相關申請案

本申請案依據(jù)35u.s.c.§119(e)請求于2014年7月31日提申的美國臨時申請案第62/031,406號的優(yōu)先權，其全部內(nèi)容以引用的方式并入本文。

本發(fā)明提供結(jié)合ctla-4并拮抗ctla-4的適體及其增進免疫活性與治療癌癥和hiv感染的用途。

背景技術：

癌癥是導致人類死亡與極大金融損失的最重要疾病。依據(jù)2004年的who報告，在全世界有超過740萬人因為這個疾病而喪生且罹病者仍逐年增加(abou-alfa,g.k.,etal.(2006),jclinoncol24,4293-4300)。癌癥的主要治療是外科手術、化學療法以及放射線療法。但是，這些傳統(tǒng)療法會造成嚴重副作用而且也會殺死正常細胞。

因此，開發(fā)了標靶療法且經(jīng)證實能有效治療數(shù)種類型的癌癥(vancutsem,e.,etal.(2009),nengljmed360,1408-1417，klein,s.andlevitzkia.(2007),advcancerres97,295-319)。但是，幾乎沒有腫瘤特異性標記而且只有少數(shù)標靶療法成功應用于臨床上(jain,r.k.,etal.(2009),natreyclinoncol6,327-3384，gazdar,a.f.(2009),oncogene28suppl1,s24-31)。此外，許多研究已顯示，基因體不穩(wěn)定促使對標靶療法的抗性(dassie,j.p.,etal.(2009),natbiotechnol27,839-849，sica,a.,schioppa,t.,mantovani,a.,andallavena,p.(2006),eurjcancer42,717–727)。最近，報導已指出腫瘤周遭微環(huán)境與腫瘤進展(尤其是免疫侵襲)有強烈相關性(pollard,j.w.(2004),natrevcancer4,71-78，devisser,k.e.,andcoussens,l.m.(2006),contribmicrobiol13,118-137，stewart,t.j.,and25abrams,s.i.(2008),oncogene27,5894-5903，joyce,j.a.,andpollard,j.w.(2009),natrevcancer9,239-252)。

數(shù)種細胞類型已被提出在腫瘤微環(huán)境中扮演關鍵角色并且參與腫瘤進展，包括腫瘤相關巨噬細胞(tam)、調(diào)節(jié)性t細胞(treg)、天然殺手(nk)細胞以及cd8⁺t細胞(solinas,g.,germano,g.,mantovani,a.,andallavena,p.(2009),jleukocbiol86,1065-1073，zou,w.(2006),natrevimmunol6,295-307，whiteside,t.l.(2006),cancertreatres130,103-124，coffelt,s.b.hughes,r.,andlewis,c.e.(2009),biochimbiophysacta1796,11-18)。nk以及cd8⁺t細胞是通過細胞媒介的細胞毒性來消滅異常腫瘤細胞的兩種主要有效細胞類型。treg細胞代表整個cd4⁺t細胞的一小部分(5-6％)(wang,r.f.,peng,g.,andwang,h.y.(2006),seminimmunol18,136-142)，而且在腫瘤微環(huán)境中是另一種主要調(diào)節(jié)性細胞類型。在正常環(huán)境下，treg細胞保護宿主免于自身反應性t細胞，因而預防自體免疫疾病形成(corthay,a.(2009),scandjimmunol70,326-336)。但是，在腫瘤微環(huán)境中，treg可分泌諸如il-10與tgf-β的細胞激素來抑制腫瘤靶定內(nèi)生性(nk細胞)與順應性(cd8⁺t細胞)免疫反應的功能(bingle,l.,brown,n.j.,andlewis,c.e.(2002),jpathol196,254-265)以及保護腫瘤細胞免于免疫清除(andrew,g.etal.(2006),jimmunol177,896-904)。

可在腫瘤微環(huán)境中下調(diào)免疫系統(tǒng)的一種蛋白質(zhì)受體是細胞毒性t淋巴球抗原4(ctla-4)，也已知是分化群152(cd152)。ctla-4是在t細胞表面上被發(fā)現(xiàn)到，而t細胞會針對抗原發(fā)動細胞免疫攻擊。t細胞可以通過刺激t細胞上的cd28受體而被活化，其亦可通過刺激ctla4受體而被抑制。

雖然抗體通常使用于靶定疾病蛋白質(zhì)，但它們有自己的限制性，包括生產(chǎn)成本高、穩(wěn)定性低，且在許多情況下對它們能夠靶定的表位有所限制。適體擁有許多使其適用于治療應用的優(yōu)點，諸如分子量較低而容許更容易穿透過組織、化學合成成本低、修飾方法已建立以及高穩(wěn)定性。因此，開發(fā)出對某個目標蛋白質(zhì)具有高親和力的適宜適體有極大利益。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明內(nèi)容至少一部分是基于意外發(fā)現(xiàn)，靶定ctla-4(ca21)的核苷酸適體在同系小鼠模型中成功地壓制肺腫瘤細胞生長達超過70％。

因此，本發(fā)明內(nèi)容的一個態(tài)樣是特征為一種結(jié)合至ctla-4的核酸適體。該適體包含與(i)gatggtgaaaatgggcctagggtggacggt(seqidno:1)、(ii)gatgactggatgcaaaaatgctgtggggta(seqidno:6)、(iii)gtccacactcagaaaacagaatagggggta(seqidno:7)，或(iv)cgatcgaaaatgtccagggagttgtctgta(seqidno:8)至少85％(例如90％或95％)一致的核酸序列。此一抗ctla-4適體可以低于20nm的解離常數(shù)(kd)結(jié)合至ctla-4。在一個實例中，該抗-ctla4適體包含gatggtgaaaatgggcctagggtggacggt(seqidno:1)、gatgactggatgcaaaaatgctgtggggta(seqidno:6)、gtccacactcagaaaacagaatagggggta(seqidno:7)，或cgatcgaaaatgtccagggagttgtctgta(seqidno:8)的核酸序列。此一抗-ctla4適體可為具有tccctacggcgctaacgatggtgaaaatgggcctagggtggacggtgccaccgtgctacaac(seqidno:2)、tccctacggcgctaacgatgactggatgcaaaaatgctgtggggtagccaccgtgctacaac(seqidno:3)、tccctacggcgctaacgtccacactcagaaaacagaatagggggtagccaccgtgctacaac(seqidno:4)，或tccctacggcgctaaccgatcgaaaatgtccagggagttgtctgtagccaccgtgctacaac(seqidno:5)的核酸。

本文所述任一種抗-ctla-4適體可與聚乙二醇(peg)接合，聚乙二醇可具有范圍自30kda至50kda的分子量，例如40kda。在一些實例中，peg接合至該適體的3’端。

在另一個態(tài)樣中，本發(fā)明內(nèi)容提供一種醫(yī)藥組成物，其包含本文所述任一種抗-ctla-4適體以及醫(yī)藥上可接受的載劑。

在又另一個態(tài)樣中，本發(fā)明內(nèi)容提供一種治療癌癥(例如肺癌、黑色素瘤、結(jié)腸直腸癌，或腎細胞癌)的方法，該方法包含向有需要的個體投與(例如靜脈內(nèi))有效量的如本文所述任一種醫(yī)藥組成物，其包含亦如本文所述的抗-ctla-4適體。

在一些實例中，受到本文所述方法治療的個體為人類患者，例如患有癌癥、懷疑患有癌癥或處于癌癥風險下的人類患者。

此外，本揭示內(nèi)容是特征為一種在個體體內(nèi)增進免疫活性的方法，該方法包含向有需要的個體投與(例如靜脈內(nèi))有效量(例如足夠增加t細胞活化之量)的本文所述任一種醫(yī)藥組成物，其包含亦如本文所述的抗-ctla-4適體。在一些實例中，該個體可以是患有癌癥(例如肺癌、黑色素瘤、結(jié)腸直腸癌，或腎細胞癌)、懷疑患有癌癥或處于癌癥風險下的人類患者。在其他實例中，該患者為患有或懷疑患有hiv感染的人類患者。

