一種結合短雙歧桿菌的適配體、篩選方法及應用
【專利摘要】本發(fā)明提供一種結合短雙歧桿菌的適配體、篩選方法及應用，其包含與序列5’?AGCAGCACAGAGGTCAGATG?N40?CCTATGCGTGCTACCGTGAA?3’具有至少與短雙歧桿菌的結合率在65％以上的核苷酸序列；其中，N代表堿基A，T，C，G中任一個，N40代表隨機片段長度為40個堿基。本發(fā)明針對短雙歧桿菌的高質量適配體，與短雙歧桿菌的結合力較高且特異性良好，可廣泛應用于有關短雙歧桿菌相關的生物技術的各個領域。
【專利說明】
一種結合短雙歧桿菌的適配體、篩選方法及應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及針對短雙歧桿菌的適配體、篩選方法以及利 用該適配體的方法。
【背景技術】
[0002] -直以來，作為益生菌的雙歧桿菌及其微生態(tài)制劑以其特有的性質越來越受到學 術界的重視和商家的關注。雙歧桿菌不僅能抑制腸道致病菌的生長，從而調節(jié)和改善腸道 菌群，雙歧桿菌還能改善乳糖不耐癥、預防腸道感染、降低血清膽固醇、促進免疫和發(fā)揮抗 氧化等作用。含雙歧桿菌的酸奶已在歐洲和日本盛行多年，而且銷量仍在增長。我國也開發(fā) 研制了多種雙歧桿菌制品，如含雙歧桿菌的酸奶、奶粉、飲料等制品，銷量也較好。
[0003] 短雙歧桿菌是母乳喂養(yǎng)嬰兒腸道中的優(yōu)勢菌，對嬰兒健康起到至關重要的作用。 正是基于短雙歧桿菌與嬰兒健康息息相關，短雙歧桿菌經(jīng)常被作為益生菌添加到微生態(tài)制 劑中。但到目前為止，短雙歧桿菌在國際上還沒有標準的檢測方法，這對短雙歧桿菌制品的 質量管理十分不利。因此，為滿足市場需求，短雙歧桿菌的快速檢測方法勢在必行。目前針 對短雙歧桿菌的檢測主要是利用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法和分子生物學方法。傳統(tǒng)檢測方法需要對短 雙歧桿菌進行培養(yǎng)，這種方法耗費時間長，而且培養(yǎng)條件對短雙歧桿菌形態(tài)有不同程度的 影響，從而導致不可靠的檢測結果，也不能滿足快速檢測的需要。以PCR技術為基礎的分子 生物學技術在一定程度上提高了檢測靈敏度同時也節(jié)省了檢測時間，但這種檢測技術需要 復雜設備且對檢測人員技術要求高，因此也很難滿足快速檢測的需要。
[0004] 核酸適配體是經(jīng)體外篩選技術篩選出的能特異結合金屬離子、多肽、蛋白質乃至 整個細胞的寡聚核苷酸（SSDNA或RNA)片段，其特異性如同抗體一樣，對可結合的配體有特 異的識別能力和高度的親和力。核酸適配體的體外篩選技術被稱為指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進 化（Systematic Evolution of Ligand by Exponential enrichment，SELEX)技術。SELEX 技術模擬自然進化過程，利用大容量的隨機寡核苷酸庫與靶分子相互作用，對隨機寡核苷 酸文庫施加選擇壓力，從中篩選出與靶標特異結合片段，并結合PCR體外擴增技術，從而實 現(xiàn)指數(shù)富集，如此循環(huán)數(shù)輪，最終得到與靶標高親和力和高特異性結合的寡核苷酸配體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本部分的目的在于概述本發(fā)明的實施例的一些方面以及簡要介紹一些較佳實施 例。在本部分以及本申請的說明書摘要和發(fā)明名稱中可能會做些簡化或省略以避免使本部 分、說明書摘要和發(fā)明名稱的目的模糊，而這種簡化或省略不能用于限制本發(fā)明的范圍。
[0006] 鑒于上述和/或現(xiàn)有針對短雙歧桿菌的適配體及用途中存在的問題，提出了本發(fā) 明。
[0007] 因此，本發(fā)明其中一個目的是，通過改良的Whole-Bacterium SELEX技術，以短雙 歧桿菌為靶標，篩選出能與短雙歧桿菌特異性結合的核酸適配體序列，以該適配體為新型 識別元件，開發(fā)短雙歧桿菌的新型快速檢測方法。
[0008] 為解決上述技術問題，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了如下技術方案:一種 結合短雙歧桿菌的適配體，其特征在于：包含與序列5 ' -AGCAGCACAGAGGTCAGATG-N40- CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3'具有至少與短雙歧桿菌的結合率在65%以上的核苷酸序列；其 中，
