專利名稱：一種骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物組織工程技術(shù)領(lǐng)域，是一種制備神經(jīng)修復(fù)移植用的種子細(xì)胞---骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞的培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
細(xì)胞移植的研究為神經(jīng)系統(tǒng)疾患如腦和脊髓的創(chuàng)傷、腦缺血、帕金森病等退行性疾病的治療以及周圍神經(jīng)的修復(fù)帶來了廣闊的前景，細(xì)胞移植以及組織工程周圍神經(jīng)的關(guān)鍵是種子細(xì)胞，目前研究的種子細(xì)胞包括胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、雪旺細(xì)胞、嗅鞘細(xì)胞、骨髓基質(zhì)干細(xì)胞等等。眾多的細(xì)胞中，神經(jīng)干細(xì)胞是最佳的選擇，神經(jīng)干細(xì)胞的主要來源為胚胎或成體中樞神經(jīng)組織，但胚胎組織的應(yīng)用涉及到倫理學(xué)和免疫排斥等問題；而成體神經(jīng)干細(xì)胞的位置較深，取材困難，不易獲得，且從活體組織中獲得神經(jīng)干細(xì)胞具有一定的危險(xiǎn)性，用于移植的神經(jīng)干細(xì)胞的來源受到了限制。
近年來，也有學(xué)者利用化學(xué)誘導(dǎo)劑、生長(zhǎng)因子、神經(jīng)節(jié)苷脂等將骨髓基質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為類神經(jīng)細(xì)胞。由于誘導(dǎo)分化涉及到部分有毒的化學(xué)試劑，如β-巰基乙醇、二甲基亞砜等，已有學(xué)者對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化提出異議(J Neurosci Res，2004，77(2)174-191，192-204)。誘導(dǎo)分化對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了非生理狀態(tài)的干擾，誘導(dǎo)分化后細(xì)胞的穩(wěn)定性、安全性都是值得考慮的。
Kucia M等(Leukemia，2005，19(7)1118-11127.)的研究認(rèn)為骨髓中含有組織定向干細(xì)胞，并采用密度離心、免疫磁珠和熒光激活細(xì)胞分離技術(shù)(fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS)從小鼠骨髓中篩選出了神經(jīng)組織定向干細(xì)胞(neural tissue-committed stem cells，NTCSCs，詳見Leukemia，2006，20(1)18-28.)。此方法需首先從骨髓中分離單核細(xì)胞，在此基礎(chǔ)上通過免疫磁珠正選法篩選出Sca-1+的細(xì)胞，通過FACS技術(shù)再逐步篩選出Sca-1+/Lin-/CD45-的細(xì)胞，這一方法得到的NTCSCs在體外培養(yǎng)可以形成神經(jīng)球，細(xì)胞純度較高。NTCSCs作為種子細(xì)胞為腦、脊髓等神經(jīng)系統(tǒng)疾患和創(chuàng)傷的修復(fù)和治療提供了廣闊的應(yīng)用前景。但此方法需有專門的免疫磁珠離心儀、FACS儀，價(jià)格昂貴，國(guó)內(nèi)多數(shù)實(shí)驗(yàn)室沒有這種條件；此方法操作程序復(fù)雜，易污染，且骨髓需要量大，這在臨床實(shí)際應(yīng)用中有一定的困難。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種操作簡(jiǎn)便、成本低廉、骨髓需要量少、神經(jīng)組織定向干細(xì)胞得率高的培養(yǎng)方法。
本發(fā)明培養(yǎng)方法包括制備骨髓單核細(xì)胞，骨髓單核細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)、增殖，以及骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞的篩選純化及增殖。其關(guān)鍵在于首先使混合在骨髓單核細(xì)胞中的骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞在含15％～20％血清的DMEM培養(yǎng)液中貼壁生長(zhǎng)、增殖，然后在含2％B27、1％N2、20ng/mlbFGF、20ng/mlEGF的DMEM/F12無血清培養(yǎng)液中篩選純化、增殖培養(yǎng)。骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞在含2％B27、1％N2、20ng/mlbFGF、20ng/mlEGF的DMEM/F12無血清培養(yǎng)液中懸浮生長(zhǎng)，并形成細(xì)胞球。因此，只要選取細(xì)胞球進(jìn)行培養(yǎng)，就能達(dá)到篩選、純化的目的。
具體培養(yǎng)方法如下1、制備骨髓單核細(xì)胞按常規(guī)從新鮮骨髓細(xì)胞中分離得到骨髓單核細(xì)胞。例如取清潔級(jí)SD大鼠雙側(cè)股骨及脛骨，按常規(guī)經(jīng)NycoPrepTM分離液分離單核細(xì)胞層，得骨髓單核細(xì)胞。
2、細(xì)胞的增殖培養(yǎng)采用含15％～20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液將上述骨髓單核細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶中，在飽和濕度、37℃、5％CO2孵育培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7～10天，待貼壁細(xì)胞長(zhǎng)滿至瓶底的80％～90％時(shí)，用0.25％的胰酶消化，再用上述含血清的DMEM培養(yǎng)液終止其消化。
