抵抗乳糖殺傷的突變體微生物的制作方法
本發(fā)明涉及產(chǎn)生抵抗乳糖殺傷現(xiàn)象的突變微生物的方法以及涉及能夠通過所述方法獲得的微生物。這樣的工程化微生物可用于生產(chǎn)特殊產(chǎn)品(specialtyproduct)，例如但不限于特殊糖類、糖脂和半乳糖基化化合物。
背景技術(shù)：
乳糖殺傷(lactosekilling)是公知且深入研究的原理，其在乳糖與另一種碳源的存在下阻礙許多生物體的生長。然而，該現(xiàn)象背后的確切機制是未知的，盡管誘導(dǎo)該現(xiàn)象所需的特征相當(dāng)清楚。當(dāng)將乳糖添加到在另一種碳源(例如但不限于甘油或蔗糖)上生長的微生物培養(yǎng)物中時，發(fā)生乳糖殺傷。當(dāng)乳糖轉(zhuǎn)運基因為可誘導(dǎo)的或組成型表達(dá)(33，39，75)時，也發(fā)生乳糖殺傷。最初對于在恒化器條件下用iptg和乳糖調(diào)節(jié)乳糖通透酶之表達(dá)的大腸桿菌(e.coli)觀察到乳糖殺傷(28)。后來對于苜蓿根瘤菌(rhizobiummeliloti)、乳酸克魯維酵母(kluyveromyceslactis)和運動發(fā)酵單胞菌(zymomonasmobilis)也觀察到乳糖殺傷(55，70，77)。這種現(xiàn)象的潛在原因之一歸因于細(xì)胞的乳糖轉(zhuǎn)運蛋白活性的所謂“成本”，這種“成本”導(dǎo)致生長減少或抑制，并且還與細(xì)胞外乳糖濃度有關(guān)(34)，其在工業(yè)過程中大多保持高水平以獲得足夠高的產(chǎn)物滴度和收率。然而，現(xiàn)有技術(shù)表明，只要在這些條件下存在乳糖轉(zhuǎn)運，就應(yīng)該會發(fā)生乳糖殺傷。為了解決乳糖殺傷的問題，已經(jīng)提出了缺失乳糖通透酶或嚴(yán)重?fù)p害乳糖攝取(34)。例如，lodi等(55)缺失(敲除)了乳酸克魯維酵母中的乳糖通透酶，發(fā)現(xiàn)乳糖殺傷不再發(fā)生。他們的實驗過程中的自發(fā)突變進(jìn)一步表明所選擇的乳糖殺傷陰性菌株在其乳糖攝取方面嚴(yán)重受損。然而，為了有效地合成特殊產(chǎn)品或生物產(chǎn)品，乳糖攝取是必需的。因此，缺失乳糖通透酶或嚴(yán)重?fù)p害乳糖通透酶活性明顯不是解決方案，因為產(chǎn)生這樣的生物產(chǎn)品需要1)有效的乳糖攝取和2)不導(dǎo)致“乳糖殺傷表型”的表達(dá)盒。先前已使用用于生產(chǎn)基于乳糖的生物產(chǎn)品的乳糖通透酶，但沒有解決“乳糖殺傷表型”。在過去，這個問題通過嚴(yán)重減少乳糖攝取(因此產(chǎn)生很少甚至不產(chǎn)生基于乳糖的特殊產(chǎn)品)或者通過將生長階段與生產(chǎn)階段分開以優(yōu)先獲得足夠的生物量來解決。在該生長階段之后，在第二階段中添加乳糖以產(chǎn)生特殊產(chǎn)品。在該第二階段中，不發(fā)生或強烈減少生長(59)。
因此，目前的共識是，為了避免乳糖殺傷，必須消除或嚴(yán)重?fù)p害乳糖攝取，因為正常的乳糖攝取將總是導(dǎo)致乳糖殺傷。相比之下，本發(fā)明公開了一種篩選方法以找到允許有效攝取乳糖而不經(jīng)歷乳糖殺傷的乳糖通透酶表達(dá)盒！
乳糖是許多生物產(chǎn)品，更特別是特殊糖類(14)、糖脂和半乳糖基化化合物(例如半乳糖基脂、半乳糖神經(jīng)酰胺和半乳糖基化糖苷配基)的結(jié)構(gòu)單元。在許多情況下，半乳糖部分用于藥物的器官靶向(28)。然而，由于上述“乳糖殺傷”現(xiàn)象，將乳糖作為基質(zhì)與其他基質(zhì)組合使用不像所認(rèn)為的那樣明顯。通常，需要多階段生產(chǎn)系統(tǒng)、非生長耦合細(xì)胞系統(tǒng)(non-growingcoupledcellsystem)以避免乳糖殺傷(32，48)。
許多特殊糖類的基本結(jié)構(gòu)骨架由乳糖或半乳糖單元組成。更具體地，人乳寡糖和引申的母乳寡糖(一大類糖類和寡糖)由半乳糖和乳糖單元構(gòu)成(15)。這些糖類用糖部分進(jìn)一步修飾，例如n-乙酰葡糖胺、n-乙酰半乳糖胺、唾液酸(例如n-乙酰神經(jīng)氨酸、n-羥乙酰神經(jīng)氨酸、2-酮-3-脫氧-d-甘油半乳糖壬酮糖酸……)(21)，l-巖藻糖等。然后這些化合物的合成需要活化的糖類，例如udp-n-乙酰葡糖胺、udp-n-乙酰半乳糖胺、cmp-唾液酸、gdp-巖藻糖……，這些非常昂貴且難以合成分子并且由于其生物合成所需的能量而最好由活的生長細(xì)胞產(chǎn)生。
人/母乳的寡糖組分具有抗炎和益生元效果和/或在治療學(xué)中用作營養(yǎng)品、抗炎劑、益生元(prebiotic)或藥物(15，24，68)。然而，仍然需要有效生產(chǎn)后面的高價值化合物的方法。
本發(fā)明描述了即使在高乳糖濃度下也不導(dǎo)致乳糖殺傷的乳糖轉(zhuǎn)運蛋白的合成表達(dá)系統(tǒng)。因此，能夠通過所述表達(dá)系統(tǒng)獲得的突變生物體可用于生產(chǎn)上述生物產(chǎn)品。
附圖說明
圖1：乳糖對大腸桿菌野生型菌株的影響。在箭頭處，將乳糖添加到培養(yǎng)物之一中，并且該培養(yǎng)物的生長立即停止，而其他菌株在其他培養(yǎng)物中繼續(xù)生長。
圖2：乳糖對大腸桿菌乳糖轉(zhuǎn)運蛋白突變株(mutantstrain)的影響，在所述突變株中通過合成的組成型啟動子改變了乳糖轉(zhuǎn)運蛋白表達(dá)。箭頭指示將乳糖添加到培養(yǎng)物之一的培養(yǎng)基中的時刻。在這種情況下，未觀察到對生長的影響。因此，可以以這種方式選擇這些突變株。
圖3：當(dāng)引入到大腸桿菌突變株中時不引起乳糖殺傷的啟動子、rbs和乳糖轉(zhuǎn)運蛋白序列組合的實例(seqidn°1)。
圖4：與lacz基因翻譯偶聯(lián)的乳糖通透酶基因的序列的實例(seqidn°2)。
圖5：與cat基因翻譯偶聯(lián)的乳糖通透酶基因lacy的序列的實例(seqidn°3)。
圖6：與aph1基因翻譯偶聯(lián)的馬克斯克魯維酵母(k.maxianus)乳糖通透酶基因的序列的實例(seqidn°4)。
圖7：與適配體偶聯(lián)的乳糖通透酶基因lacy的序列的實例(seqidn°5)，所述適配體結(jié)合(z)-4-(3，5-二氟-4-羥基亞芐基)-1，2-二甲基-1h-咪唑-5(4h)-酮并允許檢測乳糖通透酶表達(dá)。
圖8：包含參考質(zhì)粒psc101而不含與氯霉素抗性基因翻譯偶聯(lián)的乳糖通透酶的參考菌株以及具有與氯霉素抗性基因翻譯偶聯(lián)的乳糖通透酶的突變株的氯霉素抗性。x軸顯示測試的不同氯霉素濃度，y軸顯示培養(yǎng)物在孵育48小時后的光密度。參考菌株在比突變株更低的氯霉素篩選下顯示出生長阻滯，這證明，可以通過與抗生素抗性基因的翻譯偶聯(lián)來篩選乳糖通透酶的表達(dá)。因此，可以以這種方式從不表達(dá)和表達(dá)乳糖通透酶的生物體混合物選擇表達(dá)乳糖通透酶的生物體。
圖9：包含參考質(zhì)粒psc101而不含與氯霉素抗性基因翻譯偶聯(lián)的乳糖通透酶的參考菌株以及具有與氯霉素抗性基因翻譯偶聯(lián)的乳糖通透酶的突變株的氯霉素抗性。x軸顯示測試的不同氯霉素濃度，y軸顯示培養(yǎng)物在孵育92小時后的光密度。參考菌株在比突變株更低的氯霉素篩選下顯示出生長阻滯，這證明，可以通過與抗生素抗性基因的翻譯偶聯(lián)來篩選乳糖通透酶的表達(dá)。因此，可以以這種方式從不表達(dá)和表達(dá)乳糖通透酶的生物體混合物選擇表達(dá)乳糖通透酶的生物體。
圖10：pcxp14-ft_幽門螺桿菌(h.pylori)(seqidn°6)。
圖11：乳糖對酵母野生型菌株(乳酸馬克斯克魯維酵母(kluyveromycesmarxianuslactis))的影響。在箭頭處，將乳糖添加到培養(yǎng)物之一中，并且該培養(yǎng)物的生長立即停止，而其他菌株在其他培養(yǎng)物中繼續(xù)生長。
圖12：乳糖對酵母乳糖轉(zhuǎn)運蛋白突變株(釀酒酵母(saccharomycescerevisiae))的影響，在所述突變株中通過合成的組成型啟動子改變?nèi)樘寝D(zhuǎn)運蛋白表達(dá)。箭頭指示將乳糖添加到培養(yǎng)物之一中的培養(yǎng)基中的時刻。在這種情況下，未觀察到對生長的影響。因此，可以以這種方式選擇這些突變株。
圖13：當(dāng)引入到酵母突變株中時不引起乳糖殺傷的啟動子(p1)kozak、馬克斯克魯維酵母乳糖通透酶編碼序列和終止子組合的實例(seqidn°7)。
圖14：當(dāng)引入到酵母突變株中時不引起乳糖殺傷的啟動子(p2)kozak、馬克斯克魯維酵母乳糖通透酶編碼序列和終止子組合的實例(seqidn°8)。
圖15：啟動子、kozak、馬克斯克魯維酵母β-半乳糖苷酶編碼序列和終止子組合的實例(seqidn°9)。
圖16：hr1rdna(seqidn°10)。
圖17：hr2rdna(seqidn°11)。
圖18：所選擇的來源于如實施例中所述的乳糖殺傷篩選方法的序列的實例(seqidn°12至57)。
圖19：乳糖通透酶表達(dá)盒相對于野生型的相對生長速率。誤差條是至少3次重復(fù)測量的標(biāo)準(zhǔn)偏差。與x軸上的序列號相關(guān)的序列示于圖18中。
圖20：實施例16中對乳糖殺傷進(jìn)行測試的laciq_lacy表達(dá)盒的序列(seqidn°58)。
圖21：乳糖對大腸桿菌野生型菌株和placiq_lacy突變株的影響。兩種菌株均在指數(shù)期中期在添加和不添加乳糖的情況下生長。箭頭表示添加乳糖的時刻。兩種菌株的生長由于添加乳糖而嚴(yán)重受損。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明涉及產(chǎn)生微生物的方法，所述微生物當(dāng)在乳糖與其他碳源組合的環(huán)境中生長時抵抗乳糖殺傷現(xiàn)象，其中所述方法包括：
a.使微生物內(nèi)乳糖轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)突變，其中所述突變導(dǎo)致表達(dá)的乳糖轉(zhuǎn)運蛋白，
