液體乳糖酶組合物的制作方法【專利摘要】本發(fā)明提供含水的液體乳糖酶制劑，所述乳糖酶制劑包含乳糖酶并且還包含L?乳酸鈉、L?乳酸鈣或L?乳酸鉀或其組合和任選地糖，和/或任選地包含氯化鈉或氯化鉀或其組合，優(yōu)選地其中每種組分的濃度使得水活性Aw為至多0.82。該制劑在使用不含轉(zhuǎn)化酶的乳糖酶時(shí)是特別合適的，從而允許使用蔗糖作為穩(wěn)定劑。本發(fā)明還提供生產(chǎn)本發(fā)明的液體乳糖酶制劑的方法、包含本發(fā)明的液體乳糖酶制劑的嬰兒配方(例如，作為顆粒粉末)、生產(chǎn)所述嬰兒配方的方法、以及所述制劑在生產(chǎn)嬰兒配方中的用途。【專利說明】液體乳糖酶組合物發(fā)明領(lǐng)域[0001]本發(fā)明涉及液體乳糖酶制劑;其生產(chǎn)方法;生產(chǎn)嬰兒（infant，亦稱一段)配方、較大嬰兒(follow-on，亦稱二段)配方或幼兒(toddler，亦稱三段)配方的方法;包含乳糖酶制劑的嬰兒配方、較大嬰兒配方或幼兒配方;和所述制劑在生產(chǎn)嬰兒配方、較大嬰兒配方或幼兒配方中的用途。[0002]發(fā)明背景[0003]乳糖酶或β-半乳糖苷酶(E.C:3.2.1.23)是催化乳糖(二糖)水解成其組分單糖葡萄糖和半乳糖的酶。乳糖酶存在于乳制品中，更具體地乳、脫脂乳、奶油、酸奶、冰激凌和其他乳制品中。[0004]在青少年和乳糖耐受人群中，乳糖在空腸的小腸刷狀緣處被"乳糖酶-根皮苷水解酶"（LPH)水解為半乳糖和葡萄糖。在人類中，LPH由單個(gè)乳糖酶基因LCT編碼，且已發(fā)現(xiàn)成人消化乳糖的能力歸因于基因表達(dá)的順式作用突變并且以顯性方式遺傳。與單糖（即，葡萄糖和半乳糖)相比，乳糖在小腸的吸收很差。未攜帶LCT基因突變的人不能消化和吸收乳糖，且吸收不良的乳糖將以滲透方式吸引流體進(jìn)入腸腔，這將導(dǎo)致便溏。此外，乳糖是代謝其的結(jié)腸中的腸道細(xì)菌的底物，從而產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸和氣體例如二氧化碳、氫氣和甲烷，進(jìn)而導(dǎo)致腸胃氣脹和痙攣。目前估計(jì)僅25-30%的世界人口攜帶LCT基因突變并且在成年期還能夠在小腸中消化乳糖。剩余的世界人口具有不同的乳糖消化問題，這往往導(dǎo)致乳制品攝入減少。這類個(gè)體被稱為"乳糖不耐受者"。由于乳制品中存在一些維生素、蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)，所以其是健康飲食的重要組分，因此上述情況是不想要的。[0005]已經(jīng)關(guān)于多種生物體(包括微生物)描述并從其中分離了乳糖酶。乳糖酶往往是微生物（如Kluyveromyces和Bacillus)的細(xì)胞內(nèi)組分。Kluyveromyces和，特別地，1(.；1^&8；[1丨8、1(.1]1&^丨&11118和1(.1&(31：丨8以及其他酵母，例如0&11(1丨(1&、1'〇1'111&和1'〇1'111(^818屬的那些，是酵母乳糖酶的常見來源，而B.coagulans或Bcirculans是眾所周知的細(xì)菌乳糖酶來源。一些來源于這些生物體的商業(yè)乳糖酶制品是可得的，例如Maxilact(來自K.lactis，由DSM，Delft，荷蘭生產(chǎn)）。所有這些乳糖酶均是所謂的中性乳糖酶，因?yàn)樗鼈兊淖钸mpH介于pH=6和pH=8之間，一些生物體例如Aspergillusniger和Aspergillusoryzae能夠生產(chǎn)細(xì)胞外乳糖酶，且美國(guó)專利號(hào)5736374描述了由Aspergillusoryzae生產(chǎn)的此類乳糖酶的實(shí)例。乳糖酶的酶學(xué)性質(zhì)（如最適pH和最適溫度）因物種而異。一般而言，然而，分泌的乳糖顯示出pH=3.5至pH=5.0的較低最適pH(酸性乳糖酶）；對(duì)于中性乳糖酶，細(xì)胞內(nèi)乳糖酶通常顯示出在pH=6.0至pH=7.5區(qū)域的較高最適pH，但這些一般規(guī)則存在例外。[0006]目前，乳糖酶以液體形式配制和商業(yè)銷售。在生產(chǎn)液體制劑時(shí)，有兩個(gè)因素至關(guān)重要，即微生物穩(wěn)定性和酶穩(wěn)定性。微生物穩(wěn)定性表示液體制劑保持不含微生物，或者至少微生物的生長(zhǎng)被阻止或減慢。[0007]市場(chǎng)上目前有一些液體乳糖酶產(chǎn)品。它們(僅中性乳糖酶）的實(shí)例有由Novozymes出售的LactozymPure6500L;由Chr.Hansen出售的Ha-Lactase5200;由DuPont-Danisco出售的GODOYNL-2;由DSMFoodSpecialties出售的LGX5000和LGi。所有以上產(chǎn)品，且事實(shí)上目前市場(chǎng)上的所有液體乳糖酶制劑均含50%甘油。已發(fā)現(xiàn)甘油能夠提供同時(shí)良好的微生物穩(wěn)定性和酶穩(wěn)定性。甘油的量使得水活性(Aw)為至多0.82。這防止微生物生長(zhǎng)。此外，甘油還提供酶穩(wěn)定性。商業(yè)乳糖酶溶液的典型強(qiáng)度為約1000NLU/g、2000NLU/g或5000NLU/g。