[0009] N代表堿基A，T，C，G中任一個，N40代表隨機片段長度為40個堿基。
[0010] 作為本發(fā)明所述結合短雙歧桿菌的適配體的一種優(yōu)選方案，其中：其具有以下核 苷酸序列：
[0011] S'-AGCAGCACAGAGGTCAGATGCCGGGCAGCGGTCAATGCCGCAC CTTCCATATGATCGGGGCCTATGCGTGCTACCGTGAA-3 '；
[0012] S'-AGCAGCACAGAGGTCAGATGGGCCCCCTGCCTGCCAAAAAGGT GTTGCCAGGTTGGCGGCCCTATGCGTGCTACCGTGAA-3 '；
[0013] 5'-AGCAGCACAGAGGTCAGATGCTCCCAGGCCGTTGGGGCGTTGC CTGCGTGCACCCGGGGCCCTATGCGTGCTACCGTGAA-3 '。
[0014] 作為本發(fā)明所述結合短雙歧桿菌的適配體的一種優(yōu)選方案，其中：所述適配體其 中至少一個核苷酸被修飾。
[0015] 作為本發(fā)明所述結合短雙歧桿菌的適配體的一種優(yōu)選方案，其中：所述適配體被 熒光FAM修飾。
[0016] 作為本發(fā)明所述結合短雙歧桿菌的適配體的一種優(yōu)選方案，其中：所述適配體被 熒光基團、同位素、電化學標記物、酶標記物，以及用于形成組合物的親和配基、巰基所修 飾。
[0017] 本發(fā)明其中另一個目的是提供一種結合短雙歧桿菌的適配體的篩選方法。
[0018] 為解決上述技術問題，根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了如下技術方案:一 種篩選結合短雙歧桿菌的適配體的方法，包括初始隨機單鏈DNA文庫構建及引物合成文庫 序列，其還包括，PCR擴增和非變性聚丙烯酰氨凝膠電泳;ssDNA的純化和變性聚丙烯酰氨凝 膠電泳;反篩，利用長雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、動物雙歧桿菌和青春雙歧桿 菌組成的混合物作為反篩的靶標，將所述混合物與純化后ssDNA文庫進行室溫孵育，離心取 上清作為模板進行PCR，最終得到結合短雙歧桿菌的適配體。
[0019] 作為本發(fā)明所述篩選結合短雙歧桿菌的適配體的方法的一種優(yōu)選方案，其中：所 述PCR擴增，其反應系統(tǒng)中加入有機溶劑二甲亞楓，且二甲亞楓占反應體系體積百分比5% ~7%〇
[0020] 作為本發(fā)明所述篩選結合短雙歧桿菌的適配體的方法的一種優(yōu)選方案，其中：所 述PCR擴增，其退火溫度為69 °C。
[0021] 本發(fā)明再一個目的是提供一種結合短雙歧桿菌的適配體在短雙歧桿菌純化、短雙 歧桿菌的固相載體的制備，以及短雙歧桿菌的快速檢測方面的應用。
[0022]本發(fā)明所具有的有益效果：
[0023] 1、與抗體相比，核酸適配體更為穩(wěn)定，制備方法簡單、制備周期短、成本低廉，可直 接體外合成和任意修飾，操作更加方便。
[0024] 2、該組序列是從保守序列顯著、二級結構穩(wěn)定且與目標菌體具有不同親和力的適 配體序列中選取出的親和力和特異性均表現(xiàn)優(yōu)良的核酸適配體序列，適配體性質穩(wěn)定，與 雙歧桿菌的親和力和特異性十分優(yōu)秀。
[0025] 3、填補了短雙歧桿菌快速檢測領域的技術空白，推動了行業(yè)對短雙歧桿菌制品的 質量管理的發(fā)展。
【附圖說明】
[0026] 為了更清楚地說明本發(fā)明實施例的技術方案，下面將對實施例描述中所需要使用 的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本 領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其它 的附圖。其中：
[0027]圖1是CCFM623-2核酸適配體的二級結構圖；
[0028]圖2是CCFM623-10核酸適配體的二級結構圖；
[0029]圖3是CCFM623-16核酸適配體的二級結構圖；
[0030]圖4是CCFM623-2核酸適配體的飽和結合曲線圖；