b.使所述突變微生物在包含非乳糖的碳源的培養(yǎng)基上生長，
c.在所述突變微生物的生長期間向所述培養(yǎng)基中添加乳糖，和
d.選擇在所述包含乳糖的培養(yǎng)基上生長時抵抗乳糖殺傷現(xiàn)象的微生物。
更具體地，本發(fā)明涉及生產(chǎn)微生物的方法，所述微生物當(dāng)在乳糖與其他碳源組合的環(huán)境中生長時抵抗乳糖殺傷現(xiàn)象，其中所述方法包括：
a.使微生物內(nèi)乳糖轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)突變，其中所述突變導(dǎo)致所述乳糖轉(zhuǎn)運蛋白表達(dá)，
b.使所述突變微生物在包含非乳糖的碳源的培養(yǎng)基上生長，
c.在所述突變微生物的生長期間向所述培養(yǎng)基中添加乳糖，和
d.選擇這樣的微生物，其在所述包含乳糖的培養(yǎng)基上生長時抵抗乳糖殺傷現(xiàn)象，并且保留用所述乳糖轉(zhuǎn)運蛋白的野生型表達(dá)盒獲得的乳糖通量的至少50％。
本發(fā)明還涉及如上所述方法，其中步驟a)通過以下來進(jìn)行，在內(nèi)源或外源乳糖轉(zhuǎn)運蛋白基因前引入異源啟動子，和/或?qū)幋a序列前的含有核糖體結(jié)合或kozak序列的非翻譯區(qū)進(jìn)行突變，和/或?qū)?nèi)源乳糖轉(zhuǎn)運蛋白基因的密碼子使用進(jìn)行修飾。
本發(fā)明還涉及所述方法，其中所述在內(nèi)源或外源乳糖轉(zhuǎn)運蛋白基因前引入異源啟動子如下進(jìn)行：a)從基因組中缺失內(nèi)源乳糖轉(zhuǎn)運蛋白并將其重新引入在所述微生物基因組內(nèi)的另一位置處，或者b)在內(nèi)源乳糖轉(zhuǎn)運蛋白前引入異源啟動子，或者c)敲除內(nèi)源乳糖啟動子并在所述微生物的基因組中的相同位置處引入異源啟動子。
本發(fā)明還涉及上述方法，其中通過與報道基因翻譯偶聯(lián)和/或通過適配體偶聯(lián)來檢測步驟b)中所述乳糖通透酶的表達(dá)。
本發(fā)明涉及上述方法，其中通過如由seqidn°2、3、4和/或5給出的遺傳構(gòu)建體來檢測所述經(jīng)表達(dá)的乳糖轉(zhuǎn)運蛋白。
本發(fā)明還涉及如上所述方法，其中所述乳糖轉(zhuǎn)運蛋白是乳糖通透酶。
本發(fā)明還涉及如上所述方法，其中所述微生物是細(xì)菌、酵母或真菌。
本發(fā)明還涉及導(dǎo)致乳糖轉(zhuǎn)運蛋白表達(dá)的，當(dāng)含有這樣的序列的微生物在乳糖與其他碳源組合的環(huán)境中生長時不導(dǎo)致乳糖殺傷表型的，并且能夠通過上述方法獲得的啟動子序列、編碼序列前的含有核糖體結(jié)合序列或kozak序列的非翻譯區(qū)和/或乳糖通透酶序列。
本發(fā)明還涉及當(dāng)在乳糖與其他碳源組合的環(huán)境中生長時抵抗乳糖殺傷現(xiàn)象并且能夠通過上述方法獲得的微生物。
更具體地，本發(fā)明涉及如上所述微生物，并且所述微生物在如由seqidn°1、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56或57給出的乳糖轉(zhuǎn)運蛋白基因前具有異源序列。
本發(fā)明還涉及抵抗乳糖殺傷現(xiàn)象的微生物，其中使得編碼來自乳糖和/或半乳糖降解途徑之酶的基因功能降低或無功能。
本發(fā)明還涉及使用如上所述微生物來生產(chǎn)基于乳糖的特殊產(chǎn)品，例如特殊的碳水化合物、糖脂和半乳糖基化化合物。
本發(fā)明還涉及使用如上所述微生物，其中所述特殊碳水化合物是2-巖藻糖基乳糖、或2’-巖藻糖基乳糖、或3-巖藻糖基乳糖、或2’，3-二巖藻糖基乳糖、或乳糖基n三糖、或乳糖基-n-四糖、或乳糖基-nn-四糖、或3’唾液酸基乳糖(sialyllactose)或6’唾液酸基乳糖。
具體實施方式
本發(fā)明描述了通過在生物體中經(jīng)由基因工程改變?nèi)樘寝D(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)來避免乳糖殺傷的新方法，得到表達(dá)突變體乳糖轉(zhuǎn)運蛋白的生物體。為此，由不導(dǎo)致乳糖殺傷表型的異源啟動子表達(dá)外源和/或內(nèi)源乳糖轉(zhuǎn)運蛋白基因，和/或?qū)θ樘寝D(zhuǎn)運蛋白的密碼子使用進(jìn)行修飾以產(chǎn)生不導(dǎo)致乳糖殺傷表型的乳糖轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)改變。為此，乳糖轉(zhuǎn)運蛋白的天然表達(dá)控制必須以這樣的不發(fā)生乳糖殺傷的方式被除去和/或替代。例如，從基因組中缺失天然存在的乳糖轉(zhuǎn)運蛋白表達(dá)盒并在另一位置重新引入，和/或，將異源啟動子在其原始位置處引入到乳糖轉(zhuǎn)運蛋白前，和/或，首先敲除乳糖轉(zhuǎn)運蛋白并在基因組中相同和/或另一位置處用異源啟動子重新引入，和/或，將乳糖轉(zhuǎn)運蛋白引入到通過異源啟動子表達(dá)的操縱子中。
因此，本發(fā)明涉及生產(chǎn)微生物的方法，所述微生物在乳糖與其他碳源組合的環(huán)境中生長時抵抗乳糖殺傷現(xiàn)象，其中所述方法包括：1)使微生物內(nèi)乳糖轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)突變，其中所述突變導(dǎo)致所述乳糖轉(zhuǎn)運蛋白表達(dá)，2)使所述突變的微生物在包含非乳糖的碳源的培養(yǎng)基上生長，3)在所述突變的微生物的生長期間向所述培養(yǎng)基中添加乳糖，以及4)選擇這樣的微生物，其在所述包含乳糖的培養(yǎng)基上生長時抵抗乳糖殺傷現(xiàn)象，并且保留用所述乳糖轉(zhuǎn)運蛋白的野生型表達(dá)盒獲得的乳糖通量的至少50％。
術(shù)語“乳糖殺傷”是指在乳糖或半乳糖苷與其他碳源組合的環(huán)境中生長的生物體的生長阻滯(growthretardation)或生長停滯現(xiàn)象。這些碳源是但不限于甘油、麥芽糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、巖藻糖、甘露糖、唾液酸、淀粉、纖維素、多元醇(例如甘露醇、木糖醇、山梨糖醇)、有機酸(乳酸鹽/酯、琥珀酸鹽/酯、乙酸鹽/酯……)和/或戊糖(木糖、阿拉伯糖……)。
本發(fā)明描述了鑒定不導(dǎo)致乳糖殺傷的乳糖通透酶表達(dá)系統(tǒng)的方法。該方法包括突變株的生長分析，其中在指數(shù)期中期向所述突變株添加乳糖。該方法可以以高通量方式在微量滴定板中或用細(xì)胞分選儀進(jìn)行，使得能夠篩選多個啟動子、核糖體結(jié)合位點、密碼子使用以及其他可影響突變微生物中乳糖通透酶的表達(dá)的因子。本發(fā)明描述了通過翻譯偶聯(lián)和/或適配體偶聯(lián)來檢測乳糖通透酶表達(dá)以及通過報道基因選擇導(dǎo)致表達(dá)的序列的方法，所述報道基因例如但不限于抗生素抗性基因(例如但不限于氯霉素、遺傳霉素g418)、熒光蛋白、水解酶(例如但不限于半乳糖苷酶、木聚糖酶)和或適配體序列。基于報道基因通過在具有抗生素的培養(yǎng)基中生長、比色測定(例如x-gal)和/或通過分選出熒光細(xì)胞的熒光激活細(xì)胞分選儀和/或適配體測定進(jìn)一步選擇導(dǎo)致乳糖通透酶表達(dá)的序列，例如但不限于基于(z)-4-(3，5-二氟-4-羥基亞芐基)-1，2-二甲基-1h-咪唑-5(4h)-酮(37，64)。本發(fā)明還描述了篩選不經(jīng)歷乳糖殺傷的表達(dá)乳糖轉(zhuǎn)運蛋白的突變生物體的過程。此外，本發(fā)明描述了如何能通過乳糖通透酶基因的啟動子文庫、rbs或kozak序列文庫、轉(zhuǎn)錄終止子文庫和/或密碼子使用變體來創(chuàng)建乳糖通透酶表達(dá)盒的文庫。這些文庫通過例如但不限于gibson組裝、goldengate組裝、cliva組裝、lcr或限制性連接的方法進(jìn)一步創(chuàng)建(25，36，50，79)。
術(shù)語“其保留用所述乳糖轉(zhuǎn)運蛋白的野生型表達(dá)盒獲得的乳糖通量的至少50％”涉及以下事實：本發(fā)明的突變微生物應(yīng)當(dāng)仍然能夠保留當(dāng)使用所述乳糖轉(zhuǎn)運蛋白的野生型表達(dá)盒時獲得的乳糖通量的至少50％(即，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％)，盡管它們抵抗乳糖殺傷。
術(shù)語“表達(dá)盒”涉及其中存在啟動子序列、非翻譯區(qū)序列(包含核糖體結(jié)合序列或kozak序列)、編碼序列(例如乳糖通透酶基因序列)和任選的轉(zhuǎn)錄終止子(18)的任何序列。
術(shù)語“乳糖轉(zhuǎn)運蛋白”是指在微生物中表達(dá)的能夠轉(zhuǎn)運(運輸)乳糖穿過細(xì)胞質(zhì)膜的任何蛋白質(zhì)。這樣的蛋白質(zhì)是例如乳糖通透酶(來自超家族mfs或主要易化子超家族(majorfacilitatorsuperfamily)的轉(zhuǎn)運蛋白)。
術(shù)語“異源啟動子”是指不天然存在于編碼序列前的任何啟動子?！皢幼印笔俏挥谵D(zhuǎn)錄起始位點和編碼序列前的非翻譯區(qū)之前的全部rna聚合酶結(jié)合序列。因此，“異源啟動子”序列是：1)含有至少1個(即，1、2、3、4……)突變的天然存在的啟動子序列的變體；和/或2)來自表達(dá)突變?nèi)樘寝D(zhuǎn)運蛋白的微生物的天然啟動子，所述啟動子不天然存在于所述轉(zhuǎn)運蛋白的編碼序列之前；和/或3)不天然存在于表達(dá)乳糖轉(zhuǎn)運蛋白的微生物中的序列；和/或4)為計算機設(shè)計的啟動子的人工啟動子。這些啟動子可來源于文庫，例如但不限于由alper等(2005)、hammer等(2006)、demey等(2007)、coussement等(2014)或mutalik等(2013)(3，25，29，41，60)(66)或blount等(2012)所述的文庫，和/或hxt7p，啟動子例如但不限于adh1p、tef1p、tef2p、gpdp、pdc1p、fba1p、pgk1p、pgi1p、tdh2p、pyk1p、eno2p、gpm1p、tpi1p(13)或者例如由rhodius等(2012)所述設(shè)計的啟動子。術(shù)語“人工啟動子”還指具有為天然(自體)啟動子序列與部分不同(自體或異源)啟動子序列之組合的dna序列的啟動子。這樣的“人工啟動子”的序列可以存在于數(shù)據(jù)庫(例如partsregistry.org(19))中。異源啟動子導(dǎo)致組成型表達(dá)或通過轉(zhuǎn)錄因子的受調(diào)節(jié)表達(dá)。
