相關(guān)申請的交叉引用本申請要求根據(jù)2015年9月4日提交的美國臨時申請序列號62/045,947在35usc§119(e)下的權(quán)益，其全部內(nèi)容通過引用并入本文。對電子提交的序列表的援引序列表的正式副本通過efsweb以電子方式提交，其為ascii格式的序列表，名稱為“76018_st25.txt”，于2015年9月2日創(chuàng)建，大小為73.9千字節(jié)，并與本申請同時遞交。包含在該ascii格式化文檔中的序列表是說明書的一部分，其全部內(nèi)容通過引用并入本文。
背景技術(shù)：
：：土壤桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化導(dǎo)致t鏈整合在植物細(xì)胞的基因組內(nèi)。t鏈含有基因表達(dá)盒，這些基因表達(dá)盒由被精確地設(shè)計為將啟動子連接到感興趣的基因和3'非翻譯區(qū)(utr)的基因調(diào)控元件組成。這些序列相對于彼此被精確地設(shè)計，以最佳地驅(qū)動目的基因的表達(dá)以產(chǎn)生蛋白質(zhì)?；蛘{(diào)控元件的穩(wěn)定性對于感興趣的基因的最佳表達(dá)是至關(guān)重要的。包含在t鏈內(nèi)的多核苷酸序列的些許修飾可能會減少乃至消除感興趣的基因的表達(dá)。根癌土壤桿菌(lba4404)菌株通常用于將t鏈整合到植物細(xì)胞的基因組內(nèi)。參見：ooms,g.,hooykaas,p.j.j.,vanveen,r.j.m.,vanbeelen,p.,regensburg-tuienk,t.j.g.,andr.a.schilperoort(1982)"octopineti-plasmiddeletionmutantsofagrobacteriumtumefacienswithemphasisontherightsideofthet-region."plasmid7:15-29；hoekema,a.,hirsch,p.r.,hooykaas,p.j.j.,andr.a.schilperoort(1983)"abinaryplantvectorstrategybasedonseparationofvir-andt-regionoftheagrobacteriumtumefaciensti-plasmid."nature303:179-180；以及deframmond,a.j.,bartonk.a.,andm-d.chilton(1983)"mini-ti:anewvectorstrategyforplantgeneticengineering".biotechnology1:262-269。盡管在過去三十年中根癌土壤桿菌(lba4404)得到了廣泛的使用，但人們已經(jīng)觀察到，轉(zhuǎn)化在該種菌株內(nèi)的質(zhì)粒在菌株內(nèi)轉(zhuǎn)化后變得不穩(wěn)定。已經(jīng)觀察到基因調(diào)節(jié)元件，特別是那些重復(fù)的元件，在根癌土壤桿菌(lba4404)菌株內(nèi)重組。這種不穩(wěn)定性導(dǎo)致植物轉(zhuǎn)化效率降低，需要徹底地篩選潛在轉(zhuǎn)基因植物以尋找未改變的t鏈序列。鑒于轉(zhuǎn)化在該菌株內(nèi)的質(zhì)粒的不穩(wěn)定性，需要開發(fā)不具有重組特性，并且能夠穩(wěn)定地維持質(zhì)粒而不重排位于質(zhì)粒內(nèi)的遺傳元件的根癌土壤桿菌(lba4404)菌株。因此，對具有改善的質(zhì)粒穩(wěn)定性的根癌土壤桿菌菌株仍然存在需求。特別地，開發(fā)在遺傳重組途徑中有缺陷的根癌土壤桿菌菌株可能是令人期望的。發(fā)明概要本申請?zhí)峁┯糜诋a(chǎn)生和利用相對于親本菌株reca活性缺陷的根瘤土壤桿菌菌株(例如lba4404)的新組合物和方法。還公開了與根瘤土壤桿菌的其他基因缺陷菌株的組合。具體地，提供了兩種示例性的sreca-菌株：uia777，其中氯霉素抗性基因破壞了reca基因；和uia770，其中卡那霉素抗性基因破壞了reca基因。在一個方面，提供了根瘤土壤桿菌的修飾菌株，其中所述修飾菌株相對于其親本菌株在某種遺傳重組途徑中是有缺陷的。在一個實(shí)施方案中，所述修飾菌株在選自reca、recb、recd、recf、recg、recj、recn、reco、recq、recr、和recx的至少一種重組途徑中是有缺陷的。在另一個實(shí)施方案中，所述修飾菌株在reca途徑中有缺陷。在一個進(jìn)一步的實(shí)施方案中，reca基因包含與seqidno:10或11具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或100％序列同一性的多核苷酸序列。在另一個實(shí)施方案中，所述修飾菌株還在選自下組的活性中有缺陷：recb、recd、recf、recg、recj、recn、reco、recq、recr和recx。reca基因和reca蛋白質(zhì)序列分別如seqidno:10和12所示。recb基因和recb蛋白質(zhì)序列分別如seqidno:13和14所示。recd基因和recd蛋白質(zhì)序列分別如seqidno:15和16所示。recf基因和recf蛋白質(zhì)序列分別如seqidno:17和18所示。recg基因和recg蛋白質(zhì)序列分別如seqidno:19和20所示。recj基因和recj蛋白質(zhì)序列分別如seqidno:21和22所示。recn基因和recn蛋白質(zhì)序列分別如seqidno:23和24所示。reco基因和reco蛋白質(zhì)序列分別如seqidno:25和26所示。recq基因和recq蛋白質(zhì)序列分別如seqidno:27和28所示。recr基因和recr蛋白質(zhì)序列分別如seqidno:29和30所示。recx基因和recx蛋白質(zhì)序列分別如seqidno:31和32所示。在另一個實(shí)施方案中，基因組reca基因通過在reca基因中缺失、重組或插入序列而被修飾。在另一個實(shí)施方案中，基因組reca基因通過在reca基因內(nèi)插入序列，從而破壞reca蛋白的表達(dá)而被修飾。在一個進(jìn)一步的實(shí)施方案中，插入的序列包含選擇標(biāo)志物基因。在另一個實(shí)施方案中，選擇標(biāo)志物基因包括選自下組的抗生素抗性基因：氯霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、壯觀霉素抗性基因、慶大霉素抗性基因、或其組合。在一個進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述抗生素抗性基因包括氯霉素抗性基因或卡那霉素抗性基因。在所述修飾菌株的一個實(shí)施方案中，在從所述菌株制備的提取物中檢測不到reca活性。在另一個實(shí)施方案中，使用western印跡分析檢測不到reca蛋白。在另一個實(shí)施方案中，使用nothern印跡分析檢測不到recamrna。在另一個實(shí)施方案中，使用southern印跡分析檢測不到reca基因。在一個實(shí)施方案中，reca基因編碼seqidno:12的蛋白質(zhì)。在另一個實(shí)施方案中，所述菌株包含ti質(zhì)粒。在一個進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述ti質(zhì)粒包括pal4404ti質(zhì)粒，或者是自pal4404ti質(zhì)粒衍生的。在一個實(shí)施方案中，所述菌株包含二元質(zhì)粒。在一個進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述二元質(zhì)粒包含選自下組的農(nóng)藝性狀的基因：殺蟲抗性性狀、除草劑耐性性狀、氮利用效率性狀、水分利用效率性狀、營養(yǎng)品質(zhì)性狀、dna結(jié)合性狀、選擇標(biāo)志物性狀，及其組合。在另一個實(shí)施方案中，所述菌株包含三元質(zhì)粒。在另一個實(shí)施方案中，親本菌株是根瘤土壤桿菌(lba4404)。在另一個方面，提供了質(zhì)粒，所述質(zhì)粒包含來自根瘤土壤桿菌的修飾的reca基因，其中該reca基因與修飾之前的seqidno:10或seqidno:11具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或100％序列同一性，且該修飾的reca基因在reca蛋白的表達(dá)中有缺陷。在一個實(shí)施方案中，所述修飾包括在reca基因或seqidno:10或11內(nèi)插入供體序列。在一個進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述供體序列包含選擇標(biāo)志物基因。在另一個實(shí)施方案中，所述選擇標(biāo)志物基因選自下組的抗生素抗性基因：氯霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、壯觀霉素抗性基因、慶大霉素抗性基因、或其組合。在一個進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述抗生素抗性基因包括氯霉素抗性基因或卡那霉素抗性基因。在另一個實(shí)施方案中，供體序列的至少一端被seqidno:10或11的至少43堿基對的片段所側(cè)翼。在另一個方面，提供了生成這樣的根瘤土壤桿菌菌株的方法，所述菌株相對于其親本菌株在遺傳重組途徑中有缺陷。所述方法包括(a)提供針對reca基因的敲除質(zhì)粒；(b)將所述敲除質(zhì)粒導(dǎo)入根瘤土壤桿菌菌株中；(c)選擇并篩選包含基因組突變的菌落；和(d)鑒定至少一個具有reca基因組突變的突變根瘤土壤桿菌。在一個實(shí)施方案中，所述reca基因與seqidno:10或11具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或100％序列同一性。在另一個實(shí)施方案中，所述敲除質(zhì)粒引入選自下組的突變：基因組缺失、基因組重排、基因組插入、及其組合。在一個進(jìn)一步的實(shí)施方案中，基因組插入包含編碼選擇標(biāo)志物的序列。在另一個實(shí)施方案中，所述選擇標(biāo)志物基因包含選自氯霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、壯觀霉素抗性基因、慶大霉素抗性、或其組合的抗生素抗性基因。在一個進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述抗生素抗性基因包括氯霉素抗性基因或卡那霉素抗性基因。在另一個方面，提供了轉(zhuǎn)基因事件，其包含(a)被上游基因組dna邊界序列側(cè)翼的t鏈插入序列和(b)下游基因組邊界序列，其中所述轉(zhuǎn)基因事件包含來自根瘤土壤桿菌修飾菌株的t鏈的整合，所述根瘤土壤桿菌修飾菌株相對于其親本菌株在遺傳重組途徑中有缺陷。在一個實(shí)施方案中，來自根瘤土壤桿菌的修飾菌株的t鏈整合在用于再生轉(zhuǎn)基因事件的目標(biāo)植物細(xì)胞的基因組內(nèi)。在另一個實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因事件進(jìn)一步包含農(nóng)藝學(xué)性狀。在一個進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述農(nóng)藝學(xué)性狀選自下組：除草劑耐性性狀，氮利用效率性狀，水分利用效率性狀，營養(yǎng)品質(zhì)性狀，dna結(jié)合性狀，選擇標(biāo)記物性狀，及其組合。在另一個實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因事件是雙子葉植物或單子葉植物。在另一個實(shí)施方案中，所述雙子葉植物或單子葉植物選自下組：大麥、卡諾拉油菜、咖啡、玉米、棉花、亞麻、葡萄、蛇麻草、芥菜、堅(jiān)果、燕麥、罌粟、油菜、水稻、印度榕(rubberplant)、黑麥、向日葵、高粱、大豆、甘蔗、茶葉、煙草和小麥。在另一個實(shí)施方案中，所述雙子葉植物或單子葉植物選自玉米、小麥、棉花、水稻、大豆、和卡諾拉油菜。在另一個實(shí)施方案中，在另一個實(shí)施方案中，所述雙子葉植物或單子葉植物選自下組：香蕉，菠蘿，柑橘，葡萄，西瓜，網(wǎng)紋瓜(cantaloupe)，香瓜(muskmelon)以及其他甜瓜，蘋果，桃，梨，櫻桃，獼猴桃，芒果，油桃，番石榴，番木瓜，柿子，石榴，鱷梨，無花果，柑橘和漿果。在另一個方面，提供了產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法。所述方法包括(a)使目標(biāo)植物細(xì)胞與根癌土壤桿菌的修飾菌株接觸，所述菌株相對于其親本菌株在遺傳重組途徑中有缺陷；(b)選擇和篩選包含來自所述土壤桿菌菌株的dna的植物細(xì)胞，其中所述dna整合在目標(biāo)植物細(xì)胞的基因組中；(c)從步驟(b)中選擇/篩選出的植物細(xì)胞再生完整的轉(zhuǎn)基因植物。在一個實(shí)施方案中，選擇步驟使用選擇標(biāo)志物進(jìn)行。在一個進(jìn)一步的實(shí)施方案中，選擇標(biāo)志物基因包括抗生素抗性基因，所述抗生素抗性基因選自氯霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、壯觀霉素抗性基因、慶大霉素抗性基因、或其組合。在另一個實(shí)施方案中，抗生素抗性基因包括氯霉素抗性基因或卡那霉素抗性基因。附圖說明圖1示出了用于reca誘變的質(zhì)粒的插入片段圖。圖1a顯示了pwm-recanei中的reca基因及其相鄰序列。b，pcp-mmsr2中l(wèi)ba4404的dna片段的xhoi限制性圖譜。c，用編碼抗抗生素cm或km抗性的盒子代替reca。圖2示出來自根癌土壤桿菌(lba4404)的reca與來自其他土壤桿菌菌株的reca基因的相關(guān)性。該系統(tǒng)發(fā)育樹系使用phyml(可在萬維網(wǎng)phylogeny.fr訪問)(dereepera,guignonv,blancg,audics,buffets,chevenetf,dufayardjf,guindons,lefortv,lescotm,claveriejm,gascuelo.(2008)phylogeny.fr:robustphylogeneticanalysisforthenon-specialist.nucleicacidsresearch.36(webserverissue):w465-9)獲得。使用reca的內(nèi)部969bp片段(34-1005bp)進(jìn)行該比對分析。其他菌株選自土壤桿菌屬的代表性reca基因組型(g-)和如標(biāo)識的相關(guān)分類群(costechareyre等人，2010)。圖3示出了兩種示例性根癌土壤桿菌(lba4404)突變體reca-菌株：uia777和uia770，與野生型和補(bǔ)全型菌株相比的生長速率。對于這些測定，使用mgl培養(yǎng)基。圖4示出了二元質(zhì)粒pdab108700的質(zhì)粒圖，顯示了構(gòu)建體設(shè)計和構(gòu)建體內(nèi)的玉米泛素-1啟動子的重復(fù)。具體實(shí)施方式本文公開了用于生產(chǎn)和使用相對于親本菌株缺乏reca活性的根癌土壤桿菌(lba4404)菌株的新型組合物和方法。進(jìn)一步描述了用于在根癌土壤桿菌(lba4404)的基因組內(nèi)整合多核苷酸片段的染色體整合位點(diǎn)。所公開的新型組合物和方法可用于生產(chǎn)具有植物物種的轉(zhuǎn)基因事件。除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本公開涉及的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。在發(fā)生沖突的情況下，以本申請包括定義在內(nèi)為準(zhǔn)。除非上下文另有要求，單數(shù)術(shù)語應(yīng)包括復(fù)數(shù)，復(fù)數(shù)詞應(yīng)包括單數(shù)。本文提及的所有出版物，專利和其他參考文獻(xiàn)的全部內(nèi)容通過引用并入本文用于所有目的，如同每個單獨(dú)的出版物或?qū)＠暾埍痪唧w和單獨(dú)地指明通過引用并入本文一樣，除非僅將專利或?qū)＠霭嫖锏奶囟ú糠种甘緸橥ㄟ^引用并入。為了進(jìn)一步澄清本公開，提供了以下術(shù)語，縮寫和定義。如本文中使用的，術(shù)語“包含”、“包括”、“具有”、“含有”、或它們的任何其他變型均旨在是非排他性的或開放式的。例如，包含列出的要素的組合物、混合物、工藝、方法、物品、或裝置不一定僅限于那些要素，而是可以包括未明確列出的或此類組合物、混合物、工藝、方法、物品或裝置固有的其他要素。此外，除非明確相反地說明，“或”是指包含性的“或”而不是排他性的“或”。例如，通過任何一種以下情況來滿足條件a或b：a是真實(shí)的(或存在)且b是虛假的(或不存在)，a是虛假的(或不存在)且b為真實(shí)的(或存在)以及a和b都是真實(shí)的(或存在)。如本文中使用的，“內(nèi)源序列”定義處于其在生物體或生物體的基因組中的天然位置的多核苷酸、基因或多肽的天然形式。如本文中使用的，術(shù)語“多核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”可以互換使用，并可包括單個核酸、多個核酸、核酸片段、變體或其衍生物、和核酸構(gòu)建體(例如信使rna(mrna)和質(zhì)粒dna(pdna))。多核苷酸或核酸可以含有全長cdna序列、或其片段的核苷酸序列，包括非翻譯的5'和/或3'序列和編碼序列。多核苷酸或核酸可以由任何多聚核糖核苷酸或多聚脫氧核糖核苷酸組成，其可以包括未修飾的核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或修飾的核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸。例如，多核苷酸或核酸可以由單鏈和雙鏈dna；單鏈區(qū)和雙鏈區(qū)混合物dna；單鏈和雙鏈rna；以及單鏈區(qū)和雙鏈區(qū)混合物rna組成。包含dna和rna的雜交分子可以是單鏈的、雙鏈的、或單鏈區(qū)和雙鏈區(qū)的混合物。前述術(shù)語還包括化學(xué)、酶學(xué)和代謝修飾形式的多核苷酸或核酸。應(yīng)當(dāng)理解，具體的dna還指其互補(bǔ)物，其序列根據(jù)脫氧核糖核苷酸堿基配對的規(guī)則確定。如本文中使用的，術(shù)語“基因”是指編碼功能產(chǎn)物(rna或多肽/蛋白)的核酸?；蚩梢园挥诰幋a功能產(chǎn)物的序列之前(5'非編碼序列)和/或之后(3'非編碼序列)的調(diào)節(jié)序列。如本文使用的，術(shù)語“編碼序列”是指編碼特定氨基酸序列的核酸序列?！罢{(diào)節(jié)序列”是指位于編碼序列上游(例如，5'非編碼序列)、內(nèi)部或下游(例如，3'非編碼序列)的核苷酸序列，其影響相關(guān)編碼序列的轉(zhuǎn)錄、rna加工或穩(wěn)定性、或翻譯。調(diào)節(jié)序列包括，例如但不限于：啟動子；翻譯前導(dǎo)序列；內(nèi)含子；多腺苷酸化識別序列；rna加工位點(diǎn)；效應(yīng)物結(jié)合位點(diǎn)；和莖環(huán)結(jié)構(gòu)。如本文中使用的，術(shù)語“多肽”包括單個多肽、多個多肽、和其片段。該術(shù)語是指由通過酰胺鍵(也稱作肽鍵)線性連接的單體(氨基酸)構(gòu)成的分子。術(shù)語“多肽”是指兩個或更多個氨基酸構(gòu)成的任何鏈(一個或多個)，且不指示產(chǎn)物的具體長度和大小。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、蛋白質(zhì)、氨基酸鏈、和任何其他用于指示有兩個或多個氨基酸的鏈的術(shù)語均包含在“多肽”的定義之內(nèi)，并且前述術(shù)語在本文中可以和“多肽”互換使用。多肽可以是從天然生物源分離的或者通過重組技術(shù)產(chǎn)生的，但是具體的多肽不一定是從特定的核酸翻譯產(chǎn)生的。多肽可以用任何合適的方式產(chǎn)生，包括例如但不限于，通過化學(xué)合成。相反，術(shù)語“異源的”是指在參考(宿主)生物的位置處通常不會發(fā)現(xiàn)的多核苷酸、基因或多肽。例如，異源核酸可以是通常在參考生物的不同基因組位置處被發(fā)現(xiàn)的核酸。作為進(jìn)一步的實(shí)例，異源核酸可以是通常不會在參考生物中被發(fā)現(xiàn)的核酸。