本發(fā)明主要涉及一種雪旺氏細(xì)胞及其制備方法，詳細(xì)而言，涉及一種通過直接重編程來制備雪旺氏細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)：

認(rèn)為雪旺氏細(xì)胞在神經(jīng)的再生中起到?jīng)Q定性的重要作用。與神經(jīng)缺損或雪旺氏細(xì)胞的功能缺陷關(guān)聯(lián)的疾病也多，對于這些疾病，期待如果可以移植自身雪旺氏細(xì)胞，則成為理想的再生醫(yī)療。實際上，對于外傷或惡性腫瘤切除引起的神經(jīng)損傷，自身神經(jīng)移植、或從自身神經(jīng)中將雪旺氏細(xì)胞進(jìn)行分離、培養(yǎng)而移植的治療提高效果。但是，神經(jīng)的采集對患者的侵襲大，無論如何也不能避免二次的神經(jīng)損傷。另外，可以供給的雪旺氏細(xì)胞的數(shù)大多不充分。

在非專利文獻(xiàn)1及2中，公開有如下方法：將以未分化脂肪干細(xì)胞(adsc)(也稱為源自脂肪的間質(zhì)細(xì)胞)為代表的間充質(zhì)干細(xì)胞作為材料，進(jìn)行雪旺氏細(xì)胞樣的細(xì)胞(dadsc)的分化。但是，在方法的性質(zhì)上，具有來自外部的感染的危險性，因此，存在品質(zhì)管理不容易、花費成本和人力的問題。進(jìn)而也指出：得到的細(xì)胞的形質(zhì)或功能與真的雪旺氏細(xì)胞不同。另外，沒有報道有用這些方法制作的雪旺氏細(xì)胞有髓磷脂化能力，有可能不能貢獻(xiàn)于跳躍傳導(dǎo)。

最近，顯示心肌細(xì)胞或肝細(xì)胞等可以由成纖維細(xì)胞直接誘導(dǎo)(直接重編程或直接轉(zhuǎn)換)。如果可以由能夠從患者中以低侵襲采集的成纖維細(xì)胞等體細(xì)胞直接制造雪旺氏細(xì)胞，則侵襲低且癌化的危險性也低，可以期待關(guān)系到制造新的移植用自身雪旺氏細(xì)胞的技術(shù)。

關(guān)于在體細(xì)胞中導(dǎo)入組織特異性的轉(zhuǎn)錄因子的基因組、可以不經(jīng)過ips細(xì)胞而直接分化誘導(dǎo)為該組織細(xì)胞(直接重編程(直接轉(zhuǎn)換))，例如有以下的報道：

小鼠成纖維細(xì)胞→軟骨細(xì)胞(導(dǎo)入sox9+klf4+c‐myc基因)

小鼠成纖維細(xì)胞→心肌細(xì)胞(導(dǎo)入gata4+mef2c+tbx5基因)

小鼠成纖維細(xì)胞→肝細(xì)胞(hnf4α+(導(dǎo)入foxa1或foxa2或foxa3)基因)

小鼠成纖維細(xì)胞→神經(jīng)干細(xì)胞(導(dǎo)入sox2+foxg1基因等)、

小鼠、人細(xì)胞→造血干細(xì)胞等。

但是，沒有將體細(xì)胞直接轉(zhuǎn)換為雪旺氏細(xì)胞的報道。

現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)

非專利文獻(xiàn)

非專利文獻(xiàn)1：kinghampj,dfkalbermatten,dmahay,etal:adipose-derivedstemcellsdifferentiateintoaschwanncellphenotypeandpromoteneuriteoutgrowthinvitro.expneurol,2007；207:267-274.

非專利文獻(xiàn)2：liuy,zhangz,qiny,wuh,lvq,chenx,dengw:anewmethodforschwann-likecelldifferentiationofadiposederivedstemcells.neuroscilett.2013sep13；551:79-83.

技術(shù)實現(xiàn)要素：

發(fā)明所要解決的課題

本發(fā)明的目的在于，提供一種可以應(yīng)用于對與神經(jīng)缺損或雪旺氏細(xì)胞的功能缺陷有關(guān)的疾病等的治療、制備癌化的危險性少的雪旺氏細(xì)胞的方法。

用于解決課題的技術(shù)方案

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)：通過在哺乳動物的體細(xì)胞中組合特定的基因而導(dǎo)入，不經(jīng)由es細(xì)胞或ips細(xì)胞等多能性干細(xì)胞直接(通過直接重編程)可得到雪旺氏細(xì)胞。

本發(fā)明包含以下的方案。

項1、一種制備雪旺氏細(xì)胞的方法，其包含在哺乳動物的體細(xì)胞中導(dǎo)入選自由sox10基因及krox20基因構(gòu)成的組中的至少1種基因或其表達(dá)產(chǎn)物的工序。

項2、根據(jù)項1所述的方法，其中，所述基因為sox10基因及krox20基因的組合。

項3、根據(jù)項1或2所述的方法，其中，所述體細(xì)胞為成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞或間充質(zhì)干細(xì)胞。

項4、一種雪旺氏細(xì)胞，其源自于哺乳動物的體細(xì)胞，具有選自由外源性的sox10基因及krox20基因構(gòu)成的組中的至少1種基因或其表達(dá)產(chǎn)物。

項5、一種移植材料，其用于治療基于神經(jīng)的缺損或者雪旺氏細(xì)胞的缺損、不足或功能降低的疾病，包含用項1～3中任一項所述的方法得到的細(xì)胞、或項4所述的雪旺氏細(xì)胞。

項6、一種用于制備雪旺氏細(xì)胞的組合物，其包含選自由sox10基因及krox20基因構(gòu)成的組中的至少1種基因或其表達(dá)產(chǎn)物。

發(fā)明效果

本發(fā)明中，可以通過直接重編程在短期間內(nèi)由體細(xì)胞提供雪旺氏細(xì)胞。該雪旺氏細(xì)胞可以由進(jìn)行移植的本人的體細(xì)胞容易地誘導(dǎo)，因此，在將得到的雪旺氏細(xì)胞進(jìn)行移植的情況下，也不產(chǎn)生免疫學(xué)的排斥應(yīng)答等問題。另外，可以不經(jīng)由ips細(xì)胞或es細(xì)胞直接由體細(xì)胞誘導(dǎo)雪旺氏細(xì)胞，因此，可以避免癌化等起因于多能性干細(xì)胞的問題。

附圖說明

圖1表示本發(fā)明的方法的一例的概要。

圖2表示代表性的s100β的染色性像。

圖3表示s100β的通過染色性得到的4階段的典型例。

圖4a表示基于細(xì)胞形態(tài)的評價結(jié)果。表示hdf、csc及dsc的細(xì)胞形態(tài)的典型例。

圖4b表示基于細(xì)胞形態(tài)的評價結(jié)果。

圖5a表示雪旺氏細(xì)胞關(guān)聯(lián)標(biāo)記物(p75ntr)的免疫染色的一例。

圖5b表示雪旺氏細(xì)胞關(guān)聯(lián)標(biāo)記物(gfap)的免疫染色的一例。

圖5c表示雪旺氏細(xì)胞關(guān)聯(lián)標(biāo)記物(nestin)的免疫染色的一例。

圖5d表示雪旺氏細(xì)胞關(guān)聯(lián)標(biāo)記物(ng2)的免疫染色的一例。

圖6表示s100β和p75ntr基因的mrna表達(dá)量的測定結(jié)果。

圖7a表示相對于神經(jīng)細(xì)胞的神經(jīng)突起伸長效果的評價結(jié)果。表示與成纖維細(xì)胞hdf、正常雪旺氏細(xì)胞(csc、陽性對照)及dsc的各自進(jìn)行了共培養(yǎng)的、進(jìn)行了熒光標(biāo)記的ng108-15神經(jīng)細(xì)胞的一例。箭頭表示伸長的神經(jīng)突起。

圖7b表示相對于神經(jīng)細(xì)胞的神經(jīng)突起伸長效果的評價結(jié)果。

圖8表示plasmid導(dǎo)入(電穿孔)引起的轉(zhuǎn)換中的雪旺氏細(xì)胞關(guān)聯(lián)標(biāo)記物(s100β、p75ntr、gap43)的免疫染色的一例。

圖9a表示誘導(dǎo)前的源自人正常脂肪的干細(xì)胞(adsc)的相位差像、以及對雪旺氏細(xì)胞的induction(誘導(dǎo))后的相位差像及s100β的染色性像。放大200倍。

圖9b表示雪旺氏細(xì)胞關(guān)聯(lián)標(biāo)記物(s100β、gap43、p75ntr、proteinzero(po))的免疫染色的一例。放大100倍。