亦落在本發(fā)明內(nèi)容范疇中的是(a)用于治療癌癥(例如肺癌、黑色素瘤、結(jié)腸直腸癌，或腎細胞癌)或hiv感染的醫(yī)藥組成物，其中該醫(yī)藥組成物包含如本文所述的抗-ctla-4核酸適體(例如包含與(i)gatggtgaaaatgggcctagggtggacggt(seqidno:1)、(ii)gatgactggatgcaaaaatgctgtggggta(seqidno:6)、(iii)gtccacactcagaaaacagaatagggggta(seqidno；7)，或(iv)cgatcgaaaatgtccagggagttgtctgta(seqidno:8)至少85％(例如90％或95％)一致的核酸序列的核酸)以及醫(yī)藥上可接受的載劑，以及(b)ctla-4適體用于制造供治療癌癥(例如肺癌、黑色素瘤、結(jié)腸直腸癌，或腎細胞癌)或hiv感染之藥物的用途。

本發(fā)明的一或多個具體例的詳細內(nèi)容列于下面的說明中。本發(fā)明的其他特征或益處將因為下列圖式與數(shù)個具體例的詳細說明，還有因為隨附權利要求而清楚。

附圖說明

圖1包括顯示通過selex進化而結(jié)合親和力增加的圖。a區(qū)是顯示在各種濃度下適體對ctla-4的結(jié)合活性的圖。針對ctla-4的第4、8、12、16回合中的適體池經(jīng)擴增并且自500nm起連續(xù)稀釋2倍。通過與經(jīng)ctla-4轉(zhuǎn)染的野生型293t細胞培養(yǎng)，針對每一選定池分析十個劑量點。結(jié)合的適體是通過rt-qpcr定量。結(jié)果顯示于a區(qū)的xy圖中。圓圈表示第4回合的結(jié)果、矩形表示第8回合的結(jié)果、指向上方的三角形表示第12回合的結(jié)果而反向三角形表示第16回合的結(jié)果。虛線表示各個池的擬合曲線。第4、8、12、16回合的解離常數(shù)分別為120.7nm、24nm、8.8nm與6.6nm。

b-i區(qū)顯示對表現(xiàn)在野生型293t細胞上的ctla-4的適體結(jié)合活性的facs分析圖。selex第4、8、12及16回合的適體池是通過pcr而被alexafluor647標記。經(jīng)標記適體與野生型293t細胞(b、c、d與e區(qū))或經(jīng)ctla-4轉(zhuǎn)染的野生型293t細胞(f、g、h、i區(qū))一起培育。使用流式細胞儀來評估結(jié)合信號。b、c、d與e區(qū)顯示野生型293t細胞的結(jié)果，而f、g、h與i區(qū)顯示經(jīng)轉(zhuǎn)染293t細胞的結(jié)果。

圖2顯示通過selex進化篩選出的適體的ctla-4結(jié)合活性的圖。a區(qū)與b區(qū)為facs分析圖，顯示選定適體對表現(xiàn)在野生型293t細胞上的ctla-4的結(jié)合活性。a區(qū)顯示經(jīng)ctla-4表現(xiàn)質(zhì)體轉(zhuǎn)染的293t細胞而b區(qū)顯示為做為陰性對照的未轉(zhuǎn)染293t細胞。如指明，a區(qū)與b區(qū)的細胞與10nm經(jīng)alexafluor647標記的ca7、ca21、ca32及ca82適體一起培育。在洗掉未結(jié)合的適體后，通過流式細胞儀測定螢光信號而野生型293t細胞的結(jié)果顯示于a區(qū)中。表現(xiàn)ctla-4的野生型293t細胞的結(jié)果顯示于b區(qū)中。c、d、e與f區(qū)分別顯示適體ca7、ca21、ca32與ca82的ctla-4結(jié)合親和力。選出四個適體并特征鑒定其對ctla-4表現(xiàn)細胞的結(jié)合親和力。首先合成這些適體并且自250nm起連續(xù)稀釋2倍。在選定池與穩(wěn)定表現(xiàn)ctla-4的293細胞培育之后分析六個劑量點。ca7、ca21、ca32與ca82的解離常數(shù)分別為51.48mm、11.84nm、61.75nm與36.51nm。

圖3包括顯示在a區(qū)中抗-ctla-4適體的序列，以及在b區(qū)中抗-ctla-4適體ca21的預測二級結(jié)構(gòu)的圖。在a區(qū)的ca21的核苷酸序列(seqidno:2)中，底線g殘基指出形成g-四股螺旋結(jié)構(gòu)的可能位置。5’端與3’端的16個灰色核苷酸指出5’引子區(qū)及3’引子區(qū)。依據(jù)mfold決定的ca21二級結(jié)構(gòu)顯示于b區(qū)中，而這個結(jié)構(gòu)的δg為-10.6。

圖4包括顯示抗-ctla-4適體ca21的抗癌效用的圖。a區(qū)是顯示于同系小鼠模型中，單次注射ca21寡核苷酸壓制tc-1細胞的肺腫瘤生長的圖。小鼠tc-1肺癌細胞(3x10⁵)皮下植入至c57bl/6小鼠體內(nèi)。當腫瘤的短軸達到8mm時，將0.3nmoleca21(于pbs中)或?qū)φ誴bs注入小鼠的腹膜空間內(nèi)。注射日記錄為第0天且每周測量腫瘤尺寸兩次。相較于適體ca21治療(參見a區(qū)中的下排腫瘤)，在對照組中大略觀察到數(shù)個組織反應(參見a區(qū)中的上排腫瘤)。b區(qū)是顯示對照小鼠與經(jīng)ca21治療的小鼠的腫瘤體積平均值的圖。c區(qū)是顯示經(jīng)ca21治療的小鼠與經(jīng)pbs治療的小鼠的腫瘤生長率的圖。通過公式(lxd²)/2計算腫瘤尺寸，其中l(wèi)為長直徑，而d為短直徑。d區(qū)是顯示經(jīng)ca21或pbs治療的小鼠的體重的圖。e區(qū)是顯示ca21對tc-1細胞生長的活體外抑制活性的圖。

圖5包括顯示抗-ctla-4適體ca21在同系小鼠模型中對ct26結(jié)腸癌細胞的抗癌效用的圖。a區(qū)顯示皮下注射ct26結(jié)腸癌細胞的balb/c小鼠的腫瘤體積。在腫瘤達到8mm后，于第4、6、8與10天將0.3nmoleca21(于pbs中)(矩形)或?qū)φ誴bs(圓圈)注入小鼠的腹膜空間內(nèi)。ct26細胞注射日紀錄為第0天，且每周測量腫瘤尺寸三次。圖顯示經(jīng)抗-ctla-4適體ca21治療的小鼠的腫瘤體積減少大約70％。b區(qū)顯示經(jīng)對照pbs治療的c57bl/6小鼠的腫瘤(參見b區(qū)的上排腫瘤)或經(jīng)ca21適體治療的c57bl/6小鼠的腫瘤(參見b區(qū)的下排腫瘤)。

圖6包括顯示抗-ctla-4適體c21在同系小鼠模型中對路易士(lewis)肺癌細胞的抗癌效用的圖。a區(qū)顯示皮下注射路易士肺癌細胞的c57b/6小鼠的腫瘤體積。在腫瘤達到8mm后，于第4、6、8、10與12天將0.3nmoleca21(于pbs中)(矩形)或?qū)φ誴bs(圓圈)注入小鼠的腹膜空間內(nèi)。路易士肺細胞注射日紀錄為第0天，且每周測量腫瘤尺寸三次。圖顯示經(jīng)抗-ctla-4適體ca21治療的小鼠的腫瘤體積減少大約50％。b區(qū)顯示經(jīng)對照pbs治療的c57bl/6小鼠的腫瘤(參見b區(qū)的上排腫瘤)或經(jīng)ca21適體治療的c57bl/6小鼠的腫瘤(參見b區(qū)的下排腫瘤)。

圖7是顯示ca21適體與聚乙二醇化ca21適體(ca21-peg)在同系小鼠模型中通過靜脈內(nèi)注射對路易士肺癌細胞的抗癌效用的比較圖。圖顯示皮下注射路易士肺癌細胞的c57b/6小鼠的腫瘤體積。在腫瘤達到8mm后，將0.3nmoleca21(于pbs中)(矩形)、0.3nmoleca21-peg(于pbs中)(三角形)或?qū)φ誴bs(圓圈)經(jīng)由尾靜脈注射靜脈內(nèi)注入小鼠。路易士肺細胞注射日紀錄為第0天，且每周測量腫瘤尺寸兩次。圖顯示，相較于ca21適體，經(jīng)聚乙二醇化ca21適體(ca21-peg)治療的小鼠的腫瘤體積減少約50％。