含有異源多核苷酸、基因或多肽的宿主生物可以通過將異源多核苷酸、基因或多肽導(dǎo)入到宿主生物內(nèi)而產(chǎn)生。在特定的實(shí)例中，異源多核苷酸包括以不同于相應(yīng)的天然多核苷酸的形式被重新導(dǎo)入到來源生物內(nèi)的天然編碼序列、或其部分。在特定的實(shí)例中，異源基因包括以不同于相應(yīng)的天然基因的形式被重新導(dǎo)入到來源生物內(nèi)的天然編碼序列或其部分。例如，異源基因可以包括天然編碼序列，該天然編碼序列是含有非天然調(diào)節(jié)區(qū)的嵌合基因的一部分，該嵌合基因被重新導(dǎo)入到天然宿主內(nèi)。在特定的實(shí)例中，異源多肽是以不同于相應(yīng)的天然多肽的形式被重新導(dǎo)入到來源生物內(nèi)的天然多肽。異源基因或多肽可以是這樣的基因或多肽，其包含功能性多肽或編碼功能性多肽的核酸序列，該功能性多肽或編碼功能性多肽的核酸序列與其他基因或多肽融合從而產(chǎn)生嵌合或融合的多肽或編碼它的基因?；蚝偷鞍踪|(zhì)的特定實(shí)施方案包括具體例舉的全長序列和部分、區(qū)段、片段(包括與全長分子相比具有內(nèi)部和/或末端缺失的連續(xù)片段)、變體、突變體、嵌合體、以及這些序列的融合。如本文所使用的，術(shù)語“修飾”可以指本文中公開的多核苷酸內(nèi)的改變，其導(dǎo)致由該多核苷酸編碼的多肽的活性降低、基本上消失、或消失。修飾還指本文中公開的多肽中的改變，其導(dǎo)致該多肽的活性減低、基本上消失、或消失?；蛘撸g(shù)語“修飾”可以指本文中公開的多核苷酸中的改變，其導(dǎo)致該多核苷酸編碼的多肽的活性增加或提高，以及本文中公開的多肽中的改變，其導(dǎo)致該多肽的活性增加或提高。這樣的改變可以通過任何本領(lǐng)域眾所周知的方法實(shí)現(xiàn)，包括但不限于：缺失、突變(例如自發(fā)誘變；隨機(jī)誘變；增變基因?qū)е碌恼T變；或轉(zhuǎn)座子誘變)、取代、插入、下調(diào)、改變的細(xì)胞定位、改變多核苷酸或多肽的狀態(tài)(例如甲基化、磷酸化或泛素化)、除去輔助因子、導(dǎo)入反義rna/dna、導(dǎo)入干擾rna/dna、化學(xué)修飾、共價修飾、用uv或x射線輻照、同源重組、有絲分裂重組；啟動子替換方法；和/或前述的組合。可以通過比較特定多核苷酸或多肽的序列與同源(例如酵母的或細(xì)菌的)多核苷酸或多肽的序列，并使高度同源區(qū)(保守區(qū))或共有序列中的修飾數(shù)目最大化，來找到確定哪些核苷酸或氨基酸殘基可以被修飾的指引。如本文中所用的，術(shù)語“衍生物”，是指在本公開中所闡述的序列的修飾。此類修飾的實(shí)例可為相對于本文中公開的編碼序列的核酸序列取代、插入、和/或缺失一個或多個堿基，而保留、稍微改變、或增加本文所公開的編碼序列在作物物種中的功能。這樣的衍生物可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定，例如，通過使用用于預(yù)測和優(yōu)化序列結(jié)構(gòu)的計算機(jī)建模技術(shù)。術(shù)語“衍生物”還包括這樣的核酸序列，它們與本文中公開的編碼序列有實(shí)質(zhì)性的序列同一性，以至于它們能夠具有所公開的功能，供用于產(chǎn)生本公開的實(shí)施方案。術(shù)語“啟動子”指能夠控制核酸編碼序列或功能rna的表達(dá)的dna序列。在實(shí)例中，受控制的編碼序列位于啟動子序列的3'。可以從天然基因中整體獲得啟動子，啟動子可以包括來自天然出現(xiàn)的不同啟動子的不同元件，或者啟動子甚至可以包括合成的dna片段。本領(lǐng)域的技術(shù)人員理解，不同的啟動子可以指導(dǎo)基因在不同組織或細(xì)胞類型中，或者在不同的發(fā)育階段，或者響應(yīng)不同的環(huán)境或生理?xiàng)l件表達(dá)。所有上述啟動子的實(shí)例都是已知的，并且在本領(lǐng)域中用于控制異源核酸的表達(dá)。指導(dǎo)基因在大多數(shù)細(xì)胞類型中在大部分時間里表達(dá)的啟動子通常稱為“組成型啟動子”。此外，雖然本領(lǐng)域技術(shù)人員已經(jīng)嘗試界定調(diào)節(jié)序列的確切邊界(在許多情況下未成功)，但是已經(jīng)認(rèn)識到，長度不同的dna片段可能具有相同的啟動子活性。特定核酸的啟動子活性可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的技術(shù)進(jìn)行測定。術(shù)語“可操作連接”是指單一核酸上的多個核酸序列的關(guān)聯(lián)，其中一個核酸序列的功能受到另一個的影響。例如，當(dāng)啟動子能夠影響編碼序列的表達(dá)時(例如，編碼序列在啟動子的轉(zhuǎn)錄控制之下)，啟動子與編碼序列就是可操作連接的。編碼序列可以沿著有義和反義方向與調(diào)節(jié)序列可操作連接。如本文中使用的，術(shù)語“表達(dá)”可以指衍生自dna的有義(mrna)或反義rna的轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定積累。表達(dá)也可指mrna翻譯成多肽。如本文中使用的，術(shù)語“過表達(dá)”是指高于相同基因或相關(guān)基因的內(nèi)源表達(dá)的表達(dá)。因此，如果異源基因的表達(dá)高于可比較的內(nèi)源基因的表達(dá)，則該異源基因被“過表達(dá)”。如本文中使用的，術(shù)語“轉(zhuǎn)化”(“transformation”)或“轉(zhuǎn)化”(“transforming”)是指核酸或其片段被轉(zhuǎn)移并整合到宿主生物內(nèi)，導(dǎo)致基因上穩(wěn)定的遺傳。含有轉(zhuǎn)化核酸的宿主生物被稱作“轉(zhuǎn)基因”、“重組”或“轉(zhuǎn)化”生物。如本文中使用的，術(shù)語“結(jié)合”指大分子(例如，蛋白質(zhì)和核酸之間)的序列特異的非共價相互作用。結(jié)合相互作用的所有組成部分并不需要都是序列特異的(例如，與dna主鏈中的磷酸酯基團(tuán)接觸)，只要相互作用作為一個總體是序列特異性即可。這類相互作用一般以10-6m-1或更低的解離常數(shù)(kd)為特征。“親和力”指結(jié)合的強(qiáng)度：增加的結(jié)合親和力與更低的kd相關(guān)?！敖Y(jié)合蛋白”是能夠非共價地與另一個分子結(jié)合的蛋白質(zhì)。結(jié)合蛋白可以與例如dna分子(dna結(jié)合蛋白)、rna分子(rna結(jié)合蛋白)和/或蛋白質(zhì)分子(蛋白質(zhì)結(jié)合蛋白)結(jié)合。在蛋白質(zhì)結(jié)合蛋白的情況下，它可以與自身結(jié)合(以形成同型二聚體、同型三聚體等)和/或它可以與不同的一種或多種蛋白質(zhì)的一個或多個分子結(jié)合。結(jié)合蛋白可以具有多于一個類型的結(jié)合活性。例如，鋅指蛋白具有dna結(jié)合、rna結(jié)合和蛋白質(zhì)結(jié)合活性。如本文中使用的，術(shù)語“質(zhì)?！焙汀拜d體”是指染色體外元件，其可攜帶一個或多個非細(xì)胞中心代謝部分的基因。質(zhì)粒和載體通常是環(huán)狀雙鏈dna分子。然而，質(zhì)粒和載體可以是線性或環(huán)狀核酸，呈單鏈或雙鏈dna或rna，并可以衍生自任何來源，其中若干核苷酸序列被連接或重組成一個獨(dú)特的構(gòu)建體，其能夠?qū)幼悠魏途幋adna序列與任何合適的3'非翻譯序列一起導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)。在實(shí)例中，質(zhì)粒和載體可以包括自主復(fù)制序列、基因組整合序列、和/或噬菌體或核苷酸序列。多肽和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換使用，并且包括通過肽鍵連接的兩個或更多個氨基酸的分子鏈。這些術(shù)語并非是指產(chǎn)物的具體長度。因此，“肽類”和“寡肽類”被包括在多肽的定義之內(nèi)。這些術(shù)語包括多肽的翻譯后修飾，例如糖基化、乙?；⒘姿峄?，等。另外，蛋白質(zhì)片段、類似物、突變或變體蛋白、融合蛋白等被包括在多肽的含義之內(nèi)。這些術(shù)語還包括其中一個或多個氨基酸類似物或非規(guī)范性或非天然氨基酸被包括在內(nèi)的分子，正如可使用已知的蛋白質(zhì)工程技術(shù)合成或重組表達(dá)所述分子。另外，可如本文所述通過熟知的有機(jī)化學(xué)技術(shù)衍生本發(fā)明的融合蛋白。術(shù)語“融合蛋白”表明所述蛋白質(zhì)包括從一個以上的親本蛋白或多肽衍生的多肽組分。典型地，融合蛋白是從融合基因表達(dá)的，在所述融合基因中，編碼來自一種蛋白質(zhì)的多肽序列的核苷酸序列與編碼來自不同蛋白質(zhì)的多肽序列的核苷酸序列一起附加在框內(nèi)，并且任選地由接頭分開。然后，融合基因可由重組宿主細(xì)胞表達(dá)為單一的蛋白質(zhì)。表述“調(diào)控序列”通指啟動子序列、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止序列、上游調(diào)節(jié)域、增強(qiáng)子，等等，它們共同提供編碼序列在宿主細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和翻譯。并不需要所有的這些調(diào)控序列總是存在于重組體載體中，只要所期望的基因能轉(zhuǎn)錄和翻譯即可?！爸亟M”是指在兩個dna或rna分子之間dna或rna序列片段的再分配(reassortment)?！蓖粗亟M”發(fā)生在依靠各自dna分子中存在的同源或互補(bǔ)核苷酸序列雜交的兩個dna分子之間。術(shù)語“嚴(yán)格條件”或者”在嚴(yán)格條件下雜交”是指在該條件下探針會優(yōu)先與其靶亞序列雜交，而較少程度或者根本不與其它序列雜交。在核酸雜交實(shí)驗(yàn)例如southern雜交和northern雜交的上下文中，”嚴(yán)格雜交”和”嚴(yán)格雜交洗滌條件”是序列依賴性的，并且在不同的環(huán)境參數(shù)下不同。核酸雜交的廣泛指導(dǎo)參見tijssen(1993)laboratorytechniquesinbiochemistryandmolecularbiology—hybridizationwithnucleicacidprobespartichapter2overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassays,elsevier,newyork。一般而言，高嚴(yán)格雜交和洗滌條件選擇為比特異性序列在指定的離子強(qiáng)度和ph下的熱解鏈點(diǎn)(tm)低約5℃。tm是在指定的離子強(qiáng)度和ph下50％的靶序列雜交至完美匹配的探針的溫度。非常嚴(yán)格條件選擇為等于針對具體探針的tm。在southern或northern印跡中在濾紙上具有超過100個互補(bǔ)殘基的互補(bǔ)核酸的雜交的嚴(yán)格雜交條件的一個實(shí)例是50％甲酰胺與1mg肝素在42℃，其中雜交進(jìn)行過夜。高嚴(yán)格洗滌條件的一個實(shí)例是0.15mnacl，在72℃達(dá)約15分鐘。嚴(yán)格洗滌條件的一個實(shí)例是在65℃用0.2xssc洗滌持續(xù)15分鐘(參見sambrook等人，(1989)molecularcloning--alaboratorymanual(2nded.)vol.1-3,coldspringharborlaboratory,coldspringharborpress,ny，就ssc緩沖液描述而言)。常常，在高嚴(yán)格洗滌之前進(jìn)行低嚴(yán)格洗滌以除去背景探針信號。用于例如超過100個核苷酸的雙鏈體的中等嚴(yán)格洗滌的一個實(shí)例是在45℃用1xssc持續(xù)15分鐘。用于例如超過100個核苷酸的雙鏈體的低嚴(yán)格洗滌的一個實(shí)例是在40℃用4-6xssc持續(xù)15分鐘。一般而言，在具體的雜交測定中觀察到相對于不相關(guān)探針的2x(或更高)的信噪比表明檢測到特異性雜交。如果核酸編碼的多肽是基本上相同的，那么在嚴(yán)格條件下未彼此雜交的核酸仍然是基本上相同的。這在例如，核酸的拷貝是使用遺傳編碼所允許的最大密碼子簡并產(chǎn)生時會發(fā)生。本公開還涉及分離的多核苷酸，其可在嚴(yán)格條件下，優(yōu)選在高嚴(yán)格條件下，與本公開的多核苷酸雜交。本申請所用術(shù)語“雜交”意在描述用于雜交和洗滌的條件，在該條件下彼此至少約50％、至少約60％、至少約70％、更優(yōu)選至少約80％、甚至更優(yōu)選至少約85％～90％、最優(yōu)選至少95％同源的核苷酸序列通常保持彼此雜交。在一個實(shí)施方案中，本公開的核酸是與本申請所示的核酸序列或其互補(bǔ)物至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同源的。嚴(yán)格雜交條件的另一個非限制性實(shí)例是在約45℃在6x氯化鈉/檸檬酸鈉(ssc)中雜交，然后在1xssc,0.1％sds中在50℃、優(yōu)選在55℃、更優(yōu)選在60℃且甚至更優(yōu)選在65℃進(jìn)行一次或多次洗滌。高嚴(yán)格條件可包括使用標(biāo)記的dna探針諸如地高辛(dig)標(biāo)記的dna探針，在42℃溫育幾天諸如2～4天的時間，然后進(jìn)行一次或多次在2xssc,0.1％sds中在室溫的洗滌以及一次或多次在0.5xssc,0.1％sds或者0.1xssc,0.1％sds中在65-68℃的洗滌。具體地，高嚴(yán)格條件包括例如2小時至4天的在42℃的溫育，其中使用dig標(biāo)記的dna探針(例如通過使用dig標(biāo)記系統(tǒng)制備；rochediagnosticsgmbh,68298mannheim,germany)，在溶液諸如包含或者不含100μg/ml鮭精dna的digeasyhyb溶液(rochediagnosticsgmbh)，或者包含50％甲酰胺、5xssc(150mmnacl、15mm檸檬酸三鈉)、0.02％十二烷基硫酸鈉、0.1％n-月桂酰肌氨酸和2％封閉劑的溶液(rochediagnosticsgmbh)中，然后在2xssc和0.1％sds中在室溫洗滌濾紙兩次持續(xù)5～15分鐘，接著在0.5xssc和0.1％sds或者0.1xssc和0.1％sds中在65-68℃洗滌兩次持續(xù)15～30分鐘。在一些實(shí)施方案中，在高嚴(yán)格條件下與本發(fā)明核苷酸序列雜交的本發(fā)明的分離的核酸分子可對應(yīng)于天然存在的核酸分子。本申請所用的”天然存在的”核酸分子是指具有自然界中存在的核苷酸序列(例如，編碼天然蛋白質(zhì))的rna或dna分子。技術(shù)人員會知道就嚴(yán)格和高嚴(yán)格雜交條件而言適用什么條件。關(guān)于所述條件的另外指導(dǎo)在本領(lǐng)域中是易于得到的，例如在sambrook等人，1989,molecularcloning,alaboratorymanual,coldspringharborpress,n.y.；以及ausubel等人，(eds.),1995,currentprotocolsinmolecularbiology,(johnwiley&sons,n.y.)中。術(shù)語“同源性”或“百分比同一性”在本文可互換使用。就本發(fā)明的目的而言，在本文中定義：為了測定兩個氨基酸序列或兩個核酸序列的同一性百分比，為了最佳比較的目的將序列進(jìn)行比對(例如可向第一氨基酸或核酸序列中引入缺口以便實(shí)現(xiàn)與第二氨基酸或核酸序列的最佳比對)。然后比較相應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸殘基或核苷酸。當(dāng)?shù)谝恍蛄兄械奈恢帽慌c第二序列中相應(yīng)位置相同的氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)時，則兩個分子在該位置是相同的。兩個序列之間的同一性百分比是兩序列分享的相同位置數(shù)的函數(shù)(即同一性％＝相同位置數(shù)/位置總數(shù)(即重疊位置數(shù))×100)。優(yōu)選地，兩個序列長度相同。技術(shù)人員會了解下述事實(shí)：有若干種不同的計算機(jī)程序可用來測定兩個序列之間的同源性。例如，可通過使用數(shù)學(xué)算法完成兩個序列之間序列比較和同一性百分比的測定。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用needleman與wunsch(j.mol.biol.(48):444-453(1970))算法，該算法已被整合進(jìn)gcg軟件包(可在互聯(lián)網(wǎng)上的accelrys的萬維網(wǎng)accelrys.com訪問)的gap程序中，使用blossom62矩陣或pam250矩陣和16、14、12、10、8、6或4的缺口權(quán)重和1、2、3、4、5或6的長度權(quán)重來測定兩個氨基酸序列之間的百分比同一性。技術(shù)人員會理解所有這些不同的參數(shù)會產(chǎn)生稍微不同的結(jié)果，但是使用不同的算法時兩個序列之間的總體同一性百分比不會顯著改變。在又一實(shí)施方案中，用gcg軟件包(可在互聯(lián)網(wǎng)上的accelrys的萬維網(wǎng)accelrys.com訪問)中的gap程序，使用nwsgapdna.cmp矩陣和40、50、60、70或80的缺口權(quán)重及1、2、3、4、5或6的長度權(quán)重，確定兩個核苷酸序列之間的百分比同一性。在另一實(shí)施方案中，用e.meyers與w.miller(cabios，4:11-17(1989)的算法，使用pam120重量殘基表、12的缺口長度罰分和4的缺口罰分來確定兩個氨基酸或核苷酸序列之間的同一性百分比，所述算法已被整合進(jìn)align程序(2.0版)中(可在互聯(lián)網(wǎng)上的vega網(wǎng)站訪問，更具體地說是在align–ighmontpellier，或者更具體地說是在http://vega.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi訪問)。本發(fā)明的核酸和蛋白質(zhì)序列可進(jìn)一步被用作“查詢序列”來對公開數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索，來例如鑒定其他的家族成員或相關(guān)序列。這類搜索可使用例如altschul,etal.(1990)j.mol.biol.215:403-10的blastn和blastx程序(2.0版)進(jìn)行。可使用blastn程序進(jìn)行blast核苷酸搜索(分值＝100，字長＝12)來獲得與本公開的核酸分子同源的核苷酸序列?？墒褂胋lastx程序進(jìn)行blast蛋白質(zhì)搜索(分值＝50，字長＝3)來獲得與本公開的蛋白質(zhì)分子同源的氨基酸序列。為了獲得有缺口的比對用于比較的目的，可以如altschuletal.,(1997)nucleicacidsres.25(17):3389-3402中所述地利用缺口blast(gappedblast)。使用blast和缺口blast程序時，可使用各程序(例如blastx和blastn)的默認(rèn)參數(shù)(可在互聯(lián)網(wǎng)上ncbi網(wǎng)站訪問，例如萬維網(wǎng)ncbi.nlm.nih.gov)。術(shù)語“嵌合的”，如本文中使用的，是指由“重組的”序列構(gòu)成。例如，序列是“重組的，且在自然界中不一起出現(xiàn)”。本文所用的術(shù)語“重組”是指任何連接多核苷酸的方法。該術(shù)語包括端到端(endtoend)連接，以及將一個序列插入另一個序列。該術(shù)語旨在包括物理連接技術(shù)，例如粘性末端連接作用和平末端連接作用。也可以人工或重組合成這些序列使之包含重組序列。用于本發(fā)明的合適植物可以選自花卉、水果、蔬菜、苗圃、草坪和觀賞作物。在一個進(jìn)一步的實(shí)施方案中，水果選自杏、蘋果、鱷梨、香蕉、漿果(包括草莓、藍(lán)莓、覆盆子、黑莓、醋栗、和其他類型的漿果)，楊桃，櫻桃，柑橘(包括橙子、檸檬、萊檬、桔子、葡萄柚、及其他柑橘)，椰子，無花果，葡萄，番石榴，獼猴桃，芒果，油桃，甜瓜(包括網(wǎng)紋瓜，香瓜，西瓜及其他甜瓜)，橄欖，木瓜，西番蓮，柿子，菠蘿，李子和石榴。