一種長雙歧桿菌蛋白質(zhì)、其制備方法及醫(yī)藥用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明設(shè)及微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種長雙歧桿菌蛋白質(zhì)、其制備方法及醫(yī) 藥用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 雙歧桿菌作為腸道益生菌廣為人知，近年來針對其腸道益生作用研究發(fā)現(xiàn)，雙歧 桿菌的某些代謝產(chǎn)物能夠抑制其他微生物在腸道內(nèi)壁的定植，進而降低病原微生物的侵害 風(fēng)險。該特征目前已經(jīng)成為篩選雙歧桿菌菌種、研發(fā)功能性益生菌菌劑的重要依據(jù)。
[0003] 現(xiàn)有技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌對其他微生物定植于腸道內(nèi)壁的抑制機制主要是通 過分泌有機酸降低腸道抑值，調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)環(huán)境，同時分泌胞外酶從而影響致病菌或細(xì) 菌毒素的黏附位點及其特異性受體。此外，近年來有學(xué)者認(rèn)為，由雙歧桿菌自身黏附于腸道 所引發(fā)的占位效應(yīng)和空間位阻效應(yīng)可能是阻礙致病菌黏附和入侵的一個重要因素。黏附蛋 白作為雙歧桿菌黏附并定植于胃腸道上皮的重要因子，其物質(zhì)基礎(chǔ)、代謝特性在現(xiàn)有技術(shù) 中尚無明確結(jié)論，
[0004] 盡管現(xiàn)有技術(shù)中曾報道部分具有粘附性的雙歧桿菌表達(dá)蛋白，但其是否就是菌體 定植于腸道內(nèi)壁的功能性物質(zhì)尚不明確;此外，在明確獲得一種雙歧桿菌粘附蛋白的基礎(chǔ) 上，為實現(xiàn)進一步的應(yīng)用，其表達(dá)量、純化效率應(yīng)當(dāng)?shù)玫絻?yōu)化;再次，針對雙歧桿菌粘附蛋 白，應(yīng)當(dāng)進一步研究其生物學(xué)特性，從而為該粘附蛋白的其他用途奠定基礎(chǔ)。
[0005] 長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)是雙歧桿菌屬的一種，屬革蘭氏陽性、無 芽抱、不運動、厭氧性桿菌，廣泛存在于人體尤其嬰兒的腸道中，屬于藥品、微生態(tài)菌劑制備 領(lǐng)域的常規(guī)菌種之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明旨在針對現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)缺陷，提供一種長雙歧桿菌蛋白質(zhì)、其制備方法 及醫(yī)藥用途，W解決現(xiàn)有技術(shù)中缺乏一種成分單一、結(jié)構(gòu)明確的雙歧桿菌粘附蛋白的技術(shù) 問題。
[0007] 本發(fā)明要解決的另一技術(shù)問題是上述長雙歧桿菌蛋白質(zhì)制備方法不明確。
[000引本發(fā)明要解決的再一技術(shù)問題是當(dāng)采用重組表達(dá)方法制備上述長雙歧桿菌蛋白 質(zhì)時，其純化效率較低。
[0009] 本發(fā)明要解決的又一技術(shù)問題是上述長雙歧桿菌蛋白質(zhì)的應(yīng)用范圍存在局限性。
[0010] 本發(fā)明要解決的又一技術(shù)問題是大腸桿菌0157:H7對抗生素的敏感性有待提升。
[0011] 為實現(xiàn)W上技術(shù)目的，本發(fā)明采用W下技術(shù)方案：
[0012] -種長雙歧桿菌蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0013] -種上述長雙歧桿菌蛋白質(zhì)的制備方法，包括W下步驟：
