本發(fā)明涉及生產(chǎn)3-羥基-3-甲基丁酸的方法。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)3-羥基-3-甲基丁酸的方法，該方法包括將3-甲基巴豆?；?coa酶促轉(zhuǎn)化為3-甲基巴豆酸的步驟和將由此產(chǎn)生的3-甲基巴豆酸進(jìn)一步酶促轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁酸的步驟?？梢酝ㄟ^直接轉(zhuǎn)化來實(shí)現(xiàn)3-甲基巴豆?；?coa轉(zhuǎn)化為3-甲基巴豆酸，其優(yōu)選利用屬于硫酯水解酶家族(也稱為硫酯酶；ec3.1.2))或者coa-轉(zhuǎn)移酶家族(ec2.8.3)的酶。或者，可以通過以下轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)3-甲基巴豆?；?coa轉(zhuǎn)化為3-甲基巴豆酸，該轉(zhuǎn)化首先包括將3-甲基巴豆?；?coa轉(zhuǎn)化為3-甲基巴豆?；?磷酸，隨后將3-甲基巴豆酰基-磷酸轉(zhuǎn)化為3-甲基巴豆酸。3-甲基巴豆酸向3-羥基-3-甲基丁酸的轉(zhuǎn)化優(yōu)選使用屬于水裂合酶(ec4.2.1)家族的酶，特別是烏頭酸水合酶(ec4.2.1.3)家族或馬來酸水合酶(ec4.2.1.31)家族或2-甲基檸檬酸脫水酶(ec4.2.1.79)家族的酶。本發(fā)明還涉及一種從3-甲基巴豆?；?coa生產(chǎn)3-羥基-3-甲基丁酸的方法，該方法包括以下步驟：(a)將3-甲基巴豆?；?coa酶促轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁酰基-coa；和(b)進(jìn)一步將由此產(chǎn)生的3-羥基-3-甲基丁酰基-coa酶促轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁酸，其中通過首先將3-羥基-3-甲基丁酰基-coa轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁?；?磷酸，然后將由此產(chǎn)生的3-羥基-3-甲基丁?；姿徂D(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁酸，實(shí)現(xiàn)根據(jù)步驟(b)的將3-羥基-3-甲基丁?；?coa酶促轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁酸。
背景技術(shù)：
：目前大量的化學(xué)化合物來自石化產(chǎn)品。烯烴(如乙烯、丙烯、不同的丁烯、或者例如戊烯)用于塑料工業(yè)中，例如用于生產(chǎn)聚丙烯或聚乙烯，以及用于化學(xué)工業(yè)和燃料的其它領(lǐng)域。丁烯以四種形式存在，其中一種異丁烯(isobutene)(也稱為異丁烯(isobutylene))進(jìn)入甲基-叔-丁基-醚(mtbe)(用于汽車燃料的抗爆添加劑)的組成中。異丁烯也可用于生產(chǎn)異辛烯，該異辛烯又可以還原為異辛烷(2,2,4-三甲基戊烷)；異辛烷的極高辛烷值使其成為所謂的“汽油”發(fā)動(dòng)機(jī)的最佳燃料。烯烴如異丁烯目前通過石油產(chǎn)品的催化裂化(或在己烯的情況下，通過費(fèi)希爾-特羅普希法(fischer-tropsch)的衍生，自煤或氣)生產(chǎn)。因此，生產(chǎn)成本與油價(jià)格緊密相關(guān)。此外，催化裂化有時(shí)與相當(dāng)多的技術(shù)困難相關(guān)，這增加了工藝復(fù)雜性和生產(chǎn)成本。在與地球化學(xué)循環(huán)相協(xié)調(diào)的可持續(xù)工業(yè)操作的背景下，需要通過生物途徑生產(chǎn)烯烴如異丁烯。第一代生物燃料為乙醇的發(fā)酵生產(chǎn)，因?yàn)榘l(fā)酵和蒸餾方法已經(jīng)存在于食品加工工業(yè)中。第二代生物燃料的生產(chǎn)處于探索階段，特別包括長鏈醇(丁醇和戊醇)、萜烯、直鏈烷烴和脂肪酸的生產(chǎn)。兩篇最近的綜述提供了在這一領(lǐng)域研究的一般概述：ladygina等人(processbiochemistry41(2006),1001)和wackett(currentopinionsinchemicalbiology21(2008),187)。已經(jīng)描述了酵母小紅酵母(rhodotorulaminuta)將異戊酸轉(zhuǎn)化為異丁烯(fujii等人(appl.environ.microbiol.54(1988),583))，但是該反應(yīng)的效率，小于每分鐘1百萬分之一，或約每天1000分之一，與允許工業(yè)應(yīng)用差得很遠(yuǎn)。fukuda等人(bbrc201(1994),516)闡明了反應(yīng)機(jī)制，其涉及細(xì)胞色素p450酶，所述酶通過還原氧代鐵基團(tuán)(oxoferrylgroup)fev＝o使異戊酸脫羧基。通過該途徑的異丁烯大規(guī)模生物合成似乎是非常不利的，因?yàn)樗枰粋€(gè)亮氨酸分子的合成和降解以形成一個(gè)異丁烯分子。此外，催化反應(yīng)的酶使用血紅素作為輔因子，其本身不適于在細(xì)菌中重組表達(dá)、不適于酶參數(shù)的改進(jìn)。由于所有這些原因，這一途徑看起來十分不可能作為工業(yè)開發(fā)的基礎(chǔ)。其它微生物已被描述勉強(qiáng)能夠從異戊酸天然產(chǎn)生異丁烯；獲得的產(chǎn)量甚至低于用小紅酵母獲得的產(chǎn)量(fukuda等人(agric.biol.chem.48(1984),1679))。gogerty等人(appl.environm.microbiol.76(2010),8004-8010)和vanleeuwen等人(appl.microbiol.biotechnol.93(2012),1377-1387)描述了通過酶促轉(zhuǎn)化從乙酰乙?；?coa生產(chǎn)異丁烯，其中所提出的途徑的最后一步是，利用甲羥戊酸二磷酸脫羧酶轉(zhuǎn)化3-羥基-3-甲基丁酸(也稱為3-羥基異戊酸(hiv))。用于從3-羥基-3-甲基丁酸生產(chǎn)異丁烯的該反應(yīng)也描述于wo2010/001078中。在gogerty等人(參見上文)和vanleeuwen等人(參見上文)中提出，經(jīng)由3-羥基-3-甲基丁?；?coa，通過轉(zhuǎn)化3-甲基巴豆酰基-coa來實(shí)現(xiàn)3-羥基-3-甲基丁酸的生產(chǎn)。為了進(jìn)一步提高由可再生資源生產(chǎn)異丁烯的方法的效率和可變性，需要替代途徑來提供3-羥基-3-甲基丁酸，其可用作酶促轉(zhuǎn)化為異丁烯的底物。發(fā)明概述本發(fā)明通過提供如本文所公開的和如權(quán)利要求中所限定的方法，滿足了這種需求。因此，一方面，本發(fā)明涉及將3-甲基巴豆?；?coa轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁酸的方法，該方法包括以下步驟：(a)將3-甲基巴豆?；?coa酶促轉(zhuǎn)化為3-甲基巴豆酸；和(b)將由此產(chǎn)生的3-甲基巴豆酸進(jìn)一步酶促轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁酸。3-甲基巴豆?；?coa到3-羥基-3-甲基丁酸的這種轉(zhuǎn)化提供了對現(xiàn)有技術(shù)途徑的替代，現(xiàn)有技術(shù)中3-甲基巴豆?；?coa經(jīng)由3-羥基-3-甲基丁酰基-coa轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁酸。根據(jù)本發(fā)明，3-甲基巴豆?；?coa到3-甲基巴豆酸的轉(zhuǎn)化可以通過直接轉(zhuǎn)化來實(shí)現(xiàn)，其優(yōu)選使用屬于硫酯水解酶家族(在下文中稱為硫酯酶(ec3.1.2))或?qū)儆赾oa-轉(zhuǎn)移酶家族(ec2.8.3)的酶。或者，3-甲基巴豆酰基-coa到3-甲基巴豆酸的轉(zhuǎn)化可以通過以下轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn):首先包括3-甲基巴豆?；?coa到3-甲基巴豆?；?磷酸的轉(zhuǎn)化，隨后是3-甲基巴豆酰基-磷酸到3-甲基巴豆酸的轉(zhuǎn)化。因此，在第一實(shí)施方案中，3-甲基巴豆?；?coa到3-甲基巴豆酸的轉(zhuǎn)化可以通過直接轉(zhuǎn)化來實(shí)現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明，根據(jù)上述方法的步驟(a)，3-甲基巴豆?；?coa到3-甲基巴豆酸的這種直接酶促轉(zhuǎn)化可以例如通過使用(i)硫酯酶(ec3.1.2)；或(ii)coa-轉(zhuǎn)移酶(ec2.8.3)，來實(shí)現(xiàn)。硫酯酶(te；也稱為硫酯水解酶)是分類為ec3.1.2的酶。目前，硫酯酶被分類為ec3.1.2.1至ec3.1.2.27和ec3.1.2.-(用于未分類的te)。cantu等人(proteinscience19(2010),1281-1295)描述了，有23個(gè)硫酯酶家族，其在一級結(jié)構(gòu)方面彼此無關(guān)。然而，推定相同家族的所有成員具有基本上相同的三級結(jié)構(gòu)。硫酯酶水解羰基和硫原子之間的硫酯鍵。通過硫酯酶催化的3-甲基巴豆酰基-coa到3-甲基巴豆酸的轉(zhuǎn)化示意性地顯示在圖1中。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在根據(jù)本發(fā)明的方法中用于將3-甲基巴豆酰基-coa轉(zhuǎn)化為3-甲基巴豆酸的硫酯酶選自：-乙?；?coa水解酶(ec3.1.2.1)；-棕櫚?；?coa水解酶(ec3.1.2.2)；-3-羥基異丁?；?coa水解酶(ec3.1.2.4)；-油?；?[酰基-載體-蛋白]水解酶(ec3.1.2.14)；-adp依賴性短鏈酰基-coa水解酶(ec3.1.2.18)；-adp依賴性中鏈酰基-coa水解酶(ec3.1.2.19)；和-?；?coa水解酶(ec3.1.2.20)。因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過使用乙?；?coa水解酶(ec3.1.2.1)實(shí)現(xiàn)3-甲基巴豆?；?coa到3-甲基巴豆酸的直接轉(zhuǎn)化。乙酰基-coa水解酶是催化以下反應(yīng)的酶：乙酰基-coa+h2o→乙酸+coa該酶存在于多種生物體中，包括真核和原核生物體，如植物、動(dòng)物、真菌和細(xì)菌。所述酶已經(jīng)描述于例如褐家鼠(rattusnorvegicus)(uniprot登錄號：q99nb7)、小家鼠(musmusculus)、野豬(susscrofa)、牛(bostaurus)、原雞(gallusgallus)、闊鼻猴類(platyrrhini)、綿羊(ovisaries)、金色大鼠(mesocricetusauratus)、豬蛔蟲(ascarissuum)、人(homosapiens,uniprot登錄號：q8wyk0)、豌豆(pisumsativum)、黃瓜(cucumissativus)、黍?qū)?panicussp.)、蓖麻(ricinuscommunis)、馬鈴薯(solanumtuberosum)、菠菜(spinaciaoleracea)、玉米(zeamays)、大豆(glycinemax)、釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)、粗糙脈孢菌(neurosporacrassa)、白色念珠菌(candidaalbicans)、布氏布氏錐蟲(trypanosomabruceibrucei)、克氏錐蟲(trypanosomacruzi)、trypanosomadionisii、trypanosomavespertilionis、crithidiafasciculate、氨基戊酸梭菌(clostridiumaminovalericum)、發(fā)酵氨基酸球菌(acidaminococcusfermaentans)、大豆慢生根瘤菌(bradyrhizobiumjaponicum)和巴氏甲烷八疊球菌(methanosarcinabarkeri)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，3-甲基巴豆酰基-coa到3-甲基巴豆酸的直接轉(zhuǎn)化通過使用棕櫚?；?coa水解酶(ec3.1.2.2)實(shí)現(xiàn)。棕櫚?；?coa水解酶是催化以下反應(yīng)的酶：棕櫚?；?coa+h2o→棕櫚酸+coa該酶存在于多種生物體中，包括真核和原核生物體，如植物、動(dòng)物、真菌和細(xì)菌。該酶例如已經(jīng)描述在擬南芥(arabidopsisthaliana)(uniprot登錄號：q8gyw7)、豌豆(pisumsativum)、菠菜(spinaciaoleracea)、bumilleriopsisfiliformis、eremosphaeraviridis、mougeotiascalaris、纖細(xì)裸藻(euglenagracilis)、rhodotorulaaurantiaca、釀酒酵母(saccharaomycescerevisiae)、褶皺假絲酵母(candidarugosa)、秀麗隱桿線蟲(caenorhabditiselegans)、小家鼠(musmusculus)(uniprot登錄號：p58137)、人(homosapiens)、闊鼻猴類(platyrrhini)、牛(bostaurus)、家犬(canislupusfamiliaris)、野豬(cusscrofa)、豚鼠(caviaprocellus)、鴿屬(columbasp.)、cricetulusgriseus、金色大鼠(mesocricetusauratus)、黑腹果蠅(drosophilamelanogaster)、褐家鼠(rattusnorvegicus)、穴兔(oryctolaguscuniculus)、原雞(gallusgallus)、綠頭鴨(anasplatyrhynchos)、結(jié)核分支桿菌(mycobacteriumtuberculosis)、草分枝桿菌(mycobacteriumphlei)、恥垢分枝桿菌(mycobacteriumsmegmatis)、乙酸鈣不動(dòng)桿菌(acinetobactercolcaceticus)、流感嗜血桿菌(haemophilusinfluenza)、幽門螺桿菌(helicobacterpylori)、枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)、銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa)、類球紅細(xì)菌(rhodobactersphaeroides)、天藍(lán)色鏈霉菌(streptomycescoelicolor)、委內(nèi)瑞拉鏈霉菌(streptomycesvenezuelae)和大腸桿菌(e.coli)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，3-甲基巴豆酰基-coa到3-甲基巴豆酸的直接轉(zhuǎn)化通過使用3-羥基異丁?；?coa水解酶(ec3.1.2.4)實(shí)現(xiàn)。3-羥基異丁酰-coa水解酶是催化以下反應(yīng)的酶：3-羥基異丁酰基-coa+h2o→3-羥基異丁酸+coa該酶存在于多種生物體中，包括真核和原核生物體，如植物、動(dòng)物、真菌和細(xì)菌。該酶已經(jīng)描述于例如擬南芥(arabidopsisthaliana)、人、家犬(canislupusfamiliaris)、褐家鼠(rattusnorvegicus)、蠟狀芽孢桿菌(bacilluscereus)、熒光假單胞菌(pseudomonasfluorescens)和銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa)中。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，3-甲基巴豆?；?coa到3-甲基巴豆酸的直接轉(zhuǎn)化通過使用油酰基-[?；?載體-蛋白]水解酶(ec3.1.2.14)實(shí)現(xiàn)。油?；?[酰基-載體-蛋白]水解酶是催化以下反應(yīng)的酶：油?；?[?；?載體-蛋白]+h2o→油酸+[?；?載體-蛋白]這種酶存在于多種植物和細(xì)菌中。該酶已經(jīng)描述于例如擬南芥(arabidopsisthaliana)、南歐蒜(alliumampeloprasum)、南瓜(curcurbitamoschata)、美葉萼距花(cupheacalophylla)、萼距花(cupheahookeriana)、披針葉萼距花(cuphealanceolata)、cupheawrightii、加州月桂(umbellulariacalifornica)、芫荽(coriandrumsativum)、菠菜(spinaciaoleracea)、油棕屬(elaeissp.)、elaeisguineensis、大豆(glycinemax)、鱷梨(perseaamericana)、豌豆(pisumsativum)、白芥(sinapisalba)、美洲榆(ulmusamericana)、玉米(zeamays)、芥菜(brassicajuncea)、歐洲油菜(brassicanapus)、蕪菁油菜亞種(brassicarapasubsp.campestris)、桐油樹(jatrophacurcas)、蓖麻(ricinuscommunis)、樟(cinnamomumcamphorum)、四葉澳洲堅(jiān)果(macadamiatetraphylla)、magniferaindica、長葉紫荊木(madhucalongifolia)、毛白楊(populustomentosa)、臘梅(chimonanthuspraecox)、陸地棉(gossypiumhirsutum)、藏欖(diploknemabutyracea)、向日葵(helianthusannuus)和釀膿鏈球菌(streptococcuspyogenes)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，3-甲基巴豆?；?coa到3-甲基巴豆酸的直接轉(zhuǎn)化通過利用adp依賴性短鏈?；?coa水解酶(ec3.1.2.18)來實(shí)現(xiàn)。adp依賴性短鏈?；?coa水解酶是催化以下反應(yīng)的酶：?；?coa+h2o→羧酸+coa這種酶存在于多種動(dòng)物中，并且已經(jīng)描述在例如小家鼠、褐家鼠和金色大鼠中。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，3-甲基巴豆?；?coa到3-甲基巴豆酸的直接轉(zhuǎn)化通過使用adp依賴性中鏈?；?coa水解酶(ec3.1.2.19)來實(shí)現(xiàn)。adp依賴性中鏈?；?coa水解酶是催化以下反應(yīng)的酶：酰基-coa+h2o→羧酸+coa這種酶存在于多種動(dòng)物中，并且已經(jīng)描述于例如褐家鼠和金色大鼠中。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，3-甲基巴豆?；?coa到3-甲基巴豆酸的直接轉(zhuǎn)化通過使用酰基-coa水解酶(ec3.1.2.20)來實(shí)現(xiàn)。?；?coa水解酶是催化以下反應(yīng)的酶：酰基-coa+h2o→羧酸+coa該酶存在于多種生物體中，包括真核和原核生物體，如植物、動(dòng)物、真菌和細(xì)菌。該酶例如已描述于擬南芥(arabidopsisthaliana)、rhodotorulaaurantiaca、bumilleriopsisfiliformis,eremosphaeraviridis、纖細(xì)裸藻(euglenagracilis)、小家鼠、褐家鼠、人、野豬、牛、家犬(caislupusfamiliaris)、豚鼠(caviaporcellus)、cricetusgriseus、黑腹果蠅、綠頭鴨、原雞、秀麗隱桿線蟲、釀酒酵母、皺褶假絲酵母、大腸桿菌、流感嗜血桿菌、野油菜黃單胞菌(xanthomonascampestris)、鏈霉菌屬(streptomycessp.)、天藍(lán)色鏈霉菌、糞產(chǎn)堿菌(alcaligenesfaecalis)、銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌(pseudomonasputida)、地中海擬無枝酸菌(amycolatopsismediterranei)、醋酸鈣不動(dòng)桿菌(acinetobactercalcoaceticus)、幽門螺桿菌、類球紅細(xì)菌和草分枝桿菌。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，酰基-coa水解酶是來自大腸桿菌、來自惡臭假單胞菌或來自流感嗜血桿菌的酶，更優(yōu)選為來自大腸桿菌的ycia酶、或來自流感嗜血桿菌的其密切相關(guān)的同源物hi0827(zhuang等人，biochemistry47(2008),2789-2796)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，乙?；?coa水解酶是來自人的酶(cao等人，biochemistry48(2009),1293-1304)。來自大腸桿菌、流感嗜血桿菌和人的酶已被報(bào)道能夠接受β-甲基巴豆酰基-coa(3-甲基巴豆酰-coa的同義詞)作為底物。特別優(yōu)選的是來自大腸桿菌的酰基-coa硫酯水解酶(uniprotp0a8z0；seqidno:19)，來自大腸桿菌的?；?coa硫酯酶2(uniprotp0agg2；seqidno:20)和來自惡臭假單胞菌的?；?coa硫酯酶ii(uniprotq88dr1；seqidno：21)。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中使用的?；?coa水解酶具有seqidno：19至21中任一個(gè)所示的氨基酸序列、或顯示與seqidno：19至21中的任一個(gè)至少x％同源的氨基酸序列，并且具有?；?coa水解酶的活性，其中x為30至100之間的整數(shù)，優(yōu)選35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，其中這種酶能夠催化3-甲基巴豆酰基-coa轉(zhuǎn)化為3-甲基巴豆酸。優(yōu)選地，通過將相應(yīng)的序列與任何一個(gè)上述seqidno的氨基酸序列進(jìn)行比較來確定同一性程度。當(dāng)被比較的序列不具有相同的長度時(shí)，同一性程度優(yōu)選地指，較短序列中與較長序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分比，或較長序列中與較短序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分比?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域熟知的方法、優(yōu)選使用合適的計(jì)算機(jī)算法，如clustal，測定序列同一性的程度。當(dāng)使用clustal分析方法測定特定序列是否例如與參考序列80％相同時(shí)，可以使用默認(rèn)設(shè)置，或者設(shè)置優(yōu)選如下：矩陣：blosum30；開放空位罰分：10.0；延伸空位罰分：0.05；延緩差異序列比對(delaydivergent)：40；空位間隔距離：8，用于氨基酸序列的比較。對于核苷酸序列比較，延伸空位罰分優(yōu)選設(shè)定為5.0。優(yōu)選地，在序列的完整長度上計(jì)算同一性程度。如上所述，3-甲基巴豆?；?coa到3-甲基巴豆酸的直接轉(zhuǎn)化也可以通過使用分類為coa-轉(zhuǎn)移酶(ec2.8.3)的酶來實(shí)現(xiàn)。通過coa-轉(zhuǎn)移酶催化的3-甲基巴豆?；?coa到3-甲基巴豆酸的轉(zhuǎn)化示意性地顯示在圖2中。coa-轉(zhuǎn)移酶存在于來自所有血統(tǒng)系的生物體中。大多數(shù)coa-轉(zhuǎn)移酶屬于兩個(gè)熟知的酶家族(以下稱為家族i和ii)，并且存在已在細(xì)菌的厭氧代謝途徑中鑒定的第三家族。描述不同家族的綜述可以在heider(febsletters509(2001),345-349)中找到。家族i含有例如以下coa-轉(zhuǎn)移酶：對于3-含氧酸：分類在ec2.8.3.5或ec2.8.3.6中的酶；對于短鏈脂肪酸：分類在ec2.8.3.8或ec2.8.3.9中的酶；對于戊烯二酸：分類在ec2.8.3.12中的酶；對于琥珀酸：琥珀酰基-coa：乙酸coa-轉(zhuǎn)移酶，即分類在ec2.8.3.18中的酶(也參見mullins等人,biochemistry51(2012),8422-34；mullinsetal.,j.bacteriol.190(2006),4933-4940)。家族i的大多數(shù)酶天然使用琥珀酰基-coa或乙?；?coa作為coa供體。這些酶在不同聚集態(tài)中含有兩個(gè)不相似亞基。已經(jīng)鑒定了兩個(gè)保守的氨基酸序列基序：prosites條目ps01273(http://prosite.expasy.org/cgi-bin/prosite/prosite-search-ac？pdoc00980)coa_transf_1，ps01273；輔酶a轉(zhuǎn)移酶標(biāo)簽1(pattern)共有模式：[dn]-[gn]-x(2)-[livmfa](3)-g-g-f-x(3)-g-x-p和prosites條目ps01273(http://prosite.expasy.org/cgi-bin/prosite/prosite-search-ac？pdoc00980)coa_transf_2，ps01274；輔酶a轉(zhuǎn)移酶標(biāo)簽2(pattern)共有模式：[lf]-[hq]-s-e-n-g-[livf](2)-[ga]e(谷氨酸)是活性位點(diǎn)殘基。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于將3-甲基巴豆?