本發(fā)明涉及炎癥反應(yīng)的檢測方法。

背景技術(shù)：

炎癥反應(yīng)是與多種疾病癥狀均密切相關(guān)的生物體反應(yīng)之一，在理解這些疾病的病情、考慮其治療策略方面成為重要的研究對象。故而，可以檢測炎癥的實際狀態(tài)的技術(shù)的開發(fā)是不可或缺的。

已經(jīng)闡明，通常的炎癥反應(yīng)是通過如下機制而引起的。即，當細菌、病毒等感染源侵入體內(nèi)時，感染源被細胞表面的受體感知，引起細胞因子的分泌。以該細胞因子為指標，巨噬細胞等免疫細胞游走到感染部位并擊退感染源。由于在該擊退時免疫細胞的活躍行為，炎癥時引起特有的發(fā)紅、發(fā)熱、疼痛、腫脹。

作為與該炎癥反應(yīng)密切相關(guān)、也作為炎癥標志物而受到關(guān)注的細胞因子，已知有白介素-1β(il-1β)。已知的是，il-1β在無炎癥刺激時幾乎不分泌，通過炎癥刺激而在各組織中以非常高的水平產(chǎn)生并分泌(圖1)。

還獲知，il-1β通過以下的特征性的兩階段控制而受到精密調(diào)節(jié)。在由炎癥反應(yīng)引起的轉(zhuǎn)錄因子nf-κb作用下，il-1β的基因表達被活化，隨著il-1β基因表達的活化，作為前體型的proil-1β的產(chǎn)生得到促進。然后，proil-1β在通過炎性體而被活化的胱天蛋白酶作用下被切斷，轉(zhuǎn)變?yōu)榭煞置诘某墒煨蚷l-1β(圖2)。

關(guān)于以熒光素酶、紅色熒光蛋白為報道分子的il-1β基因表達的監(jiān)測，已經(jīng)有報道(非專利文獻1、2)。這些報道顯示：制作導(dǎo)入有報道分子的轉(zhuǎn)基因小鼠，在該炎癥模型中，可以檢測報道信號，還能夠用于生物成像解析。但我們認為，該方法僅借助于作為炎癥反應(yīng)級聯(lián)中的1個因子的轉(zhuǎn)錄控制，作為生理性的炎癥反應(yīng)的監(jiān)測是不充分的。

此外，還報道了通過炎性體進行控制的報道系統(tǒng)(非專利文獻3)。在該報道中按照下述方式進行了設(shè)計：非炎癥時為聚集結(jié)構(gòu)而呈無活性狀態(tài)的報道分子，通過炎癥刺激，通過炎性體發(fā)揮作用而單體化并顯示活性。但是，其也僅借助于炎性體，靈敏度不充分，此外，對于該系統(tǒng)在活體小鼠中是否發(fā)揮作用這一點沒有進行驗證。

另一方面，還嘗試了通過各種體內(nèi)刺激或外部刺激、例如氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激進行蛋白質(zhì)表達，并將該現(xiàn)象可視化(專利文獻1、2，非專利文獻4、5)。

現(xiàn)有技術(shù)文獻

專利文獻

專利文獻1:國際公開2012/099279號小冊子

專利文獻2:日本專利第4446057號公報

非專利文獻

非專利文獻1:lil.etal“functionalimagingofinterleukin1betaexpressionininflammatoryprocessusingbioluminescenceimagingintransgenicmice”bmcimmunol.，vol.9.，49(2008)

非專利文獻2:matsushimah.etal“intravitalimagingofil-1betaproductioninskin”j.invest.dermatol.，vol.130，1571-1580(2010)

非專利文獻3:bartoke.etal“igluc：aluciferase-basedinflammasomeandproteaseactivityreporter”nat.methods.，vol.10.，147-154(2013)

非專利文獻4:scientificreports2012；2：229.epub2012jan19.

