本發(fā)明涉及產(chǎn)生油脂的酵母和油脂制造方法。更具體地，本發(fā)明涉及在菌體外蓄積油脂的酵母株以及使用該酵母株的油脂制造方法。

背景技術(shù)：

為了擺脫對(duì)化石燃料的依賴并且抑制溫室氣體的排放，需要對(duì)碳中和資源(即生物質(zhì))的有效利用。關(guān)于生物質(zhì)的利用，專利文獻(xiàn)1公開了利用諸如小球藻的藻類制造油脂的技術(shù)。該文獻(xiàn)公開的技術(shù)通過(guò)在壓力容器內(nèi)分解包含藻類和水的混合物，從而在不使用有機(jī)溶劑的情況下從藻體中回收油脂。

本發(fā)明相關(guān)的專利文獻(xiàn)2公開了從碳水化合物中產(chǎn)生油脂的絲孢酵母(trichosporon)屬酵母。

現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)

1.專利文獻(xiàn)特開2012-5398號(hào)公報(bào)

2.專利文獻(xiàn)特開平7-236492號(hào)公報(bào)

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明待解決的問(wèn)題

由于專利文獻(xiàn)2所公開的絲孢酵母屬酵母在菌體外產(chǎn)生油脂，因此可在不進(jìn)行從菌體內(nèi)提取油脂的操作的情況下獲得油脂，而且所述絲孢酵母屬酵母可能用于由生物質(zhì)制造油脂。但是，對(duì)于絲孢酵母屬酵母，尚未進(jìn)行關(guān)于糖同化性的詳細(xì)研究。另外，由于進(jìn)行絲狀真菌式生殖，所以絲孢酵母屬酵母大多生長(zhǎng)緩慢，并存在病原性菌種。

本發(fā)明的主要目的在于提供一種可用于由生物質(zhì)制造油脂的新型酵母。

解決問(wèn)題的手段

為了解決如上問(wèn)題，本發(fā)明提供以下1-4。

1.一種油脂的制造方法，其包括在含有碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)紅冬孢酵母(rhodosporidiumtoruloides)ipm33-18株(nitebp-01900)或其基因改造體，以在培養(yǎng)物中蓄積油脂的步驟；

從所述培養(yǎng)物中回收所述油脂的步驟。

2.根據(jù)1所述的制造方法，其包括從所述培養(yǎng)物的液體部分中回收油脂的步驟。

3.根據(jù)1或2所述的制造方法，其特征在于不包括從菌體中提取油脂的步驟。

4.根據(jù)1或2所述的制造方法，其包括從菌體中回收油脂的步驟。

5.根據(jù)1～4中任一項(xiàng)所述的制造方法，所述基因改造為導(dǎo)入2-脫氧葡萄糖耐受突變。

6.紅冬孢酵母(rhodosporidiumtoruloides)ipm33-18株(nitebp-01900)或其基因改造體。

在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“培養(yǎng)基”、“培養(yǎng)物”和“培養(yǎng)物的液體部分”具有下述含義。

“培養(yǎng)基”意指包含酵母生長(zhǎng)中所需的營(yíng)養(yǎng)成分的液體?！芭囵B(yǎng)基”不應(yīng)包含菌體和由菌體產(chǎn)生的油脂。

“培養(yǎng)物”包括培養(yǎng)基和在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的菌體。此外，“培養(yǎng)物”應(yīng)包含由在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的菌體產(chǎn)生的油脂。

“培養(yǎng)物的液體部分”意指在培養(yǎng)物中除了菌體以外的液相?！芭囵B(yǎng)物的液體部分”應(yīng)包含由菌體產(chǎn)生的油脂中的在該液體部分中所蓄積的那些。即，由菌體產(chǎn)生的油脂中的在菌體內(nèi)蓄積的那些不包含在“培養(yǎng)物的液體部分”中。另外，“培養(yǎng)物的液體部分”由以下成分組成：包含培養(yǎng)基的水層和包含由菌體在液體部分中產(chǎn)生的油脂的油層。