在另一個實(shí)施方案中，蔬菜選自蘆筍、甜菜(例如糖用甜菜和飼料甜菜)、豆類、西蘭花、卷心菜、胡蘿卜、木薯、花椰菜、芹菜、黃瓜、茄子、大蒜、西印度黃瓜、綠葉蔬菜(萵苣，羽衣甘藍(lán)，菠菜和其他綠葉蔬菜)、韭蔥、小扁豆、蘑菇、洋蔥、豌豆、辣椒(如甜椒，柿子椒和辣辣椒)、馬鈴薯、南瓜、甘薯、食莢菜豆、倭瓜、和番茄。在另一個實(shí)施方案中，苗圃植物或花或花朵部分選自滿天星、康乃馨、大麗花、水仙花、天竺葵、非洲菊、百合、蘭花、牡丹、野胡蘿卜、玫瑰、金魚草或其他切枝花或裝飾花、盆栽花、花球、灌木、落葉或針葉樹。ti質(zhì)粒-在一些實(shí)施方案中，在reca活性中有缺陷的根癌土壤桿菌(lba4404)包含ti質(zhì)粒。ti質(zhì)粒(也稱為輔助質(zhì)粒)包含產(chǎn)生和轉(zhuǎn)移t-dna區(qū)域所必需的vir區(qū)域。ti質(zhì)粒(例如pal4404，ptibo542，ptic58[和常見的衍生物pti15955]，ptiach5或ptichry5)包括，除了其他基因特征之外，章魚堿合成基因、癌基因、毒力基因(下文稱vir基因)和不完全重復(fù)的位于t-dna側(cè)翼的t-dna邊界序列。大多數(shù)用于植物轉(zhuǎn)化的的土壤桿菌菌株中的ti質(zhì)粒是卸甲的。相應(yīng)地，位于野生型有毒力的土壤桿菌菌株的t鏈內(nèi)的vir和onc基因區(qū)已被去除或突變。然而，t-dna邊界被保留，并被修飾從而在右側(cè)和左側(cè)t-dna邊界之間包含一多核苷酸序列。卸甲的ti質(zhì)粒仍然能夠在植物基因組dna內(nèi)轉(zhuǎn)化t鏈，但是該t鏈被修飾從而減少或去除了在野生型和毒性t鏈中所見的致癌性質(zhì)。在一個實(shí)施方案中，已被修飾從而重排、突變、缺失、添加、反轉(zhuǎn)或移位了某個多核苷酸序列的野生型和毒性ti質(zhì)粒，在本文中稱為ti質(zhì)粒衍生物。在一個實(shí)施方案中，t-dna區(qū)域已經(jīng)被修飾從而含有至少一種表達(dá)農(nóng)藝性狀的基因表達(dá)盒。此類具有功能性vir基因、且缺乏全部或基本上全部的t區(qū)和相關(guān)元件的ti衍生質(zhì)粒，在本申請中作為一個實(shí)施方案提供。在后續(xù)的實(shí)施方案中，ti質(zhì)粒是ptibo542質(zhì)粒。在一個實(shí)施方案中，ti質(zhì)粒是ptibo542質(zhì)粒的衍生物(hood,e.e.；helmer,g.c.；fraley,r.t.；chilton,m.d.thehypovirulenceofagrobacteriumtumefaciensa281isencodedintheregionofptib0542outsidethet-dna.j.bacteriol.168:1291–1301；1986，在此將其全部援引并入本文)。在后續(xù)的實(shí)施方案中，ti質(zhì)粒是ptic58質(zhì)粒(holstersetal.,thefunctionalorganizationofthenopalinea.tumefaciensplasmidptic58.plasmid3(2)；212-230,1980，在此將其全部援引并入本文)。在一個實(shí)施方案中，ti質(zhì)粒是ptic58質(zhì)粒的衍生物。在后續(xù)的實(shí)施方案中，ti質(zhì)粒是ptiach5質(zhì)粒(gielen,j.；debeuckeleer,m.；seurinck,j.；deboeckf.；degreveh.；lemmers,m.；vanmontagum.；schellj.thecompletenucleotidesequenceofthetl-dnaoftheagrobacteriumtumefaciensplasmidptiach5.theembojournal.3(4):835-846；1984，在此將其全部援引并入本文)。在一個實(shí)施方案中，ti質(zhì)粒是ptiach5質(zhì)粒的衍生物。在后續(xù)的實(shí)施方案中，ti質(zhì)粒是ptichry5質(zhì)粒(kovacsl.g.；pueppkes.g.mappingandgeneticorganizationofptichry5,anoveltiplasmidfromahighlyvirulentagrobacteriumtumefaciensstrain,molgengenet242(3):327-336,1994，在此將其全部援引并入本文)。在一個實(shí)施方案中，ti質(zhì)粒是ptichry5質(zhì)粒的衍生物。在后續(xù)的實(shí)施方案中，ti質(zhì)粒是pti15995質(zhì)粒(barker,r.f.,idler,k.b.,thompson,d.v.andkemp,j.d.nucleotidesequenceofthet-dnaregionfromtheagrobacteriumtumefaciensoctopinetiplasmidpti15955,plantmol.biol.2(6),335-350,1983，在此將其全部援引并入本文)。在一個實(shí)施方案中，ti質(zhì)粒是pti15995質(zhì)粒的衍生物。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，ti質(zhì)粒是pal4404質(zhì)粒的衍生物(vanderfitsetal.,(2000)plantmolec.biol.43:495-502，在此將其全部援引并入本文)。二元質(zhì)粒-在一些實(shí)施方案中，在reca活性中有缺陷的根癌土壤桿菌(lba4404)包含二元載體。在其它實(shí)施方案中，第二質(zhì)粒是二元載體。二元載體的非限制性實(shí)例包括：pbin二元載體(bevanm(1984)binaryagrobacteriumvectorsforplanttransformation.nucleicacidsres12:8711–872,在此將其全部援引并入本文)；pga二元載體(ang(1987)binarytivectorsforplanttransformationandpromoteranalysis.methodsenzymol153:292–305ang,watsonbd,stachels,gordonmp,nesterew(1985)newcloningvehiclesfortransformationofhigherplants.emboj4:277–284,在此將其全部援引并入本文)；sev二元載體(fraleyrt,rogerssg,horschrb,eichholtzda,flickjs,finkcl,hoffmannnl,sanderspr(1985)thesevsystem:anewdisarmedtiplasmidvectorsystemforplanttransformation.biotechnology(ny)3:629–635,在此將其全部援引并入本文)；pend4k二元載體(kleehj,yanofskymf,nesterew(1985)vectorsfortransformationofhigherplants.biotechnology(ny)3:637–642,在此將其全部援引并入本文)；pbi二元載體(jeffersonra,kavanaghta,bevanmw(1987)gusfusions:b-glucuronidaseasasensitiveandversatilegenefusionmarkerinhigherplants.emboj6:3901–3907,在此將其全部援引并入本文)；pcib10二元載體(rothsteinsj,lahnerskn,lotsteinrj,carozzinb,jaynesm,riceda(1987)promotercassettes,antibiotic-resistancegenes,andvectorsforplanttransformation.gene53:153–161,在此將其全部援引并入本文)；pmrk63二元載體(vilainef,casse-delbartf(1987)anewvectorderivedfromagrobacteriumrhizogenesplasmids:amicro-riplasmidanditsusetoconstructamini-riplasmid.gene55:105–114,在此將其全部援引并入本文)；pgptv二元載體(beckerd(1990)binaryvectorswhichallowtheexchangeofplantselectablemarkersandreportergenes.nucleicacidsres18:203,在此將其全部援引并入本文)；pcgn1547二元載體(mcbrideke,summerfeltkr(1990)improvedbinaryvectorsforagrobacterium-mediatedplanttransformation.plantmolbiol14:269–276,在此將其全部援引并入本文)；part二元載體(gleaveap(1992)aversatilebinaryvectorsystemwithat-dnaorganizationalstructureconducivetoefficientintegrationofcloneddnaintotheplantgenome.plantmolbiol20:1203–1207,在此將其全部援引并入本文)；pgkb5二元載體(bouchezd,camilleric,cabochem(1993)abinaryvectorbasedonbastaresistanceforinplantatransformationofarabidopsisthaliana.cracadsciseriiiscivie316:1188–1193,在此將其全部援引并入本文)；pmjd80二元載體(daymjd,ashurstjl,dixonra(1994)plantexpressioncassettesforenhancedtranslationalefficiency.plantmolbiolrep12:347–357,在此將其全部援引并入本文)；pmjd81二元載體(daymjd,ashurstjl,dixonra(1994)plantexpressioncassettesforenhancedtranslationalefficiency.plantmolbiolrep12:347–357,在此將其全部援引并入本文)；ppzp二元載體(hajdukiewiczp,svabz,maligap(1994)thesmall,versatileppzpfamilyofagrobacteriumbinaryvectorsforplanttransformation.plantmolbiol25:989–994,在此將其全部援引并入本文)；pbinplus二元載體(vanengelenfa,molthoffjw,conneraj,napjp,pereiraa,stiekemawj(1995)pbinplus:animprovedplanttransformationvectorbasedonpbin19.transgenicres4:288–290,在此將其全部援引并入本文)；prt100二元載體(uberlackerb,werrw(1996)vectorswithrare-cutterrestrictionenzymesitesforexpressionofopenreadingframesintransgenicplants.molbreed2:293–295,在此將其全部援引并入本文)；pcb二元載體(xiangc,hanp,lutzigeri,wangk,oliverdj(1999)aminibinaryvectorseriesforplanttransformation.plantmolbiol40:711–717,在此將其全部援引并入本文)；pgreen二元載體(hellensrp,edwardsea,leylandnr,beans,mullineauxpm(2000)pgreen:aversatileandflexiblebinarytivectorforagrobacteriummediatedplanttransformation.plantmolbiol42:819–832,在此將其全部援引并入本文)；ppzp-rcs2二元載體(goderisijwm,debollemfc,francoisieja,wouterspfj,broekaertwf,cammuebpa(2002)asetofmodularplanttransformationvectorsallowingflexibleinsertionofuptosixexpressionunits.plantmolbiol50:17–27,在此將其全部援引并入本文)；pmdc二元載體(curtismd,grossniklausu(2003)agatewaycloningvectorsetforhighthroughputfunctionalanalysisofgenesinplanta.plantphysiol133:462–469,在此將其全部援引并入本文)；prcs2二元載體(chungsm,frankmanel,tzfirat(2005)aversatilevectorsystemformultiplegeneexpressioninplants.trendsplantsci10:357–361,在此將其全部援引并入本文)；pearleygate二元載體(earleykw,haagjr,ponteso,opperk,juehnet,songk,pikaardcs(2006)gateway-compatiblevectorsforplantfunctionalgenomicsandproteomics.plantj45:616–629,在此將其全部援引并入本文)；pgwtac二元載體(chenqj,zhouhm,chenj,wangxc(2006)agateway-basedplatformformultigeneplanttransformation.plantmolbiol62:927–936,在此將其全部援引并入本文)；pore二元載體(coutuc,brandlej,brownd,brownk,mikib,simmondsj,hegedusdd(2007)pore:amodularbinaryvectorseriessuitedforbothmonocotanddicotplanttransformation.transgenicres16:771–781,在此將其全部援引并入本文)；psite二元載體(chakrabartyr,banerjeer,chungsm,farmanm,citovskyv,hogenhoutsa,tzfirat,goodinm(2007)psitevectorsforstableintegrationortransientexpressionofautofluorescentproteinfusionsinplants:probingnicotianabenthamiana-virusinteractions.molplantmicrobeinteract20:740–750,在此將其全部援引并入本文)；pmsp二元載體(leely,kononovme,bassunerb,framebr,wangk,gelvinsb(2007)novelplanttransformationvectorscontainingthesuperpromoter.plantphysiol145:1294–1300,在此將其全部援引并入本文)；pcambia二元載體(http://www.cambia.org/daisy/cambia/materials/vectors)；以及pgd二元載體(goodinmm,dietzgenrg,schichnesd,ruzins,jacksonao(2002)pgdvectors:versatiletoolsfortheexpressionofgreenandredfluorescentproteinfusionsinagroinfiltratedplantleaves.plantj31:375–383,在此將其全部援引并入本文)。參見，在此將其全部援引并入本文。二元載體通常含有許多重要特征，例如：t-dna邊界序列、在大腸桿菌和土壤桿菌菌株中都有功能的復(fù)制起點(diǎn)、與由pti/pri噬菌體和/或土壤桿菌基因組所攜帶的其它抗生素抗性相容的抗生素抗性基因、以及其他可提高植物轉(zhuǎn)化效率的特征(例如，過驅(qū)動序列)。二元載體的其他特征對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是已知的，例如參見leeandgelvin(2008)plantphysiology，146；325-332(通過引用并入本文)，其公開了許多上述二元特征質(zhì)粒/載體。三元載體-在一些實(shí)施方案中，在reca活性中有缺陷的根癌土壤桿菌(lba4404)包含三元載體。已經(jīng)描述了一種“三元”(即三質(zhì)粒)載體，其中：來自ptil5955的組成型突變體virgn54d基因的一個拷貝與共存于土壤桿菌菌株lba4404中pbbr1衍生的質(zhì)粒上，所述土壤桿菌菌株lba4404含有卸甲的輔助質(zhì)粒pal4404和攜帶用于植物轉(zhuǎn)化的基因的二元質(zhì)粒。參見vanderfitsetal.,(2000)plantmolec.biol.43:495-502,在此將其全部援引并入本文。三元質(zhì)粒的其他非限制性實(shí)例在歐洲專利申請?zhí)?042602a1和美國專利申請?zhí)?010/0132068a1中有更詳細(xì)的描述，它們記載了這樣的粘粒二元載體和“強(qiáng)化”(booster)質(zhì)粒，它們當(dāng)存在于攜帶ti輔助質(zhì)粒的土壤桿菌細(xì)胞中時，構(gòu)成三元質(zhì)粒系統(tǒng)的進(jìn)一步實(shí)例，在此將上述文獻(xiàn)全部并入本文。最后，國際專利申請?zhí)?012016222a2描述了一種用于土壤桿菌的三元質(zhì)粒系統(tǒng)，在此將其全部援引并入本文。質(zhì)粒-在一些實(shí)施方案中，含有reca基因的質(zhì)粒是本公開的一個實(shí)施方案?；谫|(zhì)粒中含有的序列，將質(zhì)粒歸于不相容組(基因型命名：inc；組命名：inc)。inc決定子通常發(fā)揮以避免相同或有關(guān)的不相容組的其它質(zhì)粒共同存在于相同的宿主中，并且?guī)椭S持該質(zhì)粒在細(xì)胞中的特定拷貝數(shù)的作用。參見，例如fernandez-lopez,etal.(2006)femsmicrobiol.rev.30:942-66；和adamczykandjagura-burdzy(2003)actabiochim.pol.50:425-53。如果兩個質(zhì)粒中的任何一個在存在另一個的情況下比其單獨(dú)存在時更不穩(wěn)定，那么這兩個質(zhì)粒是不相容的。當(dāng)在相同細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)同一不相容組的兩個質(zhì)粒時，可能產(chǎn)生對細(xì)胞資源的競爭。哪個質(zhì)粒能夠更快地復(fù)制或提供一些其它優(yōu)勢，其就會在不相容系統(tǒng)允許的拷貝中以不成比例的程度呈現(xiàn)出來。令人驚訝的是，當(dāng)多個質(zhì)粒都具有相同的將其自身分裂到子細(xì)胞中的功能時，它們也可能是不相容的。質(zhì)粒通常僅落入許多現(xiàn)有的不相容組之一。有超過30種已知的不相容組。人們對屬于不相容組incp的質(zhì)粒已經(jīng)進(jìn)行了透徹的研究，并且已經(jīng)構(gòu)建了大量自該incp組衍生的質(zhì)粒(schmidhauseretal.(1988)biotechnology10:287-332)。含有incp不相容組的示例質(zhì)粒包括：pmp90rk、prk2013、prk290、prk404和prk415。這些質(zhì)粒能夠在眾多細(xì)菌物種，包括大腸桿菌和根癌土壤桿菌中維持。其它不相容組的例子包括但不限于:incn、incw、incl/m、inct、incu、incw、incy、incb/o、incfii、incii、inck、inccom9、incfi、incfii、incfiii、inchil、inchi2、incx、inca/c、incd、incfiv、incfv/fo、incfvi、inchl3、inchii、inc12、inci、incj、incv、incq，等等，包括其變體，例如顯示基本的序列或功能關(guān)系的變體。另外，使用本文中描述的方法用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的合適的載體可以含有選擇標(biāo)志物基因，其編碼的蛋白質(zhì)可賦予轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞對抗生素或除草劑抗性。