專利名稱：簡(jiǎn)單脂肪桿菌dm18菌株及其制備d－蘋果酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于有機(jī)酸制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種簡(jiǎn)單脂肪桿菌(簡(jiǎn)單棲油桿菌)(Pimelobacter simplex)DM18菌株制備D-蘋果酸的方法。
背景技術(shù)：
D-蘋果酸(英文名D-malic acid，中文別名羥基丁二酸、羥基琥珀酸)是一種自然界中稀少的有機(jī)酸。D-蘋果酸主要應(yīng)用于手性藥物合成、手性添加劑、手性助劑等領(lǐng)域，如抗生素、藥物信息素、抗病毒藥物、抗癌藥物、HMG-CoA還原酶抑制劑、抗組胺藥、D-和L-肉毒堿、維生素(R)-泛酸等合成，也可作為藥物拆分試劑和不對(duì)稱合成的配體。
D-蘋果酸合成方法主要有化學(xué)拆分法、生物拆分法(或生物降解法)、生物轉(zhuǎn)化法(酶法)等?；瘜W(xué)拆分法成本高，國(guó)內(nèi)進(jìn)行了消旋體蘋果酸的生物拆分研究工作，但D-蘋果酸對(duì)菌體生長(zhǎng)有抑制作用，D-蘋果酸的生產(chǎn)濃度極低。目前還沒有生物轉(zhuǎn)化法制備D-蘋果酸的研究報(bào)道。
從馬來酸制備D-蘋果酸的生物轉(zhuǎn)化方法是最經(jīng)濟(jì)的路線。1993年日本的Asano Y.等(Environ Microbio.1993，591110-1113.)報(bào)道了用Arthrobacter sp.MCI2612菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)、產(chǎn)量為87g/l、摩爾轉(zhuǎn)化率為72％。
1993年荷蘭Van der Warf M.J.等(Appl Environ Microbiol.1993，582854-2860)報(bào)道了Pseudomonas pseudoalcaligenes NCIMB9867。該菌有較高的馬來酸水合酶活力，但誘導(dǎo)劑對(duì)該菌的生長(zhǎng)有強(qiáng)烈的抑制作用，使得該菌株較難培養(yǎng)(OD660＜1.0)(Would JMicrobiol Biotech 1997，13279-282)，而且該菌所產(chǎn)馬來酸水合酶耐鹽性和穩(wěn)定性差(Biocatal Biotransform 1999，17125-137)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的問題是生物轉(zhuǎn)化馬來酸制備D-蘋果酸過程中馬來酸水合酶活性低和穩(wěn)定性差、不耐鹽，而不能高效轉(zhuǎn)化的問題。
本發(fā)明的技術(shù)方案是首先從自然界篩選了產(chǎn)馬來酸水合酶的嗜鹽性或耐鹽性菌種，采用其中一株高活性菌株簡(jiǎn)單脂肪桿菌(Pimelobacter simplex)DM18進(jìn)行如下反應(yīng)。該菌株已送中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號(hào)(CCTCC M 204088)，保藏日期(2004年11月26日)。