；?coa轉(zhuǎn)化為3-甲基巴豆酸的酶是戊烯二酸-coa-轉(zhuǎn)移酶(ec2.8.3.12)。優(yōu)選的戊烯二酸-coa-轉(zhuǎn)移酶是來自黃色粘球菌(myxococcusxanthus)的戊烯二酸-coa-轉(zhuǎn)移酶亞基a或b(分別為uniprotq1d4i4和q1d4i3)。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，在本發(fā)明的方法中使用的戊烯二酸-coa-轉(zhuǎn)移酶具有如seqidno：17或18所示的氨基酸序列、或顯示與seqidno：17或18至少x％同源的氨基酸序列，并且具有戊烯二酸-coa-轉(zhuǎn)移酶的活性，其中x為30至100之間的整數(shù)，優(yōu)選35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，其中這種酶能夠催化3-甲基巴豆?；?coa轉(zhuǎn)化為3-甲基巴豆酸。關(guān)于同一性程度的確定，這同樣適用于上文已經(jīng)給出的描述。coa-轉(zhuǎn)移酶家族ii由檸檬酸裂合酶(ec2.8.3.10)和檸蘋酸裂合酶(ec2.8.3.11)的同二聚α亞基組成。這些酶催化含有共價(jià)結(jié)合的coa-衍生物的酰基載體蛋白(acp)的轉(zhuǎn)移。已經(jīng)表明，這些酶在體外也接受游離的coa-硫酯，如在檸檬酸裂合酶的情況下乙酰基-coa、丙酰基-coa、丁?；?coa(dimroth等,eur.j.biochem.80(1977),479-488)和，在檸蘋酸裂合酶情況下乙?；?coa和琥珀?；?coa(dimroth等人,eur.j.biochem.80(1977),469-477)。根據(jù)heider(同上引文)，coa-轉(zhuǎn)移酶的家族iii由甲?；?coa:草酸coa-轉(zhuǎn)移酶、琥珀?；?coa:(r)-芐基琥珀酸coa-轉(zhuǎn)移酶，(e)-肉桂?；?coa:(r)-苯基乳酸coa-轉(zhuǎn)移酶和丁酰甜菜堿酰-coa:(r)-肉毒堿coa-轉(zhuǎn)移酶組成。家族iii的另一個(gè)成員是琥珀酰基-coa:l-蘋果酸coa-轉(zhuǎn)移酶，其在橙色綠屈撓菌(chloroflexusaurantiacus)的自養(yǎng)(autrophic)co2固定中的功能是用琥珀?；?coa作為coa供體、將l-蘋果酸活化為其coa硫酯(friedmans.等人j.bacteriol.188(2006),2646-2655)。該家族的coa-轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列與家族i和ii的coa-轉(zhuǎn)移酶僅顯示低程度的序列同一性。這些coa-轉(zhuǎn)移酶存在于原核生物和真核生物中。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在根據(jù)本發(fā)明的方法中使用的coa-轉(zhuǎn)移酶是屬于如上文所述的家族i或ii的coa-轉(zhuǎn)移酶。優(yōu)選地，在根據(jù)本發(fā)明的方法中使用的將3-甲基巴豆?；?coa直接轉(zhuǎn)化為3-甲基巴豆酸的coa-轉(zhuǎn)移酶選自：-乙酸coa-轉(zhuǎn)移酶(ec2.8.3.8)；和-丁酸-乙酰乙酸coa-轉(zhuǎn)移酶(ec2.8.3.9)。因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過使用乙酸coa-轉(zhuǎn)移酶(ec2.8.3.8)實(shí)現(xiàn)3-甲基巴豆酰基-coa到3-甲基巴豆酸的直接轉(zhuǎn)化。乙酸coa-轉(zhuǎn)移酶是催化以下反應(yīng)的酶：這種酶存在于多種細(xì)菌中，并且已經(jīng)描述在例如糞厭氧棒狀菌(anaerostipescaccae)、霍氏真桿菌(eubacteriumhallii)、普氏棲糞桿菌(faecalibacteriumprausnitzii)、人羅斯拜瑞氏菌(roseburiahominis)、腸道羅斯拜瑞氏菌(roseburiaintestinalis)、糞球菌屬(coprococcussp)和大腸桿菌。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過使用丁酸-乙酰乙酸coa-轉(zhuǎn)移酶(ec2.8.3.9)實(shí)現(xiàn)3-甲基巴豆?；?coa到3-甲基巴豆酸的直接轉(zhuǎn)化。丁酸-乙酰乙酸coa-轉(zhuǎn)移酶是催化以下反應(yīng)的酶：該酶存在于多種生物體中，包括真核和原核生物體，如動(dòng)物和細(xì)菌。該酶已經(jīng)描述于例如牛、梭菌屬(clostridium)和大腸桿菌中。如上所述，3-甲基巴豆?；?coa到3-甲基巴豆酸的轉(zhuǎn)化也可以通過以下轉(zhuǎn)化來實(shí)現(xiàn)，該轉(zhuǎn)化首先包括3-甲基巴豆酰基-coa到3-甲基巴豆?；?磷酸的轉(zhuǎn)化，然后是3-甲基巴豆?；?磷酸到3-甲基巴豆酸的轉(zhuǎn)化。相應(yīng)的反應(yīng)示意性地顯示在圖11中。該轉(zhuǎn)化具有產(chǎn)生一分子atp的優(yōu)點(diǎn)。3-甲基巴豆?；?coa到3-甲基巴豆?；?磷酸的轉(zhuǎn)化可以例如通過使用磷酸丁?；D(zhuǎn)移酶(ec2.3.1.19)或磷酸乙?；D(zhuǎn)移酶(ec2.3.1.8)實(shí)現(xiàn)。磷酸丁?；D(zhuǎn)移酶(ec2.3.1.19)天然催化以下反應(yīng)wiesenborn等人(appl.environ.microbiol.55(1989),317-322)和ward等人(j.bacteriol.181(1999),5433-5442)已經(jīng)描述了，除丁?；o酶a(丁?；?coa)以外，磷酸丁?；D(zhuǎn)移酶(ec2.3.1.19)還可以利用一些底物，特別是乙?；?coa、丙?；?coa、異丁?；?coa、戊?；?coa和異戊酰基-coa。該酶已被描述為存在于許多生物體中，特別是在細(xì)菌和原生動(dòng)物中。在一個(gè)實(shí)施方案中，該酶來自原生動(dòng)物dasytricharuminantium。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，磷酸丁?；D(zhuǎn)移酶是來自細(xì)菌的磷酸丁酰基轉(zhuǎn)移酶，優(yōu)選來自芽孢桿菌屬(bacillus)、丁酸弧菌屬(butyrivibrio)、腸球菌屬(enterococcus)或梭菌屬(clostridium)的細(xì)菌，更優(yōu)選來自腸球菌屬或梭菌屬，甚至更優(yōu)選來自巨大芽孢桿菌(bacillusmegaterium)、枯草芽孢桿菌、溶纖維丁酸弧菌(butyrivibriofibrisolvens)、丙酮丁醇梭菌(clostridiumacetobutylicum)、拜氏梭菌(clostridiumbeijerinckii)、丁酸梭菌(clostridiumbutyricum)、科氏梭菌(clostridiumkluyveri)、糖丁醇梭菌(clostridiumsaccharoacetobutylicum)、生孢梭菌(clostridiumsprorogenes)或糞腸球菌(enterococcusfaecalis)。最優(yōu)選地，酶來自枯草芽孢桿菌(菌株168)(uniprot登錄號p54530)、丙酮丁醇梭菌(uniprot登錄號f0k6w0)或來自糞腸球菌mtup9(uniprot登錄號k4yre8或uniprot登錄號a0a038bnc2)?？色@得的uniprot登錄號k4yre8和uniprot登錄號a0a038bnc2下的糞腸球菌磷酸丁酰基轉(zhuǎn)移酶的序列，具有99.3％的序列同源性。可獲得的uniprot登錄號a0a038bnc2下的糞腸球菌磷酸丁酰基轉(zhuǎn)移酶的序列，是更優(yōu)選的。如上所述，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，酶是來自枯草芽孢桿菌(菌株168)(uniprot登錄號p54530)的磷酸丁酰基轉(zhuǎn)移酶(ec2.3.1.19)。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中使用的磷酸丁酰基轉(zhuǎn)移酶(ec2.3.1.19)具有如seqidno：28所示的氨基酸序列、或顯示與seqidno：28至少x％同源的氨基酸序列，并且具有磷酸丁?；D(zhuǎn)移酶的活性，其中x為30至100之間的整數(shù)，優(yōu)選為35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，其中所述酶能夠?qū)?-甲基巴豆?；?coa轉(zhuǎn)化為3-甲基巴豆酰基-磷酸，如上所述。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，如上所述，酶是來自糞腸球菌mtup9的磷酸丁?；D(zhuǎn)移酶(ec2.3.1.19)(uniprot登錄號k4yre8或uniprot登錄號a0a038bnc2)。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中使用的磷酸丁?；D(zhuǎn)移酶(ec2.3.1.19)具有如seqidno：29所示的氨基酸序列、或顯示與seqidno：29至少x％同源的氨基酸序列，并且具有磷酸丁?；D(zhuǎn)移酶的活性，其中x為30至100之間的整數(shù)，優(yōu)選為35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，其中所述酶能夠?qū)?-甲基巴豆?；?coa轉(zhuǎn)化為3-甲基巴豆酰基-磷酸，如上所述。關(guān)于同一性程度的測定，同樣適用于上文已經(jīng)給出的描述。磷酸乙?；D(zhuǎn)移酶(ec2.3.1.8)天然催化以下反應(yīng)veit等人(j.biotechnol.140(2009),75-83)描述了磷酸乙?；D(zhuǎn)移酶也可以使用丁?；?coa或丙?；?coa作為底物。interpro數(shù)據(jù)庫中該酶家族的登錄號為ipr012147和ipr002505，“http://www.ebi.ac.uk/interpro/entry/ipr002505”(http://www.ebi.ac.uk/interpro/entry/ipr012147http://www.ebi.ac.uk/interpro/entry/ipr002505)也參見http://pfam.sanger.ac.uk/family/pf01515該酶已經(jīng)在多種生物體中描述，特別是細(xì)菌和真菌。因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該酶是來自細(xì)菌的酶，所述細(xì)菌優(yōu)選埃希氏菌屬(escherichia)、chlorogonium、梭菌屬(clostridium)、韋榮氏球菌屬(veillonella)、甲烷八疊球菌屬(methanosarcina)、棒桿菌屬(corynebacterium)、魯杰氏菌屬(ruegeria)、沙門氏菌屬(salmonella)、固氮菌屬(azotobacter)、慢生根瘤菌屬(bradorhizobium)、乳桿菌屬(lactobacillus)、穆爾氏菌屬(moorella)、紅假單胞菌屬(rhodopseudomonas)、中華根瘤菌屬(sinorhizobium)、鏈球菌屬(streptococcus)、熱袍菌屬(thermotoga)或芽孢桿菌屬，更優(yōu)選大腸桿菌、chlorogoniumelongatum、科氏梭菌(clostridiumkluyveri)、丙酮丁醇梭菌(clostridiumacetobutylicum)、尿酸梭菌(clostridiumacidurici)、小韋榮氏球菌(veillonellaparvula)、嗜熱甲烷八疊球菌(methanosarcinathermophila)、谷氨酸棒桿菌(corynebacteriumglutamicum)、帕氏魯杰菌(ruegeriapomeroyi)、腸沙門氏菌(salmonellaenterica)、棕色固氮菌(azotobactervinelandii)、大豆慢生根瘤菌、發(fā)酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)、舊金山乳桿菌(lactobacillussanfranciscensis)、熱醋穆爾氏菌(moorellathermoacetica)、沼澤紅假單胞菌(rhodopseudomonaspalustris)、苜蓿中華根瘤菌(sinorhizobiummeliloti)、釀膿鏈球菌(streptococcuspyogenes)、海熱袍菌(thermotogamaritima)或枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，酶是來自真菌的酶，優(yōu)選來自酵母屬，更優(yōu)選來自釀酒酵母。3-甲基巴豆?；?磷酸到3-甲基巴豆酸的轉(zhuǎn)化例如可以通過使用分類為ec2.7.2的酶，即磷酸轉(zhuǎn)移酶來實(shí)現(xiàn)。這種酶使用羧基作為受體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，3-甲基巴豆酰基-磷酸到3-甲基巴豆酸的轉(zhuǎn)化通過使用丁酸激酶(ec2.7.2.7)、支鏈脂肪酸激酶(ec2.7.2.14)、丙酸激酶(ec2.7.2.15)或乙酸激酶(ec2.7.2.1)實(shí)現(xiàn)。丁酸激酶(ec2.7.2.7)天然催化以下反應(yīng)例如，hartmanis(j.biol.chem.262(1987),617-621)已經(jīng)描述，除丁酸以外，丁酸激酶還可以使用許多底物，例如，戊酸、異丁酸、異戊酸和乙烯乙酸。該酶已經(jīng)描述在多種生物體中，特別是細(xì)菌中。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該酶來自細(xì)菌，優(yōu)選來自梭菌屬、丁酸弧菌屬、熱袍菌屬、腸球菌屬、乳桿菌屬或地芽孢桿菌屬(geobacillus)的細(xì)菌。優(yōu)選梭菌屬、乳桿菌屬或地芽孢桿菌屬。更優(yōu)選地，所述酶來自丙酮丁醇梭菌、解蛋白梭菌(clostridiumproteoclasticum)、酪丁酸梭菌(clostridiumtyrobutyricum)、丁酸梭菌、巴氏梭菌(clostridiumpasteurianum)、假破傷風(fēng)梭菌(clostridiumtetanomorphum)、溶纖維丁酸弧菌(butyrivibriofirbrosolvens)、洪氏丁酸弧菌(butyrivibriohungatei)、海熱袍菌(thermotogamaritime)、耐久腸球菌(enterococcusdurans)、干酪乳桿菌(lactobacilluscasei)(uniprot登錄號k0n529)或地芽孢桿菌(geobacillussp.)(uniprot登錄號l8a0e1)。優(yōu)選丙酮丁醇梭菌、干酪乳桿菌w56或地芽孢桿菌ghh01。對于丙酮丁醇梭菌，已經(jīng)描述了兩種丁酸激酶：丁酸激酶1(uniprot登錄號：q45829)和丁酸激酶ii(uniprot登錄號：q97ii19)。如上所述，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，酶是來自干酪乳桿菌w56的丁酸激酶(ec2.7.2.7)(uniprot登錄號k0n529)。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中使用的丁酸激酶(ec2.7.2.7)具有seqidno：30所示的氨基酸序列、或顯示與seqidno：30至少x％同源的氨基酸序列，并且具有丁酸激酶的活性，其中x為30至100之間的整數(shù)，優(yōu)選為35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，其中該酶能夠?qū)?-甲基巴豆?；?磷酸轉(zhuǎn)化為3-甲基巴豆酸，如上所述。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，酶是來自地芽孢桿菌ghh01的丁酸激酶(ec2.7.2.7)(uniprot登錄號l8a0e1)。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中使用的丁酸激酶(ec2.7.2.7)具有如seqidno：31所示的氨基酸序列、或顯示與seqidno：31至少x％同源的氨基酸序列，并且具有丁酸激酶的活性，其中x為30至100之間的整數(shù)，優(yōu)選為35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，其中該酶能夠?qū)?-甲基巴豆?；?磷酸轉(zhuǎn)化為3-甲基巴豆酸，如上所述。支鏈脂肪酸激酶(ec2.7.2.14)天然催化以下反應(yīng)該酶已被描述存在于許多細(xì)菌中。因此，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，酶是來自細(xì)菌的酶，優(yōu)選來自螺旋體屬(spirochaeta)或熱袍菌屬(thermotoga)，更優(yōu)選來自海熱袍菌。丙酸激酶(ec2.7.2.15)天然催化以下反應(yīng)該酶已被描述存在于許多細(xì)菌中，特別是腸桿菌科(enterobacteriacea)中。因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，酶是來自細(xì)菌的酶，優(yōu)選來自沙門氏菌屬或埃希氏菌屬，更優(yōu)選來自腸沙門氏菌或大腸桿菌。乙酸激酶(ec2.7.2.1)天然催化以下反應(yīng)已經(jīng)描述了該酶存在于許多生物體中，特別是細(xì)菌和真核生物中。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，酶是來自細(xì)菌的酶，優(yōu)選來自甲烷八疊球菌屬(methanosarcina)、隱球菌屬(cryptococcus)、產(chǎn)乙醇菌屬(ethanoligenens)、丙酸桿菌屬(propionibacterium)、玫瑰變色菌屬、鏈球菌屬(streptococcus)、沙門氏菌屬(salmonella)、無膽甾原體屬(acholeplasma)、不動(dòng)桿菌屬(acinetobacter)、ajellomyces、芽孢桿菌屬(bacillus)、疏螺旋體屬(borrelia)、毛殼屬(chaetomium)、梭菌屬(clostridium)、coccidioides、coprinopsis，隱球菌屬(cryptococcus)、貪銅菌屬(cupriavidus)、脫硫弧菌屬(desulfovibrio)、腸球菌屬(enterococcus)、埃希氏菌屬(escherichia)、產(chǎn)乙醇菌屬(ethanoligenes)、地芽孢桿菌屬(geobacillus)、螺桿菌屬(helicobacter)、乳桿菌屬(lactobacillus)、乳球菌屬(lactococcus)、李斯特氏菌屬(listeria)、中間原體屬(mesoplasma)、穆爾氏菌屬(moorella)、支原體(mycoplasma)、大洋芽孢桿菌屬(oceanobacillus)、丙酸桿菌屬(propionibacterium)、紅假單胞菌屬(rhodospeudomonas)、玫瑰變色菌屬(roseovarius)、沙門氏菌屬(salmonella)、葡萄球菌屬(staphylococcus)、熱袍菌屬(thermotoga)或韋榮氏球菌屬(veillonella)的細(xì)菌，更優(yōu)選來自嗜熱甲烷八疊球菌(methanosarcinathermophila)、新型隱球菌(cryptococcusneoformans)、哈爾濱產(chǎn)乙酸菌(ethanoligenensharbinense)、產(chǎn)丙酸丙酸桿菌(propionibacteriumacidipropionici)、肺炎鏈球菌(streptococcuspneumoniae)、內(nèi)臟鏈球菌(streptococcusenterica)、釀膿鏈球菌(streptococcuspyogenes)、萊氏無膽甾原體(acholeplasmalaidlawii)、醋酸鈣不動(dòng)桿菌(acinetobactercalcoaceticus)、ajellomycescapsulatus、枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)、布氏疏螺旋體(borreliaburgdorferi)、球毛殼(chaetomiumglobosum)、丙酮丁醇梭菌(clostridiumacetobutylicum)、熱解纖維梭菌(clostridiumthermocellum)、coccidioidesimmitis、coprinopsiscinerea、新型隱球菌(cryptococcusneoformans)、殺蟲貪銅菌(cupriavidusnecator)、普通脫硫弧菌(desulfovibriovulgaris)、糞腸球菌(enterococcusfaecalis)、大腸桿菌(escherichiacoli)、哈爾濱產(chǎn)乙醇菌(ethanoligenesharbinense)、嗜熱脂肪地芽孢桿菌(geobacillusstearothermophilus)、幽門螺桿菌(helicobacterpylori)、德氏乳桿菌(lactobacillusdelbrueckii)、嗜酸乳桿菌(lactobacillusacidophilus)、舊金山乳桿菌(lactobacillussanfranciscensis)、乳酸乳球菌(lactococcuslactis)、單核增生李斯特氏菌(listeriamonocytogenes)、花中間原體(mesoplasmaflorum)、噬乙酸甲烷八疊球菌(methanosarcinaacetivorans)、馬氏甲烷八疊球菌(methanosarcinamazei)、熱醋穆爾氏菌(moorellathermoacetica)、肺炎支原體(mycoplasmapneumoniae)、伊平屋橋大洋芽孢桿菌(oceanobacillusiheyensis)、費(fèi)氏丙酸桿菌(propionibacteriumfreudenreichii)、產(chǎn)丙酸丙酸桿菌(propionibacteriumacidipropionici)、沼澤紅假單胞菌(rhodospeudomonaspalustris)、腸沙門氏菌(salmonellaenteric)、金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、海熱袍菌(thermotogamaritime)、或小韋榮氏球菌(veillonellaparvula)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，酶是來自真菌的酶，優(yōu)選來自曲霉屬(aspergillus)、赤霉菌屬(gibberella)、肉座菌屬(hypocrea)、稻瘟病菌屬(magnaporthe)、暗球腔菌屬(phaeosphaeria)、原毛平革菌屬(phanerochaete)、疫霉屬(phytophthora)、核盤菌屬(sclerotinia)、uncinocarpus、黑粉菌屬(ustilago)或脈孢菌屬(neurospora)的真菌，更優(yōu)選來自以下物種的真菌：煙曲霉(aspergillusfumigates)、構(gòu)巢曲霉(aspergillusnidulans)、玉蜀黍赤霉(gibberellazeae)、紅褐肉座菌(hypocreajecorina)、水稻稻瘟病菌(magnaporthegrisea)、穎枯暗球腔菌(phaeosphaerianodorum)、黃孢原毛平革菌(phanerochaetechrysosporium)、橡樹疫霉(phytophthoraramorum)、大豆疫霉(phytophthorasojae)、核盤菌(sclerotiniasclerotiorum)、uncinocarpusreesii、玉蜀黍黑粉菌(ustilagomaydis)或粗糙脈孢菌(neurosporacrassa)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，酶是來自植物或藻類的酶，優(yōu)選來自衣藻屬(chlamydomonas)，甚至更優(yōu)選來自物種萊茵衣藻(chlamydomonasreinhardtii)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，酶來自內(nèi)阿米巴屬(entamoeba)的生物體，更優(yōu)選來自物種溶組織內(nèi)阿米巴菌(entamoebahistolytica)。已經(jīng)顯示，上述適于將3-甲基巴豆?；?磷酸轉(zhuǎn)化為3-甲基巴豆酸的酶家族是進(jìn)化相關(guān)的，并且含有共有序列標(biāo)簽(signature)。這些標(biāo)簽在prosite數(shù)據(jù)庫中引用和描述：http://prosite.expasy.org/cgi-bin/prosite/nicedoc.pl？ps01075gao等人(femsmicrobiol.lett.213(2002),59-65)已經(jīng)描述了遺傳修飾的大腸桿菌細(xì)胞，尤其是已經(jīng)被分別編碼磷酸丁?；D(zhuǎn)移酶(ec2.3.1.19)和丁酸激酶(ec2.7.2.7)的丙酮丁醇梭菌的ptb基因和buk基因轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞。這些大腸桿菌細(xì)胞已經(jīng)顯示能夠產(chǎn)生d-(-)-3-羥基丁酸(3hb)。在上述方法的步驟(a)中獲得的3-甲基巴豆酸被進(jìn)一步酶促轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁酸。這種轉(zhuǎn)化可以例如通過使用屬于水裂合酶(ec4.2.1)家族的酶實(shí)現(xiàn)，特別是使用烏頭酸水合酶(ec4.2.1.3)或馬來酸水合酶(ec4.2.1.31)或2-甲基檸檬酸脫水酶(ec4.2.1.79)實(shí)現(xiàn)。