各別采用的選擇標(biāo)志物基因可以相應(yīng)地允許對轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇，而不含有插入dna的細(xì)胞的生長可能受到該選擇性化合物的抑制。特定的選擇標(biāo)志物基因(一種或多種)的使用可以取決于實(shí)驗(yàn)設(shè)計或偏好，但可以使用以下任一種選擇標(biāo)志物以及任何未在本文中列出但可以充當(dāng)選擇標(biāo)志物的其它基因。選擇標(biāo)志物的例子包括但不限于，提供對抗生素諸如卡那霉素、g418、潮霉素、博來霉素、和甲氨蝶呤的抗性或耐受的基因，或提供對除草劑諸如膦絲菌素(雙丙氨膦(bialaphos))、草甘膦、咪唑啉酮、磺酰脲、三唑嘧啶(triazolopyrimidine)、氯磺隆(chlorosulfuron)、溴草腈(bromoxynil)、和茅草枯(dalapon)的抗性或耐受性的基因。編碼農(nóng)藝性狀的基因表達(dá)盒-在隨后的實(shí)施方案中，選擇植物細(xì)胞從所述細(xì)胞再生植物。在本公開的另外的實(shí)施方案中，t-dna含有編碼農(nóng)藝性狀的基因表達(dá)盒。在另外的實(shí)施方案中，農(nóng)藝性狀產(chǎn)生商業(yè)產(chǎn)品。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及引入插入植物基因組內(nèi)的一種或多種基因表達(dá)盒。在一些實(shí)施方案中，基因表達(dá)盒包含編碼序列。編碼序列可以編碼例如賦予農(nóng)藝性狀的基因。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，農(nóng)藝性狀選自殺蟲抗性性狀，除草劑耐受性狀，氮利用效率性狀，水分利用效率性狀，營養(yǎng)品質(zhì)性狀，dna結(jié)合性狀和選擇標(biāo)志物性狀。在另外的實(shí)施方案中，農(nóng)藝性狀在植物中表達(dá)。本發(fā)明公開的實(shí)施方案包括包含一種或多種農(nóng)藝性狀的植物。在一些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因植物包含基因表達(dá)盒。如本文中使用的用于構(gòu)建基因表達(dá)盒的標(biāo)準(zhǔn)重組dna和分子克隆技術(shù)是本領(lǐng)域公知的，在例如下列文獻(xiàn)中描述：sambrooketal.,molecularcloning:alaboratorymanual,secondedition,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,ny(1989)；和silhavyetal.,experimentswithgenefusions,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,ny(1984)；以及ausubeletal.,currentprotocolsinmolecularbiology，由greenepublishingassoc.和wiley-interscience出版(1987)?；虮磉_(dá)盒中可以使用多種在植物中指導(dǎo)基因表達(dá)的啟動子。這些啟動子可以從組成型、化學(xué)調(diào)節(jié)型、誘導(dǎo)型、組織特異型、和種子優(yōu)選型啟動子中選擇。由于指導(dǎo)核酸表達(dá)的啟動子根據(jù)具體的應(yīng)用而定。例如，適合于宿主細(xì)胞的強(qiáng)組成型啟動子一般用于表達(dá)和純化表達(dá)的蛋白質(zhì)。植物啟動子的非限制性優(yōu)選實(shí)例包括來自如下來源的啟動子序列：擬南芥泛素-10(ubi10)(callis,etal.,1990,j.biol.chem.,265:12486-12493)；根癌土壤桿菌甘露堿合酶(amas)(petolinoetal.，美國專利6,730,824)；和/或木薯葉脈花葉病毒(csvmv)(verdagueretal.,1996,plantmolecularbiology31:1129-1139)。其他組成型啟動子包括，例如，核心花椰菜花葉病毒35s啟動子(odelletal.(1985)nature313:810-812)；水稻肌動蛋白質(zhì)啟動子(mcelroyetal.(1990)plantcell2:163-171)；玉米泛素啟動子(美國專利號5,510,474；christensenetal.(1989)plantmol.biol.12:619-632；及christensenetal.(1992)plantmol.biol.18:675-689)；pemu啟動子(lastetal.(1991)theor.appl.genet.81:581-588)；als啟動子(美國專利號5,659,026)；玉米組蛋白啟動子(chaboutéetal.plantmolecularbiology,8:179-191(1987))等。其他有用的植物啟動子包括組織特異性和誘導(dǎo)型啟動子。誘導(dǎo)型啟動子是能夠響應(yīng)誘導(dǎo)劑而直接或間接激活一種或多種dna序列或基因的轉(zhuǎn)錄的啟動子。在沒有誘導(dǎo)物時，上述dna序列或基因?qū)⒉槐晦D(zhuǎn)錄。通常，特異性結(jié)合誘導(dǎo)型調(diào)控元件從而激活轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)因子以無活性的形式存在，隨后會被誘導(dǎo)劑直接或間接地轉(zhuǎn)化為活性形式。誘導(dǎo)物可以是化學(xué)劑，例如蛋白質(zhì)、代謝物、生長調(diào)節(jié)劑、除草劑或酚類化合物，或由熱、冷、鹽、或有毒元素所直接施加的生理脅迫，或通過病原體或致病劑如病毒而間接施加的生理脅迫。典型地，特異性結(jié)合誘導(dǎo)型調(diào)控元件從而激活轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)因子以無活性的形式存在，隨后會被誘導(dǎo)劑直接或間接地轉(zhuǎn)化為活性形式。可以通過從外部將誘導(dǎo)物施用給細(xì)胞或植物，例如通過噴霧、澆水、加熱或類似的方法，而將含有誘導(dǎo)型調(diào)控元件的植物細(xì)胞暴露于誘導(dǎo)物。在本文的實(shí)施方案中可以使用任何誘導(dǎo)型啟動子。見wardetal.plantmol.biol.22:361366(1993)。誘導(dǎo)型啟動子包括，例如但不限于：蛻皮激素受體啟動子(美國專利號6,504,082)；來自ace1系統(tǒng)的響應(yīng)銅的啟動子(mettetal.,proc.natl.acad.sci.90:4567-4571(1993))；來自玉米的響應(yīng)苯磺酰胺除草劑安全劑的in2-1和in2-2基因(美國專利號5,364,780；hersheyetal.,mol.gen.genetics227:229-237(1991)andgatzetal.,mol.gen.genetics243:32-38(1994))；來自tn10的tet阻遏物(gatzetal.,mol.gen.genet.227:229-237(1991)；或來自類固醇激素基因的啟動子，其轉(zhuǎn)錄活性受到糖皮質(zhì)激素的誘導(dǎo)，schenaetal.,proc.natl.acad.sci.u.s.a.88:10421(1991)和mcnellisetal.,(1998)plantj.14(2):247-257；玉米gst啟動子，其被用作苗前除草劑的疏水親電子化合物激活(參見美國專利no.5,965,387和國際專利申請公開no.wo93/001294)；和煙草pr-1a啟動子，其被水楊酸激活(見onos,kusamam,ogurar,hiratsukak.,“evaluationoftheuseofthetobaccopr-1apromotertomonitordefensegeneexpressionbytheluciferasebioluminescencereportersystem,”bioscibiotechnolbiochem.2011sep23；75(9):1796-800))。其他受化學(xué)調(diào)控的感興趣的啟動子包括四環(huán)素誘導(dǎo)型和四環(huán)素抑制型的啟動子(參見，例如，gatzetal.,(1991)mol.gen.genet.227:229-237，和美國專利號5,814,618及5,789,156)。其它可調(diào)節(jié)的感興趣啟動子包括冷應(yīng)答調(diào)控元件或熱激調(diào)控元件，其轉(zhuǎn)錄分別受到冷或熱暴露的影響(takahashietal.,plantphysiol.99:383-390,1992)；可被厭氧條件誘導(dǎo)的醇脫氫酶基因的啟動子(gerlachetal.,pnasusa79:2981-2985(1982)；walkeretal.,pnas84(19):6624-6628(1987))，來自豌豆rbcs基因或豌豆psadb基因的光誘導(dǎo)型啟動子(yamamotoetal.(1997)plantj.12(2):255-265)；光誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)元件(feinbaumetal.,mol.gen.genet.226:449,1991；lamandchua,science248:471,1990；matsuokaetal.(1993)proc.natl.acad.sci.usa90(20):9586-9590；orozcoetal.(1993)plantmol.bio.23(6):1129-1138)；植物激素誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)元件(yamaguchi-shinozakietal.,plantmol.biol.15:905,1990；karesetal.,plantmol.biol.15:225,1990)，等等。誘導(dǎo)型調(diào)控元件還可以是玉米in2-1或in2-2基因，它們響應(yīng)苯磺酰胺除草劑安全劑(hersheyetal.,mol.gen.gene.227:229-237,1991；gatzetal.,mol.gen.genet.243:32-38,1994),andthetetrepressoroftransposontn10(gatzetal.,mol.gen.genet.227:229-237,1991)。脅迫誘導(dǎo)型啟動子包括鹽/水脅迫誘導(dǎo)型啟動子，如p5cs(zangetal.(1997)plantsciences129:81-89)；冷誘導(dǎo)型啟動子，如cor15a(hajelaetal.(1990)plantphysiol.93:1246-1252)、cor15b(wilhelmetal.,(1993)plantmolbiol23:1073-1077)、wsc1(ouelletetal.,(1998)febslett.423-324-328)、ci7(kirchetal.,(1997)plantmolbiol.33:897-909)、ci21a(schneideretal.,(1997)plantphysiol.113:335-45)；干旱誘導(dǎo)型啟動子，如trg_31(chaudharyetal.(1996)plantmol.biol.30:1247-57)和rd29(kasugaetal.(1999)naturebiotechnology18:287-291)。滲透壓誘導(dǎo)型啟動子，如rab17(vilardelletal.,(1991)plantmol.biol.17:985-93)和滲壓素(osmotin)(raghothamaetal.(1993)plantmolbiol23:1117-28)；以及熱誘導(dǎo)型啟動子，如熱激蛋白(barrosetal.(1992)plantmol.19:665-75；marrsetal.(1993)dev.genet.14:27-41)、smhsp(watersetal.(1996)j.experimentalbotany47:325-338)；和來自歐芹泛素啟動子的熱激誘導(dǎo)型元件(wo03/102198)。其它脅迫誘導(dǎo)型啟動子包括rip2(美國專利號5,332,808和美國公開號no.2003/0217393)和rd29a(yamaguchishinozakietal.(1993)mol.gen.genetics236:331-340)。某些啟動子可以被創(chuàng)傷誘導(dǎo)，包括土壤桿菌屬的pmas啟動子(guevaragarciaetal.(1993)plantj.4(3):495-505)和土壤桿菌orf13啟動子(hansenetal.，(1997)mol.gen-genet.254(3):337-343)。組織優(yōu)選的啟動子可用于在特定植物組織內(nèi)靶向增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄和/或表達(dá)。當(dāng)提到優(yōu)先表達(dá)時，意指在該特定在植物組織中的表達(dá)高于在其他植物組織中的表達(dá)。這些類型啟動子的實(shí)例包括種子優(yōu)選(seed-preferred)的表達(dá)，例如由菜豆蛋白(phaseolin)啟動子(bustosetal.,(1989)theplantcellvol.1,839-853)和玉米球蛋白-1基因(belanger,etal.(1991)genetics129:863-972)提供的種子優(yōu)選表達(dá)。對于雙子葉植物，種子優(yōu)選的啟動子包括，但不限于，菜豆的β-菜豆蛋白(β-phaseolin)、油菜籽蛋白(napin)、β-伴大豆球蛋白(β-conglycinin)、大豆凝集素(soybeanlectin)、十字花科蛋白(cruciferin)，等等。對于單子葉植物，種子優(yōu)選的啟動子包括但不限于：玉米的15kda玉米醇溶蛋白、22kda玉米醇溶蛋白、27kda玉米醇溶蛋白、γ-玉米醇溶蛋白、糯質(zhì)蛋白質(zhì)(waxy)、超甜素(shrunken)1和超甜素2、球蛋白1，等等。種子優(yōu)選的啟動子還包括那些指導(dǎo)基因主要在種子內(nèi)的特定組織中表達(dá)的啟動子，例如，γ-玉米醇溶蛋白的胚乳優(yōu)選的啟動子，來自煙草的隱藏(cryptic)啟動子(fobertetal.,(1994)t-dnataggingofaseedcoat-specificcrypticpromoterintobacco.plantj.4:567-577)，來自玉米的p-基因啟動子(chopraetal.,(1996)allelesofthemaizepgenewithdistincttissuespecificitiesencodemyb-homologousproteinswithc-terminalreplacements.plantcell7:1149-1158,erratuminplantcell.1997,1:109)，來自玉米的球蛋白-1啟動子(belengerandkriz(1991)molecularbasisforallelicpolymorphismofthemaizeglobulin-1gene.genetics129:863-972)，和指導(dǎo)在玉米粒的種皮或果殼上表達(dá)的啟動子，例如果皮特異性谷氨酰胺合成酶啟動子(muhitchetal.,(2002)isolationofapromotersequencefromtheglutaminesynthetase1-2genecapableofconferringtissue-specificgeneexpressionintransgenicmaize.plantscience163:865-872)。除了啟動子之外，基因表達(dá)盒(其可以例如處于載體中)通常還含有轉(zhuǎn)錄單元或表達(dá)盒，其含有用于在宿主細(xì)胞(無論是原核還是真核)內(nèi)表達(dá)核酸所需的全部其它元件。因此，典型的表達(dá)盒含有，例如，與編碼基因產(chǎn)物(例如蛋白質(zhì))的核酸序列可操作連接的啟動子?；虮磉_(dá)盒還可以包括根據(jù)本領(lǐng)域已知方法可操作連接的其他元件：高效進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本多聚腺苷酸化、轉(zhuǎn)錄終止、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、或翻譯終止所需的信號。此外，表達(dá)盒可包含增強(qiáng)子和/或異源剪接信號。提供基因表達(dá)盒的其他成分作為實(shí)施方案。實(shí)例包括選擇標(biāo)志物、靶向序列或調(diào)控序列，轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列如優(yōu)化的轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列(見美國專利號5,510,471)，穩(wěn)定化序列如rb7mar(見thompsonandmyatt,(1997)plantmol.biol.,34:687-692，和國際專利公布號wo9727207)，或前導(dǎo)序列、內(nèi)含子等。植物表達(dá)載體和報告基因的一般描述和實(shí)例可以參見“vectorsforplanttransformation”，錄自methodsinplantmolecularbiologyandbiotechnology,glicketaleds；crcpresspp.89-119(1993)。合適的表達(dá)載體的選擇將取決于宿主和將表達(dá)載體導(dǎo)入宿主內(nèi)的方法。基因表達(dá)盒還會在感興趣的異源核苷酸序列3'端包括在植物中發(fā)揮功能的轉(zhuǎn)錄和翻譯終止區(qū)。終止區(qū)可以是感興趣的dna序列天然具有的，或者可以來自其他的來源。易用的終止區(qū)可以從根癌土壤桿菌的ti質(zhì)粒獲得，例如章魚堿合酶和胭脂堿合酶(nos)終止區(qū)(depickeretal.,mol.andappl.genet.1:561-573(1982)andshawetal.(1984)nucleicacidsresearchvol.12,no.20pp7831-7846(nos))；seealsoguerineauetal.mol.gen.genet.262:141-144(1991)；proudfoot,cell64:671-674(1991)；sanfaconetal.genesdev.5:141-149(1991)；mogenetal.plantcell2:1261-1272(1990)；munroeetal.gene91:151-158(1990)；ballasetal.,nucleicacidsres.17:7891-7903(1989)；joshietal.nucleicacidres.15:9627-9639(1987)?；虮磉_(dá)盒還可以含有5'前導(dǎo)序列。這些前導(dǎo)序列可以發(fā)揮增強(qiáng)翻譯的作用。翻譯前導(dǎo)序列是本領(lǐng)域已知的，并包括例如小核糖核酸病毒(picornavirus)的前導(dǎo)序列、emcv前導(dǎo)序列(腦心肌炎5'非編碼區(qū))，elroy-steinetal.proc.nat.acad.sci.usa86:6126-6130(1989)；馬鈴薯y病毒前導(dǎo)序列，例如，tev前導(dǎo)序列(煙草蝕紋病毒)carringtonandfreedjournalofvirology,64:1590-1597(1990)，mdmv前導(dǎo)序列(玉米矮花葉病毒)，allisonetal.,virology154:9-20(1986)；人免疫球蛋白質(zhì)重鏈結(jié)合蛋白(bip)，macejaketal.nature353:90-94(1991)；來自苜?；ㄈ~病毒的外殼蛋白mrna的非翻譯前導(dǎo)序列(amvrna4)，joblingetal.nature325:622-625(1987)；煙草花葉病毒前導(dǎo)序列(tmv)，gallieetal.(1989)molecularbiologyofrna,237-256；和玉米綠斑駁病毒前導(dǎo)序列l(wèi)ommeletal.,virology81:382-385(1991)。另見della-cioppaetal.,plantphysiology84:965-968(1987)?