圖10a表示誘導(dǎo)前的臍帶血管內(nèi)皮細(xì)胞(huvec)的相位差像、以及對雪旺氏細(xì)胞的induction(誘導(dǎo))后的相位差像及s100β的染色性像。200倍。

圖10b表示雪旺氏細(xì)胞關(guān)聯(lián)標(biāo)記物(s100β、gap43、p75ntr)的免疫染色像的一例。放大100倍。

圖11a表示髓磷脂標(biāo)記物(proteinzero(p0))的免疫染色像的一例。

圖11b表示髓磷脂標(biāo)記物(myelinbasicprotein(mbp))的免疫染色像的一例。

圖12a表示使用有坐骨神經(jīng)損傷模型的評價試驗的概要。

圖12b表示使用有雪旺氏細(xì)胞關(guān)聯(lián)標(biāo)記物的免疫染色像的一例。

圖12c表示使用有雪旺氏細(xì)胞關(guān)聯(lián)標(biāo)記物的免疫染色像的一例。

圖13a表示對免疫缺陷小鼠坐骨缺損模型的dsc的移植試驗的概要。

圖13b表示進(jìn)行了再建的神經(jīng)的宏觀像。

圖13c表示再生神經(jīng)組織橫軸切片的髓磷脂染色像。

圖13d表示坐骨神經(jīng)功能索引(sfi)的評價結(jié)果。

圖13e表示innervatedmuscle的萎縮及纖維化的評價結(jié)果。

圖14表示神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotrophicfactors:bdnf,gdnf,ngf)的產(chǎn)生。利用elisa法進(jìn)行測定。*p<0.05vs.control；**p<0.01vs.control；#p<0.05vs.csc.

予以說明，圖2、圖3、圖4a、圖5a～d、圖7a、圖8、圖9a及b、圖10a及b、圖11a及b、以及圖12b～c同時表示色反轉(zhuǎn)圖像。

具體實施方式

本發(fā)明涉及一種雪旺氏細(xì)胞的制備方法。本發(fā)明的制備方法為不經(jīng)由es細(xì)胞或ips細(xì)胞等多能性干細(xì)胞、制備雪旺氏細(xì)胞的方法。

雪旺氏細(xì)胞

雪旺氏細(xì)胞為末梢神經(jīng)系中的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。在生理條件下，進(jìn)行神經(jīng)組織的支持、形成髓磷脂(髄鞘)而有助于跳躍傳導(dǎo)的實現(xiàn)等。在末梢神經(jīng)的損傷時，完成神經(jīng)營養(yǎng)因子的產(chǎn)出及釋放、再生軸索的基礎(chǔ)、髓磷脂形成等末梢神經(jīng)再生中的許多重要的作用。

天然的雪旺氏細(xì)胞與直接源自外胚層的神經(jīng)細(xì)胞不同，源自神經(jīng)脊。成熟的雪旺氏細(xì)胞經(jīng)過雪旺氏前體細(xì)胞、未成熟雪旺氏細(xì)胞而形成。本說明書中，為了簡單，這些分化過程的中途的全部的細(xì)胞包含在“雪旺氏細(xì)胞”中。

另外，在雪旺氏細(xì)胞中，有形成髓磷脂的雪旺氏細(xì)胞、未形成髓磷脂的游走性的雪旺氏細(xì)胞(未分化雪旺氏細(xì)胞)等，本說明書中這些全部包含在“雪旺氏細(xì)胞”中。

本說明書中，不僅包含與天然的雪旺氏細(xì)胞相同的細(xì)胞，而且包含細(xì)胞的功能的一部分或全部可以視為與天然的雪旺氏細(xì)胞相同的細(xì)胞(也可以稱為“雪旺氏細(xì)胞樣的細(xì)胞”。)，均稱為“雪旺氏細(xì)胞”。

體細(xì)胞

體細(xì)胞只要是源自哺乳動物即可。特別優(yōu)選為源自哺乳動物、且并非雪旺氏細(xì)胞本身及具有在生物體內(nèi)分化為雪旺氏細(xì)胞的能力的細(xì)胞的細(xì)胞。將雪旺氏細(xì)胞移植到生物體的情況下，為了降低感染或排斥應(yīng)答等危險，優(yōu)選使用源自進(jìn)行移植的被驗體的體細(xì)胞(自身細(xì)胞)。但是，對突然的神經(jīng)的損傷等進(jìn)行移植等目的的情況下，可以將從并非自身細(xì)胞、而是他人或其它動物的體細(xì)胞中預(yù)先準(zhǔn)備的雪旺氏細(xì)胞用于移植?；蚩梢杂深A(yù)先準(zhǔn)備的他人或其它動物的體細(xì)胞制作雪旺氏細(xì)胞，用于移植。即，可以制作雪旺氏細(xì)胞庫的庫(包含雪旺氏細(xì)胞前體細(xì)胞的庫。)并供于移植目的。這種情況下，為了降低排斥應(yīng)答等危險，可以預(yù)先將mhc進(jìn)行分型。另外，可以預(yù)先確認(rèn)雪旺氏細(xì)胞的細(xì)胞特性或造腫瘤性等。

本說明書中，作為哺乳動物，可列舉小鼠、大鼠、倉鼠、人、狗、貓、猴子、兔、牛、馬、豬等，特別可列舉人。

作為成為本發(fā)明的方法(直接重編程)的對象的體細(xì)胞，沒有特別限定。

體細(xì)胞可以使用能夠容易地從生物體中采集的體細(xì)胞?？闪信e例如：成纖維細(xì)胞、角化細(xì)胞、口腔粘膜上皮細(xì)胞、鼻腔粘膜上皮細(xì)胞、氣管粘膜上皮細(xì)胞、胃粘膜上皮細(xì)胞、腸道粘膜上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、牙齦細(xì)胞(牙齦成纖維細(xì)胞、牙齦上皮細(xì)胞)、牙髄細(xì)胞、牙根膜細(xì)胞、骨髄細(xì)胞、源自骨髄的間質(zhì)細(xì)胞、白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、肌細(xì)胞、結(jié)膜上皮細(xì)胞、破骨細(xì)胞等，優(yōu)選列舉成纖維細(xì)胞、角化細(xì)胞、口腔粘膜上皮細(xì)胞、牙齦細(xì)胞、白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等。本發(fā)明中，優(yōu)選使用從生物體上采集的上述的細(xì)胞。

“生物體”不僅包含胚(胎兒)、幼蟲、幼體、成體，而且也包含連結(jié)母體和胎兒的胎盤、臍帶。臍帶血管內(nèi)皮細(xì)胞等源自臍帶的細(xì)胞或源自胎盤的細(xì)胞嚴(yán)格來講并非體細(xì)胞，但這些細(xì)胞也包含在本發(fā)明的“體細(xì)胞”中(此時，將“體細(xì)胞”換用另一詞句讀作“臍帶血管內(nèi)皮細(xì)胞”、“源自臍帶的細(xì)胞”、“源自胎盤的細(xì)胞”等)。從采集的容易性的觀點出發(fā)，這些細(xì)胞為優(yōu)選的體細(xì)胞的一例。

另外，也可列舉由間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcell:msc)、神經(jīng)干細(xì)胞(neuralstemcell)、肝干細(xì)胞(hepaticstemcell)、腸干細(xì)胞、皮膚干細(xì)胞、毛包干細(xì)胞、色素細(xì)胞干細(xì)胞等體性干細(xì)胞進(jìn)行分化誘導(dǎo)、或進(jìn)行脫分化、或進(jìn)行重編程而制作的體細(xì)胞。另外，也可列舉由各種各樣的體細(xì)胞進(jìn)行分化誘導(dǎo)、或進(jìn)行脫分化、或進(jìn)行重編程而誘導(dǎo)為其它的體細(xì)胞的細(xì)胞。另外，也可列舉由生殖系的細(xì)胞進(jìn)行分化誘導(dǎo)、或進(jìn)行脫分化、或進(jìn)行重編程而誘導(dǎo)的體細(xì)胞。

另外，也可列舉由胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcell：es細(xì)胞)或人工多能性干細(xì)胞(inducedpluripotentstemcell：ips細(xì)胞)進(jìn)行分化誘導(dǎo)、或進(jìn)行重編程而誘導(dǎo)的體細(xì)胞。

另外，除上述的進(jìn)行了分化的體細(xì)胞以外，也可以使用體干細(xì)胞。在此，干細(xì)胞是指具有自我復(fù)制能力及分化為其它種類的細(xì)胞的能力的細(xì)胞。具體而言，可例示：間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcell:msc)(例如源自脂肪的間質(zhì)細(xì)胞(adsc:adiposederivedstromalcell))、神經(jīng)干細(xì)胞(neuralstemcell)、肝干細(xì)胞(hepaticstemcell)、腸干細(xì)胞、皮膚干細(xì)胞、毛包干細(xì)胞、色素細(xì)胞干細(xì)胞等體干細(xì)胞。

