本發(fā)明屬于功能糖醇生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種低聚合度低聚木糖及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
低聚木糖是由β-1，4內(nèi)切木聚糖酶水解β-1，4糖苷鍵形成。低聚木糖可以作為雙歧因子使人體腸道內(nèi)的有益菌雙歧桿菌成倍增長，改善有機體(人和動物)消化道菌群平衡，促進消化道有益細菌的生長，抑制有害微生物的繁殖，促進營養(yǎng)吸收，提高機體免疫力。
低聚木糖中的木二糖是不能為人體消化吸收但可發(fā)酵的糖類物質(zhì)，具雙歧桿菌增殖效能，木三糖為三個木糖分子以β-1，4糖苷鍵相連而成，同樣是不為人體消化吸收但可發(fā)酵的糖類物質(zhì)，也具有雙歧桿菌增殖效能，木四糖與木三糖功能相似。卜曉莉、余世袁等(低聚木糖各組分的層析分離及對雙歧桿菌的增殖)研究發(fā)現(xiàn)：聚合度為2-5的低聚木糖對青春雙歧桿菌的增殖效能明顯強于聚合度為6-8低聚木糖?？梢?，低聚合度XOS2-4是低聚木糖產(chǎn)品中的主要有效成分，其含量的多少對其雙歧因子增殖作用起著關(guān)鍵作用。另外，提升低聚合度低聚木糖的比例含量，可間接通過去除高聚合度的低聚木糖的方法達到。
目前低聚木糖產(chǎn)品主要由聚合度2-9的木聚糖組成，產(chǎn)品中聚合度7-9的木聚糖占有較大的比例含量，產(chǎn)品中木二糖、木三糖、木四糖純度只有60％左右，使產(chǎn)品的雙歧因子增殖效能大打折扣。在目前專利及文獻資料中，制備低聚合度低聚木糖主要采用聚丙烯酰胺凝膠、活性炭等介質(zhì)分離洗脫以及酶生物催化與膜分離結(jié)合等技術(shù)制備：專利CN 1847254A采用聚丙烯酰胺凝膠為層析介質(zhì)洗脫、分離，制備出各種聚合度的低聚木糖；專利CN101632877A中介紹了一種利用活性炭對低聚木糖各單一組分進行分離純化，制備出各種聚合度低聚木糖；專利102796783A采用多功能糖酶生物催化與膜分離結(jié)合的技術(shù)，制備聚合度為3-8的功能葡聚糖產(chǎn)品。這些制備方法中分離分化步驟比較繁瑣、也不適用于工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用。專利CN1364911A通過控制里氏木霉產(chǎn)酶前期和后期的反應(yīng)條件，產(chǎn)生高活力的木聚糖酶，利用該木聚糖酶酶解木聚糖制備聚合度為2-5的低聚木糖。但是，該制備方法中初始原料為木聚糖，經(jīng)過乙醇沉淀、超濾、納濾柱層析等方法提純得到，限制了該技術(shù)的應(yīng)用范圍。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
為彌補現(xiàn)有技術(shù)之缺陷，本發(fā)明提供一種低聚合度低聚木糖的制備方法。本發(fā)明采用前處理工藝及酶解技術(shù)，結(jié)合電滲析方法對低聚木糖液凈化處理，可減少樹脂處理過程中酸堿損耗，同時可對電滲析后的殘液回收利用，制備出對功能性雙歧因子有益增殖、生產(chǎn)工藝簡單、生產(chǎn)效率高的低聚合度低聚木糖，不僅可以提高低聚糖品質(zhì)，而且可以提高生產(chǎn)效率。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：
本發(fā)明的第一方面，提供一種低聚合度低聚木糖的制備方法，包括如下步驟：