[0031]圖5是CCFM623-10核酸適配體的飽和結合曲線圖；
[0032]圖6是CCFM623-16核酸適配體的飽和結合曲線圖；
[0033] 圖7是CCFM623-2、CCFM623-10和CCFM623-16核酸適配體的結合特異性試驗結果；
[0034] 圖8是不同有機溶劑劑在PCR反應體系中的表現(xiàn)示意圖。
【具體實施方式】
[0035] 為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點能夠更加明顯易懂，下面結合說明書附圖對 本發(fā)明的【具體實施方式】做詳細的說明。
[0036] 在下面的描述中闡述了很多具體細節(jié)以便于充分理解本發(fā)明，但是本發(fā)明還可以 采用其他不同于在此描述的其它方式來實施，本領域技術人員可以在不違背本發(fā)明內(nèi)涵的 情況下做類似推廣，因此本發(fā)明不受下面公開的具體實施例的限制。
[0037]其次，此處所稱的"一個實施例"或"實施例"是指可包含于本發(fā)明至少一個實現(xiàn)方 式中的特定特征、結構或特性。在本說明書中不同地方出現(xiàn)的"在一個實施例中"并非均指 同一個實施例，也不是單獨的或選擇性的與其他實施例互相排斥的實施例。
[0038] 實施例1:
[0039] (1)體外化學合成初始隨機單鏈DNA(ssDNA)文庫及引物文庫序列如下：
[0040] 5'-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-N40-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3'（Integrated DNA Technologies，IDT)，構建了長度為80nt的隨機ssDNA文庫，兩端為固定引物序列，中間為 40nt的隨機序列，庫容量在1014以上。
[0041 ]上游引物：5 ' -AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3 '
[0042] 下游引物：5 ' -TTCACGGTAGCACGCATAGG-3 '
[0043] 5 ' 磷酸化下游引物:5 ' -P-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3 '
[0044] 將隨機ssDNA文庫和引物均用TE緩沖液配制成IOOuMIC存液于-20°C貯存?zhèn)溆谩?br>[0045] (2)SELEX 篩選
[0046] 將培養(yǎng)至對數(shù)期的短雙歧桿菌用結合緩沖液（50mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)， 5mmol/L KC1, lOOmmol/L NaCl, lmmol/L MgCl2)清洗兩遍以去除培養(yǎng)基。首輪將2nmol隨機 單鏈文庫熱變性10分鐘，隨后立即冰浴10分鐘，然后加入含短雙歧桿菌的600ul結合緩沖液 中，室溫孵育45min。洗滌兩次將未與靶標結合以及結合不牢的ssDNA洗脫，隨后將與靶標結 合的ssDNA熱解離洗脫，將洗脫液作為模板進行PCLPCR產(chǎn)物通過8 %非變性聚丙烯酰胺凝 膠電泳(PAGE)驗證，出現(xiàn)唯一的80nt目標條帶擴增產(chǎn)物，然后將該擴增產(chǎn)物用于單鏈制備。 采用Lambda核酸外切酶消化法將待切產(chǎn)物進行酶切反應，滅酶后將酶切產(chǎn)物經(jīng)尿素變性 PAGE電泳驗證，用稀釋后的80nt核酸單鏈文庫作為對照，出現(xiàn)唯一的且與對照條帶一致酶 切產(chǎn)物即可進行純化。采用飽和酚-乙醇提純法對制備的核酸單鏈文庫純化，復溶后經(jīng) Nan〇Dr〇p2000超微量分光光度計測定ssDNA濃度，定量200pmol投入下一輪篩選。分別在第 九和十一輪進行反篩(長雙歧桿菌等同屬雙歧桿菌作為反篩靶標）。將第十二輪篩選得到的 核酸適配體PCR產(chǎn)物送至上海生物工程技術有限公司進行克隆測序，獲得33條核酸單鏈序 列。采用DNAMAN軟件對核酸單鏈序列進行一級結構同源性分析，依據(jù)序列之間的同源性將 該33條序列分為六個家族。然后用RNA Structure.2軟件對核酸適配體序列的二級結構的 穩(wěn)定性進行分析。結合以上兩種軟件的分析結果，從中挑選出能級較低、結構穩(wěn)定的序列， 由美國IDT公司合成5'-FAM熒光標記的核酸適配體序列，用流式細胞分析儀作進一步的親 和力和特異性分析。