此外，在本發(fā)明中，“在培養(yǎng)物中的油脂蓄積”意指由酵母產(chǎn)生的油脂在“菌體”內(nèi)和“培養(yǎng)物的液體部分”中的蓄積。其中，“在培養(yǎng)物的液體部分中蓄積”包括由酵母產(chǎn)生的油脂釋放至該液體部分中，由酵母產(chǎn)生的油脂分泌至菌體外的情況，以及在菌體內(nèi)的產(chǎn)生油脂的酵母通過(guò)細(xì)胞死亡而分解，油脂被釋放到菌體外的情況。另外，術(shù)語(yǔ)“在菌體外蓄積”與“在培養(yǎng)物的液體部分中蓄積”同義使用。

發(fā)明效果

根據(jù)本發(fā)明，提供了一種可用于從生物質(zhì)中制造油脂的新型酵母。

附圖說(shuō)明

圖1為顯示了在ipm33-18株的菌體內(nèi)和菌體外的油脂蓄積量的測(cè)量結(jié)果的圖(實(shí)施例1)。

圖2為顯示了在ipm33-18株的培養(yǎng)上清液中的葡萄糖濃度的測(cè)量結(jié)果的圖(實(shí)施例1)。

圖3為顯示了在ipm33-18株的培養(yǎng)上清液中的氮濃度的測(cè)量結(jié)果的圖(實(shí)施例1)。

圖4為顯示了ipm33-18株的菌體重量(干燥重量)的測(cè)量結(jié)果的圖(實(shí)施例1)。

圖5為顯示了在培養(yǎng)開始10天時(shí)，在ipm33-18株的菌體外蓄積的油脂的脂肪酸組成的圖(實(shí)施例1)。

圖6為顯示了在ipm33-18株的基因改造體的菌體外的油脂蓄積量的測(cè)量結(jié)果的圖(實(shí)施例3)。

具體實(shí)施方式

以下，對(duì)用于實(shí)施本發(fā)明的優(yōu)選方式進(jìn)行說(shuō)明。另外，以下說(shuō)明的實(shí)施方式只表示本發(fā)明的代表性實(shí)施方式的一個(gè)例子，因此并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行的狹義解釋。

本發(fā)明人從日本的亞熱帶地區(qū)(西表島)和寒冷地區(qū)(利尻島)的土壤和植物中分離酵母株，并構(gòu)建了包含1000株以上酵母的庫(kù)(plosone,2012,vol.7,no.11,e50784)。本發(fā)明人使用該酵母庫(kù)對(duì)具有能夠在菌體外蓄積油脂的能力的株進(jìn)行篩選，結(jié)果新發(fā)現(xiàn)了紅冬孢酵母(rhodosporidiumtoruloides)ipm33-18株具有該能力。基于該發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了使用該菌株制造油脂的方法。

ipm33-18株已被國(guó)際保藏在獨(dú)立行政法人制品評(píng)價(jià)技術(shù)基礎(chǔ)機(jī)構(gòu)專利微生物保藏中心(千葉縣木更津市上總鐮足2-5-8122號(hào)室)，登錄號(hào)為nitebp-01900。

ipm33-18株在10～37℃的溫度下生長(zhǎng)，并具有廣泛的糖同化性。因此，在通常環(huán)境下，其能夠用于從多種生物質(zhì)中產(chǎn)生油脂。此外，不同于在菌體內(nèi)蓄積產(chǎn)生的油脂的通常的油酵母(蓄積油脂的酵母)，ipm33-18株在菌體外蓄積產(chǎn)生的油脂，因此根據(jù)ipm33-18株，可在不進(jìn)行從菌體內(nèi)提取油脂的操作的情況下制造油脂。

ipm33-18株的菌學(xué)性質(zhì)如下。

分類學(xué)上的位置

紅冬孢酵母(rhodosporidiumtoruloides)

科學(xué)性質(zhì)