術(shù)語(yǔ)NLU/g指的是每克終產(chǎn)物中乳糖酶活性的量。[0008]乳糖酶的一種重要工業(yè)應(yīng)用是生產(chǎn)用于乳糖不耐受個(gè)體的乳糖經(jīng)水解的乳制品。這種經(jīng)水解的乳制品包括巴士滅菌乳、UHT-乳、利用或者不利用中間處理步驟(例如蛋白質(zhì)水解）由其原始成分的全部或者部分復(fù)原的乳，和嬰兒配方。[0009]乳糖酶的一種特別有趣的應(yīng)用是嬰兒配方、較大嬰兒配方或幼兒配方。嬰兒配方是為喂養(yǎng)小于12個(gè)月的嬰兒和嬰孩(baby)而設(shè)計(jì)和銷售的制造食品，其通常由粉末(與水混合)或液體(含有或不含附加水)被制備用于奶瓶喂養(yǎng)或杯子喂養(yǎng)。美國(guó)聯(lián)邦食品、藥物與化妝品法案(FrocA)將嬰兒配方定義為"由于其模擬人乳或者其適合作為人乳的完全或部分替代物，聲稱是或者展示為單獨(dú)作為嬰兒食品的特殊飲食的食品"。最常用的嬰兒配方含有純化的牛乳清和酪蛋白作為蛋白質(zhì)來源，植物油共混物作為脂肪來源，乳糖作為碳水化合物來源，維生素-礦物質(zhì)混合物，和其他成分(取決于制造商）。[0010]目前可得的乳糖酶制劑的一個(gè)問題是:在許多國(guó)家，法律禁止向嬰兒、較大嬰兒或幼兒配方中添加甘油或其中遺留甘油。這使得目前的乳糖酶制劑(均包含甘油)不適合用來生產(chǎn)嬰兒配方、較大嬰兒配方或幼兒配方。因此，需要適合嬰兒配方、較大嬰兒配方或幼兒配方的且實(shí)質(zhì)上不含甘油的穩(wěn)定的液體乳糖酶制劑。[0011]發(fā)明概述[0012]本發(fā)明提供穩(wěn)定的含水的液體乳糖酶制劑，其適合用于嬰兒配方、較大嬰兒配方或幼兒配方且不含甘油。所述穩(wěn)定的乳糖酶制劑包含至少20重量％的1^_乳酸鈉、L-乳酸鈣或L-乳酸鉀或其組合，優(yōu)選地其中每種組分的濃度使得水活性Aw為至多0.82。所述制劑中任選的組分的一種實(shí)例是糖。所述制劑中任選的組分的另一實(shí)例是氯化鈉或氯化鉀或其組合。所述制劑中組合的任選的組分的一種實(shí)例是氯化鈉或氯化鉀或其組合以及糖。所述制劑在使用不含轉(zhuǎn)化酶的乳糖酶時(shí)是特別合適的，從而允許使用蔗糖作為穩(wěn)定劑。本發(fā)明還提供生產(chǎn)本發(fā)明的液體乳糖酶制劑的方法，包含本發(fā)明的液體乳糖酶制劑的嬰兒配方、較大嬰兒配方或幼兒配方(例如，作為顆粒粉末），生產(chǎn)所述嬰兒配方、較大嬰兒配方或幼兒配方的方法，以及所述制劑在生產(chǎn)嬰兒配方、較大嬰兒配方或幼兒配方中的用途。[0013]發(fā)明詳述[0014]除非另外指出，描述本發(fā)明的內(nèi)容時(shí)，不使用數(shù)量詞時(shí)應(yīng)解釋為涵蓋單數(shù)和復(fù)數(shù)。提及單數(shù)名詞(例如，化合物、細(xì)胞等）旨在包括復(fù)數(shù)。[0015]在第一方面，本發(fā)明提供含水的液體乳糖酶制劑，所述乳糖酶制劑包含乳糖酶并且還包含至少20重量％的卜乳酸鈉、L-乳酸鈣或L-乳酸鉀或其組合，優(yōu)選地其中每種組分的濃度使得水活性Aw為至多0.82。優(yōu)選地，本發(fā)明提供含水的液體乳糖酶制劑，所述乳糖酶制劑包含乳糖酶并且還包含至少20重量％的1^_乳酸鈉、L-乳酸鈣或L-乳酸鉀或其組合，其中每種組分的濃度使得水活性Aw為至多0.82。[0016]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供含水的液體乳糖酶制劑，所述乳糖酶制劑包含乳糖酶并且還包含至少20重量％的1^-乳酸鈉、L-乳酸鈣或L-乳酸鉀或其組合，并且還包含糖，優(yōu)選地其中每種組分的濃度使得水活性Aw為至多0.82。優(yōu)選地，本發(fā)明提供含水的液體乳糖酶制劑，所述乳糖酶制劑包含乳糖酶并且還包含至少20重量％的1^_乳酸鈉、L-乳酸鈣或L-乳酸鉀或其組合，并且還包含糖，其中每種組分的濃度使得水活性Aw為至多0.82。[0017]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供含水的液體乳糖酶制劑，所述乳糖酶制劑包含乳糖酶并且還包含至少20重量％的1^-乳酸鈉、L-乳酸鈣或L-乳酸鉀或其組合，并且還包含氯化鈉或氯化鉀或其組合，優(yōu)選地其中每種組分的濃度使得水活性Aw為至多0.82。優(yōu)選地，本發(fā)明提供含水的液體乳糖酶制劑，所述乳糖酶制劑包含乳糖酶并且還包含至少20重量％的L-乳酸鈉、L-乳酸鈣或L-乳酸鉀或其組合，并且還包含氯化鈉或氯化鉀或其組合，其中每種組分的濃度使得水活性Aw為至多0.82。[0018]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供含水的液體乳糖酶制劑，所述乳糖酶制劑包含乳糖酶并且還包含至少20重量％的1^-乳酸鈉、L-乳酸鈣或L-乳酸鉀或其組合，并且還包含糖，并且還包含氯化鈉或氯化鉀或其組合，優(yōu)選地其中每種組分的濃度使得水活性Aw為至多0.82。優(yōu)選地，本發(fā)明提供含水的液體乳糖酶制劑，所述乳糖酶制劑包含乳糖酶并且還包含至少20重量％的1^-乳酸鈉、L-乳酸鈣或L-乳酸鉀或其組合，并且還包含糖，并且還包含氯化鈉或氯化鉀或其組合，其中每種組分的濃度使得水活性Aw為至多0.82。