專利名稱：：一種生物活性殼聚糖基多孔支架的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于再生醫(yī)學(xué)技術(shù)中的生物醫(yī)用材料領(lǐng)域，涉及一種組織工程多孔支架及制備方法，具體涉及一種適用于骨等硬組織修復(fù)的生物活性殼聚糖基多孔支架的制備方法。
背景技術(shù)：
：組織工程技術(shù)是近些年發(fā)展起來的、最富前景的缺損組織再生修復(fù)新手段，已成為再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中研究最活躍的方向。其本質(zhì)是通過在體外構(gòu)建模擬自然組織中細(xì)胞外基質(zhì)的微環(huán)境，即多孔支架，包括空間上的多孔結(jié)構(gòu)、基質(zhì)化學(xué)成分和組成、生物活性因子等，為種子細(xì)胞提供高度仿真的三維環(huán)境，以利于細(xì)胞粘附、分化、增殖，在特定的動(dòng)態(tài)物理、化學(xué)和生物信號(hào)調(diào)控下形成具有一定功能的組織。用于制備多孔支架的生物材料主要包括合成高分子材料、天然高分子材料和無機(jī)材料三大類。其中，合成生物高分子材料由于具有分子結(jié)構(gòu)和性能可設(shè)計(jì)性，一直是研究的重點(diǎn)，然而它們存在著親水性較差、缺乏細(xì)胞識(shí)別的生物信號(hào)等不足；天然生物高分子具有良好的親水性、生物相容性和生物降解性以及獨(dú)特的生物活性等優(yōu)點(diǎn)，但它們存在降解過快、力學(xué)性能不夠理想等缺點(diǎn)；而無機(jī)生物材料通常具有生物活性如骨傳導(dǎo)性甚至骨誘導(dǎo)性，但存在脆性大等問題，主要應(yīng)用于骨等硬組織缺損的修復(fù)。在臨床上，由各種原因?qū)е碌墓侨睋p十分常見，但欲獲得理想的結(jié)構(gòu)修復(fù)和功能恢復(fù)仍具有很大的挑戰(zhàn)性，已成為再生醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)領(lǐng)域之一。骨組織工程作為一種新的缺損骨再生修復(fù)技術(shù)，被寄予了厚望。為制備綜合性能優(yōu)良的骨組織工程多孔支架，以殼聚糖為代表的天然生物高分子材料為基礎(chǔ)原料，通過與生物活性材料復(fù)合制成復(fù)合材料支架，已受到越來越多的重視。殼聚糖是天然高分子甲殼質(zhì)的脫乙酰化產(chǎn)物，它是一種線性的、由D-氨基葡萄糖經(jīng)β_1，4糖苷鍵結(jié)合而成的陽離子性聚合物。由于它具有反應(yīng)性官能團(tuán)、凝膠形成能力、抗微生物、抗腫瘤和低免疫原性等優(yōu)點(diǎn)，已在生物醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、環(huán)境、食品等工業(yè)領(lǐng)域得到應(yīng)用。有關(guān)殼聚糖的基礎(chǔ)生物醫(yī)學(xué)研究和實(shí)際臨床應(yīng)用業(yè)已證明，殼聚糖具有優(yōu)異的生物相容性和生物可降解性以及無免疫原性等性能。近來的一些研究表明，殼聚糖具有類似細(xì)胞外基質(zhì)粘多糖的許多性質(zhì)，因此，殼聚糖被認(rèn)為是理想的細(xì)胞外基質(zhì)候選材料。然而，殼聚糖及其制備的多孔支架存在明顯的不足，如僅溶于酸性水溶液而在中性和堿性環(huán)境中不溶、力學(xué)強(qiáng)度和水相中化學(xué)穩(wěn)定性較差、缺乏生物活性等，限制了其在骨等硬組織工程中的應(yīng)用。為解決這些問題，目前文獻(xiàn)報(bào)道(ZhuYX，etal.Collagen-chitosanpolymerasascaffoldfortheproliferationofhumanadiposetissue-derivedstemcells[J].JMaterSciMaterMed,2009,20:799;ZhuAM,etal.Controlledreleaseofberberinehydrochloridefromalginatemicrospheresembeddedwithincarboxymethylchitosanhydrogels[J].JApplPolymSci,2011,120:2374；YanLP,etal.Genipin-cross-1inkedcollagen/chitosanbiomimeticscaffoldsforarticularcartilagetissueengineeringapplications[J].JBiomedMaterResPartA,2010,95A:465；楊榮華，等.