；虮磉_(dá)盒構(gòu)建體還包含可增強(qiáng)翻譯和/或mrna穩(wěn)定性的序列，例如內(nèi)含子。這種內(nèi)含子的一個實(shí)例是擬南芥組蛋白h3.iii變體的基因ii的第一內(nèi)含子。chaubetetal.,journalofmolecularbiology,225:569-574(1992)。在期望基因表達(dá)盒表達(dá)的基因產(chǎn)物被引導(dǎo)到特定的細(xì)胞器，特別是質(zhì)體、造粉體，或到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，或者分泌在細(xì)胞表面或細(xì)胞外的場合，表達(dá)盒可以進(jìn)一步包括轉(zhuǎn)運(yùn)肽編碼序列。這樣的轉(zhuǎn)運(yùn)肽是本領(lǐng)域公知的，并且包括但不限于：酰基載體蛋白、rubisco的小亞基、植物epsp合酶和向日葵的轉(zhuǎn)運(yùn)肽(美國專利5,510,417)，玉米brittle-1葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(nelsonetal.,plantphysiol117(4):1235-1252(1998)；sullivanetal.,plantcell3(12):1337-48；sullivanetal.,planta(1995)196(3):477-84；sullivanetal.,j.biol.chem.(1992)267(26):18999-9004)等。此外，嵌合的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽是本領(lǐng)域已知的，例如優(yōu)化的轉(zhuǎn)運(yùn)肽(參見美國專利號5,510,471)。其它的如葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽先前已經(jīng)在美國專利號5,717,084；5,728,925中有描述。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將很容易意識到，有許多種選項(xiàng)可用于將產(chǎn)物表達(dá)到特定的細(xì)胞器中。例如，大麥α淀粉酶序列常被用于指導(dǎo)向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的表達(dá)。(rogers,j.biol.chem.260:3731-3738(1985))。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會意識到，使用重組dna技術(shù)能夠提高被轉(zhuǎn)染核酸分子的表達(dá)控制，例如通過操縱宿主細(xì)胞內(nèi)核酸分子的拷貝數(shù)、核酸分子轉(zhuǎn)錄的效率、所得的轉(zhuǎn)錄本翻譯的效率、和翻譯后修飾的效率。此外，可以對啟動子序列進(jìn)行基因工程改造，使其與天然啟動子相比表達(dá)水平提高?？捎糜诳刂坪怂岱肿颖磉_(dá)的重組技術(shù)包括，但不限于，將核酸分子穩(wěn)定整合到一個或多個宿主細(xì)胞染色體中，向質(zhì)粒添加載體穩(wěn)定性序列，替換或修飾轉(zhuǎn)錄控制信號(例如啟動子、操縱基因、增強(qiáng)子)，替換或修飾翻譯控制信號(例如，核糖體結(jié)合位點(diǎn)、shine-dalgarno或kozak序列)，修飾核酸分子使其與宿主細(xì)胞的密碼子利用率對應(yīng)、和刪除導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄物不穩(wěn)定的序列。轉(zhuǎn)化載體中可以包含用于篩選被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或組織或植物部分或植物的報告基因或標(biāo)志物基因。選擇標(biāo)志物的實(shí)例包括那些可賦予針對抗代謝物(例如除草劑或抗生素)的耐受性的標(biāo)志物，例如：二氫葉酸還原酶，其賦予對氨甲喋呤的抗性(reiss,plantphysiol.(lifesci.adv.)13:143-149,1994；另見herreraestrellaetal.,nature303:209-213,1983；meijeretal.,plantmol.biol.16:807-820,1991)；新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，其賦予對氨基糖苷類新霉素、卡那霉素和巴龍霉素的抗性(herrera-estrella,emboj.2:987-995,1983和fraleyetal.,proc.natl.acad.sciusa80:4803(1983))；和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，其賦予潮霉素抗性(marsh,gene32:481-485,(1984)；另見waldronetal.,plantmol.biol.5:103-108,(1985)；zhijianetal.,plantscience108:219-227,(1995))；trpb，其允許細(xì)胞利用吲哚代替色氨酸；hisd，其允許細(xì)胞利用組氨醇代替組氨酸(hartman,proc.natl.acad.sci.,usa85:8047,(1988))；甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶，其允許細(xì)胞利用甘露糖(國際專利申請?zhí)杦o94/20627)；鳥氨酸脫羧酶，其賦予對鳥氨酸脫羧酶抑制劑2-(二氟甲基)-dl-鳥氨酸的抗性(dfmo；mcconlogue，1987，錄自：currentcommunicationsinmolecularbiology,coldspringharborlaboratoryed.)；和來自土曲霉的脫氨酶，其賦予對稻痕菌素s的抗性(tamura,biosci.biotechnol.biochem.59:2336-2338,(1995))。其它的選擇標(biāo)志物包括，例如，突變體乙酰乳酸合酶，其賦予咪唑啉酮或磺酰脲抗性(leeetal.,emboj.7:1241-1248,(1988))，突變體psba，其賦予阿特拉津(atrazine)抗性(smedaetal.,plantphysiol.103:911-917,(1993))，或突變體原卟啉原氧化酶(見美國專利no.5,767,373)，其它賦予對除草劑(例如草胺膦)抗性的標(biāo)志物。合適的選擇標(biāo)志物基因的實(shí)例包括，但不限于，編碼氯霉素抗性(herreraestrellaetal.,emboj.2:987-992,(1983))；鏈霉素抗性(jonesetal.,mol.gen.genet.210:86-91,(1987))；壯觀霉素抗性(bretagne-sagnardetal.,transgenicres.5:131-137,(1996))；博來霉素抗性(hilleetal.,plantmol.biol.7:171-176,(1990))；磺酰胺抗性(guerineauetal.,plantmol.biol.15:127-136,(1990))；溴苯腈抗性(stalkeretal.，science242:419-423,1988)；草甘膦抗性(shawetal.,science233:478-481,(1986))；膦絲菌素(phosphinothricin)抗性(deblocketal.,emboj.6:2513-2518,(1987))，等的基因。供選擇基因使用的一個選項(xiàng)是編碼草胺膦抗性的dna，并且在一個實(shí)施方案中，可以是處于木薯葉脈花葉病病毒啟動子控制之下的草銨膦乙酰轉(zhuǎn)移酶(pat)、玉米優(yōu)化的pat基因或bar基因這些基因賦予對雙丙氨膦(bioalaphos)的抗性。見(見wohllebenetal.,(1988)gene70:25-37)；gordon-kammetal.,plantcell2:603；1990；uchimiyaetal.,biotechnology11:835,1993；whiteetal.,nucl.acidsres.18:1062,1990；spenceretal.,theor.appl.genet.79:625-631,1990；andanzaietal.,mol.gen.gen.219:492,1989)。pat基因的一個版本是玉米優(yōu)化的pat基因，其在美國專利no.6,096,947中有描述。此外，可以使用這樣的標(biāo)志物，其有助于鑒定含有編碼該標(biāo)志物的多核苷酸的植物細(xì)胞。當(dāng)序列的存在產(chǎn)生可測量的產(chǎn)物，并且能夠產(chǎn)生產(chǎn)物而不會破壞植物細(xì)胞時，可以使用可評分的(scorable)或可篩選的(screenable)標(biāo)志物。實(shí)例包括β-葡糖醛酸酶或uida基因(gus)，其編碼一種酶，該酶有多種發(fā)色底物是已知的(例如，美國專利5,268,463和5,599,670)；氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(jeffersonetal.theembojournalvol.6no.13pp.3901-3907)；和堿性磷酸酶。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所用的標(biāo)志物是β-胡蘿卜素或維生素原a(yeetal.,science287:303-305(2000))。該基因已被用于提高稻米的營養(yǎng)，但在這里是使用它作為可篩選標(biāo)志物，利用所提供的金黃色來檢測與感興趣基因連鎖的該基因的存在。與使用該基因?yàn)橹参镓暙I(xiàn)營養(yǎng)的情況不同的是，更小量的蛋白質(zhì)足以實(shí)現(xiàn)該目的。其它可篩選標(biāo)志物包括一般的花青素/類黃酮的基因(見taylorandbriggs,theplantcell(1990)2:115-127中所討論的)，包括例如，r-座位基因，其編碼的產(chǎn)物可以調(diào)節(jié)植物組織中花青素色素(紅色)的產(chǎn)生(dellaportaetal.,錄自chromosomestructureandfunction,kluweracademicpublishers,appelsandgustafsoneds.,pp.263-282(1988))；控制類黃酮色素生物合成的基因，如玉米c1基因(kaoetal·,plantcell(1996)8:1171-1179；scheffleretal·,mol.gen.genet.(1994)242:40-48)和玉米c2基因(wienandetal·,mol.gen.genet.(1986)203:202-207)；b基因(chandleretal·,plantcell(1989)1:1175-1183)，p1基因(grotewoldetal.,proc.natl.acad.sciusa(1991)88:4587-4591；grotewoldetal.,cell(1994)76:543-553；sidorenkoetal.,plantmol.biol.(1999)39:11-19)；青銅色(bronze)座位基因(ralstonetal.,genetics(1988)119:185-197；nashetal.,plantcell(1990)2(11):1039-1049)，等等。合適標(biāo)志物的其他實(shí)例包括青色熒光蛋白質(zhì)(cyp)基因(bolteetal.,(2004)j.cellscience117:943-54和katoetal.,(2002)plantphysiol129:913-42)，黃色熒光蛋白質(zhì)基因(來自evrogen的phiyfptm；見bolteetal.,(2004)j.cellscience117:943-54)；lux基因，其編碼一種熒光素酶，該熒光素酶的存在可以通過使用，例如，x射線膠片、閃爍計數(shù)、熒光光度法、低光度攝像機(jī)、光子計數(shù)攝像機(jī)或多孔發(fā)光法等進(jìn)行檢測(teerietal.(1989)emboj.8:343)；綠色熒光蛋白質(zhì)(gfp)基因(sheenetal.,plantj.(1995)8(5):777-84)；和dsred2，用該標(biāo)志物基因轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞呈紅色，因此可以通過目測選擇(dietrichetal.,(2002)biotechniques2(2):286-293)。其它的實(shí)例包括β-內(nèi)酰胺酶基因(sutcliffe,proc.nat'l.acad.sci.u.s.a.(1978)75:3737)，其編碼各種發(fā)色底物已知的酶(例如padac，一種發(fā)色頭孢菌素)；xyle基因(zukowskyetal.,proc.nat'l.acad.sci.u.s.a.(1983)80:1101)，其編碼鄰苯二酚雙加氧酶，該酶能夠轉(zhuǎn)化發(fā)色兒茶酸；α-淀粉酶基因(ikutaetal.,biotech.(1990)8:241)；和酪氨酸酶基因(katzetal.,j.gen.microbiol.(1983)129:2703)，其編碼的酶能夠?qū)⒗野彼嵫趸蒬opa和多巴醌，后者進(jìn)一步縮合形成容易檢測的化合物黑色素。顯然，許多這樣的標(biāo)志物是本領(lǐng)域技術(shù)人員可用并且知曉的。在某些實(shí)施方案中，編碼表達(dá)盒中的基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因的核苷酸序列可以任選地與盒和/或植物中的另一個感興趣的核苷酸序列組合。例如，在某些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因可以與提供對草甘膦或另一種除草劑的額外抗性或耐受性，和/或提供對選擇的昆蟲或疾病和/或營養(yǎng)增強(qiáng)的抗性，以及/或改良的農(nóng)藝特征，和/或可用于飼料，食品，工業(yè)，制藥或其它用途的蛋白質(zhì)或其它產(chǎn)品的另一核苷酸序列組合或“堆疊”。在植物基因組內(nèi)的兩個或多個感興趣的核酸序列的“堆疊”可以例如通過使用兩個或更多個事件的常規(guī)植物育種，用含有感興趣序列的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物，轉(zhuǎn)基因植物的再轉(zhuǎn)化，或通過同源重組整合來添加新的性狀來完成。此類感興趣的核苷酸序列包括，但不限于，那些賦予(1)對害蟲或疾病的抗性；(2)對除草劑的抗性；和(3)如下所述的增值性狀的基因或編碼序列實(shí)例：賦予害蟲或疾病抗性的基因或編碼序列(例如irna)(a)植物疾病抗性基因。植物防御經(jīng)常通過植物中疾病抗性基因(r)的產(chǎn)物與病原體中相應(yīng)的無毒性(avr)基因的產(chǎn)物的特異相互作用而被激活?？梢杂每寺〉目剐曰蜣D(zhuǎn)化植物品種，從而工程構(gòu)建對特定病原體株有抗性的植物。這些基因的實(shí)例包括：提供黃枝孢霉(cladosporiumfulvum)抗性的番茄cf-9基因(jonesetal.,1994science266:789)；，提供丁香假單胞桿菌番茄致病變種抗性的番茄pto基因，其編碼一種蛋白激酶(martinetal.,1993science262:1432)，和提供丁香假單胞菌抗性的擬南芥rssp2基因(mindrinosetal.,1994cell78:1089)。(b)蘇云金芽孢桿菌蛋白質(zhì)、其衍生物或以其為模本的人造多肽，例如btδ-內(nèi)毒素基因的多核苷酸序列(geiseretal.,1986gene48:109)和植物殺蟲(vip)基因(見，例如，estruchetal.(1996)proc.natl.acad.sci.93:5389-94)。此外，編碼δ-內(nèi)毒素基因的dna分子可以從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(rockville,md.)購得，atcc登錄號為40098，67136，31995和31998。(c)植物凝集素，例如，多種君子蘭(cliviaminiata)甘露糖結(jié)合性植物凝集素基因的核苷酸序列(vandammeetal.,1994plantmolec.biol.24:825)。(d)維生素結(jié)合蛋白質(zhì)，例如親和素及親和素同源物，其可用作針對昆蟲類害蟲的殺幼蟲劑。見美國專利no.5,659,026。(e)酶抑制劑，例如蛋白酶抑制劑或淀粉酶抑制劑。這些基因的實(shí)例包括水稻半胱氨酸蛋白質(zhì)酶抑制劑(abeetal.,1987j.biol.chem.262:16793)，煙草蛋白酶抑制劑i(huubetal.,1993plantmolec.biol.21:985)，和α-淀粉酶抑制劑(sumitanietal.,1993biosci.biotech.biochem.57:1243)。(f)昆蟲特異性激素或信息素，例如蛻皮激素和保幼激素或其變體、基于它們的模擬物，或其拮抗劑或激動劑，例如桿狀病毒表達(dá)的克隆保幼激素酯酶，保幼激素的失活子(hammocketal.,1990nature344:458)。(g)昆蟲特異性肽或神經(jīng)肽，其在表達(dá)時會擾亂受影響的害蟲的生理機(jī)能(j.biol.chem.269:9)。這些基因的實(shí)例包括昆蟲利尿激素受體(regan,1994)，在太平洋折翅蠊(diplopterapunctata)中鑒定的咽側(cè)體抑制素(allostatin)(pratt,1989)，和昆蟲特異性麻痹神經(jīng)毒素(美國專利no.5,266,361)。(h)在自然界中由蛇、馬蜂等產(chǎn)生的昆蟲特異性毒液，例如蝎子昆蟲毒性肽(pang,1992gene116:165)。(i)負(fù)責(zé)超富集單萜、倍半萜、甾體、異羥肟酸、苯丙烷衍生物或其它具有殺蟲活性的非蛋白質(zhì)分子的酶。(j)參與生物活性分子修飾(包括翻譯后修飾)的酶；例如糖酵解酶、蛋白質(zhì)水解酶、脂肪分解酶、核酸酶、環(huán)化酶、轉(zhuǎn)氨酶、酯酶、水解酶、磷酸酶、激酶、磷酸化酶、聚合酶、彈性蛋白酶、幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶，無論是天然的還是人造的。這些基因的實(shí)例包括馬蹄蓮(callas)基因(pct公開的申請wo93/02197)，幾丁質(zhì)酶編碼序列(其可以從例如atcc以登錄號3999637和67152獲得)，煙草鉤蟲幾丁質(zhì)酶(krameretal.,1993insectmolec.biol.23:691)，和歐芹ubi4-2多聚泛素基因(kawallecketal.,1993plantmolec.biol.21:673)。(k)刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子。這些分子的實(shí)例包括綠豆鈣調(diào)蛋白cdna克隆的核苷酸序列(botellaetal.,1994plantmolec.biol.24:757)，和玉米鈣調(diào)蛋白cdna克隆的核苷酸序列(griessetal.,1994plantphysiol.104:1467)。(l)疏水矩肽(hydrophobicmomentpeptide)。見例如美國專利nos.5,659,026和5,607,914，后者教導(dǎo)了賦予疾病抗性的人造抗微生物肽。(m)膜透性酶，通道形成劑或通道阻斷劑，例如殺菌肽-β裂解肽類似物(jaynesetal.,1993plantsci.89:43)，其使轉(zhuǎn)基因煙草植物對青枯病有抗性。(n)病毒侵襲性蛋白質(zhì)或由其衍生的復(fù)雜毒素。例如，在經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中，病毒衣殼蛋白的積累可賦予針對該衣殼蛋白所來源的病毒以及相關(guān)病毒所致的病毒感染和/或疾病發(fā)展的抗性。已經(jīng)給轉(zhuǎn)化植物賦予了衣殼蛋白介導(dǎo)的，針對苜蓿花葉病毒、黃瓜花葉病毒、煙草條紋病毒、馬鈴薯x病毒、馬鈴薯y病毒、煙草蝕紋病毒、煙草脆裂病毒和煙草花葉病毒的抗性。參見，例如，beachyetal.(1990)ann.rev.phytopathol.28:451。(o)昆蟲特異性抗體或由其衍生的免疫毒素。因此，靶向昆蟲腸道關(guān)鍵代謝功能的抗體可以使受影響的酶失活，殺死昆蟲。