非專利文獻5:naturemedicine10，98102(1january2004)

技術(shù)實現(xiàn)要素：

發(fā)明要解決的問題

本發(fā)明的目的在于，提供一種可以高效率·高靈敏度對特別是生物體內(nèi)的微小區(qū)域內(nèi)的局部性的炎癥反應(yīng)進行檢測·測定的技術(shù)。此外目的在于，為了使本檢測方法可以容易地利用而提供一種基因載體，進而為了可以在體內(nèi)的研究開發(fā)中使用而提供一種導(dǎo)入有本報道系統(tǒng)的基因載體的轉(zhuǎn)基因小鼠。

用于解決問題的方案

本發(fā)明人為了解決上述課題反復(fù)進行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，利用通過il-1β基因和炎性體以兩階段進行控制的炎癥反應(yīng)機制，從而可以構(gòu)建可以高效率·高靈敏度地進行生理性的炎癥反應(yīng)的監(jiān)視的報道系統(tǒng)，并通過構(gòu)建該方法以及搭載有該方法的基因載體和轉(zhuǎn)基因小鼠而完成了本發(fā)明。

即，本發(fā)明如下所述。

(1)一種載體，其含有：編碼炎癥性細胞因子的基因的啟動子、編碼報道蛋白的基因、編碼前述炎癥性細胞因子的基因、及編碼蛋白質(zhì)分解信號序列的基因。

(2)根據(jù)(1)中所述的載體，其中，炎癥性細胞因子為白介素1β。

(3)根據(jù)(1)或(2)中所述的載體，其中，報道蛋白為熒光素酶。

(4)根據(jù)(1)～(3)中任一項所述的載體，其中，編碼炎癥性細胞因子的基因含有編碼被胱天蛋白酶識別的肽的多核苷酸序列。

(5)一種轉(zhuǎn)化體，其含有前述(1)～(4)中任一項所述的載體。

(6)一種轉(zhuǎn)基因非人動物，其導(dǎo)入有前述(1)～(4)中任一項所述的載體。

(7)根據(jù)(6)所述的轉(zhuǎn)基因非人動物，其中，非人動物為小鼠。

(8)根據(jù)(5)所述的轉(zhuǎn)化體、或者根據(jù)(6)或(7)所述的轉(zhuǎn)基因非人動物，其中，通過炎癥性刺激，報道蛋白以發(fā)光信號形式被檢測。

(9)一種炎癥反應(yīng)的檢測方法，其特征在于，使用前述(5)所述的轉(zhuǎn)化體或(6)～(8)中任一項所述的轉(zhuǎn)基因非人動物，來檢測通過炎癥性刺激而在該轉(zhuǎn)化體或轉(zhuǎn)基因非人動物中引起的炎癥反應(yīng)。

(10)根據(jù)(9)所述的方法，其中，編碼炎癥性細胞因子的基因在由炎癥反應(yīng)引起的轉(zhuǎn)錄因子nf-κb作用下進行表達。

(11)根據(jù)(9)或(10)所述的方法，其中，通過炎癥性刺激，以發(fā)光信號形式來檢測報道蛋白。

(12)一種抗炎癥物質(zhì)的篩選方法，其特征在于，使前述(5)所述的轉(zhuǎn)化體或(6)～(8)中任一項所述的轉(zhuǎn)基因非人動物在炎癥性刺激下接觸候選物質(zhì)，以有無炎癥反應(yīng)為指標來選擇抗炎癥物質(zhì)。

(13)一種炎癥反應(yīng)檢測用或抗炎癥物質(zhì)的篩選用試劑盒，其含有前述(5)所述的轉(zhuǎn)化體或(6)～(8)中任一項所述的轉(zhuǎn)基因非人動物。

發(fā)明的效果

根據(jù)本發(fā)明，可以提供可以高效率·高靈敏度地進行炎癥反應(yīng)的監(jiān)視的報道系統(tǒng)。本發(fā)明的系統(tǒng)可以對炎癥反應(yīng)進行可視化，靈敏度及效率極高。