術(shù)語“組成型表達(dá)”被定義為在某些生長條件下不受除rna聚合酶亞基(例如，細(xì)菌σ因子)以外的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)的表達(dá)。這樣的轉(zhuǎn)錄因子的非限制性實例是大腸桿菌中的crp、laci、arca、cra、iclr……，或釀酒酵母中的aft2p、crz1p、skn7……，或枯草芽孢桿菌(b.subtilis)中的deor、gntr、fur……。這些轉(zhuǎn)錄因子在特定序列上結(jié)合并且可以阻斷或增強在某些生長條件下的表達(dá)。rna聚合酶結(jié)合特定序列以啟動轉(zhuǎn)錄，例如通過原核宿主中的σ因子。
術(shù)語“受調(diào)節(jié)表達(dá)”被定義為在某些生長條件下還受rna聚合酶亞基(例如，細(xì)菌σ因子)以外的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)的表達(dá)。這樣的轉(zhuǎn)錄因子的實例如上所述。
術(shù)語在編碼序列前的包含核糖體結(jié)合位點或kozak序列的“非翻譯區(qū)”涉及rna聚合酶結(jié)合序列與編碼序列之間的序列。這種非翻譯區(qū)也是天然存在于編碼序列前的序列，和/或天然存在于表達(dá)乳糖轉(zhuǎn)運蛋白的微生物中的序列，和/或來源于其他生物體(原核生物或真核生物)的序列，和/或人工設(shè)計的序列，其涉及具有已知或可測量的翻譯速率的非天然或計算機設(shè)計的核糖體結(jié)合位點，這些序列可來源于如由mutalik等(2013)(60)所述的文庫或者通過例如由salis等(2009)(67)所述的算法設(shè)計或者可以存在于數(shù)據(jù)庫(例如partsregistry.org(19))中。
術(shù)語“對密碼子使用進(jìn)行修飾”涉及將dna編碼序列中使用的密碼子改變?yōu)樯矬w更頻繁使用或生物體很少使用的密碼子。在數(shù)據(jù)庫如密碼子使用數(shù)據(jù)庫(61)中定義了密碼子使用并且通過密碼子使用設(shè)計算法(73)優(yōu)化密碼子使用。
術(shù)語“翻譯偶聯(lián)”是指目的基因和報道基因(例如綠色熒光蛋白、抗生素抗性基因、毒性基因)的偶聯(lián)表達(dá)(49，53，58，63)。術(shù)語“翻譯傳感器”是指作為基因表達(dá)和翻譯的指示的任何機制，例如，如以下參考文獻(xiàn)(17，72)中所述的熒光標(biāo)簽和分離標(biāo)簽。
術(shù)語“適配體偶聯(lián)”是指將適配體序列引入到可通過熒光團(tuán)檢測的乳糖轉(zhuǎn)運蛋白的信使rna中，所述熒光團(tuán)例如但不限于(z)-4-(3，5-二氟-4-羥基亞芐基)-1，2-二甲基-1h-咪唑-5(4h)-酮(37，64)。
術(shù)語“生長分析”是指生物體的生長曲線的分析。在生長環(huán)境中的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)該生物體。術(shù)語生長環(huán)境涉及所有環(huán)境參數(shù)，例如ph、溫度、溶解氧。通過ph緩沖液或通過ph控制設(shè)置ph并且例如但不限于ph4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5或8。將溫度設(shè)置為例如但不限于25℃、28℃、30℃、32℃、34℃、37℃、40℃、42℃、45℃。溶解氧為厭氧、微需氧(溶解氧低于1.5mg/l)或需氧條件。
術(shù)語“培養(yǎng)基”或“生長培養(yǎng)基”涉及包含生物體生長所必需的基質(zhì)的任何溶液。這些基質(zhì)是但不限于：氮源，例如銨鹽、硝酸鹽；酵母提取物；蛋白胨(pepton)；酪蛋白氨基酸(casamino)和/或氨基酸；磷源，例如但不限于磷酸鹽；硫源，例如但不限于硫酸鹽；元素，例如但不限于銅、鈷、鐵、硒、碘、鉬酸鹽、鎂、鈣、鉀、鈉、鋅、鎳、錳；和/或硼酸；和/或維生素，例如但不限于硫胺素、泛酸和/或煙酸；和/或碳源，例如但不限于甘油、麥芽糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、巖藻糖、甘露糖、唾液酸、淀粉、纖維素、多元醇(例如甘露醇、木糖醇、山梨糖醇)、有機酸(乳酸鹽、琥珀酸鹽、乙酸鹽……)和/或戊糖(木糖、阿拉伯糖……)。
如上所述術(shù)語“生物體”或“細(xì)胞”是指選自細(xì)菌、酵母或真菌的微生物，或者指植物或動物細(xì)胞。前述細(xì)菌優(yōu)選地屬于變形菌(proteobacteria)門或厚壁菌(firmicutes)門或藍(lán)細(xì)菌(cyanobactria)門或者異常球菌-棲熱菌(deinococcus-thermus)門。屬于變形菌門的前述細(xì)菌優(yōu)選地屬于腸桿菌科(enterobacteriaceae)，優(yōu)選地屬于大腸桿菌(escherichiacoli)種。前述細(xì)菌優(yōu)選地涉及屬于大腸桿菌種的任何菌株，例如但不限于大腸桿菌b、大腸桿菌c、大腸桿菌w、大腸桿菌k12、大腸桿菌nissle。更具體地，前述術(shù)語涉及培養(yǎng)的大腸桿菌菌株-稱為大腸桿菌k12菌株-其非常適合于實驗室環(huán)境，并且與野生型菌株不同，其已喪失了在腸中繁殖的能力。大腸桿菌k12菌株的公知實例是k12野生型、w3110、mg1655、m182、mc1000、mc1060、mc1061、mc4100、jm101、nzn111和aa200。因此，本發(fā)明特別涉及如上所述突變和/或轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株，其中所述大腸桿菌菌株是k12菌株。更具體地，本發(fā)明涉及如上所述突變和/或轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株，其中所述k12菌株是大腸桿菌mg1655。屬于厚壁菌門的前述細(xì)菌優(yōu)選地屬于芽孢桿菌屬(bacilli)，優(yōu)選地來自芽孢桿菌種。前述酵母優(yōu)選地屬于子囊菌門(ascomycota)或擔(dān)子菌門(basidiomycota)或半知菌門(deuteromycota)或接合菌門(zygomycete)。前述酵母優(yōu)選地屬于酵母屬(saccharomyces)、畢赤酵母屬(pichia)、漢遜酵母屬(hansunella)、克魯維酵母屬(kluyveromyces)、耶氏酵母屬(yarrowia)或斯塔摩酵母屬(starmerella)。前述真菌優(yōu)選地屬于根霉屬(rhizopus)、盤基網(wǎng)柄菌屬(dictyostelium)或曲霉屬(aspergillus)。
本發(fā)明描述了能夠攝取乳糖而不經(jīng)歷乳糖殺傷并且能夠?qū)⑷樘腔蚱浒肴樘遣糠洲D(zhuǎn)化為特殊產(chǎn)品的生物體。更具體地，所述特殊產(chǎn)品或生物產(chǎn)品是特殊的碳水化合物；糖脂，例如但不限于半乳糖脂和/或乳糖脂；和/或半乳糖基化化合物，例如半乳糖基脂、半乳糖神經(jīng)酰胺和/或半乳糖基化糖苷配基。
本發(fā)明描述了能夠攝取乳糖而不經(jīng)歷乳糖殺傷并將所述乳糖轉(zhuǎn)化為人乳寡糖的生物體，所述人乳寡糖例如但不限于3-巖藻糖基乳糖、2’-巖藻糖基乳糖、6-巖藻糖基乳糖、2’，3-二巖藻糖基乳糖、2’，2-二巖藻糖基乳糖、3，4-二巖藻糖基乳糖、6’-唾液酸基乳糖、3’-唾液酸基乳糖、3，6-二唾液酸基乳糖、6，6’-二唾液酸基乳糖、3，6-二唾液酸基乳糖基-n-四糖、乳糖基二巖藻糖基丁糖(lactodifucotetraose)、乳糖基-n-四糖、乳糖基-n-新四糖、乳糖基-n-巖藻糖基五糖ii、乳糖基-n-巖藻糖基五糖i、乳糖-n-巖藻糖基五糖iii、唾液酸基乳糖基-n-四糖c、唾液酸基乳糖基-n-四糖b、唾液酸基乳糖基-n-四糖a、乳糖基-n-二巖藻基己糖i、乳糖基-n-二巖藻基己糖ii、乳糖基-n-己糖、乳糖基-n-新己糖、對乳糖基-n-己糖、單巖藻糖基單唾液酸基乳糖基-n-四糖c、單巖藻糖基對乳糖基-n-己糖、單巖藻糖基乳糖基-n-六糖iii、異構(gòu)巖藻糖基化乳糖基-n-己糖iii、異構(gòu)巖藻糖基化乳糖基-n-己糖i、唾液酸乳糖基-n-己糖、唾液酸乳糖基-n-新己糖ii、二巖藻糖基對乳糖基-n-己糖、二巖藻糖基乳糖基-n-己糖、二巖藻糖基乳糖基-n-己糖a、二巖藻糖基乳糖基-n-己糖c、半乳糖基化殼聚糖、巖藻糖基化寡糖和/或唾液酸化寡糖……。