(1)以木質(zhì)纖維生物質(zhì)為原料，經(jīng)過稀堿/熱水前處理，過濾液體，對固相采用高溫降解或蒸汽爆破預(yù)處理方式，將木質(zhì)纖維質(zhì)原料中的半纖維素長鏈降解，使其中的木聚糖溶出，預(yù)處理后料液中的木糖含量控制在5-20％；降溫待用；
(2)步驟(1)中的預(yù)處理液加入木質(zhì)纖維生物質(zhì)干重0.01-0.03％的木聚糖酶進行酶解反應(yīng)；
(3)酶解液經(jīng)滅酶、凈化、濃縮、干燥處理制備出低聚合度低聚木糖。
優(yōu)選的，所述步驟(1)中木質(zhì)纖維生物質(zhì)包括：棉籽殼、玉米芯、玉米秸稈、甘蔗渣或麩皮中的一種或多種；進一步優(yōu)選所述木質(zhì)纖維生物質(zhì)為玉米芯；
優(yōu)選的，所述步驟(1)中木質(zhì)纖維生物質(zhì)原料前處理方法具體為：
熱水法：將所述木質(zhì)纖維生物質(zhì)原料與工藝水按1:(6-12)的質(zhì)量比混合，50-100℃熱水處理30min-90min，過濾液體；
稀堿法：將所述木質(zhì)纖維生物質(zhì)原料與工藝水按1:(6-12)的質(zhì)量比混合，加入所述木質(zhì)纖維生物質(zhì)原料干重百分比0.01-0.5％的堿溶液，50-100℃熱水處理30min-90min，過濾液體，并水洗至固相接近pH至7；其中堿為氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨水或氨基鈉的一種或多種；
所述前處理方式還包括其它與本發(fā)明具有等同效果的前處理工藝；
優(yōu)選的，所述步驟(1)中對固相進行高溫降解方法具體為：固相與工藝水按1:(6-12)的質(zhì)量比混合加入固相干重百分比為0.3-1.5％的弱酸催化劑，在160-170℃蒸煮30min-90min；
優(yōu)選的，所述步驟(1)中對固相進行蒸汽爆破方法具體為：固相與工藝水按1:(1-5)的質(zhì)量比混合，加入固相干重百分比0.3-1.2％的弱酸催化劑，處理壓力1.5-2.5MPa，時間30s-300s；
上述高溫降解方法和蒸氣爆破方法中弱酸催化劑為乙酸、甲酸、檸檬酸、乳酸、亞硫酸或碳酸中的一種或多種；
所述預(yù)處理方式還包括其它與本發(fā)明具有等同效果的預(yù)處理降解方法；
進一步優(yōu)選的，所述料液中木糖含量計算方法為：HPLC檢測，木糖組分的峰面積占總糖峰面積的百分比；檢測條件為：色譜柱為Shodex sugar KS-802，或其他具有同等分析效果的色譜柱；流動相為超純水，柱溫80℃，流速0.5-0.7ml/min；
優(yōu)選的，所述步驟(1)中的具體步驟為：
以棉籽殼為原料，經(jīng)稀堿法進行前處理，過濾液體，對固相采用蒸汽爆破預(yù)處理方式，將木質(zhì)纖維質(zhì)原料中的半纖維素長鏈降解，使其中的木聚糖溶出，預(yù)處理后料液中的木糖含量控制在5-20％，降溫待用；
其中，所述稀堿法為將棉籽殼與工藝水按1:(6-12)的質(zhì)量比混合，加入所述棉籽殼原料干重百分比0.01-0.5％的堿溶液，50-100℃熱水處理30min-90min，過濾液體，并水洗至固相接近pH至7；其中所述堿為氫氧化鈉；
所述蒸汽爆破預(yù)處理具體方法為：固相與工藝水按1:(1-5)的質(zhì)量比混合，加入固相干重百分比0.3-1.2％的弱酸催化劑，處理壓力1.5-2.5MPa，處理溫度為150-190℃，時間30s-300s；其中所述弱酸催化劑為乙酸；