3、骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞的篩選、純化上述培養(yǎng)瓶中細(xì)胞經(jīng)15％～20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化后，換用含2％B27、1％N2、20ng/mlbFGF、20ng/mlEGF的DMEM/F12無血清培養(yǎng)液，機(jī)械吹打，制成細(xì)胞懸液，在飽和濕度、37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5～6天后，見由4～16個(gè)數(shù)量不等的細(xì)胞形成的細(xì)胞球出現(xiàn)，經(jīng)鑒定為骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞細(xì)胞球。待細(xì)胞球生長(zhǎng)到數(shù)十個(gè)細(xì)胞時(shí)，在鏡下挑選其中一個(gè)較大的細(xì)胞球，用移液槍頭吸出機(jī)械吹打，用上述DMEM/F12無血清培養(yǎng)液進(jìn)行單克隆培養(yǎng)，待細(xì)胞再次形成較大的細(xì)胞球時(shí)，機(jī)械吹打，反復(fù)多次進(jìn)行細(xì)胞擴(kuò)增，并轉(zhuǎn)入較大的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，就可得到單克隆生長(zhǎng)的足量的骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞。
具體實(shí)施例方式
現(xiàn)結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)描述。
實(shí)施例1制備大鼠骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞1、制備骨髓單核細(xì)胞清潔級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量200g，斷頭處死，取雙側(cè)股骨及脛骨，剔除表面肌肉，剪去雙側(cè)骨骺，DMEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，200目濾網(wǎng)過濾，在離心管中預(yù)置3mlNycoPrepTM分離液，將6ml的骨髓細(xì)胞濾液輕輕置于NycoPrepTM(AXIS·SHIE/D公司)分離液上，勿混合，以2600r/min離心20min，輕輕吸取分離液上方的單細(xì)胞層，加DMEM培養(yǎng)液5ml，以1700r/min離心10min，反復(fù)沖洗3次，得到的細(xì)胞沉淀即為骨髓單核細(xì)胞。
2、細(xì)胞的增殖培養(yǎng)將上述骨髓單核細(xì)胞用含15％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液3.5ml制成細(xì)胞懸液，以5.6×107/ml的細(xì)胞密度接種于25ml的塑料培養(yǎng)瓶中，在飽和濕度、37℃、5％CO2孵育培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10天后，貼壁細(xì)胞長(zhǎng)滿程度達(dá)90％，采用0.25％的胰酶消化1分鐘，用含15％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化。
3、骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞的篩選、純化上述培養(yǎng)瓶中細(xì)胞經(jīng)15％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化后，換用含2％B27(GIBCO公司)、1％N2(GIBCO公司)、20ng/mlbFGF(CytoLab公司)、20ng/mlEGF(GIBCO公司)的DMEM/F12無血清培養(yǎng)液5ml，機(jī)械吹打貼壁細(xì)胞，使細(xì)胞重懸，細(xì)胞密度為8.6×106個(gè)/ml，在飽和濕度、37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6天后出現(xiàn)細(xì)胞球，經(jīng)鑒定為骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞。待細(xì)胞球生長(zhǎng)到數(shù)十個(gè)細(xì)胞時(shí)，在鏡下挑選其中一個(gè)較大的細(xì)胞球，用10μl的移液槍頭吸出放入培養(yǎng)皿中，機(jī)械吹打，用上述的DMEM/F12無血清培養(yǎng)液進(jìn)行單克隆培養(yǎng)，待再次形成的各細(xì)胞球較大時(shí)，機(jī)械吹打，反復(fù)3次擴(kuò)增細(xì)胞，3周后轉(zhuǎn)入25ml的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，得到單克隆生長(zhǎng)的骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞。
骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞的鑒定方法按常規(guī)經(jīng)免疫組織化學(xué)法(詳見朱長(zhǎng)庚主編，《神經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)》)檢測(cè)，細(xì)胞球呈CXCR4(Santa Cruz公司)陽(yáng)性、Nestin(Santa Cruz公司)陽(yáng)性、CD45(Santa Cruz公司)陰性，將細(xì)胞球置入6孔培養(yǎng)板中，加入0.8ml含2％B27(GIBCO公司)、1％N2(GIBCO公司)、20ng/mlBDNF(GIBCO公司)的DMEM/F12無血清培養(yǎng)液，細(xì)胞球貼壁、分化，細(xì)胞呈多突起樣、7天后檢測(cè)分化的細(xì)胞，神經(jīng)元標(biāo)志性蛋白NSE、NF-200(SantaCruz公司)陽(yáng)性，確認(rèn)此細(xì)胞球即為骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞神經(jīng)細(xì)胞球。