反應(yīng)示意性地顯示在圖3中。因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明，通過使用烏頭酸水合酶(ec4.2.1.3)，將3-甲基巴豆酸進(jìn)一步酶促轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁酸。烏頭酸水合酶是催化以下反應(yīng)的酶：該酶存在于多種生物體中，包括真核和原核生物體，如植物、動(dòng)物、真菌和細(xì)菌。該酶例如已經(jīng)描述于克萊門柚(citrusclementina)、檸檬(citruslimon)、玉蜀黍(zeamays)、歐亞槭(acerpseudoplatanus)、擬南芥(arabidopsisthaliana)、大豆(glycinemax)、本氏煙草(nicotianabenthamiana)、大黃屬物種(rheumsp.)、白芥(sinapisalba)、馬鈴薯(solanumtuberosum)、玉米、人(homosapiens)、牛(bostaurus)、野豬(susscrofa)、家犬(canislupusfamilaris)、穴兔(oryctolaguscuniculus)、褐家鼠(rattusnorvegicus)、小家鼠(musmusculus)、crassostreavirginica、黑腹果蠅(drosophilamelanogaster)、秀麗隱桿線蟲(caenorhabditiselegans)、惡性瘧原蟲(plasmodiumfalciparum)、布氏錐蟲(trypanosomabrucei)、釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)、解脂復(fù)膜孢酵母(saccharomycopsislipolytica)、黑曲霉(aspergillusniger)、血紅栓菌(trametessaguinea)、苜蓿中華根瘤菌(sinorhizobiummeliloti)、大腸桿菌、解脂耶氏酵母(yarrowialipolytica)、巴西副球孢子菌(paracoccidioidesbrasiliensis)、谷氨酸棒桿菌,枯草芽孢桿菌、advenellakashmirensis、棕色固氮菌、蠟狀芽孢桿菌(bacilluscereus)、脆弱擬桿菌(bacteroidesfragilis)、結(jié)核分支桿菌(mycobacteriumtuberculosis)、銅綠假單胞菌、腸沙門氏菌、金色素鏈霉菌(streptomycesaureus)、綠產(chǎn)色鏈霉菌(streptomycesviridochromogenes)、嗜酸熱硫化葉菌(sulfolobusacidocaldarius)、硫磺礦硫化葉菌(sulfolobussolfataricus)和野油菜黃單胞菌(xanthomonascampestris)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明，通過使用馬來酸水合酶(ec4.2.1.31)進(jìn)一步將3-甲基巴豆酸酶促轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁酸。馬來酸水合酶是催化以下反應(yīng)的酶：該酶存在于多種生物體中，包括真核和原核生物體，如動(dòng)物、真菌和細(xì)菌。該酶已經(jīng)例如描述于穴兔、假絲酵母屬物種(candidasp.)、exophialia屬物種、漢遜氏酵母屬物種(hansenulasp.)、原毛平革菌屬物種(phanerochaetesp.)、畢赤酵母屬物種(pichiasp.)、側(cè)耳屬物種(pleurotussp.)、紅酵母屬物種(rhodotorulasp.)、釀酒酵母屬物種(saccharomycessp.)、裂殖酵母屬物種(schizosaccharomycessp.)、擲孢酵母屬物種(sporobolomycessp.)、絲孢酵母屬物種(trichosporonsp)、yarrowia屬物種、不動(dòng)桿菌屬物種、游動(dòng)放線菌屬物種(actinoplanessp.)、曲霉菌屬物種、短桿菌屬物種(brevibacteriumsp.)、棒桿菌屬物種、克雷伯氏菌屬物種(klebsiellasp.)、微球菌屬物種(micrococcussp.)、分枝桿菌屬物種(mycobacteriumsp.)、諾卡氏菌屬物種(nocardiasp.)、青霉菌屬物種(penicilliumsp.)、變形桿菌屬物種(proteussp.)、假單胞菌屬物種(pseudomonassp.)、產(chǎn)堿假單胞菌(pseudomonasalcaligenes)、鏈霉菌屬物種、節(jié)桿菌屬物種(arthrobactersp.)和黃色桿菌屬物種(xanthobactersp.)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明，通過使用2-甲基檸檬酸脫水酶(ec4.2.1.79)將3-甲基巴豆酸進(jìn)一步酶促轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁酸。2-甲基檸檬酸脫水酶是催化以下反應(yīng)的酶：這種酶存在于多種細(xì)菌中，并且已經(jīng)描述于例如腸沙門氏菌、谷氨酸棒桿菌、大腸桿菌、恥垢分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌、奧奈達(dá)湖希瓦氏菌(shewanellaoneidensis)、霍亂弧菌(vibriocholerae)、假單胞菌屬(pseudomonassp)、產(chǎn)堿假單胞菌(pseudomonaspseudoalcaligenes)(vanderwerfetal.,appl.environ.microbiol.59(1993),2823-2829)、莢膜紅細(xì)菌(rhodobactercapsulatus)和解脂耶氏酵母。根據(jù)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的3-羥基-3-甲基丁酸可以例如進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為異丁烯。這種轉(zhuǎn)化可以例如通過使用脫羧酶、特別是甲羥戊酸二磷酸(mdp)脫羧酶來實(shí)現(xiàn)。該轉(zhuǎn)化已經(jīng)在現(xiàn)有技術(shù)中描述，例如在wo2010/001078、wo2012/052427和gogerty等人(appl.environm.microbiol.76(2010),8004-8010)中描述。因此，本發(fā)明還涉及生產(chǎn)異丁烯的方法，該方法包括將3-甲基巴豆酰基-coa轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁酸，該方法包括以下步驟：(a)將3-甲基巴豆?；?coa酶促轉(zhuǎn)化為3-甲基巴豆酸；和(b)將由此產(chǎn)生的3-甲基巴豆酸進(jìn)一步酶促轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁酸；并且其還包括步驟:通過脫羧反應(yīng)，優(yōu)選通過由mdp脫羧酶催化的脫羧反應(yīng),將由此產(chǎn)生的3-羥基-3-甲基丁酸轉(zhuǎn)化為異丁烯。根據(jù)本發(fā)明的方法轉(zhuǎn)化為3-甲基巴豆酸的3-甲基巴豆?；?coa本身可以通過酶反應(yīng)提供，例如，通過脫羧將3-甲基戊烯二?；?coa轉(zhuǎn)化為3-甲基巴豆?；?coa。該反應(yīng)示意性地顯示在圖4中。其可以由不同的酶催化。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，3-甲基戊烯二?；?coa通過脫羧轉(zhuǎn)化為3-甲基巴豆?；?coa，可以通過甲基巴豆?；?coa羧化酶(ec6.4.1.4)催化。甲基巴豆酰coa羧化酶已經(jīng)描述為催化以下反應(yīng)：即，羧化，但它們可以用于催化脫羧反應(yīng)。甲基巴豆酰基-coa羧化酶存在于多種生物體中，包括真核和原核生物體，如植物、動(dòng)物、真菌和細(xì)菌。該酶例如已經(jīng)描述于：胡蘿卜(daucuscarota)、大豆、大麥(hordeumvulgare)、豌豆(pisumsativum)、番茄(solanumlycopersicum)、馬鈴薯(solanumtuberosum)、玉米(zeamays)、擬南芥屬物種(arabidopsissp.)、兵豆(lensculinaris)、人、牛、褐家鼠、小家鼠、真鯛(pagrusmajor)、構(gòu)巢裸胞殼(emericellanidulans)、銅綠假單胞菌、香茅醇假單胞菌(pseudomonascitronellolis)、發(fā)酵氨基酸球菌(acidaminococcusfermentans)、大腸桿菌、分枝桿菌屬(mycobacteriumsp)和無色小桿菌屬物種(achromobactersp.)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，3-甲基戊烯二酰基-coa通過脫羧到3-甲基巴豆酰基-coa的轉(zhuǎn)化，由香葉?；?coa羧化酶(ec6.4.1.5)催化。香葉酰基-coa羧化酶天然催化以下反應(yīng)：該酶發(fā)生在真核生物和原核生物中，例如植物和細(xì)菌。該酶例如描述在胡蘿卜、大豆、玉米、假單胞菌屬、銅綠假單胞菌、香茅醇假單胞菌和門多薩假單胞菌(pseudomonasmendocina)中。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，3-甲基戊烯二?；?coa通過脫羧到3-甲基巴豆酰基-coa的轉(zhuǎn)化，通過3-甲基戊烯二酰基-coa脫羧酶催化，例如由liub基因編碼的黃色粘球菌的3-甲基戊烯二?；?coa脫羧酶。該基因編碼具有兩個(gè)亞基aiba和aibb的酶(li等人，angew.chem.int.ed.52(2013),1304-1308)。因此，本發(fā)明還涉及一種從3-甲基戊烯二?；?coa生產(chǎn)3-羥基-3-甲基丁酸的方法，其中3-甲基戊烯二?；?coa首先通過脫羧反應(yīng)轉(zhuǎn)化為3-甲基巴豆酰基-coa，然后進(jìn)一步被酶促轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁酸，如上文所述。轉(zhuǎn)化為3-甲基巴豆?；?coa的3-甲基戊烯二酰基-coa本身可以通過天然發(fā)生的酶反應(yīng)提供，其涉及3-羥基-3-甲基戊二?；?coa到3-甲基戊烯二酰基-coa的轉(zhuǎn)化，其可以例如由分類為3-甲基戊烯二?；?輔酶a水合酶(ec4.2.1.18)的酶催化。該反應(yīng)示意性地顯示在圖5中。3-甲基戊烯二?；?輔酶a水合酶是催化以下反應(yīng)的酶：該酶存在于多種生物體中，包括真核和原核生物體，例如植物、動(dòng)物和細(xì)菌。該酶已經(jīng)被描述于例如，黃長春花(catharantusroseus)、人、牛、綿羊、不動(dòng)桿菌屬物種、粘球菌屬物種(myxococcussp)和惡臭假單胞菌。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，3-甲基戊烯二?；o酶a水合酶是來自粘球菌屬物種的酶，甚至更優(yōu)選是具有如seqidno：10所示的氨基酸序列、或顯示出至少x％同源于seqidno：10的氨基酸序列的酶，并且具有3-甲基戊烯二?；o酶a水合酶的活性，其中x為30至100之間的整數(shù)，優(yōu)選35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，其中這種酶能夠?qū)?-羥基-3-甲基戊二?；?coa轉(zhuǎn)化為3-甲基戊烯二?；?coa，如上所述。關(guān)于同一性程度的確定，同樣適用于上文已有的闡述。3-羥基-3-甲基戊二?；?coa到3-甲基戊烯二?；?coa的轉(zhuǎn)化也可以通過使用3-羥基-3-甲基戊二酰基輔酶a脫水酶活性來實(shí)現(xiàn)，該酶已經(jīng)例如在黃色粘球菌中鑒定，其由liuc基因編碼(li等人，angew.chem.int.ed.52(2013),1304-1308)。因此，本發(fā)明還涉及一種從3-羥基-3-甲基戊二酰基-coa生產(chǎn)3-羥基-3-甲基丁酸的方法，其中3-羥基-3-甲基戊二?；?coa首先被轉(zhuǎn)化為3-甲基戊烯二酰基-coa，然后通過脫羧反應(yīng)被轉(zhuǎn)化為3-甲基巴豆酰基-coa，然后進(jìn)一步酶促轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁酸，如上所述。轉(zhuǎn)化為3-甲基戊烯二?；?coa的3-羥基-3-甲基戊二酰基-coa本身可以通過酶促方式提供，例如，通過乙酰基-coa和乙酰乙?；?coa的縮合，該反應(yīng)由酶3-羥基-3-甲基戊二酰基-coa合酶(也稱為hmg-coa合酶)天然催化。hmg-coa合酶分類在ec2.3.3.10(以前，hmg-coa合酶被分類為ec4.1.3.5，但已轉(zhuǎn)移至ec2.3.3.10)。術(shù)語“hmg-coa合酶”是指，能夠催化反應(yīng)——乙酰基-coa與乙酰乙?；?coa縮合以形成3-羥基-3-甲基戊二?；?coa(hmg-coa)——的任何酶(參見圖6)。hmg-coa合酶是甲羥戊酸途徑的一部分。已經(jīng)鑒定了合成異戊烯基焦磷酸(ipp)的兩種途徑，即甲羥戊酸途徑和甘油醛3-磷酸-丙酮酸途徑。hmg-coa合酶催化乙?；?coa與乙酰乙?；?coa的生物claisen縮合，其是?；s合酶超家族的成員，該家族包括β-酮硫解酶(ketothiolases)、脂肪酸合酶(β-酮脂酰載體蛋白合酶)和聚酮化合物合酶(polyketidesynthases)。已經(jīng)描述了各種生物體的hmg-coa合酶。還可以從許多來源獲得編碼hmg-coa合酶的氨基酸和核酸序列。通常，序列僅共有低程度的總體序列同一性。例如，來自葡萄球菌屬或鏈球菌屬的酶與人和禽類的hmg-coa合酶只顯示約20％的同一性。在一些來源中，報(bào)道了細(xì)菌hmg-coa合酶及其動(dòng)物對應(yīng)物僅顯示約10％的總體序列同一性(sutherlin等人，bacteriol.184(2002),4065-4070)。然而，涉及乙?；涂s合反應(yīng)的氨基酸殘基在細(xì)菌和真核hmg-coa合酶中是保守的(campobasso等人，.biol.chem.279(2004),44883-44888)。已經(jīng)測定了三種hmg-coa合酶的三維結(jié)構(gòu)，并且對于酶促反應(yīng)至關(guān)重要的氨基酸基本上被充分表征(campobasso等人,同上引文；chun等人,j.biol.chem.275(2000),17946-17953；nagegowda等人,biochem.j.383(2004),517-527；hegardt,biochem.j.338(1999),569-582)。在真核生物中，存在兩種形式的hmg-coa合酶，即，胞質(zhì)和線粒體形式。胞質(zhì)形式在膽固醇和其它類異戊二烯的產(chǎn)生中起關(guān)鍵作用，線粒體形式參與酮體的產(chǎn)生。原則上，任何hmg-coa合酶可以在本發(fā)明的上下文中使用，特別是來自原核或真核生物體的。原核hmg-coa合酶描述于例如金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)(campobasso等人，loc.cit；uniprot登錄號q9fd87)、表皮葡萄球菌(staphylococusepidermidis)(uniprot登錄號q9fd76)、溶血葡萄球菌(staphylococcushaemolyticus)(uniprot登錄號q9fd82)、糞腸球菌(enterococcusfaecalis)(sutherlin等人,loc.cit.；unirprot登錄號q9fd7)、屎腸球菌(enterococcusfaecium)(uniprot登錄號q9fd66)、肺炎鏈球菌(streptococcuspneumonia)(uniprot登錄號q9fd56)、釀膿鏈球菌(streptococcuspyogenes)(uniprot登錄號q9fd61)和熱自養(yǎng)甲烷桿菌(methanobacteriumthermoautotrophicum)(登錄號ae000857)、布氏疏螺旋體(borreliaburgdorferi)(ncbi登錄號bb0683)。其它hmg-coa合酶例如描述于wo2011/032934中。優(yōu)選的hmg-coa合酶是來自粟酒裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)的酶(uniprotp54874)。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中使用的hmg-coa合酶具有seqidno：16所示的氨基酸序列、或顯示與seqidno：16至少x％同源的氨基酸序列，并具有hmg-coa合酶的活性，其中x為30至100之間的整數(shù)，優(yōu)選為35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，其中這種酶能夠催化乙?；?coa和乙酰乙?；?coa縮合成3-羥基-3-甲基戊二酰coa。關(guān)于同一性程度的確定，同樣適用于上文已有的闡述。因此，本發(fā)明還涉及一種從乙?；?coa和乙酰乙?；?coa生產(chǎn)3-羥基-3-甲基丁酸的方法，其中首先將乙酰基-coa和乙酰乙?；?coa縮合以形成3-羥基-3-甲基戊二酰基-coa，然后將3-羥基-3-甲基戊二?；?coa轉(zhuǎn)化為3-甲基戊烯二?；?coa，然后通過脫羧反應(yīng)轉(zhuǎn)化為3-甲基巴豆?；?coa，然后進(jìn)一步酶促轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁酸，如上所述。用于生產(chǎn)3-羥基-3-甲基戊二?；?coa的乙酰乙?；?coa本身可以通過酶反應(yīng)提供。例如，乙酰乙酰基-coa可以由乙?；?coa產(chǎn)生，例如，如wo2013/057194中所述。因此，根據(jù)本發(fā)明，乙酰基-coa可以例如通過以下反應(yīng)轉(zhuǎn)化為乙酰乙?；?coa：該反應(yīng)由稱為乙?；?coac-乙酰基轉(zhuǎn)移酶的酶催化，其被歸類為ec2.3.1.9。屬于該類并且催化上述兩分子乙?；?coa轉(zhuǎn)化為乙酰乙?；?coa和coa的酶存在于所有界的生物體中，即植物、動(dòng)物、真菌、細(xì)菌等，并且已廣泛描述于文獻(xiàn)中。已經(jīng)針對多種生物體(僅舉幾個(gè)例子，例如人、擬南芥、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、丙酮丁醇梭菌和假絲酵母)測定了這些酶的核苷酸和/或氨基酸序列。原則上，任何乙?；?coac-乙?；D(zhuǎn)移酶(ec2.3.1.9)可以用于本發(fā)明的上下文中。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，酶是來自丙酮丁醇梭菌的乙?；?coa乙酰基轉(zhuǎn)移酶(uniprotp45359)。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中使用的乙?；?coa乙?；D(zhuǎn)移酶具有如seqidno：15所示的氨基酸序列、或顯示與seqidno：15至少x％同源的氨基酸序列，并具有乙?；?coa乙?；D(zhuǎn)移酶的活性，其中x為30至100之間的整數(shù)，優(yōu)選為35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，其中該酶能夠?qū)⒁阴；?coa轉(zhuǎn)化為乙酰乙?；?coa，如上文所述。關(guān)于同一性程度的確定，同樣適用于上文已有的闡述?；蛘撸峁┮阴Ｒ阴；?coa也可以通過根據(jù)以下反應(yīng)將乙?；?coa和丙二?；?coa酶促轉(zhuǎn)化為乙酰乙?；?coa來實(shí)現(xiàn)。乙?；?coa+丙二?；鵦oa→乙酰乙酰基-coa+coa+co2該反應(yīng)由稱為乙酰乙?；?coa合酶(ec2.3.1.194)的酶催化。在土壤分離的革蘭氏陽性鏈霉菌株cl190中、在用于生成萜類化合物的甲羥戊酸途徑的基因簇中鑒定了編碼該酶的基因(okamura等人，pnasusa107(2010),11265-11270,2010)。此外，最近在大腸桿菌中開發(fā)了使用該酶生成乙酰乙酰基-coa的生物合成途徑(matsumotok等人，biosci.biotechnol.biochem,75(2011),364-366)。因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，乙?；?coa到所述乙酰乙酰基-coa的酶促轉(zhuǎn)化由單一酶反應(yīng)組成，其中乙?；?coa直接轉(zhuǎn)化為乙酰乙酰基-coa。優(yōu)選地，通過使用乙?；?coa乙?；D(zhuǎn)移酶(ec2.3.1.9)來實(shí)現(xiàn)乙酰基-coa到乙酰乙?；?coa的酶促轉(zhuǎn)化，如上所述?；蛘?，乙酰乙?；?coa也可以通過酶促轉(zhuǎn)化提供，其包括兩個(gè)步驟，即，(i)乙酰基-coa到丙二?；?coa的酶促轉(zhuǎn)化；和(ii)丙二酰基-coa和乙?；?coa到乙酰乙酰基-coa的酶促轉(zhuǎn)化。優(yōu)選地，通過使用乙?；?coa羧化酶(ec6.4.1.2)實(shí)現(xiàn)乙酰基-coa到丙二?；?coa的酶促轉(zhuǎn)化。該酶催化以下反應(yīng)：乙酰基-coa+atp+co2→丙二?；?coa+adp優(yōu)選地，通過使用乙酰乙?；?coa合酶(ec2.3.1.194)實(shí)現(xiàn)丙二?；?coa和乙?；?coa到乙酰乙?；?coa的酶促轉(zhuǎn)化。原則上，在根據(jù)本發(fā)明的方法中可以應(yīng)用任何乙酰基-coa乙?；D(zhuǎn)移酶(ec2.3.1.9)、乙?；?coa羧化酶(ec6.4.1.2)和/或乙酰乙酰基-coa合酶(ec2.3.1.194)。圖7示意性地顯示了從乙酰基-coa生產(chǎn)乙酰乙?；?coa的可能方式。因此，本發(fā)明還涉及一種由乙酰基-coa產(chǎn)生3-羥基-3-甲基丁酸的方法，其中如上所述由乙?；?coa產(chǎn)生乙酰乙酰基-coa，由此產(chǎn)生的乙酰乙?；?coa然后與乙?；?coa縮合以形成3-羥基-3-甲基戊二?；?coa，其中3-羥基-3-甲基戊二?；?coa然后轉(zhuǎn)化為3-甲基戊烯二?；?coa，然后通過脫羧反應(yīng)轉(zhuǎn)化為3-甲基巴豆?；?coa，然后如上文所述進(jìn)一步酶促轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁酸。如上所述，根據(jù)上述任何方法生產(chǎn)的3-羥基-3-甲基丁酸可以進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為異丁烯，如上所述。因此，本發(fā)明還涉及一種用于生產(chǎn)異丁烯的方法，該方法包括上述任何方法的步驟，并且還包括將所產(chǎn)生的3-羥基-3-甲基丁酸轉(zhuǎn)化為異丁烯的步驟。在另一方面，本發(fā)明還涉及將3-甲基巴豆?；?coa轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁酸的方法，該方法包括以下步驟：(a)將3-甲基巴豆?；?coa酶促轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁酰基-coa；和(b)將由此產(chǎn)生的3-羥基-3-甲基丁酰基-coa進(jìn)一步酶促轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁酸。根據(jù)本發(fā)明，3-羥基-3-甲基丁?；?coa到3-羥基-3-甲基丁酸的轉(zhuǎn)化可以通過直接轉(zhuǎn)化來實(shí)現(xiàn)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，3-羥基-3-甲基丁?；?coa到3-羥基-3-甲基丁酸的轉(zhuǎn)化可以通過以下轉(zhuǎn)化來實(shí)現(xiàn)，該轉(zhuǎn)化首先包括3-羥基-3-甲基丁?；?coa到3-羥基-3-甲基丁?；姿岬霓D(zhuǎn)化，和隨后的3-羥基-3-甲基丁酰基磷酸到3-羥基-3-甲基丁酸的轉(zhuǎn)化。根據(jù)本發(fā)明，根據(jù)上述方法的步驟(a)，3-甲基巴豆酰基-coa到3-羥基-3-甲基丁?；?coa的酶促轉(zhuǎn)化可以例如通過使用以下來實(shí)現(xiàn)(i)3-羥基丙酰基-coa脫水酶(ec4.2.1.116)；(ii)3-羥基丁?；?coa脫水酶(ec4.2.1.55)；(iii)烯?；?coa水合酶(ec4.2.1.17)；(iv)3-羥基辛酰基-[?；?載體-蛋白]脫水酶(ec4.2.1.59)；(v)巴豆?；?[酰基-載體-蛋白]水合酶(ec4.2.1.58)；(vi)3-羥基癸?；?[?；?載體-蛋白]脫水酶(ec4.2.1.60)；(vii)3-羥基棕櫚?；?[?；?載體-蛋白]脫水酶(ec4.2.1.61)；(viii)長鏈烯?；?coa水合酶(ec4.2.1.74)；(ix)3-甲基戊烯二酰基-coa水合酶(ec4.2.1.18)。3-甲基巴豆酰基-coa到3-羥基-3-甲基丁?；?coa的轉(zhuǎn)化示意性地顯示在圖8中。項(xiàng)(i)至(ix)中提及的酶的特征在于它們使用具有以下最小結(jié)構(gòu)基序的天然底物：其中r1是氫原子或烷基或ch2coo-，r2是氫原子或甲基；和r3是輔酶a或酰基-載體蛋白。因此，上述酶可以分成如下兩組：i.上式中的r3是?；?載體蛋白該組包括ec4.2.1.58、ec4.2.1.59、ec4.2.1.60和ec4.2.1.61。