本發(fā)明采用以稀堿法結(jié)合蒸汽爆破法對低聚木糖進行前處理，發(fā)明人在實踐研究中發(fā)現(xiàn)，稀堿法可以有效將原料中的木聚糖主鏈上的乙?；?、葡萄糖基、阿拉伯糖基去除，使得產(chǎn)品單糖含量大幅度降低，有利于提高產(chǎn)品低聚合度木聚糖所占比例；同時，通過上述添加比例，使得加入堿后的溶液pH維持在8-10之間，從而有效避免因堿性過高導致木聚糖結(jié)構(gòu)破壞降低低聚木糖收率；同時也避免因堿性過低導致無法起到去除雜糖鏈、乙酰基及少量木質(zhì)素和膠質(zhì)的作用效果；而后通過蒸汽爆破法對植物細胞壁進行進一步的機械破壞，從而使得木聚糖進一步溶解在提取液中，同時，由于前期經(jīng)過稀堿法處理并在蒸汽爆破法中加入弱酸催化劑，從而有效降低蒸汽爆破法反應(yīng)溫度和壓力，避免提取液顏色較深；
同時，發(fā)明人在實踐研究意外發(fā)現(xiàn)經(jīng)過預(yù)處理后的木糖含量這一指標對于控制木聚糖降解程度和溶出效果非常重要；當木糖含量過高時(＞20％)，盡管木聚糖的解離度提高，但是副產(chǎn)物明顯增多，導致后續(xù)酶解過程得到的低聚木糖含量比例降低，而預(yù)處理后的木糖含量較低(＜5％)時，木聚糖解離度偏低，不利于后續(xù)木聚糖酶的酶解作用，同樣導致后續(xù)低聚木糖收率降低；而且，經(jīng)過前處理和預(yù)處理工藝后，后續(xù)酶解時間減少，而且，木聚糖酶使用量降低，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。
優(yōu)選的，所述步驟(2)中木聚糖酶為里氏木霉、綠垂曲霉或具有等同效果的其它菌株進行微生物發(fā)酵處理制備的β-1,4-內(nèi)切型木聚糖酶，另有β-木糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶等具有降解半纖維素的酶系輔助作用；
優(yōu)選的，所述步驟(3)中凈化步驟包括活性炭脫色和電滲析脫鹽，其中所述活性炭脫色采用的脫色溫度為50-90℃，活性炭添加量為0.1-2％，脫色時間為20-90min，脫色完成后板框過濾；電滲析脫鹽后達標料液電導率≤800μs/cm，pH＝4-8，電滲析溫度15-42℃，其中陽離子交換膜和陰離子交換膜的膜壓差為0.2-0.8MPa，陽極室和陰極室殘液進行回收利用。
本發(fā)明的第二個方面，公開了上述制備方法制備得到的低聚合度低聚木糖。經(jīng)上述制備方法得到的低聚木糖，聚合度(Degree of Polymerization，簡稱DP)為2-6之間，低聚木糖純度≥75％，其中聚合度2-4低聚木糖純度≥70％，同時研究發(fā)現(xiàn)，所述低聚木糖不含阿拉伯糖、乙?；鶄?cè)鏈，結(jié)構(gòu)式如下所示：其中n＝0～4，A、B、C和D分別對應(yīng)于二維核磁共振波譜解析中的4個端基；
本發(fā)明的第三個方面，公開了上述低聚合度低聚木糖在動物雙歧桿菌及干酪乳桿菌增殖中的應(yīng)用。由于制備方法不同，所得到的低聚木糖產(chǎn)品中低聚木糖的純度、各聚合度低聚木糖比例、雜質(zhì)的組分比例并不相同，現(xiàn)有技術(shù)并未提供本發(fā)明所屬結(jié)構(gòu)和/組成的低聚木糖，而本發(fā)明制備得到的低聚木糖產(chǎn)品，經(jīng)試驗驗證，對動物雙歧桿菌及干酪乳桿菌增殖具有良好的效果。
本發(fā)明的有益效果為：
本發(fā)明通過前處理和預(yù)處理工藝的協(xié)同作用，能夠有效提高木糖溶出度和降解效果，同時有效降低提取液色度及副產(chǎn)物產(chǎn)生，并能顯著降低木聚糖酶添加量，縮短酶解反應(yīng)時間，提高產(chǎn)品純度；