具體實施方式

發(fā)明的詳細說明

本發(fā)明內(nèi)容是以下列為基礎：開發(fā)特異地結(jié)合并抑制ctla-4的核酸適體(例如ca21)且意外發(fā)現(xiàn)此核酸適體在同系小鼠模型中成功地壓制癌細胞生長達超過70％。該抗-ctla4適體治療不會影響小鼠體重，暗示該適體大體上無毒。因此，諸如ca21的抗-ctla-4適體將有效增進免疫活性并減低癌癥生長。

因此，本文描述諸如ca21的抗-ctla-4適體、包含抗-ctla-4適體的醫(yī)藥組成物，以及使用本文揭示的抗-ctla-4適體來增進免疫活性及/或治療諸如癌癥與hiv感染的疾病的方法。

抗-ctla-4核酸適體

本文描述結(jié)合至ctla-4并抑制其活性的核酸適體(抗-ctla-4適體)，從而增進免疫活性(諸如t細胞活性)。如本文所用核酸適體意指一種對特定目標分子(例如ctla-4)具有結(jié)合活性并因而抑制其活性的核酸分子(dna或rna)。本揭示內(nèi)容的抗-ctla-4適體呈線性或環(huán)狀形式，可以是rna、dna(例如單股dna)、經(jīng)修飾核酸，或其混合物。該抗-ctla-4適體可以是非天然分子(例如含有不存在于天然基因中的核苷酸序列或含有自然界中不存在的經(jīng)修飾核苷酸)?；蛘呋蛄硗?，該抗-ctla-4適體可不含有編碼功能性肽的核苷酸序列。

ctla-4，稱為細胞毒性t淋巴球相關蛋白4(也已知為cd152)，是一種表現(xiàn)在t細胞上的受體，其反向地調(diào)控t細胞活性。舉例而言，人類ctla-4的胺基酸序列是依據(jù)genbank登錄編號aah69566所提供。

在一些具體例中，本文揭示的抗-ctla-4核酸適體可包含與5’-gatggtgaaaatgggcctagggtggacggt-3’(seqidno:1)至少70％(例如80％、85％、90％、95％或98％)一致的核苷酸序列。在一些實例中，本文揭示的抗-ctla-4核酸適體可包含與seqidno:1的核酸序列至少85％一致的核苷酸序列。在一些實例中，該抗-ctla-4適體包含5’-gatggtgaaaatgggcctagggtggacggt-3’(seqidno:1)的核苷酸序列。在一個具體實例中，該抗-ctla-4適體由seqidno:1或seqidno:2的核苷酸序列組成。

在一些具體例中，本文揭示的抗-ctla4核酸適體可包含與下列序列的粗體區(qū)至少70％(例如80％、85％、90％、95％或98％)一致的核苷酸序列：

(а)tccctacggcgctaacgccaccgtgctacaac(seqidno:3)；

(b)tccctacggcgctaacgccaccgtgctacaac(seqidno:4)；或

(c)tccctacggcgctaacgccaccgtgctacaac(seqidno:5)。

在一些實例中，本文揭示的抗-ctla-4核酸適體可包含與seqidno:3、4或5的核酸序列至少85％一致的核苷酸序列。在一些實例中，該抗-ctla-4適體包含seqidno:3、4或5的核苷酸序列，或其中的粗體區(qū)。在一個具體實例中，該抗-ctla-4適體由seqidno:3、4或5的核苷酸序列，或其中呈粗體區(qū)組成。

兩個核酸的”百分率同一性”是使用karlinandaltschulproc.natl.acad.sci.usa87:2264-68,1990的演算法，經(jīng)如在karlinandaltschulproc.natl.acad.sci.usa90:5873-77,1993中所修改來決定。此一演算法并入altschul,etal.j.mol.biol.215:403-10,1990的nblast及xblast程序(第2.0版)中。blast核苷酸研究可以使用nblast程序進行，計分＝100，字長＝12，獲得與本發(fā)明核酸分子同源的核苷酸序列。若兩個序列之間存在空位，則可如altschuletal.,nucleicacidsres.25(17):3389-3402,1997中所述使用gappedblast。當采用blast及gappedblast程序時，可使用個別程序(例如xblast及nblast)的預設參數(shù)。

在其他具體例中，相比于5’-gatggtgaaaatgggcctagggtggacggt-3’(seqidno:1)的核苷酸序列，本文所述抗-ctla-4適體可包含至多8個(例如至多7、6、5、4、3、2或1個)核苷酸變異。能引入此等變異的位置是可以依據(jù)例如ca21的二級結(jié)構(gòu)(其包含參考核苷酸序列)來決定(參見圖3b)。

在一些實例中，抗-ctla-4適體在5’端、3’端或兩端可包含引子位點。在一個實例中，該抗-ctla-4適體具有tccctacggcgctaacgatggtgaaaatgggcctagggtggacggtgccaccgtgctacaac-3’(seqidno:2)的核苷酸序列，其中底線/斜體旁側(cè)序列意指5’及3’引子位點。亦參見seqidno:3、4或5的非粗體區(qū)。

本文揭示的任一種抗-ctla-4適體可含有至多200個核苷酸(nt)，例如150個nt、100個nt、80個nt、70個nt、60個nt、50個nt、40個nt或30個nt。在一些實例中，該抗-ctla-4適體可含有范圍自30-150nt、30-100nt、30-80nt、30-70nt、30-60nt、30-50nt或30-40nt的核苷酸。

在一些具體例中，本文所述抗-ctla-4適體以低于20nm(例如15nm、10nm、5nm、1nm，或更低)的解離常數(shù)(kd)結(jié)合至ctla-4(例如人類ctla-4)。該抗-ctla-4適體可特異地結(jié)合人類ctla-4?；蛘?，該適體可結(jié)合至來自不同物種(例如人類及小鼠)的ctla-4分子。當結(jié)合至表現(xiàn)在t細胞表面上的ctla-4分子時，此一適體可抑制ctla-4的活性達至少20％(例如40％、50％、80％、100％、2-倍、5-倍、10-倍、100-倍，或1,000-倍)(因而增加t細胞活性)?？?ctla-4適體對ctla-4的抑制活性(以及因而活化增進t細胞活性)可以通過例如下面實例中所述彼等來測定。

在一些具體例中，本文所述抗-ctla-4適體可含有非天然核堿基、糖，或共價核苷間鍵結(jié)(骨架)。此一經(jīng)修飾寡核苷酸賦予期望特性，諸如細胞攝入提高、對目標核酸的親和力增進，以及活體內(nèi)穩(wěn)定性增加。

在一個實例中，本文所述適體具有經(jīng)修飾的骨架，包括彼等保有磷原子者(參見例如美國專利第3,687,808號；第4,469,863號；第5,321,131號；第5,399,676號；以及第5,625,050號)，與彼等不具有磷原子者(參見例如美國專利第5,034,506號；第5,166,315號；以及第5,792,608號)。含磷經(jīng)修飾骨架的實例包括，但不限于具有3’-5’鍵接或2’-5’鍵接的硫代磷酸酯、對掌性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、胺基烷基-磷酸三酯、膦酸甲基酯與其他膦酸烷基酯(包括3’-膦酸伸烷基酯、5’-膦酸伸烷基酯與對掌性膦酸酯)、亞磷酸酯、磷酰胺酯(phosphoramidates)(包括3’-胺基磷酰胺酯與胺基烷基磷酰胺酯)、硫羰代磷酰胺酯、硫羰代烷基膦酸酯、硫羰代烷基磷酸三酯、硒代磷酸酯，以及硼烷磷酸酯。此等骨架也包括彼等具有相反極性者，亦即3’至3’、5’至5’或2’至2’鍵接。不包括磷原子的經(jīng)修飾骨架是由短鏈烷基或環(huán)烷基核苷間鍵結(jié)、混合型雜原子與烷基或環(huán)烷基核苷間鍵結(jié)或一或多個短鏈雜原子或雜環(huán)核苷間鍵結(jié)所形成。此等骨架包括彼等具有嗎啉基鍵結(jié)者(部分由核苷的糖部分所形成)；硅氧烷骨架；硫化物、亞砜和砜骨架；甲酰乙?；?formacetyl)和硫代甲酰乙酰基骨架；亞甲基甲酰乙酰基和硫代甲酰乙?；羌埽缓颂且阴；羌?；含烯骨架；胺基磺酸酯骨架；亞甲基亞胺基和亞甲基肼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架；以及其他具有混合的n、o、s和ch2組成部分的骨架。