該組的酶具有催化以下類型的反應(yīng)的共同點(diǎn)：該組的酶具有共同的結(jié)構(gòu)基序，其在interpro中稱為interproipr013114(http://www.ebi.ac.uk/interpro/entry/ipr013114)。在pfam數(shù)據(jù)庫中這些酶的登錄號是pf07977(http://pfam.sanger.ac.uk/family/pf07977)。ii.上式中的r3是輔酶a該組包括ec4.2.1.116、ec4.2.1.55、ec4.2.1.17、ec4.2.1.74和ec4.2.1.18。該組酶具有共同的結(jié)構(gòu)基序，其在interpro數(shù)據(jù)庫中稱為interproipr001753(http://www.ebi.ac.uk/interpro/entry/ipr001753)和ipr0018376(http：//www.ebi。ac.uk/interpro/entry/ipr018376)。在pfam數(shù)據(jù)庫中這些酶的登錄號是pf00378(http://pfam.sanger.ac.uk/family/pf00378)。在根據(jù)本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案中，3-甲基巴豆酰基-coa到3-羥基-3-甲基丁?；?coa的轉(zhuǎn)化通過使用3-羥基丙酰基-coa脫水酶(ec4.2.1.116)實(shí)現(xiàn)。3-羥基丙?；?coa脫水酶(ec4.2.1.116)催化以下反應(yīng)：該酶已知來自各種細(xì)菌和古細(xì)菌。因此，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用細(xì)菌3-羥基丙?；?coa脫水酶(ec4.2.1.116)，優(yōu)選來自選自以下屬的細(xì)菌或古細(xì)菌的3-羥基丙?；?coa脫水酶：生金球菌屬(metallosphaera)、硫化葉菌屬(sulfolobus)和短芽孢桿菌屬(brevibacillus)，最優(yōu)選選自銅生金球菌(metallosphaeracuprina)、勤奮生金球菌(metallosphaerasedula)、東京理工學(xué)院硫化葉菌(sulfolobustokodaii)和側(cè)孢短芽孢桿菌(brevibacilluslaterosporus)的物種。這樣的細(xì)菌3-羥基丙?；?coa脫水酶的實(shí)例是來自銅生金球菌(uniprotf4fz85；seqidno：1)、勤奮生金球菌(uniprota4yi89，teufel等人，j.bacteriol.191(2009)，4572-4581；seqidno：3)、東京理工學(xué)院硫化葉菌(uniprotf9vng3；seqidno：2)和側(cè)孢短芽孢桿菌(uniprotf7ttz1；seqidno：6)。這些酶的氨基酸和核苷酸序列是可獲得的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中使用的3-羥基丙酰基-coa脫水酶具有seqidno：1至3或6中任一個(gè)所示的氨基酸序列，或顯示至少x％同源于seqidno：1至3或6中的任一個(gè)的氨基酸序列，并且具有3-羥基丙?；?coa脫水酶的活性，其中x為30至100之間的整數(shù)，優(yōu)選35、40、45、50、55、60、65、70、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，其中所述酶能夠?qū)?-甲基巴豆?；?coa轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁?；?coa，如上所述。關(guān)于同一性程度的確定，同樣適用于上文已有的闡述。在根據(jù)本發(fā)明方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，3-甲基巴豆酰基-coa到3-羥基-3-甲基丁?；?coa的轉(zhuǎn)化通過使用3-羥基丁?；?coa脫水酶(ec4.2.1.55)實(shí)現(xiàn)。3-羥基丁?；?coa脫水酶(ec4.2.1.55)催化以下反應(yīng)：該反應(yīng)對應(yīng)于michael消除(michaelelimination)。3-羥基丁酰基-coa脫水酶屬于裂合酶家族，特別是斷裂碳-氧鍵的水裂合酶。該酶類的系統(tǒng)名稱是(3r)-3-羥基丁?；?coa水裂合酶(巴豆?；?coa-形成)。常用的其它名稱包括d-3-羥基丁?；o酶a脫水酶、d-3-羥基丁?；?coa脫水酶、烯?；o酶a水合酶和(3r)-3-羥基丁酰基-coa水裂合酶。該酶參與丁酸代謝。屬于該類并催化上述3-羥基丁?；o酶a轉(zhuǎn)化為巴豆?；o酶a的酶，已被描述為存在于，例如，褐家鼠(rattusnorvegicus)、深紅紅螺菌(rhodospirillumrubrum)、黃色粘球菌、微紅黃色粘球菌(myxococcusfulvus)、葉柄粘球菌(myxococcusstipitatus)、類珊瑚珊瑚球菌(corallococcuscoralloides)、橙色標(biāo)樁菌(stigmatellaauranticaca)、嗜酸熱硫化葉菌(sulfolobusacidocaldarius)和好客酸雙面菌(acidianushospitalis)中。已經(jīng)確定了這些酶的核苷酸和/或氨基酸序列。原則上，可以在本發(fā)明的上下文中使用能夠催化3-甲基巴豆酰基-coa轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁?；?coa的任何3-羥基丁?；?coa脫水酶(ec4.2.1.55)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用來自古細(xì)菌的3-羥基丁酰基-coa脫水酶，優(yōu)選來自選自硫化葉菌屬和酸雙面菌屬(acidianus)的古細(xì)菌的3-羥基丁酰基-coa脫水酶，最優(yōu)選來自選自嗜酸熱硫化葉菌和好客酸雙面菌(acidianushospitalis)的物種。這樣的細(xì)菌3-羥基丁?；?coa脫水酶的實(shí)例是來自嗜酸熱硫化葉菌(uniprotq4j8d5；seqidno：4)和來自好客酸雙面菌(acidianushospitalis)(uniprotf4b9r3；seqidno：5)的酶。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用來自粘球菌屬(myxococcus)、珊瑚球菌屬(corallococcus)或標(biāo)樁菌屬(stigmatella)的細(xì)菌的3-羥基丁?；?coa脫水酶，優(yōu)選來自物種黃色粘球菌、微紅黃色粘球菌,葉柄粘球菌、類珊瑚珊瑚球菌或橙色標(biāo)樁菌(stigmatellaaurantiaca)的3-羥基丁酰基-coa脫水酶。這種細(xì)菌3-羥基丁?；?coa脫水酶的例子是來自黃色粘球菌(uniprotq1d5y4；seqidno:7)、微紅黃色粘球菌(uniprotf8cdh2；seqidno:11)、葉柄粘球菌(uniprotl7u993；seqidno:12)、類珊瑚珊瑚球菌(uniproth8n0f4；seqidno:13)或橙色標(biāo)樁菌(uniprotq08ys1；seqidno:14)的酶。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中使用的3-羥基丁?；?coa脫水酶具有seqidno：4、5、7或11至14中任一個(gè)所示的氨基酸序列，或顯示與seqidno：4、5、7或11至14中任一個(gè)至少x％同源的氨基酸序列，并且具有3-羥基丁酰基-coa脫水酶的活性，其中x為30至100之間的整數(shù)，優(yōu)選35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，其中該酶能夠?qū)?-甲基巴豆?；?coa轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁酰基-coa，如上所述。關(guān)于同一性程度的確定，同樣適用于上文的闡述。在根據(jù)本發(fā)明方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，3-甲基巴豆?；?coa到3-羥基-3-甲基丁?；?coa的轉(zhuǎn)化通過使用烯酰基-coa水合酶(ec4.2.1.17)實(shí)現(xiàn)。烯?；?coa水合酶(ec4.2.1.17)催化以下反應(yīng)：烯?；?coa水合酶是通常使?；?coa上第二和第三碳原子之間雙鍵發(fā)生水合的酶。然而，其也可以用于在相反方向上催化該反應(yīng)。這種酶，也稱為巴豆酸酶，天然地參與代謝脂肪酸以產(chǎn)生乙?；?coa和能量。屬于這類的酶已經(jīng)被描述存在于，例如，褐家鼠(rattusnorvegicus)、人、小家鼠(musmusculus)、野豬(susscrofa)、牛(bostaurus)、大腸桿菌、丙酮丁醇梭菌和氨基丁酸梭菌(clostridiumaminobutyricum)。已經(jīng)確定了這種酶的核苷酸和/或氨基酸序列，例如，對于褐家鼠、人和枯草芽孢桿菌和炭疽芽孢桿菌(bacillusanthracis)。原則上，可以催化3-甲基巴豆?；?coa轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁?；?coa的任何烯酰基-coa水合酶(ec4.2.1.17)可以用于本發(fā)明的上下文中。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，烯酰基-coa水合酶是galactomycesreessii的烯?；?coa水合酶(dhar等人，j.ind.microbiol.biotechnol.28(2002),81-87)、枯草芽孢桿菌的烯?；?coa水合酶(uniprotg4pbc3；seqidno：8)或炭疽芽孢桿菌的烯?；?coa水合酶(uniprotq81yg6；seqidno：9)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中使用的烯?；?coa水合酶具有seqidno：8或9中任一個(gè)所示的氨基酸序列，或顯示與seqidno：8或9任何一個(gè)至少x％同源的氨基酸序列，并且具有烯酰基-coa水合酶的活性，其中x為30至100之間的整數(shù)，優(yōu)選優(yōu)選35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，其中這種酶能夠?qū)?-甲基巴豆?；?coa轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁?；?coa，如上所述。關(guān)于同一性程度的確定，同樣適用于上文的闡述。在根據(jù)本發(fā)明方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，3-甲基巴豆?；?coa到3-羥基-3-甲基丁酰基-coa的轉(zhuǎn)化通過使用3-羥基辛?；?[?；?載體-蛋白]脫水酶(ec4.2.1.59)實(shí)現(xiàn)。3-羥基辛?；?[酰基-載體-蛋白]脫水酶(ec4.2.1.59)催化以下反應(yīng)：這種酶屬于裂合酶家族，具體地?cái)嗔烟?氧鍵的水裂合酶。該酶的系統(tǒng)名稱是(3r)-3-羥基辛?；?[?；?載體-蛋白]水裂合酶(辛-2-烯酰基-[?；?載體蛋白]-形成)。常用的其它名稱包括d-3-羥基辛?；?[?；d體蛋白]脫水酶、d-3-羥基辛?；??；d體蛋白脫水酶、β-羥基辛?；?酰基載體蛋白脫水酶、β-羥基辛?；蝓ッ撍?、β-羥基辛?；?acp脫水酶、和(3r)-3-羥基辛?；?[酰基-載體-蛋白]水裂合酶。已經(jīng)描述了3-羥基辛?；?[?；?載體-蛋白]脫水酶存在于例如大腸桿菌中(mizugaki等人，biochem.biophys.res.commun.33(1968),520-527)。原則上，可以在本發(fā)明的上下文中使用能夠催化3-甲基巴豆?；?coa轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁?；?coa的任何3-羥基辛?；?[?；?載體-蛋白]脫水酶。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，來自大腸桿菌的酶用于根據(jù)本發(fā)明的方法中。在根據(jù)本發(fā)明方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，3-甲基巴豆?；?coa到3-羥基-3-甲基丁?；?coa的轉(zhuǎn)化通過使用巴豆?；?[?；?載體-蛋白]水合酶(ec4.2.1.58)實(shí)現(xiàn)。巴豆?；?[酰基-載體-蛋白]水合酶(ec4.2.1.58)催化以下反應(yīng)：這種酶屬于裂合酶家族，具體地?cái)嗔烟?氧鍵的水裂合酶。常用的其它名稱包括(3r)-3-羥基丁酰基-[?；?載體-蛋白]水裂合酶、β-羥基丁?；；d體蛋白脫水酶、β-羥基丁酰基?；d體蛋白(acp)脫水酶、β-羥基丁?；；d體蛋白脫水酶、烯?；；d體蛋白水合酶、巴豆?；；d體蛋白水合酶、3-羥基丁?；；d體蛋白脫水酶、β-羥基丁酰基?；d體和蛋白脫水酶。該酶參與脂肪酸生物合成。已經(jīng)描述了巴豆酰基-[酰基-載體-蛋白]水合酶存在于例如大腸桿菌和擬南芥(arabidopsisthaliana)中。原則上，可以催化3-甲基巴豆酰基-coa轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁?；?coa的任何巴豆?；?[酰基-載體-蛋白]水合酶可用于本發(fā)明的上下文中。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，來自大腸桿菌的酶用于根據(jù)本發(fā)明的方法中。在根據(jù)本發(fā)明方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，3-甲基巴豆酰基-coa到3-羥基-3-甲基丁?；?coa的轉(zhuǎn)化通過使用3-羥基癸酰基-[酰基-載體-蛋白]脫水酶(ec4.2.1.60)實(shí)現(xiàn)。3-羥基癸酰基-[?；?載體-蛋白]脫水酶(ec4.2.1.60)催化以下反應(yīng)：已經(jīng)描述了該酶存在于例如銅綠假單胞菌、熒光假單胞菌、剛地弓形蟲(toxoplasmagondii)、惡性瘧原蟲、幽門螺桿菌、產(chǎn)氨棒桿菌(corynebacteriumammoniagenes)、產(chǎn)氣腸桿菌(enterobacteraerogenes)、大腸桿菌、普通變形桿菌(proteusvulgaris)和腸沙門氏菌中。原則上，可以在本發(fā)明的上下文中使用能夠催化3-甲基巴豆?；?coa轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁酰基-coa的任何3-羥基癸?；?[?；?載體-蛋白]脫水酶。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，來自大腸桿菌的酶用于根據(jù)本發(fā)明的方法中。在根據(jù)本發(fā)明方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，3-甲基巴豆?；?coa到3-羥基-3-甲基丁?；?coa的轉(zhuǎn)化通過使用3-羥基棕櫚酰基-[?；?載體-蛋白]脫水酶(ec4.2.1.61)實(shí)現(xiàn)。3-羥基棕櫚酰基-[?；?載體-蛋白]脫水酶(ec4.2.1.61)催化以下反應(yīng)：這種酶屬于裂合酶家族，具體地?cái)嗔烟?氧鍵的水裂合酶。常用的其它名稱包括d-3-羥基棕櫚?；?[?；?載體-蛋白]脫水酶、β-羥基棕櫚?；?酰基載體蛋白脫水酶、β-羥基棕櫚?；蝓ッ撍浮ⅵ?羥基棕櫚?；?acp脫水酶和(3r)-3-羥基棕櫚酰基-[?；?載體-蛋白]水裂合酶。已經(jīng)描述了3-羥基棕櫚?；?[?；?載體-蛋白]脫水酶存在于例如白色念珠菌、解脂耶氏酵母、釀酒酵母、粟酒裂殖酵母(s.pombe)、炭色旋孢腔菌(cochlioboluscarbonum)、小家鼠、褐家鼠、牛、原雞和人。原則上，可以在本發(fā)明的上下文中使用能夠催化3-甲基巴豆酰基-coa轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁?；?coa的任何3-羥基棕櫚?；?[?；?載體-蛋白]脫水酶。在根據(jù)本發(fā)明方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，3-甲基巴豆?；?coa到3-羥基-3-甲基丁酰基-coa的轉(zhuǎn)化通過使用長鏈烯?；?coa水合酶(ec4.2.1.74)實(shí)現(xiàn)。長鏈烯?；?coa水合酶(ec4.2.1.74)催化以下反應(yīng)：這種酶屬于裂合酶家族，具體地?cái)嗔烟?氧鍵的水裂合酶。該酶類的系統(tǒng)名稱是長鏈-(3s)-3-羥基?；?coa水裂合酶。該酶也稱為長鏈烯?；o酶a水合酶，并且其參與線粒體中的脂肪酸延長和脂肪酸代謝。這種酶存在于許多生物體中，例如，在褐家鼠(wu等人,org.lett.10(2008),2235-2238)、野豬和豚鼠(fongandschulz,j.biol.chem.252(1977),542-547；schulz,biol.chem.249(1974),2704-2709)中，并且原則上可以催化3-甲基巴豆酰基-coa轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁?；?coa的任何長鏈烯?；?coa水合酶可用于本發(fā)明的方法中。在根據(jù)本發(fā)明方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，3-甲基巴豆酰基-coa到3-羥基-3-甲基丁?；?coa的轉(zhuǎn)化通過使用3-甲基戊烯二?；?coa水合酶(ec4.2.1.18)實(shí)現(xiàn)。3-甲基戊烯二?；?coa水合酶(ec4.2.1.18)催化以下反應(yīng)：這種酶存在于許多生物體中，特別是在細(xì)菌、植物和動(dòng)物中。該酶已有描述，例如對于惡臭假單胞菌、不動(dòng)桿菌屬物種(swissprot登錄號q3hw12)、黃長春花(catharantusroseus)、人(swissprot登錄號q13825)、牛和綿羊，并且原則上可以催化3-甲基巴豆?；?coa轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁?；?coa的任何3-甲基戊烯二酰基-coa水合酶可用于本發(fā)明的方法中。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于將3-甲基巴豆?；?coa轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁?；?coa的酶是由黃色粘球菌的liuc基因編碼的蛋白質(zhì)(li等人，angew.chem.int.ed.52(2013),1304-1308)。如上所述，可以將所產(chǎn)生的3-羥基-3-甲基丁?；?coa進(jìn)一步酶促轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁酸(步驟(b))。這種轉(zhuǎn)化可以通過直接轉(zhuǎn)化、或者可選地通過經(jīng)由3-羥基-3-甲基丁酰基磷酸的兩步反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)。在第一實(shí)施方案中，3-羥基-3-甲基丁?；?coa直接轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁酸。所產(chǎn)生的3-羥基-3-甲基丁?；?coa到3-羥基-3-甲基丁酸的酶促轉(zhuǎn)化可以例如通過使用以下實(shí)現(xiàn)(i)硫酯酶(ec3.1.2)；或(ii)coa-轉(zhuǎn)移酶(ec2.8.3)。通過硫酯酶催化的3-羥基-3-甲基丁酰基-coa到3-羥基-3-甲基丁酸的轉(zhuǎn)化，示意性地顯示在圖9中。由coa-轉(zhuǎn)移酶催化的3-羥基-3-甲基丁?；?coa到3-羥基-3-甲基丁酸的轉(zhuǎn)化，示意性地顯示在圖10中。硫酯酶和coa-轉(zhuǎn)移酶已經(jīng)在上面詳細(xì)描述，這里也適用。關(guān)于在所述的3-羥基-3-甲基丁?；?coa向3-羥基-3-甲基丁酸轉(zhuǎn)化的上下文中使用的coa-轉(zhuǎn)移酶，在此額外地，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用屬于如上所述的家族i或ii的coa-轉(zhuǎn)移酶，特別是酶復(fù)合物的α亞基。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，coa-轉(zhuǎn)移酶是檸檬酸裂合酶(ec2.8.3.10)檸蘋酸coa-轉(zhuǎn)移酶(ec2.8.3.11)或琥珀?；?coa:乙酸coa-轉(zhuǎn)移酶(ec2.8.3.18；也參見mullins等人,biochemistry51(2012),8422-34；mullins等人,j.bacteriol.190(2006),4933–4940)的α亞基。檸蘋酸coa-轉(zhuǎn)移酶(ec2.8.3.11)是催化以下反應(yīng)的酶：該酶已被描述存在于例如木糖氧化無色小桿菌(achromobacterxylosoxidans)和假破傷風(fēng)梭菌(clostridiumtetanomorphum)中。特別地，來自假破傷風(fēng)梭菌(clostridiumtetanomorhum)的酶復(fù)合物檸蘋酸裂合酶的α亞基被證明催化從檸蘋?；?coa和乙酸形成乙?；?coa和檸蘋酸(dimroth等人，eur.j.biochem.80(1977),479-477)。琥珀?；?coa:乙酸coa-轉(zhuǎn)移酶是催化以下反應(yīng)的酶：該酶已被描述存在于例如醋化醋桿菌(acetobacteraceti)、胎兒三毛滴蟲(tritrichomonasfoetus)、陰道三毛滴蟲(trichomonasvaginalis)和布氏錐蟲(trypanosomabrucei)。在第二實(shí)施方案中，首先將3-羥基-3-甲基丁?；?coa轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁?；姿?，然后將其進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁酸。反應(yīng)可概括如下：(i)3-羥基-3-甲基丁酰基-coa+h3po4→3-羥基-3-甲基丁?；姿?coa(ii)3-羥基-3-甲基丁?；姿?adp→3-羥基-3-甲基丁酸+atp因此，本發(fā)明還提供了將3-甲基巴豆?；?coa轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁酸的方法，該方法包括以下步驟：(a)將3-甲基巴豆酰基-coa酶促轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁?；?coa；和(b)將由此產(chǎn)生的3-羥基-3-甲基丁?；?coa進(jìn)一步酶促轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁?；姿?；和(c)將由此產(chǎn)生的羥基-3-甲基丁?；姿徇M(jìn)一步酶促轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁酸。3-羥基-3-甲基丁?；?coa到3-羥基-3-甲基丁酰基磷酸的轉(zhuǎn)化可以例如通過使用磷酸丁?；D(zhuǎn)移酶(ec2.3.1.19)或磷酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶(ec2.3.1.8)實(shí)現(xiàn)。磷酸丁?；D(zhuǎn)移酶(ec2.3.1.19)天然催化以下反應(yīng)wiesenborn等人(appl.environ.microbiol.55(1989),317-322)和ward等人(j.bacteriol.181(1999),5433-5442)已經(jīng)描述了，除丁酰基-輔酶a(丁?；?coa)以外，磷酸丁酰基轉(zhuǎn)移酶(ec2.3.1.19)還可以利用許多底物，特別是乙?；?coa、丙?；?coa、異丁?；?coa、戊?；?coa和異戊?；?coa。該酶已被描述存在于許多生物體中，特別是在細(xì)菌和原生動(dòng)物中。在一個(gè)實(shí)施方案中，該酶來自原生動(dòng)物dasytricharuminantium。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，磷酸丁酰基轉(zhuǎn)移酶是來自細(xì)菌的磷酸丁?；D(zhuǎn)移酶，優(yōu)選來自芽孢桿菌屬、丁酸弧菌屬、腸球菌屬或梭菌屬的細(xì)菌，更優(yōu)選來自腸球菌屬或梭菌屬的細(xì)菌，甚至更優(yōu)選來自巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、溶纖維丁酸弧菌、丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、丁酸梭菌、科氏梭菌、糖丁醇梭菌、生孢梭菌或糞腸球菌。最優(yōu)選地，酶來自枯草芽孢桿菌(菌株168)(uniprot登錄號p54530)、丙酮丁醇梭菌(uniprot登錄號f0k6w0)或來自糞腸球菌mtup9(uniprot登錄號k4yre8或uniprot登錄號a0a038bnc2)。可獲得的uniprot登錄號k4yre8和uniprot登錄號a0a038bnc2下的來自糞腸球菌的磷酸丁?；D(zhuǎn)移酶的序列具有99.3％的序列同源性。可獲得的uniprot登錄號a0a038bnc2下的來自糞腸球菌的磷酸丁?；D(zhuǎn)移酶的序列是更優(yōu)選的。如上所述，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，酶是來自枯草芽孢桿菌(菌株168)的磷酸丁?