本發(fā)明還描述了不經(jīng)歷乳糖殺傷并且合成核苷酸糖的生物體，所述核苷酸糖例如但不限于gdp-l-巖藻糖、gdp-甘露糖、gdp-葡萄糖、cmp-唾液酸、udp-葡萄糖、udp-半乳糖、udp-n-乙酰葡糖胺、udp-n-乙酰甘露糖胺、udp-n-乙酰半乳糖胺、udp-葡糖醛酸、udp-半乳糖醛酸、udp-木糖、udp-阿拉伯糖和/或dtdp-鼠李糖。術(shù)語“唾液酸”是例如但不限于由varki(1992)(71)定義的神經(jīng)氨酸、n-乙酰神經(jīng)氨酸或n-羥乙酰神經(jīng)氨酸(glycoylneuramicacid)的化合物的組名。細(xì)胞內(nèi)gdp-巖藻糖濃度或庫通過上調(diào)從頭途徑和/或補救途徑而增強。從頭途徑由gdp-4-酮-6-脫氧甘露糖-3，5-差向異構(gòu)酶-4-還原酶或gdp-巖藻糖合酶、gdp-甘露糖-4，6-脫水酶、gdp-d-甘露糖焦磷酸化酶、磷酸甘露糖異構(gòu)酶和/或磷酸甘露糖變位酶組成，其表達(dá)通過如下單獨增強：遺傳元件，例如但不限于單順反子或多順反子(操縱子結(jié)構(gòu))中的啟動子和/或核糖體結(jié)合位點和/或改變的密碼子使用；和/或通過腸桿菌科(enterobacteriaceae)中的調(diào)節(jié)子arcaiclr和/或通過腸桿菌科中的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子rcsa或細(xì)菌中的同源基因，或釀酒酵母中的xbp1、spt20、sfp1、rpd3、rap1、gcr1、gcn5、cst6、abf1、hsf1、reb1、cad1、sin4、ash1、ixr1、met32、pho2、rgr1、spt7、swi4，或酵母或真菌中的同源基因。補救途徑由l-巖藻糖激酶和/或gdp-l-巖藻糖焦磷酸化酶組成。gdp-甘露糖庫通過上調(diào)編碼gdp-d-甘露糖焦磷酸化酶、磷酸甘露糖異構(gòu)酶和/或磷酸甘露糖變位酶的基因和/或編碼甘露糖激酶和gdp-d-甘露糖焦磷酸化酶的基因而增強。udp-半乳糖庫通過上調(diào)編碼如下的基因而增強：半乳糖激酶和/或半乳糖1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶；和/或udp-半乳糖-4-差向異構(gòu)酶；和/或udp-半乳糖/葡萄糖焦磷酸化酶；和/或乳糖合酶；和/或乳糖磷酸化酶；和/或蔗糖磷酸化酶。udp-葡萄糖庫通過上調(diào)編碼如下的基因而增強：葡糖激酶；和/或udp-葡萄糖焦磷酸化酶；和/或蔗糖磷酸化酶；和/或磷酸葡糖變位酶；和/或蔗糖合酶。cmp-唾液酸庫通過上調(diào)編碼如下的基因而增強：l-谷氨酰胺：d-果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶；和/或磷酸葡糖胺變位酶；和/或葡糖胺-1-磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶；和/或n-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶；和/或udp-n-乙酰葡糖胺-2-差向異構(gòu)酶；和/或n-乙酰神經(jīng)氨酸合酶(n-acetylneuraminatesynthase)；和/或胞苷5’-單磷酸n-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶。udp-n-乙酰葡糖胺庫通過上調(diào)編碼如下的基因而增強：l-谷氨酰胺：d-果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶；和/或磷酸葡糖胺變位酶；和/或葡糖胺-1-磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶；和/或n-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶；和/或葡糖胺-6-磷酸n-乙酰轉(zhuǎn)移酶；和/或磷酸乙酰葡糖胺變位酶；和/或udp-n-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶。udp-n-乙酰甘露糖胺庫通過上調(diào)編碼udp-n-乙酰葡糖胺庫增強和/或udp-n-乙酰葡糖胺2-差向異構(gòu)酶的基因而增強。udp-n-乙酰半乳糖胺庫通過上調(diào)編碼udp-n-乙酰葡糖胺庫增強和/或udp-n-乙酰葡糖胺c4-差向異構(gòu)酶的基因而增強。udp-葡糖醛酸庫通過上調(diào)編碼udp-葡萄糖庫增強和/或udp-葡萄糖脫氫酶的基因而增強。udp-木糖庫通過上調(diào)編碼udp-葡糖醛酸庫(glucuronicpool)增強和/或udp-d-木糖合酶的基因而增強。udp-半乳糖醛酸庫通過上調(diào)編碼udp-葡糖醛酸庫增強和/或udp-d-葡糖醛酸4-差向異構(gòu)酶的基因而增強。udp-阿拉伯糖庫通過上調(diào)編碼如下的基因而增強：udp-葡糖醛酸庫增強和/或udp-d-木糖4-差向異構(gòu)酶和/或阿拉伯糖激酶和/或udp-l-阿拉伯糖焦磷酸化酶。dtdp-鼠李糖庫通過上調(diào)編碼如下的基因而增強：dtdp-葡萄糖焦磷酸化酶；和/或dtdp-葡萄糖4，6-脫水酶；和/或dtdp-4-脫氫鼠李糖3，5-差向異構(gòu)酶；和/或dtdp-4-脫氫鼠李糖還原酶；和/或葡萄糖-1-磷酸胸苷酰轉(zhuǎn)移酶(thymidylyltransferase)；和/或核苷酸鼠李糖合酶。
術(shù)語“庫”還涉及天然存在于野生型生物體中的代謝物的濃度，例如，核苷酸糖庫的濃度。術(shù)語“增強庫”涉及所述代謝物庫的比野生型生物體之代謝物庫高的顯著提高的濃度。
術(shù)語“上調(diào)基因”涉及導(dǎo)致基因表達(dá)和/或產(chǎn)物(如果所述基因有的話)活性增強的每種基因修飾。所述基因修飾是啟動子、非翻譯區(qū)、核糖體結(jié)合位點、編碼序列、基因位置、內(nèi)含子/外顯子結(jié)構(gòu)和/或轉(zhuǎn)錄終止子中的修飾，其導(dǎo)致所述提高的表達(dá)和/或活性。
另外，本發(fā)明描述了可通過糖基轉(zhuǎn)移酶將這些核苷酸糖轉(zhuǎn)移到單糖、二糖或寡糖上的遺傳修飾的生物體，所述單糖、二糖或寡糖例如但不限于：半乳糖、乳糖、乳糖基n二糖、乳糖基n三糖、乳糖基n四糖、乳糖基-n-新四糖、globotriose、2’-巖藻糖基乳糖、3-巖藻糖基乳糖、3-唾液酸基乳糖、6-唾液酸基乳糖、人乳寡糖、heparosan、殼聚糖、結(jié)瘤因子、糖脂和/或糖苷配基……。
本發(fā)明還描述了不經(jīng)歷乳糖殺傷并且可以用酶進(jìn)一步修飾所述乳糖的生物體，所述酶例如但不限于：碳水化合物水解酶、糖碳水化合物轉(zhuǎn)移酶、碳水化合物合酶、乙?；?、?；D(zhuǎn)移酶、碳水化合物磷酸酶、多糖裂解酶、激酶、丙酮酸酶(pyruvylase)和/或磺基轉(zhuǎn)移酶。
本發(fā)明還描述了不經(jīng)歷乳糖殺傷且通過使乳糖水解酶基因具有較少功能或無功能而不再降解乳糖的生物體。
術(shù)語“使得基因具有較少功能或無功能”是指技術(shù)人員公知的技術(shù)，例如使用sirna、rnai、mirna、asrna、使基因產(chǎn)生突變、敲除基因、轉(zhuǎn)座子誘變、crispr/cas等，其用于以這樣的方式改變基因：它們不太可能(即，與功能野生型基因相比統(tǒng)計學(xué)上顯著“不太可能”)或完全不能(例如敲除基因)產(chǎn)生功能最終產(chǎn)物。因此，術(shù)語“(基因)敲除”是指使得基因無功能。術(shù)語“缺失基因”或“基因缺失”也指使得基因無功能(2，4-9，22，27，30，43，45，46，51，65，74)。
本發(fā)明描述了其中引入/敲入/上調(diào)基因以產(chǎn)生如上所述的生物產(chǎn)品的生物體。這些基因存在于基因數(shù)據(jù)庫中，例如但不限于基因庫或蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(例如但不限于uniprot)，或酶數(shù)據(jù)庫(例如但不限于brenda酶數(shù)據(jù)庫(16，23，38))，并且針對生物產(chǎn)品的途徑存在于在數(shù)據(jù)庫中，例如但不限于kegg、biocyc、metacyc(20，44，47)。針對上述某一生物產(chǎn)品的途徑可通過本領(lǐng)域中所述的若干種數(shù)學(xué)工具(35，54，57，76)確定。
實施例
1.材料和方法大腸桿菌
菌株和質(zhì)粒
大腸桿菌mg1655[λ-，f-，rph-1]和jm109獲自荷蘭細(xì)菌培養(yǎng)物保藏中心(netherlandsculturecollectionofbacteria，nccb)。使用datsenko&wanner的方法(27)產(chǎn)生所有突變株。
培養(yǎng)基
luria肉湯(luriabroth，lb)培養(yǎng)基由1％胰蛋白胨蛋白胨(difco，erembodegem，belgium)、0.5％酵母提取物(difco)和0.5％氯化鈉(vwr，leuven，belgium)組成。搖瓶培養(yǎng)基包含2g/lnh4cl、5g/l(nh4)2so4、2.993g/lkh2po4、7.315g/lk2hpo4、8.372g/lmops、0.5g/lnacl、0.5g/lmgso4·7h2o、15g/l甘油(除非另有說明)、1ml/l維生素溶液、100μl/l鉬酸鹽溶液和1ml/l硒溶液。用1mkoh將培養(yǎng)基設(shè)置為ph為7。
維生素溶液由3.6g/lfecl2·4h2o、5g/lcacl2·2h2o、1.3g/lmncl2·2h2o、0.38g/lcucl2·2h2o、0.5g/lcocl2·6h2o、0.94g/lzncl2、0.0311g/lh3bo4、0.4g/lna2edta·2h2o和1.01g/l硫胺·hcl組成。鉬酸鹽溶液包含0.967g/lna2moo4·2h2o。硒溶液包含42g/lseo2。
用于發(fā)酵的基本培養(yǎng)基包含6.75g/lnh4cl、1.25g/l(nh4)2so4、1.15g/lkh2po4、0.5g/lnacl、0.5g/lmgso4·7h2o、30g/l乳糖和20g/l蔗糖(或不同濃度，如果另有說明)，具有與上述相同組成的1ml/l維生素溶液、100μl/l鉬酸鹽溶液和1ml/l硒溶液。
培養(yǎng)條件