附圖說明

圖1為示出利用脂多糖(lps)進行炎癥刺激后的il-1β值的變化的圖。使用的lps：sigma#l2654，使用濃度：3～4μg/g體重

圖2為示出il-1β的產(chǎn)生及分泌控制機制的圖。

圖3為示出利用il-1β的炎癥報道系統(tǒng)的構(gòu)建的圖。

圖4為示出一過性地導(dǎo)入報道基因的raw264中的報道活性的圖。使用的lps：sigma#l2654，使用濃度：2μg/ml

圖5為示出由lps刺激后的炎癥報道小鼠發(fā)出的信號的圖。使用的lps：sigma#l2654，使用濃度：3～4μg/g體重

圖6為示出一過性地導(dǎo)入報道基因的raw264中的報道活性的圖。使用的lps：sigma#l2654，使用濃度：2μg/ml，處理時間：48h

圖7為本發(fā)明的載體的構(gòu)建圖。

圖8為示出對小鼠的系統(tǒng)間的lps刺激前后的報道信號進行比較的結(jié)果的圖。

具體實施方式

以下對本發(fā)明進行詳細說明。

1.載體等及檢測方法

本發(fā)明中使用的載體含有將多個基因連接而成的融合基因，在編碼炎癥性細胞因子的基因的啟動子控制下表達報道分子、胱天蛋白酶識別序列及蛋白質(zhì)分解信號序列的融合蛋白。

本發(fā)明中，“炎癥性細胞因子”是指由通過細菌等抗原等被活化的輔助t細胞、單核細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞、樹突狀細胞等產(chǎn)生的細胞因子，是活化巨噬細胞和其它免疫細胞、血管內(nèi)皮細胞、破骨細胞的細胞因子。作為這樣的炎癥性細胞因子,可以列舉例如：il-1β、il-6、il-8、il-12、il-13、il-17、il-18、腫瘤壞死因子(tnf)等。編碼炎癥性細胞因子的基因在由炎癥反應(yīng)引起的轉(zhuǎn)錄因子nf-κb作用下進行表達。

本發(fā)明中，可以使用編碼這些炎癥性細胞因子的基因或其部分序列。編碼上述炎癥性細胞因子的基因及這些基因的啟動子的信息是公知的。部分序列只要具有炎癥應(yīng)答性則對長度沒有特別限定，可以以炎癥應(yīng)答性表達增強、炎癥應(yīng)答性加工等為指標來決定長度及區(qū)域。

il-1β：登錄號nm＿008361.3

il-6：登錄號nm＿031168.1

il-8：登錄號nm＿009140.2

il-12：登錄號nm＿001159424.1

il-13：登錄號nm＿008355.3

il-17：登錄號nm＿010552.3

il-18：登錄號nm＿008360.1

tnf：登錄號nm＿001278601.1

il-1β啟動子：登錄號nc＿000068.7

il-6啟動子：登錄號nc＿000071.6

il-8啟動子：登錄號nc＿000071.6

il-12啟動子：登錄號nc＿000069.6

il-13啟動子：登錄號nc＿000077.6

il-17啟動子：登錄號nc＿000067.6

il-18啟動子：登錄號nc＿000075.6

tnf啟動子：登錄號nc＿000083.6

本說明書中，為了便于說明，以il-1β為例進行說明。

制作在il-1β基因的啟動子下游連接有報道基因、在其下游添加有例如il-1β部分序列和蛋白質(zhì)分解信號序列的基因構(gòu)建體。il-1β部分序列中編碼的肽連接子含有被胱天蛋白酶識別的序列(胱天蛋白酶識別序列)。并且，該il-1β部分序列所編碼的肽連接子為通過稱為炎性體的蛋白復(fù)合物而被活化的胱天蛋白酶(胱天蛋白酶-1)作用的區(qū)域，該肽連接子通過胱天蛋白酶而被切斷。