本發(fā)明培養(yǎng)方法操作簡(jiǎn)便，成本低廉，只需取少量骨髓就可以培養(yǎng)得到足夠量的骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞，細(xì)胞可來源于自體，避免了免疫排斥和倫理學(xué)等問題。且培養(yǎng)過程中無有毒試劑，不僅有利于環(huán)保，也有利于干細(xì)胞的穩(wěn)定及移植的安全。本發(fā)明為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾患的細(xì)胞移植治療及周圍神經(jīng)的修復(fù)提供了一種移植用種子細(xì)胞的來源途徑。
權(quán)利要求
1.一種骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，包括制備骨髓單核細(xì)胞，骨髓單核細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)、增殖，以及骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞的篩選純化及增殖；其特征在于骨髓單核細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)、增殖采用的是含15％～20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞的篩選純化、增殖采用的是含2％B27、1％N2、20ng/mlbFGF、20ng/mlEGF的DMEM/F12無血清培養(yǎng)液；骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞在含2％B27、1％N2、20ng/mlbFGF、20ng/mlEGF的DMEM/F12無血清培養(yǎng)液中懸浮生長(zhǎng)，并形成細(xì)胞球，選取細(xì)胞球進(jìn)行增殖培養(yǎng)，即得所需的骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞。
2.按權(quán)利要求1所述的骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于具體步驟如下(1)制備骨髓單核細(xì)胞按常規(guī)從新鮮骨髓細(xì)胞中分離得到骨髓單核細(xì)胞；(2)細(xì)胞的增殖培養(yǎng)將上述骨髓單核細(xì)胞，用含15％～20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液制備成細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶中，在5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待貼壁細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底時(shí)，用0.25％的胰酶消化，再用上述含血清的DMEM培養(yǎng)液終止其消化；(3)骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞的篩選、純化上述培養(yǎng)瓶中細(xì)胞經(jīng)15％～20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化后，換用含2％B27、1％N2、20ng/mlbFGF、20ng/mlEGF的DMEM/F12無血清培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，在5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至細(xì)胞球出現(xiàn)，取一個(gè)較大的細(xì)胞球，用上述DMEM/F12無血清培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液繼續(xù)培養(yǎng)，待形成眾多的細(xì)胞球時(shí)，按上述方法將細(xì)胞球再次制備成細(xì)胞懸液，如此反復(fù)，骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞得以增殖，即可得到足夠量的骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞。
3.權(quán)利要求1或2所述培養(yǎng)方法得到的骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞。
4.權(quán)利要求3所述骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞在制備神經(jīng)修復(fù)制劑或組織工程神經(jīng)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物組織工程技術(shù)領(lǐng)域，是一種制備神經(jīng)修復(fù)移植用種子細(xì)胞——骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞的培養(yǎng)方法。本發(fā)明只需少量骨髓，分離到骨髓單核細(xì)胞后經(jīng)增殖培養(yǎng)，再用含2％B27、1％N2、20ng/ml bFGF、20ng/ml EGF的DMEM/F12無血清培養(yǎng)液進(jìn)行篩選、純化、培養(yǎng)就可制得足夠量的骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞。本發(fā)明操作簡(jiǎn)便、成本低廉，得到的骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞穩(wěn)定、安全，且可來源于自體，避免了免疫排斥和倫理學(xué)等問題。本發(fā)明為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾患的細(xì)胞移植治療及周圍神經(jīng)的修復(fù)提供了一種移植用種子細(xì)胞的來源途徑。
文檔編號(hào)C12N5/08GK1974764SQ20061011943
公開日2007年6月6日 申請(qǐng)日期2006年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月12日
發(fā)明者張志英, 張傳森, 任叢莉 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)