[0014] 1)制備長雙歧桿菌蛋白質(zhì)的重組大腸桿菌表達(dá)菌株；
[0015] 2)取步驟1)所述長雙歧桿菌蛋白質(zhì)的重組大腸桿菌表達(dá)菌株進行培養(yǎng)，至培養(yǎng)液 0D600皿為ο. 6~ο. 9時加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為ο. 8~1.2mM，而后于35~39°C、震蕩條件 下誘導(dǎo)培養(yǎng)4~化；
[0016] 3)收集菌體、破碎、收集上清；
[0017] 4)取步驟3)上清液，利用GST親和層析純化，收集洗脫液后超濾濃縮，脫鹽，干燥， 即得到所述長雙歧桿菌蛋白質(zhì)。
[0018] 作為優(yōu)選，步驟3)所述的破碎是將菌體重懸于PBS緩沖液后，在冰浴條件下超聲破 碎20~30次，每次破碎的持續(xù)時間為2~4s，每2次破碎之間的時間間隔為4~6s。
[0019] 作為優(yōu)選，步驟4)具體包括W下操作：
[0020] a)取緩沖液A，W2.5~3.5mL/min的流速平衡谷脫甘膚瓊脂糖樹脂柱；
[0021] b)取步驟2)上清液，~2mL/min的流速上樣；
[0022] C)取緩沖液B，W0.8~1.2mL/min的流速洗脫，收集洗脫峰處溶液即為洗脫液；
[0023] d)取洗脫液超濾濃縮，而后過脫鹽柱，再利用純水W2.5~3.5mL/min的流速洗脫， 收集洗脫峰處溶液即為第二洗脫液，而后冷凍干燥，即得到所述長雙歧桿菌蛋白質(zhì)；
[0024] 其中所述緩沖液A是含有1.5~2.5mM邸TA的PBS緩沖液；
[0025] 所述緩沖液B是含有1.5~2.5mM邸TA、15~25mM谷脫甘膚的PBS緩沖液;進一步優(yōu) 選的，步驟a)中用于平衡谷脫甘膚瓊脂糖樹脂柱的緩沖液A用量為25~35mL，更優(yōu)的是 30mL〇
[0026] 作為優(yōu)選，步驟1)中所述的震蕩是150~20化/min轉(zhuǎn)速的搖床培養(yǎng)，更優(yōu)的是 18化/min轉(zhuǎn)速的搖床培養(yǎng)。
[0027] 氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示的蛋白質(zhì)用于提升大腸桿菌0157:H7對抗生素敏 感性的應(yīng)用;進一步優(yōu)選的，是上述長雙歧桿菌蛋白質(zhì)作為抗生素抑菌增效劑的應(yīng)用。
[002引作為優(yōu)選，所述抗生素是β-內(nèi)酷胺類抗生素;進一步優(yōu)選的，所述β-內(nèi)酷胺類抗生 素可W是氨節(jié)青霉素、青霉素 G或頭抱霉素。
[0029] 作為優(yōu)選，所述抗生素是氨基糖巧類抗生素;進一步優(yōu)選的，所述氨基糖巧類抗生 素是卡那霉素。
[0030] 作為優(yōu)選，所述抗生素是酷胺醇類抗生素;進一步優(yōu)選的，所述酷胺醇類抗生素是 氯霉素。
[0031] 作為優(yōu)選，所述應(yīng)用是利用含有濃度為45~55yg/mL的、氨基酸序列為SEQ ID NO: 1的蛋白質(zhì)溶液，W接觸方式處理大腸桿菌〇157:H7;進一步優(yōu)選的，被處理大腸桿菌0157: H7在所述蛋白質(zhì)溶液中的濃度是106CFU/mM進一步優(yōu)選的，所述處理時間是1.5~2.化。
[0032] 在W上技術(shù)方案中，所述敏感性是指微生物受抗生素抑制的程度，所述提升微生 物對抗生素敏感性，是指利用含有本發(fā)明長雙歧桿菌蛋白質(zhì)的介質(zhì)解育微生物后，被處理 微生物在抗生素作用下抑菌效果更為顯著。所述長雙歧桿菌蛋白質(zhì)，是說明自然環(huán)境下該 蛋白來源于長雙歧桿菌，而并不構(gòu)成對該蛋白質(zhì)技術(shù)特征的限定作用;在本發(fā)明中，該蛋白 質(zhì)的技術(shù)特征僅由其序列限定。所述長雙歧桿菌蛋白質(zhì)的重組大腸桿菌表達(dá)菌株，是指整 合有本發(fā)明長雙歧桿菌天然表達(dá)基因的重組大腸桿菌;其制備方法通常包括長雙歧桿菌總 DNA的提取，目的基因的擴增，擴增產(chǎn)物的純化，目的基因及載體的酶切、連接，重組載體向 大腸桿菌中的導(dǎo)入，重組子的篩選等步驟;實際制備方法可依據(jù)本領(lǐng)域的一般技術(shù)常識進 行適應(yīng)性設(shè)計。