將來自lb-板上單菌落的預(yù)培養(yǎng)物在5mllb培養(yǎng)基中在37℃下在軌道搖床(orbitalshaker)上以200rpm孵育8小時。從該培養(yǎng)物中，將2ml轉(zhuǎn)移到500ml搖瓶中的100ml基本培養(yǎng)基中，并在37℃下在軌道搖床上以200rpm孵育16小時。將4％接種物用于具有1.5l或4l工作體積的2或5lbiostatbplus培養(yǎng)容器(sartoriusstedimbiotech，melsungen，germany)中。培養(yǎng)條件為：37℃，以800rpm攪拌，并且氣體流速為1.5l/分鐘。通過用空氣鼓泡來維持需氧條件。用0.5mh2so4和35％m氨溶液將ph維持在7。通過排氣冷卻器(frigomix1000，sartoriusstedimbiotech，melsungen，germany)使廢氣冷卻至4℃。當(dāng)發(fā)酵期間發(fā)泡產(chǎn)生時添加硅酮消泡劑(bdh331512k，vwrintltd.，poole，england)的10％溶液(約10μl)。用el3020尾氣分析儀(abbautomationgmbh，60488frankfurtammain，germany)測量尾氣。
用sartoriusmfcs/winv3.0系統(tǒng)(sartoriusstedimbiotech，melsungen，germany)記錄所有數(shù)據(jù)。
抽樣方法
生物反應(yīng)器在其內(nèi)部包括連接至反應(yīng)器端口的收獲管(bdspinalneedle，1.2x152mm(bdmedicalsystems，franklinlakes，nj-usa))，其在外部連接至masterflex-14管(cole-parmer，antwerpen，belgium)，隨后是具有隔膜的收獲端口用于取樣。該收獲端口的另一側(cè)用masterflex-16管連接回反應(yīng)容器。該系統(tǒng)被稱為快速取樣回路。在取樣期間，在取樣回路中循環(huán)泵送反應(yīng)器肉湯(reactorbroth)。據(jù)估計，在150ml/分鐘的流速下，反應(yīng)器肉湯需要0.04秒到達(dá)收獲端口，并且需要3.2秒重新進(jìn)入反應(yīng)器。在50％的po2水平下，在37℃的液體中存在約3mg/l的氧。po2水平?jīng)Q不應(yīng)低于20％以避免微需氧條件。因此，在運輸通過收獲回路的過程中可以消耗1.8mg/l的氧。假設(shè)攝氧速率為0.4g氧/g生物質(zhì)/小時(在μmax存在的最大攝氧速率)，這得到5g/l生物質(zhì)，2g/l/小時或0.56mg/l/秒的攝氧速率乘以3.2秒(在回路中的停留時間)得到1.8mg/l耗氧量。
為了停止取樣期間細(xì)胞的代謝，將反應(yīng)器肉湯抽吸通過填充有在-20℃下預(yù)冷卻的62g不銹鋼珠的注射器中的收獲端口，即刻將5ml肉湯冷卻至4℃。取樣后立即冷離心(15000g，5分鐘，4℃)。在分批實驗期間，使用快速取樣回路和冷不銹鋼珠取樣方法取得用于od600nm測量的樣品。
分析方法
通過在600nm處測量光密度(uvikom922分光光度計，brs，brussel，belgium)來頻繁監(jiān)測培養(yǎng)物的細(xì)胞密度。通過將預(yù)干燥和稱重的falcon中的20g反應(yīng)器肉湯離心(15分鐘，5000g，gsa轉(zhuǎn)子，sorvallrc-5b，goffinmeyvis，kapellen，belgium)來獲得細(xì)胞干重。將沉淀隨后用20ml生理溶液(9g/lnacl)洗滌一次并在70℃下干燥至恒重。為了能夠?qū)d600nm測量值轉(zhuǎn)換為生物量濃度，作od600nm對生物量濃度的相關(guān)曲線。使用在65℃下加熱的配備有1cm預(yù)置柱的aminexhpx-87h柱(bio-rad，eke，belgium)，使用5mmh2so4(0.6ml/分鐘)作為流動相，在varianprostarhplc系統(tǒng)(varian，sint-katelijne-waver，belgium)上測定葡萄糖和有機酸的濃度。使用雙波uv-vis(210nm和265nm)檢測器(varianprostar325)和示差折光率檢測器(mercklachroml-7490，merck，leuven，belgium)進(jìn)行峰檢測。通過將在265nm和210nm兩處的峰吸收相除，可以鑒定峰。除法得到恒定值，其對于某一化合物而言是典型的(beer-lambert公式)。
葡萄糖、果糖、蔗糖、寡糖和葡萄糖-1-磷酸通過具有hypercarb柱的hplc測量，并用msms檢測器檢測(antonio等，2007；nielsen等，2006)。
遺傳方法
用于突變體構(gòu)建的方法描述如下。
將質(zhì)粒保持在宿主大腸桿菌dh5α(f-、
質(zhì)粒。pkd46(red輔助質(zhì)粒，氨芐青霉素抗性)、pkd3(包含frt側(cè)翼的氯霉素抗性(cat)基因)、pkd4(包含frt側(cè)翼的卡那霉素抗性(kan)基因)和pcp20(表達(dá)flp重組酶活性)質(zhì)粒用于突變體構(gòu)建。使用質(zhì)粒pbluescript(fermentas，st.leon-rot，germany)來構(gòu)建具有啟動子文庫或具有攜帶點突變的等位基因的pkd3和pkd4的衍生物。
突變。突變包括基因破壞(敲除，knock-out，ko)。使用datsenko和wanner的概念(27)將其引入。
使攜帶red輔助質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體在具有氨芐青霉素(100mg/l)和l-阿拉伯糖(10mm)的10mllb培養(yǎng)基中在30℃下生長至od600nm為0.6。通過第一次用50ml冰冷的水以及第二次用1ml冰冷的水洗滌細(xì)胞將其制成電感受態(tài)(electrocompetent)。然后，將細(xì)胞重懸于50μl冰冷的水中。通過使用genepulsertm(biorad)(600ω，25μfd和250伏特)，用50μl細(xì)胞和10-100ng線性雙鏈dna產(chǎn)物進(jìn)行電穿孔。
電穿孔后，將細(xì)胞添加到1mllb培養(yǎng)基中，在37℃下孵育1小時，并且最后鋪在包含25mg/l氯霉素或50mg/l卡那霉素的lb-瓊脂上以選擇抗生素抗性轉(zhuǎn)化體。所選擇的突變體通過用修飾區(qū)上游和下游的引物的pcr進(jìn)行驗證，并在42℃下在lb-瓊脂中生長以失去輔助質(zhì)粒。測試突變體的氨芐青霉素敏感性。
線性雙鏈dna。使用pkd3、pkd4及其衍生物作為模板通過pcr獲得線性雙鏈dna擴增子。所使用的引物具有與模板互補的序列的一部分以及與染色體dna上必須發(fā)生重組的一側(cè)互補的另一部分。對于ko，同源區(qū)域被設(shè)計為目的基因的起始和終止密碼子上游50-nt和下游50-nt。對于ki，必須考慮轉(zhuǎn)錄起點(+1)。pcr產(chǎn)物進(jìn)行pcr純化，用dpni消化，從瓊脂糖凝膠再純化，并懸浮于洗脫緩沖液(5mmtris，ph8.0)中。
消除抗生素抗性基因。用pcp20質(zhì)粒轉(zhuǎn)化所選擇的突變體(氯霉素或卡那霉素抗性)，所述質(zhì)粒顯示出溫度敏感型復(fù)制和熱誘導(dǎo)的flp合成的氨芐青霉素和氯霉素抗性質(zhì)粒。在30℃下選擇氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化體，之后在42℃下在lb中對一些進(jìn)行菌落純化，然后測試所有抗生素抗性和flp輔助質(zhì)粒的丟失。用對照引物檢查基因敲除和敲入(fw/rv-基因驗證(fw/rv-gene-out))。
轉(zhuǎn)化。使用hanahan(42)的簡化過程或通過如上所述的電穿孔在cacl2感受態(tài)細(xì)胞中轉(zhuǎn)化質(zhì)粒。
2.材料和方法酵母
2.1.菌株
釀酒酵母by4742獲自euroscarf培養(yǎng)物保藏中心(euroscarfculturecollection)。使用gietz的方法(40)通過同源重組或質(zhì)粒轉(zhuǎn)化產(chǎn)生所有突變株。乳酸馬克斯克魯維酵母獲自工業(yè)生物技術(shù)和生物催化實驗室(laboratoryofindustrialbiotechnologyandbiocatalysis)的培養(yǎng)物保藏中心。
2.2.培養(yǎng)基
使菌株在具有完全補充混合物的合成的成分明確的酵母培養(yǎng)基(syntheticdefinedyeastmediumwithcompletesupplementmixture，sdcsm)或沒有csm(csmdrop-out)的合成的成分明確的酵母培養(yǎng)基(sdcsm-ura)上生長，所述培養(yǎng)基包含6.7g·l-1無氨基酸的酵母氮源(yeastnitrogenbase)(ynbw/oaa，difco)、20g·l-1瓊脂(difco)(固體培養(yǎng)物)、22g·l-1葡萄糖一水合物或20g·l-1乳糖和0.79g·l-1csm或0.77g·l-1csm-ura(mpbiomedicals)。
2.3.培養(yǎng)條件
首先將酵母培養(yǎng)物接種在5ml的合適的培養(yǎng)基中，并在30℃和200rpm下孵育過夜。為了獲得更大體積的培養(yǎng)物，將2％(或更高)的預(yù)培養(yǎng)物接種在50-200ml培養(yǎng)基中。將這些培養(yǎng)物再次在30℃和200rpm下孵育。
在96孔板或erlenmeyer計量器(erlenmeyerscale)中進(jìn)行生長實驗。為了獲得作為生長和生產(chǎn)實驗的起始材料的單菌落，將菌株鋪板在選擇性sdcsm板上并在30℃下孵育2-3天。然后挑選一個菌落并轉(zhuǎn)移至5ml培養(yǎng)基中用于erlenmeyer研究或轉(zhuǎn)移至1ml培養(yǎng)基中用于微量滴定板實驗。
對于erlenmeyer實驗，將預(yù)培養(yǎng)物在30℃和200rpm下孵育過夜，并將2％的這些預(yù)培養(yǎng)物添加到100ml培養(yǎng)基中以開始生長實驗。
對于mtp生長實驗，將菌落添加到150μl培養(yǎng)基中并在30℃下孵育24小時。孵育后，將2μl的mtp預(yù)培養(yǎng)物添加到包含mtp的150μl新鮮培養(yǎng)基中。用
2.4.取樣方法