[0019]發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn):不使用甘油時(shí)，酶穩(wěn)定的液體酶制劑是可行的。優(yōu)選地，所述液體酶制劑還是微生物穩(wěn)定的。他們發(fā)現(xiàn)：當(dāng)乳糖酶被配制為包含至少20重量％的1^_乳酸鈉、L-乳酸鈣或L-乳酸鉀(優(yōu)選L-乳酸鈉)或其組合和任選地糖和/或任選地包含氯化鈉或氯化鉀或其組合和任選地乳清蛋白，且水活性為至多0.82的液體時(shí)，酶穩(wěn)定性良好。此外，微生物穩(wěn)定性也良好。因?yàn)槿樘敲缸陨聿⒉皇呛芊€(wěn)定，所以這更加令人驚訝。[0020]酶穩(wěn)定性是對(duì)酶活性下降速率的測(cè)量。微生物穩(wěn)定性是對(duì)微生物能夠在組合物中繁殖和生長(zhǎng)的速率的測(cè)量。[0021]本發(fā)明的乳糖酶制劑優(yōu)選地適用于嬰兒配方、較大嬰兒配方或幼兒配方。換言之，乳糖酶制劑可用于生產(chǎn)嬰兒配方、較大嬰兒配方或幼兒配方的方法中。為此，本發(fā)明的乳糖酶制劑優(yōu)選地實(shí)質(zhì)上不含多元醇或二醇，更優(yōu)選地不含甘油和/或山梨醇。甘油的量，優(yōu)選地甘油和山梨醇的量?jī)?yōu)選地少于45重量％、少于40重量％、更優(yōu)選地少于35重量％、少于30重量％、少于25重量％、更優(yōu)選地少于20重量％、少于15重量％、甚至更優(yōu)選地少于10重量％、少于5重量％。最優(yōu)選地，乳糖酶不含甘油或任何其他多元醇或二醇。[0022]本發(fā)明的乳糖酶制劑優(yōu)選地還不含例如山梨酸酯和/或苯甲酸酯和/或?qū)αu基苯甲酸酯(對(duì)羥基苯甲酸鹽的烷基酯）的化合物(防腐劑）。[0023]本發(fā)明的乳糖酶制劑的組分（即，穩(wěn)定劑例如L-乳酸鈉、L-乳酸鈣或L-乳酸鉀、糖、氯化鈉或氯化鉀）以一定量添加以使得水活性Aw為至多0.82。各個(gè)組分的水活性是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，且描述在手冊(cè)中。本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識(shí)到可以改變和更換制劑中各組分的量以使得水活性保持至多0.82。各組分總體對(duì)水活性的貢獻(xiàn)是各個(gè)組分的貢獻(xiàn)之和，即效果是累加的。在本文中使用時(shí)，水活性指的是在25°C下測(cè)量的值。相對(duì)低的水活性可有助于獲得期望的微生物穩(wěn)定性。在本專利申請(qǐng)的上下文中，術(shù)語(yǔ)"水活性"用來明確地表達(dá)不含或含少量甘油或任何其他多元醇或二醇的貨架穩(wěn)定的(shelf-stable)乳糖酶制劑。[0024]術(shù)語(yǔ)"含水的液體乳糖酶制劑"包括包含水，例如至少20重量％的水、例如至少30重量％或40重量％的水的任何組合物或溶液。[0025]本發(fā)明的乳糖酶制劑(或乳糖酶制品：這些術(shù)語(yǔ)在本文中可交換使用)包含至少20重量％的1^_乳酸鈉、L-乳酸鈣或L-乳酸鉀或其組合。乳糖酶制劑可因此包含至少20重量％的L-乳酸鈉或至少20重量％的!^-乳酸鈣或至少20重量％的!^-乳酸鉀或其組合，例如至少20重量％的1^_乳酸鈉和L-乳酸鈣或至少20重量％的!^-乳酸鈉和L-乳酸鉀或至少20重量％的L-乳酸鈣和L-乳酸鉀或至少20重量％的!^-乳酸鈉、L-乳酸鈣和L-乳酸鉀。如果是乳酸鹽的組合，則特征"至少20重量％"指的是各個(gè)L-乳酸鹽的組合濃度。[0026]乳酸鈉是乳酸的鈉鹽。乳酸鈣和乳酸鉀分別是乳酸的鈣鹽和鉀鹽。一般而言，乳酸鹽(例如乳酸鈉、乳酸鈣和乳酸鉀)是源于乳酸中和的鹽且大部分商業(yè)用乳酸是由不含乳品的產(chǎn)品（例如，玉米淀粉、土豆或糖蜜)發(fā)酵的?？深~外使用糖或木薯粉。然而，一些乳酸是由乳品產(chǎn)品（例如乳清和乳糖)發(fā)酵的。乳清由多于6.5%固體構(gòu)成，所述固體中4.8%是固體乳糖。在某些乳品產(chǎn)品制造期間，當(dāng)乳清本身作為廢物產(chǎn)生時(shí)，廢乳清通常用來生產(chǎn)乳酸。[0027]乳酸鈉、乳酸鈣或乳酸鉀可以以D型、L型或DL型存在。優(yōu)選地，僅使用L型。然而，提到L-乳酸鈉、L-乳酸鈣或L-乳酸鉀并不排除少量例如D-乳酸鈉、D-乳酸鈣或D-乳酸鉀(或者DL-乳酸鈉、DL-乳酸鈣或DL-乳酸鉀）的存在。少量D型乳酸鈉、乳酸鈣或乳酸鉀的量等于或低于L型貯存物(stock)中存在的總D型乳酸鹽的量的5%、優(yōu)選地等于或低于L型貯存物中存在的總D型乳酸鹽的量的3%。優(yōu)選地，使用的L乳酸鹽是L乳酸鈉。[0028]除了乳糖酶和至少20重量％的卜乳酸鈉、L-乳酸鈣或L-乳酸鉀或其組合之外，本發(fā)明的乳糖酶制劑可還包含糖。優(yōu)選地，所述糖是蔗糖、果糖、葡萄糖或乳糖或其組合，更優(yōu)選地所述糖是蔗糖。所用L-乳酸鹽和糖的濃度應(yīng)選擇為使得水活性Aw為至多0.82。