[0033] 如前文所述，本發(fā)明可用于提升微生物對抗生素的敏感性。但利用本發(fā)明長雙歧 桿菌蛋白質(zhì)處理后的物質(zhì)并不必然予W抗生素處理，當(dāng)予W抗生素處理時，其處理方法可 采用W下方案:氨節(jié)青霉素作用濃度為1~SOyg/mL青霉素 G作用濃度為1~SOyg/mL頭抱 霉素作用濃度為1~50yg/ni;卡那霉素作用濃度為1~25yg/ni;氯霉素作用濃度為1~25μ g/mLo
[0034] 本發(fā)明提供了一種來源于長雙歧桿菌的粘附蛋白，并明確了其氨基酸序列；在此 基礎(chǔ)上基于遺傳工程技術(shù)獲得了一株該蛋白的表達(dá)菌株，并針對菌株及粘附蛋白的特性從 誘導(dǎo)表達(dá)、層析純化、超濾濃縮等方面進行創(chuàng)新性設(shè)計，進而獲得了上述粘附蛋白的高效制 備方法。進一步的，實驗發(fā)現(xiàn)該粘附蛋白不僅能夠粘附于腸上皮細(xì)胞，而且具有提升微生物 抗生素敏感性的作用，基于運種有益的發(fā)現(xiàn)，確定了該蛋白作為抗生素抑菌增效劑的用途， 從而擴展了其用途范圍，同時提供了一種提升微生物藥敏性的新途徑。本發(fā)明基于嚴(yán)謹(jǐn)?shù)?實驗手段獲得了突出的技術(shù)效果，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0035] 圖1是本發(fā)明實施例1中長雙歧桿菌特異性蛋白AIP2的表達(dá)純化電泳檢測圖；圖中 泳道Μ是Protein Marker(12-80kDa);泳道1是E.coli PGEX-4T-1表達(dá)產(chǎn)物(對照）；泳道2是 純化后的AIP2蛋白；泳道3是E.coli PGEX-4T-AIP2融合蛋白表達(dá)產(chǎn)物。
[0036] 圖2是本發(fā)明實施例5中長雙歧桿菌特異性蛋白AIP2提升巧中常見食源性致病菌對 氨節(jié)青霉素敏感性的實驗結(jié)果圖；圖中A部分是長雙歧桿菌特異性蛋白AIP2對單核增生李 斯特菌的作用結(jié)果;B部分是長雙歧桿菌特異性蛋白AIP2對大腸桿菌0157:H7的作用結(jié)果;C 部分是長雙歧桿菌特異性蛋白AIP2對鼠傷寒沙口氏菌的作用結(jié)果。
[0037] 圖3是本發(fā)明實施例6中長雙歧桿菌特異性蛋白AIP2提升巧中常見食源性致病菌對 青霉素 G、頭抱霉素、卡那霉素、氯霉素敏感性的實驗結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0038] W下將對本發(fā)明的【具體實施方式】進行詳細(xì)描述。為了避免過多不必要的細(xì)節(jié)，在 W下實施例中對屬于公知的結(jié)構(gòu)或功能將不進行詳細(xì)描述。
[0039] W下實施例中所使用的近似性語言可用于定量表述，表明在不改變基本功能的情 況下可允許數(shù)量有一定的變動。因此，用"大約"、"左右"等語言所修正的數(shù)值不限于該準(zhǔn)確 數(shù)值本身。在一些實施例中，"大約"表示允許其修正的數(shù)值在正負(fù)百分之十（10%)的范圍 內(nèi)變化，比如，"大約100"表示的可W是90到110之間的任何數(shù)值。此外，在"大約第一數(shù)值到 第二數(shù)值"的表述中，大約同時修正第一和第二數(shù)值兩個數(shù)值。在某些情況下，近似性語言 可能與測量儀器的精度有關(guān)。
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