例如，taylor等人(1994)，在第七屆國際分子植物-微生物相互作用研討會(seventhint'l.symposiumonmolecularplantmicrobeinteractions)上的第497號摘要顯示了轉(zhuǎn)基因煙草中通過產(chǎn)生單鏈抗體片段的酶失活。(p)病毒特異性抗體。見例如tavladorakietal.(1993)nature266:469，其顯示了表達(dá)重組抗體基因的轉(zhuǎn)基因植物被保護(hù)免于病毒攻擊。(q)由病原體或寄生物自然產(chǎn)生的發(fā)育阻滯(developmental-arrestive)蛋白質(zhì)。因此，真菌內(nèi)切α-1,4-d多聚半乳糖醛酸酶通過溶解植物細(xì)胞壁的均聚-α-1,4-d-半乳糖醛酸而促進(jìn)真菌定殖和植物營養(yǎng)素釋放(lambetal.,1992)bio/technology10:1436。toubart等(1992plantj.2:367)描述了豆類內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的編碼基因的克隆和表征。(r)由植物自然產(chǎn)生的發(fā)育阻滯(developmental-arrestive)蛋白質(zhì)，例如大麥核糖體失活基因，其提供了增加的針對真菌疾病的抗性(longemannetal.,1992).bio/technology10:3305。(s)rna干擾，其中用編碼rna分子的dna多核苷酸抑制靶基因的表達(dá)。一個實(shí)施例中的rna分子是部分或完全雙鏈的，其觸發(fā)沉默響應(yīng)，導(dǎo)致dsrna被切割成小的干擾rna，它們隨后被納入到靶向復(fù)合體中，靶向復(fù)合體破壞同源的mrna。見例如fire等人，美國專利6,506,559；graham等人，美國專利6,573,099。賦予除草劑抗性的基因或編碼序列(a)編碼針對抑制生長點(diǎn)或分生組織的除草劑，例如咪唑啉酮類(imidazalinone)、磺酰苯胺類(sulfonanilide)或磺酰脲類除草劑的抗性或耐受性的基因。這類基因的實(shí)例編碼一種突變als酶(leeetal.,1988emboj.7:1241)，其也稱ahal酶(mikietal.,1990theor.appl.genet.80:449)。(b)一種或多種額外的編碼針對草甘膦抗性或耐受性的基因，所述抗性或耐受性是由突變體epsp合酶和aroa基因賦予的，或者是通過一些基因如gat(草甘膦乙酰轉(zhuǎn)移酶)或gox(草甘膦氧化酶)和其它膦酰基化合物，如草胺膦(pat和bar基因，dsm-2)，和芳氧基苯氧基丙酸和環(huán)己二酮(acc酶抑制劑編碼基因)所致的代謝失活而獲得的。見例如美國專利no.4,940,835，其公開了可賦予草甘膦抗性的epsp形式的核苷酸序列。編碼突變體aroa基因的dna分子能夠以atcc登錄號39256獲得，突變體基因的核苷酸序列在美國專利no.4,769,061中公開。歐洲專利申請no.0333033和美國專利no.4,975,374公開了可賦予除草劑如l-草銨膦抗性的谷氨酰胺合酶基因的核苷酸序列。歐洲專利申請no.0242246提供了草銨膦乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的核苷酸序列。degreefetal.(1989)bio/technology7:61中描述了表達(dá)編碼草銨膦乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的嵌合bar基因的轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生。賦予針對芳氧基苯氧基丙酸和環(huán)己二酮如稀禾定和甲禾靈(haloxyfop)的抗性的示例性基因是accl-s1,accl-s2和accl-s3基因，如marshalletal.(1992)theor.appl.genet.83:435所述。(c)編碼針對可抑制光合作用的除草劑例如三嗪(psba和gs+基因)和芐腈(腈水解酶基因)的抗性的基因。przibillaetal.(1991)plantcell3:169描述了使用編碼突變體psba基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化衣藻。在美國專利no.4,810,648中腈水解酶基因的核苷酸序列，含有這些基因的dna分子可以通過atcc登錄號53435、67441和67442獲得。hayesetal.(1992)biochem.j.285:173中描述了編碼谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶的dna的克隆和表達(dá)。(d)編碼針對可結(jié)合羥基苯基丙酮酸二加氧酶(hppd)的除草劑的抗性基因，hppd是催化對-羥基苯基丙酮酸(hpp)轉(zhuǎn)化形成尿黑酸的反應(yīng)的酶。這包括例如異噁唑(歐洲專利418175,歐洲專利470856,歐洲專利487352,歐洲專利527036,歐洲專利560482,歐洲專利682659,美國專利5,424,276)，特別是異噁唑草酮，其是玉米的選擇性除草劑，二酮腈(diketonitrile)(歐洲專利496630,歐洲專利496631)，特別是2-氰基-3-環(huán)丙基-1-(2-so2ch3-4-cf3苯基)丙烷-1,3-二酮和2-氰基-3-環(huán)丙基-1-(2-so2ch3-4-2,3cl2苯基)丙烷-1,3-二酮，三酮類(歐洲專利625505，歐洲專利625508，美國專利5,506,195)，特別是磺草酮、和pyrazolinate等除草劑。在植物中產(chǎn)生過量hppd的基因能夠提供針對這些除草劑的耐受性或抗性，包括例如美國專利nos.6,268,549和6,245,968和美國專利公開no.20030066102中描述的基因。(e)編碼針對苯氧基生長素除草劑，如2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-d)的抗性或耐受性的基因，其也可以賦予針對芳氧基苯氧基丙酸類(aopp)除草劑的抗性或耐受性。這些基因的實(shí)例包括α-酮戊二酸依賴性的雙加氧酶(aad-1)基因，如美國專利no.7,838,733所述。(f)編碼針對苯氧基生長素除草劑如2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-d)的抗性或耐受性的基因，其也可以賦予針對吡啶基氧基生長素除草劑，如氟草煙或綠草定的抗性或耐受性。這些基因的實(shí)例包括α-酮戊二酸依賴性的雙加氧酶(aad-12)基因，如wo2007/053482-a2所述。(g)編碼針對麥草畏的抗性或耐受性的基因(見例如美國專利公開no.20030135879)。(h)編碼針對抑制原卟啉原氧化酶(ppo)的除草劑的抗性或耐受性的基因(見美國專利no.5,767,373)。(i)提供針對可結(jié)合光系統(tǒng)ii反應(yīng)中心(psii)核心蛋白質(zhì)的三嗪除草劑(例如莠去津)和尿素衍生物(如敵草隆)除草劑的抗性或耐受性的基因。見brussianetal.,(1989)emboj.1989,8(4):1237-1245?？少x予或貢獻(xiàn)增值性狀(valueaddedtrait)的基因(a)修飾的脂肪酸代謝，例如通過用反義基因或硬脂酰-acp去飽和酶轉(zhuǎn)化玉米或蕓苔屬植物從而增加植物的硬脂酸含量(knultzonetal.,1992)proc.nat.acad.sci.usa89:2624。(b)降低的植酸含量(1)引入植酸酶編碼基因，如黑曲霉植酸酶基因(vanhartingsveldtetal.,1993gene127:87)，提高植酸降解，向被轉(zhuǎn)化植物添加更多游離磷酸鹽。(2)可引入降低植酸含量的基因。在玉米中，這可以通過，例如，克隆然后重新導(dǎo)入如下所述的單個等位基因的相關(guān)dna來實(shí)現(xiàn)：該單個等位基因?qū)е乱灾菜崴降蜑樘卣鞯挠衩淄蛔凅w的原因(raboyetal.,1990maydica35:383)。(c)改良的碳水化合物組成，例如通過用編碼改變淀粉的分支模式的酶的基因轉(zhuǎn)化植物而實(shí)現(xiàn)。這些酶的實(shí)例包括，粘液鏈球菌(streptococcusmucus)果糖基轉(zhuǎn)移酶基因(shirozaetal.,1988)j.bacteriol.170:810，枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(steinmetzetal.,1985mol.gen.genel.200:220)，地衣芽孢桿菌α-淀粉酶(penetal.,1992bio/technology10:292)，番茄轉(zhuǎn)化酶基因(elliotetal.,1993),大麥淀粉酶基因(sogaardetal.,1993j.biol.chem.268:22480)，和玉米胚乳淀粉分支酶ii(fisheretal.,1993plantphysiol.102:10450)。商業(yè)產(chǎn)品-在本發(fā)明的另外的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生商業(yè)產(chǎn)品。在一個實(shí)施方案中，商業(yè)產(chǎn)品選自蛋白質(zhì)濃縮物，蛋白質(zhì)分離物，谷物，粗粉或粕(meal)，面粉，油或纖維。商業(yè)產(chǎn)品是指任何由源自植物或植物種子的材料組成、并被出售給消費(fèi)者的產(chǎn)品。作物植物是消費(fèi)的蛋白質(zhì)，碳水化合物和植物油的最大來源。轉(zhuǎn)基因植物可用于制造商業(yè)產(chǎn)品。植物和/或植物種子可以加工成粗粉或粕、面粉或油，以及用作陸生動物和水生動物的動物飼料中的蛋白質(zhì)或油源。大豆和大豆油可用于制造許多不同的產(chǎn)品，但不限于，全種子或加工種子、動物飼料、植物油、膳食、面粉、無毒塑料、印刷油墨、潤滑劑、蠟、液壓油、電力變壓器流體、溶劑、化妝品、護(hù)發(fā)產(chǎn)品、納豆，天貝，蛋白質(zhì)濃縮物，蛋白質(zhì)分離物，組織化蛋白質(zhì)(texturedprotein)和水解蛋白質(zhì)，以及生物柴油。植物分類-在另外的實(shí)施方案中，本公開涉及轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物選自雙子葉植物或單子葉植物。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本公開涉及可消費(fèi)植物，包括作物植物以及油用、蛋白質(zhì)用或糖用植物。因此，可以選擇任何植物物種或植物細(xì)胞，如下文進(jìn)一步描述的那樣。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本公開的遺傳修飾的植物(例如，植物宿主細(xì)胞)包括但不限于任何高等植物，包括雙子葉植物和單子葉植物，特別是可消費(fèi)植物，包括作物植物。這樣的植物可以包括但不限于例如：苜蓿，大豆，棉花，油菜(也稱為卡諾拉油菜)，亞麻，玉米，稻，臂形草(brachiaria)，小麥，紅花，高粱，糖用甜菜，向日葵，煙草和草坪草。因此，可以選擇任何植物物種或植物細(xì)胞。在實(shí)施方案中，本文使用的植物細(xì)胞和從其生長或衍生的植物包括但不限于可從油菜籽(brassicanapus)；印度芥(brassicajuncea)；埃塞俄比亞芥(brassicacarinata)；蘿卜(brassicarapa)；卷心菜(brassicaoleracea)；大豆(glycinemax)；亞麻(linumusitatissimum)；玉米(也稱玉蜀黍)(zeamays)；紅花(carthamustinctorius)；向日葵(helianthusannuus)；煙草(nicotianatabacum)；擬南芥；巴西堅(jiān)果(betholettiaexcelsa)；蓖麻(ricinuscommunis)；椰子(cocusnucifera)；香菜(coriandrumsativum)；棉花(gossypiumspp.)；花生(arachishypogaea)；霍霍巴(simmondsiachinensis)；油棕(elaeisguineeis)；橄欖(oleaeurpaea)；水稻(oryzasativa)；南瓜(cucurbitamaxima)；大麥(hordeumvulgare)；甘蔗(saccharumofficinarum)；水稻(oryzasativa)；小麥(triticumspp.，包括硬粒小麥(triticumdurum)和(triticumaestivum)；和浮萍(lemnaceaesp.)獲得的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，植物物種內(nèi)的遺傳背景可以變化。引入植物細(xì)胞的核酸可用于在基本上任何植物上賦予所需的性狀。可以使用本公開的基因表達(dá)構(gòu)建體和上述各種轉(zhuǎn)化方法工程改造各種植物和植物細(xì)胞系統(tǒng)以實(shí)現(xiàn)用于本文所述的所需生理和農(nóng)藝特征。在實(shí)施方案中，用于工程改造的目標(biāo)植物和植物細(xì)胞包括但不限于單子葉植物和雙子葉植物，例如包括谷類作物(例如小麥，玉米，水稻，小米，大麥)的作物，水果作物(例如番茄蘋果，梨，草莓，橙子)，飼料作物(如苜蓿)，根用蔬菜作物(如胡蘿卜，馬鈴薯，甜菜，山藥)，綠葉蔬菜類作物(如萵苣，菠菜)；開花植物(例如矮牽牛，玫瑰，菊花)，針葉樹和松樹(例如松杉，云杉)；用于植物修復(fù)的植物(例如，重金屬積聚植物)；油料作物(例如向日葵，油菜籽)和用于實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡闹参?例如，擬南芥)。因此，所公開的方法和組合物已經(jīng)在廣泛的植物上使用，包括但不限于來自天門冬屬(asparagus)、燕麥屬(avena)、臂形草屬(brachiaria)、蕓苔屬(brassica)、柑桔屬(citrus)、西瓜屬(citrullus)、辣椒屬(capsicum)、南瓜屬(cucurbita)、胡蘿卜屬(daucus)、飛蓬屬(erigeron)、大豆屬(glycine)、棉屬(gossypium)、大麥屬(hordeum)、萵苣屬(lactuca)、黑麥草屬(lolium)、番茄屬(lycopersicon)、蘋果屬(malus)、木薯屬(manihot)、煙草屬(nicotiana)、諸葛菜屬(orychophragmus)、稻屬(oryza)、鱷梨屬(persea)、菜豆屬(phaseolus)、豌豆屬(pisum)、梨屬(pyrus)、李屬(prunus)、蘿卜屬(raphanus)、黑麥屬(secale)、茄屬(solanum)、高粱屬(sorghum)、小麥屬(triticum)、葡萄屬(vitis)、豇豆屬(vigna)和玉蜀黍(zeamays)。在本公開的進(jìn)一步方面，本文公開的系統(tǒng)，組合物和方法涉及轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞。在其他實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞通過使植物細(xì)胞與缺乏reca活性的根癌土壤桿菌(lba4404)菌株接觸而產(chǎn)生。體外測定-在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于評估根癌土壤桿菌(lba4404)菌株內(nèi)的reca活性的體外測定。各種體外測定法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。下面進(jìn)一步描述幾個示例性方法。已經(jīng)描述了分子信標(biāo)(molecularbeacon)在序列檢測中使用。簡言之，設(shè)計與側(cè)翼基因組和插入dna接合部重疊的fret寡核苷酸探針。fret探針的獨(dú)特結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其含有使熒光和淬滅模塊保持極其接近的二級結(jié)構(gòu)。在存在熱穩(wěn)定性聚合酶和dntp的情況中循環(huán)fret探針和pcr引物(在插入dna序列中的一條引物和在側(cè)翼基因組序列中的一條)。在成功的pcr擴(kuò)增后，fret探針與靶序列的雜交導(dǎo)致探針二級結(jié)構(gòu)的去除和熒光模塊與淬滅模塊的空間分離。由于成功擴(kuò)增和雜交，熒光信號指示側(cè)翼基因組/轉(zhuǎn)基因插入序列的存在。此類用于檢測擴(kuò)增反應(yīng)的分子信標(biāo)測定是本主題公開的一個實(shí)施方案。水解探針測定法，亦稱作(lifetechnologies,fostercity,calif.)，是一種檢測和量化dna序列的存在的方法。簡言之，設(shè)計與基因組側(cè)翼和插入dna接合部重疊的fret寡核苷酸探針。在熱穩(wěn)定性聚合酶和dntp存在下循環(huán)fret探針和pcr引物(一個引物在插入dna序列中，一個在側(cè)翼基因組序列中)。fret探針的雜交導(dǎo)致fret探針上的熒光模塊從淬滅模塊切割并釋放。熒光信號表明由于成功的擴(kuò)增和雜交所致的側(cè)翼/轉(zhuǎn)基因插入序列的存在。此類用于檢測擴(kuò)增反應(yīng)的水解探針測定是本主題公開的一個實(shí)施方案。測定是一種檢測并定量dna序列之存在的方法。簡而言之，使用一種基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)的測定，名為測定系統(tǒng)，來篩選包含整合的基因表達(dá)盒多核苷酸的基因組dna樣品。在本主題公開的實(shí)施中使用的測定可w使用pcr測定混合物，該混合物包含多種引物。在pcr測定混合物中使用的引物可包括至少一種正向引物和至少一種反向引物。正向引物含有對應(yīng)于供體dna多核苷酸的特定區(qū)域的序列，而反向引物含有對應(yīng)于基因組序列的特定區(qū)域的序列。此外，在pcr測定混合物中使用的引物可以包括至少一種正向引物和至少一種反向引物。例如，pcr測定混合物可以使用對應(yīng)于兩個不同等位基因的兩種正向引物以及一種反向引物。其中一種正向引物含有對應(yīng)于內(nèi)源性基因組序列的特定區(qū)域的序列。第二種正向引物含有對應(yīng)于供體dna多核苷酸的特定區(qū)域的序列。反向引物含有對應(yīng)于基因組序列的特定區(qū)域的序列。這樣的用于檢測擴(kuò)增反應(yīng)的測定法是本公開的實(shí)施方案。在一些實(shí)施方案中，熒光信號或熒光染料選自下組：hex熒光染料，fam熒光染料，joe熒光染料，tet熒光染料，cy3熒光染料，cy3.5熒光染料cy5熒光染料，cy5.5熒光染料，cy7熒光染料，和rox熒光染料。在其它實(shí)施方案中，使用合適的第二熒光dna染料進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，所述第二熒光dna染料能夠以可通過流式細(xì)胞術(shù)檢測的濃度范圍染色細(xì)胞dna，并且具有可由實(shí)時熱循環(huán)儀檢測的熒光發(fā)射光譜。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，其他核酸染料是已知的并且不斷被鑒定?？梢允褂萌魏尉哂羞m當(dāng)激發(fā)和發(fā)射光譜的合適的核酸染料，例如sytoxsybrgreen和在一個實(shí)施方案中，第二種熒光dna染料是以小于10μm，小于4μm或小于2.7μm使用。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可以利用下一代測序(ngs)確認(rèn)基因組修飾。如brautigma等人，2010所述，dna序列分析可以用于測定分離和擴(kuò)增的片段的核苷酸序列?？梢苑蛛x擴(kuò)增的片段并亞克隆到載體中，并使用鏈終止法(也稱為sanger測序)或染料終止劑測序來測序。此外，可以用下一代測序?qū)U(kuò)增子進(jìn)行測序。ngs技術(shù)不需要亞克隆步驟，并且可以在單個反應(yīng)中完成多個測序讀取。有三種ngs平臺已商品化：來自454lifesciences/roche的genomesequencerflxtm，來自solexa的illuminagenomesequencer和appliedbiosystems的solidtm(首字母縮寫詞，代表：“寡聚物連接和檢測測序(sequencingbyoligoligationanddetection)”)。此外，目前正在開發(fā)兩種單分子測序方法。