一種多孔羥基磷灰石/殼聚糖-明膠復(fù)合材料支架[P].專利申請(qǐng)?zhí)?00910250313.1)中主要采用小分子交聯(lián)劑如戊二醛、碳二亞胺、京尼平等對(duì)殼聚糖進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，以提高殼聚糖基多孔支架力學(xué)性能和化學(xué)穩(wěn)定性。然而，這些交聯(lián)劑對(duì)細(xì)胞有潛在的毒性，制約了殼聚糖基多孔支架的發(fā)展。近幾年，研究表明醛基化多糖類聚合物比小分子量醛類具有更快的膠凝效果和更好的生物相容性(NairS,etal.Abiodegradableinsituinjectablehydrogelbasedonchitosanandoxidizedhyaluronicacidfortissueengineeringapplications[J].CarbohydPolym,2011,85838；HoffmannB,etal.Glutaraldehydeandoxidiseddextranascrosslinkerreagentsforchitosan-basedscaffoldsforcartilagetissueengineering[J].JMaterSci:MaterMed,2009,20:1495；EJiM^nM瑪，等.基于殼聚糖和氧化多糖的保護(hù)性凝膠[P].專利申請(qǐng)?zhí)?00980118461.6)。無機(jī)生物材料，如羥基磷灰石、磷酸三鈣和各種生物活性玻璃等，已成為增強(qiáng)高分子材料力學(xué)性能和生物活性的主要手段。對(duì)殼聚糖而言，由于其在堿性條件下不溶，難以采用原位形成無機(jī)材料的方法制備復(fù)合材料，通常只能采用殼聚糖溶液和無機(jī)材料懸液混合的方法制備。然而，這種簡單復(fù)合雖然可提高干態(tài)殼聚糖復(fù)合材料的生物活性，改善力學(xué)性能，但無機(jī)材料的加入干擾了殼聚糖分子間的氫鍵作用，降低了結(jié)晶度，從而降低了其在水相中的穩(wěn)定性，使降解速度加快。為此，有研究者(JiangLY，etal.Preparationandpropertiesofnano-hydroxyapatite/chitosan/carboxymethylcellulosecompositescaffold[J],CarbohydPolym,2008,74680)通過添加一定量聚陰離子，以離子交聯(lián)方法獲得穩(wěn)定的復(fù)合材料，但這種方法降低了支架孔隙率，而且該交聯(lián)方法得到的支架穩(wěn)定性受PH景i響較大。最近，有文獻(xiàn)艮道(WangGC,etal.Constructionofafluorescentnanostructuredchitosan-hydroxyapatitescaffoldbynano-crystalloninducedbiomimeticmineralizationanditscellbiocompatibility[J].ACSApplMaterInterfaces,2011,3(5):1692)利用京尼平交聯(lián)殼聚糖/羥基磷灰石漿料制備殼聚糖基復(fù)合材料多孔支架，并用骨髓基質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行了生物學(xué)評(píng)價(jià)，取得了較好的初步結(jié)果。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有殼聚糖基多孔支架的缺陷，提供了一種生物活性殼聚糖基多孔支架的制備方法。本發(fā)明的多孔支架具有良好的生物活性、生物相容性和生物降解性，可廣泛應(yīng)用于組織工程技術(shù)修復(fù)骨等硬組織缺損。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是在殼聚糖和無機(jī)生物活性微/納米粒漿料中加入水溶性醛基化多糖聚合物的溶液，經(jīng)冷凍干燥法制得生物活性殼聚糖基多孔支架；其中，無機(jī)生物活性材料和醛基化多糖聚合物分別占?xì)ぞ厶堑馁|(zhì)量百分比540%和310%。