[0047] 實施例2:
[0048]單鏈核苷酸堿基之間存在的相互作用可使其形成一定的空間結構，這些結構易于 與各種靶分子實現(xiàn)構象結合?；谶@種構象識別特性，采用一個足夠大容量(1〇14以上)的核 酸文庫能夠包容盡可能多的立體結構，因此有可能從中篩選得到針對任何種類靶標的高親 和力和高特異性的適配體。
[0049] 根據(jù)上述原理，本實施例中發(fā)明人提出了一組通過改良的whole-Bacterium SELEX技術篩選得到與短雙歧桿菌特異結合的核酸適配體序列。下面結合說明書附圖和具 體實施方式對本發(fā)明作進一步說明。
[0050]短雙歧桿菌特異結合的核酸適配體篩選方法大致如下：
[00511 (1)初始隨機單鏈DNA( ssDNA)文庫構建及引物合成文庫序列如下：5'_ AGCAGCACAGAGGTCAGATG-N40-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3'（Integrated DNA Technologies， IDT)，構建了長度為80nt的隨機ssDNA文庫，兩端為固定引物序列，中間為40nt的隨機序列， 庫容量在1014以上。
[0052] 上游引物：5 ' -AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3 '
[0053] 下游引物：5 ' -TTCACGGTAGCACGCATAGG-3 '
[0054] 5 ' 磷酸化下游引物:5 ' -P-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3 '
[0055] 將隨機ssDNA文庫和引物均用TE緩沖液配制成IOOuMIC存液于-20°C貯存?zhèn)溆谩?br>[0056] (2)whole_Bacterium SELEX篩選
[0057] 將培養(yǎng)至對數(shù)期的短雙歧桿菌用結合緩沖液（50mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)， 5mmol/L KC1, lOOmmol/L NaCl, lmmol/L MgCl2)清洗兩遍以去除培養(yǎng)基。首輪將2nmol隨機 單鏈文庫熱變性10分鐘，隨后立即冰浴10分鐘，然后加入含短雙歧桿菌的600ul結合緩沖液 中，室溫孵育45min。洗滌兩次將未與靶標結合以及結合不牢的ssDNA洗脫，隨后將與靶標結 合的ssDNA熱解離洗脫，將洗脫液作為模板進行PCLPCR產(chǎn)物通過8 %非變性聚丙烯酰胺凝 膠電泳(PAGE)驗證，出現(xiàn)唯一的80nt目標條帶擴增產(chǎn)物，然后將該擴增產(chǎn)物用于單鏈制備。 采用Lambda核酸外切酶消化法將待切產(chǎn)物進行酶切反應，滅酶后將酶切產(chǎn)物經(jīng)尿素變性 PAGE電泳驗證，用稀釋后的80nt核酸單鏈文庫作為對照，出現(xiàn)唯一的且與對照條帶一致酶 切產(chǎn)物即可進行純化。采用飽和酚-乙醇提純法對制備的核酸單鏈文庫純化，復溶后經(jīng) Nan〇Dr〇p2000超微量分光光度計測定ssDNA濃度，定量200pmol投入下一輪篩選。將第十二 輪篩選得到的核酸適配體PCR產(chǎn)物送至上海生物工程技術有限公司進行克隆測序，獲得33 條核酸單鏈序列。采用DNAMAN軟件對核酸單鏈序列進行一級結構同源性分析，依據(jù)序列之 間的同源性將該33條序列分為六個家族。然后用RNA Structure.2軟件對核酸適配體序列 的二級結構（如說明書附圖1~圖3所示）的穩(wěn)定性進行分析。結合以上兩種軟件的分析結 果，從中挑選出能級較低、結構穩(wěn)定的序列，由美國IDT公司合成5'-FAM熒光標記的核酸適 配體序列，用流式細胞分析儀作進一步的親和力和特異性分析。
[0058] (3)whole_Bacterium SELEX篩選方法的優(yōu)化 [0059] 1)PCR擴增和非變性聚丙烯酰氨凝膠電泳
[0060] 為了增加 PCR擴增產(chǎn)物的特異性，我們在PCR反應體系中加入了有機溶劑二甲亞楓 (DMS0)。25此的PCR反應體系如下： 丁叫酶 0.3μ1\ Buffer 2.5'uL (1NTP 2μ1. DMSO 1.25αΙ.