；D(zhuǎn)移酶(ec2.3.1.19)(uniprot登錄號p54530)。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中使用的磷酸丁?；D(zhuǎn)移酶(ec2.3.1.19)具有如seqidno：28所示的氨基酸序列、或顯示與seqidno：28至少x％同源的氨基酸序列，并且具有磷酸丁?；D(zhuǎn)移酶的活性，其中x為30至100之間的整數(shù)，優(yōu)選為35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，其中這種酶能夠?qū)?-羥基-3-甲基丁?；?coa轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁酰基磷酸，如上所述。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，如上所述，酶是來自糞腸球菌mtup9的磷酸丁?；D(zhuǎn)移酶(ec2.3.1.19)(uniprot登錄號k4yre8或uniprot登錄號a0a038bnc2)。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中使用的磷酸丁?；D(zhuǎn)移酶(ec2.3.1.19)具有如seqidno：29所示的氨基酸序列，或顯示與seqidno：29至少x％同源的氨基酸序列，并且具有磷酸丁?；D(zhuǎn)移酶的活性，其中x為30至100之間的整數(shù)，優(yōu)選為35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，其中這種酶能夠?qū)?-羥基-3-甲基丁?；?coa轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁酰基磷酸，如上所述。關(guān)于同一性程度的確定，同樣適用于上文的闡述。磷酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶(ec2.3.1.8)天然催化以下反應(yīng)veit等人已經(jīng)描述了(j.biotechnol.140(2009),75-83)磷酸乙?；D(zhuǎn)移酶也可以用丁?；?coa或丙酰基-coa作底物。interpro數(shù)據(jù)庫中該酶家族的登錄號為ipr012147和ipr002505(http://www.ebi.ac.uk/interpro/entry/ipr012147http://www.ebi.ac.uk/interpro/entry/ipr002505)也參見http://pfam.sanger.ac.uk/family/pf01515該酶已經(jīng)描述于多種生物體中，特別是細(xì)菌和真菌。因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，酶是來自細(xì)菌的酶，優(yōu)選埃希氏菌屬(escherichia)、chlorogonium、梭菌屬(clostridium)、韋榮氏球菌屬(veillonella)、甲烷八疊球菌屬(methanosarcina)、棒桿菌屬(corynebacterium)、魯杰氏菌屬(ruegeria)、沙門氏菌屬(salmonella)、固氮菌屬(azotobacter)、慢生根瘤菌屬(bradorhizobium)、乳桿菌屬(lactobacillus)、穆爾氏菌屬(moorella)、紅假單胞菌屬(rhodopseudomonas)、中華根瘤菌屬(sinorhizobium)、鏈球菌屬(streptococcus)、熱袍菌屬(thermotoga)或芽孢桿菌屬，更優(yōu)選大腸桿菌、chlorogoniumelongatum、科氏梭菌(clostridiumkluyveri)、丙酮丁醇梭菌(clostridiumacetobutylicum)、尿酸梭菌(clostridiumacidurici)、小韋榮氏球菌(veillonellaparvula)、嗜熱甲烷八疊球菌(methanosarcinathermophila)、谷氨酸棒桿菌(corynebacteriumglutamicum)、帕氏魯杰菌(ruegeriapomeroyi)、腸沙門氏菌(salmonellaenterica)、棕色固氮菌(azotobactervinelandii)、大豆慢生根瘤菌、發(fā)酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)、舊金山乳桿菌(lactobacillussanfranciscensis)、熱醋穆爾氏菌(moorellathermoacetica)、沼澤紅假單胞菌(rhodopseudomonaspalustris)、苜蓿中華根瘤菌(sinorhizobiummeliloti)、釀膿鏈球菌(streptococcuspyogenes)、海熱袍菌(thermotogamaritima)或枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，酶是來自真菌的酶，優(yōu)選來自酵母屬，更優(yōu)選來自釀酒酵母。3-羥基-3-甲基丁基酰磷酸到3-羥基-3-甲基丁酸的轉(zhuǎn)化可以例如通過使用丁酸激酶(ec2.7.2.7)、支鏈脂肪酸激酶(例如，ec2.7.2.14)、丙酸激酶(ec2.7.2.15)或乙酸激酶(ec2.7.2.1)實(shí)現(xiàn)。丁酸激酶(ec2.7.2.7)天然催化以下反應(yīng)例如，hartmanis(j.biol.chem.262(1987),617-621)已經(jīng)描述了，除了丁酸以外，丁酸激酶還可以使用許多底物，例如，戊酸、異丁酸、異戊酸和乙烯乙酸。該酶已經(jīng)描述于多種生物體，特別是細(xì)菌中。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，酶來自細(xì)菌，優(yōu)選來自梭菌屬、丁酸弧菌屬、熱袍菌屬、腸球菌屬、乳桿菌屬或地芽孢桿菌屬的細(xì)菌。優(yōu)選梭菌屬、乳桿菌屬或地芽孢桿菌屬的細(xì)菌。更優(yōu)選地，所述酶來自丙酮丁醇梭菌、解蛋白梭菌(clostridiumproteoclasticum)、酪丁酸梭菌(clostridiumtyrobutyricum)、丁酸梭菌、巴氏梭菌(clostridiumpasteurianum)、假破傷風(fēng)梭菌(clostridiumtetanomorphum)、溶纖維丁酸弧菌(butyrivibriofirbrosolvens)、洪氏丁酸弧菌(butyrivibriohungatei)、海熱袍菌(thermotogamaritime)、耐久腸球菌(enterococcusdurans)、干酪乳桿菌(lactobacilluscasei)(uniprot登錄號k0n529)或地芽孢桿菌(geobacillussp.)(uniprot登錄號l8a0e1)。優(yōu)選丙酮丁醇梭菌、干酪乳桿菌w56或地芽孢桿菌ghh01。對于丙酮丁醇梭菌，已經(jīng)描述了兩種丁酸激酶：丁酸激酶1(uniprot登錄號：q45829)和丁酸激酶ii(uniprot登錄號：q97ii19)如上所述，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，酶是來自干酪乳桿菌w56的丁酸激酶(ec2.7.2.7)(uniprot登錄號k0n529)。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中使用的丁酸激酶(ec2.7.2.7)具有seqidno：30所示的氨基酸序列或顯示與seqidno：30至少x％同源的氨基酸序列，并且具有丁酸激酶的活性，其中x為30至100之間的整數(shù)，優(yōu)選為35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，其中這種酶能夠?qū)?-羥基-3-甲基丁酰基磷酸轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁酸，如上所述。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，酶是來自地芽孢桿菌ghh01的丁酸激酶(ec2.7.2.7)(uniprot登錄號l8a0e1)。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中使用的丁酸激酶(ec2.7.2.7)具有如seqidno：31所示的氨基酸序列或顯示與seqidno：31至少x％同源的氨基酸序列，并且具有丁酸激酶的活性，其中x為30至100之間的整數(shù)，優(yōu)選為35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，其中這種酶能夠?qū)?-羥基-3-甲基丁?；姿徂D(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁酸，如上所述。支鏈脂肪酸激酶(ec2.7.2.14)天然催化以下反應(yīng)該酶已被描述存在于許多細(xì)菌中。因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該酶是來自細(xì)菌的酶，優(yōu)選來自螺旋體屬或熱袍菌屬，更優(yōu)選海熱袍菌的酶。丙酸激酶(ec2.7.2.15)天然催化以下反應(yīng)該酶已被描述存在于許多細(xì)菌中，特別是腸桿菌科(enterobacteriacea)中。因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，酶是來自細(xì)菌的酶，優(yōu)選來自沙門氏菌屬或埃希氏菌屬，更優(yōu)選來自腸沙門氏菌或大腸桿菌。乙酸激酶(ec2.7.2.1)天然催化以下反應(yīng)已經(jīng)描述了該酶存在于許多生物體中，特別是細(xì)菌和真核生物中。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，酶是來自細(xì)菌的酶，優(yōu)選來自甲烷八疊球菌屬(methanosarcina)、隱球菌屬(cryptococcus)、產(chǎn)乙醇菌屬(ethanoligenens)、丙酸桿菌屬(propionibacterium)、玫瑰變色菌屬(roseovarius)、鏈球菌屬(streptococcus)、沙門氏菌屬(salmonella)、無膽甾原體屬(acholeplasma)、不動(dòng)桿菌屬(acinetobacter)、ajellomyces、芽孢桿菌屬(bacillus)、疏螺旋體屬(borrelia)、毛殼屬(chaetomium)、梭菌屬(clostridium)、coccidioides、coprinopsis，隱球菌屬(cryptococcus)、貪銅菌屬(cupriavidus)、脫硫弧菌屬(desulfovibrio)、腸球菌屬(enterococcus)、埃希氏菌屬(escherichia)、產(chǎn)乙醇菌屬(ethanoligenes)、地芽孢桿菌屬(geobacillus)、螺桿菌屬(helicobacter)、乳桿菌屬(lactobacillus)、乳球菌屬(lactococcus)、李斯特氏菌屬(listeria)、中間原體屬(mesoplasma)、穆爾氏菌屬(moorella)、支原體(mycoplasma)、大洋芽孢桿菌屬(oceanobacillus)、丙酸桿菌屬(propionibacterium)、紅假單胞菌屬(rhodospeudomonas)、玫瑰變色菌屬(roseovarius)、沙門氏菌屬(salmonella)、葡萄球菌屬(staphylococcus)、熱袍菌屬(thermotoga)或韋榮氏球菌屬(veillonella)的細(xì)菌，更優(yōu)選來自嗜熱甲烷八疊球菌(methanosarcinathermophila)、新型隱球菌(cryptococcusneoformans)、哈爾濱產(chǎn)乙酸菌(ethanoligenensharbinense)、產(chǎn)丙酸丙酸桿菌(propionibacteriumacidipropionici)、肺炎鏈球菌(streptococcuspneumoniae)、內(nèi)臟鏈球菌(streptococcusenterica)、釀膿鏈球菌(streptococcuspyogenes)、萊氏無膽甾原體(acholeplasmalaidlawii)、醋酸鈣不動(dòng)桿菌(acinetobactercalcoaceticus)、ajellomycescapsulatus、枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)、布氏疏螺旋體(borreliaburgdorferi)、球毛殼(chaetomiumglobosum)、丙酮丁醇梭菌(clostridiumacetobutylicum)、熱解纖維梭菌(clostridiumthermocellum)、coccidioidesimmitis、coprinopsiscinerea、新型隱球菌(cryptococcusneoformans)、殺蟲貪銅菌(cupriavidusnecator)、普通脫硫弧菌(desulfovibriovulgaris)、糞腸球菌(enterococcusfaecalis)、大腸桿菌(escherichiacoli)、哈爾濱產(chǎn)乙醇菌(ethanoligenesharbinense)、嗜熱脂肪地芽孢桿菌(geobacillusstearothermophilus)、幽門螺桿菌(helicobacterpylori)、德氏乳桿菌(lactobacillusdelbrueckii)、嗜酸乳桿菌(lactobacillusacidophilus)、舊金山乳桿菌(lactobacillussanfranciscensis)、乳酸乳球菌(lactococcuslactis)、單核增生李斯特氏菌(listeriamonocytogenes)、花中間原體(mesoplasmaflorum)、噬乙酸甲烷八疊球菌(methanosarcinaacetivorans)、馬氏甲烷八疊球菌(methanosarcinamazei)、熱醋穆爾氏菌(moorellathermoacetica)、肺炎支原體(mycoplasmapneumoniae)、伊平屋橋大洋芽孢桿菌(oceanobacillusiheyensis)、費(fèi)氏丙酸桿菌(propionibacteriumfreudenreichii)、產(chǎn)丙酸丙酸桿菌(propionibacteriumacidipropionici)、沼澤紅假單胞菌(rhodospeudomonaspalustris)、腸沙門氏菌(salmonellaenteric)、金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、海熱袍菌(thermotogamaritime)、或小韋榮氏球菌(veillonellaparvula)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，酶是來自真菌的酶，優(yōu)選來自曲霉屬(aspergillus)、赤霉菌屬(gibberella)、肉座菌屬(hypocrea)、稻瘟病菌屬(magnaporthe)、暗球腔菌屬(phaeosphaeria)、原毛平革菌屬(phanerochaete)、疫霉屬(phytophthora)、核盤菌屬(sclerotinia)、uncinocarpus、黑粉菌屬(ustilago)或脈孢菌屬(neurospora)的真菌，更優(yōu)選來自以下物種的真菌：煙曲霉(aspergillusfumigates)、構(gòu)巢曲霉(aspergillusnidulans)、玉蜀黍赤霉(gibberellazeae)、紅褐肉座菌(hypocreajecorina)、水稻稻瘟病菌(magnaporthegrisea)、穎枯暗球腔菌(phaeosphaerianodorum)、黃孢原毛平革菌(phanerochaetechrysosporium)、橡樹疫霉(phytophthoraramorum)、大豆疫霉(phytophthorasojae)、核盤菌(sclerotiniasclerotiorum)、uncinocarpusreesii、玉蜀黍黑粉菌(ustilagomaydis)或粗糙脈孢菌(neurosporacrassa)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，酶是來自植物或藻類的酶，優(yōu)選來自衣藻屬(chlamydomonas)，甚至更優(yōu)選來自物種萊茵衣藻(chlamydomonasreinhardtii)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，酶來自內(nèi)阿米巴屬(entamoeba)的生物體，更優(yōu)選來自物種溶組織內(nèi)阿米巴菌(entamoebahistolytica)。已經(jīng)顯示，上述適于將3-羥基-3-甲基丁酰磷酸轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁酸的酶家族是進(jìn)化相關(guān)的，并且含有共有序列標(biāo)簽(signature)。這些標(biāo)簽在prosite數(shù)據(jù)庫中引用和描述：http://prosite.expasy.org/cgi-bin/prosite/nicedoc.pl？ps01075gao等人(femsmicrobiol.lett.213(2002),59-65)已經(jīng)描述了遺傳修飾的大腸桿菌細(xì)胞，尤其是已經(jīng)被分別編碼磷酸丁?；D(zhuǎn)移酶(ec2.3.1.19)和丁酸激酶(ec2.7.2.7)的丙酮丁醇梭菌的ptb基因和buk基因轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞。這些大腸桿菌細(xì)胞已經(jīng)顯示能夠產(chǎn)生d-(-)-3-羥基丁酸(3hb)。用于經(jīng)由3-羥基-3-甲基丁?；?coa轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁酸的3-甲基巴豆?；?coa本身可以通過本文上述的方法提供。因此，本發(fā)明還涉及生產(chǎn)3-羥基-3-甲基丁酸的方法，該方法包括以下步驟：將3-甲基巴豆?；?coa經(jīng)由3-羥基-3-甲基丁?；?coa轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁酸，和進(jìn)一步包括用于提供3-甲基巴豆?；?coa的任何上述進(jìn)一步的酶促步驟。所產(chǎn)生的3-羥基-3-甲基丁酸可以如上所述進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為異丁烯。因此，本發(fā)明還涉及一種生產(chǎn)異丁烯的方法，其包括上述用于生產(chǎn)3-羥基-3-甲基丁酸的方法，和進(jìn)一步地還包括將由此產(chǎn)生的3-羥基-3-甲基丁酸酶促轉(zhuǎn)化為異丁烯的步驟，如上所述。根據(jù)本發(fā)明的方法可以在體外或體內(nèi)進(jìn)行。體外反應(yīng)理解為其中不使用細(xì)胞的反應(yīng)，即無細(xì)胞反應(yīng)。因此，體外優(yōu)選是指在無細(xì)胞系統(tǒng)中。在一個(gè)實(shí)施方案中，術(shù)語“體外”是指在分離的酶(或任選包含可能需要的輔因子的酶系統(tǒng))的存在下。在一個(gè)實(shí)施方案中，在該方法中使用的酶以純化形式使用。為了在體外實(shí)施該方法，在允許酶有活性并發(fā)生酶促轉(zhuǎn)化的條件(緩沖液、溫度、共底物、輔因子等)下，孵育用于反應(yīng)的底物和酶。使反應(yīng)進(jìn)行足以產(chǎn)生相應(yīng)產(chǎn)物的時(shí)間。相應(yīng)產(chǎn)物的產(chǎn)量可以通過本領(lǐng)域已知的方法測量，如可與質(zhì)譜檢測連接的氣相色譜。酶可以是允許酶反應(yīng)發(fā)生的任何合適的形式。它們可以被純化或部分純化，或者以粗細(xì)胞提取物或部分純化的提取物的形式。也可以將酶固定在合適的載體上。在另一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法在生物(優(yōu)選微生物)存在下在培養(yǎng)中進(jìn)行，所述生物產(chǎn)生上述用于如上所述的本發(fā)明轉(zhuǎn)化方法的酶。使用微生物實(shí)施本發(fā)明方法的方法被稱為“體內(nèi)”方法?？梢允褂锰烊划a(chǎn)生上述用于根據(jù)本發(fā)明方法的轉(zhuǎn)化的酶的微生物、或者使用已經(jīng)被遺傳修飾從而表達(dá)(包括過表達(dá))一種或多種這樣的酶的微生物。因此，微生物可以是表達(dá)上述用于根據(jù)本發(fā)明方法的轉(zhuǎn)化的酶的工程化微生物，即所述微生物在其基因組中具有編碼這種酶的核苷酸序列，并且已被修飾以過表達(dá)這些酶。表達(dá)可以組成型或以誘導(dǎo)或調(diào)節(jié)的方式發(fā)生。在另一個(gè)實(shí)施方案中，微生物可以是已經(jīng)通過引入一種或多種核酸分子進(jìn)行遺傳修飾的微生物，所述核酸分子含有編碼上述用于根據(jù)本發(fā)明方法的轉(zhuǎn)化的一種或多種酶的核苷酸序列。核酸分子可以穩(wěn)定地整合到微生物的基因組中，或者可以以染色體外的方式存在，例如，在質(zhì)粒上。這種經(jīng)遺傳修飾的微生物可以是例如這樣的微生物，所述微生物并不天然表達(dá)上述用于根據(jù)本發(fā)明方法的轉(zhuǎn)化的酶，但其已經(jīng)被遺傳修飾以表達(dá)這樣的酶；或者所述微生物是天然表達(dá)這樣的酶的微生物并且其已經(jīng)被遺傳修飾，例如，用編碼相應(yīng)酶的核酸(例如載體)轉(zhuǎn)化，和/或在編碼酶的內(nèi)源核苷酸序列前插入啟動(dòng)子，以增加所述微生物中相應(yīng)的活性。然而，本發(fā)明優(yōu)選排除在自然界中發(fā)現(xiàn)的、以在自然界中的水平表達(dá)上述酶的、天然存在的微生物。相反，本發(fā)明的微生物和本發(fā)明方法中使用的微生物優(yōu)選是非天然存在的微生物，無論其是已被遺傳修飾以表達(dá)(包括過表達(dá))通常不存在于其基因組中的本發(fā)明外源性酶，或是已經(jīng)工程化以過表達(dá)外源酶。因此，與本發(fā)明相關(guān)使用的酶和(微)生物優(yōu)選是非天然存在的酶或(微生物)，即它們是與天然存在的酶或微生物顯著不同的酶或(微)生物體，其在自然界中不存在。關(guān)于酶，它們優(yōu)選是天然存在的酶的變體，其由此不是天然存在的。這樣的變體包括例如突變體，特別是通過分子生物學(xué)方法制備的突變體，其顯示出改進(jìn)的性質(zhì)，如更高的酶活性、更高的底物特異性、更高的溫度耐性等。關(guān)于(微)生物，它們優(yōu)選是如上所述的遺傳修飾的生物，其由于遺傳修飾而與天然存在的生物不同。遺傳修飾的生物是非天然存在的生物體，即其不能在自然界中被找到，并且由于引入外源核酸分子而與天然存在的生物體實(shí)質(zhì)上不同。通過過表達(dá)上文所述的外源或內(nèi)源酶，酶的濃度實(shí)質(zhì)性地高于自然界中發(fā)現(xiàn)的濃度，這然后可以意想不到地促進(jìn)使用非天然的相應(yīng)酶的本發(fā)明反應(yīng)。優(yōu)選地，過表達(dá)酶的濃度為總宿主細(xì)胞蛋白的至少5％、10％、20％、30％或40％。“非天然”底物理解為在自然界中不被相應(yīng)的酶作用的分子，即使它可能實(shí)際上與內(nèi)源性酶一起共存在于微生物中。該“非天然”底物在自然界中不被微生物轉(zhuǎn)化，因?yàn)槠渌孜锸莾?yōu)選的(例如“天然底物”)。因此，本發(fā)明考慮在非天然存在的環(huán)境中使用非天然底物與上述酶。因此，在本發(fā)明的上下文中，微生物也可以是天然不具有相應(yīng)酶活性但經(jīng)遺傳修飾而包含允許表達(dá)相應(yīng)酶的核苷酸序列的微生物。類似地，微生物也可以是天然具有相應(yīng)酶活性但被遺傳修飾以增強(qiáng)該活性的微生物，例如通過引入編碼相應(yīng)酶的外源核苷酸序列，或通過引入啟動(dòng)子用于編碼酶的內(nèi)源基因以增加內(nèi)源性生產(chǎn)至過表達(dá)(非天然)水平。如果使用天然表達(dá)相應(yīng)酶的微生物，可以修飾這樣的微生物，使得相應(yīng)活性在微生物中過表達(dá)。這可以例如通過在相應(yīng)基因的啟動(dòng)子區(qū)域中進(jìn)行突變或引入高表達(dá)啟動(dòng)子從而產(chǎn)生確?；蚋弑磉_(dá)的啟動(dòng)子來實(shí)現(xiàn)?；蛘?，還可以使基因突變以便產(chǎn)生顯示更高活性的酶。通過使用表達(dá)上述酶的微生物用于根據(jù)本發(fā)明方法的轉(zhuǎn)化，可以在培養(yǎng)基中直接進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的方法，而不需要分離或純化酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明方法中使用的生物是已經(jīng)被遺傳修飾而含有外源核酸分子的微生物，其中所述外源核酸分子編碼至少一種用于本發(fā)明方法的轉(zhuǎn)化的上述酶。在本文中，術(shù)語“外來”或“外源”意指核酸分子不天然存在于所述微生物中。這意味著，它不存在于微生物的相同結(jié)構(gòu)中或相同位置上。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，外源核酸分子是包含啟動(dòng)子和編碼相應(yīng)酶的編碼序列的重組分子，其中驅(qū)動(dòng)編碼序列表達(dá)的啟動(dòng)子相對于編碼序列是異源的。在本文中“異源”是指啟動(dòng)子不是天然驅(qū)動(dòng)所述編碼序列表達(dá)的啟動(dòng)子，而是天然驅(qū)動(dòng)不同編碼序列表達(dá)的啟動(dòng)子，即其來源于另一個(gè)基因，或是合成啟動(dòng)子或嵌合啟動(dòng)子。優(yōu)選地，啟動(dòng)子是與微生物異源的啟動(dòng)子，即天然不存在于相應(yīng)微生物中的啟動(dòng)子。