具體步驟如下1)水溶性醛基化多糖聚合物的合成首先將水溶性多糖聚合物溶于水中形成質(zhì)量百分比濃度為225%的多糖聚合物溶液，然后用5mol/L的硫酸調(diào)節(jié)多糖聚合物溶液的pH值為14后在避光條件下分批加入多糖聚合物質(zhì)量15倍的高碘酸鈉，在攪拌下于3560°C反應(yīng)3他后再加入過量的乙二醇繼續(xù)反應(yīng)30min；反應(yīng)結(jié)束后，用冷乙醇沉淀出產(chǎn)物，用水和乙醇混合物充分洗滌至無碘檢出；最后，經(jīng)室溫真空干燥得到水溶性醛基化多糖聚合物；2)殼聚糖-生物活性無機(jī)微/納米粒漿料制備在攪拌條件下，將殼聚糖溶于體積分?jǐn)?shù)為2%的乙酸水溶液中形成質(zhì)量百分比濃度為13%的殼聚糖溶液，然后向其中加入殼聚糖質(zhì)量540%的生物活性微/納米粒，經(jīng)行星式球磨機(jī)球磨后得到穩(wěn)定的殼聚糖-生物活性無機(jī)微/納米粒漿料；3)希夫堿交聯(lián)過程將步驟1)中得到的水溶性醛基化多糖聚合物溶于蒸餾水中制成質(zhì)量百分比濃度為28%的醛基化多糖聚合物溶液，在劇烈攪拌下以10200μ1/min的速度將醛基化多糖聚合物溶液滴加至步驟2、的殼聚糖-生物活性無機(jī)微/納米粒漿料中，控制醛基化多糖聚合物與殼聚糖的質(zhì)量比為310010100，滴加結(jié)束后繼續(xù)攪拌1030min，然后將其注入M孔培養(yǎng)板中，于-0.06-0.03MPa環(huán)境中靜置12小時(shí)，以徹底脫泡和使交聯(lián)反應(yīng)充分，得到凝膠狀試樣；4)冷凍-干燥將步驟3)制成的凝膠狀試樣置于冷凍干燥機(jī)中，以-50°C/10h、-40°C/8h、-3(rC/8h、-20°C/12h、-10°C/12h和5°C/8h凍干工藝進(jìn)行冷凍-干燥，從M孔培養(yǎng)板中脫模即得到初步多孔支架；5)后處理先用質(zhì)量百分比濃度為2%的氫氧化鈉的乙醇溶液浸泡得到的初步多孔支架以中和其中的乙酸，接著用體積比為1946的蒸餾水乙醇混合溶液對(duì)初步多孔支架進(jìn)行清洗，使混合溶液PH為7，再用純蒸餾水洗兩次后進(jìn)行冷凍-干燥得到生物活性殼聚糖基多孔支架。所述的水溶性多糖聚合物為羧甲基纖維素鈉、透明質(zhì)酸、右旋糖酐、海藻酸鈉或硫酸軟骨素。所述的殼聚糖為脫乙酰度為5595%、分子量為1050萬的殼聚糖。所述的生物活性微/納米粒為納米羥基磷灰石、亞微米級(jí)α-磷酸三鈣、亞微米級(jí)β-磷酸三鈣或微米級(jí)45S5玻璃粉。所述的劇烈攪拌的轉(zhuǎn)速為1000轉(zhuǎn)/分以上。本發(fā)明將生物相容性和生物降解性好的殼聚糖和具有生物活性的無機(jī)微/納米粒復(fù)合，利用生物相容性好的水溶性醛基化多糖聚合物為希夫堿交聯(lián)劑，經(jīng)希夫堿交聯(lián)和冷凍干燥制成多孔支架。該多孔支架綜合性能滿足骨等組織工程技術(shù)的基本應(yīng)用要求。該支架孔徑范圍為80300μm，孔隙率約為90%，壓縮強(qiáng)度范圍為300700kPa，并具有良好的孔連通性和的孔壁粗糙度，利于細(xì)胞粘附和生長。本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)所具有的優(yōu)點(diǎn)及有益效果(1)以生物相容性好的水溶性醛基化多糖聚合物為交聯(lián)劑，通過希夫堿形成實(shí)現(xiàn)殼聚糖交聯(lián)，避免了使用戊二醛等對(duì)細(xì)胞有害的小分子化學(xué)交聯(lián)劑，提高了多孔支架的生物相容性。(2)水溶性醛基化多糖聚合物交聯(lián)劑的使用，不僅提高了殼聚糖基多孔支架的強(qiáng)度和水相中的穩(wěn)定性，而且賦予多孔支架更好的親水性，利于細(xì)胞粘附和多孔支架內(nèi)外物質(zhì)傳輸，進(jìn)而利于細(xì)胞的增殖和生長。(3)無機(jī)生物活性微/納米粒作為復(fù)合材料組分之一，既賦予了支架生物活性，又實(shí)現(xiàn)了在不改變凍干法制備多孔支架形貌的情況下增加了孔壁表面粗糙度，人成骨樣細(xì)胞MG-63細(xì)胞的培養(yǎng)研究已證實(shí)細(xì)胞在該多孔支架上粘附和生長效果良好。(4)利用希夫堿交聯(lián)-凍干法制備的殼聚糖基多孔支架，干態(tài)時(shí)表現(xiàn)為堅(jiān)硬、無彈性的多孔體，而在水相中呈現(xiàn)柔軟、高彈性和高溶脹特點(diǎn)，其降解性、孔徑范圍、孔連通性和力學(xué)強(qiáng)度等性質(zhì)能滿足骨等硬組織的組織工程技術(shù)應(yīng)用要求。(5)本發(fā)明的制備方法具有工藝不復(fù)雜、操作方便、原料豐富、成本低等優(yōu)點(diǎn)。