專利名稱：Ngf殼聚糖微球-高仿生支架緩釋系統(tǒng)及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于神經(jīng)組織工程支架技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種神經(jīng)組織工程支架，具體涉及一種NGF殼聚糖微球-高仿生支架緩釋系統(tǒng)，本發(fā)明還涉及上述緩釋系統(tǒng)的制備方法。
背景技術(shù)：
周圍神經(jīng)損傷后的神經(jīng)再生和功能恢復(fù)是臨床治療的一個(gè)難題。自體神經(jīng)移植是目前臨床上首選的神經(jīng)重建方法(“金標(biāo)準(zhǔn)”)，但供區(qū)感覺功能障礙、供體來源受限、供受神經(jīng)尺寸和類型不匹配、手術(shù)時(shí)間延長等原因大大限制了其應(yīng)用；同種異體神經(jīng)再生管道是指清除了雪旺細(xì)胞和其他生物大分子的神經(jīng)內(nèi)膜管，為神經(jīng)再生創(chuàng)造一個(gè)良好的環(huán)境， 這種管道具有易獲得、可得到任何長度和口徑的神經(jīng)段、對(duì)患者的不良影響較小以及易保存等優(yōu)點(diǎn)，但會(huì)引起患者自身的免疫排斥反應(yīng)，需對(duì)其進(jìn)行長期的免疫耐受治療。另外，非神經(jīng)組織制成的再生管道主要有靜脈和肌膜管等，其基底膜與雪旺細(xì)胞的基底膜相似，這種相似的結(jié)構(gòu)不僅可為再生神經(jīng)纖維提供定向的低阻力通道，而且基底膜成分的層粘連蛋白和纖維粘連蛋白還能對(duì)再生的軸突起到接觸性引導(dǎo)作用，從而更好的引導(dǎo)軸突再生，然而非神經(jīng)組織管道也存在易粘連、易坍塌和易降解等缺點(diǎn)。為了進(jìn)一步提高修復(fù)長節(jié)段周圍神經(jīng)缺損的治療效果，人們從神經(jīng)細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)方面對(duì)周圍神經(jīng)再生進(jìn)行了深入的研究和大量的實(shí)驗(yàn)。近年來，利用組織工程學(xué)的方法構(gòu)建的組織工程神經(jīng)支架成為最有希望替代自體神經(jīng)的發(fā)展方向。目前已開發(fā)了具有不同超微結(jié)構(gòu)的神經(jīng)支架并取得了一定的修復(fù)效果，人工合成神經(jīng)支架大體分為兩類 第一類是非降解的人工合成神經(jīng)支架，主要由硅膠管和聚四氟乙烯等材料制備而成，這種支架價(jià)格便宜，可根據(jù)需要調(diào)整支架的內(nèi)徑大小，但是這種支架不能被生物降解，需通過二次手術(shù)取出，若長期存留于體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生感染和結(jié)締組織反應(yīng)；另一類是可降解的人工合成神經(jīng)支架，主要由聚乳酸、聚羥基乙酸以及聚合物等材料制備而成，這類支架的生物兼容性好，可被生物降解吸收，無需二次手術(shù)取出，不會(huì)壓迫神經(jīng)，具有明顯的優(yōu)勢(shì)，但是，這些支架的超微結(jié)構(gòu)與正常神經(jīng)基底膜結(jié)構(gòu)相差較大，不能更好的引導(dǎo)神經(jīng)再生。神經(jīng)的再生過程不僅需要有良好的物理引導(dǎo)作用以促進(jìn)再生軸突向特定靶組織生長，更重要的是還需要長期有效的神經(jīng)營養(yǎng)支持。神經(jīng)生長因子是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族中最重要成員之一，神經(jīng)生長因子不僅可以促進(jìn)感覺神經(jīng)元的生長與分化，還可以促進(jìn)周圍神經(jīng)再生。為了進(jìn)一步提高神經(jīng)支架修復(fù)長節(jié)段神經(jīng)損傷的治療效果，一些學(xué)者將神經(jīng)營養(yǎng)因子NGF直接復(fù)合于神經(jīng)支架，取得了一定的修復(fù)效果。然而在神經(jīng)支架中釋放的神經(jīng)營養(yǎng)因子只能在最初的階段促進(jìn)神經(jīng)再生，這種作用往往不超過一個(gè)月，這可能是營養(yǎng)因子快速降解、從支架中漏出或者被稀釋的緣故。因此提供一種具有緩釋功能的神經(jīng)組織工程支架是非常必要的，不僅可以保護(hù)營養(yǎng)因子的生物活性，還可以使其長期、有效的釋放到神經(jīng)損傷部位