本發(fā)明在制備中采用電滲析方法替代離子交換樹脂的應(yīng)用，減少酸堿用量及樹脂再生，節(jié)約生產(chǎn)成本；一步法低聚合度低聚木糖的制備，減少傳統(tǒng)制備方法中聚丙烯酰胺凝膠、活性炭、膜分離、色譜分離等洗脫、分離步驟，簡化工藝。
總之，本發(fā)明通過合理優(yōu)化各工藝步驟，最終得到低聚木糖聚合度低，以木二糖、木三糖和木四糖為主，從而增強其作為雙歧因子的功能性，經(jīng)試驗驗證，所制備得到的低聚木糖對動物雙歧桿菌及干酪乳桿菌增殖效果好?？傊景l(fā)明簡化了工藝，提升產(chǎn)品品質(zhì)，具有良好的應(yīng)用前景。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
實施例1
取棉籽殼450g，與濃度為0.05％的氫氧化鈉溶液按1:7的質(zhì)量比混合，升溫至60攝氏度保溫30min，濾除液體；水洗一遍至pH值中性；與工藝水按1:3的質(zhì)量比混合，加入棉籽殼干重百分比0.7％的弱酸催化劑(乙酸)，蒸汽爆破處理，處理壓力1.5-2.5MPa，時間120s；氣爆液中的木糖含量為5.85％，降溫待用。向蒸煮液加入0.8g木聚糖酶，酶解反應(yīng)溫度為60℃，酶解時間為8h，酶解液經(jīng)滅酶、活性炭脫色、電滲析除鹽、濃縮制備低聚合度低聚木糖。所述活性炭脫色采用的脫色溫度為50-90℃，活性炭添加量為0.1-2％，脫色時間為20-90min，脫色完成后板框過濾；電滲析脫鹽后達標料液電導率≤800μs/cm，pH＝4-8，電滲析溫度15-42℃，其中陽離子交換膜和陰離子交換膜的膜壓差為0.2-0.8MPa，陽極室和陰極室殘液進行回收利用。
表1實施例1中低聚合度低聚木糖組分含量表
由表1可知：實施例1產(chǎn)品中，低聚合度2-6低聚木糖純度為87.21％，不含木七糖等高聚合度低聚木糖，且聚合度2-4木聚糖純度為83.04％。
實施例2
取玉米芯450g，與工藝水按1:6的質(zhì)量比混合升溫至80攝氏度保溫40min,濾除液體；加入玉米芯干重百分比為0.8％的乙酸，高溫蒸煮處理，處理條件為：蒸煮溫度165℃，蒸煮時間50min，將玉米芯中的木聚糖溶出，蒸煮液中的木糖含量為15.75％，降溫待用。向蒸煮液加入0.1g木聚糖酶，酶解反應(yīng)溫度為80℃，酶解時間為8h，酶解液經(jīng)滅酶、活性炭脫色、電滲析除鹽、濃縮制備低聚合度低聚木糖。所述活性炭脫色采用的脫色溫度為50-90℃，活性炭添加量為0.1-2％，脫色時間為20-90min，脫色完成后板框過濾；電滲析脫鹽后達標料液電導率≤800μs/cm，pH＝4-8，電滲析溫度15-42℃，其中陽離子交換膜和陰離子交換膜的膜壓差為0.2-0.8MPa，陽極室和陰極室殘液進行回收利用。
表2實施例2中低聚合度低聚木糖組分含量表
由表2可知：實施例2產(chǎn)品中，低聚合度低聚木糖純度為79.16％，不含木七糖等高聚合度低聚木糖，且聚合度2-4木聚糖純度為71.18％。
實施例3
取麥秸450g，與工藝水按1:10的質(zhì)量比混合升溫至90攝氏度保溫60min，濾除液體；與工藝水按1:8的質(zhì)量比混合，加入麥秸干重百分比為1.2％的乙酸，高溫蒸煮處理，處理條件為：蒸煮溫度165℃，蒸煮時間60min，將麥秸中的木聚糖溶出，蒸煮液中的木糖含量為19.96％，降溫待用。向蒸煮液加入0.4g木聚糖酶，酶解反應(yīng)溫度為80℃，酶解時間為8h，酶解液經(jīng)滅酶、活性炭脫色、電滲析除鹽、濃縮制備低聚合度低聚木糖。所述活性炭脫色采用的脫色溫度為50-90℃，活性炭添加量為0.1-2％，脫色時間為20-90min，脫色完成后板框過濾；電滲析脫鹽后達標料液電導率≤800μs/cm，pH＝4-8，電滲析溫度15-42℃，其中陽離子交換膜和陰離子交換膜的膜壓差為0.2-0.8MPa，陽極室和陰極室殘液進行回收利用。