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定合適濃度而無需任何過度負(fù)擔(dān)。果糖僅用于在較大嬰兒配方或幼兒配方中使用的乳糖酶制品。[0029]除了乳糖酶和至少20重量％的卜乳酸鈉、L-乳酸鈣或L-乳酸鉀或其組合之外，本發(fā)明的乳糖酶制劑可還包含氯化鈉或氯化鉀或其組合。再次，選擇各自的濃度以使得水活性Aw為至多0.82。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定合適濃度而無需任何過度負(fù)擔(dān)。[0030]本發(fā)明的乳糖酶制劑可還包含蛋白質(zhì)，優(yōu)選地乳清蛋白。液體制劑中乳清蛋白的量?jī)?yōu)選地介于l_15g/l之間（以β-乳球蛋白測(cè)量），更優(yōu)選地介于3-12g/l之間，更優(yōu)選地介于4-6g/l之間。[0031]制劑中的乳糖酶優(yōu)選地是中性乳糖酶。本發(fā)明的制劑中乳糖酶(優(yōu)選地中性乳糖酶）的濃度可以是500_15000NLU/g之間的任何值，且典型地是1000NLU/g、2000NLU/g或5000NLU/g。中性乳糖酶優(yōu)選地在pH介于6-9之間，優(yōu)選地pH介于7-8之間或更優(yōu)選地pH介于6.5-7.5之間時(shí)是活性的，或者具有其最佳活性。[0032]根據(jù)FCC(第六版，2008,第1124-1126頁(yè)：乳糖酶（中性)β-半乳糖苷酶活性）中所述程序，使用〇-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(0NPG)作為底物，以中性乳糖酶單位(NLU)測(cè)定乳糖酶活性。[0033]本發(fā)明的制劑中的乳糖酶優(yōu)選地是細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的中性乳糖酶，在這種情況下，通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法從其宿主細(xì)胞中提取中性乳糖酶。[0034]中性乳糖酶已經(jīng)被描述并且從多種生物體(包括微生物）中分離。乳糖酶常常是微生物（如Kluyveromyces和Baci1lus)的細(xì)胞內(nèi)組分。Kluyveromyces以及特別地Κ·fragi1is和K.lacti，和其他酵母，例如Candida、Torula和Torulopsis屬的那些，是酵母乳糖酶的常見來源，而B.coagulans、B.circulans或乳酸菌是眾所周知的細(xì)菌乳糖酶來源。一些來源于這些生物體的商業(yè)乳糖酶制品是可得的，例如Maxiiact?(來自K.lactis,由DSM，Delft,荷蘭生產(chǎn)）。優(yōu)選地，本發(fā)明的乳糖酶制劑包含中性Kluyveromyceslactis乳糖酶，更優(yōu)選地中性K.lactis乳糖酶。[0035]本發(fā)明的制劑中的乳糖酶可作為任選濃縮的例如來自K.lactis的提取物。優(yōu)選地，這樣的提取物已經(jīng)通過例如離心或過濾經(jīng)受了固液分離步驟以除去固體。這樣的提取物可包含來自酵母的天然組分以及發(fā)酵培養(yǎng)基的剩余物。所述組分的實(shí)例有核酸、蛋白質(zhì)、殘留糖、寡糖、固有酶、鹽、礦物質(zhì)、細(xì)胞內(nèi)組分、離子和核苷酸或其他組分。在某種程度上，這些組分可在本發(fā)明的制劑中出現(xiàn)(endup)。例如，在5000NLU/g的乳糖酶制劑中，基于組合物的總重量，不同于乳糖酶的蛋白質(zhì)的量通常介于0.1-10重量％之間，更可能介于1-5重量％或者1-4重量％之間，介于2-3重量％之間。所述制劑中鹽、灰分、糖類、核酸等的量通常介于0.5-4重量％之間。[0036]或者，乳糖酶可以是酸性乳糖酶，即最適pH在3.5-5.0之間的乳糖酶。[0037]為了避免任何混淆，本文提到的例如L-乳酸鈉、L-乳酸鈣或L-乳酸鉀或者糖或者氯化鈉或氯化鉀(或者任何其他添加的組分）的量指的是添加的組分的量，且不包括來自上述乳糖酶提取物中存在的組分的可能遺留物。[0038]此外，水活性Aw還考慮了乳糖酶溶液(例如，乳糖酶提取物或純化的乳糖酶制品）的水活性，其可因所用批次而略微不同。[0039]本發(fā)明的制劑中的乳糖酶可以是濃縮的（未純化的）乳糖酶或者可以是純化的?？梢酝ㄟ^下述步驟獲得濃縮的（未純化的）乳糖酶:釋放來自宿主細(xì)胞的酶，例如通過過濾或離心除去固體，通過例如超濾濃縮液相(乳糖酶）?；蛘?，乳糖酶是純化的，例如通過使用色譜法。[0040]本發(fā)明的液體乳糖酶制劑中的糖可包括單糖，例如果糖或葡萄糖;二糖，例如乳糖或蔗糖;或寡糖。優(yōu)選的糖可溶于水。[0041]本發(fā)明的乳糖酶制劑優(yōu)選地實(shí)質(zhì)上不含轉(zhuǎn)化酶。轉(zhuǎn)化酶[EC3.2.1.26]是催化蔗糖水解以形成一個(gè)葡萄糖單體和一個(gè)果糖單體的酶。產(chǎn)生的果糖和葡萄糖的混合物被稱為經(jīng)轉(zhuǎn)化的糖漿。商業(yè)乳糖酶往往含有痕量的轉(zhuǎn)化酶。發(fā)明人發(fā)現(xiàn):關(guān)于乳糖酶的酶穩(wěn)定性，蔗糖往往不能產(chǎn)生令人滿意的結(jié)果。