這些包括來自helicosbiosciencetm的真實(shí)單分子測序(tsms)和來自pacificbiosciences的singlemoleculerealtimetm(單分子實(shí)時)(smrt)測序。由454lifesciences/roche推出的genomesequencerflxtm是長讀段ngs，其使用乳液pcr和焦磷酸測序來生成測序讀段?？梢允褂?00-800bp的dna片段或含有3-20kbp片段的文庫。反應(yīng)每次運(yùn)行可以生成超過100萬個約250至400個堿基的讀段，總產(chǎn)量為250至400兆堿基。與其它ngs技術(shù)相比，此技術(shù)生成的讀段最長，但每次運(yùn)行的總序列輸出較低。由solexatm推出的illuminagenomeanalysertm是一種短讀段ngs，其利用熒光染料標(biāo)記的可逆終止劑核苷酸邊合成邊測序，并且以固相橋式pcr為基礎(chǔ)?？梢允褂煤懈哌_(dá)10kb的dna片段的配對末端測序文庫的構(gòu)建。反應(yīng)生成長度為35-76個堿基的超過1億個短讀段。此數(shù)據(jù)可以每次運(yùn)行生成3-6千兆堿基。由appliedbiosystemstm推出的寡聚物連接和檢測測序(solid)系統(tǒng)是一種短讀段技術(shù)。此ngs技術(shù)使用長度最多可達(dá)10kbp的片段化雙鏈dna。該系統(tǒng)使用通過染料標(biāo)記的寡核苷酸引物的連接和乳液pcr測序以生成10億個短讀段，其導(dǎo)致每次運(yùn)行高達(dá)30千兆堿基的總序列輸出。helicosbiosciencetm的tsms和pacificbiosciencestm的smrt應(yīng)用使用單個dna分子進(jìn)行序列反應(yīng)的不同方法。tsmshelicostm系統(tǒng)生成高達(dá)8億個短讀段，每次運(yùn)行導(dǎo)致21千兆堿基。這些反應(yīng)使用熒光染料標(biāo)記的虛擬終止劑核苷酸完成，其被描述為“邊合成邊測序”方法。由pacificbiosciencestm上市的smrt下一代測序系統(tǒng)使用通過合成的實(shí)時測序。由于不受可逆終止劑限制，此技術(shù)可以生成長度高達(dá)1,000bp的讀段。使用此技術(shù)每天可以生成相當(dāng)于二倍體人類基因組的一倍覆蓋度的原始讀取通量。在另一個實(shí)施方案中，可以使用印跡法測定法完成基因組修飾的確認(rèn)，包括western印跡，northern印跡和southern印跡。此類印跡法測定法是用于生物樣品的鑒定和量化的生物研究中常用的技術(shù)。這些測定法包括首先通過電泳手段分離凝膠中的樣品組分，接著將電泳分離的組分從凝膠轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)移膜，諸如用硝化纖維，聚偏二氟乙烯(pvdf)或尼龍的材料制成的轉(zhuǎn)移膜。分析物也可以直接點(diǎn)樣在這些支持物上，或通過施加真空，毛細(xì)管作用或壓力而定向到支持物上的特定區(qū)域，而不需要在先分離。然后通常對轉(zhuǎn)移膜進(jìn)行轉(zhuǎn)移后處理，以增強(qiáng)分析物彼此區(qū)分的能力，和通過檢視或通過自動讀取器檢測的能力。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可以使用elisa測定法來完成基因組修飾的確認(rèn)，所述elisa測定法使用固相酶免疫測定法檢測液體樣品或濕樣品中物質(zhì)(通常是抗原)的存在。將來自樣品的抗原附著于平板的表面。然后，將另外的特異性抗體施加在表面上，使得其可以結(jié)合所述抗原。此抗體是與酶連接的，并且在最后的步驟中，添加含有酶底物的物質(zhì)。隨后的反應(yīng)生成可檢測的信號，最常見的是底物中的顏色變化。轉(zhuǎn)化-用本文公開的載體轉(zhuǎn)化根癌土壤桿菌lba(4404)宿主細(xì)胞可以使用本領(lǐng)域已知的任何轉(zhuǎn)化方法實(shí)施，并且細(xì)菌宿主細(xì)胞可以作為完整細(xì)胞或者作為原生質(zhì)體(即，包含細(xì)胞質(zhì))被轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化方法包括穿孔方法，例如，電穿孔，原生質(zhì)體融合，細(xì)菌接合，和二價陽離子處理，例如氯化鈣處理或cacl2/mg2+處理)，以及其它本領(lǐng)域已知的方法。參見，例如morrison,j.bact.,132:349-351(1977)；clark-curtiss&curtiss,methodsinenzymology,101:347-362(wuetal.,eds,1983),sambrooketal.,molecularcloning,alaboratorymanual(2nded.1989)；kriegler,genetransferandexpression:alaboratorymanual(1990)；andcurrentprotocolsinmolecularbiology(ausubeletal.,eds.,1994)).otherknowntransformationmethodsspecificaredescribedatbyguerout-fleury,a.m.,frandsen,n.andstragier,p.(1996)plasmidsforectopicintegrationinbacillussubtilis.gene180(1-2),57-61。整合位點(diǎn)-本公開的實(shí)施方案包括用于鑒定和整合根癌土壤桿菌(lba4404)的基因組基因座內(nèi)的多核苷酸片段的方法。本文提供了reca基因組座位內(nèi)的整合，或reca基因組座位的直接上游或下游的多核苷酸片段內(nèi)的整合。用于整合多聚核苷酸片段的基因組座位如seqidno:11所示。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解，在根癌土壤桿菌的seqidno:11(lba4404)中可以觀察到所公開的基因組多核苷酸序列的等位基因變異。因此，本公開涉及與seqidno:11具有80％，82.5％，85％，87.5％，90％，92.5％，95％，97.5％，99％，99.5％或99.9％的序列同一性的多核苷酸序列。本發(fā)明的其他實(shí)施方案可以包括將含有基因表達(dá)盒的多核苷酸整合入根癌土壤桿菌(lba4404)基因組的reca基因組座位，并且隨后在相同位置整合堆疊第二個多核苷酸。其中，根癌土壤桿菌(lba4404)基因組內(nèi)的基因組位點(diǎn)被用作引入另外的多核苷酸的優(yōu)選基因座。在一個實(shí)施方案中，seqidno:11中的任何位置充當(dāng)中和整合位點(diǎn)供多核苷酸整合到根癌土壤桿菌(lba4404)基因組中。本發(fā)明另外的實(shí)施方案包括將含有基因表達(dá)盒的多核苷酸整合入根癌土壤桿菌(lba4404)基因組的reca基因組座位，并隨后從整合的多核苷酸中去除選擇標(biāo)記表達(dá)盒。其中，用于去除選擇標(biāo)志物表達(dá)盒的方法是雙交換方法，使用cre-lox的切除方法，使用flp-frt的切除方法，或使用red/et試劑盒(genebridges,heidelberg,germany)的切除方法，以及本領(lǐng)域已知的其它切除方法。本公開的其它實(shí)施方案可以包括將多核苷酸整合到根癌土壤桿菌(lba4404)基因組中reca基因組座位處，作為使用外來復(fù)制質(zhì)粒的替代方法。其中，由于存在相似的起源或復(fù)制，不相容群，冗余選擇標(biāo)志物或其他基因元件，一種或多種外來復(fù)制質(zhì)粒是不相容的。其中，由于根癌土壤桿菌(lba4404)限制性修飾系統(tǒng)的特異性，一種或多種外來復(fù)制質(zhì)粒在根癌土壤桿菌(lba4404)中不起作用。其中，一個或多個外來復(fù)制質(zhì)粒不可用、不起作用、或不易于轉(zhuǎn)化在根癌土壤桿菌(lba4404)基因組內(nèi)。本發(fā)明的其他實(shí)施方案可以包括在原核細(xì)胞中增加同源重組效率的方法。依賴于引入的酶介導(dǎo)的同源重組的方法，如λ-red“重組工程化”和類似方法，在數(shù)量有限的細(xì)菌種類中是有用的，尤其是埃希氏菌屬(escherichia)(datsenkoandwanner(2000)procnatlacadsciusa.97:6640-5)和沙門氏菌屬(salmonella)。也可以使用依賴于引入的酶(如噬菌體整合酶、flp/frt或cre/loxp)介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性重組的方法，但它們依賴于靶dna中事先存在的位點(diǎn)的存在(wirthetal(2007)currentopinionsinbiotechnology18,411-419)。體外方法采用病毒或可動因子(mobileelement)，或它們的組分(例如噬菌體、轉(zhuǎn)座子或可動內(nèi)含子)。然而，依賴于宿主介導(dǎo)的同源重組的方法是目前最常使用的染色體dna修飾類型。在宿主介導(dǎo)的同源重組的典型微生物應(yīng)用中，通過單交換整合將具有與染色體有序列同一性的單個區(qū)域的質(zhì)粒整合入染色體，有時稱作坎貝爾式整合(campbell-likeintegration)。在這樣的事件后，在引入的質(zhì)粒上的基因作為染色體的一部分復(fù)制，這可以比質(zhì)粒復(fù)制更迅速。相應(yīng)地，在帶有針對質(zhì)粒攜帶的選擇性標(biāo)志基因的選擇的培養(yǎng)基中生長可為整合提供選擇壓力?？藏悹柺秸夏軌蛲ㄟ^下述方式用于失活染色體基因：將目的基因的內(nèi)部片段置于質(zhì)粒上，使得在整合之后，染色體將不含該基因的全長拷貝。坎貝爾式整合體細(xì)胞的染色體是不穩(wěn)定的，因?yàn)檎系馁|(zhì)粒側(cè)翼是引導(dǎo)該整合的同源序列。這些序列間的進(jìn)一歩同源重組事件導(dǎo)致質(zhì)粒的切除，和染色體逆轉(zhuǎn)為野生型。因?yàn)檫@個原因，可能有必要保持對質(zhì)粒攜帶的選擇性標(biāo)志基因的選擇以保持整合體克隆。對染色體修飾的基本單交換整合方法的改進(jìn)可以包括雙交換同源重組，也稱作等位基因交換，其涉及兩個重組事件。將期望的經(jīng)修飾的等位基因置于質(zhì)粒上，其側(cè)翼是與染色體中靶等位基因側(cè)翼的區(qū)域具有同源性的區(qū)域(“同源臂”)。第一整合事件可以發(fā)生在任一一對同源臂中，導(dǎo)致質(zhì)粒以與坎貝爾式整合相同的方式整合入染色體。在第一交換事件之后，染色體含有能夠引導(dǎo)第二重組事件的兩組可供選擇的同源序列。如果與引導(dǎo)第一事件的相同的序列重組，那么質(zhì)粒會被切除，并且細(xì)胞會回復(fù)成野生型。如果第二重組事件由另ー同源臂引導(dǎo)，質(zhì)粒會被切除，但原有的染色體等位基因會替換為質(zhì)粒上引入的經(jīng)修飾的等位基因；會實(shí)現(xiàn)期望的染色體修飾。與坎貝爾式整合一樣，通常檢測第一重組事件，并且使用通過質(zhì)粒攜帶的選擇性標(biāo)志基因的整合所賦予的選擇優(yōu)勢來分離整合體。在下面的實(shí)施例中進(jìn)一步舉例說明本發(fā)明的實(shí)施方案。應(yīng)當(dāng)理解這些權(quán)利要求僅是為了舉例說明的目的給出的。實(shí)施例實(shí)施例1.根癌土壤桿菌(lba4404)基因組文庫的構(gòu)建和reca+粘?？寺〉姆蛛x構(gòu)建基因組dna文庫以分離和鑒定來自根癌土壤桿菌(lba4404)的先前未表征的reca基因。將來自根癌土壤桿菌(lba4404)的基因組dna用限制酶sau3a1(newenglandbiolabs，ipswich，ma)部分消化，并通過在緩沖液(20mmtris-hcl,ph8.0；10mmedta；和50mmnacl)中的10-40％不連續(xù)蔗糖梯度上離心加以分級。合并含有大小在約20-40kb范圍內(nèi)的基因組dna片段的級分，并連接到寬宿主范圍的粘粒載體pcp13/b(四環(huán)素抗性)(dessauxy,tempéj,farrandsk.1987.geneticanalysisofmannitylopinecatabolisminoctopine-typeagrobacteriumtumefaciensstrain15955.molgengenet.208(1-2):301-8)。該粘粒載體在用于連接反應(yīng)之前用bamhi和堿性磷酸酶處理。使用promega的lambdadna包裝系統(tǒng)(promega，madison，wi)處理連接混合物并轉(zhuǎn)染到大腸桿菌(hb101)中。得到的文庫含有大約5,000個抗四環(huán)素的粘粒轉(zhuǎn)導(dǎo)子，代表了根癌土壤桿菌(lba4404)基因組的大約二十倍覆蓋率。為了分離攜帶根癌土壤桿菌(lba4404)的reca基因的粘?？寺?，從文庫中分離出大腸桿菌(hb101)細(xì)菌菌株，并涂布到含有0.01％甲磺酸甲酯(mms)的luria肉湯平板上。因?yàn)榇竽c桿菌(hb101)是一種reca突變體，因此其對mms敏感，故在培養(yǎng)基上生長的mms抗性菌落被假設(shè)為含有編碼根癌土壤桿菌reca基因(lba4404)(farrandsk,o'morchoesp,mccutchanj.1989.constructionofanagrobacteriumtumefaciensc58recamutant.jbacteriol.171(10):5314-21)。獲得數(shù)百個抗mms的粘?？寺。瑢⑵渲?4個進(jìn)一步純化，并用xhoi進(jìn)行限制酶消化分析。將九個享有共同的xhoi片段子集的菌落交付末端測序，使用下述引物：pcp13/b和pcp13/b右(表1)。在假設(shè)根癌土壤桿菌染色體(lba4404)和根癌土壤桿菌(c58)的經(jīng)測序菌株之間具有同線性的條件下，對各粘粒搜索這樣的接合部序列：該序列預(yù)示reca會位于插入序列的中間。對一種這樣的粘?！猵cp-mmsr2進(jìn)行進(jìn)一步測序確認(rèn)假設(shè)性鑒定的reca基因的存在，以使用如表1中進(jìn)一步描述的引物。實(shí)施例2來自根癌土壤桿菌(lba4404)的reca基因的克隆、表征和序列分析為了構(gòu)建根癌土壤桿菌(lba4404)的reca基因敲除菌株，評估reca基因的位置以確定reca基因的位置是否存在于與其他reca基因分離物相同的基因組背景中，土壤桿菌屬和根瘤菌屬物種(goodnerbetal.,2001.genomesequenceoftheplantpathogenandbiotechnologyagentagrobacteriumtumefaciensc58.science2942323-2328；以及slaterscetal.,2009.genomesequencesofthreeagrobacteriumbiovarshelpelucidatetheevolutionofmulti-chromosomegenomesinbacteria.jbacteriol.191(8):2501-11)。因此，對于來自根癌土壤桿菌(c58)、葡萄土壤桿菌(a.visis)(s4)，放射土壤桿菌(a.radiobactor)(k84)、豆科根瘤菌(rhizobiumleguminosarum)和根瘤菌屬(rhizobiumsp.)ngr234的位于reca的上游和下游的相鄰序列搜索高度保守的序列，以設(shè)計引物(表1中的f-recanei和r-recanei)。這些序列位于reca基因上游和下游約1.5kb處。使用與來自根癌土壤桿菌(lba4404)的包含reca基因的區(qū)域結(jié)合的引物，通過pcr擴(kuò)增這些序列。將得到的3.7kbpcr片段克隆到pwm91質(zhì)粒中以產(chǎn)生一個新質(zhì)粒，標(biāo)記為pwm-recanei(參見圖1)(metcalfww,jiangw,danielsll,kimsk,haldimanna,wannerbl.1996.conditionallyreplicativeandconjugativeplasmidscarryinglaczalphaforcloning,mutagenesis,andallelereplacementinbacteria.plasmid.35(1):1-13)。將pcr擴(kuò)增的reca基因片段使用如表1所示的recanei引物進(jìn)行測序。測序數(shù)據(jù)鑒定了來自根癌土壤桿菌(lba4404)的reca基因，其如seqidno:10所示。此外，測序數(shù)據(jù)表明來自根瘤土壤桿菌的reca基因含有與其他親緣菌株相同的基因組背景；在下游方向側(cè)翼是alas，在上游方向側(cè)翼是atu1875(含有reca基因及其上游和下游側(cè)翼序列的基因組序列也作為seqidno:11示出)。根癌土壤桿菌(lba4404)的reca基因的序列與來自生物群1土壤桿菌菌株的基因組型1分離株如377，tt111和atcc4720的reca基因的序列幾乎相同。此外，根癌土壤桿菌(lba4404)的reca基因在核酸序列上與基因組型-8株即c58的reca基因(costechareyre等人，2010)享有92％的同一性?？梢员容^根癌土壤桿菌(lba4404)reca基因與其他土壤桿菌菌株和相關(guān)分類群的reca基因相比的總體相關(guān)性，該比較的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示。根癌土壤桿菌(lba4404)reca基因的序列比較結(jié)果表明，根癌土壤桿菌(lba4404)基因組的相當(dāng)多的區(qū)域含有與根癌土壤桿菌(c58)無關(guān)的基因組dna序列。進(jìn)一步的序列比較表明，在土壤桿菌屬密切近緣的生物群1分離株中甚至存在染色體多態(tài)性。實(shí)施例3用卡那霉素或氯霉素抗性盒替代和破壞mms抗性粘粒中的reca基因使用基于噬菌體λ的red重組將抗生素抗性盒引入到pcp-mmsr2上攜帶的根癌土壤桿菌(lba4404)的reca基因中(datsenkoka，wannerbl.2000。one-stepinactivationofchromosomalgenesinescherichiacolik-12usingpcrproducts.procnatlacadsciusa.97(12)：6640-5)。簡言之，使用表1中列出的引物f-reca-frt和r-reca-frt，分別從pkd3和pkd4擴(kuò)增編碼氯霉素和卡那霉素抗生素抗性基因的dna片段。這些擴(kuò)增出的編碼抗生素盒的pcr片段被reca基因上游和下游的43bp序列所側(cè)翼。序列還包括來自reca基因的每個末端的9bp。將所得到的線性pcr擴(kuò)增產(chǎn)物電穿孔到攜帶mms抗性粘粒pcp-mmsr2和pkd20的大腸桿菌(hb101)菌株，以進(jìn)行red介導(dǎo)的重組。質(zhì)粒pkd20提供red重組酶，該質(zhì)粒可以通過在重組后在42℃下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的菌株而加以清除。接下來，通過測試其不能恢復(fù)大腸桿菌(hb101)的mms抗性，并通過使用引物f3-recanei和r2-recanei(表1)分析序列，來證實(shí)粘粒內(nèi)reca基因的破壞。幾種這樣的構(gòu)建體滿足了不能補(bǔ)全大腸桿菌(hb101)中的reca突變的要求。保留每種抗生素抗性類別中的一種，即pcp-mmsrδrecakan和pcp-mmsrδrecacm，用于構(gòu)建根癌土壤桿菌reca敲除菌株(lba4404)。實(shí)施例4用卡那霉素或氯霉素抗性盒替換和破壞根癌土壤桿菌(lba4404)染色體中的reca基因?qū)⑸鲜鰞蓚€reca已被破壞的粘?？寺∞D(zhuǎn)化到根癌土壤桿菌(lba4404)中，以圖將粘粒的破壞reca基因標(biāo)記物交換(marker-change)到根癌土壤桿菌(lba4404)染色體reca基因中。簡單地說，在將reca已被破壞的粘粒電穿孔到根癌土壤桿菌(lba4404)中后，在含有四環(huán)素和卡那霉素或氯霉素的營養(yǎng)瓊脂平板上選擇和純化轉(zhuǎn)化體。接下來，將轉(zhuǎn)化體接種在僅含有卡那霉素或氯霉素的液體培養(yǎng)基中。將這些培養(yǎng)物亞培養(yǎng)3次以提高雙交換事件和粘?？寺G失的可能性。