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種NGF殼聚糖微球-高仿生支架緩釋系統(tǒng)，解決了現(xiàn)有神經(jīng)組織工程支架系統(tǒng)內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)與正常神經(jīng)基底膜結(jié)構(gòu)相差較大，難以更好的引導(dǎo)神經(jīng)再生，以及無法長期有效緩釋神經(jīng)生長因子以更好、更快的促進(jìn)神經(jīng)再生的問題。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述NGF殼聚糖微球-高仿生支架緩釋系統(tǒng)的制備方法。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是，一種NGF殼聚糖微球-高仿生支架緩釋系統(tǒng)，包括有橫截面直徑為2mm，長度為 I. 5cm 2. 5cm的圓柱形膠原-殼聚糖神經(jīng)支架，圓柱形膠原-殼聚糖神經(jīng)支架內(nèi)部具有相互平行的軸向微管樣結(jié)構(gòu)，圓柱形膠原-殼聚糖神經(jīng)支架內(nèi)部均勻復(fù)合有包埋神經(jīng)生長因子的殼聚糖微球，包埋神經(jīng)生長因子的殼聚糖微球的粒徑為3 μ m 60 μ m。本發(fā)明所采用的另一技術(shù)方案是，一種NGF殼聚糖微球-高仿生支架緩釋系統(tǒng)的制備方法，制備出的具有緩釋功能的神經(jīng)組織工程支架，包括有橫截面直徑為2mm，長度為 I. 5cm 2. 5cm的圓柱形膠原-殼聚糖神經(jīng)支架，圓柱形膠原-殼聚糖神經(jīng)支架內(nèi)部具有相互平行的軸向微管樣結(jié)構(gòu)，圓柱形膠原-殼聚糖神經(jīng)支架內(nèi)部均勻復(fù)合有包埋神經(jīng)生長因子的殼聚糖微球，包埋神經(jīng)生長因子的殼聚糖微球的粒徑為3 μ m 60 μ m ;具體按照以下步驟實(shí)施步驟I :制備出水相和油相；步驟2 :制備包埋神經(jīng)生長因子的殼聚糖微球；步驟3 :干燥、冷藏包埋神經(jīng)生長因子的殼聚糖微球；步驟4 :制備膠原-殼聚糖凝膠狀懸濁液；步驟5 :注模冷琳，制備膠原-殼聚糖支架凝膠；步驟6 :真空干燥，形成膠原-殼聚糖神經(jīng)支架；步驟7 :對(duì)膠原-殼聚糖神經(jīng)支架進(jìn)行交聯(lián)和消毒；步驟8 :制備NGF殼聚糖微球-高仿生支架緩釋系統(tǒng)。本發(fā)明的特點(diǎn)還在于，其中的步驟I具體按照以下步驟實(shí)施在低溫2 6°C的條件下，按質(zhì)量比為I : 20 30分別稱取神經(jīng)生長因子和牛血清白蛋白，將神經(jīng)生長因子溶解于pH為7. 2 7. 6的PBS溶液中，配制成質(zhì)量-體積濃度為4 8μ g/ml的溶液，再將牛血清白蛋白倒入溶液中完全溶解后制備出神經(jīng)生長因子溶液；在室溫條件下，將殼聚糖粉末完全溶解于質(zhì)量-體積濃度為3mg/ml醋酸水溶液中，制備出質(zhì)量-體積濃度為10 20mg/ml的殼聚糖醋酸溶液；將配置好的神經(jīng)生長因子溶液與殼聚糖醋酸溶液按體積比為I : 5 15充分混合，制備出水相；將液體石蠟油與表面活性劑Span80按體積比為70 80 I量取好后，依次注入三口燒瓶中，采用機(jī)械攪拌3min 7min,攪拌速度為300r/min 700r/min,使液體石臘油與表面活性劑Span80混合均勻，制備出油相；其中的步驟2具體按照以下步驟實(shí)施I)在低溫2 6°C的條件下，按體積比為I : 5 15將步驟I制得的水相逐滴加入制得的油相中，采用機(jī)械攪拌O. 5h I. 5h,攪拌速度為800r/min 1200r/min,制備出水/油乳濁液；
2)配置質(zhì)量百分濃度為3%的三聚磷酸鈉溶液，三聚磷酸鈉溶液與步驟I中使用的液體石蠟油體積比為I : 7 8;3)將質(zhì)量百分濃度為3%的三聚磷酸鈉溶液逐滴加入步驟I)得到的水/油乳濁液中，采用機(jī)械攪拌O. 5h I. 5h,攪拌速度為800r/min 1200r/min,形成乳池液；4)依次用石油醚、異丙醇反復(fù)清洗步驟3)得到的乳濁液3次，即得到包埋神經(jīng)生長因子的殼聚糖微球；其中的步驟3具體按照以下步驟實(shí)施將步驟2得到的包埋神經(jīng)生長因子的殼聚糖微球放入冷凍干燥機(jī)內(nèi)于-80 _40°C條件下冷凍干燥4h 8h，冰凍干燥后，將凍干的包埋神經(jīng)生長因子的殼聚糖微球儲(chǔ)存于2 6°C冰箱內(nèi)；其中的步驟4具體按照以下步驟實(shí)施I)按質(zhì)量比為2 6 : I分別稱取I型膠原蛋白和殼聚糖；2)將稱取的I型膠原蛋白放入質(zhì)量-體積濃度為3mg/ml醋酸水溶液中溶解22 26小時(shí),配置成質(zhì)量-體積濃度為24mg/ml 30mg/ml的I型膠原蛋白醋酸懸池液；3)再將稱取的殼聚糖加入質(zhì)量-體積濃度為3mg/ml醋酸水溶液中攪拌至完全溶解，配置成質(zhì)量-體積濃度為12mg/ml 16mg/ml的殼聚糖醋酸懸池液；4)將兩種懸濁液按體積比為I 3 : I混合并保持2 6°C恒溫，再以IOOOOr/ min 14000r/min攪拌速度攪拌70min IlOmin,充分混合后，制成膠原-殼聚糖凝膠狀懸濁液；其中的步驟5具體按照以下步驟實(shí)施I)取硅膠管模具，將步驟4制得的膠原-殼聚糖凝膠狀懸濁液注入硅膠管模具內(nèi)， 以鉛絲封閉硅膠管模具兩端；2)將注入膠原-殼聚糖凝膠狀懸濁液的硅膠管模具沿縱軸方向在電子微型調(diào)速儀的控制下，以2X 10_2cm/s 6X 10_2cm/s的速度緩慢浸入冷淋劑液氮，開始時(shí)硅膠管模具底端距冷淋液表面的距離為15cm 25cm，直至硅膠管模具全部進(jìn)入冷淋劑內(nèi)；3)將硅膠管模具從冷淋劑內(nèi)取出，把硅膠管模具內(nèi)冰凍好的膠原-殼聚糖支架凝膠取出后剪成短節(jié)段，每節(jié)長度為I. 5cm 2. 