將具有這樣的基因構(gòu)建體的細胞中顯示炎癥報道系統(tǒng)的概要示于圖3。圖3是示出il-1β作為炎癥性細胞因子、示出熒光素酶(luc)作為報道分子的例子。當然，炎癥性細胞因子及報道分子并不限于圖3所示的il-1β及l(fā)uc。

圖3中，無炎癥刺激時，il-1β基因啟動子不工作，因此報道基因的表達未被活化。即使發(fā)生了表達遺漏(leak)，也仍然由于沒有炎癥刺激而炎性體不發(fā)揮作用，所表達的由報道分子-胱天蛋白酶識別序列-蛋白質(zhì)分解信號序列構(gòu)成的融合蛋白在其蛋白質(zhì)分解信號序列的作用下被泛素-蛋白酶體系統(tǒng)積極地分解。

另一方面，在有炎癥刺激時，在作為轉(zhuǎn)錄因子的nf-κb作用下，啟動子工作，從而報道基因的表達被活化，通過由炎性體引起的胱天蛋白酶的活化，產(chǎn)生的報道分子被從蛋白質(zhì)分解信號序列切下，報道分子本身單獨時是穩(wěn)定的，可以以報道蛋白的發(fā)光信號(報道信號)形式高水平地檢測。該檢測結(jié)果可以通過可視化并顯示在監(jiān)視器中的圖像來確認。

本發(fā)明的一方式中，在來自小鼠的巨噬細胞樣細胞raw264株中一過性地導(dǎo)入了結(jié)構(gòu)如下的基因載體：在il-1β基因的啟動子控制下，表達報道分子、胱天蛋白酶識別序列(構(gòu)成il-1β的氨基酸序列的一部分)和蛋白質(zhì)分解信號序列的融合蛋白。在該細胞株的培養(yǎng)液中添加作為大腸桿菌細胞膜構(gòu)成成分的lps(lipopolysaccharide，脂多糖)時，可以確認報道活性的顯著上升(圖4)。

此外，通過將該基因載體注射到c57bl/6系統(tǒng)的原核期(前核期)受精卵中，制作了轉(zhuǎn)基因小鼠。通過在該轉(zhuǎn)基因小鼠的腹腔內(nèi)施予lps而給予炎癥刺激，通過生物體成像裝置檢測剛施予后、4小時后、24小時后的熒光素酶的發(fā)光信號的變化?？梢栽谌淼慕M織中觀察到炎癥反應(yīng)依賴性的發(fā)光(實施例、圖5)。

作為報道蛋白(報道分子)，可以利用例如：熒光素酶、gfp(綠色熒光蛋白)、dsred(紅色熒光蛋白)、lacz(β-半乳糖苷酶)等，此外，基因載體也可以采取質(zhì)粒dna、病毒載體等形態(tài)，本發(fā)明不受其限定。

編碼這些報道蛋白的基因是公知的，可以由國內(nèi)外的生物試劑廠商等獲得。

“蛋白質(zhì)分解信號序列”是指在e3連接酶作用下被積極地多泛素化、結(jié)果容易被蛋白酶體消化的序列，作為本發(fā)明中使用的蛋白質(zhì)分解信號序列，可以列舉：cl1序列、pest序列等。這些編碼蛋白質(zhì)分解信號序列的基因是公知的，可以由國內(nèi)外的生物試劑廠商等獲得。

本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體可以通過將基因載體導(dǎo)入到宿主中而獲得。

對導(dǎo)入基因載體的宿主也沒有特別限定，可以是原核生物(大腸桿菌、乳酸菌等)、真核細胞(酵母)等單細胞生物，此外，也可以使用來自人的細胞(hela，hek293等)以及來自小鼠的細胞(nih3t3等)的株化培養(yǎng)細胞、或其它動物細胞。在緊挨著啟動子后邊連接上述基因的方法是公知的(molecularcloning：alaboratorymanual(4thedition)、coldspringharborlaboratorypress(2012))?；蜉d體向宿主的導(dǎo)入可以通過電穿孔法(electroporation)、使用市售的脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑的脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法、利用病毒載體的方法等眾所周知的方法來實施(參照上述molecularcloning等)。