他們推測(cè)轉(zhuǎn)化酶的存在可能與該問題有關(guān)。發(fā)明人還發(fā)現(xiàn):作為穩(wěn)定劑，葡萄糖不如其他糖有效，這可以是蔗糖的穩(wěn)定化效果不足的可能解釋。實(shí)際上，他們發(fā)現(xiàn):當(dāng)在本發(fā)明的制劑中使用不含轉(zhuǎn)化酶的乳糖酶時(shí)，蔗糖是酶穩(wěn)定性的有效穩(wěn)定劑。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的制劑包含蔗糖且實(shí)質(zhì)上不含轉(zhuǎn)化酶。[0042]如上所述，本發(fā)明提供含水的液體乳糖酶制劑，所述乳糖酶制劑包含乳糖酶且還包含至少20重量％的1^_乳酸鈉、L-乳酸鈣或L-乳酸鉀或其組合。所述制劑可任選地包含[0043]-糖;或[0044]-氯化鈉或氯化鉀或其組合;或[0045]-氯化鈉或氯化鉀或其組合以及糖[0046]優(yōu)選地其中每種組分的濃度使得水活性Aw為至多0.82。[0047]一種合適的乳糖酶制劑包含至少20重量％、21重量％、22重量％、23重量％、24重量％、25重量％、26重量％、27重量％、28重量％、29重量％、30重量％、31重量％、32重量％、33重量％、34重量％或35重量％的1^_乳酸鈉、L-乳酸鈣或L-乳酸鉀(優(yōu)選L-乳酸鈉)或其組合。優(yōu)選地，所述乳糖酶制劑包含500-15000NLU/g乳糖酶。[0048]本發(fā)明的乳糖酶制劑可本質(zhì)上由乳糖酶和L-乳酸鈉、L-乳酸鈣或L-乳酸鉀（優(yōu)選地L-乳酸鈉)或其組合組成?；蛘?，乳糖酶制劑可包含（i)乳糖酶、（ii)至少20重量％的1^_乳酸鈉、L-乳酸鈣或L-乳酸鉀或其組合和（iii)糖。優(yōu)選地，所述糖是蔗糖、果糖、葡萄糖或乳糖、或其組合，更優(yōu)選地所述糖是蔗糖。[0049]或者，乳糖酶制劑可包含（i)乳糖酶、（ii)至少20重量％的卜乳酸鈉、L-乳酸鈣或L-乳酸鉀或其組合和（iii)氯化鈉或氯化鉀或其組合。[0050]或者，乳糖酶制劑可包含（i)乳糖酶、（ii)至少20重量％的卜乳酸鈉、L-乳酸鈣或L-乳酸鉀或其組合、（iii)糖和（iv)氯化鈉或氯化鉀或其組合。[0051]在所有情況下，選擇各個(gè)組分的濃度以使得最終水活性Aw為至多0.82。[0052]本發(fā)明的乳糖酶制劑的pH在pH6-9，優(yōu)選地pH7-8.5，優(yōu)選地pH7-8的范圍內(nèi)。[0053]一種合適的乳糖酶制劑包含1000NLU/g、2000NLU/g或5000NLU/g乳糖酶和25重量％、26重量％、27重量％、28重量％、29重量％、30重量％、31重量％、32重量％、33重量％、34重量％或35重量％L-乳酸鈉，優(yōu)選地5000NLU/g乳糖酶和30重量％L-乳酸鈉。[0054]另一種優(yōu)選的乳糖酶制劑包含5000NLU/g乳糖酶、30重量％L-乳酸鈉和乳清蛋白(5-10g/l、優(yōu)選地5g/l，以β-乳球蛋白測(cè)量）。[0055]另一種合適的乳糖酶制劑包含1000NLU/g、2000NLU/g或5000NLU/g乳糖酶和5重量％、6重量％、7重量％、8重量％、9重量％、10%重量％、11重量％、12重量％、13重量％、14重量％或15重量％NaCl以及35重量％、36重量％、37重量％、38重量％、39重量％、40重量％、41重量％、42重量％、43重量％、44重量％或45重量％蔗糖，優(yōu)選地5000NLU/g乳糖酶、10重量％NaCl和40重量％蔗糖。[0056]另一種優(yōu)選的乳糖酶制劑包含5000NLU/g乳糖酶、10重量％NaCl、40重量％蔗糖和乳清蛋白（5-10g/l、優(yōu)選地5g/l，以β-乳球蛋白測(cè)量）。[0057]另一種合適的乳糖酶制劑包含1000NLU/g、2000NLU/g或5000NLU/g乳糖酶和5重量％、6重量％、7重量％、8重量％、9重量％、10%重量％、11重量％、12重量％、13重量％、14重量％或15重量％似(31以及13重量％、14重量％、15重量％、16重量％、17重量％、18重量％、19重量％、20重量％、21重量％、22重量％或23重量％1^-乳酸鈉，優(yōu)選地5000見1]/8乳糖酶、10重量％NaCl和18重量％L-乳酸鈉。[0058]另一種優(yōu)選的乳糖酶制劑包含5000NLU/g乳糖酶、10重量％NaCl、18重量％L-乳酸鈉和乳清蛋白（5-10g/l、優(yōu)選地5g/l，以β-乳球蛋白測(cè)量）。[0059]另一種合適的乳糖酶制劑包含1000NLU/g、2000NLU/g或5000NLU/g乳糖酶和15重量％、16重量％、17重量％、18重量％、19重量％、20%重量％、21重量％、22重量％、23重量％、24重量％或25重量％果糖以及17重量％、18重量％、19重量％、20重量％、21重量％、22重量％、23重量％、24重量％、25重量％、26重量％或27重量％L-乳酸鈉，優(yōu)選地5000NLU/g乳糖酶、20重量％果糖和22重量％L-乳酸鈉。[0060]另一種優(yōu)選的乳糖酶制劑包含5000NLU/g乳糖酶、20重量％果糖、22重量％L-乳酸鈉和乳清蛋白（5-10g/l、優(yōu)選地5g/l，以β-乳球蛋白測(cè)量）。