另外，嚴(yán)格來講并非體細(xì)胞，es細(xì)胞、ips細(xì)胞、或生殖系的細(xì)胞也包含在本發(fā)明的“體細(xì)胞”中(此時，將“體細(xì)胞”換用另一詞句讀作“es細(xì)胞”、“ips細(xì)胞”或“生殖系的細(xì)胞”)。

另外，也可列舉培養(yǎng)細(xì)胞，也可列舉由培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行分化誘導(dǎo)、或進(jìn)行脫分化、或進(jìn)行重編程而誘導(dǎo)的體細(xì)胞。另外，也可列舉由es細(xì)胞、ips細(xì)胞、或生殖系的細(xì)胞進(jìn)行分化誘導(dǎo)、或進(jìn)行脫分化、或進(jìn)行重編程而誘導(dǎo)的體細(xì)胞。

在本發(fā)明的優(yōu)選的一個方式中，體細(xì)胞為成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞(特別是臍帶血管內(nèi)皮細(xì)胞)或間充質(zhì)干細(xì)胞(特別是源自脂肪的間質(zhì)細(xì)胞)。

基因或其表達(dá)產(chǎn)物

在本發(fā)明的方法中，在體細(xì)胞中導(dǎo)入選自由sox10基因及krox20基因構(gòu)成的組中的至少1種基因或其表達(dá)產(chǎn)物。在此，作為“表達(dá)產(chǎn)物”，可列舉sox10基因和/或krox20基因的mrna或蛋白質(zhì)。

作為可以使用的基因的組合，包含僅sox10基因、僅krox20基因、sox10基因及krox20基因的組合。從可以得到雪旺氏細(xì)胞的效率的觀點出發(fā)，優(yōu)選sox10基因及krox20基因的組合。

在本發(fā)明的方法中，也可以同時使用sox10基因和/或krox20基因的1種或2種以外的基因。另外，也可以同時使用microrna、sirna、shrna或表達(dá)它們的dna。另外，也可以同時使用各種蛋白質(zhì)。另外，也可以與各種其它基因同時導(dǎo)入。從可以得到雪旺氏細(xì)胞的效率的觀點、及簡便性的觀點出發(fā)，優(yōu)選使用僅1種或2種、特別是sox10基因及krox20基因的兩種基因。

sox10基因編碼屬于sox(sry-relatedhmg-box)家族的、參與胚胎期的發(fā)生中的細(xì)胞命運的決定的控制的轉(zhuǎn)錄因子。

krox20基因(別名、egr2、at591、cmt1d、cmt4e)編碼具有3個c2h2型鋅指(zincfingers)的蛋白質(zhì)。

上述基因均為在脊椎動物中高度保守的基因，本說明書中，只要沒有特別示出動物名，則表示包含同族體的基因。另外，還包含含有polymorphism(多態(tài)性)、即使為具有變異的基因但與野生型的基因產(chǎn)物具有同等功能的基因。

例如，人(homosapiens)及小鼠(musmusculus)的sox10基因及krox20基因的cdna堿基序列及其所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列在美國生物工程信息中心(ncbi；nationalcenterforbiotechnologyinformation)提供的genbank中以下述的入藏號(accessionnumber)被注冊(注冊有多個修訂本(revision)的情況下，理解為是指最新的修訂本。)：

人sox10基因cdna序列：nm_006941(例如nm_006941.3)、

人sox10蛋白質(zhì)氨基酸序列：np_008872(例如np_008872.1)；

小鼠sox10基因cdna序列：nm_011437(例如nm_011437.1)、

小鼠sox10蛋白質(zhì)氨基酸序列：np_035567(例如np_035567.1)；

人krox20基因cdna序列：nm_000399、nm_001136177、nm_001136178、nm_001136179(例如nm_000399.3、nm_001136177.1、nm_001136178.1、nm_001136179.1)、

人krox20蛋白質(zhì)氨基酸序列：np_000390、np_001129649、np_001129650、np_001129651(例如np_000390.2、np_001129649.1、np_001129650.1、np_001129651.1)；

小鼠krox20基因cdna序列：nm_010118(例如nm_010118.3)

小鼠krox20蛋白質(zhì)氨基酸序列：np_034248(例如np_034248.2)。

導(dǎo)入

本發(fā)明的方法除選擇特定的基因、使用適于雪旺氏細(xì)胞的培養(yǎng)基以外，可以按照公知的直接重編程的方法而進(jìn)行，例如可以按照以下的任一種文獻(xiàn)的方法而進(jìn)行：

1:directreprogrammingoffibroblastsintofunctionalcardiomyocytesbydefinedfactors；masakiieda,ji-dongfu,pauldelgado-olguin,vasanthvedantham,yoheihayashi,benoitg.bruneau,anddeepaksrivastavacell142:375-386,2010.

2:directconversionoffibroblaststofunctionalneuronsbydefinedfactors.thomasvierbuchen,austinostermeier,zhipingp.pang,yukokokubu,thomasc.sudhof&mariuswernig.nature463:1035-1041,2010

3:inductionofhumanneuronalcellsbydefinedtranscriptionfactors.pangzp,yangn,vierbuchent,ostermeiera,fuentesdr,yangtq,citria,sebastianov,marros,sudhoftc,wernigm.nature476:220-223,2011.

4:generationofhyalinecartilaginoustissuefrommouseadultdermalfibroblastculturebydefinedfactorskunihikohiramatsu,satorusasagawa,hidetatsuoutan

i,kanakonakagawa,hidekiyoshikawa,andnoriyukitsumaki,journalofclinicalinvestigation,121:640-657,2011.

5:inductionoffunctionalhepatocyte-likecellsfrommousefibroblastsbydefinedfactors.pengyuhuang,zhiyinghe,shuyiji,huawangsun,daoxiang,changchengliu,yipinghu,xinwang&lijianhui,.nature475:386-389,2011.

6:directconversionofmousefibroblaststohepatocyte-likecellsbydefinedfactors.sayakasekiya&atsushisuzuki.nature475:390-393,2011.

7:國際公開公報wo2014/010746號

上述的文獻(xiàn)1～7的內(nèi)容在本說明書中作為參考被引用。

具體而言，優(yōu)選將目的基因插入于1個或多個表達(dá)載體，在作為對象的體細(xì)胞中導(dǎo)入表達(dá)載體，在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)。

作為導(dǎo)入基因的方法，可列舉使逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、慢病毒載體、腺隨伴病毒載體、皰疹病毒載體、仙臺病毒載體等病毒性載體感染的方法。此外，在導(dǎo)入基因和其表達(dá)產(chǎn)物的情況下，也可以通過陽離子脂質(zhì)體、陽離子聚合物、電穿孔法等非病毒載體將質(zhì)粒載體或附加型載體、基因的表達(dá)產(chǎn)物(mrna、蛋白質(zhì))進(jìn)行轉(zhuǎn)染的方法。另外，也可以導(dǎo)入mrna。這些用于基因?qū)氲氖侄稳堪ㄔ趦?nèi)，在本說明書中均稱為載體。

從導(dǎo)入效率和導(dǎo)入基因的穩(wěn)定保持的觀點出發(fā)，優(yōu)選病毒載體，為了抑制癌化的危險，優(yōu)選質(zhì)粒。

另外，通過與目的的基因一起導(dǎo)入成為藥劑選擇標(biāo)記物的基因(嘌呤霉素耐性、殺稻瘟菌素s耐性、新霉素耐性、潮霉素耐性等)，其后進(jìn)行藥劑選擇，可以在選擇表達(dá)目的基因的細(xì)胞后使用。

本發(fā)明的基因的導(dǎo)入可以通過質(zhì)粒進(jìn)行，也可以使用病毒載體、例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。從導(dǎo)入效率和導(dǎo)入基因的穩(wěn)定保持的觀點出發(fā)，優(yōu)選病毒載體，為了抑制癌化的危險，優(yōu)選質(zhì)粒。

被導(dǎo)入于體細(xì)胞的基因也可以利用ltr啟動子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，也可以由載體內(nèi)部的其它的啟動子進(jìn)行表達(dá)。例如可以利用cmv啟動子、ef-1α啟動子、cag啟動子等組成型表達(dá)啟動子、或所期望的誘導(dǎo)性啟動子。另外，可以利用將ltr的一部分置換為其它啟動子的嵌合啟動子。

另外，在導(dǎo)入因子為基因的表達(dá)產(chǎn)物(例如蛋白質(zhì))的情況下，使被稱為proteintransductiondomain(ptd)的肽等與作為表達(dá)產(chǎn)物的蛋白質(zhì)結(jié)合并添加于培養(yǎng)基，由此可以導(dǎo)入于體細(xì)胞內(nèi)。