基因組dna的d1/d2區(qū)域的堿基序列與上述種子的標(biāo)準(zhǔn)株一致。培養(yǎng)基上的形態(tài)等也顯示與紅冬孢酵母相同的性質(zhì)。

培養(yǎng)條件

有氧、靜置培養(yǎng)

培養(yǎng)基組成

另外，在本發(fā)明中，ipm33-18株的基因改造體可代替ipm33-18株使用或與ipm33-18株組合使用?？蛇m當(dāng)選擇本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法用于基因改造，例如使用突變?cè)晕镔|(zhì)的ipm33-18株的培養(yǎng)和使用載體的基因?qū)敕ā?/p>

作為基因改造，優(yōu)選的是用于提高糖的同化性的改造或用于提高油脂在培養(yǎng)物中的蓄積量的改造。作為用于提高糖的同化性的改造，可以提及例如導(dǎo)入2-脫氧葡萄糖耐受突變。

或者，在本發(fā)明中，ipm33-18株的提取液可代替ipm33-18株使用。在該提取液中可以使用經(jīng)純化的所需酶的一部分或全部。例如，當(dāng)使用衍生自ipm33-18株的脂肪酶時(shí)，根據(jù)lukaszewicz等人的文獻(xiàn)(1stannualinternationalinterdisciplinaryconference,aiic2013年4月24-26,azores,portugal,第441-449頁(yè))中所述的方法，可以通過(guò)硫酸銨分級(jí)純化。

本發(fā)明的油脂的制造方法包括在含有碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)ipm33-18株或其基因改造體，以在培養(yǎng)物中蓄積油脂的步驟；從所述培養(yǎng)物中回收所述油脂的步驟。如下所述，從培養(yǎng)物中回收油脂的步驟可以是如下步驟的任一者：從培養(yǎng)物的液體部分中回收油脂的步驟，或者除了從所述液體部分中回收油脂之外還從菌體中回收油脂的步驟。

可以使用含有碳源的培養(yǎng)液通過(guò)現(xiàn)有公知的方法培養(yǎng)ipm33-18株。由于ipm33-18株具有廣泛的糖同化性，因此可以使用(而無(wú)特別限定)糖類、糖醇和酸性糖或包含它們的生物質(zhì)作為碳源。這里，在本發(fā)明中，“生物質(zhì)”意指含有上述碳源的可再生材料。

糖類可以是單糖類、低聚糖類以及多糖類。低聚糖類指二～十糖類，它們可以是均質(zhì)低聚糖類或異質(zhì)低聚糖類。另外，多糖指具有比低聚糖類更大單糖單元數(shù)的糖類，它們可以是均質(zhì)多糖或異質(zhì)多糖。具體而言，單糖類可以是戊糖(如l-阿拉伯糖、d-木糖、d-核糖等)、己糖(如d-葡萄糖、d-半乳糖、d-果糖、d-甘露糖等)、6-脫氧己糖(如l-鼠李糖等)等。低聚糖類可以是二糖(如蔗糖、麥芽糖、乳糖、纖維二糖、海藻糖、蜜二糖等)、三糖(如棉子糖等)等。多糖類可以是淀粉、纖維素、肝糖、葡聚糖、甘露聚糖、木聚糖等。上述糖類可以單獨(dú)使用或適當(dāng)組合使用。淀粉水解物等也可包含在上述組合中。此外作為糖類，也可以使用包含糖類為主要成分的原料，例如廢糖蜜、豆渣等。

糖醇可以是d-山梨糖醇、d-甘露糖醇、半乳糖醇、麥芽糖醇等。酸性糖可以是葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸等。