[0061] 模板 5gL 上游引物（2(^mol/L) 〇.5μL. 5'磷酸化下游引物 （20μL?〇1/? 0.5μΤ. 加入無菌水，補充體系至25,u:U
[0062] PCR擴增產(chǎn)物通過區(qū)分度更好的8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)進行檢測， 結果出現(xiàn)唯一的80nt目標條帶擴增產(chǎn)物。在此，參見圖8,縱軸為特異性條帶與非特異性條 帶比率，從圖上我們能看出，當在PCR反應體系中加入DMS0時可以明顯增加 PCR反應的特異 性。
[0063] 在PCR反應程序:預變性、變性、退火和延伸4個主要步驟中，一般情況下預變性、變 性、延伸的溫度很少改變，改變的往往是退火溫度，退火溫度過高或過低對PCR結果都能產(chǎn) 生較大的影響，退火溫度太高，特異性強，會導致目的條帶的丟失，退火溫度太低，特異性 差，會導致雜帶的增多，所以對于PCR的擴增，找到最適退火溫度是PCR成功的關鍵。該PCR反 應中若模板DNA是混合物且模板的的G、C含量高，往往需要更高的退火溫度，而當退火溫度 過高時，又會對PCR結果產(chǎn)生負作用，DMS0是一種含硫有機化合物，常溫下為無色無臭的透 明液體。在PCR反應體系中加入DMS0有利于減少DNA的二級結構，使G、C含量高的模板易于完 全變性，從而間接降低PCR反應所需的退火溫度，進而使得PCR擴增產(chǎn)物特異性更高。在本實 施方式中，優(yōu)選退火溫度為69 °C。
[0064] 2) ssDNA的純化和變性聚丙稀酰氨凝膠電泳
[0065] Lambda核酸外切酶消化后的ssDNA通過苯酸、氯仿、異戊醇(苯酸:氯仿:異戊醇= 25: 24:1)混合液抽提，12000rpm，離心5min，吸取上層水相，并加入1/10倍體積的3mol/L的 醋酸鈉 （pH 5.2)，2.5倍體積的冰乙醇混勻，置于-20 °C的冰箱2h，4°C、12000rpm，離心 15min，棄上清，用4°C預冷的75%乙醇洗滌后，4°C、12000rpm，離心15min。沉淀部分室溫干 燥，用30yL的結合緩沖液重溶，用Nan〇Dr〇p2000超微量分光光度計測定ssDNA濃度。
[0066] PCR擴增產(chǎn)物通過區(qū)分度更好的8%變性(7M尿素)聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)進 行檢測，用稀釋ssDNA文庫作為標記檢測純化產(chǎn)物。
[0067] 3)反篩
[0068] 為了得到特異性更好的適配體，我們分別在第九和十一輪進行反篩，具體做法如 下:利用長雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、動物雙歧桿菌和青春雙歧桿菌組成的 混合物作為反篩的靶標，將該混合物與純化后ssDNA文庫進行室溫孵育45min，離心取上清 作為模板進行PCR。
[0069] (4)短雙歧桿菌核酸適配體的親和力分析
[0070]將合成的三條FAM熒光標記的短雙歧桿菌適配體均用結合緩沖液稀釋成lOOuM貯 存液于-20°C貯存?zhèn)溆?。將這三條適配體序列l(wèi)OOpmol分別與雙歧桿菌（108cfu/mL)室溫下 孵育45min，并用結合緩沖液沖洗離心，去除未與菌體結合的寡核苷酸適配體，用結合緩沖 液重懸，然后通過流式細胞分析儀檢測結合上FAM標記適配體的菌體陽性結合率。每個數(shù)據(jù) 做三個平行樣，整個過程注意避光操作。所測得陽性結合率如下表所示。
[0071]
根據(jù)上述親和力分析結果可知，這三條適配體序列與短雙歧桿菌的結合率均在 65%以上，進一步將該組適配體分別用結合緩沖液稀釋為不同濃度梯度(0，10,25,50,75， 100，150nM)，分別與108cfu短雙歧桿菌室溫孵育45min，用結合緩沖液沖洗離心后，將菌體 重懸于結合緩沖液中，用流式細胞分析儀檢測結合上FAM標記適配體的菌體陽性率。除了被 熒光基團、同位素、電化學標記物、酶標記物所修飾外，還可以被用于形成組合物的親和配 基、疏基所修飾。每個數(shù)據(jù)做三個平行樣，整個過程注意避光操作。利用GraphPad Prism 5.0軟件計算各寡核苷酸適配體的解離常數(shù)Kd值，繪制短雙歧桿菌各個適配體飽和結合曲 線(如說明書附圖4~圖6所示）。
[0073] (5)短雙歧桿菌核酸適配體的特異性分析