每兩小時直至穩(wěn)定期和在穩(wěn)定期期間每幾個小時取培養(yǎng)物的od(0.2ml)樣品以及細(xì)胞和上清液級分(1ml)樣品兩者。首先將1ml樣品離心(11)，之后分離細(xì)胞沉淀和上清液并在-20℃下分別儲存。儲存上清液用于細(xì)胞外產(chǎn)物分析，而沉淀用于細(xì)胞內(nèi)代謝物分析。
2.5.分析方法
通過在600nm下測量光密度(uvikom922分光光度計，brs，brussel，belgium)或通過用biochromanthoszenyth340微量滴定板讀數(shù)器來頻繁監(jiān)測培養(yǎng)物的細(xì)胞密度。通過將預(yù)干燥和稱重的falcon中的20g反應(yīng)器肉湯離心(15分鐘，5000g，gsa轉(zhuǎn)子，sorvallrc-5b，goffinmeyvis，kapellen，belgium)來獲得細(xì)胞干重。隨后將沉淀用20ml生理溶液(9g/lnacl)洗滌一次并在70℃下干燥至恒重。為了能夠?qū)d600nm測量值轉(zhuǎn)換為生物量濃度，制作od600nm對生物量濃度的相關(guān)曲線。使用在65℃下加熱的配備有1cm預(yù)置柱的aminexhpx-87h柱(bio-rad，eke，belgium)，使用5mmh2so4(0.6ml/分鐘)作為流動相，在varianprostarhplc系統(tǒng)(varian，sint-katelijne-waver，belgium)上測定葡萄糖和有機酸的濃度。使用雙波uv-vis(210nm和265nm)檢測器(varianprostar325)和示差折光率檢測器(mercklachroml-7490，merck，leuven，belgium)進(jìn)行峰檢測。通過將在265nm和210nm兩處的峰吸收相除，可以鑒定峰。除法得到恒定值，其對于某一化合物而言是典型的(beer-lambert公式)。
葡萄糖、果糖、蔗糖、寡糖和葡萄糖-1-磷酸通過具有hypercarb柱的hplc測量，并用msms檢測器檢測(antonio等，2007；nielsen等，2006)。
2.6遺傳方法
用于突變體構(gòu)建的方法描述如下。
將質(zhì)粒保持在宿主大腸桿菌dh5α(f-、
質(zhì)粒。使用可在工業(yè)生物技術(shù)和生物催化實驗室處獲得的酵母表達(dá)質(zhì)粒p2a_2μ_lac4使得酵母屬(saccharomyces)能夠在作為唯一c源的乳糖上生長。該質(zhì)粒包含氨芐青霉素抗性基因和細(xì)菌復(fù)制起點，以允許在大腸桿菌中進(jìn)行選擇和維持。質(zhì)粒還包含2μ酵母ori和ura3選擇標(biāo)志物用于在酵母中選擇和維持。最后，質(zhì)粒包含β-半乳糖苷酶表達(dá)盒(seqid9，圖15)。
突變。突變包括使用p2a_2μ_lac4(如上所述)的質(zhì)粒引入和使用雙鏈線性dna(如上所述)的基因敲入(ki)(在rdna基因座處的ki)。在用質(zhì)粒dna轉(zhuǎn)化后，將轉(zhuǎn)化體鋪在sdcsm-ura上，或者在用雙鏈線性dna轉(zhuǎn)化后，將其鋪在用乳糖作為唯一c源的sdcsm-ura上。通過用匹配p2a_2μ_lac4的引物的pcr驗證具有所選質(zhì)粒的突變體。所選擇的基因組敲入突變體通過用修飾區(qū)上游和下游的引物的pcr驗證并通過測序確認(rèn)(在lgcgenomics(lgcgroup，germany)處進(jìn)行)。
線性雙鏈dna。使用質(zhì)粒pjet_ki_p1_lac12_t@rdna或pjet_ki_p2_lac12_t@rdna通過pcr獲得線性雙鏈dna擴增子。這些質(zhì)粒在pjet克隆載體(thermoscientific)的多克隆位點處分別在seqid7和seqid8的側(cè)翼包含2500bp的同源區(qū)(hr1(seqid10，圖16)和hr2(seqid11，圖17))。所使用的引物與hr1(正向引物)的5’端和hr2的3，端(反向引物)同源。pcr產(chǎn)物在轉(zhuǎn)化前進(jìn)行pcr純化。
轉(zhuǎn)化。使用方法gietz(40)轉(zhuǎn)化質(zhì)粒和線性雙鏈dna。
3.結(jié)果
實施例1：在agp基因座處構(gòu)建大腸桿菌乳糖通透酶lacy敲入
首先，根據(jù)如上所述datsenko和wanner的方法構(gòu)建菌株mg1655δlacy。為此，用pkd46轉(zhuǎn)化mg1655，并由基礎(chǔ)質(zhì)粒pkd3和pkd4構(gòu)建與lacy基因側(cè)翼同源的線性dna。然后用合適的抗生素篩選成功的重組。為了確保在該菌株中不攝取乳糖，在僅含有乳糖作為碳源的基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌株。在該實驗期間未觀察到生長，因此該細(xì)胞不再能夠運輸乳糖通過其膜。
為了進(jìn)一步構(gòu)建合成表達(dá)系統(tǒng)，將合成啟動子和rbs與lacy基因(從idt和geneart訂購)組合一起合成。該序列示于圖3。還通過改編datsenko和wanner方法將該序列在agp基因座處引入到基因組中。簡言之，首先用來自pkd3質(zhì)粒的篩選盒組裝乳糖通透酶構(gòu)建體，得到新質(zhì)粒pcx_lacy-kan。由該質(zhì)粒，可以pcr擴增與agp基因組區(qū)同源的線性dna。然后可將所獲得的線性dna轉(zhuǎn)化到大腸桿菌mg1655δlacy(其中存在pkd46質(zhì)粒)中。這導(dǎo)致乳糖轉(zhuǎn)運蛋白表達(dá)盒重組到基因組中，得到乳糖通透酶表達(dá)生物體mg1655δlacyδagp：：lacy合成。為了確保恢復(fù)在乳糖上的生長，使該菌株在如上所述的乳糖基本培養(yǎng)基上生長。這導(dǎo)致完全恢復(fù)了在乳糖上的生長，生長速率類似于野生型。
實施例2：乳糖對野生型大腸桿菌菌株和不經(jīng)歷乳糖殺傷的突變大腸桿菌菌株的影響
用野生型mg1655和mg1655δlacyδagp：：lacy合成建立如材料和方法中所述的搖瓶實驗。使這些菌株在甘油搖瓶培養(yǎng)基(15g/l甘油，如材料和方法中所述)中生長，并在指數(shù)期中期(約在od0.8處)添加乳糖(添加200g/l儲液，導(dǎo)致最終濃度為10g/l)。由圖1和圖2可以看出，突變菌株不經(jīng)歷乳糖殺傷。
實施例3：使用翻譯偶聯(lián)或翻譯傳感器(translationalsensor)以確保乳糖轉(zhuǎn)運蛋白表達(dá)
由于完全乳糖通透酶敲除菌株也不會經(jīng)歷乳糖殺傷并且目標(biāo)是獲得有功能的、有活性的、表達(dá)的乳糖通透酶，因此需要篩選以確保乳糖通透酶表達(dá)。為此，可以產(chǎn)生啟動子、核糖體結(jié)合位點、kozak序列、密碼子使用和轉(zhuǎn)錄終止子的序列變體。然而，這些序列變體可導(dǎo)致無效表達(dá)構(gòu)建體，因此導(dǎo)致乳糖轉(zhuǎn)運蛋白陰性突變株。因此，需要設(shè)計系統(tǒng)以檢測乳糖轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)，優(yōu)選地通過易于篩選的報道基因如lacz、熒光蛋白或抗生素抗性基因。
重新啟動報道基因的翻譯以檢測乳糖轉(zhuǎn)運蛋白表達(dá)的翻譯偶聯(lián)系統(tǒng)的構(gòu)建
通過在目的基因的3’和報道基因的5’之間引入翻譯重新啟動區(qū)可以翻譯偶聯(lián)兩個基因。翻譯可以通過若干個密碼子重新啟動，例如aug、uug、gug或aua(63)。這樣的構(gòu)建體(其將乳糖通透酶基因和lacz基因翻譯連接)的序列示于圖4。為了產(chǎn)生該序列，用具有g(shù)oldengate限制性位點(bsai，獲自neb)的引物從大腸桿菌基因組中擴增lacy和lacz序列。允許翻譯偶聯(lián)的基因間區(qū)域可以從任何基因合成公司(例如idt或geneart)訂購。然后通過如由engler等(2013)(36)所述的goldengate方法將所有部分與如圖3所示的啟動子和rbs序列(對于大腸桿菌)一起組裝到puc54質(zhì)粒中或與芽孢桿菌啟動子和核糖體結(jié)合位點一起組裝到在芽孢桿菌屬中復(fù)制的pgk12中。
通過打開核糖體結(jié)合位點上的環(huán)來啟動報道基因的翻譯以檢測乳糖轉(zhuǎn)運蛋白表達(dá)的翻譯偶聯(lián)系統(tǒng)的構(gòu)建
mendez-perez等(2012)(58)描述了通過翻譯偶聯(lián)篩選表達(dá)的第二種方法。該方法適用于用氯霉素報道基因篩選乳糖通透酶表達(dá)。在這種情況下，乳糖轉(zhuǎn)運蛋白lacy通過his-標(biāo)簽和核糖體結(jié)合位點與氯霉素抗性基因偶聯(lián)。該構(gòu)建體的序列部分也在idt或geneart處訂購并通過goldengate組裝來組裝。所得序列在圖5中給出。
將酵母乳糖轉(zhuǎn)運蛋白與報道基因偶聯(lián)的翻譯偶聯(lián)系統(tǒng)的構(gòu)建
盡管酵母不使用順反子，但仍可能經(jīng)由病毒內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(所謂的ires序列)(56)通過翻譯偶聯(lián)來篩選表達(dá)。這樣的序列的一個實例是t2a序列(10)，其允許順反子中兩個蛋白質(zhì)的完全獨立(這意味著不是蛋白質(zhì)融合)但偶聯(lián)的翻譯。這意味著如果順反子的最后一個蛋白質(zhì)得到表達(dá)，則第一個蛋白質(zhì)也被表達(dá)。
在酵母中，例如馬克斯克魯維酵母的乳糖通透酶基因可用于在細(xì)胞中運輸乳糖。該基因可以與t2a序列偶聯(lián)至aph1基因，編碼對遺傳霉素的抗性。該序列類似地如上所述構(gòu)建。最終序列在圖6中給出。
將適配體引入乳糖通透酶的信使rna的適配體偶聯(lián)系統(tǒng)的構(gòu)建