在另一個實例中，本文所述適體包括一或多個經(jīng)置換糖部分。此等經(jīng)置換糖部分可在其2’位置處包括下列基團之一：oh；f；o-烷基、s-烷基、n-烷基、o-烯基、s-烯基、n-烯基；o-炔基、s-炔基、n-炔基及o-烷基-o-烷基。在這些基團中，烷基、烯基及炔基可以是未經(jīng)置換或經(jīng)置換c1至c10烷基或c2至c10烯基與炔基。它們也可以在其2’位置處包括雜環(huán)烷基、雜環(huán)烷芳基、胺基烷基胺基、聚烷基胺基、經(jīng)置換硅烷基、rna切割基團、報導子基團、嵌入劑、增進寡核苷酸之藥動學特性的基團，或增進寡核苷酸之藥效學特性的基團。較佳的經(jīng)置換糖部分包括彼等具有2’-甲氧基乙氧基、2’-二甲基胺基氧基乙氧基，及2’-二甲基胺基乙氧基乙氧基者。參見martinetal.,helv.chim.acta,1995,78,486-504。

或者或另外，本文所述適體包括一或多個經(jīng)修飾天然核堿基(亦即腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶)。經(jīng)修飾核堿基包括彼等描述于美國專利第3,687,808號中者。theconciseencyclopediaofpolymerscienceandengineering,pages858-859,kroschwitz,j.i.,ed.johnwiley&sons,1990、englischetal.,angewandtechemie,internationaledition,1991,30,613，以及sanghvi,y.s.,chapter15,antisenseresearchandapplications,pages289-302,crcpress,1993。這些核堿基中的某一些尤其適用于增加適體分子對其目標位點的結(jié)合親和力。這些包括5-經(jīng)置換的嘧啶、6-氮雜嘧啶及n-2、n-6與o-6經(jīng)置換嘌呤(例如2-胺基丙基-腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶與5-丙炔基胞嘧啶)。參見sanghvi,etal.,eds.,antisenseresearchandapplications,crcpress,bocaraton,1993,pp.276-278)。

任一種本文所述適體可通過現(xiàn)有方法制備，例如化學合成或活體外轉(zhuǎn)錄。如本文所述，其所期望的生物活性可經(jīng)例如彼等描述于下面實例中者來進行驗證。用于表現(xiàn)任一種抗-ctla-4適體的載體也落在本發(fā)明內(nèi)容的范疇內(nèi)。

本文所述任一種適體可經(jīng)由共價鍵結(jié)、非共價鍵結(jié)或兩者接合至一或多個聚醚部分，諸如聚乙二醇(peg)部分。因此，在一些具體例中，本文所述適體經(jīng)聚乙二醇化。本揭示內(nèi)容不是要限制特定分子量的peg部分。在一些具體例中，聚乙二醇部分具有范圍自5kda至100kda、10kda至80kda、20kda至70kda、20kda至60kda、20kda至50kda，或30kda至50kda的分子量。在一些實例中，peg部分具有40kda的分子量。接合至本文所述抗-ctla-4適體的peg部分可以是線性或具分支。其可接合至核酸適體的5’端、適體的3’端或兩端。若需要的話，peg部分可以共價接合至核酸適體的3’端。

將peg部分接合至核酸的方法為技藝中已知且先前已描述于例如pct公開案第wo2009/073820號中，其相關教示以引用的方式并入本文中。應理解，本文所述接合peg的核酸適體以及用于將peg接合至核酸適體的方法為例示性且無意具限制性。

本揭示內(nèi)容也提供本文所述任一種抗-ctla-4核酸適體的二聚體。在一些具體例中，抗-ctla-4適體二聚體包含兩個通過適當聚合物部分連接的抗-ctla-4適體，適當聚合物部分可為如本文所述彼等peg部分。在二聚體中，兩個適體的一者或兩者可包含seqidno：1-2的核苷酸序列。或者，在二聚體中，兩者適體的一者或兩者可包含seqidno:3、4或5的核苷酸序列或其中粗體區(qū)。兩個抗-ctla-4適體可相同或不同。例如，抗-ctla-4適體的一者或兩者可包含(seqidno:1)。在另一個實例中，如本文所述抗-ctla-4適體二聚體可具有一個包含(seqidno:1)的適體以及另一個包含(seqidno:2)的適體。

在一些具體例中，本文提供的任一種抗-ctla-4適體二聚體的聚合物部分為peg，其可具有如本文所述的分子量。

在一些具體例中，本文提供的抗-ctla-4適體二聚體包含經(jīng)由連接子連接至聚合物部分的適體。在一個實例中，第一適體經(jīng)由連接子連接至聚合物部分。在另一個實例中，第二適體經(jīng)由連接子連接至聚合物部分。在又另一個實例中，第一適體及第二適體是經(jīng)由連接子連接至聚合物部分。“連接子”如本文所用，意指連接兩個分子或部分的化學部分。在一些實例中，連接子包含一或多個核苷酸，其可為去氧核糖核苷酸。在一些實例中，核酸連接子長度為1至50個核苷酸。此等連接子長度可為1至5、1至10、1至15、1至20、1至30、1至40、10至15、10至20、10至30、10至40、10至50、20至30、20至40、20至50、30至40、30至50，或40至50個核苷酸。在一些實例中，連接子長度為11個核苷酸。連接子可包含腺嘌呤(a)、胞嘧啶(c)、胸腺嘧啶(t)及/或鳥嘌呤(u)。在一些實例中，連接子包含聚t(polyt)片段?！妇踭片段」意指2個或更多個連續(xù)胸腺嘧啶(t)核苷酸殘基的延伸物。例如，聚t連接子可包含2至50個t殘基。在一些實例中，聚t連接子長度為2至40、2至35、2至30、2至25、2至20、5至15，或10至15個核苷酸。在一些具體例中，聚t連接子包含11個連續(xù)胸腺嘧啶(t)核苷酸。

醫(yī)藥組成物

如本文所述任一種抗-ctla-4適體或peg接合物可與醫(yī)藥上可接受的載劑混合而形成醫(yī)藥組成物用來治療目標疾病?！翱山邮堋北硎据d劑必須與組成物的活性成分相容(且較佳能夠穩(wěn)定活性成分)并且對于待治療個體無害。醫(yī)藥上可接受的賦形劑(載劑)包括技藝中所熟知的緩沖劑。參見例如remington:thescienceandpracticeofpharmacy20thed.(2000)lippincottwilliamsandwilkins,ed.k.e.hoover。

使用于本發(fā)明方法中的醫(yī)藥組成物可包含醫(yī)藥上可接受的載劑、賦形劑或穩(wěn)定劑，呈凍干調(diào)配物或水溶液的形式。參見例如remington:thescienceandpracticeofpharmacy20thed.(2000)lippincottwilliamsandwilkins,ed.k.e.hoover)?？山邮艿妮d劑、賦形劑或穩(wěn)定劑在所用劑量與濃度下對接受者來說無毒，且可包含緩沖劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽與其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸與甲硫胺酸；防腐劑(諸如十八烷基二甲基芐基氯化銨；氯化六甲雙銨；氯化芐二甲烴銨、氯化本索寧；苯酚、丁基或芐基醇；對羥苯甲酸烷基酯，諸如對羥苯甲酸甲基酯或?qū)αu苯甲酸丙基酯；兒茶酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；及m-甲酚)；低分子量(少于約10個殘基)多肽；蛋白質(zhì)，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩酰胺酸、天冬酰胺酸、組胺酸、精胺酸，或離胺酸；單糖、雙糖，及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或右旋糖；螯合劑，諸如edta；糖，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬復合物(例如zn-蛋白復合物)；及/或非離子性界面活性劑，諸如tween^tm、pluronics^tm或聚乙二醇(peg)。