[0061]另一種合適的乳糖酶制劑包含100NLU/g、2000NLU/g或5000NLU/g乳糖酶和20重量％、21重量％、22重量％、23重量％、24重量％、25重量％、26重量％、27重量％、28重量％、29重量％或30重量％蔗糖以及15重量％、16重量％、17重量％、18重量％、19重量％、20%重量％、21重量％、22重量％、23重量％、24重量％或25重量％1^-乳酸鈉，優(yōu)選地5000見1]/8乳糖酶、25重量％蔗糖和20重量％L-乳酸鈉。[0062]另一種優(yōu)選的乳糖酶制劑包含5000NLU/g乳糖酶、25重量％蔗糖、20重量％L-乳酸鈉和乳清蛋白（5-10g/l、優(yōu)選地5g/l，以β-乳球蛋白測(cè)量）。[0063]另一種合適的乳糖酶制劑包含100NLU/g、2000NLU/g或5000NLU/g乳糖酶和15重量％、16重量％、17重量％、18重量％、19重量％、20%重量％、21重量％、22重量％、23重量％、24重量％或25重量％果糖以及15重量％、16重量％、17重量％、18重量％、19重量％、20重量％、21重量％、22重量％、23重量％、24重量％或25重量％蔗糖。[0064]另一種優(yōu)選的乳糖酶制劑包含5000NLU/g乳糖酶、20重量％蔗糖、20重量％果糖和乳清蛋白（5-10g/l、優(yōu)選地5g/l，作為β-乳球蛋白測(cè)量）。[0065]描述了優(yōu)選組合物的一些其他實(shí)施方式：[0066]一種優(yōu)選的乳糖酶制劑包含500-8000NLU/g乳糖酶和至少28重量％、29重量％或30重量％L-乳酸鈉、L-乳酸鈣或L-乳酸鉀或其組合，優(yōu)選地至少31重量％或32重量％或32.5重量％L-乳酸鈉、L-乳酸鈣或L-乳酸鉀或其組合。[0067]另一種優(yōu)選的乳糖酶制劑包含500-8000NLU/g乳糖酶和至少28重量％、29重量％或30重量％L-乳酸鈉，優(yōu)選地至少31重量％或32重量％或32.5重量％L-乳酸鈉。[0068]另一種優(yōu)選的乳糖酶制劑包含500-8000NLU/g乳糖酶和至少25重量％L-乳酸鈉、L-乳酸鈣或L-乳酸鉀或其組合，以及0.01-5重量％、優(yōu)選地0.01-3重量％、更優(yōu)選地0.01-3重量％、最優(yōu)選地〇.〇1-2重量％范圍內(nèi)的氯化鈉或氯化鉀。[0069]另一種優(yōu)選的乳糖酶制劑包含500-8000NLU/g乳糖酶和至少25重量％L-乳酸鈉，以及0.01-5重量％、優(yōu)選地0.01-3重量％、更優(yōu)選地0.01-3重量％、最優(yōu)選地0.01-2重量％范圍內(nèi)的氯化鉀。[0070]另一種優(yōu)選的乳糖酶制劑包含500-8000NLU/g乳糖酶和至少25重量％L-乳酸鈉，以及0.01-3重量％、優(yōu)選地0.01-2重量％范圍內(nèi)的氯化鉀。[0071]本發(fā)明的制劑是酶穩(wěn)定的，優(yōu)選地微生物穩(wěn)定的和酶穩(wěn)定的。換言之，在2-8°C(例如，4°C)下貯存2個(gè)月后，制劑中殘留的酶活性為至少80%、優(yōu)選地至少90%、更優(yōu)選地至少95%、甚至更優(yōu)選地至少99%。同樣地，微生物穩(wěn)定性使得在2-8°C(例如，4°C)下貯存2個(gè)月后，總平板計(jì)數(shù)為優(yōu)選地少于1000個(gè)菌落形成單位(CFU)/ml，更優(yōu)選地少于500CFU/ml，更優(yōu)選地少于300CFU/ml，甚至更優(yōu)選地少于200CFU/ml，最優(yōu)選地少于100CFU/ml。[0072]可采用定義明確的標(biāo)準(zhǔn)程序通過標(biāo)準(zhǔn)平板計(jì)數(shù)、酵母數(shù)目和霉菌數(shù)目來表示本發(fā)明的組合物的微生物性質(zhì)。例如，標(biāo)準(zhǔn)平板計(jì)數(shù)可以是lml中S100CFU(菌落形成單位），酵母計(jì)數(shù)可以是lml中<10CFU且霉菌計(jì)數(shù)可以是lml中<10CFU。由于組合物在使用前往往被貯存，所以期望平板計(jì)數(shù)、酵母數(shù)目和霉菌數(shù)目保持低于確定的邊界值持續(xù)至少2個(gè)月。[0073]在本文中使用時(shí)，根據(jù)NEN-IS021527-2來測(cè)定酵母計(jì)數(shù)和霉菌計(jì)數(shù)。[0074]在另一方面，本發(fā)明提供生產(chǎn)本發(fā)明的液體乳糖酶制劑的方法，所述方法包括:添加乳糖酶，L-乳酸鈉、L-乳酸鈣或L-乳酸鉀或其組合和任選地糖，和/或任選地氯化鈉或氯化鉀或其組合，和/或水；以及任選地混合。所述方法中的乳糖酶可以是，或者可以獲自例如來自K.lactis的任選濃縮的發(fā)酵液(裂解細(xì)胞后）?；蛘撸樘敲缚梢允羌兓娜樘敲?，例如通過色譜法純化的乳糖酶。添加乳糖酶和其他組分的順序并不關(guān)鍵。所述方法可包括混合以獲得清澈溶液。[0075]在另一方面，本發(fā)明提供嬰兒配方、較大嬰兒配方或幼兒配方，其包含通過如上所述的本發(fā)明的方法生產(chǎn)的本發(fā)明的液體乳糖酶制劑或者乳糖酶組合物。