[0074]根據(jù)上述親和力分析結果，進一步將這三條適配體進行特異性分析。分別將該組 序列與其它菌(長雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、動物雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、植物乳桿菌)室 溫下孵育45min，然后用結合緩沖液沖洗離心，去除未與菌體結合的寡核苷酸適配體，用結 合緩沖液重懸，然后通過流式細胞分析儀檢測結合上FAM標記適配體的菌體陽性結合率。每 個數(shù)據(jù)做三個平行樣，整個過程注意避光操作。將測定結果進行比較分析，如說明書附圖7 所示。
[0075] 由此可見，短雙歧桿菌與適配體CCFM623-2、CCFM623-10和CCFM623-16的結合力均 較高且特異性良好。故上述適配體可以適用用于短雙歧桿菌的純化、短雙歧桿菌的固相載 體的制備，以及應用于短雙歧桿菌的快速檢測。該組核酸適配體為分析檢測微生態(tài)制劑中 短雙歧桿菌提供了特異高效的識別配體，該組適配體將會在工業(yè)生產(chǎn)中短雙歧桿菌快速檢 測方面發(fā)揮廣泛應用前景。
[0076]應說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非限制，盡管參照較佳 實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發(fā)明的技術 方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術方案的精神和范圍，其均應涵蓋在本發(fā) 明的權利要求范圍當中。
【主權項】
1. 一種結合短雙歧桿菌的適配體，其特征在于:包含與序列 5 ' -AGCAGCACAGAGGTCAGATG-N40-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3 ' 具有至少與短雙歧桿菌的 結合率在65%以上的核苷酸序列;其中， N代表堿基A，T，C，G中任一個，N40代表隨機片段長度為40個堿基。2. 根據(jù)權利要求1所述的適配體，其特征在于:其具有以下核苷酸序列： 5 '-AGCAGCACAGAGGTCAGATGCCGGGCAGCGGTCAATGCCGCACC TTCCATATGATCGGGGCCTATGCGT GCTACCGTGAA-3,； 5 '-AGCAGCACAGAGGTCAGATGGGCCCCCTGCCTGCCAAAAAGGTG TTGCCAGGTTGGCGGCCCTATGCGT GCTACCGTGAA-3,； 5 '-AGCAGCACAGAGGTCAGATGCTCCCAGGCCGTTGGGGCGTTGCC TGCGTGCACCCGGGGCCCTATGCGT GCTACCGTGAA-3,。3. 根據(jù)權利要求1或2所述的適配體，其特征在于:所述適配體其中至少一個核苷酸被 修飾。4. 根據(jù)權利要求3所述的適配體，其特征在于:所述適配體被熒光FAM修飾。5. 根據(jù)權利要求3所述的適配體，其特征在于:所述適配體被熒光基團、同位素、電化學 標記物、酶標記物，以及用于形成組合物的親和配基、巰基所修飾。6. -種篩選如權利要求1、2、4或5任一所述的結合短雙歧桿菌的適配體的方法，包括初 始隨機單鏈DNA文庫構建及引物合成文庫序列，其特征在于:還包括， PCR擴增和非變性聚丙烯酰氨凝膠電泳； ssDNA的純化和變性聚丙烯酰氨凝膠電泳； 反篩，利用長雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、動物雙歧桿菌和青春雙歧桿菌 組成的混合物作為反篩的靶標，將所述混合物與純化后ssDNA文庫進行室溫孵育，離心取上 清作為模板進行PCR，最終得到結合短雙歧桿菌的適配體。7. 根據(jù)權利要求6所述的適配體，其特征在于:所述PCR擴增，其反應系統(tǒng)中加入有機溶 劑二甲亞楓，且二甲亞楓占反應體系體積百分比5%~7%。8. 根據(jù)權利要求6所述的適配體，其特征在于:所述PCR擴增，其退火溫度為69 °C。9. 一種結合短雙歧桿菌的適配體在短雙歧桿菌純化、短雙歧桿菌的固相載體的制備， 以及短雙歧桿菌的快速檢測方面的應用。
【文檔編號】C12N15/10GK105838719SQ201610229311
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年4月13日
【發(fā)明人】陳衛(wèi), 張灝, 胡陸軍, 趙建新, 田豐偉, 王剛, 張秋香, 范大明, 翟齊嘯, 趙國忠
【申請人】江南大學