在一些實例中，本文所述醫(yī)藥組成物包含含有ctla-4結(jié)合適體(或帶有該適體的核苷酸序列的載劑)的脂質(zhì)體，其可通過下列方法制備，諸如彼等描述于epstein,etal.,proc.natl.acad.sci.usa82:3688(1985)；hwang,etal.,proc.natl.acad.sci.usa77:4030(1980)；以及u.s.專利第4,485,045號與第4,544,545號中者。具有循環(huán)時間提高的脂質(zhì)體揭示于美國專利第5,013,556號中。尤其適用的脂質(zhì)體可以使用含有磷脂酰膽堿、膽固醇與peg衍生的磷脂酰乙醇胺(peg-pe)的脂質(zhì)組成物通過逆相蒸發(fā)法來生成。脂質(zhì)體被擠壓穿過具有限定孔隙之過濾器，以產(chǎn)生具有期望直徑的脂質(zhì)體。

抗-ctla-4適體亦可陷入于制備的微膠囊中(例如分別通過凝聚技術或通過介面聚合作用(例如羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚-(甲基甲基丙烯酸酯)微膠囊)、于膠體藥物投遞系統(tǒng)(例如脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳液、奈米顆粒及奈米膠囊)中或巨乳液中。此等技術為技藝中所熟知，參見例如remington,thescienceandpracticeofpharmacy20thed.mackpublishing(2000)。

在其他實例中，本文所述醫(yī)藥組成物可調(diào)配成持續(xù)釋放形式。持續(xù)釋放制品的適當實例包括含有抗-ctla-4適體的固體疏水性聚合物的半通透性基質(zhì)，該基質(zhì)是呈有形物品的形式(例如薄膜或微膠囊)。持續(xù)釋放基質(zhì)的實例包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)，或聚(乙烯基醇)、聚乳酸(美國專利第3,773,919號)、l-麩胺酸與7-麩胺酸乙基酯的共聚物、非可分解性乙烯-乙酸乙烯酯、可分解性乳酸-乙醇酸共聚物(諸如luprondepot^tm(乳酸-乙醇酸共聚物和柳菩林組成的可注射微球)、蔗糖乙酸異丁酸酯，及聚-d-(-)-3-羥基丁酸。

使用于活體內(nèi)投與的醫(yī)藥組成物必須是無菌的。這是通過例如濾過無菌過濾膜而輕易達到。治療性抗-ctla-4適體組成物可以放置在具有無菌出入口的容器(例如靜脈內(nèi)溶液袋或具有可被皮下注射針頭穿刺的擋塞的小瓶)中。

本文所述醫(yī)藥組成物可以呈諸如錠劑、丸劑、膠囊、粉劑、顆粒、溶液或懸浮液，或栓劑的單位劑型，供用于經(jīng)口、非經(jīng)口或直腸投與，或是通過吸入或吹入投與。

關于制備固體組成物(諸如錠劑)，主要活性成分可與醫(yī)藥載劑混合以形成含有本發(fā)明化合物的均質(zhì)混合物的固體預調(diào)配組成物，或其醫(yī)藥上可接受的無毒鹽，醫(yī)藥載劑為例如習知制錠成分，諸如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸鎂、磷酸二鈣或膠，以及其他醫(yī)藥稀釋劑，例如水。當提到這些預調(diào)配組成物為均質(zhì)時，表示活性成分平均分散在組成物中，使得組成物可容易分成等效單位劑型，諸如錠劑、丸劑與膠囊。此固體預調(diào)配組成物接而被分成上述類型的單位劑型，含有0.1至約500mg本發(fā)明活性成分。新穎組成物的錠劑或丸劑可經(jīng)包覆或以其他方式經(jīng)化合而提供給予延長作用益處的劑型。例如，錠劑或丸劑可包含內(nèi)劑量組分以及外劑量組分，后者呈包覆前者的包衣形式。兩種組分可被在胃中耐受崩解并允許內(nèi)組分完整通過進入十二指腸或延遲釋放的腸衣層所分隔。此腸衣層或包衣可使用各種材料，諸如包括一些聚合酸及聚合酸與如蟲膠、十六醇及乙酸纖維素的材料的混合物。

適當表面活性劑尤其包括非離子性試劑，諸如聚氧乙烯山梨糖醇(例如tween^tm20、40、60、80或85)以及其他山梨糖醇(例如span^tm20、40、60、80或85)。具有表面活性劑的組成物將習知地包含0.05％與5％間的表面活性劑，且可介于0.1％與2.5％。應理解，若需要的話可添加其他成分，例如甘露糖醇或其他醫(yī)藥上可接受媒劑。

可使用商業(yè)可購得脂質(zhì)乳液來制備適當乳液，脂質(zhì)乳液為諸如intralipid^tm、liposyn^tm、infonutrol^tm、lipofundin^tm及l(fā)ipiphysan^tm?；钚猿煞挚扇芙庥陬A先混合的乳液組成物中或者其可溶解于油(例如大豆油、葵花油、棉仔油、芝麻油、玉米油或杏仁油)中，在與磷脂(例如蛋磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)和水混合之后形成乳液。應理解，可添加其他成分來調(diào)整乳液的張力，其他成分為例如甘油或葡萄糖。適當乳液通常含有至多20％的油，例如5％與20％之間。脂質(zhì)乳液可包含脂質(zhì)小滴，介于0.1與1.0μm之間，尤其是0.1與0.5μm之間，并具有范圍在5.5至8.0的ph。

乳液組成物可以是彼等通過將抗-ctla-4適體與intralipid^tm或其組分(大豆油、蛋磷脂、甘油與水)混合來制備。

用于吸入或吹入的醫(yī)藥組成物包括于醫(yī)藥上可接受水性或有機溶劑或其混合物中的溶液及懸浮液，及粉劑。液體或固體組成物可含有上列適當醫(yī)藥上可接受的賦形劑。在一些具體例中，用于局部或全身性效用的組成物是通過經(jīng)口或鼻呼吸路徑投與。

較佳于無菌醫(yī)藥上可接受溶劑中的組成物可以通過使用氣體而被霧化?？芍苯訌膰婌F裝置吸入霧化溶液或可將噴霧裝置附接到面罩、遮棚或間歇式正壓呼吸器。溶液、懸浮液或粉劑組成物較佳經(jīng)口或經(jīng)鼻自以適當方式遞送調(diào)配物的裝置被投與。

治療方法

本文所述任一種抗-ctla-4適體(包括peg接合物)可用來增進免疫活性，尤其是t細胞活性，從而有效治療癌癥或諸如病毒性(例如hiv)感染或細菌性感染的傳染病。

為實施本文揭示的方法，有效量之含有至少一種抗-ctla-4適體的本文所述醫(yī)藥組成物可經(jīng)由適當途徑被投與給有治療需要的個體(例如人類)，適當途徑為諸如靜脈內(nèi)投與(例如團注(bolus))或經(jīng)由連續(xù)輸注一段時間、通過肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦脊髓內(nèi)、皮下、關節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、鞘內(nèi)、經(jīng)口、吸入或局部路徑。用于液體調(diào)配物的商用噴霧器包括可用于投與的噴射噴霧器以及超音波噴霧器。液體調(diào)配物可直接被霧化而凍干粉末可以在還原之后被霧化。或者，如本文所述含有抗-ctla-4適體的組成物可使用氟碳調(diào)配物及計量劑量吸入器被氣溶膠化，或者如凍干且研磨粉劑被吸入。

如本文所用，“有效量”意指各個活性劑對個體賦予治療效用所需的量，不論是單獨或與一或多種其他活性劑組合。在一些具體例中，治療效用為降低腫瘤負荷、減少癌細胞，或增加免疫活性。決定何量ctla-4結(jié)合適體達到治療效用對于習于技藝者來說將會是明顯的。如技藝中具有通常技術者所認知，有效量會改變，取決于待治療的特定病況、病況的嚴重性、個別患者參數(shù)(包括年齡、身體狀況、身高、性別與體重)、治療持續(xù)時間、同時治療(若有的話)的特性、特定投與路徑及健康從業(yè)人員知識與專業(yè)內(nèi)的類似因素。這些因素為技藝中彼等具有通常技術者所熟知且可在不超出慣常實驗的情況下獲得處理。通常較佳為使用個別組分或其組合的最大劑量，其依據(jù)周全醫(yī)學判斷為最高安全劑量。

經(jīng)驗上的考量(諸如半衰期)通常影響劑量的決定。可決定投與頻率并隨著治療過程而調(diào)整，且大體上(但非必須)是基于治療及/或壓制及/或改善及/或延遲目標疾病/病癥?；蛘?，ctla-4結(jié)合適體的持續(xù)連續(xù)釋放調(diào)配物可能是適合的。用于達到持續(xù)釋放的各種調(diào)配物及裝置在技藝中是熟知的。