圖1是生物活性殼聚糖基多孔支架制備原理示意圖。該交聯(lián)反應(yīng)發(fā)生在殼聚糖分子鏈上氨基和醛基化多糖聚合物上醛基之間，二者反應(yīng)形成希夫堿鍵，獲得三維交聯(lián)空間網(wǎng)絡(luò)。與此同時(shí)，生物活性的無機(jī)粒子被嵌入網(wǎng)絡(luò)之中。圖2是醛基化羧甲基纖維素希夫堿交聯(lián)殼聚糖的紅外光譜圖。在殼聚糖的紅外光譜中，1656cm—1和1596cm—1處分別是酰胺I和II的特征振動(dòng)峰；在醛基化羧甲纖維素的紅外光譜圖中，1737CHT1和885CHT1兩個(gè)吸收峰分別是醛基和半縮醛的特征吸收峰，表明多糖聚合物已被成功氧化出醛基基團(tuán)；在交聯(lián)產(chǎn)物的紅外光譜中，1640cm-1處的吸收峰是希夫堿(-C=N-)的特征吸收峰，這證實(shí)了殼聚糖上氨基基團(tuán)和醛基化多糖聚合物上醛基之間發(fā)生了化學(xué)反應(yīng)，形成了希夫堿鍵。圖3是殼聚糖/納米羥基磷灰石復(fù)合支架的掃描電鏡圖。掃描電鏡照片表明，該多孔支架孔徑范圍為80300μm，孔間連通性好，復(fù)合的羥基磷灰石粉體被嵌入殼聚糖基體中，使孔壁表面呈鋪路石樣的粗糙結(jié)構(gòu)；阿基米德法測(cè)得的孔隙率為91%，壓縮強(qiáng)度為750kPa。圖4是殼聚糖/亞微米β-磷酸三鈣復(fù)合支架的掃描電鏡圖。掃描電鏡的結(jié)果與圖3的類似，不同之處孔壁粗糙度更大一些，這是因?yàn)樘砑拥膩單⒚准?jí)磷酸三鈣粒度大于納米級(jí)羥基磷灰石造成的；阿基米德法測(cè)得的孔隙率為87%，壓縮強(qiáng)度為680kPa。圖5是人成骨樣細(xì)胞MG-63細(xì)胞在殼聚糖/納米羥基磷灰石復(fù)合支架上培養(yǎng)5天的掃描電鏡圖。掃描電鏡表明，MG-63細(xì)胞在支架上形成了團(tuán)簇狀的細(xì)胞球，表明該多孔支架具有很好的生物相容性。圖6是人成骨樣細(xì)胞MG-63細(xì)胞在殼聚糖/亞微米β-磷酸三鈣復(fù)合支架上培養(yǎng)3天的掃描電鏡圖。掃描電鏡結(jié)果類似圖5，表明這種多孔支架也具有很好的生物相容性。圖7是MTT法測(cè)得的人成骨樣細(xì)胞MG-63細(xì)胞在殼聚糖/納米羥基磷灰石復(fù)合支架上的增殖情況MTT法結(jié)果表明，MG-63細(xì)胞在該支架上生長良好，在培養(yǎng)第3天后，增殖生長更加明顯，這表明該多孔支架能支持細(xì)胞生長和促進(jìn)細(xì)胞增殖，用作骨組織工程多孔支架的潛力大。具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案進(jìn)一步說明，不是對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。圖1是生物活性殼聚糖基多孔支架制備原理示意圖。實(shí)施例1殼聚糖/納米羥基磷灰石復(fù)合多孔支架制備1)水溶性醛基化羧甲基纖維素的合成首先將水溶性多糖聚合物羧甲基纖維素鈉溶于水中形成質(zhì)量百分比濃度為5%的多糖聚合物溶液，然后用5mol/L的硫酸調(diào)節(jié)多糖聚合物溶液的pH值為3后在避光條件下分批加入多糖聚合物質(zhì)量5倍的高碘酸鈉，在攪拌下于45°C反應(yīng)他后再加入過量的乙二醇繼續(xù)反應(yīng)30min；反應(yīng)結(jié)束后，用冷乙醇沉淀出產(chǎn)物，用水和乙醇混合物充分洗滌至無碘檢出；最后，經(jīng)室溫真空干燥得到水溶性醛基化羧甲基纖維素；2)殼聚糖-羥基磷灰石漿料制備在攪拌條件下，將脫乙酰度為90%、分子量為20萬的殼聚糖溶于體積分?jǐn)?shù)為2%的乙酸水溶液中形成質(zhì)量百分比濃度為2%的殼聚糖溶液，然后向其中加入殼聚糖質(zhì)量20%的納米羥基磷灰石，經(jīng)行星式球磨機(jī)球磨后得到穩(wěn)定的殼聚糖-羥基磷灰石漿料；3)希夫堿交聯(lián)過程將步驟1)中得到的水溶性醛基化羧甲基纖維素溶于蒸餾水中制成質(zhì)量百分比濃度為4%的水溶性醛基化羧甲基纖維素溶液，在1200轉(zhuǎn)/分劇烈攪拌下以100μ1/min的速度將水溶性醛基化羧甲基纖維素溶液滴加至步驟2、的殼聚糖-羥基磷灰石漿料中，控制醛基化羧甲基纖維素與殼聚糖的質(zhì)量比為5100，滴加結(jié)束后繼續(xù)攪拌30min，然后將其注入M孔培養(yǎng)板中，于-0.(MMI5a環(huán)境中靜置12小時(shí)，以徹底脫泡和使交聯(lián)反應(yīng)充分，得到凝膠狀試樣；該希夫堿交聯(lián)過程驗(yàn)證的紅外光譜圖見圖2。