5cm ；其中的步驟6具體按照以下步驟實(shí)施I)將步驟5制得的膠原-殼聚糖神經(jīng)支架凝膠短節(jié)段置于0°C的鋁制容器內(nèi)，將鋁制容器置于冷凍干燥機(jī)中，于-80 _40°C條件下冷凍干燥22h 26h后將冷凍干燥后的膠原-殼聚糖神經(jīng)支架凝膠短節(jié)段取出；2)將冷凍干燥機(jī)的溫度升至0°C，再把膠原-殼聚糖神經(jīng)支架凝膠短節(jié)段放入冷凍干燥機(jī)內(nèi)冷凍干燥6h IOh后取出；3)再將冷凍干燥機(jī)的溫度升至20 24°C，繼續(xù)把膠原-殼聚糖神經(jīng)支架凝膠短節(jié)段放入冷凍干燥機(jī)內(nèi)，保持30min 60min即制得干燥成形的膠原-殼聚糖神經(jīng)支架；其中的步驟7具體按照以下步驟實(shí)施I)將步驟6制得的膠原-殼聚糖神經(jīng)支架置于O. 5% I. 5%京尼平水溶液中交聯(lián) 22h 26h ；2)將交聯(lián)后的膠原-殼聚糖神經(jīng)支架用去離子水和無水乙醇交替清洗4h 8h，去除多余的交聯(lián)劑；3)將清洗后的膠原-殼聚糖神經(jīng)支架置于冷凍干燥機(jī)內(nèi)于_20°C下冷凍干燥 6h IOh ；4)將冷凍干燥后的膠原-殼聚糖神經(jīng)支架經(jīng)Co6°照射消毒；其中的步驟8具體按照以下步驟實(shí)施I)將步驟3制成的包埋神經(jīng)生長因子的殼聚糖微球溶于蒸餾水中，配置成濃度為 300mg/ml 700mg/ml的溶液，將配置好的溶液分為等量的兩份；2)將其中一份包埋神經(jīng)生長因子的殼聚糖微球溶液通過針管注入膠原-殼聚糖神經(jīng)支架的一端；再將另一份包埋神經(jīng)生長因子的殼聚糖微球溶液通過針管注入膠原-殼聚糖神經(jīng)支架的另一端，這個(gè)過程重復(fù)2 5次，直到包埋神經(jīng)生長因子的殼聚糖微球溶液浸透直到包埋神經(jīng)生長因子的殼聚糖微球溶液浸透膠原-殼聚糖神經(jīng)支架，制備出NGF殼聚糖微球-高仿生支架緩釋系統(tǒng)；3)將制備出的NGF殼聚糖微球-高仿生支架緩釋系統(tǒng)放入冷凍干燥機(jī)內(nèi)， 于-80 -40°C條件下冷凍干燥4h 8h，冰凍干燥后將NGF殼聚糖微球-高仿生支架緩釋系統(tǒng)儲(chǔ)存于2 6°C冰箱內(nèi)。本發(fā)明的有益效果是，本發(fā)明NGF殼聚糖微球-高仿生支架緩釋系統(tǒng)其內(nèi)部為平行排列的微管樣結(jié)構(gòu)，高度仿真于正常神經(jīng)基底膜結(jié)構(gòu)，能有效的引導(dǎo)再生軸突的定向生長。支架上負(fù)載的包埋神經(jīng)生長因子的殼聚糖微球具有良好的緩釋作用，能為神經(jīng)的再生長期、有效的提供神經(jīng)營養(yǎng)支持，不僅可以很好的保護(hù)神經(jīng)營養(yǎng)因子的生物活性，還可以使神經(jīng)營養(yǎng)因子長期、有效的釋放到神經(jīng)損傷部位，大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)本發(fā)明具有緩釋功能的神經(jīng)組織工程支架能更快更好的促進(jìn)再生神經(jīng)組織和功能學(xué)的恢復(fù)，可應(yīng)用于治療周圍神經(jīng)缺損的患者，修復(fù)長節(jié)段神經(jīng)損傷。此外，本發(fā)明所使用的材料在人體內(nèi)可吸收降解，無毒無害，無需二次手術(shù)，可以很大程度上提高修復(fù)神經(jīng)缺損的治療效果，本發(fā)明具有廣泛的應(yīng)用前景。


圖I包埋神經(jīng)生長因子的殼聚糖微球的掃描電鏡圖片；圖2是本發(fā)明NGF殼聚糖微球_高仿生支架緩釋系統(tǒng)的橫截面掃描電鏡圖片；圖3是本發(fā)明NGF殼聚糖微球_高仿生支架緩釋系統(tǒng)的縱截面掃描電鏡圖片；圖4是本發(fā)明NGF殼聚糖微球_高仿生支架緩釋系統(tǒng)的緩釋效果曲線圖；圖5是使用本發(fā)明緩釋系統(tǒng)后大鼠的神經(jīng)傳導(dǎo)速度隨時(shí)間變化的統(tǒng)計(jì)圖；圖6是使用本發(fā)明緩釋系統(tǒng)后大鼠的肌肉動(dòng)作電位最大峰值隨時(shí)間變化的統(tǒng)計(jì)圖；圖7是采用本發(fā)明緩釋系統(tǒng)治療大鼠后，大鼠坐骨神經(jīng)功能指數(shù)隨時(shí)間變化的統(tǒng)計(jì)圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合