導(dǎo)入有本報道基因載體的轉(zhuǎn)基因非人動物可以用小鼠、大鼠、狗、猴、山羊等制作，但不限于這些非人動物。轉(zhuǎn)基因非人動物可以通過用微量注射器在各動物的受精卵中注入基因載體dna而制作，或者還可以通過同源重組法建立胚胎干細胞(es細胞)、人工多能性干細胞(ips細胞)后制作轉(zhuǎn)基因動物。顯微注射法等均為本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地實施的公知方法(參照上述molecularcloning等)。

本發(fā)明中使用的轉(zhuǎn)基因非人動物不限于個體，也可以使用來自該轉(zhuǎn)基因非人動物的生物材料例如細胞、器官、組織、胚等。

2.篩選方法

本發(fā)明中，對成為抗炎癥物質(zhì)的候選的被檢物質(zhì)(候選物質(zhì))沒有特別限定，可以列舉例如：肽、蛋白質(zhì)、dna、非肽性化合物、合成化合物、發(fā)酵產(chǎn)物、細胞提取液、植物提取液等，這些化合物可以是新穎化合物也可以是公知化合物。這些被檢物質(zhì)可以形成鹽，作為被檢物質(zhì)的鹽，使用生理學上允許的與酸(例如無機酸等)、堿(例如有機酸等)等的鹽，優(yōu)選生理學上允許的酸加成鹽。就被檢物質(zhì)而言，可以對單一物質(zhì)獨立地進行試驗，也可以對混合物(包括文庫等)進行試驗。作為含有多種被檢物質(zhì)的文庫，可以列舉：合成化合物文庫(組合文庫等)、肽文庫(組合文庫等)等。

本發(fā)明中包括：對轉(zhuǎn)基因非人動物施予炎癥性物質(zhì)(給予炎癥性刺激)而引起炎癥反應(yīng)，使該動物接觸被檢物質(zhì)，調(diào)查炎癥反應(yīng)的抑制效果的方式；以及，使轉(zhuǎn)基因非人動物接觸被檢物質(zhì)后，施予炎癥性物質(zhì)而引起炎癥反應(yīng)，調(diào)查該動物中的炎癥反應(yīng)的抑制效果的方式。任意方式中，均可以選擇獲得炎癥反應(yīng)的抑制效果的被檢物質(zhì)作為炎癥性疾病(例如感染癥、風濕、過敏)的治療藥或預(yù)防藥即抗炎癥劑。

作為成為被檢物質(zhì)施予對象的轉(zhuǎn)基因非人動物(被檢動物)及對照動物，沒有特別限定，通常使用同種的非人動物。此外，被驗動物及對照動物更優(yōu)選使用同性別及同齡的動物。

本發(fā)明中，在使用轉(zhuǎn)化體的情況下包括：使轉(zhuǎn)化體接觸被檢物質(zhì)后，使該轉(zhuǎn)化體接觸炎癥性物質(zhì)，調(diào)查炎癥反應(yīng)的抑制效果的方式；以及，使轉(zhuǎn)化體接觸炎癥性物質(zhì)而引起炎癥反應(yīng)，使該轉(zhuǎn)化體接觸被檢物質(zhì)，調(diào)查炎癥反應(yīng)的抑制效果的方式。

就是否抑制炎癥反應(yīng)而言，將以通過炎癥性刺激報道蛋白是否以發(fā)光信號形式被檢測為指標而獲得的檢測結(jié)果作為指標，來選擇抗炎癥物質(zhì)。