本發(fā)明的反應(yīng)路線為 其中，馬來酸鹽為可溶性鹽或難溶性鹽，也可為按一定比例的可溶性性鹽和難溶性鹽的組合?？捎玫目扇苄择R來酸鹽不必加以特別限定，常用的可溶性鹽即可。更具體地說，可以選自鈉鹽、鉀鹽。所指的鹽既可以是所說的鹽，也可用相應(yīng)的酸，加相應(yīng)的堿獲得，例如，馬來酸鈉鹽可以用馬來酸加氫氧化鈉獲得。這樣反應(yīng)產(chǎn)生的D-蘋果酸相應(yīng)的鹽一般具有較好的溶解度。可用難溶性馬來酸鹽不必加以特別限定，常用的難溶性鹽即可。更具體地說，可以選自鈣鹽、鋇鹽。這樣隨著反應(yīng)的進(jìn)行，難溶性馬來酸鹽轉(zhuǎn)化成溶解度底的D-蘋果酸鹽，利于過濾獲得產(chǎn)品。
所說的菌種具有以下特征(一)菌種的來源及分離方法、形態(tài)特征以底物馬來酸的類似物寧康酸Citraconic acid為唯一碳源和能源進(jìn)行篩選，共篩到29株菌，再?gòu)哪艽x和利用寧康酸的菌株中篩選馬來酸水合酶高的菌珠，即分別從馬來酸及寧康酸為底物轉(zhuǎn)化后采用HPLC法分別進(jìn)行D-蘋果酸(D-malic acid)及D-寧蘋酸(Citramalic acid)測(cè)定，選取D-蘋果酸及D-寧蘋酸酸量高的轉(zhuǎn)化菌株。
該菌株為革蘭氏陽性，無芽孢。過氧化物酶試驗(yàn)陽性。同時(shí)該菌株經(jīng)16srDNA(同源性為98.2％)序列分析及脂肪酸指紋分析鑒定，該菌為簡(jiǎn)單脂肪桿菌(簡(jiǎn)單棲油桿菌)(Pimelobacter Simplex)DM18.
(二)菌體的發(fā)酵該菌體在檸康酸為誘導(dǎo)劑的發(fā)酵液中發(fā)酵即可。一般地發(fā)酵液中含有作為誘導(dǎo)劑的檸康酸0.5-10g/L；作為碳源，一般不必特別限定，可用糖類例如葡萄糖，0-10g/L；作為緩沖溶劑，只要能維持發(fā)酵液pH6-10即可，可以選用磷酸二氫鉀5-15g/L；作為無機(jī)氮源可以選用硝酸銨0-5g/L；作為生長(zhǎng)因子的微量元素可選用鎂鹽和/或亞鐵鹽，例如無水硫酸鎂，0-5g/L，七水硫酸亞鐵0-0.5g/L；作為有機(jī)氮可以用酵母膏、蛋白胨、牛肉膏和/或魚粉，添量為0-20g/L；作為有機(jī)氮和碳源可選用玉米漿添加量為0-30g/L；菌種接種量(體積百分比計(jì))一般為0.2-10％，更好為3-6％，在150-300rpm轉(zhuǎn)速攪動(dòng)下，保持溫度在20-40℃，發(fā)酵至水合酶活力被誘導(dǎo)出來，發(fā)酵時(shí)間一般為16-50小時(shí)，發(fā)酵25～38小時(shí)較好。
該菌發(fā)酵后收集菌體，在反應(yīng)液中含1％以下的破壁劑用于后續(xù)反應(yīng)。破壁劑可選用甲苯，SDS(十二烷基磺酸鈉)，CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)等，較好為CTAB，所用濃度可根據(jù)一般使用量確定，較好的使用量為以重量百分計(jì)1-3‰。
其發(fā)酵特點(diǎn)為1、無需大量的碳氮源，一般固體碳氮源的含量0-50g/l.2、用檸康酸作為誘導(dǎo)劑.3、發(fā)酵為好氧發(fā)酵。