在本發(fā)明的方法的方式之一中，向體細(xì)胞導(dǎo)入基因等之后，可以將被導(dǎo)入的細(xì)胞在適于雪旺氏細(xì)胞的培養(yǎng)的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。作為適于雪旺氏細(xì)胞的培養(yǎng)的培養(yǎng)基，可以使用公知的培養(yǎng)基。例如可以使用在添加有10％fbs(fetalbovineserum)的dmem培養(yǎng)基(達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(dulbecco'smodiedeagle'smedium))等通常培養(yǎng)基上含有1～20μm左右(特別是5μm左右)的forskolin；2～50ng/ml左右(特別是10ng/ml左右)的bfgf(堿基性成纖維細(xì)胞增殖因子、basicfibroblastgrowthfactor)；2～50ng/ml左右(特別是10ng/ml左右)的pdgf(platelet-derivedgrowthfactor)；50～1000ng/ml左右(特別是200ng/ml左右)的humanneuregulin-β1(別名、heregulin、ggf(glialgrowthfactor))等成分的1種或2種以上(優(yōu)選全部)的培養(yǎng)基(雪旺氏細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基)(以上的濃度均為終濃度)。作為一例，可以使用非專利文獻(xiàn)1或2中記載的培養(yǎng)基(可以由未分化脂肪干細(xì)胞誘導(dǎo)雪旺氏細(xì)胞的培養(yǎng)基)。

培養(yǎng)期間沒有特別限定，例如可以設(shè)為12小時～1個月左右、1天～3周左右、3天～2周左右。根據(jù)需要，可以進(jìn)行培養(yǎng)基交換。培養(yǎng)條件優(yōu)選按照常規(guī)方法。

制備

這樣，由體細(xì)胞誘導(dǎo)雪旺氏細(xì)胞，制備雪旺氏細(xì)胞。

所制備的雪旺氏細(xì)胞在某種方式中具有選自由外源性的sox10基因及krox20基因構(gòu)成的組中的至少1種基因或其表達(dá)產(chǎn)物。在此，“外源性”是指主要為上述的導(dǎo)入手段的結(jié)果所導(dǎo)入的基因或其表達(dá)產(chǎn)物的方式、與天然的方式不同的方式?？闪信e例如受天然的啟動子以外的啟動子控制表達(dá)的基因、天然以外的染色體上的位置、或存在于染色體外的基因的方式等。

得到了雪旺氏細(xì)胞這一點，作為雪旺氏細(xì)胞的功能的評價等可例示：形態(tài)(例如細(xì)胞寬度和細(xì)胞長度之比。)的觀察和評價；s100β、p75ntr、gfap、nestin、ng2等雪旺氏細(xì)胞特異性標(biāo)記物的表達(dá)的檢測(可列舉例如利用rt-pcr法等的標(biāo)記物的基因表達(dá)的檢測、利用免疫染色等的標(biāo)記物蛋白質(zhì)的表達(dá)的檢測等。)；神經(jīng)營養(yǎng)因子的產(chǎn)生；相對于進(jìn)行了共培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞的神經(jīng)突起伸長的效果或髓磷脂形成能力等。

雪旺氏細(xì)胞典型而言具有比較小型的核的雙極、或多極性的細(xì)胞形態(tài)。

雪旺氏細(xì)胞特異性標(biāo)記物中，p75ntr為未分化雪旺氏細(xì)胞的標(biāo)記物。

形成髓磷脂可以通過myelinproteinzero(mpz、p0)、髓磷脂堿基性蛋白質(zhì)(mbp:myelinbasicprotein)等髓磷脂細(xì)胞的標(biāo)記物的檢測、髓磷脂的形態(tài)的觀察等來確認(rèn)。

雪旺氏細(xì)胞有時作為與雪旺氏細(xì)胞以外的細(xì)胞(例如原來的體細(xì)胞。)的混合物得到。這種情況下，可以將雪旺氏細(xì)胞和雪旺氏細(xì)胞以外的細(xì)胞根據(jù)需要進(jìn)行分離。用于進(jìn)行分離的手段沒有特別限定。例如，將得到的雪旺氏細(xì)胞和作為原來的細(xì)胞的成纖維細(xì)胞進(jìn)行分離時，可以基于與相對于基礎(chǔ)(例如骨膠原等。)的細(xì)胞的粘接性的差異進(jìn)行分離。一般而言，雪旺氏細(xì)胞與成纖維細(xì)胞相比，相對于基礎(chǔ)的粘附性弱。另外，也可以根據(jù)分類將雪旺氏細(xì)胞和雪旺氏細(xì)胞以外的細(xì)胞進(jìn)行分離。

由本發(fā)明制備的雪旺氏細(xì)胞例如可以優(yōu)選用作后述的移植材料。

由本發(fā)明制備的雪旺氏細(xì)胞另外可以用于使用有雪旺氏細(xì)胞的各種各樣的研究或技術(shù)開發(fā)等。例如對雪旺氏細(xì)胞的產(chǎn)生、分化、形態(tài)形成的機(jī)制、相對于這些的力學(xué)的應(yīng)力、營養(yǎng)、激素等影響的分析等基楚研究是有用的。

如果使用由本發(fā)明制備的雪旺氏細(xì)胞，則可以由具有各種各樣的疾病或遺傳的背景的人或動物簡便、迅速、廉價地建立雪旺氏細(xì)胞，因此，可以通過生物化學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)等方法分析與疾病或遺傳的背景關(guān)聯(lián)的雪旺氏細(xì)胞的異常，由此可以有益于疾病的發(fā)癥機(jī)理的闡明等研究或診斷法的開發(fā)。另外，如果使用這種雪旺氏細(xì)胞進(jìn)行藥劑的開發(fā)、藥劑的毒性試驗等，則可以有益于相對于各種疾病的新型治療法的開發(fā)。

移植材料

由本發(fā)明得到的雪旺氏細(xì)胞可以用于治療各種疾病。該情況下，雪旺氏細(xì)胞可以移植材料的形態(tài)被提供。

移植材料是指為了神經(jīng)纖維的修復(fù)、再建而導(dǎo)入于生物體內(nèi)的、含有雪旺氏細(xì)胞的材料。本發(fā)明中得到的雪旺氏細(xì)胞可以用于移植材料的制作。雪旺氏細(xì)胞自身也成為移植材料。因此，也可以將雪旺氏細(xì)胞作為細(xì)胞制劑移植于患者，可以與由人工材料構(gòu)成的基材(支架)一起移植，或與支架一起進(jìn)行培養(yǎng)后移植。基材(支架)例如作為神經(jīng)再建起作用。這些情況下，支架可以根據(jù)移植目的而制成各種3維的形狀。

本發(fā)明的移植材料可以通過包含前述的雪旺氏細(xì)胞的制備方法作為工序的方法來制造。

作為基材(支架)的具體例，可列舉組合有聚乙醇酸(pga)管、骨膠原管、纖維蛋白膠(fibringlue)、聚合物泡沫管、明膠管、聚乙醇酸(pga)和骨膠原的管等。作為組合有聚乙醇酸(pga)和骨膠原的管，也可以使用“ナーブブリッジ”(東洋紡株式會社制)等市售品。

移植材料可以按照自身神經(jīng)移植、或從自身神經(jīng)將雪旺氏細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)而移植的治療而使用。這種方法記載于下述的文獻(xiàn)：

1:hadlockt,sundbackc,hunterd,cheneym,vacantijp.apolymerfoamconduitseededwithschwanncellspromotesguidedperipheralnerveregeneration.tissueeng2000；6:119-127.

2:jesurajnj,santosakb,macewanmr,mooream,kasukurthir,raywz,flagger,hunterda,borschelgh,johnsonpj,mackinnonse,sakiyama-elbertse.schwanncellsseededinacellularnervegraftsimprovefunctionalrecovery.musclenerve.2014feb；49(2):267-76.

3:tabeshh,amoabedinyg,nikns,heydarim,yosefifardm,siadatso,mottaghyk.theroleofbiodegradableengineeredscaffoldsseededwithschwanncellsforspinalcordregeneration.neurochemint.2009feb；54(2):73-83.

4:novikovaln,petterssonj,brohlinm,wibergm,novikovln.biodegradablepoly-beta-hydroxybutyratescaffoldseededwithschwanncellstopromotespinalcordrepair.biomaterials.2008mar；29(9):1198-206.

5:guestj,santamariaaj,benavidesfd.clinicaltranslationofautologousschwanncelltransplantationforthetreatmentofspinalcordinjury.curropinorgantransplant.2013dec；18(6):682-9.

6:brookga,lawrencejm,shahb,raismang.extrusiontransplantationofschwanncellsintotheadultratthalamusinducesdirectionalhostaxongrowth.expneurol.1994mar；126(1):31-43.