所述嬰兒配方、較大嬰兒配方或幼兒配方優(yōu)選地為干燥制劑，例如呈顆粒粉末的形式。本發(fā)明的嬰兒配方、較大嬰兒配方或幼兒配方中乳糖的量為優(yōu)選地少于1重量％的乳糖，優(yōu)選地少于〇.5重量％的乳糖，更優(yōu)選地少于0.2重量％的乳糖，甚至更優(yōu)選地少于0.1重量％的乳糖，所有重量％均基于嬰兒配方、較大嬰兒配方或幼兒配方的總重量。嬰兒配方是為喂養(yǎng)小于12個(gè)月的嬰孩和嬰兒而設(shè)計(jì)和銷售的制造食品。較大嬰兒配方或幼兒嬰配方針對(duì)6個(gè)月至2歲的年齡出售。[0076]在另一方面，本發(fā)明提供生產(chǎn)嬰兒配方(例如，本發(fā)明的嬰兒配方)的方法，所述方法包括：向濃縮乳中添加液體乳糖酶制劑和任選地其他組分，例如礦物質(zhì)、維生素和脂肪；混合和/或均化;蒸發(fā);和噴霧干燥。添加各組分的順序并不關(guān)鍵。例如，可如此進(jìn)行所述方法:將乳糖酶制劑添加到(液體)濃縮乳中，所述(液體)濃縮乳中已添加了例如礦物質(zhì)、維生素和脂肪的組分?；蛘?，在添加乳糖酶制劑之后添加這些其他組分。在另一種實(shí)施方式中，將乳糖酶制劑添加到其他組分中，然后將混合物添加到濃縮乳中。混合、均化、噴霧干燥和?；鶕?jù)本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。[0077]在另一方面，本發(fā)明提供本發(fā)明的液體乳糖酶制劑在生產(chǎn)嬰兒配方中的用途。[0078]現(xiàn)在參考下述非限制性實(shí)施例來闡釋本發(fā)明。實(shí)施例[0079]實(shí)施例1包含32.5重量％乳酸鈉的乳糖酶制劑[0080]可以使用現(xiàn)有技術(shù)中所述的方法（例如，RodriguesPinho和LopesPassos(2011)JournalofFoodBiochemistry35,323-336)或者以前描述的從Kluyveromyces中提取和濃縮乳糖酶的任何其他方法獲得從Kluyveromyceslactis酵母提取的濃縮乳糖酶。向280g這樣濃縮的（未純化的）具有~14000NLU/g的活性的乳糖酶中加入520gL-乳酸鈉（50重量％儲(chǔ)液）。這產(chǎn)生活性為4950NLU/g、pH為7.0且水活性為0.815的32.5重量％1^-乳酸鈉制劑。使用超高質(zhì)(UHQ)水中的1%樣品溶液進(jìn)行pH測(cè)量。通過在25°C下測(cè)量樣品上方的相對(duì)濕度來測(cè)量水活性直至Aw值穩(wěn)定。如果沒有變化>0.001，則Aw值被視為穩(wěn)定。檢測(cè)Aw持續(xù)4分鐘。利用標(biāo)準(zhǔn)儀器測(cè)定Aw值。[0081]將約lg制劑樣品貯存在5°C分別持續(xù)2周、4周和8周。將樣品移出試驗(yàn)后，對(duì)它們進(jìn)行視覺觀察并測(cè)定活性。[0082]8周后，制劑的殘余酶活性為94%。[0083][0084]實(shí)施例2包含20重量％乳酸鈉+25重量％蔗糖的乳糖酶制劑[0085]向280g具有~14000NLU/g的活性的濃縮的乳糖酶(濃縮的（未純化的）乳糖酶）中加入320gL-乳酸鈉(50重量％溶液)和200g蔗糖。這產(chǎn)生活性為5040NLU/g、pH為7.0且水活性為0.815的20重量％L-乳酸鈉+25重量％蔗糖制劑。使用超高質(zhì)(UHQ)水中的1%樣品溶液進(jìn)行pH測(cè)量。通過在25°C下測(cè)量樣品上方的相對(duì)濕度來測(cè)量水活性直至Aw值穩(wěn)定。如果沒有變化>0.001，則Aw值被視為穩(wěn)定。檢測(cè)Aw持續(xù)4分鐘。利用標(biāo)準(zhǔn)儀器測(cè)定Aw值。[0086]將約lg制劑樣品貯存在5°C分別持續(xù)2周、4周和8周。將樣品移出試驗(yàn)后，對(duì)它們進(jìn)行視覺觀察并測(cè)定活性。[0087]8周后，制劑的殘余酶活性為82%?！?0881[0089]實(shí)施例3包含（i)32重量％L-乳酸鈉制劑或（ii)20重量％L-乳酸鈉+25重量％蔗糖或（iii)50重量％甘油制劑的乳糖酶制劑的微生物挑戰(zhàn)試驗(yàn)[0090]向350g具有~13600NLU/g的活性的濃縮的乳糖酶(濃縮的（未純化的）乳糖酶）中加入650gL-乳酸鈉（50重量％溶液）。利用NaOH將pH調(diào)節(jié)為7.8。這產(chǎn)生活性為~476011]/g，以及水活性為0.80的32.5重量％L-乳酸鈉制劑。[0091]向400g具有~13600NLU/g的活性的濃縮的乳糖酶(濃縮的（未純化的）乳糖酶）中加入45781^-乳酸鈉(50重量％溶液)和2858蔗糖。利用似0!1將?!1調(diào)節(jié)為7.8。這產(chǎn)生活性為~4760NLU/g、水活性為0.794的20重量％L-乳酸鈉+25重量％蔗糖制劑。[0092]作為參照，向400g具有~13600NLU/g的活性的濃縮的乳糖酶中加入150g水和550g甘油。利用NaOH將pH調(diào)節(jié)為7.8。這產(chǎn)生活性為~4945見1^、水活性為0.769的50重量％甘油制劑。[0093]該試驗(yàn)的目的是比較50重量％甘油的乳糖酶組合物與本發(fā)明的乳糖酶組合物的微生物穩(wěn)定性。