所說的反應(yīng)，可以按以下方式進(jìn)行(一)馬來酸可溶性鹽轉(zhuǎn)化成D-蘋果酸采用磷酸或Tris-HCl緩沖液，由收集的菌體制備菌懸液(pH6.0～8.0，pH7.0～7.2更好)，加入一定量的破壁劑和底物-馬來酸可溶性鹽例如鈉鹽、鉀鹽等(以馬來酸計(jì)算濃度為20～120g/L，濃度為60～80g/L更好)，在28～36℃反應(yīng)，30-34℃反應(yīng)更好，可獲得產(chǎn)物D-蘋果酸可溶性鹽。
(二)馬來酸難溶性鹽轉(zhuǎn)化成D-蘋果酸采用磷酸或Tris-HCl緩沖液，由收集的菌體制備菌懸液(pH6.0～8.0，pH7.0～7.2更好)，加入一定量的破壁劑和底物-馬來酸難溶性鹽例如鈣鹽、鋇鹽等(以馬來酸計(jì)算濃度可從100～500g/L)，在28～36℃反應(yīng)，30-34℃反應(yīng)更好，可獲得產(chǎn)物D-蘋果酸難溶性鹽。
其轉(zhuǎn)化反應(yīng)特點(diǎn)為1、采用馬來酸鈣鹽或鋇鹽，其中以馬來酸鈣鹽的轉(zhuǎn)化反應(yīng)速率為最快。2、只要能充分?jǐn)嚢桉R來酸鈣鹽固體，就可以加快反應(yīng)。
(三)馬來酸難溶性鹽加少量馬來酸可溶性鹽轉(zhuǎn)化成D-蘋果酸在上述反應(yīng)(二)的反應(yīng)液中除馬來酸難溶性鹽例如鈣鹽以外，加入少量馬來酸可溶性鹽例如鈉鹽，馬來酸可溶性鹽的添加量可以以酶活性的變化來決定，一般調(diào)整到游離馬來酸終濃度為30-120g/L，較好為50-80g/L，在28～36℃反應(yīng)，30-34℃反應(yīng)更好，可獲得產(chǎn)物D-蘋果酸難溶性鹽。
綜上所述，本發(fā)明采用簡(jiǎn)單脂肪桿菌(簡(jiǎn)單棲油桿菌)(Pimelobacter simplex)DM18菌株，所產(chǎn)生的馬來酸水合酶具有耐高濃度底物和產(chǎn)物特點(diǎn)，同時(shí)具有較高穩(wěn)定性，有效避免高濃度產(chǎn)物及底物對(duì)馬來酸水合酶的抑制作用。進(jìn)一步耦合利用馬來酸和D-蘋果酸難溶性鹽例如鈣鹽、鋇鹽的溶解度低的特點(diǎn)，以馬來酸鈣或馬來酸鋇為底物，經(jīng)水合酶催化加水轉(zhuǎn)化成D-蘋果酸鈣或鋇，實(shí)現(xiàn)邊反應(yīng)邊分離產(chǎn)物的反應(yīng)分離耦合的目的。同時(shí)巧妙地利用難溶性鹽例如鈣鹽或鋇鹽與可溶性鹽例如鈉鹽或鉀鹽的混合反應(yīng)體系提高了轉(zhuǎn)化反應(yīng)速率，縮短反應(yīng)時(shí)間，提高產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率。本發(fā)明方法可以獲得200～500g/L的D-蘋果酸鈣，其轉(zhuǎn)化率可達(dá)99％。同時(shí)，菌體的培養(yǎng)條件比較簡(jiǎn)單，易于得到活性穩(wěn)定的菌體，因此利于產(chǎn)業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式
(實(shí)施例)實(shí)施例1(菌體的發(fā)酵)按以下重量比例配制發(fā)酵液檸康酸2.5g/L，葡萄糖3g/L，磷酸二氫鉀10.5g/L，硝酸銨2.0g/L，無水硫酸鎂0.25g/L，七水硫酸亞鐵0.015g/L，酵母膏2.8g/L，玉米漿5g/L，此時(shí)pH值7.2。滅菌后接種量為4％，在溫度為30℃和轉(zhuǎn)速為200rpm攪拌下，發(fā)酵。