和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。一種NGF殼聚糖微球-高仿生支架緩釋系統(tǒng)，包括有橫截面直徑為2mm，長度為I.5cm 2. 5cm的圓柱形膠原-殼聚糖神經(jīng)支架，圓柱形膠原-殼聚糖神經(jīng)支架內(nèi)部具有相互平行的軸向微管樣結(jié)構(gòu)，圓柱形膠原-殼聚糖神經(jīng)支架內(nèi)部均勻復(fù)合有包埋神經(jīng)生長因子的殼聚糖微球，包埋神經(jīng)生長因子的殼聚糖微球的粒徑為3 μ m 60 μ m。一種NGF殼聚糖微球-高仿生支架緩釋系統(tǒng)的制備方法，具體按照以下步驟實(shí)施步驟I，制備水相和油相在低溫2 6°C的條件下，按質(zhì)量比為I : 20 30分別稱取神經(jīng)生長因子和牛血清白蛋白，將神經(jīng)生長因子溶解于pH為7. 2 7. 6的PBS溶液中，配制成質(zhì)量-體積濃度為4 8μ g/ml的溶液，再將牛血清白蛋白倒入溶液中完全溶解后制備出神經(jīng)生長因子溶液；在室溫條件下，將殼聚糖粉末完全溶解于質(zhì)量-體積濃度為3mg/ml醋酸水溶液中，制備出質(zhì)量-體積濃度為10 20mg/ml的殼聚糖醋酸溶液；將配置好的神經(jīng)生長因子溶液與殼聚糖醋酸溶液按體積比為I : 5 15充分混合，制備出水相；將液體石蠟油與表面活性劑Span80按體積比為70 80 I量取好后，依次注入三口燒瓶中，采用機(jī)械攪拌3min 7min,攪拌速度為300r/min 700r/min,使液體石臘油與表面活性劑Span80混合均勻，制備出油相；步驟2，制備包埋神經(jīng)生長因子的殼聚糖微球I)在低溫2 6°C的條件下，按體積比為I : 5 15將步驟I制得的水相逐滴加入制得的油相中，采用機(jī)械攪拌O. 5h I. 5h,攪拌速度為800r/min 1200r/min,制備出水/油乳濁液；2)配置質(zhì)量百分濃度為3%的三聚磷酸鈉溶液，三聚磷酸鈉溶液與步驟I中使用的液體石蠟油體積比為I : 7 8;3)將質(zhì)量百分濃度為3%的三聚磷酸鈉溶液逐滴加入步驟I)得到的水/油乳濁液中，采用機(jī)械攪拌O. 5h I. 5h,攪拌速度為800r/min 1200r/min,形成乳池液；4)依次用石油醚、異丙醇反復(fù)清洗步驟3)得到的乳濁液3次，即得到包埋神經(jīng)生長因子的殼聚糖微球；步驟3，干燥、冷藏步驟2得到的包埋神經(jīng)生長因子的殼聚糖微球；將步驟2得到的包埋神經(jīng)生長因子的殼聚糖微球放入冷凍干燥機(jī)內(nèi)于-80 _40°C條件下冷凍干燥4h 8h，冰凍干燥后，將凍干的包埋神經(jīng)生長因子的殼聚糖微球儲(chǔ)存于2 6°C冰箱內(nèi)；步驟4，制備膠原-殼聚糖凝膠狀懸濁液I)按質(zhì)量比為2 6 : I分別稱取I型膠原蛋白和殼聚糖；2)將稱取的I型膠原蛋白放入質(zhì)量-體積濃度為3mg/ml醋酸水溶液中溶解22 26小時(shí),配置成質(zhì)量-體積濃度為24mg/ml 30mg/ml的I型膠原蛋白醋酸懸池液；3)再將稱取的殼聚糖加入質(zhì)量-體積濃度為3mg/ml醋酸水溶液中攪拌至完全溶解，配置成質(zhì)量-體積濃度為12mg/ml 16mg/ml的殼聚糖醋酸懸池液；4)將兩種懸濁液按體積比為I 3 : I混合并保持2 6°C恒溫，再以IOOOOr/ min 14000r/min攪拌速度攪拌70min IlOmin,充分混合后，制成膠原-殼聚糖凝膠狀懸濁液；步驟5，注模冷琳，制備膠原-殼聚糖支架凝膠
I)取硅膠管模具，將步驟4制得的膠原-殼聚糖凝膠狀懸濁液注入硅膠管模具內(nèi)， 以鉛絲封閉硅膠管模具兩端；2)將注入膠原-殼聚糖凝膠狀懸濁液的硅膠管模具沿縱軸方向在電子微型調(diào)速儀的控制下，以2X 10_2cm/s 6X 10_2cm/s的速度緩慢浸入冷淋劑液氮，開始時(shí)硅膠管模具底端距冷淋液表面的距離為15cm 25cm，直至硅膠管模具全部進(jìn)入冷淋劑內(nèi)；3)將硅膠管模具從冷淋劑內(nèi)取出，把硅膠管模具內(nèi)冰凍好的膠原-殼聚糖支架凝膠取出后剪成短節(jié)段，每節(jié)長度為I. 5cm 2. 5cm ；步驟6，真空干燥，形成膠原-殼聚糖神經(jīng)支架I)將步驟5制得的膠原-殼聚糖神經(jīng)支架凝膠短節(jié)段置于0°C的鋁制容器內(nèi)，將鋁制容器置于冷凍干燥機(jī)中，于-80 _40°C條件下冷凍干燥22h 26h后將冷凍干燥后的膠原-殼聚糖神經(jīng)支架凝膠短節(jié)段取出；2)將冷凍干燥機(jī)的溫度升至0°C，再把膠原-殼聚糖神經(jīng)支架凝膠短節(jié)段放入冷凍干燥機(jī)內(nèi)冷凍干燥6h IOh后取出；3)再將冷凍干燥機(jī)的溫度升至20 24°C，繼續(xù)把膠原-殼聚糖神經(jīng)支架凝膠短節(jié)段放入冷凍干燥機(jī)內(nèi)，保持30min 60min即制得干燥成形的膠原-殼聚糖神經(jīng)支架；步驟7，對(duì)膠原-殼聚糖神經(jīng)支架進(jìn)行交聯(lián)消毒I)將步驟6制得的膠原-殼聚糖神經(jīng)支架置于O. 