4)冷凍-干燥將步驟3)制成的凝膠狀試樣置于冷凍干燥機(jī)中，以_50°C/10h、-40°C/8h,-30°C/8h、-20°C/12h、-10°C/12h和5°C/8h凍干工藝進(jìn)行冷凍-干燥，從M孔培養(yǎng)板中脫模即得到初步多孔支架；5)后處理先用質(zhì)量百分比濃度為2%的氫氧化鈉的乙醇溶液浸泡得到的初步多孔支架以中和其中的乙酸，接著用體積比為28的蒸餾水乙醇混合溶液對(duì)初步多孔支架進(jìn)行清洗，使混合溶液PH為7，再用純蒸餾水洗兩次后進(jìn)行冷凍-干燥得到生物活性殼聚糖/納米羥基磷灰石復(fù)合多孔支架。見圖3。細(xì)胞培養(yǎng)將制備的生物活性殼聚糖/納米羥基磷灰石復(fù)合多孔支架加成厚度為3mm、直徑為4mm的圓片，經(jīng)75%(ν/ν)的乙醇和紫外線照射對(duì)進(jìn)行滅菌處理后，置于96孔板內(nèi)，用DMEM培養(yǎng)液浸泡4h，去除培養(yǎng)液后在每孔中種植5XIO4個(gè)人成骨樣細(xì)胞MG-63細(xì)胞，置于37°C、飽和濕度、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育他，待細(xì)胞貼壁后補(bǔ)加培養(yǎng)基，繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。每天更換新鮮培養(yǎng)液。培養(yǎng)1、3和5天后，去除培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液淋洗后用2.5%(ν/ν)戊二醛固定lh，再用梯度濃度酒精進(jìn)行脫水處理，室溫真空干燥兩天或凍干，用于電鏡觀察。培養(yǎng)細(xì)胞5天的電鏡照片見圖5，培養(yǎng)1、3和5天的細(xì)胞增殖情況見圖7。實(shí)施例2殼聚糖/β-磷酸三鈣復(fù)合多孔支架制備1)水溶性醛基化多糖透明質(zhì)酸的合成首先將水溶性多糖聚合物透明質(zhì)酸溶于水中形成質(zhì)量百分比濃度為2%的多糖聚合物溶液，然后用5mol/L的硫酸調(diào)節(jié)多糖聚合物溶液的pH值為4后在避光條件下分批加入多糖聚合物質(zhì)量3倍的高碘酸鈉，在攪拌下于60°C反應(yīng)4h后再加入過量的乙二醇繼續(xù)反應(yīng)30min；反應(yīng)結(jié)束后，用冷乙醇沉淀出產(chǎn)物，用水和乙醇混合物充分洗滌至無碘檢出；最后，經(jīng)室溫真空干燥得到水溶性醛基化多糖透明質(zhì)酸；2)殼聚糖-β-磷酸三鈣漿料制備在攪拌條件下，將脫乙酰度為90%、分子量為30萬的殼聚糖溶于體積分?jǐn)?shù)為2%的乙酸水溶液中形成質(zhì)量百分比濃度為3%的殼聚糖溶液，然后向其中加入殼聚糖質(zhì)量的生物活性亞微米級(jí)β-磷酸三鈣，經(jīng)行星式球磨機(jī)球磨后得到穩(wěn)定的殼聚糖-β-磷酸三鈣漿料；3)希夫堿交聯(lián)過程將步驟1)中得到的水溶性醛基化多糖透明質(zhì)酸溶于蒸餾水中制成質(zhì)量百分比濃度為6%的水溶性醛基化多糖透明質(zhì)酸溶液，在1500轉(zhuǎn)/分劇烈攪拌下以50μ1/min的速度將水溶性醛基化多糖透明質(zhì)酸溶液滴加至步驟2、的殼聚糖-β-磷酸三鈣漿料中，控制水溶性醛基化多糖透明質(zhì)酸與殼聚糖的質(zhì)量比為8100，滴加結(jié)束后繼續(xù)攪拌20min，然后將其注入M孔培養(yǎng)板中，于-0.05MI^環(huán)境中靜置12小時(shí)，以徹底脫泡和使交聯(lián)反應(yīng)充分，得到凝膠狀試樣；4)冷凍-干燥將步驟3)制成的凝膠狀試樣置于冷凍干燥機(jī)中，以_50°C/10h、_40°C/8h,-30°C/8h、-20°C/12h、-10°C/12h和5°C/8h凍干工藝進(jìn)行冷凍-干燥，從M孔培養(yǎng)板中脫模即得到初步多孔支架；5)后處理先用質(zhì)量百分比濃度為2%的氫氧化鈉的乙醇溶液浸泡得到的初步多孔支架以中和其中的乙酸，接著用體積比為37的蒸餾水乙醇混合溶液對(duì)初步多孔支架進(jìn)行清洗，使混合溶液PH為7，再用純蒸餾水洗兩次后進(jìn)行冷凍-干燥得到殼聚糖/β-磷酸三鈣復(fù)合多孔支架。見圖4。