培養(yǎng)基中的碳源的量不受特別限制，但通常為約3～15％(w/w)。

除了碳源以外，培養(yǎng)基可以包含氮源、無(wú)機(jī)物和其他營(yíng)養(yǎng)素。作為氮源，可以使用氨、氯化銨、硫酸銨、碳酸銨、乙酸銨、硝酸鈉、尿素等無(wú)機(jī)有機(jī)氮化合物。進(jìn)一步，作為氮源，也可以使用諸如蛋白胨、肉提取物、酵母提取物、玉米漿、酪蛋白水解物、魚粉或其消化物、脫脂大豆餅或其消化物的含氮天然產(chǎn)物。作為無(wú)機(jī)物，可以使用磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、氯化亞鐵、硫酸錳、氯化鈣、碳酸鈣、硫酸鋅、硫酸銅、硼酸鉬酸銨、碘化鉀等。

培養(yǎng)在振蕩培養(yǎng)或深部攪拌培養(yǎng)等的有氧條件下進(jìn)行。培養(yǎng)溫度一般優(yōu)選為20～35℃，但只要是細(xì)菌可以生長(zhǎng)的溫度，也可使用其他溫度條件。培養(yǎng)中培養(yǎng)基的ph通常為4.0～7.2。培養(yǎng)開始后通常2～4天內(nèi)，油脂在菌體外產(chǎn)生蓄積。

可以使用親油性溶劑通過(guò)現(xiàn)有公知的方法從培養(yǎng)物中回收油脂。具體地，向培養(yǎng)物中添加溶劑，將培養(yǎng)物的液體部分中所包含的油脂回收到溶劑中。可以在從培養(yǎng)物中分離菌體而得到液體部分之后，向液體部分中添加溶劑來(lái)進(jìn)行油脂的回收?？赏ㄟ^(guò)諸如離心分離和靜置沉降等的操作以及諸如分離器、傾析器和過(guò)濾器等的裝置從培養(yǎng)物中分離菌體，從而獲得培養(yǎng)物的液體部分。其中，可根據(jù)常規(guī)方法提取在菌體內(nèi)蓄積的油脂。作為溶劑，優(yōu)選使用溶解油脂，但與水不可溶混或與水較差溶混、在常溫下為液狀的有機(jī)溶劑，例如鹵代低級(jí)烷烴(氯仿、二氯甲烷、四氯化碳、1,2-二氯乙烷)、正己烷、乙醚、乙酸乙酯、芳香族烴(苯、甲苯、二甲苯)等。不特別限定提取溶劑的添加量，只要其能夠充分地回收在培養(yǎng)物中或液體部分中產(chǎn)生蓄積的油脂的量即可。

本發(fā)明的制造方法得到的油脂可以是：由脂肪族羧酸和脂肪族醇組成的脂肪族酯化合物。不特別限定脂肪族羧酸，只要其由酵母產(chǎn)生即可，其可以是例如，碳原子數(shù)為8～24，優(yōu)選12～24的脂肪族羧酸，具體為肉豆蔻酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸、山崳酸和二十四烷酸等。另外，作為油脂，也可以包含諸如磷脂質(zhì)、游離脂肪酸、糖脂質(zhì)、類固醇化合物、類胡蘿卜素等的光合色素等。

根據(jù)本發(fā)明的制造方法，可在不進(jìn)行從菌體中提取油脂的操作的情況下從培養(yǎng)物或其液體部分中回收油脂。以往為了提取菌體內(nèi)的油脂，破壞堅(jiān)固的細(xì)胞壁的操作是必要的。與此相對(duì)，根據(jù)本發(fā)明的制造方法，有可能僅通過(guò)混合培養(yǎng)物或其液體部分與親油性溶劑來(lái)回收油脂。另外，如上所述，本發(fā)明的ipm33-18株具有廣泛的糖同化性。因此，本發(fā)明可用于從生物質(zhì)中制造油脂，并且可用于例如生物柴油生產(chǎn)或利用未使用的生物質(zhì)的生物煉制等的應(yīng)用。

實(shí)施例

<實(shí)施例1：ipm33-18株的油脂菌體外蓄積能力>

按以下步驟，培養(yǎng)ipm33-18株，從培養(yǎng)物的液體部分中回收油脂。

培養(yǎng)