甚至更優(yōu)選地，啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。用于在不同類型的生物體中，特別是在微生物中驅(qū)動(dòng)表達(dá)的啟動(dòng)子是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，核酸分子對微生物是外源的，因?yàn)榫幋a的酶對于微生物不是內(nèi)源的，即當(dāng)微生物沒有被遺傳修飾時(shí)其天然不表達(dá)該酶。換句話說，編碼的酶相對于微生物是異源的。外源核酸分子可以以染色體外形式(例如，作為質(zhì)粒)存在于微生物中，或穩(wěn)定整合在染色體中。優(yōu)選穩(wěn)定的整合。因此，遺傳修飾可以是，例如，將編碼所述酶的相應(yīng)基因整合到染色體中，或從在酶編碼序列上游含有啟動(dòng)子的質(zhì)粒表達(dá)該酶，啟動(dòng)子和編碼序列優(yōu)選源自不同生物體，或是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其它方法。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“微生物”是指細(xì)菌、以及真菌，如酵母，以及藻類和古細(xì)菌。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，微生物是細(xì)菌。原則上可以使用任何細(xì)菌。在根據(jù)本發(fā)明的方法中使用的優(yōu)選細(xì)菌是芽孢桿菌屬、梭菌屬、棒桿菌屬、假單胞菌屬、發(fā)酵單胞菌屬(zymomonas)或埃希氏菌屬的細(xì)菌。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)菌屬于埃希氏菌屬，甚至更優(yōu)選屬于大腸桿菌。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)菌屬于惡臭假單胞菌種或運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌種(zymomonasmobilis)或?qū)儆诠劝彼岚魲U菌種或枯草芽孢桿菌種。還可以使用嗜極端細(xì)菌如嗜熱棲熱菌(thermusthermophilus)，或來自梭菌(clostridiae)的厭氧細(xì)菌。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，微生物是真菌，更優(yōu)選酵母屬、裂殖酵母屬、曲霉屬、木霉屬、克魯維酵母屬或畢赤酵母屬的真菌，甚至更優(yōu)選釀酒酵母、粟酒裂殖酵母、黑曲霉、里氏木霉(trichodermareesei)、馬克斯克魯維酵母(kluyveromycesmarxianus)、乳酸克魯維酵母(kluyveromyceslactis)、巴斯德畢赤酵母(pichiapastoris)、圓畢赤酵母(pichiatorula)或產(chǎn)朊畢赤酵母(pichiautilis)的菌種。在另一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法利用表達(dá)至少一種用于如上本發(fā)明轉(zhuǎn)化的酶的光合微生物。優(yōu)選地，微生物是光合細(xì)菌或微藻。在另一個(gè)實(shí)施方案中，微生物是藻類，更優(yōu)選屬于硅藻類(diatomeae)的藻。還可以想到在根據(jù)本發(fā)明的方法中使用微生物的組合，其中不同的微生物表達(dá)如上所述的不同的酶。下面還將進(jìn)一步詳細(xì)描述表達(dá)感興趣的酶的微生物的遺傳修飾。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括步驟：提供生物，優(yōu)選提供(細(xì)胞)培養(yǎng)物形式(優(yōu)選，液體細(xì)胞培養(yǎng)物形式)的、帶有相應(yīng)酶活性(一種或多種)的微生物；隨后在允許相應(yīng)酶表達(dá)的合適條件下在發(fā)酵罐(通常也稱為生物反應(yīng)器)中培養(yǎng)生物(優(yōu)選微生物)；并且還包括步驟：實(shí)施如上文所述的本發(fā)明方法的酶促轉(zhuǎn)化。合適的發(fā)酵罐或生物反應(yīng)器裝置和發(fā)酵條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。生物反應(yīng)器或發(fā)酵罐是指本領(lǐng)域已知的支持生物活性環(huán)境的任何生產(chǎn)的或工程化的裝置或系統(tǒng)。因此，生物反應(yīng)器或發(fā)酵罐可以是容器，在其中進(jìn)行化學(xué)/生物化學(xué)如本發(fā)明方法，其中所述化學(xué)/生物化學(xué)涉及生物體，優(yōu)選微生物和/或生物化學(xué)活性物質(zhì)，即源自這些生物的上述酶或包含上述酶的生物。在生物反應(yīng)器或發(fā)酵罐中，該過程可以是需氧的或厭氧的。這些生物反應(yīng)器通常是圓柱形的，并且尺寸可以從升到立方米，并且通常由不銹鋼制成。在這方面，不受理論的束縛，發(fā)酵罐或生物反應(yīng)器可以以適于在例如分批培養(yǎng)、補(bǔ)料分批培養(yǎng)、灌注培養(yǎng)或恒化培養(yǎng)中培養(yǎng)生物體(優(yōu)選微生物)的方式設(shè)計(jì)，所有這些都是本領(lǐng)域公知的。培養(yǎng)基可以是適于培養(yǎng)相應(yīng)生物體或微生物的任何培養(yǎng)基。根據(jù)本發(fā)明的方法中使用的酶可以是天然存在的酶或源自天然存在的酶的酶，例如，通過引入突變或其它改變，例如改變或改善酶活性、穩(wěn)定性等。用于修飾和/或改善蛋白質(zhì)的期望酶活性的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，包括例如隨機(jī)誘變或定點(diǎn)誘變，隨后選擇具有所需性質(zhì)的酶或稱為“定向進(jìn)化”的方法。例如，對于原核細(xì)胞中的遺傳修飾，可以將編碼相應(yīng)酶的核酸分子引入質(zhì)粒，其允許通過dna序列的重組進(jìn)行誘變或序列修飾。標(biāo)準(zhǔn)方法(參見sambrookandrussell(2001),molecularcloning:alaboratorymanual,cshpress,coldspringharbor,ny,usa)允許進(jìn)行堿基交換或添加天然或合成序列。可以通過使用與片段互補(bǔ)的適體(adapters)和接頭來連接dna片段。此外，可以使用提供合適的限制性位點(diǎn)或去除多余dna或限制性位點(diǎn)的工程化手段。在那些可能進(jìn)行插入、缺失或取代的情況中，可以使用體外誘變、“引物修復(fù)”，限制或連接。通常，進(jìn)行序列分析、限制性分析和其它生物化學(xué)和分子生物學(xué)方法作為分析方法。然后可以使用如上所述的測定法，特別是針對增加的酶活性，測試所得酶變體的期望活性，例如酶活性。如上所述，在本發(fā)明的方法中使用或包含在本發(fā)明的組合物中的微生物可以是通過引入編碼相應(yīng)酶的核酸分子而被遺傳修飾的微生物。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，微生物是重組微生物，其已經(jīng)被遺傳修飾以具有增加的至少一種上述用于根據(jù)本發(fā)明方法的轉(zhuǎn)化的酶的活性。這可以例如通過用編碼相應(yīng)酶的核酸轉(zhuǎn)化微生物實(shí)現(xiàn)。下面將進(jìn)一步詳細(xì)描述微生物的遺傳修飾。優(yōu)選地，引入微生物中的核酸分子是相對于微生物是異源的核酸分子，即它不天然存在于所述微生物中。在本發(fā)明的上下文中，“增加的活性”是指，在經(jīng)遺傳修飾的微生物中酶的表達(dá)和/或活性，比相應(yīng)的未修飾的微生物中的，高至少10％、優(yōu)選至少20％、更優(yōu)選至少30％或50％、甚至更優(yōu)選至少70％或80％、特別優(yōu)選至少90％或100％。在甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案中，表達(dá)和/或活性的增加可以為至少150％、至少200％或至少500％。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，與相應(yīng)的未修飾的微生物相比，表達(dá)高至少10倍、更優(yōu)選至少100倍、甚至更優(yōu)選至少1000倍。術(shù)語“增加的”表達(dá)/活性還涵蓋其中相應(yīng)的未修飾的微生物不表達(dá)相應(yīng)的酶從而在未修飾的微生物中相應(yīng)的表達(dá)/活性為零的情況。優(yōu)選地，過表達(dá)的酶的濃度為總宿主細(xì)胞蛋白的至少5％、10％、20％、30％或40％。用于測量細(xì)胞中給定蛋白質(zhì)的表達(dá)水平的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。在一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)水平的測量通過測量相應(yīng)蛋白質(zhì)的量來進(jìn)行。相應(yīng)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，包括westernblot，elisa等。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過測量相應(yīng)rna的量，進(jìn)行表達(dá)水平的測量。相應(yīng)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，包括例如northernblot。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“重組”是指，與野生型或非修飾的微生物相比，微生物被遺傳修飾以包含編碼如上定義的酶的核酸分子。編碼如上定義的酶的核酸分子可以單獨(dú)使用或作為載體的一部分使用。核酸分子還可以包含與包含在該核酸分子中的多核苷酸可操作地連接的表達(dá)控制序列。如本說明書通篇使用的術(shù)語“可操作地連接”或“可操作地連接”是指，一個(gè)或多個(gè)表達(dá)控制序列與待表達(dá)的多核苷酸中的編碼區(qū)之間的連接，使得在與表達(dá)控制序列相容的條件下可以實(shí)現(xiàn)表達(dá)。表達(dá)包括異源dna序列的轉(zhuǎn)錄，優(yōu)選轉(zhuǎn)錄成可翻譯的mrna。確保在真菌以及細(xì)菌中表達(dá)的調(diào)節(jié)元件是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。它們包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止信號、靶向信號等。下面結(jié)合有關(guān)載體的解釋，進(jìn)一步給出實(shí)例。用于與核酸分子有關(guān)的啟動(dòng)子就其來源和/或就待表達(dá)的基因而言可以是同源或異源的。合適的啟動(dòng)子是例如引起組成型表達(dá)的啟動(dòng)子。然而，也可以使用僅在由外部影響決定的時(shí)間點(diǎn)上活化的啟動(dòng)子。人工和/或化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可用于本文。載體可以進(jìn)一步包含與載體中所含的所述多核苷酸可操作地連接的表達(dá)控制序列。這些表達(dá)控制序列可以適合于確?？煞g的rna在細(xì)菌或真菌中的轉(zhuǎn)錄和合成。此外，可以通過分子生物學(xué)中常用的方法(參見例如sambrook和russell(2001)，molecularcloning：alaboratorymanual，cshpress，coldspringharbor，ny，usa)，將不同的突變插入到多核苷酸中，導(dǎo)致可能具有修飾的生物學(xué)性質(zhì)的多肽的合成?？梢韵氲剑谌缦挛恢锰幰朦c(diǎn)突變，在該位置處氨基酸序列的修飾將例如影響多肽的生物活性或多肽的調(diào)節(jié)。此外，可以制備具有修飾的底物或產(chǎn)物特異性的突變體。優(yōu)選地，這種突變體顯示出增加的活性?；蛘撸梢灾苽淦浯呋钚员煌耆茐亩粏适У孜锝Y(jié)合活性的突變體。此外，可以將突變引入編碼如上所定義的酶的多核苷酸中，以允許減少或增加所述多核苷酸編碼的酶的基因表達(dá)速率和/或活性。為了遺傳修飾細(xì)菌或真菌，可以將編碼如上定義的酶或這些分子的部分的多核苷酸引入允許通過dna序列重組進(jìn)行誘變或序列修飾的質(zhì)粒中。標(biāo)準(zhǔn)方法(參見sambrook和russell(2001)，molecularcloning：alaboratorymanual，cshpress，coldspringharbor，ny，usa)允許進(jìn)行堿基交換或添加天然或合成序列。dna片段可以通過對片段應(yīng)用適體和接頭而彼此連接。此外，可以使用工程化手段來提供合適的限制性位點(diǎn)或去除多余的dna或限制性位點(diǎn)。在那些可能進(jìn)行插入、缺失或取代的情況中，可以使用體外誘變、“引物修復(fù)”、限制或連接。通常，進(jìn)行序列分析、限制性分析和其它生物化學(xué)和分子生物學(xué)方法作為分析方法。因此，根據(jù)本發(fā)明，可以通過遺傳修飾真菌或細(xì)菌，包括將上述多核苷酸、核酸分子或載體引入真菌或細(xì)菌中，來生產(chǎn)重組微生物，。表達(dá)編碼相應(yīng)酶的多核苷酸，從而導(dǎo)致產(chǎn)生具有上述任何活性的多肽。不同表達(dá)系統(tǒng)的綜述參見例如methodsinenzymology153(1987)，385-516，bitter等人(methodsinenzymology153(1987)，516-544)和sawers等人(appliedmicrobiologyandbiotechnology46(1996)，1-9)，billman-jacobe(currentopinioninbiotechnology7(1996)，500-4)，hockney(trendsinbiotechnology12(1994)，456-463)，griffiths等人(methodsinmolecularbiology75(1997)，427-440)。酵母表達(dá)系統(tǒng)的綜述參見例如hensing等人(antonievanleuwenhoek67(1995)，261-279)，bussineau等人(developmentsinbiologicalstandardization83(1994)，13-19)，gellissen等人(antonievanleuwenhoek62(1992)，79-93，fleer(currentopinioninbiotechnology3(1992)，486-496)，vedvick(currentopinioninbiotechnology2(1991)，742-745)和buckholz(bio/technology9(1991)，1067-1072)。表達(dá)載體已經(jīng)在文獻(xiàn)中廣泛描述。通常，它們不僅包含選擇標(biāo)記基因和確保在所選宿主中復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)，而且包含細(xì)菌或病毒啟動(dòng)子，并且在大多數(shù)情況下包含用于轉(zhuǎn)錄的終止信號。在啟動(dòng)子和終止信號之間通常存在至少一個(gè)能夠插入編碼dna序列的限制性位點(diǎn)或多接頭。天然控制相應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄的dna序列，如果它在所選宿主生物體中具有活性，則可用作啟動(dòng)子序列。然而，該序列也可以換成其它啟動(dòng)子序列?？梢允褂么_?；蚪M成型表達(dá)的啟動(dòng)子和允許有意控制基因表達(dá)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。具有這些性質(zhì)的細(xì)菌和病毒啟動(dòng)子序列在文獻(xiàn)中有詳細(xì)描述。在文獻(xiàn)中充分描述了在微生物(例如大腸桿菌、釀酒酵母)中用于表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。允許下游序列的特別高表達(dá)的啟動(dòng)子是例如t7啟動(dòng)子(studier等人，methodsinenzymology185(1990)，60-89)，lacuv5、trp、trp-lacuv5(deboer等人，inrodriguez和chamberlin(eds)，promoters，structureandfunction；praeger，newyork，(1982)，462-481；deboer等，proc.natl.acad.sci.usa(1983)，21-25)，lp1、rac(boros等人，gene42(1986)，97-100)。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子優(yōu)選用于多肽的合成。這些啟動(dòng)子通常導(dǎo)致比組成型啟動(dòng)子更高的多肽產(chǎn)量。為了獲得多肽的最佳量，通常使用兩階段方法。首先，將宿主細(xì)胞在最佳條件下培養(yǎng)至相對高的細(xì)胞密度。在第二步中，根據(jù)所用啟動(dòng)子的類型，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄。在這方面，tac啟動(dòng)子是特別合適的，其可以被乳糖或iptg(＝異丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷)誘導(dǎo)(deboer等人，proc.natl.acad.sci.usa80(1983),21-25)。用于轉(zhuǎn)錄的終止信號也描述在文獻(xiàn)中。用如上所述的多核苷酸或載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行，例如sambrookandrussell(2001),molecularcloning:alaboratorymanual,cshpress,coldspringharbor,ny,usa；methodsinyeastgenetics,alaboratorycoursemanual,coldspringharborlaboratorypress,1990。宿主細(xì)胞培養(yǎng)在營養(yǎng)培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基將滿足所使用的特定宿主細(xì)胞的要求，特別是在ph值、溫度、鹽濃度、通氣、抗生素、維生素、微量元素等方面。本發(fā)明還涉及-硫酯酶(ec3.1.2)或表達(dá)硫酯酶(ec3.1.2)的生物；或-coa-轉(zhuǎn)移酶(ec2.8.3)或表達(dá)coa-轉(zhuǎn)移酶(ec2.8.3)的生物用于將3-甲基巴豆?；?coa酶促轉(zhuǎn)化為3-甲基巴豆酸的用途。關(guān)于所述的硫酯酶和coa-轉(zhuǎn)移酶及微生物，適用上文就本發(fā)明方法所作出的描述。本發(fā)明還涉及如下組合用于將3-甲基巴豆?；?coa轉(zhuǎn)化為3-甲基巴豆酸的用途，所述組合包含：-磷酸丁酰基轉(zhuǎn)移酶(ec2.3.1.19)和/或磷酸乙?；D(zhuǎn)移酶(ec2.3.1.8)；和-磷酸轉(zhuǎn)移酶(ec2.7.2)，優(yōu)選丁酸激酶(ec2.7.2.7)、支鏈脂肪酸激酶(ec2.7.2.14)、丙酸激酶(ec2.7.2.15)和/或乙酸激酶(ec2.7.2.1)。此外，本發(fā)明涉及如下組合用于將3-甲基巴豆?；?coa轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁酸的用途，所述組合包含：-硫酯酶(ec3.1.2)和/或coa-轉(zhuǎn)移酶(ec2.8.3)；和-水裂合酶(ec4.2.1)；或包含-磷酸丁酰基轉(zhuǎn)移酶(ec2.3.1.19)和/或磷酸乙?；D(zhuǎn)移酶(ec2.3.1.8)；和-磷酸轉(zhuǎn)移酶(ec2.7.2)，優(yōu)選丁酸激酶(ec2.7.2.7)、支鏈脂肪酸激酶(ec2.7.2.14)、丙酸激酶(ec2.7.2.15)和/或乙酸激酶(ec2.7.2.1)；和-水裂合酶(ec4.2.1)。關(guān)于所述的硫酯酶和coa-轉(zhuǎn)移酶以及水合酶/脫水酶和微生物，適用上文就本發(fā)明方法所作出的闡述。本發(fā)明還涉及如下組合用于將3-甲基巴豆酰基-coa轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁酸的用途，所述組合包含：-表達(dá)硫酯酶(ec3.1.2)和/或coa-轉(zhuǎn)移酶(ec2.8.3)的生物；和-表達(dá)水裂合酶(ec4.2.1)的生物，或包含-表達(dá)磷酸丁?；D(zhuǎn)移酶(ec2.3.1.19)和/或磷酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶(ec2.3.1.8)；和磷酸轉(zhuǎn)移酶(ec2.7.2)，優(yōu)選丁酸激酶(ec2.7.2.7)、支鏈脂肪酸激酶(ec2.7.2.14)、丙酸激酶(ec2.7.2.15)和/或乙酸激酶(ec2.7.2.1)的生物；和-表達(dá)水裂合酶(ec4.2.1)的生物。此外，本發(fā)明涉及生物用于將3-甲基巴豆酰基-coa轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁酸的用途，所述生物表達(dá)：-硫酯酶(ec3.1.2)和/或coa-轉(zhuǎn)移酶(ec2.8.3)；和-水裂合酶(ec4.2.1)，或所述生物表達(dá)：-磷酸丁?；D(zhuǎn)移酶(ec2.3.1.19)和/或磷酸乙?；D(zhuǎn)移酶(ec2.3.1.8)；和-磷酸轉(zhuǎn)移酶(ec2.7.2)，優(yōu)選丁酸激酶(ec2.7.2.7)、支鏈脂肪酸激酶(ec2.7.2.14)、丙酸激酶(ec2.7.2.15)和/或乙酸激酶(ec2.7.2.1)；和-水裂合酶(ec4.2.1)。關(guān)于上述實(shí)施方案，對于硫酯酶和coa-轉(zhuǎn)移酶以及水合酶/脫水酶和微生物，同樣適用于上文就本發(fā)明方法所作出的描述。本發(fā)明還涉及如下組合用于將3-甲基巴豆?；?coa酶促轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁酸的用途，所述組合包含：(a)選自以下的酶：(i)3-羥基丙?；?coa脫水酶(ec4.2.1.116)；(ii)3-羥基丁?；?coa脫水酶(ec4.2.1.55)；(iii)烯?；?coa水合酶(ec4.2.1.17)；(iv)3-羥基辛?；?[?；?載體-蛋白]脫水酶(ec4.2.1.59)；(v)巴豆?；?[?；?載體-蛋白]水合酶(ec4.2.1.58)；(vi)3-羥基癸?；?[酰基-載體-蛋白]脫水酶(ec4.2.1.60)；(vii)3-羥基棕櫚酰基-[?；?載體-蛋白]脫水酶(ec4.2.1.61)；(viii)長鏈烯酰基-coa水合酶(ec4.2.1.74)；和(ix)3-甲基戊烯二?；?coa水合酶(ec4.2.1.18)和(b)磷酸丁酰基轉(zhuǎn)移酶(ec2.3.1.19)和/或磷酸乙?；D(zhuǎn)移酶(ec2.3.1.8)；和(c)磷酸轉(zhuǎn)移酶(ec2.7.2)。本發(fā)明還涉及如下組合用于將3-甲基巴豆酰基-coa轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁酸的用途，所述組合包含：-表達(dá)如上文(a)中所定義的酶的生物；和-表達(dá)如上文(b)中所定義的酶的生物；和-表達(dá)如上文(c)中所定義的酶的生物。此外，本發(fā)明涉及生物，所述生物表達(dá)：-如上文(a)中所定義的酶；和-如上文(b)中所定義的酶，和-如上文(c)中所定義的酶；以及所述生物用于將3-甲基巴豆?；?coa轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁酸的用途。關(guān)于上述實(shí)施方案，對于其中提及的酶和微生物，同樣適用于上文就本發(fā)明方法所作出的描述。此外，描述了一種用于生產(chǎn)3-羥基-3-甲基丁酸的方法，該方法包括步驟：將3-甲基巴豆?；?coa酶促轉(zhuǎn)化為3-甲基巴豆酸；和將由此產(chǎn)生的3-甲基巴豆酸進(jìn)一步酶促轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁酸。3-甲基巴豆酰基-coa到3-甲基巴豆酸的轉(zhuǎn)化可以通過直接轉(zhuǎn)化來實(shí)現(xiàn)，其優(yōu)選利用屬于硫酯水解酶家族(也稱為硫酯酶(ec3.1.2))的酶或?qū)儆赾oa-轉(zhuǎn)移酶家族(ec2.8.3)的酶?；蛘撸?-甲基巴豆?；?coa到3-甲基巴豆酸的轉(zhuǎn)化可以通過以下轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)，該轉(zhuǎn)化首先包括3-甲基巴豆?；?coa到3-甲基巴豆?；?磷酸的轉(zhuǎn)化，和隨后的3-甲基巴豆?；?磷酸到3-甲基巴豆酸的轉(zhuǎn)化。3-甲基巴豆酸到3-羥基-3-甲基丁酸的轉(zhuǎn)化優(yōu)選使用屬于水裂合酶(ec4.2.1)家族的酶，特別是使用烏頭酸水合酶(ec4.2.1.3)、或馬來酸水合酶(ec4.2.1.31)或2-甲基檸檬酸脫水酶(ec4.2.1.79)。因此，本發(fā)明特別涉及以下項(xiàng)：1.一種將3-甲基巴豆酰基-coa轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁酸的方法，所述方法包括以下步驟：(a)將3-甲基巴豆?；?coa酶促轉(zhuǎn)化為3-甲基巴豆酸；和(b)將由此產(chǎn)生的3-甲基巴豆酸進(jìn)一步酶促轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁酸。2.根據(jù)項(xiàng)1所述的方法，其中根據(jù)步驟(a)的3-甲基巴豆酰基-coa到3-甲基巴豆酸的酶促轉(zhuǎn)化通過使用(i)硫酯水解酶(ec3.1.2)；或(ii)coa-轉(zhuǎn)移酶(ec2.8.3)實(shí)現(xiàn)。3.根據(jù)項(xiàng)2所述的方法，其中所述硫酯酶(ec3.1.2)選自：-乙?；?coa水解酶(ec3.1.2.1)；-棕櫚?；?coa水解酶(ec3.1.2.2)；-3-羥基異丁?；?coa水解酶(ec3.1.2.4)；-油?；?[?；?載體-蛋白]水解酶(ec3.1.2.14)；-adp-依賴性短鏈?；?coa水解酶(ec3.1.2.18)；-adp-依賴性中鏈?；?coa水解酶(ec3.1.2.19)；和-?；?coa水解酶(ec3.1.2.20)。4.根據(jù)項(xiàng)2或3所述的方法，其中所述coa-轉(zhuǎn)移酶(ec2.8.3)選自：-乙酸coa-轉(zhuǎn)移酶(ec2.8.3.8)；和-丁酸-乙酰乙酸coa-轉(zhuǎn)移酶(ec2.8.3.9)。5.根據(jù)項(xiàng)1所述的方法，其中根據(jù)步驟(a)的3-甲基巴豆?；?coa到3-甲基巴豆酸的酶促轉(zhuǎn)化，通過首先將3-甲基巴豆?；?coa轉(zhuǎn)化為3-甲基巴豆酰基-磷酸，然后將由此產(chǎn)生的3-甲基巴豆?；?磷酸轉(zhuǎn)化為3-甲基巴豆酸來實(shí)現(xiàn)。6.根據(jù)項(xiàng)5所述的方法，其中3-甲基巴豆?；?coa到3-甲基巴豆?；?磷酸的轉(zhuǎn)化通過利用磷酸丁酰基轉(zhuǎn)移酶(ec2.3.1.19)或磷酸乙?；D(zhuǎn)移酶(ec2.3.1.8)實(shí)現(xiàn)。7.根據(jù)項(xiàng)5或6所述的方法，其中3-甲基巴豆酰基-磷酸到3-甲基巴豆酸的轉(zhuǎn)化通過利用磷酸轉(zhuǎn)移酶(ec2.7.2)實(shí)現(xiàn)。8.根據(jù)項(xiàng)7所述的方法，其中所述磷酸轉(zhuǎn)移酶(ec2.7.2)選自丁酸激酶(ec2.7.2.7)、支鏈脂肪酸激酶(ec2.7.2.14)、丙酸激酶(ec2.7.2.15)和乙酸激酶(ec2.7.2.1)。9.根據(jù)項(xiàng)1至8中任一項(xiàng)所述的方法，其中根據(jù)步驟(b)的3-甲基巴豆酸到3-羥基-3-甲基丁酸的酶促轉(zhuǎn)化通過使用水裂合酶(ec4.2.1)實(shí)現(xiàn)。10.根據(jù)項(xiàng)9所述的方法，其中所述水合酶/脫水酶(ec4.2.1)選自：-烏頭酸水合酶(ec4.2.1.3)；-馬來酸水合酶(ec4.2.1.31)；和-2-甲基檸檬酸脫水酶(ec4.2.1.79)。11.-硫酯水解酶(ec3.1.2)或表達(dá)硫酯水解酶(ec3.1.2)的生物；或-coa-轉(zhuǎn)移酶(ec2.8.3)或表達(dá)coa-轉(zhuǎn)移酶(ec2.8.3)的生物用于將3-甲基巴豆?；?coa酶促轉(zhuǎn)化為3-甲基巴豆酸的用途；或，包含-磷酸丁?；D(zhuǎn)移酶(ec2.3.1.19)和/或磷酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶(ec2.3.1.8)；和-磷酸轉(zhuǎn)移酶(ec2.7.2)的組合用于將3-甲基巴豆?；?coa酶促轉(zhuǎn)化為3-甲基巴豆酸的用途。12.如下組合用于將3-甲基巴豆酰基-coa轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁酸的用途，其中所述組合包含-硫酯水解酶(ec3.1.2)和/或coa-轉(zhuǎn)移酶(ec2.8.3)；和-水合酶/脫水酶(ec4.2.1)；或，包含-磷酸丁酰基轉(zhuǎn)移酶(ec2.3.1.19)和/或磷酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶(ec2.3.1.8)；和-磷酸轉(zhuǎn)移酶(ec2.7.2)；和-水裂合酶(ec4.2.1)。13.如下組合用于將3-甲基巴豆?；?coa轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁酸的用途，所述組合包含-表達(dá)硫酯水解酶(ec3.1.2)和/或coa-轉(zhuǎn)移酶(ec2.8.3)的生物；和-表達(dá)水裂合酶(ec4.2.1)的生物，或包含-表達(dá)磷酸丁?；D(zhuǎn)移酶(ec2.3.1.19)和/或磷酸乙?；D(zhuǎn)移酶(ec2.3.1.8)；和磷酸轉(zhuǎn)移酶(ec2.7.2)的生物；和-表達(dá)水裂合酶(ec4.2.1)的生物。14.生物用于將3-甲基巴豆?；?coa轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁酸的用途，所述生物表達(dá)-硫酯水解酶(ec3.1.2)和/或coa-轉(zhuǎn)移酶(ec2.8.3)；和-水裂合酶(ec4.2.1)，或所述生物表達(dá)-磷酸丁?；D(zhuǎn)移酶(ec2.3.1.19)和/或磷酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶(ec2.3.1.8)；和-磷酸轉(zhuǎn)移酶(ec2.7.2)；和-水裂合酶。15.根據(jù)項(xiàng)11至14中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述硫酯水解酶(ec3.1.2)選自：-乙?；?coa水解酶(ec3.1.2.1)；-棕櫚?；?coa水解酶(ec3.1.2.2)；-3-羥基異丁酰基-coa水解酶(ec3.1.2.4)；-油?；?[?；?載體-蛋白]水解酶(ec3.1.2.14)；-adp-依賴性短鏈?；?coa水解酶(ec3.1.2.18)；-adp-依賴性中鏈?；?coa水解酶(ec3.1.2.19)；和-?；?coa水解酶(ec3.1.2.20)。16.根據(jù)項(xiàng)11至15中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述coa-轉(zhuǎn)移酶(ec2.8.3)選自：-乙酸coa-轉(zhuǎn)移酶(ec2.8.3.8)；和-丁酸-乙酰乙酸coa-轉(zhuǎn)移酶(ec2.8.3.9)。17.項(xiàng)11至16中任一項(xiàng)的用途，其中所述磷酸轉(zhuǎn)移酶(ec2.7.2)選自丁酸激酶(ec2.7.2.7)、支鏈脂肪酸激酶(ec2.7.2.14)、丙酸激酶(ec2.7.2.15)和乙酸激酶(ec2.7.2.1)。附圖簡述圖1示意性示出了由硫酯酶催化的3-甲基巴豆?；?coa到3-甲基巴豆酸的轉(zhuǎn)化反應(yīng)。圖2示意性示出了由coa-轉(zhuǎn)移酶催化的3-甲基巴豆?；?coa到3-甲基巴豆酸的轉(zhuǎn)化反應(yīng)。圖3示意性示出了3-甲基巴豆酸到3-羥基-3-甲基丁酸的轉(zhuǎn)化反應(yīng)。圖4示出了3-甲基戊烯二?；?coa經(jīng)由脫羧反應(yīng)到3-甲基巴豆?；?coa的轉(zhuǎn)化。圖5示出了3-羥基-3-甲基戊二?；?coa到3-甲基戊烯二酰基-coa的轉(zhuǎn)化。圖6示出了乙酰基-coa和乙酰乙?；?coa縮合成3-羥基-3-甲基戊烯二酰基-coa。圖7示出了從乙?；?coa生產(chǎn)乙酰乙?；?coa的可能途徑。圖8示出了3-甲基巴豆?；?coa到3-羥基-3-甲基丁?；?coa的轉(zhuǎn)化。圖9示出了通過硫酯酶催化的3-羥基-3-甲基丁?；?coa到3-羥基-3-甲基丁酸的轉(zhuǎn)化。圖10示出了通過coa-轉(zhuǎn)移酶催化的3-羥基-3-甲基丁?；?coa到3-羥基-3-甲基丁酸的轉(zhuǎn)化。圖11示出了3-甲基巴豆?；?coa到3-甲基巴豆?；?磷酸的轉(zhuǎn)化，和隨后的3-甲基巴豆?；?磷酸到3-甲基巴豆酸的轉(zhuǎn)化。圖12示出了幾種研究的酶用于3-甲基巴豆?；?coa水合的活性，其中通過記錄在263nm處3-甲基巴豆?；?coa的吸光度降低來監(jiān)測所述活性(實(shí)施例2)。圖13示出了通過3-甲基巴豆?；?coa的水合而形成3-羥基-3-甲基丁?；?coa酸(3-羥基異戊?；?coa)的時(shí)間過程，其中所述水合由來自勤奮生金球菌的3-羥基丙酰基-coa脫水酶和來自炭疽芽孢桿菌的烯?；?coa水合酶催化(實(shí)施例3)。圖14示出了，如實(shí)施例4中描述的，用來自勤奮生金球菌的3-羥基丙?；?coa脫水酶酶促水合3-甲基巴豆?；?coa所獲得的色譜圖。該試驗(yàn)用4mm3-甲基巴豆?；?coa進(jìn)行并孵育16分鐘。圖15示出了，在不同底物濃度下，作為時(shí)間的函數(shù)，3-羥基異戊?；?coa從3-甲基巴豆?；?coa的形成。該轉(zhuǎn)化由來自勤奮生金球菌的3-羥基丙酰基-coa脫水酶催化(實(shí)施例4)。圖16在a部分中示出了不同酶將3-羥基-3-甲基戊二酰基-coa轉(zhuǎn)化為3-甲基戊烯二?；?coa的百分比，其中所述酶在部分b中給出(實(shí)施例5)。圖17示出了，如實(shí)施例6中描述的，從乙?；?coa產(chǎn)生異丁烯的示例性生物化學(xué)途徑的示意圖。圖18示出了由來自枯草芽孢桿菌的磷酸丁?；D(zhuǎn)移酶催化的、從3-羥基異戊酰基-coa(3-羥基-3-甲基丁?；?coa)和磷酸產(chǎn)生的3-羥基異戊酰基磷酸(3-羥基-3-甲基丁?；姿?的質(zhì)譜(實(shí)施例9)。圖19示出了，針對a)實(shí)施例10中的酶學(xué)試驗(yàn)a；和b)實(shí)施例10中的無酶試驗(yàn)h，獲得的典型hplc-色譜圖的疊加。在hplc-色譜圖中，分析了3-羥基異戊?；?coa(3-羥基-3-甲基丁酰基-coa)和co-sh。在磷酸丁?；D(zhuǎn)移酶與丁酸激酶組合的酶學(xué)試驗(yàn)中，觀察到3-羥基異戊?；?coa(3-羥基-3-甲基丁?；?coa)的消耗，同時(shí)產(chǎn)生coa-sh。圖20示出了，針對a)酶學(xué)試驗(yàn)(試驗(yàn)a，實(shí)施例10)b)無酶試驗(yàn)(試驗(yàn)h，實(shí)施例10)，獲得的典型hplc-色譜圖的疊加。在hplc-色譜中，分析了3-羥基異戊酸、adp和atp。在磷酸丁?；D(zhuǎn)移酶與丁酸激酶組合的酶學(xué)試驗(yàn)中，觀察到adp消耗，同時(shí)產(chǎn)生atp。圖21示出了在酶學(xué)試驗(yàn)中3-羥基異戊酸(3-羥基-3-甲基丁酸)和atp的產(chǎn)生結(jié)果，其中來自枯草芽孢桿菌的磷酸丁?；D(zhuǎn)移酶與不同的丁酸激酶組合。此外，示出了如實(shí)施例10中所示的不同對照試驗(yàn)的結(jié)果。圖22示出了在酶學(xué)試驗(yàn)中3-羥基異戊酸(3-羥基-3-甲基丁酸)和atp的產(chǎn)生結(jié)果，其中來自糞腸球菌的磷酸丁?；D(zhuǎn)移酶與不同的丁酸激酶組合。此外，示出了如實(shí)施例11中所示的不同對照試驗(yàn)的結(jié)果。圖23示出了使用來自惡臭假單胞菌的酰基-coa硫酯酶ii進(jìn)行酶學(xué)試驗(yàn)所獲得的典型hplc-色譜圖的實(shí)例。圖24a示出了，針對a)酶學(xué)試驗(yàn)(試驗(yàn)a，實(shí)施例13)b)無酶試驗(yàn)(試驗(yàn)h，實(shí)施例13)獲得的典型hplc-色譜圖(分析3-甲基巴豆酰基-coa，3-甲基巴豆酸和coa-sh)的疊加。在磷酸丁?；D(zhuǎn)移酶與丁酸激酶組合的酶學(xué)試驗(yàn)中，觀察到3-甲基巴豆?；?coa的消耗，同時(shí)產(chǎn)生coa-sh和3-甲基巴豆酸。圖24b示出了，針對a)酶學(xué)試驗(yàn)(試驗(yàn)a，實(shí)施例13)b)無酶試驗(yàn)(試驗(yàn)h，實(shí)施例13)，獲得的典型hplc-色譜(分析adp和atp)的疊加。在磷酸丁?；D(zhuǎn)移酶與丁酸激酶組合的酶學(xué)試驗(yàn)中，觀察到adp的消耗，同時(shí)產(chǎn)生atp。圖25示出了，在包含來自枯草芽孢桿菌的磷酸丁?；D(zhuǎn)移酶和不同丁酸激酶的組合的酶學(xué)試驗(yàn)中，以及在不同的對照試驗(yàn)中，3-甲基巴豆酸和atp的產(chǎn)生結(jié)果。圖26示出了，在包含來自糞腸球菌的磷酸丁?；D(zhuǎn)移酶和不同丁酸激酶的組合的酶學(xué)試驗(yàn)中，以及在不同的對照試驗(yàn)中，3-甲基巴豆酸和atp的產(chǎn)生結(jié)果。在本說明書中，引用了許多文獻(xiàn)，包括專利申請。這些文獻(xiàn)的公開，雖然不被認(rèn)為與本發(fā)明的可專利性相關(guān)，但通過引用以其整體并入本文。更具體地，所有參考文獻(xiàn)通過引用并入，其程度如同每個(gè)單獨(dú)文獻(xiàn)被具體地和單獨(dú)地指明通過引用并入?，F(xiàn)在將通過參考以下實(shí)施例來描述本發(fā)明，這些實(shí)施例僅僅是舉例說明性的，而不應(yīng)被解釋為對本發(fā)明范圍的限制。實(shí)施例實(shí)施例1：酶的克隆、表達(dá)和純化基因合成、克隆和重組蛋白的表達(dá)從原核和真核生物的基因組推斷的研究酶的序列，通過串聯(lián)寡核苷酸而產(chǎn)生，以適合大腸桿菌的密碼子使用(基因由商業(yè)合成)。在甲硫氨酸起始密碼子后插入6個(gè)組氨酸密碼子以提供用于純化的親和標(biāo)簽。將如此合成的基因克隆到pet-25b(+)表達(dá)載體(由構(gòu)建的載體)中。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)熱休克步驟，用這些載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌bl21(de3)細(xì)胞(novagen)。使用zym-5052自誘導(dǎo)培養(yǎng)基(studierfw，prot.exp.pur.41，(2005)，207-234)，在30℃下振蕩(160rpm)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞6小時(shí)，并在28℃或18℃過夜繼續(xù)蛋白表達(dá)(約16小時(shí))。通過在4℃、10,000rpm離心20分鐘收集細(xì)胞，并將沉淀儲存在-80℃。蛋白純化和濃縮將來自200ml培養(yǎng)細(xì)胞的沉淀在冰上解凍，并重懸于5ml含有500mmnacl、10mmmgcl2、10mm咪唑和1mmdtt的50mmhepes緩沖液ph7.0中。加入20微升的lysonase(novagen)。將細(xì)胞在室溫下孵育10分鐘，然后放回冰上20分鐘。通過超聲處理2×30秒，完成細(xì)胞裂解。然后通過在4℃、4000rpm離心40分鐘，澄清細(xì)菌提取物。將澄清的細(xì)菌裂解物加載到protino-2000ni-ted柱(macherey-nagel)上，該柱允許吸附6-his標(biāo)記的蛋白質(zhì)。洗滌柱子，用6ml含有300mmnacl和250mm咪唑的50mmhepes緩沖液ph7.0，洗脫目的酶。然后將洗脫液濃縮，在amiconultra-410kda過濾單元(millipore)上脫鹽，將酶重懸于含有100mmnacl的50mmhepesph7.0中。由此純化的蛋白質(zhì)的純度如通過sds-page分析評估的從70％至90％變化。通過在nanodrop1000分光光度計(jì)(thermoscientific)上直接uv280nm測量、或通過bradford試驗(yàn)儀(biorad)，測定蛋白質(zhì)濃度。實(shí)施例2：使用3-甲基巴豆酰基-coa作為底物篩選一批水裂合酶用于生產(chǎn)3-羥基-3-甲基丁?；?coa(3-羥基異戊酰基-coa)合成編碼?；?coa脫水酶和烯?；?coa水合酶的基因，并根據(jù)實(shí)施例1中所述的步驟進(jìn)一步產(chǎn)生相應(yīng)的酶。在水中制備3-甲基巴豆酰基-coa(sigma-aldrich)的儲備溶液。標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)混合物含有：50mmhepesph7.00.25mm3-甲基巴豆?；?coa5mmmgcl25mmnacl0.002mg/ml純化的酶在30℃下在96孔板中進(jìn)行試驗(yàn)，總體積為0.12ml。通過加入3-甲基巴豆?；?coa，開始每個(gè)反應(yīng)。然后在spectramaxplus384uv/vis微板讀數(shù)器(moleculardevices)上，連續(xù)監(jiān)測樣品在263nm的3-甲基巴豆?；?coa吸光度的降低(fukuit等人，j.bacteriol.180(1998),667-673)。幾種酶顯示了以3-甲基巴豆?；?coa作為底物的活性(圖12)。對于沒有酶的對照試驗(yàn)，沒有觀察到263nm處吸光度的改變。實(shí)施例3：3-甲基巴豆?；?coa的酶促水合產(chǎn)物的基于hplc的分析酶學(xué)試驗(yàn)在0.2ml的總反應(yīng)體積中進(jìn)行。標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)混合物含有：50mmhepesph7.04mm3-甲基巴豆酰基-coa20mmmgcl220mmnacl0.02mg/ml來自勤奮生金球菌的純化的3-羥基丙?；?coa脫水酶(uniprot登錄號：a4yi89)或來自炭疽芽孢桿菌的純化的烯酰基-coa水合酶(uniprot登錄號：q81yg6)。試驗(yàn)在30℃下振蕩孵育0、5和30分鐘。在孵育期后，通過加入0.1ml乙腈來終止反應(yīng)。使用基于hplc的方法，定量3-羥基-3-甲基丁?；?coa(3-羥基異戊?；?coa)的量。將樣品離心，通過0.22μm過濾器過濾，將澄清的上清液轉(zhuǎn)移到干凈的小瓶中用于進(jìn)一步分析。使用配備有柱加熱模塊和uv檢測器(260nm)的1260inifinitylc系統(tǒng)(agilent)，進(jìn)行hplc分析。在zorbaxsb-aq柱(250×4.6mm，5μm粒徑，柱溫30℃)上，以1.5ml/min的流動(dòng)相流速，分離5μl樣品。使用混合的a(含有8.4mm硫酸的h2o)和b(乙腈)溶液以線性梯度(0％b在初始時(shí)間0分鐘→70％b在8分鐘)進(jìn)行分離。3-羥基異戊?；?coa由專門從事定制合成的公司(syntheval，france)按要求從3-羥基異戊酸化學(xué)合成。在這些條件下3-羥基異戊?；?coa和3-甲基巴豆?；?coa的保留時(shí)間分別為4.40和5.25分鐘。在酶學(xué)試驗(yàn)中觀察到3-羥基異戊?；?coa的顯著產(chǎn)生(圖13)。在無酶對照試驗(yàn)中沒有觀察到3-羥基異戊酰基-coa的產(chǎn)生。因此，?；?coa脫水酶和烯?；?coa水合酶能夠有效催化3-甲基巴豆?；?coa到3-羥基異戊?；?coa的水合。實(shí)施例4：3-甲基巴豆?；?coa的水合反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)研究酶學(xué)試驗(yàn)在0.2ml的總反應(yīng)體積中進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)混合物含有：50mmhepesph7.00-4mm3-甲基巴豆酰基-coa20mmmgcl220mmnacl0.01mg/ml來自勤奮生金球菌的3-羥基丙酰-coa脫水酶。將試驗(yàn)在30℃下振蕩孵育0、2、4、8、16分鐘，并通過加入100μl乙腈來終止反應(yīng)。根據(jù)實(shí)施例3中描述的基于hplc的方法，定量3-羥基異戊?；?coa的量。圖14示出了在孵育16分鐘后，使用4mm底物濃度，在酶學(xué)試驗(yàn)中獲得的典型色譜圖的實(shí)例。在圖15中顯示了，在不同底物濃度下，作為時(shí)間的函數(shù)，描繪的3-羥基異戊?；?coa的形成。發(fā)現(xiàn)來自勤奮生金球菌的3-羥基丙?；?coa脫水酶對于3-甲基巴豆?；?coa具有0.3mm的km和10s-1的kcat。實(shí)施例5：酶催化的3-羥基-3-甲基戊二?；?coa脫水成3-甲基戊烯二?；?coa合成編碼?；?coa脫水酶和烯酰基-coa水合酶的基因，并根據(jù)實(shí)施例1所述的方案進(jìn)一步生產(chǎn)相應(yīng)的酶。在水中制備3-羥基-3-甲基戊二酰基-coa的儲備溶液(sigma-aldrich)。酶學(xué)試驗(yàn)在0.2ml的總反應(yīng)體積中進(jìn)行。標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)混合物含有：50mmhepesph7.04mm3-羥基-3-甲基戊二?；?coa20mmmgcl220mmnacl0.01mg/ml純化的酶在16分鐘的孵育期后，通過加入0.1ml的乙腈來終止試驗(yàn)。將樣品離心，通過0.22μm過濾器過濾，將澄清的上清液轉(zhuǎn)移到干凈的小瓶中用于hplc分析。根據(jù)實(shí)施例3中所述的方案，進(jìn)行hplc分析。在這些條件下3-羥基-3-甲基戊二酰基-coa的保留時(shí)間為4.20分鐘。通過測量底物的消耗來跟蹤反應(yīng)進(jìn)程。幾種?；?coa脫水酶和烯酰基-coa水合酶顯示能夠催化3-羥基-3-甲基戊二?；?coa脫水成3-甲基戊烯二?；?coa(圖16)。實(shí)施例6：用于從乙?；?coa生產(chǎn)3-羥基異戊酸的微生物該實(shí)施例顯示，通過表達(dá)幾種外源基因的重組大腸桿菌生產(chǎn)3-羥基異戊酸。與大多數(shù)生物一樣，大腸桿菌將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乙?；?coa。在該研究中，根據(jù)途徑1(圖17)，用于將乙?；?coa轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁酸(又稱，3-羥基異戊酸)的酶，總結(jié)在表1中。表1在大腸桿菌中表達(dá)3-羥基異戊酸生物合成途徑使用含有修飾的多克隆位點(diǎn)的修飾版本的puc18(newenglandbiolabs)作為表達(dá)載體(puc18mcs)(wo2013/007786)。將終止子序列插入puc18mcs中hindiii和nari限制性位點(diǎn)之間，所得載體稱為pgbe1992。對相應(yīng)的基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化以在大腸桿菌中表達(dá)，并通過(lifetechnologies)合成。使用引物3211和3212，從pmk-rq-thl_adc載體(由geneart提供的主質(zhì)粒)，pcr擴(kuò)增乙?；?coa乙?；D(zhuǎn)移酶(ca_c2873)基因。在pcr產(chǎn)物的5'端引入paci限制性位點(diǎn)。在pcr產(chǎn)物的3'端引入noti限制性位點(diǎn)和clai限制性位點(diǎn)。將所得的1.6kbppcr產(chǎn)物和pgbe1992用paci和noti限制性酶消化，然后連接在一起，得到pgbe2101質(zhì)粒。通過測序驗(yàn)證重組pgbe2101質(zhì)粒。使用引物3327和3328，從pmk-t-acoadh_mx載體(由geneart提供的主質(zhì)粒)，pcr擴(kuò)增3-羥基丁?；?coa脫水酶(mxan_3757)基因。通過pcr插入ecori限制性位點(diǎn)在5'端和kpni限制性位點(diǎn)在3'端。擴(kuò)增的基因包含全長mxan_3757編碼序列，該編碼序列在甲硫氨酸起始密碼子后帶有6個(gè)組氨酸密碼子以提供用于純化的親和標(biāo)簽。將得到的0.8kbppcr產(chǎn)物用限制性酶消化，并連接到事先用ecori和kpni限制性內(nèi)切酶消化的pgbe2101質(zhì)粒中。所得質(zhì)粒稱為pgbe2326，并通過測序驗(yàn)證。用限制性酶clai和noti消化質(zhì)粒pmk-rq-aiba_aibb(geneart提供的主質(zhì)粒)以產(chǎn)生1.6kbp的產(chǎn)物。將含有mxan_4264和mxan_4265基因的1.6kbp限制性片段連接到切割的pgbe2326質(zhì)粒中。通過測序驗(yàn)證所得的重組質(zhì)粒pgbe2360。使用引物3329和3330，從pet-25b(+)-a_129(由geneart提供的主質(zhì)粒)，pcr擴(kuò)增編碼來自粟酒裂殖酵母的羥甲基戊二?；?coa合酶的hcs1基因。由此通過pcr在5'端引入noti限制性位點(diǎn)和在3'端引入hindiii限制性位點(diǎn)。擴(kuò)增的基因包含全長hcs1編碼序列，該序列在甲硫氨酸起始密碼子后帶有6個(gè)組氨酸密碼子以提供用于純化的親和標(biāo)簽。得到的1.4kbppcr產(chǎn)物用noti和hindiii限制性酶消化，并與消化的pgbe2360質(zhì)粒連接。通過測序驗(yàn)證所得質(zhì)粒pgbe2396。表2培養(yǎng)基和燒瓶發(fā)酵條件菌株mg1655大腸桿菌制成電感受態(tài)。然后用表達(dá)載體pgbe2396轉(zhuǎn)化mg1655電感受態(tài)細(xì)胞。還轉(zhuǎn)化空質(zhì)粒puc18以產(chǎn)生在試驗(yàn)中用作陰性對照的菌株。然后將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞涂布在提供有氨芐青霉素(100μg/ml)的lb平板上。將板在30℃過夜孵育。使用分離的菌落接種補(bǔ)充有氨芐青霉素的lb培養(yǎng)基，隨后在30℃下過夜孵育。將1ml該過夜培養(yǎng)物用于接種300ml的zym-5052自誘導(dǎo)培養(yǎng)基(studierfw，prot.exp.pur.41，(2005)，207-234)。將該培養(yǎng)物在30℃和160rpm振蕩下生長20小時(shí)。取出對應(yīng)于od60030的一定體積的培養(yǎng)物并離心。