細(xì)胞培養(yǎng)將殼聚糖/β-磷酸三鈣復(fù)合多孔支架加成厚度為3mm、直徑為4mm的圓片，經(jīng)75%(ν/ν)的乙醇和紫外線照射對(duì)進(jìn)行滅菌處理后，置于96孔板內(nèi)，用DMEM培養(yǎng)液浸泡4h，去除培養(yǎng)液后在每孔中種植5XIO4個(gè)人成骨樣細(xì)胞MG-63細(xì)胞，置于37°C、飽和濕度、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育他，待細(xì)胞貼壁后補(bǔ)加培養(yǎng)基，繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。每天更換新鮮培養(yǎng)液。培養(yǎng)3天后，去除培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液淋洗后用2.5%(ν/ν)戊二醛固定lh，再用梯度濃度酒精進(jìn)行脫水處理，室溫真空干燥兩天或凍干，用于電鏡觀察。見圖6。實(shí)施例3殼聚糖/α-磷酸三鈣復(fù)合多孔支架制備1)水溶性醛基化多糖海藻酸的合成首先將水溶性多糖聚合物海藻酸鈉溶于水中形成質(zhì)量百分比濃度為6%的多糖聚合物溶液，然后用5mol/L的硫酸調(diào)節(jié)多糖聚合物溶液的pH值為1后在避光條件下分批加入多糖聚合物質(zhì)量4倍的高碘酸鈉，在攪拌下于50°C反應(yīng)證后再加入過量的乙二醇繼續(xù)反應(yīng)30min;反應(yīng)結(jié)束后，用冷乙醇沉淀出產(chǎn)物，用水和乙醇混合物充分洗滌至無碘檢出；最后，經(jīng)室溫真空干燥得到水溶性醛基化多糖海藻酸；2)殼聚糖-α-磷酸三鈣漿料制備在攪拌條件下，將脫乙酰度為90%、分子量為40萬的殼聚糖溶于體積分?jǐn)?shù)為2%的乙酸水溶液中形成質(zhì)量百分比濃度為2%的殼聚糖溶液，然后向其中加入殼聚糖質(zhì)量30%的生物活性亞微米級(jí)α-磷酸三鈣，經(jīng)行星式球磨機(jī)球磨后得到穩(wěn)定的殼聚糖-α-磷酸三鈣漿料；3)希夫堿交聯(lián)過程將步驟1)中得到的水溶性醛基化多糖海藻酸溶于蒸餾水中制成質(zhì)量百分比濃度為5%的水溶性醛基化多糖海藻酸溶液，在1200轉(zhuǎn)/分劇烈攪拌下以30μ1/min的速度將水溶性醛基化多糖海藻酸溶液滴加至步驟2、的殼聚糖-α-磷酸三鈣漿料中，控制水溶性醛基化多糖海藻酸與殼聚糖的質(zhì)量比為3100，滴加結(jié)束后繼續(xù)攪拌lOmin，然后將其注入M孔培養(yǎng)板中，于-0.03MI^環(huán)境中靜置12小時(shí)，以徹底脫泡和使交聯(lián)反應(yīng)充分，得到凝膠狀試樣；4)冷凍-干燥將步驟3)制成的凝膠狀試樣置于冷凍干燥機(jī)中，以_50°C/10h、-40°C/8h,-30°C/8h、-20°C/12h、-10°C/12h和5°C/8h凍干工藝進(jìn)行冷凍-干燥，從M孔培養(yǎng)板中脫模即得到初步多孔支架；5)后處理先用質(zhì)量百分比濃度為2%的氫氧化鈉的乙醇溶液浸泡得到的初步多孔支架以中和其中的乙酸，接著用體積比為46的蒸餾水乙醇混合溶液對(duì)初步多孔支架進(jìn)行清洗，使混合溶液PH為7，再用純蒸餾水洗兩次后進(jìn)行冷凍-干燥得到生物活性殼聚糖/α-磷酸三鈣復(fù)合多孔支架。細(xì)胞培養(yǎng)方法同實(shí)施例1。實(shí)施例4殼聚糖/45S5玻璃復(fù)合多孔支架制備1)水溶性醛基化右旋糖酐的合成首先將水溶性多糖聚合物右旋糖酐溶于水中形成質(zhì)量百分比濃度為10%的多糖聚合物溶液，然后用5mol/L的硫酸調(diào)節(jié)多糖聚合物溶液的pH值為3后在避光條件下分批加入多糖聚合物質(zhì)量2倍的高碘酸鈉，在攪拌下于45°C反應(yīng)池后再加入過量的乙二醇繼續(xù)反應(yīng)30min；反應(yīng)結(jié)束后，用冷乙醇沉淀出產(chǎn)物，用水和乙醇混合物充分洗滌至無碘檢出；最后，經(jīng)室溫真空干燥得到水溶性醛基化右旋糖酐；2)殼聚糖-45S5玻璃漿料制備在攪拌條件下，將脫乙酰度為65%、分子量為50萬的殼聚糖溶于體積分?jǐn)?shù)為2%的乙酸水溶液中形成質(zhì)量百分比濃度為的殼聚糖溶液，然后向其中加入殼聚糖質(zhì)量40%的生物活性微米45S5玻璃粉，經(jīng)行星式球磨機(jī)球磨后得到穩(wěn)定的殼聚糖-45S5玻璃漿料；3)希夫堿交聯(lián)過程將步驟1)中得到的水溶性醛基化右旋糖酐溶于蒸餾水中制成質(zhì)量百分比濃度為102%的水溶性醛基化右旋糖酐溶液，在1700轉(zhuǎn)/分劇烈攪拌下以200μΙ/min的速度將水溶性醛基化右旋糖酐溶液滴加至步驟2、的殼聚糖-45S5玻璃漿料中，控制水溶性醛基化右旋糖酐與殼