實(shí)施例2 Pimelobacter simplex DM18菌、按實(shí)施列1發(fā)酵28小時(shí)，離心收集菌體，用Tris-HCl緩沖液(pH7.2)制備菌懸液，調(diào)整反應(yīng)液終OD660至10，加入終濃度為3‰的破壁劑CTAB和80g/L底物馬來酸鈉鹽(以馬來酸計(jì)算濃度為80g/L)，32℃振蕩反應(yīng)(或攪拌反應(yīng))15小時(shí)，獲得91g/L的D-蘋果酸。
實(shí)施例3 Pimelobacter simplex DM18菌、按實(shí)施列1發(fā)酵30小時(shí)，離心收集菌體，用Tris-HCl緩沖液(pH7.2)制備菌懸液，調(diào)整反應(yīng)液終OD660至10，加入終濃度為3‰的破壁CTAB和80g/L底物馬來酸鈉鹽(以馬來酸計(jì)算終濃度為80g/L)開始反應(yīng)，32℃振蕩反應(yīng)(或攪拌反應(yīng))，反應(yīng)開始3～4小時(shí)后間歇添加少量高濃度的馬來酸鈉鹽溶液，連續(xù)反應(yīng)32小時(shí)，獲得153.9g/L的D-蘋果酸，底物轉(zhuǎn)化收率達(dá)到96.67％。
實(shí)施例4 Pimelobacter simplex DM18菌、按實(shí)施列1發(fā)酵28小時(shí)，離心收集菌體，用Tris-HCl緩沖液(pH7.2)制備菌懸液，調(diào)整反應(yīng)液終OD660至10，加入終濃度為5‰的破壁劑甲苯和200g/L馬來酸鈣鹽，32℃振蕩反應(yīng)(或攪拌反應(yīng))30小時(shí)，獲得218g/L的D-蘋果酸鈣鹽，有少量D-蘋果酸鹽溶于溶液中，底物轉(zhuǎn)化率達(dá)到99％以上(以轉(zhuǎn)化后存在底物含量計(jì)).
實(shí)施例5 Pimelobacter simplex DM18菌、按實(shí)施列1發(fā)酵28小時(shí)，離心收集菌體，用Tris-HCl緩沖液(pH7.2)制備菌懸液，調(diào)整反應(yīng)液終OD660至10，加入終濃度為3‰的破壁劑CTAB和60g/L底物馬來酸鈉鹽(以馬來酸計(jì)算濃度為60g/L)，同時(shí)加入200g/L馬來酸鈣鹽，32℃振蕩反應(yīng)(或攪拌反應(yīng))26小時(shí)，獲得259g/L的D-蘋果酸鈣鹽，有少量D-蘋果酸鹽溶于溶液中，底物轉(zhuǎn)化收率達(dá)到99％以上(以轉(zhuǎn)化后存在底物含量計(jì))。
實(shí)施例6 Pimelobacter simplex DM18菌、按實(shí)施列1發(fā)酵28小時(shí)，離心收集菌體，用Tris-HCl緩沖液(pH7.2)制備菌懸液，調(diào)整反應(yīng)液終OD660至10，加入終濃度為3‰的破壁劑CTAB和60g/L底物馬來酸鈉鹽(以馬來酸計(jì)算濃度為60g/L)，同時(shí)加入200g/L馬來酸鈣鹽，32℃振蕩反應(yīng)(或攪拌反應(yīng))26小時(shí)，獲得257g/L的D-蘋果酸鈣鹽，有少量D-蘋果酸鹽溶于溶液中，底物轉(zhuǎn)化收率達(dá)到99％；離心分離產(chǎn)物和反應(yīng)液，在回收反應(yīng)液中再加入200g/L馬來酸鈣鹽，32℃振蕩反應(yīng)(或攪拌反應(yīng))28小時(shí)，獲得221g/L的D-蘋果酸鈣鹽，底物轉(zhuǎn)化收率達(dá)到99％以上(以轉(zhuǎn)化后存在底物含量計(jì)).