7:vaudanoe,campbellg,huntsp.changeinthemolecularphenotypeofschwanncellsupontransplantationintothecentralnervoussystem:down-regulationofc-jun.neuroscience.1996sep；74(2):553-65.

8:keirsteadhs,ben-hurt,rogisterb,o'learymt,dubois-dalcqm,blakemorewf.polysialylatedneuralcelladhesionmolecule-positivecnsprecursorsgeneratebotholigodendrocytesandschwanncellstoremyelinatethecnsaftertransplantation.jneurosci.1999sep1；19(17):7529-36.

9:wanh,anyh,sunmz,zhangyz,wangzc.schwanncellstransplantationpromotedandtherepairofbrainsteminjuryinrats.biomedenvironsci.2003sep；16(3):212-8.

10:chenl,fanx,jing,wanx,qiur,yig,youy,xuq.treatmentofratwithtraumaticbraininjuryandmrtracinginvivoviacombinedtransplantationofbonemarrowstromalcellslabeledwithsuperparamagneticironoxideandschwanncells.jbiomednanotechnol.2014feb；10(2):205-15.

11:shieldssa,blakemorewf,franklinrj.schwanncellremyelinationisrestrictedtoastrocyte-deficientareasaftertransplantationintodemyelinatedadultratbrain.jneuroscires.2000jun1；60(5):571-8.。

上述的文獻(xiàn)1～11的內(nèi)容在本說明書中作為參考被引用。

作為成為上述的治療的對象的疾病，可列舉：腦梗塞、脊椎損傷等引起的中樞神經(jīng)的缺損或損傷、外傷或與神經(jīng)炎或腫瘤的切除等相伴隨的末梢神經(jīng)的缺損或損傷；多發(fā)性硬化癥、視神經(jīng)脊髄炎(devic綜合征)、同心圓硬化癥(balo病)、急性播散性腦脊髓炎(acutedisseminatedencephalomyelitis、adem)、炎癥性廣泛性硬化癥(schilder病)、亞急性硬化性全腦炎(subacutesclerosingpanencephalitis、sspe)、進(jìn)行性多灶性白質(zhì)腦病(progressivemultifocalleukoencephalopathy、pml)等中樞神經(jīng)系的疾??；guillain-barre綜合征、費舍爾綜合征、慢性炎癥性脫髄性多發(fā)根神經(jīng)炎等末梢神經(jīng)系的疾病；charcot-marie-toothdisease(cmt)等基于雪旺氏細(xì)胞缺損、不足或功能降低的疾病等。

本說明書中，只要沒有特別明示，“治療”這樣的術(shù)語是指在患者患有特定的疾病或障礙期間進(jìn)行的處理，是指由此減輕疾病或障礙的重癥度、或1個或多個其癥狀、或疾病或障礙的進(jìn)行延遲或減速。本說明書中，在“治療”中包含“預(yù)防”。

本發(fā)明中得到的雪旺氏細(xì)胞另外并不限于疾病的治療，也可以以美容或功能增強(qiáng)的目的使用。此時，相對于人的處理也在本說明書中方便上稱為治療，“患者”可以換用另一詞句讀作“健康者”或“人”，“疾病”可以換用另一詞句讀作“美容”或“功能”。

本發(fā)明另外不僅可以用于人的疾病的治療，而且也可以用于包含狗、貓等賞玩動物或牛、馬、豬、綿羊、雞等家畜的哺乳動物的疾病的治療。該情況下，將“患者”換用另一詞句讀作“患畜”或“哺乳動物”。

組合物

如上所述，通過將選自由sox10基因及krox20基因構(gòu)成的組中的至少1種基因或其表達(dá)產(chǎn)物導(dǎo)入于體細(xì)胞，可以制備雪旺氏細(xì)胞。因此，本發(fā)明進(jìn)而提供一種用于制備雪旺氏細(xì)胞的組合物，其包含選自由sox10基因及krox20基因構(gòu)成的組中的至少1種基因或其表達(dá)產(chǎn)物。用于制備該雪旺氏細(xì)胞的組合物包含為了從體細(xì)胞中誘導(dǎo)雪旺氏細(xì)胞而使用的因子，上述基因或其表達(dá)產(chǎn)物優(yōu)選以可導(dǎo)入于體細(xì)胞的形態(tài)含有。上述基因作為可導(dǎo)入于體細(xì)胞的形態(tài)，具體而言，可例示插入有上述基因的載體。在此，上述基因可以分別插入于不同的載體，也可以2種以上的基因同時插入于1個載體。

關(guān)于可以使用的載體的種類等，如上所述。

在活體內(nèi)(invivo)的直接重編程

如上所述，通過將選自由sox10基因及krox20基因構(gòu)成的組中的至少1種基因或其表達(dá)產(chǎn)物導(dǎo)入于體細(xì)胞，可以制備雪旺氏細(xì)胞。

在此，在神經(jīng)損傷時，在損傷部聚集成纖維細(xì)胞。聚集的成纖維細(xì)胞其后形成纖維性的傷疤。

因此，通過應(yīng)用本發(fā)明的制備方法在神經(jīng)的損傷部的成纖維細(xì)胞中導(dǎo)入選自由sox10基因及krox20基因構(gòu)成的組中的至少1種基因或其表達(dá)產(chǎn)物，在該損傷部通過直接重編程而誘導(dǎo)雪旺氏細(xì)胞，因此，可以有助于神經(jīng)損傷的治療或神經(jīng)的再生。在選自由sox10基因及krox20基因構(gòu)成的組中的至少1種基因或其表達(dá)產(chǎn)物的導(dǎo)入中，可以優(yōu)選使用上述的本發(fā)明的組合物。

本發(fā)明的制備方法理解為除在活體外(invitro)的直接重編程之外，也包含如上所述的在活體內(nèi)(invivo)的直接重編程。

在活體內(nèi)(invivo)的直接重編程除在神經(jīng)的損傷部的成纖維細(xì)胞中導(dǎo)入選自由sox10基因及krox20基因構(gòu)成的組中的至少1種基因或其表達(dá)產(chǎn)物以外，例如可以按照下述的文獻(xiàn)中記載的在活體內(nèi)(invivo)的心肌細(xì)胞的直接重編程而進(jìn)行。

1:iedam.heartregenerationusingreprogrammingtechnology.procjpnacadserbphysbiolsci.2013；89(3):118-28.review.

2:iedam,fujd,delgado-olguinp,vedanthamv,hayashiy,bruneaubg,srivastavad.directreprogrammingoffibroblastsintofunctionalcardiomyocytesbydefinedfactors.cell.2010aug6；142(3):375-86.

3:qianl,huangy,spencerci,foleya,vedanthamv,liul,conwaysj,fujd,srivastavad.invivoreprogrammingofmurinecardiacfibroblastsintoinducedcardiomyocytes.nature.2012may31；485(7400):593-8.

上述的文獻(xiàn)1～3的內(nèi)容在本說明書中作為參考被引用。

【實施例】

以下，示出實施例，但本發(fā)明并不僅限定于該實施例。

實施例中，hdf表示人皮膚成纖維細(xì)胞(humandermalfibroblast)。csc表示從對照的生物體上采集的培養(yǎng)雪旺氏細(xì)胞(culturedschwanncells)。dsc表示通過本發(fā)明的方法得到的雪旺氏細(xì)胞(directlyreprogrammedschwanncells)。

cont表示對照(control)。

實施例1方法的概略(圖1)

圖1表示用于制備本發(fā)明的雪旺氏細(xì)胞(圖中，“directlyreprogrammedschwanncell:dsc”)的方法的概略。

在逆轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒pmxs.puro中使用geneart系統(tǒng)插入sox10等各種基因的cdna編碼序列。將包裝細(xì)胞platgp細(xì)胞懸浮于含有100u/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的1％neaa10％fbsdmem(通常培養(yǎng)基)，在進(jìn)行了明膠包被的10cm培養(yǎng)盤中以每盤5×10⁶個的濃度播種(第-3天)。24小時培養(yǎng)后，將含有各種基因的pmxs載體以各種組合與pcmvvsv載體同時使用x-tremegene9按以下的比導(dǎo)入。即將導(dǎo)入基因5μg、pcmv.vsv2.5μg、opti-mem500μl、x-tremegene922.5μl的混合液添加于裝入10ml的培養(yǎng)基的10cm盤(第-2天)。24小時后，交換成不含有抗生素的通常培養(yǎng)基(第-1天)。同日(第-1天)，將人正常皮膚成纖維細(xì)胞株(ahdf)(圖中，“fibroblast”)以1.5×10⁴～2×10⁴cells/ml播種于培養(yǎng)盤或12孔板。24小時后(第0天)，將platgp培養(yǎng)上清液通過孔隙的直徑為0.45μm的針頭過濾器之后，與聚丁烯(最終濃度4μg/ml)進(jìn)行混合(病毒液)。抽吸除去ahdf的培養(yǎng)上清液之后，快速地加入上述的病毒液1ml，培養(yǎng)24小時(感染；圖中、“transfection”)。作為對照組，也準(zhǔn)備不進(jìn)行病毒感染的細(xì)胞。1天后(第1天)，抽吸除去培養(yǎng)上清液，加入雪旺氏細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基(通常在培養(yǎng)基中加入有5mmforskolin,10ng/mlrecombinanthumanbasicfibroblastgrowthfactor(bfgf),5ng/mlrecombinanthumanplatelet-derivedgrowthfactor(pdgf)and200ng/mlrecombinanthumanheregulin1-b1(ggf)(均為最終濃度)的培養(yǎng)基)，其后，每2天與相同的組成的新的培養(yǎng)液進(jìn)行交換。第12-22天，對得到的細(xì)胞進(jìn)行作為雪旺氏細(xì)胞的代表性的標(biāo)記物的s100β染色。將不使逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染、進(jìn)行了相同的培養(yǎng)的細(xì)胞設(shè)為control。