聚糖的質(zhì)量比為10100，滴加結(jié)束后繼續(xù)攪拌30min，然后將其注入M孔培養(yǎng)板中，于-0.06MI^環(huán)境中靜置12小時(shí)，以徹底脫泡和使交聯(lián)反應(yīng)充分，得到凝膠狀試樣；4)冷凍-干燥將步驟3)制成的凝膠狀試樣置于冷凍干燥機(jī)中，以_50°C/10h、_40°C/8h,-30°C/8h、-20°C/12h、-10°C/12h和5°C/8h凍干工藝進(jìn)行冷凍-干燥，從M孔培養(yǎng)板中脫模即得到初步多孔支架；5)后處理先用質(zhì)量百分比濃度為2%的氫氧化鈉的乙醇溶液浸泡得到的初步多孔支架以中和其中的乙酸，接著用體積比為16的蒸餾水乙醇混合溶液對(duì)初步多孔支架進(jìn)行清洗，使混合溶液PH為7，再用純蒸餾水洗兩次后進(jìn)行冷凍-干燥得到生物活性殼聚糖/45S5玻璃復(fù)合多孔支架。細(xì)胞培養(yǎng)過程同實(shí)施例1。實(shí)施例5殼聚糖/納米羥基磷灰石復(fù)合多孔支架制備1)水溶性醛基化硫酸軟骨素的合成首先將水溶性多糖聚合物硫酸軟骨素溶于水中形成質(zhì)量百分比濃度為25%的多糖聚合物溶液，然后用5mol/L的硫酸調(diào)節(jié)多糖聚合物溶液的pH值為2后在避光條件下分批加入多糖聚合物質(zhì)量1倍的高碘酸鈉，在攪拌下于35°C反應(yīng)他后再加入過量的乙二醇繼續(xù)反應(yīng)30min；反應(yīng)結(jié)束后，用冷乙醇沉淀出產(chǎn)物，用水和乙醇混合物充分洗滌至無碘檢出；最后，經(jīng)室溫真空干燥得到水溶性醛基化硫酸軟骨素；2)殼聚糖-羥基磷灰石漿料制備在攪拌條件下，將脫乙酰度為95%、分子量為10萬的殼聚糖溶于體積分?jǐn)?shù)為2%的乙酸水溶液中形成質(zhì)量百分比濃度為3%的殼聚糖溶液，然后向其中加入殼聚糖質(zhì)量5%的生物活性納米羥基磷灰石，經(jīng)行星式球磨機(jī)球磨后得到穩(wěn)定的殼聚糖-羥基磷灰石漿料；3)希夫堿交聯(lián)過程將步驟1)中得到的水溶性醛基化硫酸軟骨素溶于蒸餾水中制成質(zhì)量百分比濃度為8%的水溶性醛基化硫酸軟骨素溶液，在1000轉(zhuǎn)/分劇烈攪拌下以10μ1/min的速度將水溶性醛基化硫酸軟骨素溶液滴加至步驟2、的殼聚糖-羥基磷灰石漿料中，控制水溶性醛基化硫酸軟骨素與殼聚糖的質(zhì)量比為6100，滴加結(jié)束后繼續(xù)攪拌25min，然后將其注入24孔培養(yǎng)板中，于-0.04MPa環(huán)境中靜置12小時(shí)，以徹底脫泡和使交聯(lián)反應(yīng)充分，得到凝膠狀試樣；4)冷凍-干燥將步驟3)制成的凝膠狀試樣置于冷凍干燥機(jī)中，以-50°C/10h、-40°C/8h、-3(rC/8h、-20°C/12h、-10°C/12h和5°C/8h凍干工藝進(jìn)行冷凍-干燥，從M孔培養(yǎng)板中脫模即得到初步多孔支架；5)后處理先用質(zhì)量百分比濃度為2%的氫氧化鈉的乙醇溶液浸泡得到的初步多孔支架以中和其中的乙酸，接著用體積比為19的蒸餾水乙醇混合溶液對(duì)初步多孔支架進(jìn)行清洗，使混合溶液PH為7，再用純蒸餾水洗兩次后進(jìn)行冷凍-干燥得到生物活性殼聚糖基多孔支本發(fā)明是一種生物活性殼聚糖基多孔支架和制備方法，以及在人成骨樣細(xì)胞MG-63細(xì)胞培養(yǎng)方面的用途為例來描述的，但這種描述并不意味著對(duì)本發(fā)明構(gòu)成限制。參照本發(fā)明多孔支架的描述、其他種類的細(xì)胞以及對(duì)實(shí)施例的等效改變，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員都是可以預(yù)料的。因此，這種簡單改變均不脫離本發(fā)明限定的范圍和精神本質(zhì)。權(quán)利要求1.一種生物活性殼聚糖基多孔支架的制備方法，其特征在于在殼聚糖和無機(jī)生物活性微/納米粒漿料中加入水溶性醛基化多糖聚合物的溶液，經(jīng)冷凍干燥法制得生物活性殼聚糖基多孔支架；其中，無機(jī)生物活性材料和醛基化多糖聚合物分別占?xì)ぞ厶堑馁|(zhì)量百分比540%禾口310%。