將沉淀重懸于30mlms培養(yǎng)基(richaudc,mengin-leucreulxd.,pochets.,johnsonej.,cohengn.andmarlièrep,thejournalofbiologicalchemistry,268,(1993),26827-26835)，該培養(yǎng)基含有葡萄糖(45g/l)和mgso4(1mm)。然后將培養(yǎng)物在160ml瓶中孵育，用螺旋蓋密封，在30℃振蕩3天。使用30％nh4oh將培養(yǎng)物的ph值調(diào)節(jié)至8.5，每天兩次。在孵育結(jié)束時(shí)，取出1ml培養(yǎng)基并在4℃、10,000rpm離心5分鐘。將上清液通過0.22μm過濾器過濾并用等體積的h2o稀釋。然后分析3-羥基異戊酸的產(chǎn)生。3-羥基異戊酸生產(chǎn)的分析使用基于hplc的方法，測量所產(chǎn)生的3-羥基異戊酸的量。使用配有柱加熱模塊和折射計(jì)的1260inifinitylc系統(tǒng)agilent，進(jìn)行hplc分析。使用如下串聯(lián)連接的3個(gè)柱，分離10μl樣品：1.hi-plex保護(hù)柱(100×7.7mm，8μm粒徑)(agilent)2.hi-plex柱(100×7.7mm，8μm粒徑)(agilent)3.zorbaxsb-aq柱(250×4.6mm，5μm粒徑，柱溫度65℃)(agilent)。流動(dòng)相由硫酸水溶液(1mm)組成，流動(dòng)相流速為1.5ml/min。使用商業(yè)3-羥基異戊酸(tci)作為參考。在這些條件下3-羥基異戊酸的保留時(shí)間為7.7分鐘。在這些搖瓶實(shí)驗(yàn)中通過工程化大腸桿菌產(chǎn)生約2.2mm3-羥基異戊酸，所述工程化大腸桿菌含有3-羥基異戊酸生物合成途徑的基因。用含有空載體的對照菌株，沒有觀察到3-羥基異戊酸的產(chǎn)生。生物反應(yīng)器發(fā)酵條件菌株大腸桿菌mg1655δagpδapha制成電感受態(tài)。然后用表達(dá)載體pgbe2396轉(zhuǎn)化電感受態(tài)細(xì)胞。然后將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞涂布在lb平板上，根據(jù)“培養(yǎng)基和燒瓶發(fā)酵條件”部分中所述的方案，制備預(yù)培養(yǎng)物。在具有ph和溫度控制的1l生物反應(yīng)器(multifors2，inforsht)中進(jìn)行發(fā)酵。使用lb培養(yǎng)基中的預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞，以0.5的初始光密度(od600)接種含有mgso4(1mm)、酵母提取物(2g/l)和氨芐青霉素(100μg/ml)的900mlms液體培養(yǎng)基。使用進(jìn)料泵，將發(fā)酵運(yùn)行中的葡萄糖濃度維持在0g/l和10g/l之間。溫度和ph保持恒定(分別為30℃和6.5)。將溶解氧維持在20％(在空氣中獲得100％)。在發(fā)酵期間取等份試樣的培養(yǎng)基，并在4℃、10000rpm離心5分鐘。然后將上清液通過0.22μm過濾器過濾并用等體積的h2o稀釋。根據(jù)上述基于hplc的方案，測量產(chǎn)生的3-羥基異戊酸的量。發(fā)酵143小時(shí)后，3-羥基異戊酸濃度達(dá)到12mm。實(shí)施例7：3-羥基異戊?；?coa到3-羥基異戊酸的酶催化水解合成編碼來自惡臭假單胞菌的?；?coa硫酯酶ii的基因，并根據(jù)實(shí)施例1中所述的步驟進(jìn)一步生產(chǎn)相應(yīng)的酶。載體pcan含有編碼來自大腸桿菌的酰基-coa硫酯水解酶ycia和?；鵦oa-硫酯酶2(tesb)的基因，該載體購自naist(narainstituteofscienceandtechnology，japan，askacollection)。提供的載體在甲硫氨酸起始密碼子后含有6個(gè)組氨酸密碼子。根據(jù)實(shí)施例1中所述的步驟進(jìn)一步生產(chǎn)相應(yīng)的酶。酶學(xué)試驗(yàn)在0.2ml的總反應(yīng)體積中進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)混合物含有：50mmhepesph7.010mm3-羥基異戊酰基-coa20mmmgcl220mmnacl1mg/ml純化的硫酯酶試驗(yàn)在30℃下振蕩孵育30分鐘，通過加入0.1ml乙腈終止反應(yīng)。根據(jù)實(shí)施例3中描述的基于hplc的方法，定量3-羥基異戊?；?coa的量。在這些條件下，3-羥基異戊?；?coa保留時(shí)間為4.40分鐘，輔酶a(coa)保留時(shí)間為3.96分鐘。觀察到3-羥基異戊?；?coa峰顯著降低，同時(shí)觀察到增加的輔酶a峰。另外，根據(jù)實(shí)施例6中所述的步驟，分析3-羥基異戊酸的生產(chǎn)。所有研究的硫酯酶均催化了3-羥基異戊?；?coa的水解，形成3-羥基異戊酸(表3)。在沒有酶的對照試驗(yàn)中沒有觀察到3-羥基異戊酸信號。表3基因名稱生物uniprot登陸號轉(zhuǎn)化,％ycia大腸桿菌p0a8z025tesb大腸桿菌p0agg252tesb惡臭假單胞菌q88dr158實(shí)施例8：重組的磷酸丁?；D(zhuǎn)移酶和丁酸激酶的克隆和過表達(dá)重組蛋白的基因合成、克隆和表達(dá)來自枯草芽孢桿菌(菌株168)和糞腸球菌mtup9的磷酸丁?；D(zhuǎn)移酶基因的序列(分別為uniprot登錄號：p54530和a0a038bnc2)和來自干酪乳桿菌w56和地芽孢桿菌ghh01的丁酸激酶(分別為uniprot登錄號：k0n529和l8a0e1)，通過寡核苷酸連接而產(chǎn)生，以適合大腸桿菌的密碼子使用(基因由商業(yè)合成)。相應(yīng)蛋白質(zhì)的表達(dá)按照實(shí)施例1中所述的方法進(jìn)行。通過在4℃、10.000rpm離心20分鐘收集細(xì)胞，并將沉淀儲存在-80℃。蛋白純化和濃縮將來自200ml培養(yǎng)細(xì)胞的沉淀在冰上解凍，并重懸于5ml含有100mmnacl、10mmmgcl2、10mm咪唑和1mmdtt的50mm磷酸鉀緩沖液ph7.5中。加入20微升的lysonase(novagen)。將細(xì)胞在室溫下孵育10分鐘，然后放回冰上20分鐘。通過超聲處理2×30秒,完成細(xì)胞裂解。然后通過在4℃、4000rpm離心40分鐘，使細(xì)菌提取物澄清。將澄清的細(xì)菌裂解物加載到protino-2000ni-ted柱(macherey-nagel)上，該柱允許吸附6-his標(biāo)簽蛋白。洗滌柱，用6ml含有100mmnacl和250mm咪唑的50mm磷酸鉀緩沖液ph7.5洗脫目的酶。然后將洗脫液濃縮，在amiconultra-410kda過濾單元(millipore)上脫鹽，將酶重懸于含有100mmnacl的50mm磷酸鉀緩沖液ph7.5中。由此純化的蛋白質(zhì)的純度如通過sds-page分析評估的，從70％至90％變化。在nanodrop1000分光光度計(jì)(thermoscientific)上通過直接uv280nm測量，或通過bradford試驗(yàn)(biorad)，測定了蛋白質(zhì)濃度。實(shí)施例9：由來自枯草芽孢桿菌的磷酸丁酰基轉(zhuǎn)移酶催化從3-羥基異戊?；?coa和磷酸形成3-羥基異戊酰基磷酸研究的酶促反應(yīng)在以下條件下進(jìn)行：50mmtris-hclph7.510mmmgcl210mmnacl10mm3-羥基異戊?；?coa(3-羥基-3-甲基丁?；?coa)將來自枯草芽孢桿菌的純化的磷酸丁酰基轉(zhuǎn)移酶重懸于5mm磷酸鉀ph7.5中。平行進(jìn)行不含酶的對照試驗(yàn)。通過向20μl反應(yīng)混合物中加入20μl酶制劑，啟動(dòng)酶學(xué)試驗(yàn)。通過質(zhì)譜(ms)分析3-羥基異戊?；姿?3-羥基-3-甲基丁酰基磷酸)的形成。通過環(huán)注射將5μl的試驗(yàn)液注入質(zhì)譜儀。使用dionexultimate色譜系統(tǒng)(thermofisherscientific)，以100μl/min的流速，進(jìn)行流動(dòng)注射分析，流動(dòng)相由含10mm甲酸銨ph9.45和乙腈75:25v/v的h2o組成。用配備有電噴霧電離源(負(fù)離子化模式，分辨率為70000m/δm，fwhm在m/z200)的q-exactive分光計(jì)(thermofisherscientific)進(jìn)行檢測。非共振誘導(dǎo)的解離實(shí)驗(yàn)——高能c阱裂解(hcd)——在10％的標(biāo)化碰撞能量下獲取。使用xcalibur版本3.0(thermofisherscientific)的qualbrowser模塊，手動(dòng)檢查原始數(shù)據(jù)。在酶學(xué)試驗(yàn)中觀察到在m/z197.0213處的新離子形成，對應(yīng)于c5h10o6p-(圖18)。使用ms/ms分析進(jìn)一步研究了該新形成的離子(m/z197.0213)的結(jié)構(gòu)解析和完全歸屬。在ms/ms實(shí)驗(yàn)下產(chǎn)生m/z值為96.968的片段離子，對應(yīng)于h2po4-物質(zhì)。因此，通過ms技術(shù)證明酶催化試驗(yàn)中3-羥基異戊酰基磷酸的產(chǎn)生。實(shí)施例10：通過來自枯草芽孢桿菌的磷酸丁酰基轉(zhuǎn)移酶和來自干酪乳桿菌或地芽孢桿菌的丁酸激酶的組合作用，催化3-羥基異戊?；?coa和adp轉(zhuǎn)化為3-羥基異戊酸和atp。酶學(xué)試驗(yàn)在0.2ml的總反應(yīng)體積中進(jìn)行。標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)混合物含有：50mm磷酸鉀緩沖液ph7.54mm3-羥基異戊?；?coa4mmadp10mmmgcl210mmnacl0.2mg/ml來自枯草芽孢桿菌的純化的磷酸丁?；D(zhuǎn)移酶0.2mg/ml來自干酪乳桿菌或地芽孢桿菌的純化的丁酸激酶平行進(jìn)行一系列對照(試驗(yàn)c-h；表4)。表4然后將試驗(yàn)在30℃下振蕩孵育20分鐘。在孵育期后，通過在90℃下加熱反應(yīng)介質(zhì)4分鐘來終止反應(yīng)。將樣品離心，通過0.22μm過濾器過濾，將澄清的上清液轉(zhuǎn)移到干凈的小瓶中用于進(jìn)一步分析。通過使用基于hplc的方法跟蹤adp和3-羥基異戊?；?coa的消耗以及atp、3-羥基異戊酸和游離輔酶a(coa-sh)的形成。adp、atp和3-羥基異戊酸的基于hplc分析使用配備柱加熱模塊和ri檢測器的1260inifinitylc系統(tǒng)(agilent)進(jìn)行hplc分析。在polarisc18-a柱(150×4.6mm，5μm粒徑，柱溫30℃)上以1.5ml/min的流動(dòng)相流速，分離2μl樣品。使用8.4mm硫酸在h2o/meoh混合溶液(99/1)(v/v)中，進(jìn)行分離。在這些條件下，adp、atp和3-羥基異戊酸的保留時(shí)間分別為2.09分鐘、2.26分鐘和5.01分鐘。3-羥基異戊酰基-coa和游離輔酶a(coa-sh)的基于hplc的分析使用配備有柱加熱模塊和uv檢測器(260nm)的1260inifinitylc系統(tǒng)(agilent)，進(jìn)行hplc分析。在zorbaxsb-aq柱(250×4.6mm，5μm粒徑，柱溫30℃)上，以1.5ml/min的流動(dòng)相流速，分離1μl樣品。使用混合的a(含有8.4mm硫酸的h2o)和b(乙腈)溶液以線性梯度(0％b在初始時(shí)間0分鐘→70％b在8分鐘)進(jìn)行分離。在這些條件下，3-羥基異戊?；?coa和游離輔酶a(coa-sh)的保留時(shí)間分別為4.53和4.10分鐘。對于酶學(xué)試驗(yàn)a和無酶試驗(yàn)h獲得的典型色譜圖顯示在圖19和20中。hplc分析的結(jié)果總結(jié)于圖21中。所獲得的數(shù)據(jù)表明，在分別由兩種酶催化的兩步反應(yīng)(試驗(yàn)a和b)中，3-羥基異戊酰基-coa被轉(zhuǎn)化為3-羥基異戊酸，同時(shí)伴隨從adp產(chǎn)生atp。因此，該轉(zhuǎn)化通過形成中間體3-羥基異戊酰基磷酸、然后通過轉(zhuǎn)移該中間體的磷酸基團(tuán)到adp上釋放atp，而發(fā)生。當(dāng)單獨(dú)使用磷酸丁?；D(zhuǎn)移酶時(shí)(試驗(yàn)e)，觀察到3-羥基異戊酸的顯著產(chǎn)生，沒有同時(shí)產(chǎn)生atp。該產(chǎn)生是由通過磷酸丁?；D(zhuǎn)移酶作用產(chǎn)生的3-羥基異戊?；姿岬淖园l(fā)水解導(dǎo)致的。在不含adp的對照試驗(yàn)(試驗(yàn)c和d)中，以相同的方式觀察到3-羥基異戊酸的產(chǎn)生。這種產(chǎn)生也是由通過磷酸丁?；D(zhuǎn)移酶作用產(chǎn)生的3-羥基異戊?；姿岬乃鈱?dǎo)致的。實(shí)施例11：由來自糞腸球菌的磷酸丁酰基轉(zhuǎn)移酶和來自干酪乳桿菌或地芽孢桿菌的丁酸激酶的組合作用，催化3-羥基異戊?；?coa和adp轉(zhuǎn)化為3-羥基異戊酸和atp。酶學(xué)試驗(yàn)在0.2ml的總反應(yīng)體積中進(jìn)行。標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)混合物含有：50mm磷酸鉀緩沖液ph7.54mm3-羥基異戊?；?coa4mmadp10mmmgcl210mmnacl0.2mg/ml來自糞腸球菌的純化的磷酸丁?；D(zhuǎn)移酶0.2mg/ml來自干酪乳桿菌或地芽孢桿菌的純化的丁酸激酶。平行進(jìn)行一系列對照(試驗(yàn)c-h表5)。表5然后將試驗(yàn)在30℃下振蕩孵育20分鐘在孵育期后，通過在90℃下加熱反應(yīng)介質(zhì)4分鐘來終止反應(yīng)。將樣品離心，通過0.22μm過濾器過濾，將澄清的上清液轉(zhuǎn)移到干凈的小瓶中用于進(jìn)一步分析。根據(jù)實(shí)施例10中描述的方法，通過hplc分析來跟蹤adp和3-羥基異戊?；?coa的消耗以及atp和3-羥基異戊酸和游離輔酶a(coa-sh)的形成。hplc分析的結(jié)果總結(jié)于圖22中。所獲得的數(shù)據(jù)表明，在分別由兩種酶催化的兩步反應(yīng)(試驗(yàn)a和b)中，3-羥基異戊酰基-coa被轉(zhuǎn)化為3-羥基異戊酸，同時(shí)伴隨從adp產(chǎn)生atp。因此，該轉(zhuǎn)化通過形成中間體3-羥基異戊?；姿?，然后通過轉(zhuǎn)移該中間體的磷酸基團(tuán)到adp上釋放atp，而發(fā)生。當(dāng)單獨(dú)使用磷酸丁?；D(zhuǎn)移酶時(shí)，觀察到3-羥基異戊酸的顯著產(chǎn)生，沒有同時(shí)產(chǎn)生atp(試驗(yàn)e)。這種產(chǎn)生是由通過磷酸丁?；D(zhuǎn)移酶的作用產(chǎn)生的3-羥基異戊酰基磷酸的水解所導(dǎo)致的。在不含adp的對照試驗(yàn)(試驗(yàn)c和d)中，以相同的方式觀察到3-羥基異戊酸的產(chǎn)生。這種產(chǎn)生也是由于通過磷酸丁酰基轉(zhuǎn)移酶的作用產(chǎn)生的3-羥基異戊?；姿岬乃鈱?dǎo)致的。實(shí)施例12：3-甲基巴豆?；?coa到3-甲基巴豆酸和游離輔酶a的酶催化水解根據(jù)如實(shí)施例1中所述的步驟，合成編碼來自惡臭假單胞菌的?；?coa硫酯酶ii的基因。含有編碼來自大腸桿菌的?；?coa硫酯酶2(tesb)的基因的載體pca24n，購自naist(narainstituteofscienceandtechnology，japan，askacollection)。提供的此載體在甲硫氨酸起始密碼子后包含6個(gè)組氨酸的密碼子。根據(jù)實(shí)施例1中所述的步驟，產(chǎn)生相應(yīng)的酶。酶學(xué)試驗(yàn)在0.2ml的總反應(yīng)體積中進(jìn)行。標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)混合物含有：50mmhepesph7.010mm3-甲基巴豆?；?coa(sigma-aldrich)20mmmgcl220mmnacl1mg/ml純化的重組硫酯酶。進(jìn)行對照試驗(yàn)，其中不加入酶或不加入底物。將試驗(yàn)在30℃下振蕩孵育30分鐘，通過加入0.1ml乙腈終止反應(yīng)，然后通過基于hplc的步驟，分析樣品?；趆plc分析3-甲基巴豆?；?coa的消耗和3-甲基巴豆酸和游離輔酶a(coa-sh)的形成使用裝備有柱加熱模塊和uv檢測器(210nm)的1260inifinitylc系統(tǒng)(agilent)，進(jìn)行hplc分析。在zorbaxsb-aq柱(250×4.6mm，5μm粒徑，柱溫30℃)上，以1.5ml/min的流動(dòng)相流速，分離5μl樣品。使用混合的a(含有8.4mm硫酸的h2o)和b(乙腈)溶液以線性梯度(0％b在初始時(shí)間0分鐘→70％b在8分鐘)進(jìn)行分離。使用商業(yè)的3-甲基巴豆?；?coa、3-甲基巴豆酸(sigma-aldrich)和coa-sh(sigma-aldrich)作為參考。在這些條件下，游離的輔酶a(coa-sh)、3-甲基巴豆?；?coa和3-甲基巴豆酸的保留時(shí)間分別為4.05、5.38和5.83分鐘。在對照試驗(yàn)中沒有觀察到3-甲基巴豆酸信號。研究的兩種硫酯酶均催化了3-甲基巴豆?；?coa的水解，形成3-甲基巴豆酸。用來自惡臭假單胞菌的酰基-coa硫酯酶ii獲得的色譜圖的實(shí)例顯示在圖23中。在酶學(xué)試驗(yàn)中觀察到的3-甲基巴豆酸的產(chǎn)生程度示于表6中。表6實(shí)施例13：由來自枯草芽孢桿菌的磷酸丁?；D(zhuǎn)移酶和來自干酪乳桿菌或地芽孢桿菌的丁酸激酶的組合作用，催化3-甲基巴豆酰基-coa和adp轉(zhuǎn)化為3-甲基巴豆酸和atp在下文所述的試驗(yàn)中，使用以下酶：表7基因名稱生物uniprot登陸號ptb(yqis)枯草芽孢桿菌p54530buk干酪乳桿菌k0n529buk地芽孢桿菌.l8a0e1酶學(xué)試驗(yàn)在0.2ml的總反應(yīng)體積中進(jìn)行。標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)混合物含有：50mm磷酸鉀緩沖液ph7.54mm3-甲基巴豆酰基-coa4mmadp10mmmgcl210mmnacl0.2mg/ml來自枯草芽孢桿菌的純化的磷酸丁?；D(zhuǎn)移酶0.2mg/ml來自干酪乳桿菌或地芽孢桿菌的純化的丁酸激酶。平行進(jìn)行一系列對照(試驗(yàn)c-h，如表8所示)。表8然后將試驗(yàn)在30℃下振蕩孵育20分鐘。在孵育期后，通過在90℃下加熱反應(yīng)介質(zhì)4分鐘來終止反應(yīng)。將樣品離心，通過0.22μm過濾器過濾，將澄清的上清液轉(zhuǎn)移到干凈的小瓶中用于進(jìn)一步分析。通過使用基于hplc的方法，跟蹤adp和3-甲基巴豆?；?coa的消耗以及atp、3-甲基巴豆酸和游離輔酶a(coa-sh)的形成?；趆plc分析adp和atp使用裝備有柱加熱模塊和ri檢測器的1260inifinitylc系統(tǒng)(agilent)進(jìn)行hplc分析。在polarisc18-a柱(150×4.6mm，5μm粒徑，柱溫30℃)上以1.5ml/min的流動(dòng)相流速，分離2μl樣品。根據(jù)實(shí)施例10中所述的方法，通過hplc分析來跟蹤adp的消耗和atp的形成?；趆plc分析3-甲基巴豆?；?coa、3-甲基巴豆酸和游離輔酶a(coa-sh)使用裝備有柱加熱模塊和uv檢測器(260nm)的1260inifinitylc系統(tǒng)(agilent)進(jìn)行hplc分析。在zorbaxsb-aq柱(250×4.6mm，5μm粒徑，柱溫度30℃)上以1.5ml/min的流動(dòng)相流速，分離1μl樣品。根據(jù)實(shí)施例12中描述的步驟，跟蹤3-甲基巴豆?；?coa的消耗和3-甲基巴豆酸和游離輔酶a(coa-sh)的形成。在這些條件下，3-甲基巴豆?；?coa、3-甲基巴豆酸和游離輔酶a(coa-sh)的保留時(shí)間分別為5.38分鐘、5.73分鐘和4.07分鐘。對于酶學(xué)試驗(yàn)a和無酶試驗(yàn)h獲得的典型色譜圖顯示在圖24a和24b中。hplc分析的結(jié)果總結(jié)在圖25中。所獲得的數(shù)據(jù)表明，在分別由兩種酶催化的兩步反應(yīng)中(試驗(yàn)a和b)，3-甲基巴豆酰基-coa被轉(zhuǎn)化為3-甲基巴豆酸，同時(shí)伴隨從adp產(chǎn)生atp。因此，通過形成中間體3-甲基巴豆酰基磷酸，然后通過轉(zhuǎn)移該中間體的磷酸基團(tuán)到adp上釋放atp，而發(fā)生該轉(zhuǎn)化。當(dāng)單獨(dú)使用磷酸丁酰基轉(zhuǎn)移酶時(shí)，觀察到3-甲基巴豆酸的顯著產(chǎn)生，沒有同時(shí)產(chǎn)生atp(試驗(yàn)e)。這種產(chǎn)生是由于通過磷酸丁酰基轉(zhuǎn)移酶的作用產(chǎn)生的3-甲基巴豆?；姿岬淖园l(fā)水解所導(dǎo)致的。在不含adp的對照試驗(yàn)(試驗(yàn)c和d)中，以相同的方式觀察到3-甲基巴豆酸的產(chǎn)生。這種產(chǎn)生也是由于通過磷酸丁酰基轉(zhuǎn)移酶的作用產(chǎn)生的3-甲基巴豆?；姿岬乃馑鶎?dǎo)致的。實(shí)施例14：由來自糞腸球菌的磷酸丁?；D(zhuǎn)移酶和來自干酪乳桿菌或地芽孢桿菌的丁酸激酶的組合作用，催化3-甲基巴豆酰基-coa和adp轉(zhuǎn)化為3-甲基巴豆酸和atp。在下文所述的試驗(yàn)中，使用以下酶：表9基因名稱生物uniprot登陸號ptb糞腸球菌a0a038bnc2buk干酪乳桿菌k0n529buk地芽孢桿菌.l8a0e1酶學(xué)試驗(yàn)在0.2ml的總反應(yīng)體積中進(jìn)行。標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)混合物含有：50mm磷酸鉀緩沖液ph7.54mm3-甲基巴豆酰基-coa4mmadp10mmmgcl210mmnacl0.2mg/ml來自糞腸球菌的純化的磷酸丁?；D(zhuǎn)移酶0.2mg/ml來自干酪乳桿菌或地芽孢桿菌的純化的丁酸激酶。平行進(jìn)行一系列對照(試驗(yàn)c-h表10)。表10然后將試驗(yàn)在30℃下振蕩孵育20分鐘。在孵育期后，通過在90℃下加熱反應(yīng)介質(zhì)4分鐘來終止反應(yīng)。將樣品離心，通過0.22μm過濾器過濾，將澄清的上清液轉(zhuǎn)移到干凈的小瓶中用于進(jìn)一步分析。根據(jù)實(shí)施例10和實(shí)施例12中描述的方法，通過hplc分析，跟蹤adp和3-甲基巴豆?；?coa的消耗以及atp和3-甲基巴豆酸和游離輔酶a(coa-sh)的形成。hplc分析的結(jié)果總結(jié)在圖26中。所獲得的數(shù)據(jù)表明，在分別由兩種酶催化的兩步反應(yīng)(試驗(yàn)a和b)中，3-甲基巴豆?；?coa被轉(zhuǎn)化為3-甲基巴豆酸，同時(shí)伴隨從adp產(chǎn)生atp。因此，通過形成中間體3-甲基巴豆酰基磷酸，然后通過轉(zhuǎn)移該中間體的磷酸基團(tuán)到adp上釋放atp，而發(fā)生該轉(zhuǎn)化。當(dāng)單獨(dú)使用磷酸丁?；D(zhuǎn)移酶時(shí)，觀察到3-甲基巴豆酸的顯著產(chǎn)生，沒有同時(shí)產(chǎn)生atp(試驗(yàn)e)。這種產(chǎn)生是由于通過磷酸丁?；D(zhuǎn)移酶的作用產(chǎn)生的3-甲基巴豆酰基磷酸的水解所導(dǎo)致的。在不含adp的對照試驗(yàn)(試驗(yàn)c和d)中，以相似的方式觀察到3-甲基巴豆酸的產(chǎn)生。這種產(chǎn)生也是由于通過磷酸丁?；D(zhuǎn)移酶的作用產(chǎn)生的3-甲基巴豆?；姿岬乃馑鶎?dǎo)致的。實(shí)施例15：篩選用于從3-甲基巴豆酸產(chǎn)生3-羥基-3-甲基丁酸的水裂合酶水裂合酶——被分類為屬于2-甲基檸檬酸脫水酶(ec4.2.1.79)家族的酶，已經(jīng)被描述為能夠?qū)?-甲基巴豆酸轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁酸。針對來自類產(chǎn)堿假單胞菌(pseudomonaspseudoalcaligenes)的馬來酸水合酶，這已被描述,其能夠使用3-甲基巴豆酸作為底物(vanderwerf等人，appl.environ.microbiol.59(1993),2823-2829)。顯示具有將3-甲基巴豆酸酶促轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁酸的相應(yīng)反應(yīng)性的其它水裂合酶，可以通過篩選已知水裂合酶的該反應(yīng)性而鑒定，如下所述：可以從通?？色@得的來源，獲得編碼屬于水裂合酶家族(分類為ec4.2.1.-)的酶的相應(yīng)基因，優(yōu)選編碼屬于烏頭酸水合酶(ec4.2.1.3)、馬來酸水合酶(ec4.2.1.31)或2-甲基檸檬酸脫水酶(ec4.2.1.79)家族的酶的相應(yīng)基因?？梢院铣珊蜻x酶的相應(yīng)基因，并且可以根據(jù)實(shí)施例1中所述的方法產(chǎn)生酶。一旦根據(jù)上述描述產(chǎn)生和純化酶，可以測試各水裂合酶將3-甲基巴豆酸酶促轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁酸的反應(yīng)性。對于該水合酶試驗(yàn)，使用含有mgcl2、nacl和0-100mm的3-甲基巴豆酸的反應(yīng)混合物。進(jìn)行對照試驗(yàn)，其中不加入酶或不加入底物。通過基于hplc的方案，監(jiān)測每個(gè)樣品中3-甲基巴豆酸的消耗和/或3-羥基-3-甲基丁酸的形成。如果與對照試驗(yàn)相比，在上述試驗(yàn)中3-羥基-3-甲基丁酸的形成顯示增加，則水裂合酶將被鑒定為能夠?qū)?-甲基巴豆酸酶促轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基丁酸的合適酶。當(dāng)前第1頁12