實施例2從人正常皮膚成纖維細(xì)胞向雪旺氏細(xì)胞的轉(zhuǎn)換、s100β熒光免疫染色像(表1)(圖2)

將人正常皮膚成纖維細(xì)胞(ahdf)在12孔板上進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)行實施例1中記載的操作。第14天，從各孔抽吸除去培養(yǎng)液，用pbs進(jìn)行1次清洗后，用4％pfa固定。加入封閉溶液，在37℃下靜置15分鐘。為用抗s100β抗體(一抗)和alexafluor566標(biāo)記抗兔igg抗體(二抗)進(jìn)行了染色的細(xì)胞。在板的各孔中導(dǎo)入不同的基因的組合，在哪個號碼的孔中導(dǎo)入哪個基因的組合記載于表1(表中，在各基因的欄中有記載為“1”的物質(zhì)，表示使含有該基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染，空欄表示不使含有該基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染)。作為雪旺氏細(xì)胞關(guān)聯(lián)基因的sox10、krox20、oct6的導(dǎo)入的基因候補為作為重編程關(guān)聯(lián)基因的sox2、c-myc、klf4、oct3/4的7因子。例如，表1的no.43為感染含有sox10、krox20、oct6、klf4的基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的細(xì)胞。

作為代表性的s100β的染色性像，將導(dǎo)入有sox10和krox20的2因子的基因的細(xì)胞示于圖2。圖2為與dapi(4',6-diamidino-2-phenylindole)引起的核染色的共染色。

【表1】

實施例3從人正常皮膚成纖維細(xì)胞向雪旺氏細(xì)胞的轉(zhuǎn)換、s100β染色的半定量(圖3)

在與圖2相同的實驗中，為了確認(rèn)其它組合的染色性，用熒光顯微鏡(olympus制)觀察板，以4階段評價s100β的染色性(從s100β陽性細(xì)胞多的物質(zhì)依次為+++、++、+、-)。

用圖3表示各自的評價的典型像。另外，將其評價結(jié)果在表1中同時示出。例如可知：no.4的感染含有sox10和krox20的2基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的細(xì)胞成為+++的評價，含有最多的s100β陽性細(xì)胞。即使sox10單獨、或krox20單獨的導(dǎo)入，也可以以低的效率誘導(dǎo)雪旺氏細(xì)胞，但sox10和krox20的共導(dǎo)入可以更高效地誘導(dǎo)。另外可知：oct6在雪旺氏細(xì)胞的誘導(dǎo)中幾乎沒有效果。

實施例4從人正常皮膚成纖維細(xì)胞向雪旺氏細(xì)胞的轉(zhuǎn)換、細(xì)胞形態(tài)評價(圖4)

在實施例1中，對導(dǎo)入有sox10和krox20的2因子的基因的細(xì)胞，對于從人正常皮膚成纖維細(xì)胞向雪旺氏細(xì)胞的轉(zhuǎn)換中的細(xì)胞形態(tài)變化，以細(xì)胞長度/細(xì)胞寬度比對雪旺氏細(xì)胞特征性的雙極型的細(xì)胞長度的增加進(jìn)行評價。

將評價的結(jié)果示于圖4。通過轉(zhuǎn)換而顯示細(xì)胞長度/細(xì)胞寬度比的增大、即變化為雪旺氏細(xì)胞的特征性細(xì)胞形態(tài)。

實施例5從人正常皮膚成纖維細(xì)胞向雪旺氏細(xì)胞的轉(zhuǎn)換、使用有其它雪旺氏細(xì)胞關(guān)聯(lián)標(biāo)記物的免疫細(xì)胞熒光染色像(圖5)

將人正常皮膚成纖維細(xì)胞ahdf在12孔板上進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)行實施例1的操作。示出導(dǎo)入有sox10及krox20的2個基因的組的結(jié)果。從基因?qū)?2天后，進(jìn)行免疫染色。

將結(jié)果示于圖5?？筽75ntr抗體(一抗)、抗gfap抗體(一抗)、抗ng2抗體(一抗)的宿主為兔，抗nestin抗體(一抗)的宿主為小鼠。二抗使用alexafluor488,566標(biāo)記抗兔igg抗體或alexafluor488標(biāo)記抗小鼠igg抗體。雖然與s100β相比陽性率下降，但是確認(rèn)各自的表達(dá)。

實施例6

a.從人正常皮膚成纖維細(xì)胞向雪旺氏細(xì)胞的轉(zhuǎn)換、s100β和p75ntr基因的mrna表達(dá)量的測定(圖6)

將人正常皮膚成纖維細(xì)胞(ahdf)在12孔板上進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)行實施例1的操作。在孔no.1～6的細(xì)胞中導(dǎo)入sox10和krox20的2因子的基因，孔no.7～12的細(xì)胞中沒有導(dǎo)入基因，作為對照?；?qū)?2天后，從各孔用isogenii回收總rna，使用revertraaceqpcrrtmastermix合成cdna。以定量ucp1和β肌動蛋白基因的mrna水平的目的將real-timepcrmastermix、taqmanprobe、specificprimer及cdna進(jìn)行混合，使用ab7300real-timepcrsystem進(jìn)行real-timert-pcr。計算各細(xì)胞的相對于β肌動蛋白mrna水平的目的基因的mrna水平的值。

將結(jié)果示于圖6。圖表的縱軸將孔no.1的值作為“1”，將算出了各孔的值的相對值作為相對mrna水平表示。導(dǎo)入有sox10和krox20的2個基因的細(xì)胞(no.1～6)與control(no.7～12)相比，看到作為雪旺氏細(xì)胞特異性標(biāo)記物的s100β和p75ntr基因的強(qiáng)表達(dá)。

b.rt-pcr產(chǎn)物的使用有瓊脂糖凝膠的電泳

對a中得到的real-timert-pcr產(chǎn)物進(jìn)行使用有瓊脂糖凝膠的電泳。結(jié)果，在導(dǎo)入有sox10和krox20的2因子的基因的細(xì)胞群中，可確認(rèn)s100β和p75ntr基因的mrna的強(qiáng)表達(dá)。

c.通過沒有因子導(dǎo)入、僅sox10、僅krox20、sox10+krox20的各自的組合進(jìn)行的人成纖維細(xì)胞向雪旺氏細(xì)胞的直接重編程效率的使用有rtpcr的研究。

將作為人正常皮膚成纖維細(xì)胞的ahdf在12孔板上進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)行實施例1的操作。用與a同樣的方法將沒有基因?qū)氲募?xì)胞(對照)、僅導(dǎo)入sox10基因、導(dǎo)入僅krox20基因、導(dǎo)入有sox10基因+krox20基因的細(xì)胞各自的s100β和p75ntr的mrna的表達(dá)進(jìn)行比較。將mrna的相對值作為相對mrna水平表示。計算各組的相對于β肌動蛋白mrna水平的目的基因的mrna水平的值。將非導(dǎo)入細(xì)胞的中的1群的值作為“1”，將算出了各組的值的相對值的平均作為相對mrna水平表示。結(jié)果，導(dǎo)入有sox10+krox20的2因子的組中，s100β和p75ntr的mrna的表達(dá)量大大上升。另外，即使僅導(dǎo)入有sox10的細(xì)胞，與導(dǎo)入有sox10和krox20這兩者的細(xì)胞相比時低，但s100β和p75ntr的mrna表達(dá)量上升。另外，即使僅導(dǎo)入有krox20的細(xì)胞，與導(dǎo)入有sox10和krox20這兩者的細(xì)胞相比時低，但s100β的mrna表達(dá)量上升。s100β的相對mrna水平在非導(dǎo)入細(xì)胞中為4.4，在sox10單獨導(dǎo)入細(xì)胞中為1712.3，在krox20單獨導(dǎo)入細(xì)胞中為25.1，在導(dǎo)入有sox10+krox20的細(xì)胞中為127615.0。p75ntr的相對mrna水平在非導(dǎo)入細(xì)胞中為3.1，在sox10單獨導(dǎo)入細(xì)胞中為74.3，在krox20單獨導(dǎo)入細(xì)胞中為0.4，在導(dǎo)入有sox10+krox20的細(xì)胞中為35397.6。因此，即使sox10單獨或krox20單獨，效率也低，但是有可能產(chǎn)生由人成纖維細(xì)胞向雪旺氏細(xì)胞的直接重編程。