在一個實例中，如本文所述抗-ctla-4結(jié)合適體在個體中的劑量可以按經(jīng)驗來決定，該等個體經(jīng)給予一或多次ctla-4結(jié)合適體投與。給予個體漸增劑量的拮抗劑。為評估拮抗劑的效力，可追蹤疾病/病癥的指標。

大體上，就投與任一種本文所述抗-ctla-4適體來說，初始候選劑量可為約2mg/kg。就本發(fā)明內(nèi)容的目的而言，典型日劑量范圍可為約0.1μg/kg至3μg/kg至30μg/kg至300μg/kg至3mg/kg，至30mg/kg至100mg/kg或更多中任一者，取決于上述因子。就重復投與超過數(shù)日或更久，持續(xù)治療直到期望發(fā)生癥狀壓抑或直到達到充分治療程度以減輕目標疾病或病癥或其癥狀為止，端視病況而定。例示性給藥方案包含投與約2mg/kg的初始劑量，接著每周約1mg/kgctla-4結(jié)合適體的維持劑量，接著每隔一周約1mg/kg的維持劑量。但是，其他劑量方案亦可行，取決于從業(yè)人員希望達到的藥動學衰退型態(tài)而定。例如，預計一周給藥一至四次。在一些具體例中，可采用范圍自約3μg/mg至約2mg/kg(諸如約3μg/mg、約10μg/mg、約30μg/mg、約100μg/mg、約300μg/mg、約1mg/kg，及約2mg/kg)的給藥。在一些具體例中，給藥頻率為為每周、每2周、每4周、每5周、每6周、每7周、每8周、每9周，或每10周一次；或每個月、每2個月，或每3個月或更久一次。此療法的進程可簡單地通過現(xiàn)有技術及分析進行監(jiān)控。給藥方案(包括所用ctla-4結(jié)合適體)可隨著時間而有所改變。

在一些具體例中，就具有正常體重的成人患者來說，可投與范圍自約0.3至5.00mg/kg的劑量。具體劑量方案(亦即劑量、時間安排及重復)將取決于特定個體以及個體病史，還有個別藥劑的特性(諸如藥劑半衰期，以及其他在技藝中所熟知的考量因素)。

就本發(fā)明內(nèi)容的目的，如本文所述ctla-4結(jié)合適體的適當劑量將取決于特定ctla-4結(jié)合適體、特定ctla-4結(jié)合適體、疾病/病癥類型與嚴重性、ctla-4結(jié)合適體是出于預防或治療目的而投與、先前療法、患者的臨床病史以及對拮抗劑的反應，和參與臨床醫(yī)師的斟酌而定。臨床人員可投與ctla-4結(jié)合適體直到達到期望結(jié)果的劑量。在一些具體例中，期望結(jié)果為腫瘤負荷降低、癌細胞減少或免疫活性增加。決定劑量是否造成期望結(jié)果的方法對于習于技藝者來說是明顯的?？蛇B續(xù)或間歇投與一或多個ctla-4結(jié)合適體，取決于例如接受者的生理狀況、投與目的為治療或預防，以及其他習于技藝的操作人員所熟知的因素。投與ctla-4結(jié)合適體基本上可為在預選時間段里連續(xù)或者是呈連續(xù)間隔劑量，例如在目標疾病或病癥長成之前、期間或之后。

如本文所用，術語“治療”意指對個體施用或投與包括一或多種活性劑的組成物，該個體患有目標疾病或病癥、該疾病/病癥的癥狀，或有罹患該疾病/病癥的傾向，目的是要治愈、治療、減輕、緩解、改變、治療、改善、增進或影響病癥、疾病癥狀，或罹患該疾病或病癥的傾向。

減輕目標疾病/病癥包括延遲疾病生成或進展，或降低疾病嚴重性。減輕疾病不一定需要治療結(jié)果。如本文所用，“延遲”目標疾病或病癥生成表示推遲、阻礙、減緩、延遲、穩(wěn)定/或延緩疾病的進展。這個延遲可以是時間長度的改變，取決于待治療疾病及/或個體的病史而定?！把舆t”或減輕疾病長成，或延遲疾病發(fā)生的方法是當與未使用該方法相比時，在一個給定時間框內(nèi)降低生成該疾病的一或多個癥狀的可能性及/或在給定時間框內(nèi)降低癥狀程度的方法。此等比對通常是基于臨床研究，使用一些足以提供統(tǒng)計上顯著結(jié)果的個體。

疾病的“生成”或“進展”表示疾病的初始病征及/或后續(xù)進展?？墒褂萌缂妓囍兴熘臉藴逝R床技術來偵測并評估疾病的生成。但是，生成也意指不能被偵測到的進展。就本發(fā)明內(nèi)容的目的，生成或進展意指癥狀的生物過程。“生成”包括發(fā)生、復發(fā)與出現(xiàn)。如本文所用，目標疾病或病癥的“出現(xiàn)”或“發(fā)生”包括起初出現(xiàn)及/或復發(fā)。

在一些具體例中，本文所述ctla-4結(jié)合適體呈在活體內(nèi)足以降低腫瘤負荷或癌細胞生長、或hiv增生達至少5％(例如10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多)的量被投與給有治療需要的個體。在其他具體例中，ctla-4結(jié)合適體呈有效降低ctla-4活性位準達至少5％(例如10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多)的量被投與。在其他具體例中，ctla-4結(jié)合適體呈有效增加免疫活性達至少5％(例如10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多)的量被投與。

醫(yī)學領域中彼等具有通常技術者所熟知的習知方法可用來將醫(yī)藥組成物投與給個體，取決于待治療疾病類型或疾病部位而定。這個組成物也可以經(jīng)由其他現(xiàn)有路徑被投與(例如經(jīng)口、非經(jīng)口、通過吸入噴霧、局部、直腸、經(jīng)鼻、頰內(nèi)、陰道或經(jīng)由植入貯器投與)。術語“非經(jīng)口”如本文所用包括皮下、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、關節(jié)內(nèi)、動脈內(nèi)、滑膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、鞘內(nèi)、病灶內(nèi)及顱內(nèi)注射或輸注技術。此外，可經(jīng)由可注射貯器投與路徑投與給個體，諸如使用1-、3-或6-個月貯器可注射或生物可分解材料及方法。在一些實例中，醫(yī)藥組成物經(jīng)眼內(nèi)或經(jīng)玻璃體內(nèi)投與。

可注射組成物可含有各種載劑，諸如植物油、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、乙酸乙酯、碳酸乙酯、肉豆蔻酸異丙酯、乙醇，及多元醇(甘油、丙二醇、液體聚乙二醇，與類似物)。關于靜脈內(nèi)注射，可通過滴注方法投與水溶性ctla-4結(jié)合適體，從而輸注含有ctla-4結(jié)合適體及生理學上可接受賦形劑的醫(yī)藥調(diào)配物。生理學上可接受的賦形劑可包括例如5％右旋糖、0.9％食鹽水、林格氏溶液或其他適當賦形劑。肌肉內(nèi)制品(例如適當可溶鹽形式之ctla-4結(jié)合適體的無菌調(diào)配物)可溶解于諸如注射用水、0.9％食鹽水或5％葡萄糖溶液的醫(yī)藥賦形劑中并在其中被投與。

在一個具體例中，經(jīng)由部位特異性或靶定局部投遞技術來投與ctla-4結(jié)合適體。部位特異性或靶定局部投遞技術的實例包括具有ctla-4結(jié)合適體的各種可植入貯器來源或局部投遞導管，諸如輸注導管、留置導管或針頭導管、合成移植物、外包套、分流器及支架或其他可植入裝置、部位特異性載劑、直接注射或直接施用。參見例如pct公開案第wo00/53211號及u.s.專利第5,981,568號。

亦可以使用含有反義聚核苷酸、表現(xiàn)載體或次基因體聚核苷酸的治療性組成物的靶定遞送。接受體媒介的dna遞送技術描述于例如findeisetal.,trendsbiotechnol.(1993)11:202；chiouetal.,genetherapeutics:methodsandapplicationsofdirectgenetransfer(j.a.wolff,ed.)(1994)；wuetal.,j.biol.chem.(1988)263:621；wuetal.,j.biol.chem.(1994)269:542；zenkeetal.,proc.natl.acad.sci.usa(1990)87:3655；wuetal.,j.biol.chem.(1991)266:338中。