5% I. 5%京尼平水溶液中交聯(lián) 22h 26h ；2)將交聯(lián)后的膠原-殼聚糖神經(jīng)支架用去離子水和無水乙醇交替清洗4h 8h， 去除多余的交聯(lián)劑；3)將清洗后的膠原-殼聚糖神經(jīng)支架置于冷凍干燥機(jī)內(nèi)于_20°C下冷凍干燥 6h IOh ；4)將冷凍干燥后的膠原-殼聚糖神經(jīng)支架經(jīng)Co6°照射消毒；步驟8制備NGF殼聚糖微球-高仿生支架緩釋系統(tǒng)支架I)將步驟3制成的包埋神經(jīng)生長因子的殼聚糖微球溶于蒸餾水中，配置成濃度為 300mg/ml 700mg/ml的溶液，將配置好的溶液分為等量的兩份；2)將其中一份包埋神經(jīng)生長因子的殼聚糖微球溶液通過針管注入膠原-殼聚糖神經(jīng)支架的一端；再將另一份包埋神經(jīng)生長因子的殼聚糖微球溶液通過針管注入膠原-殼聚糖神經(jīng)支架的另一端，這個(gè)過程重復(fù)2 5次，直到包埋神經(jīng)生長因子的殼聚糖微球溶液浸透膠原-殼聚糖神經(jīng)支架，制備出NGF殼聚糖微球-高仿生支架緩釋系統(tǒng)；3)將制備出的NGF殼聚糖微球-高仿生支架緩釋系統(tǒng)放入冷凍干燥機(jī)內(nèi)， 于-80 -40°C條件下冷凍干燥4h 8h，冰凍干燥后將NGF殼聚糖微球-高仿生支架緩釋系統(tǒng)儲(chǔ)存于2 6°C冰箱內(nèi)。二、結(jié)果分析I.掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果分析殼聚糖與三聚磷酸鈉發(fā)生靜電相互吸引后，會(huì)形成包埋神經(jīng)生長因子的殼聚糖微球。通過掃描電鏡對(duì)制得的包埋神經(jīng)生長因子的殼聚糖微球粒徑進(jìn)行觀察和分析，如圖I 所示，經(jīng)分析可知包埋神經(jīng)生長因子的殼聚糖微球平均粒徑為22 μ m，微球的粒徑范圍在 3 μ m 60 μ m0
本發(fā)明NGF殼聚糖微球-高仿生支架緩釋系統(tǒng)的掃描電鏡圖，如圖2所示，支架的橫切面為蜂巢樣結(jié)構(gòu)，呈規(guī)則排列；如圖3所示，縱切面可見平行排列的微管樣結(jié)構(gòu)，微管內(nèi)徑均一，微管直徑為97. 6 μ m 107 μ m,管徑范圍為85. 7 μ m 114. 9 μ m，此結(jié)構(gòu)與正常神經(jīng)基底膜結(jié)構(gòu)類似。2.包埋神經(jīng)生長因子的殼聚糖微球緩釋效果分析量取2ml pH為7. 4的磷酸鹽緩沖液(即PBS溶液)倒入燒瓶中，再將本發(fā)明的支架放置于燒瓶內(nèi)，在37°C的條件下，將燒瓶放置于搖床上，緩慢搖動(dòng)12周；在特定時(shí)間內(nèi)(I 周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周)，每次用吸管吸取上層的緩釋液后再補(bǔ)充2mlpH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液；將每次回收的緩釋液置于溫度為_20°C 的冰箱內(nèi)冷藏；對(duì)緩釋液中的神經(jīng)生長因子做定量分析(神經(jīng)生長因子ELISAKit)，測(cè)量隨時(shí)間的增長，回收的緩釋液中神經(jīng)生長因子含量的變化情況，如圖4所示，本發(fā)明NGF殼聚糖微球-高仿生支架緩釋系統(tǒng)的緩釋時(shí)間能達(dá)12周左右，能達(dá)到持續(xù)緩釋神經(jīng)生長因子的目的。3. MTT比色法細(xì)胞活力檢測(cè)將本發(fā)明NGF殼聚糖微球-高仿生支架緩釋系統(tǒng)與大鼠的嗜絡(luò)細(xì)胞瘤共培養(yǎng)，分別在特定的時(shí)間1、3、14、28天做MTT比色法細(xì)胞活力檢測(cè)。先將大鼠的嗜絡(luò)細(xì)胞瘤培養(yǎng)于添加有15%馬血清(Gibco，USA), 2. 5%胎牛血清 (6讓(30，”4)，1%青霉素/鏈霉素(Gibco7USA)的 RPMI1640 (Gibco，USA)培養(yǎng)液中，在 37°C 條件下在細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)內(nèi)3 5天；再將神經(jīng)組織支架沿縱截面切成幾個(gè)部分后放置于 24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)進(jìn)行消毒處理，24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)盛放有濃度為70%的酒精；隨后用 PBS溶液清洗神經(jīng)組織支架，接著在37°C的條件下將神經(jīng)組織支架放置于2ml的RPMI1640 培養(yǎng)液中過夜；第二天，用吸管吸取支架內(nèi)的培養(yǎng)液，將20 μ I大鼠的嗜絡(luò)細(xì)胞瘤懸液以 I X IO4細(xì)胞/孔，均勻接種于神經(jīng)組織支架上；培養(yǎng)2小時(shí)后，將700 