗人IgG檢測上清中抗體的存在。對于每一對重鏈/輕鏈確定抗體效價(ng/ml)并且將不同的經(jīng)重排的種系輕鏈的效價與用親本抗體分子(即，與共有輕鏈配對的重鏈)獲得的效價進(jìn)行比較，并且計算出原生效價(native titer)的百分比(表I)。Vh:重鏈可變基因。ND:在目前的實驗條件下沒有檢測到表達(dá)。
權(quán)利要求
1.小鼠，其包括 (a)在內(nèi)源小鼠K免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)基因座處，以人Vk1-39/J基因區(qū)段、人Vk 3-20/J基因區(qū)段或其組合替代所有或基本上所有的內(nèi)源小鼠K免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)基因區(qū)段，其中所述人基因區(qū)段與內(nèi)源小鼠K恒定基因可操作地連接；和， (b)以多種人重鏈可變區(qū)基因區(qū)段替代所有或基本上所有的內(nèi)源小鼠重鏈可變區(qū)基因基因座，其中所述人重鏈可變區(qū)基因區(qū)段與內(nèi)源小鼠重鏈恒定基因可操作地連接，并且所述人重鏈可變區(qū)基因區(qū)段能夠重排并形成經(jīng)重排的人/小鼠嵌合重鏈基因。
2.權(quán)利要求I的小鼠，其中所述小鼠缺少能夠重排并形成編碼小鼠K可變區(qū)的基因的內(nèi)源小鼠K免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)基因座。
3.權(quán)利要求I的小鼠，其還包括相對于小鼠輕鏈恒定區(qū)為5’的小鼠K內(nèi)含子增強(qiáng)子。
4.權(quán)利要求I的小鼠，其還包括小鼠K3’增強(qiáng)子。
5.權(quán)利要求I的小鼠，其中所述多種人重鏈可變區(qū)基因區(qū)段包括選自下列的區(qū)段人免疫球蛋白可變區(qū)基因區(qū)段的 1-2，1-8，1-24，2-5，3-7，3-9, 3-11,3-13, 3-15, 3-20, 3-23,3-30,3-33,3-48,4-31,4-39，4-59，5-51，6-1。
6.權(quán)利要求I的小鼠，其中所述多種人重鏈可變區(qū)基因區(qū)段包括選自下列的區(qū)段Dl-7, Dl-26, D3-3, D3-10，D3-16，D3-22，D5-5，D5-12，D6-6，D6-13，D7-27 基因區(qū)段，以及它們的組合。
7.權(quán)利要求I的小鼠，其中所述小鼠包括包含經(jīng)重排的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)基因序列的B細(xì)胞，所述經(jīng)重排的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)基因序列包含人重鏈可變區(qū)基因，所述人重鏈可變區(qū)基因源自選自VH2-5，VH3-23，VH3-30，VH4-39，VH4-59，VH5-51的VH基因區(qū)段以及源自選自 Dl-7, Dl-26, D3-3, D3-16，D3-10，D3-22，D5-5，D5-12，D6-6，D6-13 和 D7-27的D基因區(qū)段。
8.權(quán)利要求I的小鼠，其中所述人VK 1-39基因區(qū)段存在于含有人J K 5基因區(qū)段的重排中。
9.權(quán)利要求I的小鼠，其中所述人VK 3-20基因區(qū)段存在于含有人J K I基因區(qū)段的重排中。
10.選擇用于制備雙特異性抗體的人可變區(qū)的方法，其包括 (a)用目的抗原免疫接種經(jīng)遺傳修飾的小鼠，其中所述小鼠包括(i)在內(nèi)源小鼠K免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)基因座處，以人Vk 1-39/J基因區(qū)段、人Vk3-20/J基因區(qū)段或其組合替代所有或基本上所有的內(nèi)源小鼠K免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)基因區(qū)段，其中所述人基因區(qū)段與內(nèi)源小鼠K恒定基因可操作地連接；和(ii)以多種人重鏈可變區(qū)基因區(qū)段替代所有或基本上所有的內(nèi)源小鼠重鏈可變區(qū)基因基因座，其中所述人重鏈可變區(qū)基因區(qū)段與內(nèi)源小鼠重鏈恒定基因可操作地連接，并且所述人重鏈可變區(qū)基因區(qū)段能夠重排并形成經(jīng)重排的人/小鼠嵌合重鏈基因； (b)允許所述小鼠產(chǎn)生對于目的抗原的免疫應(yīng)答；和， (C)鑒別表達(dá)特異性結(jié)合所述目的抗原的抗體的小鼠的克隆性選擇的淋巴細(xì)胞，并且從所述淋巴細(xì)胞或所述抗體獲得編碼特異性結(jié)合所述目的抗原的人重鏈可變區(qū)的核苷酸序列；和， (d)采用(C)中的核苷酸序列來制備雙特異性抗體。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述小鼠缺少能夠重排并形成編碼小鼠K可變區(qū)的基因的內(nèi)源小鼠K免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)基因座。