含有聚核苷酸(例如本文所述ctla-4結(jié)合適體或用于生產(chǎn)該結(jié)合適體的載體)的治療性組成物可在約100ng至約200mgdna的范圍內(nèi)在基因療法程序中被投與供局部投與。在一些具體例中，也可在基因療法程序期間使用濃度范圍約500ng至約50mg、約1μg至約2mg、約5μg至約500μg，及約20μg至約100μg或更多的dna。

要依據(jù)本文所述方法治療的個體可以是哺乳動物，諸如農(nóng)場動物、運動動物、寵物、靈長類、馬、狗、貓、小鼠及大鼠。在一個實例中，該個體為人類。含有抗-ctla-4適體的組成物可用于在需要治療的個體中增進免疫活性，例如t細胞活性。在一些實例中，個體可為患有癌癥、懷疑患有癌癥或處于癌癥風險下的人類患者，癌癥為諸如肺癌、黑色素瘤、結(jié)腸直腸癌，或腎細胞癌。在其他實例中，個體可以是患有或懷疑患有hiv感染的人類患者。此一患者也可以通過慣常醫(yī)學實務予以鑒定。

患有目標疾病或病癥(例如癌癥或諸如hiv感染的病毒性感染或細菌性感染)的個體可以通過慣常醫(yī)學檢驗予以鑒定，醫(yī)學檢驗為例如實驗室測試、器官功能測試、ct掃描或超音波。懷疑患有此等目標疾病/病癥任一者的個體可能表現(xiàn)出該疾病/病癥的一或多種癥狀。處于該疾病/病癥風險下的個體可能是帶有與那個疾病/病癥有關之一或多個風險因子的個體。此一個體也可以通過慣常醫(yī)學實務予以鑒定。

在本文所述方法中使用的具體劑量方案(亦即劑量、時間安排及重復)將取決于特定個體(例如人類患者)以及個體病史。

在一些具體例中，抗-ctla-4適體可與另一種適當治療劑(例如抗癌劑或抗hiv劑)共同使用?；蛘呋蛄硗猓?ctla-4適體也可以與其他用來增進及/或補充藥劑有效性的藥劑組合使用。

目標疾病/病癥的治療效力可以通過例如下面實例中所述方法進行評估。

用于減輕目標疾病的套組

本揭示內(nèi)容亦提供用于增進免疫活性(例如t細胞活性)、減輕癌癥(例如肺癌、黑色素瘤、結(jié)腸直腸癌，或腎細胞癌)，及/或治療或降低hiv感染風險的套組。此等套組可包括一或多個含有例如本文所述彼等任一種結(jié)合ctla-4的適體的容器。

在一些具體例中，套組可包含與本文所述方法任一者一致的使用說明。所納入的使用說明可包含投與如本文所述那些要治療目標疾病、延遲目標疾病發(fā)生，或減輕目標疾病之適體的說明。套組可進一步包含篩選適合治療之個體的說明，其是基于鑒別個體是否患有目標疾病。在又其他具體例中，使用說明包含向處于目標疾病風險下的個體投與適體的說明。

與使用ctla-4結(jié)合適體有關的使用說明通常包括期望治療的劑量、給藥計畫表，以及投與路徑的資訊。容器可以是單位劑量、散裝(例如多劑量包裝)或次單位劑量。在本發(fā)明套組中所提供的使用說明通常是標簽或包裝插頁上的書面說明(例如套組中所包括的紙張)，但機器可讀說明(例如磁性或光學儲存碟片上所傳達的說明)也是可接受的。

標簽或包裝插頁指明該等組成物是用于治療癌癥相關疾病或病癥(諸如本文所述彼等癌癥)、延遲癌癥相關疾病或病癥發(fā)生及/或減輕癌癥相關疾病或病癥?？商峁┦褂谜f明供實施本文所述任一方法。

本發(fā)明套組可以呈適當包裝。適當包裝包括，但不限于小瓶、瓶、罐、可撓性包裝(例如密封麥拉膜(mylar)或塑膠袋)，以及類似物。也預期包裝可用于與特定裝置組合，特定裝置為諸如吸入器，鼻投與裝置(例如霧化器)或諸如迷你泵的輸注裝置。套組可具有無菌出入口(例如容器可以是靜脈內(nèi)溶液袋或具有可被皮下注射針頭穿刺過的擋塞的小瓶)。容器也可以具有無菌出入口(例如容器可以是靜脈內(nèi)溶液袋或具有可被皮下注射針頭穿刺過的擋塞的小瓶)。組成物中的至少一種活性劑是如本文所述彼等ctla-4結(jié)合適體。

套組可視情況提供額外組分，諸如緩沖劑或說明資訊。通常，套組包含容器及標簽或包裝插頁在容器上或附接于容器。在一些具體例中，本發(fā)明提供制造包含上述套組內(nèi)含物的物品。

一般性技術

除非另有指明，否則本發(fā)明的實施將采用分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學及免疫學的現(xiàn)有技術，其落在技術技能中。molecularcloning:alaboratorymanual,secondedition(sambrook,etal.,1989)coldspringharborpress；oligonucleotidesynthesis(m.j.gait,ed.,1984)；methodsinmolecularbiology,humanapress；cellbiology:alaboratorynotebook(j.e.cellis,ed.,1998)academicpress；animalcellculture(r.i.freshney,ed.,1987)；introductiontocellandtissueculture(j.p.matherandp.e.roberts,1998)plenumpress；cellandtissueculture:laboratoryprocedures(a.doyle,j.b.griffiths,andd.g.newell,eds.,1993-8)j.wileyandsons；methodsinenzymology(academicpress,inc.)；handbookofexperimentalimmunology(d.m.weirandc.c.blackwell,eds.)；genetransfervectorsformammaliancells(j.m.millerandm.p.calos,eds.,1987)；currentprotocolsinmolecularbiology(f.m.ausubel,etal.,eds.,1987)；pcr:thepolymerasechainreaction,(mullis,etal.,eds.,1994)；currentprotocolsinimmunology(j.e.coliganetal.,eds.,1991)；shortprotocolsinmolecularbiology(wileyandsons,1999)；immunobiology(c.a.janewayandp.travers,1997)；antibodies(p.finch,1997)；antibodies:apracticalapproach(d.catty.,ed.,irlpress,1988-1989)；monoclonalantibodies:apracticalapproach(p.shepherdandc.dean,eds.,oxforduniversitypress,2000)；usingantibodies:alaboratorymanual(e.harlowandd.lane(coldspringharborlaboratorypress,1999)；theantibodies(m.zanettiandj.d.capra,eds.,harwoodacademicpublishers,1995)。

在沒有進一步詳細闡述的情況下，本領域技術人員可基于以上說明，將本發(fā)明利用至其最大程度。因此，下列特定具體例被認為僅是例示說明，在任何方面都對發(fā)明內(nèi)容的其余部分不具限制性。本文引用的全部公開數(shù)據(jù)以引用的方式并入或作為本文引用的技術現(xiàn)況。

實例1：通過免疫沉淀-selex篩選抗-ctla-4適體

本研究采用指數(shù)增富的配體系統(tǒng)性進化(selex)方法，其中結(jié)合分子是選自于一個大型且多樣化的核酸庫(dna或rna)。參見例如mol.cellbiol(oliphanta.r.,etal.,1989)；science(tuerkc.etal.,1990)；nature(ellingtona.d.,etal.,1990)。

為增加適體篩選的成功率，采用合并免疫沉淀-selex(ip-selex)與以細胞為主的selex的篩選策略。ip-selex可以大幅地降低池(pool)中的非特異性適體，而另一方面，以細胞為主的selex可減少無法辨識細胞膜上的目標蛋白質(zhì)的適體。folr-2與ctla-4分別進行十六個回合的selex程序。在第2、3與4回合中使用ip-selex，而在其余回合中使用以細胞為主的selex。為顯示適體池的成功進化，篩選并分析ctla-4篩選的第4、8、12與16回合適體池。通過與rt-qpcr(如圖1，a區(qū)中所示)及流式細胞儀(如圖1a，b-i區(qū)中所示)偶合的總結(jié)合分析來測定結(jié)合親和力與特異性。這些數(shù)據(jù)指出，親和力與特異性會隨著selex回合增加而升高。例如，親和力從120.7nm(第4回合)增加至6.6nm(第16回合)(如圖1，a區(qū)中所示)。在之后的selex回合中成功地降低適體池的非特異性結(jié)合(如圖1，b-i區(qū)中所示)。這些數(shù)據(jù)暗示，吾人的selex程序在篩選高親和力及特異性適體時充分作用。在16個回合的篩選之后，將適體池定序。