培養(yǎng)在以下條件下進(jìn)行。

用鉑環(huán)刮取ym瓊脂培養(yǎng)基上的菌落，并將其移入3ml的ym培養(yǎng)基，在27℃和150rpm下預(yù)培養(yǎng)過(guò)夜。用分光光度計(jì)測(cè)量600nm處的吸光度，確定濁度(od600)。使用25ml的ss2培養(yǎng)基(3％葡萄糖、0.5％硫酸銨、0.05％硫酸鎂、0.01％氯化鈉、0.01％氯化鈣、0.01％酵母提取物)接種預(yù)培養(yǎng)液，使得od600變成0.2，主培養(yǎng)在27℃和150rpm下進(jìn)行。

采樣

在主培養(yǎng)開始后的第2、4、6、8、10天時(shí)采集3ml培養(yǎng)物，在12,000rpm下離心分離5分鐘，并回收菌體。使用培養(yǎng)上清液(培養(yǎng)物的液體部分)用于測(cè)量葡萄糖濃度和氮濃度。菌體用蒸餾水洗滌1次后，再次離心分離并冷凍干燥。

另外，將5ml的己烷添加至剩余量的培養(yǎng)上清液中并攪拌，分離出上層(己烷層)。用蒸發(fā)器去除己烷，得到紅色油狀殘?jiān)?/p>

在培養(yǎng)開始后的第2、4、6、8、10天時(shí)測(cè)定以下項(xiàng)目。

葡萄糖濃度

使用高效液相色譜進(jìn)行培養(yǎng)上清液中的葡萄糖濃度的測(cè)定。高效液體色譜分析在以下條件下進(jìn)行。

高效液相色譜儀：由島津制作所制造的prominence

柱：由bio-radlaboratories公司制造的aminexfermentationmonitoringcolumn

保護(hù)柱：由bio-radlaboratories公司制造的micro-guardcationhrefillcartridges

檢測(cè)器：由島津制作所制造的rid10

柱式加熱爐：由島津制作所制造的cto20a

自動(dòng)進(jìn)樣器：由島津制作所制造的sil-20a

流動(dòng)相：5mm硫酸水溶液，每分鐘0.6ml

柱溫：60℃

由濃度已知的d-葡萄糖(和光純藥工業(yè))的相對(duì)保留值和峰面積來(lái)鑒定葡萄糖，并確定其濃度。

氮濃度

根據(jù)文獻(xiàn)(bioresour.technol.,2012,vol.114,p.443-449)中所述的方法進(jìn)行培養(yǎng)上清液中的氮濃度的測(cè)量。向100μl的上清中加入500μl的堿性次氯酸鹽溶液、500μl的酚硝普鹽(フェノールニトルプルシド)溶液和3ml的水。在25℃下放置1小時(shí)后，測(cè)量570nm處的吸光度?；谟?0、40、80mg/l的硫酸銨水溶液制成的校準(zhǔn)線來(lái)確定氮濃度。

油脂量

根據(jù)文獻(xiàn)(j.lipidres,2010,vol.51,no.3,p635-640)中所述的方法將通過(guò)如上采樣獲得的干燥菌體和紅色油狀殘?jiān)谆Ｔ趯?00μl甲苯和1.5ml甲醇添加至干燥菌體或紅色油狀殘?jiān)泻?，僅對(duì)干燥菌體進(jìn)行15分鐘的超聲破碎。接著，加入含8％鹽酸的85％的甲醇300μl，攪拌后，在45℃下靜置過(guò)夜。最后，加入1ml己烷和1ml蒸餾水，攪拌后，挑取上層(己烷層)，供接下來(lái)的氣相色譜分析用。

通過(guò)氣相色譜分析，解析脂肪酸甲酯的組成。氣相色譜分析在以下條件下進(jìn)行。

氣相色譜儀：由島津制作所制造的gc-2010plus

檢測(cè)器：fid

自動(dòng)進(jìn)樣器：由島津制作所制造的aoc20

柱：由agilenttechnologies公司制造的db-23毛細(xì)管柱(30m×0.25mm×0.25μm)