“接觸”包括：將被檢物質(zhì)施予非人動物的方式、對轉(zhuǎn)化體或生物體材料添加被檢物質(zhì)的方式、在被檢物質(zhì)存在下進行培養(yǎng)的方式等。為了使轉(zhuǎn)基因非人動物本身接觸被檢物質(zhì)，可以通過注射等對這些動物接種被檢物質(zhì)。對轉(zhuǎn)化體或生物體材料添加被檢物質(zhì)的方式可以列舉：在細胞的培養(yǎng)物中添加被檢物質(zhì)，在組織、器官等中添加被檢物質(zhì)等?！芭囵B(yǎng)物”是指細胞、培養(yǎng)液、細胞提取物中的任一種。“在被檢物質(zhì)存在下進行培養(yǎng)”是指在細胞與被檢物質(zhì)接觸的條件下進行培養(yǎng)，被檢物質(zhì)與上述細胞等的接觸可以如下實施：例如，在細胞培養(yǎng)基或各種緩沖液(例如hepes緩沖液、磷酸緩沖液、磷酸緩沖生理鹽水、tris鹽酸緩沖液等)中添加被檢物質(zhì)，將細胞孵育一定時間。

培養(yǎng)物中添加的被檢物質(zhì)的濃度根據(jù)化合物的種類(溶解度、毒性等)不同，可以在例如100ng/ml～10μg/ml的范圍內(nèi)適當選擇。作為孵育時間，可以列舉例如4～48小時。

3.試劑盒

本發(fā)明提供一種炎癥反應(yīng)檢測用或抗炎癥物質(zhì)的篩選用試劑盒，其含有導(dǎo)入有載體的轉(zhuǎn)化體或轉(zhuǎn)基因非人動物，所述載體含有編碼炎癥性細胞因子的基因的啟動子、編碼報道蛋白的基因、編碼前述炎癥性細胞因子的基因、及編碼蛋白質(zhì)分解信號序列的基因。

在將本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體或轉(zhuǎn)基因非人動物作為炎癥性疾病、炎癥反應(yīng)的檢測藥使用時，除了上述轉(zhuǎn)化體或轉(zhuǎn)基因非人動物之外還可含有其它試劑例如蒸餾水、緩沖試劑、炎癥引起物質(zhì)、使用說明書等。

實施例

以下通過實施例具體且詳細地說明本發(fā)明，但這些對本發(fā)明的范圍沒有限定。

基因載體的構(gòu)建

以從來自小鼠的細胞提取的基因組dna為材料，來克隆來自小鼠的il-1β基因的上游約5kbp的區(qū)域。構(gòu)建在克隆區(qū)域的正下方融合來自hsv的tk基因啟動子、在該融合啟動子的下游連接來自熒燭(photinuspyralis)的改變型熒光素酶(gl4，約1.7kbp)、進而在其下游連接來自小鼠的編碼il-1β的部分序列(17-216aa)的堿基序列、進而在其下游連接cl1(來自釀酒酵母(saccharomycescerevisiae))-pest(來自小鼠的)序列、來自sv40的polya序列的載體(圖7)(序列號1)。

il-1β基因的克隆如下進行。

關(guān)于來自小鼠的il-1b基因的上游約5kbp的區(qū)域

將整個區(qū)域分成4部分并分別用pcr法進行克隆。所有部分中，使用的pcr試劑盒均為primestar(takara)，模板dna均為來自小鼠es細胞的基因組dna，反應(yīng)條件均為：98℃10秒、55℃5秒、72℃2分鐘，循環(huán)35次。使用的引物根據(jù)部位的不同而不同，如下所述。

第1部分

5側(cè)引物；aaaactagttcgtcttttgagaaagtcagggcag(序列號2)

3側(cè)引物；gaataggcatcgataaacaagattc(序列號3)

第2部分

5側(cè)引物；gaatcttgtttatcgatgcctattc(序列號4)

3側(cè)引物；aaactcgaggcacatgcatgaagacgaatggcc(序列號5)