乳糖通透酶表達(dá)也可以在信使rna水平上檢測。為此，在如圖7所示的乳糖通透酶編碼序列后克隆(z)-4-(3，5-二氟-4-羥基亞芐基)-1，2-二甲基-1h-咪唑-5(4h)-酮結(jié)合適配體。如實施例6所述進(jìn)一步調(diào)節(jié)該構(gòu)建體的表達(dá)。在細(xì)胞生長后，如由pothoulakis等(2013)(64)所述，將(z)-4-(3，5-二氟-4-羥基亞芐基)-1，2-二甲基-1h-咪唑-5(4h)-酮添加到培養(yǎng)基中，并且通過熒光激活細(xì)胞分選儀(fluorescence-activatedcellsorter，facs)選擇表達(dá)乳糖通透酶的突變株。
實施例4：檢測與氯霉素抗性基因翻譯偶聯(lián)的乳糖轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)
構(gòu)建了兩種菌株，在所述菌株中從基因組中敲除了乳糖通透酶。將包含卡那霉素抗性基因的psc101質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到兩種菌株中，區(qū)別在于質(zhì)粒之一包含如實施例1和2中所述的組成型表達(dá)的乳糖通透酶，得到如實施例4和圖5所述的參考菌株mg1655δlacypsc101_kan和lacy_cat翻譯偶聯(lián)菌株mg1655δlacypsc101_kan_lacy合成_cat。使兩種菌株在如上所述的基本培養(yǎng)基中在不同的氯霉素濃度(在0mg/l和30mg/l之間)下生長。圖8和9顯示在生長48和92小時之后，與突變體lacy_cat翻譯偶聯(lián)菌株相比，參考菌株的生長在更低的氯霉素濃度下受到抑制，這使得這樣的系統(tǒng)能夠優(yōu)異的篩選表達(dá)乳糖通透酶的遺傳構(gòu)建體。
實施例5：不經(jīng)歷乳糖殺傷的表達(dá)乳糖通透酶的突變體的篩選步驟
類似于實施例2，使兩種氯霉素抗性菌株(一種不經(jīng)歷乳糖殺傷且與氯霉素翻譯偶聯(lián)的菌株以及一種具有氯霉素盒但具有乳糖通透酶的天然表達(dá)系統(tǒng)的菌株)的混合物生長。如實施例2所述，使兩種菌株在培養(yǎng)基中生長，并如實施例2所示在指數(shù)期中期添加乳糖。不經(jīng)歷乳糖殺傷的突變株保持生長，而另一種菌株(即，乳糖殺傷敏感的)停止生長。在指數(shù)期結(jié)束時，將0.1ml該培養(yǎng)物接種在具有如上所述相似培養(yǎng)基的第二個搖瓶中。再次，在od0.8處，添加乳糖，阻止乳糖殺傷敏感菌株的生長并進(jìn)一步富集不經(jīng)歷乳糖殺傷的突變株。在該步驟重復(fù)5次后，獲得99％富集的不經(jīng)歷乳糖殺傷的突變株，然后將其容易地從培養(yǎng)物中分離出來。
實施例6：乳糖通透酶表達(dá)盒的突變體的產(chǎn)生
啟動子、核糖體結(jié)合位點、kozak序列、轉(zhuǎn)錄終止子的序列變體和乳糖通透酶基因變體(具有不同的密碼子使用)在基因合成供應(yīng)商(例如idt、geneart、genscript、gen9……)處訂購。細(xì)菌啟動子文庫的設(shè)計基于細(xì)菌啟動子的共有序列，在轉(zhuǎn)錄起始的-10bp和-35bp處具有兩個保守區(qū)。然后，這些保守區(qū)之間、之前和之后的堿基的a、t、g或c隨機變化，導(dǎo)致具有不同表達(dá)強度的啟動子?；蛘?，保守區(qū)發(fā)生改變而周圍序列保持固定，這也導(dǎo)致具有不同強度的啟動子。然后將這些序列混合物克隆(通過gibson組裝、goldengate組裝、cliva組裝、lcr或限制性連接)(25，36，50，79)到翻譯偶聯(lián)的乳糖通透酶之前，得到可通過實施例5中所述的篩選方案篩選的乳糖通透酶的表達(dá)盒文庫。
基于核心啟動子創(chuàng)建真核啟動子文庫(13)。對于釀酒酵母，該啟動子可以是異源tef啟動子ptef1，其用uas序列增強并且被突變以改變啟動子強度(12)。訂購這樣的啟動子并如上所述將其克隆到翻譯偶聯(lián)的乳糖通透酶之前，并將最終構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到酵母如釀酒酵母中，在質(zhì)粒上或整合到染色體中。
非翻譯區(qū)對于原核生物有核糖體結(jié)合位點組成，對于真核生物由kozak序列組成。使兩個序列隨機化并如上所述將其克隆到編碼序列之前，得到具有不同翻譯效率的表達(dá)盒文庫?？梢允褂弥T如計算序列翻譯效率相關(guān)性的rbs計算器等工具使隨機化合理化，并減少必須包括在文庫中的變體的數(shù)量(67)。
通過改變基因的編碼序列而不改變蛋白質(zhì)的氨基酸序列來改變密碼子使用。這被稱為密碼子適應(yīng)。整個密碼子序列中的密碼子使用以這樣的方式改變：在某些區(qū)域中引入更多或更少稀有密碼子，導(dǎo)致表達(dá)效率和折疊效率改變。在其序列中僅具有稀有密碼子(通過密碼子使用數(shù)據(jù)庫(61)在生物體基礎(chǔ)上確定)的通透酶較具有完全密碼子優(yōu)化序列的通透酶(僅具有在靶生物體中具有高發(fā)生率的密碼子)顯示出更低的翻譯速率。此外，編碼序列的第一密碼子也影響kozak或核糖體結(jié)合位點效率(62，69，78)。
通過數(shù)據(jù)庫中存在的內(nèi)源或外源轉(zhuǎn)錄終止子序列改變轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)域(18，26)。這些轉(zhuǎn)錄終止子也類似于上述方法進(jìn)行克隆。
實施例7：表達(dá)乳糖通透酶并且不導(dǎo)致乳糖殺傷的表達(dá)盒的富集
根據(jù)實施例3和7創(chuàng)建表達(dá)盒。這得到乳糖通透酶的表達(dá)盒的文庫。根據(jù)實施例3和4的方法選擇導(dǎo)致乳糖通透酶表達(dá)的表達(dá)盒。根據(jù)實施例2和5所述的方法選擇不導(dǎo)致乳糖殺傷的表達(dá)乳糖通透酶的表達(dá)盒。通過測序和通過實施例2中所述的方法進(jìn)一步分析所選擇的表達(dá)盒。
實施例8：用來源于幽門螺桿菌(helicobacterpylori)的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶與大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)2-巖藻糖基乳糖
將突變株(其中敲除基因lacz、glgc、agp、pfka、pfkb、pgi、arca、iclr、wcaj并且如實施例1和實施例2中所述通過組成型表達(dá)表達(dá)lacy以確保在所有培養(yǎng)條件下的表達(dá))用來源于幽門螺桿菌的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶和來自青春雙岐桿菌(bifidobacteriumadolescentis)的蔗糖磷酸化酶進(jìn)一步轉(zhuǎn)化，所述巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶和所述蔗糖磷酸化酶也是組成型表達(dá)的。組成型啟動子來源于由demey等2007年所述的啟動子文庫。將該菌株在如材料和方法中所述但具有30g/l蔗糖和50g/l乳糖的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。這導(dǎo)致形成高達(dá)1.5g/l的2’-巖藻糖基乳糖。
實施例9：用大腸桿菌補料分批生產(chǎn)2-巖藻糖基乳糖
通過上述基因工程方法構(gòu)建具有以下基因型的突變株：δlaczyaδglgcδagpδpgiδpfka-p22-baspδpfkbδarcaδiclr：：slδwcajδlonδadhe-p14-frk+pcxp14-ft_幽門螺桿菌(具有序列seqidn°6的載體，參見圖10)，其中如實施例1和實施例2中所述改變?nèi)樘峭ㄍ该副磉_(dá)。啟動子p22和p14來源于由demey等(29)構(gòu)建的啟動子文庫，并且與aerts等(1)所述的方法類似地進(jìn)行克隆?！埃海簊l”標(biāo)記無痕基因缺失，因此沒有保留在染色體中的frt位點。
將該菌株在如以上材料和方法中所述的生物反應(yīng)器中在具有30g/l蔗糖和50g/l乳糖的無機培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。在分批階段后，向生物反應(yīng)器供應(yīng)500g/l蔗糖、50g/l乳糖和1g/l硫酸鎂七水合物。這導(dǎo)致在上清液中積累27.5g/l的巖藻糖基乳糖。
實施例10：用大腸桿菌生產(chǎn)乳糖基n三糖
通過基因工程用上述方法構(gòu)建突變株，所述突變株在pbr322質(zhì)粒上表達(dá)udp-n-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶、蔗糖磷酸化酶和l-谷氨酰胺：d-果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶和葡糖胺尿苷酰轉(zhuǎn)移酶，所述質(zhì)粒各自具有來自demey等(29)的啟動子文庫的組成型啟動子以及具有β-內(nèi)酰胺酶選擇標(biāo)志物。將該載體在具有如上所述組成性表達(dá)乳糖通透酶的基因型δlaczyaδglgcδagp：：p14-frk-p22-baspδpgiδpfkaδpfkbδnagabcdeδmanaδnanatekδmanxyz的大腸桿菌突變株中轉(zhuǎn)化。將該菌株在如上所述具有乳糖和蔗糖作為碳源的有或沒有另外的甘油的搖瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。該生產(chǎn)宿主不經(jīng)歷乳糖殺傷并且由添加的乳糖分別產(chǎn)生62.5mg/l和55.3mg/l乳糖基n三糖。
實施例11：在rdna基因座處構(gòu)建馬克斯克魯維酵母乳糖通透酶(p1)敲入