這是通過根據(jù)NEN-IS021527-2利用酵母或霉菌的標(biāo)準(zhǔn)混合物或健壯混合物挑戰(zhàn)不同制劑來進(jìn)行的。這種標(biāo)準(zhǔn)混合物包含可能存在于(食物)產(chǎn)品、成分或工業(yè)過程或設(shè)施中的一般、普遍存在的微生物的選擇。健壯混合物是能夠在挑戰(zhàn)條件下生長(zhǎng)的菌株的選擇。[0094]將標(biāo)準(zhǔn)霉菌、健壯霉菌、標(biāo)準(zhǔn)酵母或健壯酵母的混合物添加到制劑中，然后在8°C和25°C下孵育并在0周、1周、2周、3周、1個(gè)月、2個(gè)月后取樣以測(cè)定微生物生長(zhǎng)。[0095]2個(gè)月后，對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)酵母、健壯酵母和健壯霉菌，包含乳酸鹽的制劑的微生物穩(wěn)定性比甘油制劑的微生物穩(wěn)定性好。對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)霉菌，包含乳酸鹽的制劑與甘油制劑的微生物穩(wěn)定性相同?！局鳈?quán)項(xiàng)】1.含水的液體乳糖酶制劑，所述乳糖酶制劑包含乳糖酶并且還包含至少20重量％的1^_乳酸鈉、L-乳酸鈣或L-乳酸鉀或其組合，優(yōu)選地其中每種組分的濃度使得水活性Aw為至多0.82〇2.根據(jù)權(quán)利要求1的乳糖酶制劑，其還包含糖。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的乳糖酶制劑，其還包含氯化鈉或氯化鉀或其組合。4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3的乳糖酶制劑，其中所述糖是蔗糖、果糖、葡萄糖、乳糖或其組合，更優(yōu)選地所述糖是蔗糖。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的乳糖酶制劑，其中所述乳糖酶是中性乳糖酶。6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的乳糖酶制劑，其中所述乳糖酶實(shí)質(zhì)上不含轉(zhuǎn)化酶。7.根據(jù)權(quán)利要求6的乳糖酶制劑，所述乳糖酶制劑包含乳糖酶、至少20重量％的1^_乳酸鈉、L-乳酸鈣或L-乳酸鉀或其組合和蔗糖。8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的乳糖酶制劑，其實(shí)質(zhì)上不含多元醇或二醇，更優(yōu)選地不含甘油和/或山梨醇。9.生產(chǎn)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的液體乳糖酶制劑的方法，所述方法包括:添加乳糖酶，L-乳酸鈉、L-乳酸鈣或L-乳酸鉀或其組合和任選地糖，和/或任選地氯化鈉或氯化鉀或其組合，和/或水；以及任選地混合。10.嬰兒配方、較大嬰兒配方或幼兒配方，其包含權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的液體乳糖酶制劑或者通過權(quán)利要求9所述的方法生產(chǎn)的乳糖酶組合物。11.生產(chǎn)嬰兒配方、較大嬰兒配方或幼兒配方的方法，所述方法包括：向濃縮乳中添加權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的液體乳糖酶制劑或者通過權(quán)利要求9的方法生產(chǎn)的乳糖酶組合物和任選地其他組分，例如礦物質(zhì)、維生素和脂肪;混合和/或均化;蒸發(fā);和噴霧干燥。12.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的液體乳糖酶制劑或者通過權(quán)利要求9的方法生產(chǎn)的乳糖酶組合物在生產(chǎn)嬰兒配方、較大嬰兒配方或幼兒配方中的用途?！疚臋n編號(hào)】C12N9/38GK106061293SQ201580011694【公開日】2016年10月26日【申請(qǐng)日】2015年3月5日公開號(hào)201580011694.1,CN106061293A,CN106061293A,CN201580011694,CN-A-106061293,CN106061293A,CN106061293A,CN201580011694,CN201580011694.1,PCT/2015/54652,PCT/EP/15/054652,PCT/EP/15/54652,PCT/EP/2015/054652,PCT/EP/2015/54652,PCT/EP15/054652,PCT/EP15/54652,PCT/EP15054652,PCT/EP1554652,PCT/EP2015/054652,PCT/EP2015/54652,PCT/EP2015054652,PCT/EP201554652【發(fā)明人】芬娜·約翰娜·凱瑟琳娜·喬林克,艾伯特·沙普【申請(qǐng)人】帝斯曼知識(shí)產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司