表3實施例3中低聚合度低聚木糖組分含量表
由表3可知：實施例3產(chǎn)品中，低聚合度低聚木糖純度為75.09％，不含木七糖、木六糖等高聚合度低聚木糖，且聚合度2-4木聚糖純度為72.11％。
對比例1
方法同實施例1，唯一不同之處在于省去稀堿法這一處理步驟，即省去“與濃度為0.05％的氫氧化鈉溶液按1:7的質(zhì)量比混合，升溫至60攝氏度保溫30min，濾除液體；水洗一遍至pH值中性”步驟。
表4對比例1中低聚合度低聚木糖組分含量表
由表4可知：對比例1產(chǎn)品中，低聚合度2-6低聚木糖純度為77.79％，含木七糖，聚合度2-4木聚糖純度為73.51％。
實施例4
對實施例1-3和對比例1中得到的低聚合度低聚木糖進行干酪乳桿菌增殖的體外厭氧培養(yǎng)實驗：以去掉葡萄糖的MRS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中加入不同的低聚木糖替代葡萄糖作為低聚木糖培養(yǎng)基。以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對照，采用比濁法測定生長量，在不同培養(yǎng)時間測其OD600nm，繪制生長曲線。
活化菌種：取-85℃保存的甘油冷凍管乳桿菌菌種，接種到MRS液體培養(yǎng)基中，接種量1％，36℃培養(yǎng)36h。
干酪乳桿菌增殖：將滅菌好的糖漿和葡萄糖添加到對應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，然后向各個培養(yǎng)基中接種活化好的干酪乳桿菌，接種量1％，36℃培養(yǎng)36h。
由體外增殖實驗可看出，低聚合度低聚木糖對干酪乳桿菌的增殖效果比普通低聚木糖效果好，且實施例1-3增殖效果優(yōu)于對比例1。
實施例5
對實施例1-3和對比例1中得到的低聚合度低聚木糖進行動物雙歧桿菌增殖的體外厭氧培養(yǎng)實驗：以去掉葡萄糖的MRS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中加入不同的低聚木糖替代葡萄糖作為低聚木糖培養(yǎng)基。以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對照，采用比濁法測定生長量，在不同培養(yǎng)時間測其OD600nm，繪制生長曲線。
活化菌種：取-85℃保存的甘油冷凍管菌種，接種到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，接種量1％，36℃培養(yǎng)36h。
動物雙歧桿菌增殖：將滅菌好的低聚糖和葡萄糖添加到對應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，然后向各個培養(yǎng)基中接種活化好的動物雙歧桿菌，接種量1％，36℃培養(yǎng)48h。
由體外增殖實驗可看出，低聚合度低聚木糖對動物雙歧桿菌的增殖效果比普通低聚木糖效果好，且實施例1-3增殖效果優(yōu)于對比例1。
上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明白，在本發(fā)明的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員不需要付出創(chuàng)造性勞動即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護范圍。