首先，質(zhì)粒p2a_2μ_lac4用于轉(zhuǎn)化到釀酒酵母by4742野生型菌株中。使用gietz方案(40)使用總計4μg的質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化。將轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞鋪在sd-csm漏失板(不含尿嘧啶)上。兩天后，在板上觀察到生長，并對酵母菌落中期望質(zhì)粒的存在進(jìn)行測試。在所有33個菌落上進(jìn)行菌落pcr。所有菌落對質(zhì)粒p2a_2μ_lac4的存在測試為陽性。選擇菌落5用于進(jìn)一步使用。用2μg獲得自pjet_ki_p1_lac12_t@rdna的雙鏈線性dna轉(zhuǎn)化該菌落。將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞鋪在具有乳糖作為唯一c源的sd-csm-ura板上。轉(zhuǎn)化后3天，使幾個菌落充分生長以測試酵母屬rdna中l(wèi)ac12表達(dá)盒的存在。對所有菌落進(jìn)行菌落pcr。所有菌落對lac12表達(dá)盒的存在測試為陽性。選擇菌落6用于進(jìn)一步使用(酵母菌ki_p1_lac12_t@rdna)。
實施例12：在rdna基因座處構(gòu)建馬克斯克魯維酵母乳糖通透酶(p2)敲入
首先，質(zhì)粒p2a_2μ_lac4用于轉(zhuǎn)化到釀酒酵母by4742野生型菌株中。使用gietz方案(40)使用總計4μg的質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化。將轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞鋪在sd-csm漏失板(不含尿嘧啶)上。兩天后，在板上觀察到生長，并對酵母菌落中期望質(zhì)粒的存在進(jìn)行測試。在所有33個菌落上進(jìn)行菌落pcr。所有菌落對質(zhì)粒p2a_2μ_lac4的存在測試為陽性。選擇菌落5用于進(jìn)一步使用。用2μg獲得自pjet_ki_p2_lac12_t@rdna的雙鏈線性dna轉(zhuǎn)化該菌落。將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞鋪在具有乳糖作為唯一c源的sd-csm-ura板上。轉(zhuǎn)化后3天，使幾個菌落充分生長以測試酵母屬rdna中l(wèi)ac12表達(dá)盒的存在。對所有菌落進(jìn)行菌落pcr。所有菌落對lac12表達(dá)盒的存在測試為陽性。選擇菌落7用于進(jìn)一步使用(酵母屬ki_p2_lac12_t@rdna)。
實施例13：野生型酵母菌株和2種突變酵母菌株在乳糖上的生長
用野生型克魯維酵母、酵母菌ki_p1_lac12_t@rdna和酵母菌ki_p2_lac12_t@rdna建立如材料和方法中所述的搖瓶實驗。這些菌株在包含乳糖(20g/l)作為唯一c源的搖瓶培養(yǎng)基中生長。從表1中可以看出，突變釀酒酵母菌株與野生型乳酸馬克斯克魯維酵母生長一樣快，所述乳酸馬克斯克魯維酵母已知在乳糖上快速生長(31)。因此，組成型表達(dá)的乳糖通透酶確保了酵母細(xì)胞中乳糖的快速且有效流入。
表1
實施例14：乳糖對野生型酵母菌株和不經(jīng)歷乳糖殺傷的突變酵母菌株的影響
用野生型克魯維酵母、酵母菌ki_p1_lac12_t@rdna和酵母菌ki_p2_lac12_t@rdna建立如材料和方法中所述的搖瓶實驗。這些菌株在葡萄糖搖瓶培養(yǎng)基(20g/l葡萄糖，如材料和方法中所述)中生長，并且在指數(shù)期中期添加乳糖(添加200g/l儲液，導(dǎo)致10g/l的最終濃度)。從圖11和圖12中可以看出，突變株不經(jīng)歷乳糖殺傷。然而，在實施例13中證明了這些酵母細(xì)胞中乳糖的快速且有效流入。
實施例15：不經(jīng)歷乳糖殺傷的乳糖通透酶表達(dá)盒的測序
對來源于上述篩選的46個菌落進(jìn)行測序，得到seqidn°12-57(圖18)。這些序列是當(dāng)在大腸桿菌中表達(dá)時不導(dǎo)致乳糖殺傷的啟動子和rbs變體。注意，這是對大量已被測序的菌落的選擇，因此，篩選方法已導(dǎo)致較圖18中所示的多得多的序列，并且如上所述的替代文庫創(chuàng)建方法也將導(dǎo)致除圖18中所示的那些之外的其他序列。
實施例16：乳糖通透酶表達(dá)盒突變株的μmax的測定
所有菌株從lb-瓊脂板開始或從冷凍管開始并接種在5.0mlluria肉湯培養(yǎng)基(10g胰蛋白胨；5g酵母提取物；10gnacl)中。在37℃下過夜(o/n)生長后，將1ml該預(yù)培養(yǎng)物添加到包含100mlph7.0基本乳糖培養(yǎng)基(2.0g/lnh4cl；5.0g/l；(nh4)2so4；3.0g/lkh2po4.7.3g/lk2hpo4；8.4g/lmops；0.5g/lmgso4×7h2o；0.5g/lnacl；10g/l乳糖；0.4mg/lna2edta×2h2o；0.03mg/lh3bo3；1.01mg/l硫胺素hcl；0.94mg/lzncl2；0.5mg/lcocl2×6h2o；0.38mg/lcucl2×2h2o；1.59mg/lmncl2×4h2o；3.6mg/lcacl2和0.096mg/lna2moo4×2h2o)的500ml搖瓶中。在37℃下過夜生長后，將兩種預(yù)培養(yǎng)物用基本乳糖培養(yǎng)基稀釋至od600為0.050。然后將懸液轉(zhuǎn)移至96mtp板(n＝32)，用易密封蓋覆蓋。使用infinitem200pro(tecan)在以下條件下每10分鐘進(jìn)行od測量持續(xù)24小時：溫度：37℃+/-0.5；搖動597秒；2mm搖動幅度；280rpm；波長od600；閃光#10；停止時間150毫秒)。
實施例17：乳糖通透酶表達(dá)盒的表征
減少或消除乳糖殺傷的一種方法是顯著降低或消除乳糖通透酶的活性(參見實施例16)。然而，鑒于生產(chǎn)基于乳糖或半乳糖的生物產(chǎn)品，需要進(jìn)入細(xì)胞中的高乳糖通量。在此，證明了乳糖殺傷抗性突變株的乳糖通量與經(jīng)歷乳糖殺傷的野生型生物體的乳糖通量相比仍然可比、相等或者甚至更高。為此，將新的乳糖通透酶表達(dá)盒引入到仍然表達(dá)β-半乳糖苷酶的mg1655δlacy菌株中。這些新菌株的生長速率是乳糖通量的度量，因為在乳糖通透酶表達(dá)中具有顯著降低的表達(dá)的任何菌株將具有顯著降低的生長速率。
該分析的結(jié)果示于圖19中。該圖中示出的幾乎所有菌株具有等于或高于野生型的生長速率，表明等于或高于野生型的乳糖通透酶活性和表達(dá)，然而，與野生型表達(dá)系統(tǒng)形成對比，這些表達(dá)盒不導(dǎo)致乳糖殺傷。然而，該方法受β-半乳糖苷酶基因表達(dá)(其成為生長的限速步驟)限制。因此，通過上述的上述翻譯偶聯(lián)系統(tǒng)測量乳糖通透酶基因的表達(dá)。氯霉素的最小抑制濃度(minimalinhibitionconcentration，mic)指示乳糖通透酶基因的表達(dá)，并且對于每個盒測定最小抑制濃度。使用與野生型相比仍然導(dǎo)致相同生長速率的最低mic作為表達(dá)野生型乳糖通透酶表達(dá)的指示。
與野生型菌株相同的生長速率的具有最低mic的盒具有約20mg/l氯霉素的mic。具有略低生長速率的突變株具有15mg/l至20mg/l的mic，并且具有相等或更高生長速率的突變株具有20mg/l至80mg/l的mic。85％的序列屬于后一種，這意味著鑒定為乳糖殺傷陰性表達(dá)盒的大多數(shù)序列具有較高的乳糖通透酶表達(dá)，與文獻(xiàn)中先前描述的相反。
實施例18：laciq啟動子表達(dá)盒的構(gòu)建
與上述方法類似，將placiq啟動子克隆到大腸桿菌lacy基因之前。該構(gòu)建體的最終序列示于圖20中。
實施例19：經(jīng)歷乳糖殺傷的本領(lǐng)域中使用的其他啟動子
啟動子placiq是本領(lǐng)域中用于在大腸桿菌中表達(dá)乳糖通透酶的啟動子。該啟動子的使用導(dǎo)致乳糖攝取到細(xì)胞中。然而，未測試這樣的攝取的效果。野生型在乳糖上的生長速率與laciq啟動子(μmax分別為0.1和0.11小時-1)沒有顯著差異，因此表明類似的乳糖攝取速率。該laciq表達(dá)盒的乳糖殺傷篩選證明該啟動子也導(dǎo)致乳糖殺傷(參見圖21)。這證明存在導(dǎo)致乳糖殺傷的特定啟動子序列和不導(dǎo)致乳糖殺傷的其他序列。序列的合理化是不可能的，并且單個序列的反復(fù)試驗是一項費力的工作，這將導(dǎo)致巨大的成本，因此，上述用于鑒定不經(jīng)歷乳糖殺傷的表達(dá)盒的方法是避免冗長且昂貴的篩選工作的完美方法。
實施例20：用釀酒酵母生產(chǎn)乳糖基n四糖
例如如由lee等(52)所述，將實施例11和12中構(gòu)建的突變株進(jìn)一步用來源于腦膜炎奈瑟菌(neisseriameningitidis)的β-1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和β-1，3-n-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶使用標(biāo)準(zhǔn)酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化，所述酶也是組成型表達(dá)的。將菌株培養(yǎng)在如材料和方法中所述但具有20g/l蔗糖和20g/l乳糖的培養(yǎng)基中。這導(dǎo)致形成高至30mg/l的乳糖基n四糖。
實施例21：用釀酒酵母生產(chǎn)2-巖藻糖基乳糖
例如如由lee等(52)所述，將實施例11和12中構(gòu)建的突變株進(jìn)一步用大腸桿菌的gdp-巖藻糖合酶和gdp-甘露糖4，6-脫水酶和來源于幽門螺桿菌的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶使用標(biāo)準(zhǔn)酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化，所述酶也是組成型表達(dá)的。將菌株培養(yǎng)在如材料和方法中所述但具有20g/l蔗糖和20g/l乳糖的培養(yǎng)基中。這導(dǎo)致形成高至10mg/l的2巖藻糖基乳糖。
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