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物活性殼聚糖基多孔支架的制備方法，其特征在于包括以下步驟1)水溶性醛基化多糖聚合物的合成首先將水溶性多糖聚合物溶于水中形成質(zhì)量百分比濃度為225%的多糖聚合物溶液，然后用5mol/L的硫酸調(diào)節(jié)多糖聚合物溶液的pH值為14后在避光條件下分批加入多糖聚合物質(zhì)量15倍的高碘酸鈉，在攪拌下于3560°C反應(yīng)3他后再加入過量的乙二醇繼續(xù)反應(yīng)30min；反應(yīng)結(jié)束后，用冷乙醇沉淀出產(chǎn)物，用水和乙醇混合物充分洗滌至無碘檢出；最后，經(jīng)室溫真空干燥得到水溶性醛基化多糖聚合物；2)殼聚糖-生物活性無機(jī)微/納米粒漿料制備在攪拌條件下，將殼聚糖溶于體積分?jǐn)?shù)為2%的乙酸水溶液中形成質(zhì)量百分比濃度為13%的殼聚糖溶液，然后向其中加入殼聚糖質(zhì)量540%的生物活性微/納米粒，經(jīng)行星式球磨機(jī)球磨后得到穩(wěn)定的殼聚糖-生物活性無機(jī)微/納米粒漿料；3)希夫堿交聯(lián)過程將步驟1)中得到的水溶性醛基化多糖聚合物溶于蒸餾水中制成質(zhì)量百分比濃度為28%的醛基化多糖聚合物溶液，在劇烈攪拌下以10200μΙ/min的速度將醛基化多糖聚合物溶液滴加至步驟2、的殼聚糖-生物活性無機(jī)微/納米粒漿料中，控制醛基化多糖聚合物與殼聚糖的質(zhì)量比為310010100，滴加結(jié)束后繼續(xù)攪拌1030min，然后將其注入M孔培養(yǎng)板中，于-0.06-0.03MPa環(huán)境中靜置12小時(shí)，以徹底脫泡和使交聯(lián)反應(yīng)充分，得到凝膠狀試樣；4)冷凍-干燥將步驟3)制成的凝膠狀試樣置于冷凍干燥機(jī)中，以_50°C/10h、-40°C/8h,-30°C/8h,-20°C/12h,-10°C/12h和5°C/8h凍干工藝進(jìn)行冷凍-干燥，從M孔培養(yǎng)板中脫模即得到初步多孔支架；5)后處理先用質(zhì)量百分比濃度為2%的氫氧化鈉的乙醇溶液浸泡得到的初步多孔支架以中和其中的乙酸，接著用體積比為1946的蒸餾水乙醇混合溶液對(duì)初步多孔支架進(jìn)行清洗，使混合溶液PH為7，再用純蒸餾水洗兩次后進(jìn)行冷凍-干燥得到生物活性殼聚糖基多孔支架。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的生物活性殼聚糖基多孔支架的制備方法，其特征在于所述的水溶性多糖聚合物為羧甲基纖維素鈉、透明質(zhì)酸、右旋糖酐、海藻酸鈉或硫酸軟骨ο4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的生物活性殼聚糖基多孔支架的制備方法，其特征在于所述的殼聚糖為脫乙酰度為陽95%、分子量為1050萬的殼聚糖。5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的生物活性殼聚糖基多孔支架的制備方法，其特征在于所述的生物活性微/納米粒為納米羥基磷灰石、亞微米級(jí)α-磷酸三鈣、亞微米級(jí)β-磷酸三鈣或微米級(jí)45S5玻璃粉。6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的生物活性殼聚糖基多孔支架的制備方法，其特征在于所述的劇烈攪拌的轉(zhuǎn)速為1000轉(zhuǎn)/分以上。全文摘要本發(fā)明公開了一種生物活性殼聚糖基多孔支架的制備方法，以殼聚糖和具有生物活性的無機(jī)微/納米粒為原料制成漿料，以水溶性醛基化多糖聚合物為交聯(lián)劑，通過希夫堿交聯(lián)過程和冷凍干燥法制成一類生物活性殼聚糖基復(fù)合材料多孔支架，其孔隙率、孔徑大小、力學(xué)性能、降解性能和骨傳導(dǎo)性/骨誘導(dǎo)性等可通過配方和工藝條件來調(diào)控。本發(fā)明的多孔支架未使用有害的化學(xué)交聯(lián)劑，不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成不利影響；交聯(lián)的多孔結(jié)構(gòu)和大量親水基團(tuán)如氨基、羧基和羥基等，使其在寬pH范圍(pH5～9)內(nèi)的水相中具有較高的化學(xué)穩(wěn)定性，具有柔軟、高彈性和達(dá)30倍的溶脹比等突出優(yōu)點(diǎn)；在多孔結(jié)構(gòu)、物質(zhì)化學(xué)成分和表面化學(xué)等方面具有仿自然骨細(xì)胞外微環(huán)境的優(yōu)點(diǎn)。文檔編號(hào)C08L5/00GK102321271SQ20111027314公開日2012年1月18日申請(qǐng)日期2011年9月15日優(yōu)先權(quán)日2011年9月15日發(fā)明者徐明輝,楊騰飛,金欣霞,錢軍民申請(qǐng)人:西安交通大學(xué)