由以上確認(rèn)：由人成纖維細(xì)胞向雪旺氏細(xì)胞的直接重編程在使用sox10和krox20的2因子的情況下效率高。另外顯示，即使sox10或krox20的任意1因子，效率雖然低但可以由人成纖維細(xì)胞對雪旺氏細(xì)胞的直接重編程。

實施例7dsc相對于神經(jīng)細(xì)胞的神經(jīng)突起伸長效果的研究(圖7)

將ng108-15培養(yǎng)12小時，其后與hdf、csc、或dsc(導(dǎo)入sox10和krox20的2因子的基因而誘導(dǎo)的dsc)共培養(yǎng)36小時。作為對照，將ng108-15通過僅添加1％fbs的dmem進(jìn)行培養(yǎng)。將i.具有神經(jīng)突起的細(xì)胞(neurite-bearingcell)的比例(percentofneurite-bearing-cells)、ii.由細(xì)胞體直接伸長的一次神經(jīng)突起數(shù)(numberofprimaryneurites)、iii.最長神經(jīng)突起的長度(longestneuritelength)通過文獻(xiàn)：tomitak,madurat,sakaiy,etal:glialdifferentiationofhumanadipose-derivedstemcells:implicationsforcell-basedtransplantationtherapy.neuroscience.2013；236:55-65.的方法進(jìn)行比較研究。使用抗tuj-1抗體(一抗)和二抗alexafluor566標(biāo)記抗兔igg抗體僅對ng108-15進(jìn)行熒光染色。

圖7表示結(jié)果。通過與對照組的比較，csc、dsc這兩者在所研究的全部參數(shù)(i-iii)中均顯示高的神經(jīng)突起伸長促進(jìn)效果，dsc的成績與csc匹敵。由以上確認(rèn)：dsc培養(yǎng)上清液對于神經(jīng)細(xì)胞促進(jìn)突起伸長。

實施例8通過無病毒方式plasmid導(dǎo)入(電穿孔)引起的從人正常皮膚成纖維細(xì)胞向雪旺氏細(xì)胞的轉(zhuǎn)換(圖8)

將人正常皮膚成纖維細(xì)胞ahdf在12孔板上進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)行實施例1的操作。示出導(dǎo)入有sox10及krox20的2個基因的組的結(jié)果?；?qū)?4天后，進(jìn)行免疫染色。

將結(jié)果示于圖8?？箂100β抗體(一抗)、抗p75ntr抗體(一抗)、抗gap43抗體(一抗)的宿主為兔，二抗使用alexafluor566標(biāo)記抗兔igg抗體。雖然與使用有逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的情況相比陽性率下降，但是，可以確認(rèn)s100β、p75ntr及gap43各自的表達(dá)，可以確認(rèn)由成纖維細(xì)胞ahdf向雪旺氏細(xì)胞的轉(zhuǎn)換。

實施例9從源自人正常脂肪的干細(xì)胞向雪旺氏細(xì)胞的轉(zhuǎn)換、使用有其它雪旺氏細(xì)胞關(guān)聯(lián)標(biāo)記物的免疫細(xì)胞熒光染色像(圖9)

驗證了從源自脂肪的間質(zhì)細(xì)胞向dsc的轉(zhuǎn)換。

〈方法〉

將源自人正常脂肪的間質(zhì)細(xì)胞(adsc:adiposererivedstromalcell)在12孔板上進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)行實施例1的操作。示出導(dǎo)入有sox10及krox20的2個基因的組的結(jié)果。從基因?qū)?4天后，進(jìn)行免疫染色。

〈結(jié)果〉

將結(jié)果示于圖9?？箂100β抗體(一抗)、抗p75ntr抗體(一抗)、抗gap43抗體(一抗)、抗proteinzero抗體(一抗)的宿主為兔，二抗使用alexafluor566標(biāo)記抗兔igg抗體。利用s100β的染色中，約40％的細(xì)胞顯示陽性。關(guān)于其它雪旺氏細(xì)胞標(biāo)記物，雖然與s100β相比陽性率下降，但是也可確認(rèn)各自的表達(dá)。作為髓磷脂標(biāo)記物的proteinzero也顯示陽性。

具體而言，用與成纖維細(xì)胞(fibroblast)同樣的方法進(jìn)行了雪旺氏細(xì)胞誘導(dǎo)的結(jié)果，細(xì)胞的形態(tài)由源自人正常脂肪的間質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)變化成雪旺氏細(xì)胞典型性的具有比較小型的核的雙極、或多極性的細(xì)胞形態(tài)。進(jìn)而，在雪旺氏細(xì)胞中變化成典型的細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞為雪旺氏細(xì)胞標(biāo)記物(s100β)陽性(約40-50％)(圖9a)。

另外，就誘導(dǎo)后的細(xì)胞而言，雪旺氏細(xì)胞標(biāo)記物(s100β、gap43)、未分化雪旺氏細(xì)胞標(biāo)記物(p75ntr)、髓磷脂標(biāo)記物(p0)為陽性(圖9b)。

實施例10從臍帶血管內(nèi)皮細(xì)胞向雪旺氏細(xì)胞的轉(zhuǎn)換、使用有其它雪旺氏細(xì)胞關(guān)聯(lián)標(biāo)記物的免疫細(xì)胞熒光染色像(圖10)

驗證了從血管內(nèi)皮細(xì)胞向dsc的轉(zhuǎn)換。

〈方法〉

將臍帶血管內(nèi)皮細(xì)胞(huvec:humanumbilicalveinendothelialcells)在12孔板上進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)行實施例1的操作。示出導(dǎo)入有sox10及krox20的2個基因的組的結(jié)果。從基因?qū)?4天后，進(jìn)行免疫染色。

〈結(jié)果〉

將結(jié)果示于圖10?？箂100β抗體(一抗)、抗p75ntr抗體(一抗)、抗gap43抗體(一抗)、抗proteinzero抗體(一抗)的宿主為兔，二抗使用566標(biāo)記抗兔igg抗體。利用s100β的染色中，約30％的細(xì)胞顯示陽性。關(guān)于其它雪旺氏細(xì)胞標(biāo)記物，雖然與s100β相比陽性率下降，但是也可確認(rèn)各自的表達(dá)。作為髓磷脂標(biāo)記物的proteinzero也顯示陽性。

具體而言，用與成纖維細(xì)胞(fibroblast)同樣的方法進(jìn)行了雪旺氏細(xì)胞誘導(dǎo)的結(jié)果，細(xì)胞的形態(tài)從臍帶血管內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)變化成雪旺氏細(xì)胞典型性的具有比較小型的核的雙極、或多極性的細(xì)胞形態(tài)。進(jìn)而，在雪旺氏細(xì)胞中變化成典型的細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞為雪旺氏細(xì)胞標(biāo)記物(s100β)陽性(約50-60％)(圖10a)。

另外，就誘導(dǎo)后的細(xì)胞而言，雪旺氏細(xì)胞標(biāo)記物(s100β、gap43)、未分化雪旺氏細(xì)胞標(biāo)記物(p75ntr)為陽性(圖10b)。

實施例11用gfp標(biāo)記的dsc(導(dǎo)入sox10和krox20的2因子的基因而誘導(dǎo)的dsc)和drgn的共培養(yǎng)引起的dsc的活體外的髓磷脂化形成。使用有雪旺氏細(xì)胞關(guān)聯(lián)標(biāo)記物的免疫細(xì)胞熒光染色像(圖11)

評價用gfp標(biāo)記的dsc和drgn的共培養(yǎng)引起的dsc的活體外的髓磷脂化能力。

〈方法〉

使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將dsc用gfp進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)記。