μ I的RPMI1640培養(yǎng)液緩慢的注入神經(jīng)組織支架內(nèi)，再將神經(jīng)組織支架放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)；經(jīng)過1、7、14和28 天的共培養(yǎng)后，用PBS溶液分別清洗支架3次；隨后在含有20 μ I MTT和700 μ I RPMI1640 培養(yǎng)液的混合液中培養(yǎng)4小時(shí)；4小時(shí)后移除培養(yǎng)液，用二甲亞砜溶解反應(yīng)產(chǎn)物；將反應(yīng)產(chǎn)物放置于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，并把24孔細(xì)胞培養(yǎng)板放置于搖床搖動(dòng)20分鐘。用全自動(dòng)定量繪圖酶標(biāo)儀在570nm的波長下讀取24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)OD值，測(cè)試后發(fā)現(xiàn)隨時(shí)間的增長 OD值不斷增大，這是由于活細(xì)胞中的脫氫酶能將MTT還原成不溶于水的藍(lán)紫色產(chǎn)物甲臜， 并沉淀在細(xì)胞中，二甲亞砜能溶解沉積甲臜，使溶液的色澤不斷變淺，但死細(xì)胞沒有這種功能，由圖5說明，本發(fā)明的NGF殼聚糖微球-高仿生支架緩釋系統(tǒng)具有良好的生物活性，能持續(xù)緩釋具有生物活性的神經(jīng)生長因子。三、動(dòng)物手術(shù)實(shí)例，再生神經(jīng)功能性評(píng)估I.電生理評(píng)估利用本發(fā)明NGF殼聚糖微球-高仿生支架緩釋系統(tǒng)來修復(fù)大鼠16mm坐骨神經(jīng)缺損，通過治療效果來評(píng)定大鼠外周神經(jīng)長節(jié)段缺損16_的修復(fù)效果。I)將15只雄性SD大鼠(200-220g)采用腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉(100mg/ml)麻醉；2)麻醉大鼠后，固定大鼠左腿并備皮消毒，切開皮膚和皮下筋膜，鈍性分離肌肉組織，顯露坐骨神經(jīng)；3)用顯微剪剪去7 8mm長的坐骨神經(jīng)，神經(jīng)斷端回縮后留下16mm長的神經(jīng)缺損；4)在顯微鏡下，采用10/0尼龍縫線通過神經(jīng)外膜縫合技術(shù)將支架組縫合在神經(jīng)斷端；5)最后，使用6/0尼龍縫線縫合肌肉，皮膚。將手術(shù)后的大鼠放入鋪滿木屑的籠子里，常規(guī)喂水進(jìn)食后觀察12周。分別在第4、
8、12周，對(duì)大鼠腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，隨后鈍性分離大鼠左腿的肌肉組織，用絕緣的橡皮圈將顯露神經(jīng)修復(fù)部位與周圍組織隔離。測(cè)試移植本發(fā)明神經(jīng)組織工程支架后， 大鼠肌肉動(dòng)作電位最大峰值和神經(jīng)傳導(dǎo)速度，肌肉動(dòng)作電位主要反映運(yùn)動(dòng)神經(jīng)的傳導(dǎo)性、 肌纖維受神經(jīng)支配的狀態(tài)，神經(jīng)傳導(dǎo)速度用來評(píng)價(jià)周圍神經(jīng)傳導(dǎo)功能，如圖6所示，大鼠的神經(jīng)傳導(dǎo)速度隨時(shí)間的變化有明顯的提升，由第5周的lOm/s到第12周的23m/s，如圖6所示，肌肉動(dòng)作電位最大峰值由第4周的7毫伏到第12周的16毫伏?？芍捎帽景l(fā)明NGF 殼聚糖微球-高仿生支架緩釋系統(tǒng)修復(fù)大鼠16_坐骨神經(jīng)缺損后，大鼠的神經(jīng)傳導(dǎo)功能、 肌纖維受神經(jīng)支配的狀態(tài)都具有明顯的提升。2.對(duì)大鼠進(jìn)行步徑試驗(yàn)，分析再生神經(jīng)對(duì)大鼠肌肉功能支配情況分別在第4、8、12周，對(duì)上述三組大鼠進(jìn)行步徑試驗(yàn)分析，給每只大鼠的左后足蘸上黑色的墨水，訓(xùn)練大鼠通過一條鋪滿白紙(50cmX7cm)的小路，使大鼠最終到達(dá)一個(gè)暗箱內(nèi)。大鼠會(huì)在白紙上留下一連串的腳印，對(duì)足跡分析評(píng)估坐骨神經(jīng)功能指數(shù)SFI，用SFI 來評(píng)價(jià)再生神經(jīng)對(duì)大鼠肌肉的功能支配情況，以SFI指為O表示正常，-100為神經(jīng)完全離斷為指標(biāo)，如圖7所示，隨時(shí)間的增長，坐骨神經(jīng)功能指數(shù)SFI在第4周為-75，到第12周恢復(fù)為-55，表示移植本發(fā)明NGF殼聚糖微球-高仿生支架緩釋系統(tǒng)后，再生神經(jīng)對(duì)大鼠肌肉的功能支配情況逐漸恢復(fù)。SFI計(jì)算公式如下
權(quán)利要求