實(shí)施例7 Pimelobacter simplex DM18菌、按實(shí)施列1發(fā)酵28小時(shí)，離心收集菌體，用Tris-HCl緩沖液(pH7.2)制備菌懸液，調(diào)整反應(yīng)液終OD660至10，加入終濃度為3‰的破壁劑CTAB和60g/L底物馬來酸鈉鹽(以馬來酸計(jì)算濃度為60g/L)，同時(shí)加入400g/L馬來酸鈣鹽，32℃振蕩反應(yīng)(或攪拌反應(yīng))42小時(shí)，獲得487g/L的D-蘋果酸鈣鹽，有少量D-蘋果酸鹽溶于溶液中，底物轉(zhuǎn)化收率達(dá)到99％以上(以轉(zhuǎn)化后存在底物含量計(jì))。
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)化馬來酸制備D-蘋果酸的菌株，其特征在于該菌株是簡(jiǎn)單脂肪桿菌(簡(jiǎn)單棲油桿菌)(Pimelobacter Simplex)DM18菌株，已由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號(hào)CCTCC M 204088；該菌為革蘭氏陽性，無芽孢；過氧化物酶試驗(yàn)陽性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述菌株制備D-蘋果酸的方法，其特征在于用Pimelobactersimplex DM18菌的馬來酸水合酶轉(zhuǎn)化馬來酸制備D-蘋果酸，反應(yīng)路線為
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述制備D-蘋果酸的方法，其特征在于馬來酸鹽和D-蘋果酸鹽為可溶性鹽。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述制備D-蘋果酸的方法，其特征在于馬來酸鹽和D-蘋果酸鹽的可溶性鹽為鈉鹽或鉀鹽。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述制備D-蘋果酸的方法，其特征在于采用間歇添加高濃度的馬來酸可溶性鹽，維持馬來酸可溶性鹽濃度低于80g/L，進(jìn)行反應(yīng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述制備D-蘋果酸的方法，其特征在于馬來酸鹽和D-蘋果酸鹽為難溶性鹽。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述制備D-蘋果酸的方法，其特征在于馬來酸鹽和D-蘋果酸鹽的難溶性鹽為鈣鹽或鋇鹽。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述制備D-蘋果酸的方法，其特征在于反應(yīng)過濾分離出D-蘋果酸難溶性鹽后，在母液中加入馬來酸難溶性鹽，繼續(xù)反應(yīng)。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述制備D-蘋果酸的方法，其特征是發(fā)酵液無需大量的碳氮源，一般固體碳氮源的含量為0-50g/l，并用檸康酸作為誘導(dǎo)劑，發(fā)酵為好氧發(fā)酵。
10.根據(jù)權(quán)利要求2所述制備D-蘋果酸的方法，其特征是反應(yīng)物用馬來酸難溶性鹽和少量馬來酸可溶性鹽，馬來酸可溶性鹽添加量在30～120g/L，并充分?jǐn)嚢琛?br> 11.根據(jù)權(quán)利要求10所述制備D-蘋果酸的方法，其特征是馬來酸難溶性鹽是鈣鹽或鋇鹽，馬來酸可溶性鹽是鈉鹽或鉀鹽。
全文摘要
本發(fā)明屬于有機(jī)酸制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種簡(jiǎn)單脂肪桿菌(簡(jiǎn)單棲油桿菌)(Pimelobacter simplex)DM18菌株制備D－蘋果酸的方法。本發(fā)明采用高活性菌株簡(jiǎn)單脂肪桿菌DM18產(chǎn)生的馬來酸水合酶，將馬來酸難溶性鹽或可溶性鹽轉(zhuǎn)化為D蘋果酸鹽，轉(zhuǎn)化率可達(dá)99％，菌體培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，活性穩(wěn)定，利于產(chǎn)業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12P7/46GK1632104SQ20041006538
公開日2005年6月29日 申請(qǐng)日期2004年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月30日
發(fā)明者何冰芳, 柏中中, 章云, 周華, 韋萍, 歐陽平凱 申請(qǐng)人:南京工業(yè)大學(xué)