將50微升體積的1000倍稀釋的培養(yǎng)物涂布在含有適當(dāng)抗生素的平板上，挑選約100-200個菌落，通過測試對卡那霉素或氯霉素的抗性以及對四環(huán)素和mms二者的敏感性來篩選雙重交換。將如此得到的候選reca敲除土壤桿菌菌株分離，并標(biāo)記為uia777(cm)和uia770(kan)。通過使用表1中列出的引物的pcr和序列分析進(jìn)一步確認(rèn)分離的reca敲除菌株。構(gòu)建根癌土壤桿菌中reca基因敲除的完整過程如圖1所示。實(shí)施例5根瘤土壤桿菌(lba4404)菌株的reca敲除株的生長特性的表征觀察兩種根癌土壤桿菌(lba4404)敲除reca菌株——uia777和uia770的細(xì)菌生長速率。觀察到，當(dāng)接種到mgl液體培養(yǎng)基中時，與野生型菌株相比，reca敲除菌株顯示出1小時的生長延遲(參見圖3)。進(jìn)一步的觀察結(jié)果表明，在固體營養(yǎng)瓊脂平板上，兩種reca敲除菌株都生長得更慢。例如，觀察到，reca敲除菌株的菌落直徑達(dá)到約1-2mm需要三天以上，而野生型菌株在約兩天內(nèi)生長至相同大小。觀察兩種根癌土壤桿菌(lba4404)敲除reca菌株——uia777和uia770，對甲磺酸甲酯(mms)和紫外(uv)輻照的敏感性。對mms和紫外線輻照的敏感性是細(xì)菌reca敲除菌株的常見特征(farrandsk，o'morchoesp，mccutchanj.1989.constructionofaagrobacteriumtumefaciensc58recamutant.jbacteriol.171(10)：5314-21)。將根癌土壤桿菌(lba4404)reca敲除菌株的過夜培養(yǎng)物稀釋100倍至3mlmgl培養(yǎng)基中，并搖動培養(yǎng)至早穩(wěn)定期。然后將得到的培養(yǎng)物在0.9％nacl中十倍連續(xù)稀釋，并將5-μl樣品點(diǎn)樣到營養(yǎng)瓊脂平板的表面上。對于mms處理，培養(yǎng)基中包含0.01％的mms。對于uv輻照，將板暴露于uv光源(amersham-pharmaciabiotech，pittsburgh，pa)，以通過內(nèi)部uv劑量計測量來提供精確劑量的uv。暴露后立即將板蓋上并在28℃的防光黑盒中孵育24小時。利用培養(yǎng)物在零稀釋時的效價來確定在存在mms的情況下或在暴露于各種劑量的uv輻照后細(xì)胞的存活。如表2所示，與野生型根癌土壤桿菌(lba4404)相比，兩種根癌土壤桿菌(lba4404)reca敲除菌株uia777和uia770對mms和uv輻照都是敏感的。實(shí)施例6reca敲除根癌土壤桿菌(lba4404)菌株的補(bǔ)全質(zhì)粒psom301是pcp13/b的衍生物，含有來自c58的reca基因(farrandsk,o'morchoesp,mccutchanj.1989.constructionofanagrobacteriumtumefaciensc58recamutant.jbacteriol.171(10):5314-21)，測試了psom301補(bǔ)全根癌土壤桿菌(lba4404)reca敲除菌株uia770的緩慢生長、mms及uv敏感性的能力。psom301質(zhì)?；謴?fù)了uia770的生長延遲和小集落表型(圖3)。它還可以將uia770對mms和uv輻照的抗性恢復(fù)到與野生型根癌土壤桿菌(lba4404)所示的水平相似的水平(表2)。實(shí)施例7來自reca敲除的根瘤土壤桿菌(lba4404)菌株的分離質(zhì)粒的表征野生型根癌土壤桿菌(lba4404)菌株攜帶vir輔助質(zhì)粒pal4404(hoekemaa,hirschpr,hooykaaspjjj,schilperoort,1983.abinaryplantvectorstrategybasedonseparationofvirandt-regionoftheagrobacteriumtumefaciensti-plasmid.nature303:179-180)。從reca敲除菌株中分離pal4404輔助質(zhì)粒(即ti質(zhì)粒)。接下來，對該輔助質(zhì)粒進(jìn)行凝膠電泳分析。所得的凝膠分析表明，來自根癌土壤桿菌(lba4404)uia777和uia770菌株的分離的質(zhì)粒均含有以與pal4404相同的遷移率遷移的單個質(zhì)粒。實(shí)施例8來自reca敲除根瘤土壤桿菌(lba4404)菌株三元質(zhì)粒的導(dǎo)入用三元質(zhì)粒(pdab9292)轉(zhuǎn)化兩個根癌土壤桿菌(lba4404)reca敲除菌株uia777和uia770；該質(zhì)粒先前在國際專利申請pct/us2011/046028(通過引用并入本文)中描述。通過分子確認(rèn)測定(即限制酶消化和測序)證實(shí)該三元質(zhì)粒被導(dǎo)入了土壤桿菌菌株中。實(shí)施例9含有重復(fù)基因元件的二元質(zhì)粒在reca敲除根癌土壤桿菌(lba4404)菌株中的穩(wěn)定性測試根癌土壤桿菌(lba4404)reca敲除菌株以評估含有重復(fù)的基因元件的二元質(zhì)粒的穩(wěn)定性。在先前的實(shí)驗(yàn)中觀察到，當(dāng)二元質(zhì)?？寺〉礁┩寥罈U菌(lba4404)中時，二元質(zhì)粒中重復(fù)基因元件的使用將重新排列。該二元質(zhì)粒，pdab108700(seqidno:12)，在圖1中示出。如圖所示，pdab108700含有兩個由相同啟動子驅(qū)動的基因表達(dá)盒。第一個基因表達(dá)盒含有與phi-yellow熒光蛋白(phiypfv3)基因序列連接的玉米泛素-1啟動子(zmubi1啟動子v2)，并以玉米過氧化物酶5'3'utr(zmper53'utrv2)終止。第二個基因表達(dá)盒含有與膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(patv9)基因序列連接的玉米泛素-1啟動子(zmubi1啟動子v2)，并以玉米脂肪酶3'utr(zmlip3'utrv1)終止。將該二元質(zhì)粒，pdab108700，轉(zhuǎn)化到表3的根癌土壤桿菌菌株中。轉(zhuǎn)化后，從每個細(xì)菌菌株的轉(zhuǎn)化中分離出兩個細(xì)菌菌落。讓每個菌落長大，并且通過用一系列限制酶消化(即noti，ecori，fsoi和psti消化)分離二元質(zhì)粒dna用于驗(yàn)證。接下來，從第一實(shí)驗(yàn)選擇一個特定菌落，在固體培養(yǎng)基上劃線。挑選十個在固體培養(yǎng)基上生長的菌落讓其長大。通過一系列限制酶消化(即noti，ecori，fsoi和psti消化物)分離二元質(zhì)粒dna用于另一輪驗(yàn)證。觀察限制酶消化的條帶圖案，看是否產(chǎn)生預(yù)期大小的質(zhì)粒-dna片段。將產(chǎn)生具有異常和預(yù)料之外的大小的質(zhì)粒dna片段的條帶圖案的菌落鑒定為不穩(wěn)定的。將產(chǎn)生具有預(yù)期大小的質(zhì)粒dna片段的條帶圖案的菌落鑒定為穩(wěn)定的。對于每個不同菌株，計算未顯示任何重排的質(zhì)粒的總百分比，結(jié)果示于表3中。實(shí)施例10根癌土壤桿菌(lba4404)reca敲除菌株的植物介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案轉(zhuǎn)化植物物種。使用含有二元質(zhì)粒的兩種根癌土壤桿菌(lba4404)reca敲除菌株uia777和uia770進(jìn)行植物介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。作為轉(zhuǎn)化的結(jié)果，含有選擇標(biāo)志物的基因表達(dá)盒作為t鏈整合到植物染色體內(nèi)的基因組基因座中。t鏈在上游和下游基因組側(cè)翼序列中的整合導(dǎo)致穩(wěn)定整合在轉(zhuǎn)基因植物的基因組內(nèi)的轉(zhuǎn)基因事件?？梢酝ㄟ^利用先前在wo2007/053482的實(shí)施例8中所述的相同技術(shù)，使用含有二元質(zhì)粒的兩種根癌土壤桿菌(lba4404)reca敲除菌株uia777和uia770中的任一種來轉(zhuǎn)化玉米植物。轉(zhuǎn)化的結(jié)果是，含有農(nóng)藝性狀(作為t鏈整合)的基因表達(dá)盒被納入到植物染色體內(nèi)的基因組基因座中?？梢酝ㄟ^利用先前在wo2007/053482的實(shí)施例#11或?qū)嵤├?13中描述的相同技術(shù)，使用含有二元質(zhì)粒的兩種根癌土壤桿菌(lba4404)reca敲除菌株uia777和uia770中的任一種來轉(zhuǎn)化大豆植物。轉(zhuǎn)化的結(jié)果是，含有農(nóng)藝性狀(作為t鏈整合)的基因表達(dá)盒被納入到植物染色體內(nèi)的基因組基因座中。棉花植物可以通過利用先前在專利申請美國專利號7,838,733中的實(shí)施例14、或wo2007/053482(wright等人)的實(shí)施例12中描述過的相同技術(shù)，用兩種根癌土壤桿菌(lba4404)reca敲除菌株uia777和uia770中的任一種進(jìn)行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化的結(jié)果是，含有農(nóng)藝性狀(作為t鏈整合)的基因表達(dá)盒被納入到植物染色體內(nèi)的基因組基因座中?？ㄖZ拉油菜植物可以通過利用先前在美國專利號7,838,733的實(shí)施例26或wo2007/053482的實(shí)施例22(wright等人)中所述的相同技術(shù)，用兩種根癌土壤桿菌(lba4404)reca敲除菌株uia777和uia770中的任一種進(jìn)行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化的結(jié)果是，含有農(nóng)藝性狀(作為t鏈整合)的基因表達(dá)盒被納入到植物染色體內(nèi)的基因組基因座中。對于土壤桿菌介導(dǎo)的黑麥轉(zhuǎn)化，參見例如popelkajc,xuj,altpeterf.,“generationofryewithlowtransgenecopynumberafterbiolisticgenetransferandproductionof(secalecerealel.)plantsinstantlymarker-freetransgenicrye,”transgenicres.2003oct；12(5):587-96.)。對于土壤桿菌介導(dǎo)的高粱轉(zhuǎn)化，參見例如zhaoetal.,“agrobacterium-mediatedsorghumtransformation,”plantmolbiol.2000dec；44(6):789-98。對于土壤桿菌介導(dǎo)的大麥轉(zhuǎn)化，參見例如tingayetal.,“agrobacteriumtumefaciens-mediatedbarleytransformation,”theplantjournal,(1997)11:1369–1376。對于土壤桿菌介導(dǎo)的小麥轉(zhuǎn)化，參見例如chengetal.,“genetictransformationofwheatmediatedbyagrobacteriumtumefaciens,”plantphysiol.1997nov；115(3):971-980。對于土壤桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化，參見例如hieietal.,“transformationofricemediatedbyagrobacteriumtumefaciens,”plantmol.biol.1997sep；35(1-2):205-18。這些和其他植物的拉丁名稱如下。應(yīng)該清楚的是，植物可以用包含二元質(zhì)粒的兩種根癌土壤桿菌(lba4404)reca敲除菌株uia777和uia770中的任一種進(jìn)行轉(zhuǎn)化。因此，兩種根癌土壤桿菌(lba4404)reca敲除菌株uia777和uia770都可以用于將農(nóng)藝性狀轉(zhuǎn)化成這些和其他植物。例子包括但不限于：玉米(zeamays)，小麥(triticumspp.)，稻(oryzaspp.和zizaniaspp.)，大麥(hordeumspp.)，棉花(abromaaugusta和gossypiumspp.)，大豆(glycinemax)，糖用和菜用甜菜(betaspp.)，甘蔗(arengapinnata)，番茄(lycopersiconesculentum)等其他物種，茜草(physalisixocarpa)，黃水茄(solanumincanum)和其他物種以及樹番茄(cyphomandrabetacea)，馬鈴薯(solanumtuberosum)，甘薯(ipomoeabatatas)，黑麥(secalespp.)，辣椒(capsicumannuum，capsicumchinense，和capsicumfrutescens)，萵苣(lactucasativa，lactucaperennis和lactucapulchella)，甘藍(lán)(brassicaspp.)，芹菜(apiumgraveolens)，茄子(solanummelongena)(arachishypogea)，高粱(sorghumspp.)，苜蓿(medicagosativa)，胡蘿卜(juucuscarota)，豆類(phaseolusspp.等)，燕麥(avenasativa和strigosa)，豌豆(pisum，vigna和tetragonolobus(helianthusannuus)，倭瓜(cucurbitaspp.)，黃瓜(cucumissativa)，煙草(nicotianaspp.)，擬南芥(arabidopsisthaliana)，草坪草(lolium，agrostis，poa，cynodon等)，三葉草(trifolium)，蠶豆(vicia)。作為本公開的一個實(shí)施方案，考慮了使用含有二元質(zhì)粒的兩種根癌土壤桿菌(lba4404)reca敲除菌株uia777和uia770中的任一種對上述植物進(jìn)行轉(zhuǎn)化。含有二元質(zhì)粒的兩種根癌土壤桿菌(lba4404)reca敲除菌株uia777和uia770可用于許多落葉和常綠木材種植系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)基因木材物種將增加這些除草劑的超量(over-the-top)使用的靈活性，而不會造成人身傷害。這些物種包括但不限于：白樺(alnusspp.)，梣(fraxinusspp.)，山毛櫸(fagusspp.)，樺樹(betulaspp.)，櫻桃(prunusspp.)，桉樹(eucalyptusspp.)，山核桃(caryaspp.)，楓樹(acerspp.)，橡樹(quercusspp.)和松樹(pinusspp.))。包含用于轉(zhuǎn)化觀賞和含果物種的二元質(zhì)粒的兩種根癌土壤桿菌(lba4404)reca敲除菌株uia777和uia770中的任一種的用途也在本公開的實(shí)施方案的范圍內(nèi)。例子包括但不限于：玫瑰(rosaspp.)，衛(wèi)矛(euonymusspp.)，矮牽牛(petuniaspp.)，秋海棠(begoniaspp.)，杜鵑(rhododendronspp.)，野蘋果或蘋果(malusspp.)，梨(pyrusspp.)，桃(prunusspp.)和萬壽菊(tagetesspp.)。盡管已經(jīng)在某些實(shí)施例中描述了本發(fā)明的各方面，但是可以在本公開的精神和范圍內(nèi)進(jìn)一步修改本發(fā)明。因此，本申請旨在覆蓋使用其一般原理的本發(fā)明的實(shí)施例的任何變化、使用或修改。此外，本申請意圖涵蓋與本公開有所不同，但屬于本發(fā)明所屬領(lǐng)域的已知或慣例實(shí)踐、且屬于所附權(quán)利要求的范圍之物。序列表<110>美國陶氏益農(nóng)公司m·古普塔s·班尼特s·庫馬爾d·默洛n·薩爾德賽<120>用于重組土壤桿菌基因缺陷菌株的方法和組合物<130>14764-240069<150>62/045947<151>2014-09-04<160>32<170>patentinversion3.5<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>用于從根癌土壤桿菌鑒定并分離reca基因的引物<400>1ggcattcttggcatagtggt20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>用于從根癌土壤桿菌鑒定并分離reca基因的引物<400>2gctgaagccagttaccttcg20<210>3<211>34<212>dna<213>人工序列<220><223>用于從根癌土壤桿菌鑒定并分離reca基因的引物<400>3ccggatccccgcgttccagcgtcttgcggaaacg34<210>4<211>36<212>dna<213>人工序列<220><223>用于從根癌土壤桿菌鑒定并分離reca基因的引物<400>4ccggatccggatagggcatgccgtgggtgatgatgg36<210>5<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>用于從根癌土壤桿菌鑒定并分離reca基因的引物<400>5cgttccagcgtcttgcggaaacg23<210>6<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>用于從根癌土壤桿菌鑒定并分離reca基因的引物<400>6ccgtttcagtctcgatcatgc21<210>7<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>用于從根癌土壤桿菌鑒定并分離reca基因的引物<400>7gcattggtgaacatcagtgtcgg23<210>8<211>63<212>dna<213>人工序列<220><223>用于從根癌土壤桿菌鑒定并分離reca基因的引物<400>8ccaccggacgcgaacgcccggaccttcgaatgcatcagccctcgtgtaggctggagctgc60ttc63<210>9<211>63<212>dna<213>人工序列<220><223>用于從根癌土壤桿菌鑒定并分離reca基因的引物<400>9cctgtgcggcttcaataacctaaaggtggatcggatggcacaacatatgaatatcctcct60tag63<210>10<211>1092<212>dna<213>根癌土壤桿菌（agrobacteriumtumefaciens）<400>10atggcacaaaattctttgcgtctcgtagaggataaatcggtggataaaagcaaggcactg60gaagcggcgctctcccagatcgaacggtcgttcggcaagggatcgatcatgaagctcggt120tccaatgaaaacgtggttgaagtagagaccatttcgacgggttctctcagcctggatata180gcgctcggtatcggcggcctgccgaaggggcgtatcgttgagatttacggcccggaaagc240tccggtaagacgacgcttgcgttgcagacgatcgcggaagcccagaaaaagggcggcatc300tgcgccttcgtggatgccgagcacgcgctcgatccggtctatgcccgcaagctcggtgtg360gatttgcagaaccttctgatctcgcagccggatacgggcgagcaggcgcttgaaatcacc420gatacgctggtgcgctccggtgccgtcgacattctggtcgtggactcggttgcggcgctg480acgccgcgtgccgaaatcgaaggcgagatgggtgacagcctgccgggccttcaggcacgt540ctgatgagccaggcgctgcgcaagctgaccgcctcgatctccaagtcgaagtgcatggtg600atcttcatcaaccagatccgcatgaagatcggcgtcatgttcggttcgccggaaacgacg660acgggcggtaatgcgcttaaattctacgcctcggtgcgtctcgacattcgccgtatcggc720gccgtcaaggagcgtgaagaggttgtcggcaaccagacccgcgtcaaggtcgtcaagaac780aagatggcaccgcctttcaagcaggtggaattcgaca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