12.權(quán)利要求10的方法，其還包括相對于小鼠輕鏈恒定區(qū)為5’的小鼠K內(nèi)含子增強(qiáng)子。
13.權(quán)利要求10的方法，其還包括小鼠K3’增強(qiáng)子。
14.權(quán)利要求10的方法，其中所述多種人重鏈可變區(qū)基因區(qū)段包括選自下列的區(qū)段人免疫球蛋白可變區(qū)基因區(qū)段的 1-2，1-8，1-24，2-5，3-7，3-9，3-11，3-13，3-15，3-20，3-23，3-30,3-33,3-48,4-31,4-39，4-59，5-51，6-1。
15.權(quán)利要求10的方法，其中所述多種人重鏈可變區(qū)基因區(qū)段包括選自下列的區(qū)段Dl-7, Dl-26, D3-3, D3-10，D3-16，D3-22，D5-5，D5-12，D6-6，D6-13，D7-27 基因區(qū)段，以及其組合。
16.權(quán)利要求10的方法，其中所述小鼠包括包含經(jīng)重排的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)基因序列的B細(xì)胞，所述經(jīng)重排的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)基因序列包含人重鏈可變區(qū)基因，所述人重鏈可變區(qū)基因源自選自VH2-5，VH3-23, VH3-30, VH4-39，VH4-59，VH5-51的VH基因區(qū)段以及源自選自 Dl-7, Dl-26, D3-3, D3-16，D3-10，D3-22，D5-5，D5-12，D6-6，D6-13 和D7-27的D基因區(qū)段。
17.權(quán)利要求10的方法，其中所述人VK 1-39基因區(qū)段存在于含有人J K 5基因區(qū)段的重排中。
18.權(quán)利要求10的方法，其中所述人VK 3-20基因區(qū)段存在于含有人J K I基因區(qū)段的重排中。
19.權(quán)利要求10的方法，其中對于第一目的抗原進(jìn)行第一次步驟(a)至(d)以產(chǎn)生第一人重鏈可變區(qū)序列，且對于第二目的抗原進(jìn)行第二次步驟(a)至(d)以產(chǎn)生第二人重鏈可變區(qū)序列，并且其中所述第一人重鏈可變區(qū)序列與第一人重鏈恒定序列融合而表達(dá)以形成第一人重鏈，所述第二人重鏈可變區(qū)序列與第二人重鏈恒定區(qū)融合而表達(dá)以形成第二人重鏈，其中所述第一和第二人重鏈在源自Vk 1-39或Vk 3-20基因區(qū)段的單一人輕鏈的存在下表達(dá)。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述第一人重鏈包含消除或?qū)嵸|(zhì)上降低所述第一人重鏈與蛋白A的親和力的修飾，且所述第二人重鏈保留與蛋白A結(jié)合的能力。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述消除或?qū)嵸|(zhì)上降低所述第一人重鏈與蛋白A的親和力的修飾選自95R(EU 435R)，96F(EU 436F)，及其組合。
全文摘要
提供了經(jīng)遺傳修飾的小鼠，其中所述小鼠不能重排和表達(dá)內(nèi)源小鼠免疫球蛋白輕鏈可變序列，其中所述小鼠僅表達(dá)在內(nèi)源小鼠K基因座處與小鼠κ(K)恒定基因可操作連接的由人免疫球蛋白序列編碼的一種或兩種人輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，其中所述小鼠表達(dá)反向嵌合抗體，所述反向嵌合抗體具有源自僅有的兩種人輕鏈可變區(qū)基因區(qū)段之一的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和小鼠K恒定結(jié)構(gòu)域，以及人重鏈可變結(jié)構(gòu)域和來自內(nèi)源小鼠重鏈基因座的小鼠重鏈恒定結(jié)構(gòu)域。提供了完全為人的雙特異性表位結(jié)合蛋白，其包括與相同的輕鏈締合的兩個不同的重鏈，所述輕鏈包含源自兩種不同的人輕鏈可變區(qū)基因區(qū)段之一的可變結(jié)構(gòu)域。
文檔編號C07K16/46GK102791866SQ201180013714
公開日2012年11月21日 申請日期2011年2月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月8日
發(fā)明者A·J·莫菲, D·R·巴克勒, J·麥克沃克, L·麥克唐納, S·史蒂文斯, S·戴維斯 申請人:瑞澤恩制藥公司