溫度程序：在50℃下保持2分鐘，以每分鐘10℃升溫至180℃，保持5分鐘，以每分鐘5℃升溫至240℃，保持3分鐘

載氣：氦氣(每分鐘1ml)

補(bǔ)氣：氮?dú)?/p>

注射器溫度：250℃

檢測(cè)器溫度：300℃

分流比：50:1

由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(花生酸甲酯、山崳酸甲酯、癸酸甲酯、順式-13-二十二烯酸甲酯、月桂酸甲酯、亞油酸甲酯、亞麻酸甲酯、肉豆蔻酸甲酯、辛酸甲酯、油酸甲酯、棕櫚酸甲酯、棕櫚油酸甲酯、硬脂酸甲酯、二十四烷酸甲酯、和光純藥工業(yè))的相對(duì)保留值鑒定各脂肪酸甲酯。由脂肪酸甲酯混合物(18918-1amp,supelco)的峰面積來(lái)確定各脂肪酸甲酯的濃度。

圖1示出了培養(yǎng)期間在菌體內(nèi)和菌體外的油脂蓄積量的變化。圖1的縱軸示出了在1l培養(yǎng)物所包含的菌體中蓄積的油脂量(細(xì)胞內(nèi))以及在液體部分中蓄積的油脂量(細(xì)胞外)。另外，圖2～4示出了培養(yǎng)上清液中的葡萄糖濃度、氮濃度和干燥菌體重量的變化。

隨著培養(yǎng)的進(jìn)行，培養(yǎng)基中的葡萄糖和氮被消耗而產(chǎn)生油脂，其中可以明確的是：一定量的油脂在細(xì)胞外蓄積。特別地，當(dāng)菌體的增殖達(dá)到平穩(wěn)在培養(yǎng)第4天之后，油脂的菌體外蓄積增加，菌體外蓄積量/菌體內(nèi)蓄積量的比例顯著增加。

圖5示出了菌體外蓄積的油脂的脂肪酸組成(培養(yǎng)開始第10天)。菌體外(10dextra)和菌體內(nèi)(10intra)蓄積的油脂的組成無(wú)明顯差異，兩者均包含肉豆蔻酸(c14：0)、棕櫚酸(c16：0)、棕櫚油酸(c16：1)、硬脂酸(c18：0)、油酸(c18∶1)、亞油酸(c18∶2)、亞麻酸(c18∶3)、山崳酸(c22：0)、二十四烷酸(c24：0)之類的主要脂肪酸。

<實(shí)施例2：ipm33-18株的糖同化性>

用其它糖類替換實(shí)施例1中用于碳源的葡萄糖，通過(guò)檢測(cè)油脂的菌體外蓄積來(lái)分析ipm33-18株的糖同化性。使用木糖、阿拉伯糖、甘油、纖維二糖、淀粉、木聚糖作為糖類。結(jié)果，在將任何糖用作碳源的情況下，都能夠確定脂質(zhì)的菌體外蓄積與葡萄糖類似。很明顯，ipm33-18株具有廣泛的糖同化性。

<實(shí)施例3：ipm33-18株的基因改造>

將2-脫氧葡萄糖耐受突變導(dǎo)入ipm33-18株中，以分析油脂的菌體外蓄積量的變化。

根據(jù)文獻(xiàn)(appl.microbiol.biotechnol.2011,vol.90,no.4,p.1573-1586)中所述的方法，將2-脫氧葡萄糖耐受突變導(dǎo)入ipm33-18株中以制備基因改造體。在合成木糖培養(yǎng)基(0.17％ynb,0.5％as,6％木糖)中培養(yǎng)基因改造體。除了培養(yǎng)基以外的培養(yǎng)條件與實(shí)施例1相同。

圖6示出了培養(yǎng)期間菌體外的油脂蓄積量的變化。通過(guò)導(dǎo)入2-脫氧葡萄糖耐受突變，油脂的產(chǎn)量顯著增加。

pct

受理局填寫欄

國(guó)際局填寫欄

pct/ro/134表