1.一種NGF殼聚糖微球-高仿生支架緩釋系統(tǒng)，其特征在于，包括有橫截面直徑為 2mm,長度為I. 5cm 2. 5cm的圓柱形膠原-殼聚糖神經(jīng)支架，圓柱形膠原_殼聚糖神經(jīng)支架內(nèi)部具有相互平行的軸向微管樣結(jié)構(gòu)，圓柱形膠原-殼聚糖神經(jīng)支架內(nèi)部均勻復(fù)合有包埋神經(jīng)生長因子的殼聚糖微球，包埋神經(jīng)生長因子的殼聚糖微球的粒徑為3 μ m 60 μ m。
2.—種NGF殼聚糖微球-高仿生支架緩釋系統(tǒng)的制備方法，其特征在于，制備出的具有緩釋功能的神經(jīng)組織工程支架，包括有橫截面直徑為2mm，長度為I. 5cm 2. 5cm的圓柱形膠原-殼聚糖神經(jīng)支架，圓柱形膠原-殼聚糖神經(jīng)支架內(nèi)部具有相互平行的軸向微管樣結(jié)構(gòu)，圓柱形膠原-殼聚糖神經(jīng)支架內(nèi)部均勻復(fù)合有包埋神經(jīng)生長因子的殼聚糖微球，包埋神經(jīng)生長因子的殼聚糖微球的粒徑為3 μ m 60 μ m ;具體按照以下步驟實(shí)施步驟I :制備出水相和油相；步驟2 :制備包埋神經(jīng)生長因子的殼聚糖微球；步驟3 :干燥、冷藏包埋神經(jīng)生長因子的殼聚糖微球；步驟4 :制備膠原-殼聚糖凝膠狀懸濁液；步驟5 :注模冷琳，制備膠原-殼聚糖支架凝膠；步驟6 :真空干燥，形成膠原-殼聚糖神經(jīng)支架；步驟7 :對(duì)膠原-殼聚糖神經(jīng)支架進(jìn)行交聯(lián)和消毒；步驟8 :制備NGF殼聚糖微球-高仿生支架緩釋系統(tǒng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的NGF殼聚糖微球-高仿生支架緩釋系統(tǒng)的制備方法，其特征在于，所述的步驟I具體按照以下步驟實(shí)施在低溫2 6°C的條件下，按質(zhì)量比為I : 20 30分別稱取神經(jīng)生長因子和牛血清白蛋白，將神經(jīng)生長因子溶解于pH為7. 2 7. 6的PBS溶液中，配制成質(zhì)量-體積濃度為 4 8μ g/ml的溶液，再將牛血清白蛋白倒入溶液中完全溶解后制備出神經(jīng)生長因子溶液; 在室溫條件下，將殼聚糖粉末完全溶解于質(zhì)量-體積濃度為3mg/ml醋酸水溶液中，制備出質(zhì)量-體積濃度為10 20mg/ml的殼聚糖醋酸溶液；將配置好的神經(jīng)生長因子溶液與殼聚糖醋酸溶液按體積比為I : 5 15充分混合，制備出水相；將液體石蠟油與表面活性劑Span80按體積比為70 80 I量取好后，依次注入三口燒瓶中，采用機(jī)械攪拌3min 7min,攪拌速度為300r/min 700r/min,使液體石臘油與表面活性劑Span80混合均勻，制備出油相。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的NGF殼聚糖微球-高仿生支架緩釋系統(tǒng)的制備方法，其特征在于，所述的步驟2具體按照以下步驟實(shí)施1)在低溫2 6°C的條件下，按體積比為I: 5 15將步驟I制得的水相逐滴加入制得的油相中，采用機(jī)械攪拌O. 5h I. 5h,攪拌速度為800r/min 1200r/min,制備出水/ 油乳濁液；2)配置質(zhì)量百分濃度為3%的三聚磷酸鈉溶液，三聚磷酸鈉溶液與步驟I中使用的液體石蠟油體積比為I : 7 8;3)將質(zhì)量百分濃度為3%的三聚磷酸鈉溶液逐滴加入步驟I)得到的水/油乳濁液中， 采用機(jī)械攪拌O. 5h I. 5h,攪拌速度為800r/min 1200r/min,形成乳池液；4)依次用石油醚、異丙醇反復(fù)清洗步驟3)得到的乳濁液3次，即得到包埋神經(jīng)生長因子的殼聚糖微球。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的NGF殼聚糖微球-高仿生支架緩釋系統(tǒng)的制備方法，其特征在于，所述的步驟3具體按照以下步驟實(shí)施將步驟2得到的包埋神經(jīng)生長因子的殼聚糖微球放入冷凍干燥機(jī)內(nèi)于-80 -40°C條件下冷凍干燥4h 8h，冰凍干燥后，將凍干的包埋神經(jīng)生長因子的殼聚糖微球儲(chǔ)存于2 6°C冰箱內(nèi)。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的NGF殼聚糖微球-高仿生支架緩釋系統(tǒng)的制備方法，其特征在于，所述的步驟4具體按照以下步驟實(shí)施.1)按質(zhì)量比為2 6: I分別稱取I型膠原蛋白和殼聚糖；.2)將稱取的I型膠原蛋白放入質(zhì)量-體積濃度為3mg/ml醋酸水溶液中溶解22 26 小時(shí)，配置成質(zhì)量-體積濃度為24mg/ml 30mg/ml的I型膠原蛋白醋酸懸池液；.3)再將稱取的殼聚糖加入質(zhì)量-體積濃度為3mg/ml醋酸水溶液中攪拌至完全溶解，配置成質(zhì)量-體積濃度為12mg/ml 16mg/ml的殼聚糖醋酸懸池液；.4)將兩種懸濁液按體積比為I 3: I混合并保持2 6°C恒溫，再以10000r/min 14000r/min攪拌速度攪拌70min IlOmin,充分混合后,制成膠原-殼聚糖凝膠狀懸池液。