第3部分

5側(cè)引物；aaactcgagatgcatgtgccttcctccaaatc(序列號6)

3側(cè)引物；gtaggagctagcccgggtgagtag(序列號7)

第4部分

5側(cè)引物；aaaactagttcgtcttttgagaaagtcagggcaggaac(序列號8)

3側(cè)引物；aaaactagtcacaaggaagcttggctggagaggatc(序列號9)

需要說明的是，各部分的連接使用clai位點、ecot22i位點、smai位點進行。

關(guān)于來自小鼠的il-1β基因的部分(17-216aa)區(qū)域

用pcr法對全部區(qū)域的十分之一進行克隆。所使用的pcr試劑盒為primestar(takara)，模板dna為來自小鼠胎盤的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，反應(yīng)條件為：98℃10秒、55℃5秒、72℃1分鐘，循環(huán)35次。

使用引物為5側(cè)引物；aaaggtaccgatgagaatgacctgttctttg(序列號10)、3側(cè)引物；aaactcgagaaaccgtttttccatcttcttc(序列號11)。

對培養(yǎng)細胞的一過性導(dǎo)入

將如上構(gòu)建的基因載體一過性地導(dǎo)入到來自小鼠的巨噬細胞樣細胞raw264株中。

轉(zhuǎn)染中使用effectene(qiagen)，回收轉(zhuǎn)染后24小時的細胞供于實驗。在一過性的表達細胞的培養(yǎng)液中按照2μg/ml的濃度添加lps(sigma#l2654)，用發(fā)光計對添加后48小時的熒光素酶發(fā)光量進行定量測定。作為對照，設(shè)置lps無添加組。此外，作為現(xiàn)有型的僅檢測il-1β基因表達的報道系統(tǒng)，制作在il-1β基因的啟動子下游連接有g(shù)l4的載體，用以該載體進行了轉(zhuǎn)染處理的細胞同樣進行試驗。

其結(jié)果是，獲得圖6所示的報道信號。導(dǎo)入有本發(fā)明的載體的、導(dǎo)入現(xiàn)有型的載體中的任一種的細胞中，均確認到通過lps刺激而報道信號的顯著上升。但是，就其靈敏度而言，本發(fā)明品比現(xiàn)有型提高了2倍以上。

轉(zhuǎn)基因小鼠的制作

將切割、純化后的基因載體注射到200個從c57bl/6系統(tǒng)的小鼠采集的原核期受精卵中，得到71只胎仔。使用由胎仔的體組織提取的基因組dna，對基因型進行解析，得到18只基因組中插入有基因載體的建立者小鼠(foundermouse)。使4只建立者小鼠分別與野生型c57bl/6系統(tǒng)小鼠交配，制作f1代小鼠，研究腹腔內(nèi)施予lps(sigma#l2654)時的報道分子的反應(yīng)。

其結(jié)果，在系統(tǒng)編號no.m1的個體中，s/n比最優(yōu)異，以炎癥報道小鼠形式建立了該系統(tǒng)。(圖8)。

使用轉(zhuǎn)基因小鼠的炎癥反應(yīng)的可視化

在所建立的炎癥報道小鼠的腹腔內(nèi)，以3mg/kg體重的濃度施予lps(sigma#l2654)。在施予后0h、4h、24小時，用生物體成像裝置(ivis)觀察熒光素酶發(fā)光。其結(jié)果是，可以從全身的組織捕捉到熒光素酶的發(fā)光信號(圖5)。

序列表自由文本

序列號1～11：合成dna

序列表

<110>轉(zhuǎn)基因股份有限公司(transgenicinc.)

國立大學法人熊本大學(nationaluniversitycorporationkumamotouniversity)

國立大學法人群馬大學(nationaluniversitycorporationgunmauniversity)

<120>炎癥報道系統(tǒng)

<130>g1166wo

<160>11

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>8406

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