實例2：經(jīng)分離適體以高親和力特異地辨識表現(xiàn)ctla-4的細胞

因為結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性較高，選出經(jīng)由在實例1中所述方法分離的四個適體(ca7、ca21、ca32與ca82)。通過流式細胞儀分析這四個適體的結(jié)合特異性。所有這四個適體特異地辨識表現(xiàn)ctla-4的細胞，除了ca7對野生型293細胞的非特異性結(jié)合信號相對較低以外(圖2，a與b區(qū))。這個數(shù)據(jù)暗示，針對ctla-4表現(xiàn)細胞的特異性適體被鑒別出。ctla-4表現(xiàn)細胞的非波形螢光信號(圖2，b區(qū))是因為瞬時轉(zhuǎn)染，造成ctla-4表現(xiàn)位準的大幅變化。這四個適體的結(jié)合親和力亦如圖2，c-f區(qū)中所示來進行鑒別。

適體ca7、ca32與ca82的核酸序列顯示于下。

ca7：(seqidno:3)

ca32：(seqidno:4)

ca82：(seqidno:5)

斜體區(qū)意指引子位點而粗體區(qū)意指這些抗-ctla-4適體的核心區(qū)。

實例3：ctla-4拮抗性適體在活體內(nèi)抑制腫瘤生長

在分析50個經(jīng)分離ctla-4適體之后，鑒別出5個辨識ctla-4上的b7-1與b7-2蛋白結(jié)合位點的適體。適體的一ca21與小鼠ctla-4交叉反應，其被選出在同系小鼠模型中用于腫瘤抑制分析。圖3顯示ca21適體的序列(圖3，a區(qū))及預測二級結(jié)構(gòu)(圖3，b區(qū))。

將小鼠tc-1肺癌細胞(3x10⁵)皮下植入至c57bl/6小鼠體內(nèi)。當腫瘤的短軸達到8mm時，將0.3nmoleca21(于pbs中)或?qū)φ誴bs注入小鼠的腹膜空間內(nèi)。注射日記錄為第0天且每周測量腫瘤尺寸兩次。結(jié)果指出，相較于對照pbs治療對照組，ca21可有效率地抑制腫瘤生長(圖4，a區(qū))。監(jiān)控腫瘤體積歷時24天，且腫瘤生長在ca21治療之后減少達超過70％(圖4，b與c區(qū))。相反地，ca21治療不會影響小鼠體重或活體外的腫瘤細胞增生(圖4，d與e區(qū))。這些數(shù)據(jù)暗示，ca21是通過間接機制來抑制腫瘤細胞生長。

實例4：ctla-4拮抗性適體在結(jié)腸癌的活體內(nèi)同系小鼠模型中抑制腫瘤生長

使用同系小鼠模型來證實ctla-4拮抗性適體ca21在活體內(nèi)對于結(jié)腸癌生長的抑制活性。簡言之，在第0天將小鼠ct26結(jié)腸直腸癌細胞(atcccrl-2638)皮下植入至balb/c小鼠體內(nèi)(每只小鼠2x10⁵個ct26細胞)。當腫瘤的短軸達到8mm時，將0.3nmoleca21(于pbs中)或?qū)φ誴bs注入小鼠的腹膜空間內(nèi)。如圖5，a區(qū)中所示，ct26細胞同系小鼠在第4、6、8及10天時注射ca21適體(圖5，a區(qū)；箭頭表示注射時間)。每周測量腫瘤尺寸三次。用來計算腫瘤尺寸的公式為(lxd²)/2，其中l(wèi)為腫瘤的長直徑，而d為腫瘤的短直徑。相較于以對照pbs治療之小鼠的腫瘤尺寸，經(jīng)ca21治療之小鼠的腫瘤尺寸在腫瘤細胞注射之后第16天減少達約70％(圖5，b區(qū))。這些數(shù)據(jù)指明，ca21適體可用來治療結(jié)腸癌。

實例5：ctla-4拮抗性適體在肺癌的活體內(nèi)同系小鼠模型中抑制腫瘤生長

使用同系肺癌小鼠模型來證實ctla-4拮抗性適體ca21在活體內(nèi)對于肺癌生長的抑制活性。簡言之，在第0天將小鼠路易士肺癌細胞(atcc，crl1642)皮下植入至c57bl/6小鼠體內(nèi)(每只小鼠1x10⁵個路易士肺細胞)。當腫瘤的短軸達到8mm時，將0.3nmoleca21(于pbs中)或?qū)φ誴bs注入小鼠的腹膜空間內(nèi)。如圖6，a區(qū)中所示，路易士肺細胞同系小鼠在第4、6、8、10及12天時注射ca21適體(圖6，a區(qū)；箭頭表示注射時間)。每周測量腫瘤尺寸三次。用來計算腫瘤尺寸的公式為(lxd²)/2，其中l(wèi)為腫瘤的長直徑，而d為腫瘤的短直徑。相較于以對照pbs治療的小鼠的腫瘤尺寸，經(jīng)ca21治療的小鼠的腫瘤尺寸在腫瘤細胞注射之后第18天減少達約50％(圖5，b區(qū))。這些數(shù)據(jù)指明，ca21適體可用來治療肺癌。

實例6：靜脈內(nèi)投與聚乙二醇化ctla-4拮抗性適體抑制腫瘤生長

于本研究中評估ca21的聚乙二醇化形式(ca21-peg)在活體內(nèi)對于癌細胞的抑制活性。

使用馬來酰亞胺將ca21適體接合至聚乙二醇(peg)。為產(chǎn)生ca21-peg，將20μl的18mm甲酸銨ph4中的3’-硫醇ca21適體(3nmol)添加至具有分子量為40kda的30nmolpeg(還原適體對peg莫耳比為1：5)?；旌衔镌诹虼技榜R來酰亞胺反應中于37℃下進行混合。1小時后，混合物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(page)以分離ca21-peg，而ca21-peg是使用標準技術由聚丙烯酰胺凝膠中被萃取出來。所使用的peg分子量為40kda，其附接至ca21適體的3’端。

在同系肺癌小鼠模型中通過靜脈內(nèi)投與來測定ca21-peg的抗癌活性。在第0天將路易士肺癌細胞(atcc，crl1642)皮下植入至c57bl/6小鼠體內(nèi)(每只小鼠1x10⁵個路易士肺細胞)。當腫瘤的短軸達到8mm時，將0.3nmoleca21(于pbs中)、0.3nmoleca21-peg(于pbs中)或?qū)φ誴bs的一個劑量注入小鼠的尾靜脈內(nèi)。每周測量腫瘤尺寸兩次。用來計算腫瘤尺寸的公式為(lxd²)/2，其中l(wèi)為腫瘤的長直徑，而d為腫瘤的短直徑。相較于以ca21治療的小鼠的腫瘤尺寸，經(jīng)ca21-peg治療的小鼠的腫瘤尺寸在腫瘤細胞注射之后第16天減少達約50％(圖7)。這些數(shù)據(jù)指明，聚乙二醇化ca21適體(ca21-peg)可通過靜脈內(nèi)投與用來治療癌癥。

其他具體例

此說明書中揭示的所有特征能以任何組合形式加以組合。此說明書中揭示的個別特征可被具有相同、相等或類似特性的替代性特征所取代。因此，除非他處有清楚說明，否則所揭示的個別特征僅為具有相等或類似特征的上位系列實例。

由以上說明，習于技藝者可容易確定本發(fā)明的主要特征，且在不偏離其精神與范疇的情況下做出本發(fā)明的各種變化與修飾，以使其適用于不同用途及情況。因此，其他具體例也落在權利要求內(nèi)。

序列表

<110>中央研究院

<120>拮抗性ctla-4適體及其于增進免疫活性的應用

<130>a0988.70056wo00

<140>尚未分派

<141>同時隨附

<150>us62/031,406

<151>2014-07-31

<160>8

<170>patentinversion3.5

<210>1

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