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的NGF殼聚糖微球-高仿生支架緩釋系統(tǒng)的制備方法，其特征在于，所述的步驟5具體按照以下步驟實(shí)施.1)取硅膠管模具，將步驟4制得的膠原-殼聚糖凝膠狀懸濁液注入硅膠管模具內(nèi)，以鉛絲封閉硅膠管模具兩端；.2)將注入膠原-殼聚糖凝膠狀懸濁液的硅膠管模具沿縱軸方向在電子微型調(diào)速儀的控制下，以2X 10_2cm/s 6X 10_2cm/s的速度緩慢浸入冷淋劑液氮，開始時(shí)硅膠管模具底端距冷淋液表面的距離為15cm 25cm，直至硅膠管模具全部進(jìn)入冷淋劑內(nèi)。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的NGF殼聚糖微球-高仿生支架緩釋系統(tǒng)的制備方法，其特征在于，所述的步驟6具體按照以下步驟實(shí)施.1)將步驟5制得的膠原-殼聚糖神經(jīng)支架凝膠短節(jié)段置于0°C的鋁制容器內(nèi)，將鋁制容器置于冷凍干燥機(jī)中，于-80 _40°C條件下冷凍干燥22h 26h后將冷凍干燥后的膠原-殼聚糖神經(jīng)支架凝膠短節(jié)段取出；.2)將冷凍干燥機(jī)的溫度升至0°C，再把膠原-殼聚糖神經(jīng)支架凝膠短節(jié)段放入冷凍干燥機(jī)內(nèi)冷凍干燥6h IOh后取出；.3)再將冷凍干燥機(jī)的溫度升至20 24°C，繼續(xù)把膠原-殼聚糖神經(jīng)支架凝膠短節(jié)段放入冷凍干燥機(jī)內(nèi)，保持30min 60min即制得干燥成形的膠原-殼聚糖神經(jīng)支架。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的NGF殼聚糖微球-高仿生支架緩釋系統(tǒng)的制備方法，其特征在于，所述的步驟7具體按照以下步驟實(shí)施.1)將步驟6制得的膠原-殼聚糖神經(jīng)支架置于O.5% I. 5%京尼平水溶液中交聯(lián) 22h 26h ；.2)將交聯(lián)后的膠原-殼聚糖神經(jīng)支架用去離子水和無水乙醇交替清洗4h 8h，去除多余的交聯(lián)劑；.3)將清洗后的膠原-殼聚糖神經(jīng)支架置于冷凍干燥機(jī)內(nèi)于_20°C下冷凍干燥6h 1Oh ；.4)將冷凍干燥后的膠原-殼聚糖神經(jīng)支架經(jīng)Co6°照射消毒。
10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的NGF殼聚糖微球-高仿生支架緩釋系統(tǒng)的制備方法，其特征在于，所述的步驟8具體按照以下步驟實(shí)施.1)將步驟3制成的包埋神經(jīng)生長因子的殼聚糖微球溶于蒸餾水中，配置成濃度為 300mg/ml 700mg/ml的溶液，將配置好的溶液分為等量的兩份；.2)將其中一份包埋神經(jīng)生長因子的殼聚糖微球溶液通過針管注入膠原-殼聚糖神經(jīng)支架的一端；再將另一份包埋神經(jīng)生長因子的殼聚糖微球溶液通過針管注入膠原-殼聚糖神經(jīng)支架的另一端，這個(gè)過程重復(fù)2 5次，直到包埋神經(jīng)生長因子的殼聚糖微球溶液浸透膠原-殼聚糖神經(jīng)支架，制備出NGF殼聚糖微球-高仿生支架緩釋系統(tǒng)；.3)將制備出的NGF殼聚糖微球-高仿生支架緩釋系統(tǒng)放入冷凍干燥機(jī)內(nèi)， 于-80 -40°C條件下冷凍干燥4h 8h，冰凍干燥后將NGF殼聚糖微球-高仿生支架緩釋系統(tǒng)儲(chǔ)存于2 6°C冰箱內(nèi)。
全文摘要
本發(fā)明公開的一種NGF殼聚糖微球-高仿生支架緩釋系統(tǒng)，該緩釋系統(tǒng)為圓柱形膠原-殼聚糖神經(jīng)支架，支架內(nèi)部均勻負(fù)載有包埋神經(jīng)生長因子的殼聚糖微球。該支架的制備方法是首先，采用乳化交聯(lián)法制備出包埋神經(jīng)生長因子的殼聚糖微球；其次，制備具有相互平行的軸向微管樣結(jié)構(gòu)的膠原-殼聚糖神經(jīng)支架；最后，通過后復(fù)合技術(shù)將殼聚糖微球復(fù)合于膠原-殼聚糖神經(jīng)支架，制備出NGF殼聚糖微球-高仿生支架緩釋系統(tǒng)。這種支架結(jié)構(gòu)與正常神經(jīng)基底膜結(jié)構(gòu)類似，在最大程度上發(fā)揮了支架對(duì)再生神經(jīng)的物理引導(dǎo)作用；該支架能緩釋具有生物活性的神經(jīng)生長因子達(dá)12周，可使神經(jīng)生長因子長期有效釋放到神經(jīng)損傷部位，以達(dá)到更好、更快的促進(jìn)長節(jié)段神經(jīng)缺損修復(fù)的目的。
文檔編號(hào)A61L27/54GK102600506SQ20121005994
公開日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月7日
發(fā)明者曾文, 羅卓荊, 胡學(xué)昱, 黃景輝 申請(qǐng)人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)