具體的方法按照文獻(xiàn)：yoshiokat,ageyaman,shibatah,yasut,misaway,takeuchik,matsuik,yamamotok,teraok,shimadak,ikedau,ozawak,hanazonoy.repairofinfarctedmyocardiummediatedbytransplantedbonemarrow-derivedcd34+stemcellsinanonhumanprimatemodel.stemcells.2005mar；23(3):355-64.及文獻(xiàn)：hirschmannf,verhoeyene,wirthd,bauwenss,hauserh,rudertm.vitalmarkingofarticularchondrocytesbyretroviralinfectionusinggreenfluorescenceprotein.osteoarthritiscartilage.2002feb；10(2):109-18.中記載的方法。

將從生后第5天的小鼠中采集的后根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(drgn:dorsalrootganglionneuron)在12孔板中培養(yǎng)2天，在含有用gfp標(biāo)記的dsc、神經(jīng)生長因子、抗壞血酸和camp的髓磷脂分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行共培養(yǎng)。從共培養(yǎng)基因開始14天后，進(jìn)行免疫染色。

使用的培養(yǎng)基的組成如下所述：

dmemcontainingn2supplement(invitrogen),50ng/mlascorbicacid(wako,osaka,japan),and50ng/mlrecombinantratb-nervegrowthfactor(ngf)(r&dsystems,inc.,minneapolis,mn,usa),0.5μmcamp(r&dsystems,inc.,minneapolis,mn,usa)。

培養(yǎng)基按照文獻(xiàn)：sangok,kawakamie,yanagisawah,takakus,tsukamotom,utsunomiyak,watabek.myelinationincocultureofestablishedneuronalandschwanncelllines.histochemcellbiol.2012jun；137(6):829-39.的記載而制作。

抗神經(jīng)絲抗體(一抗)、抗mbp(myelinbasicprotein)抗體(一抗)的宿主為小鼠，抗tuj-1抗體(一抗)、抗proteinzero抗體(一抗)的宿主為兔，二抗使用alexafluor566標(biāo)記抗小鼠和兔的igg抗體、cy5標(biāo)記抗小鼠和兔的igg抗體。作為髓磷脂標(biāo)記物抗體的抗mbp抗體和抗proteinzero抗體用紅色標(biāo)記，作為神經(jīng)軸索標(biāo)記物的抗神經(jīng)絲抗體和抗tuj-1抗體用灰色標(biāo)記。

〈結(jié)果〉

將結(jié)果示于圖11。沿drg的神經(jīng)突起可看到進(jìn)行了髓磷脂化的雪旺氏細(xì)胞，但一部分髓磷脂化雪旺氏細(xì)胞和用gfp標(biāo)記的dsc細(xì)胞發(fā)生了重疊。

實施例12相對于坐骨神經(jīng)損傷模型的用gfp標(biāo)記的dsc(導(dǎo)入sox10和krox20的2因子的基因而誘導(dǎo)的dsc)移植引起的活體外的髓磷脂化形成。使用有髓磷脂關(guān)聯(lián)標(biāo)記物的免疫細(xì)胞熒光染色像(圖12)

進(jìn)行了dsc在活體內(nèi)的髓磷脂化能力的研究。

〈方法〉

使用病毒載體將dsc用gfp進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)記。

使免疫缺陷小鼠的坐骨神經(jīng)露出，用手術(shù)用止血鉗將中央部分把持約1分鐘，將約5mm的范圍內(nèi)的神經(jīng)壓碎。在其末梢側(cè)注入用gfp標(biāo)記的dsc約5萬個。從移植開始1個月后，采集被壓碎的部位的修復(fù)神經(jīng)并進(jìn)行免疫染色。將方法的概要示于圖12。

抗神經(jīng)絲抗體(一抗)、抗mbp抗體(一抗)的宿主為小鼠，抗tuj-1抗體(一抗)、抗proteinzero抗體(一抗)的宿主為兔，二抗使用alexafluor566標(biāo)記抗小鼠和兔的igg抗體、cy5標(biāo)記抗小鼠和兔的igg抗體。作為髓磷脂標(biāo)記物抗體的抗mbp抗體和抗proteinzero抗體用紅色標(biāo)記，作為神經(jīng)軸索標(biāo)記物的抗神經(jīng)絲抗體和抗tuj-1抗體用灰色標(biāo)記。

〈結(jié)果〉

將結(jié)果示于圖12。gfp+細(xì)胞以沿再生神經(jīng)的方式排列，這些與髓磷脂標(biāo)記物+細(xì)胞發(fā)生重疊(圖12b及c)。

不穩(wěn)定寄生于(erraticparasitism，日語：迷入)再生神經(jīng)的gfp+細(xì)胞也表達(dá)髓磷脂標(biāo)記物(圖12b及c、箭頭)。

實施例13對免疫缺陷小鼠坐骨缺損(5mm)模型的dsc的移植(圖13)

〈方法〉

將培養(yǎng)雪旺氏細(xì)胞(sc：比較對照組)從坐骨神經(jīng)進(jìn)行分離培養(yǎng)。將這些細(xì)胞預(yù)先播種于明膠管，在小鼠的坐骨神經(jīng)干中制作約5mm的缺口。將得到的混合型管移植至神經(jīng)缺損部。以sham小鼠及僅含有pbs的管移植組(cont)為對照，評價神經(jīng)再生促進(jìn)效果(圖13a)。

再建神經(jīng)顯示宏觀像和再生神經(jīng)組織橫軸切片的勒克司堅牢藍(lán)引起的髓磷脂染色像。坐骨神經(jīng)功能顯示移植后6周(6w)和12周(12w)后的結(jié)果，支配肌肉的委縮以濕肌肉重量進(jìn)行評價。

坐骨神經(jīng)功能索引(sfi:sciaticfunctionalindex)按照文獻(xiàn)：inserramm,blochda,terrisdj.functionalindicesforsciatic,peroneal,andposteriortibialnervelesionsinthemouse.microsurgery.1998；18:119-124.的記載而求出。

支配的肌肉的萎縮及纖維化按照文獻(xiàn)：clavijo-alvarezja,nguyenvt,santiagoly,doctorjs,leewp,marrakg.comparisonofbiodegradableconduitswithinagedratsciaticnervedefects.plastreconstrsurg.2007；119:1839-1851.的記載進(jìn)行評價。

〈結(jié)果〉

進(jìn)行了再建的神經(jīng)的宏觀像中，csc組和dsc的兩者均與control相比優(yōu)異，在兩者間沒有看到明顯的差異(圖13b)。

再生神經(jīng)組織橫軸切片的髓磷脂染色像中，dsc組與csc組匹敵(圖13c)。

坐骨神經(jīng)功能索引(sfi:sciaticfunctionalindex)中，在12w的時刻，dsc組可看到與csc匹敵的坐骨神經(jīng)功能的恢復(fù)(圖13d)。

關(guān)于支配肌肉萎縮及纖維化，在兩組中也可看到與對照的顯著性差異，但沒有看到csc和dsc間的顯著差異(圖13e)。

實施例14向雪旺氏細(xì)胞的轉(zhuǎn)換(表2)

對表2所示的基因的組合，進(jìn)行與實施例2同樣的實驗。

在哪個號碼的孔中導(dǎo)入哪個基因的組合記載于表2(表中，在各基因的欄中有記載為“1”的物質(zhì)表示使含有該基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染，空欄表示不使含有該基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染)。

與實施例3同樣地，用熒光顯微鏡(olympus制)觀察板，將s100β的染色性以4階段進(jìn)行評價(由s100β陽性細(xì)胞多的物質(zhì)依次為+++、++、+、-)。

將評價結(jié)果在表2中同時示出。

由該結(jié)果可知：已知oct6為在雪旺氏細(xì)胞的分化中完成重要的功能的因子，但幾乎不能誘導(dǎo)由體細(xì)胞對雪旺氏細(xì)胞的直接重編程。另外可知：oct6不能提高由sox10單獨、krox20單獨、或sox10+krox20引起的體細(xì)胞對雪旺氏細(xì)胞的直接重編程的效率。

【表2-1】

【表2-2】

實施例15神經(jīng)營養(yǎng)因子的產(chǎn)生(圖14)

將hdf、csc、及dsc在4×10⁴cells/cm²的條件下播種于細(xì)胞培養(yǎng)用盤，確認(rèn)80％匯合后，在細(xì)胞上清液采集用培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時。其后，將各組的培養(yǎng)上清液通入于40-μm過濾器之后，進(jìn)行采集。對腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derivedneurotrophicfactor(bdnf))、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glialcellline-derivedneurotrophicfactor(gdnf))、腦神經(jīng)營養(yǎng)因子(nervegrowthfactor(ngf))，使用elisakitshumanbdnf、gdnf、ngf(promega,madison,wi)測定各自的培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中所含的蛋白量。

其結(jié)果是，與對照(hdf)相比，csc和dsc均較強(qiáng)地產(chǎn)生bdnf、gdnf、ngf的全部。另外，bdnf的產(chǎn)生即使在最高點，csc和dsc也類似。