本發(fā)明涉及分子生物學(xué)與生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種利用生物酶催化技術(shù)制備3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸的方法及其制備用7α-類固醇脫氫酶。
背景技術(shù)：
：3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸又名7-酮石膽酸，是制備熊去氧膽酸的重要中間體。而熊去氧膽酸是名貴中藥熊膽的主要有效成分，具有增加膽汁酸分泌、并使膽汁成分改變、降低膽汁中膽固醇及膽固醇脂等功效，主要用于治療膽石疾病。眾所周知，熊膽是一種非常稀缺的資源，原因在于其獲取的傳統(tǒng)途徑主要是依賴于人工養(yǎng)殖活熊取膽的方法。目前，這種周期長、收率低且不人道的傳統(tǒng)途徑逐漸被人工合成方法所取代，而現(xiàn)知的人工合成熊去氧膽酸的方法中，3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸都是極為重要的中間體。目前3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸的工業(yè)化生產(chǎn)多采用化學(xué)法，但是存在操作條件苛刻、選擇性低、污染環(huán)境、使用大量有機(jī)溶劑、存在有機(jī)溶劑殘留、有毒有害等缺點。為了解決化學(xué)法存在的諸多缺點，人們另辟蹊徑，尋找更好的生產(chǎn)途徑。中國發(fā)明專利CN1912192B公開了一種采用電化學(xué)合成制備3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸的方法，但是此種方法依然需要使用有機(jī)溶劑，并且成本較高。中國發(fā)明專利申請CN105368828A公開了一種采用全細(xì)胞催化制備3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸的方法，但是此種方法需進(jìn)行細(xì)胞發(fā)酵培養(yǎng)，存在反應(yīng)時間長、操作繁瑣、產(chǎn)物復(fù)雜等缺點。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸的新的制備方法，以解決上述
背景技術(shù)：
中提到的現(xiàn)有制備方法所存在的有機(jī)溶劑殘留、條件苛刻、反應(yīng)時間長、操作繁瑣、成本較高、污染環(huán)境等缺點，本發(fā)明同時提供了該新制備方法適用的生物酶。為實現(xiàn)上述目的，發(fā)明人經(jīng)過長期大量的實驗摸索，在經(jīng)歷上百次的失敗嘗試之后，終于篩選出適用于細(xì)胞外生物催化制備3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸的生物酶，并在此序列基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化，獲得了活性提高和去除底物抑制的突變體酶，從而開發(fā)出一種新的制備3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸的方法，其特征在于：以鵝去氧膽酸為底物，在NAD、乳酸脫氫酶、丙酮酸鈉以及緩沖溶液存在的條件下，用7α-類固醇脫氫酶催化鵝去氧膽酸制備3α-羥基-7氧代-5β膽烷酸，所述7α-類固醇脫氫酶來源于羊種布魯氏菌Brucellamelitensis，所述乳酸脫氫酶的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示，在整個催化反應(yīng)體系中，所述底物的濃度為50～100mg/mL，所述NAD的濃度為0.01～0.25mg/mL，所述丙酮酸鈉的濃度為10～30mg/mL。上述方法中所使用的兩種酶的具體存在形式包括液態(tài)酶、固態(tài)酶以及各種固定化酶，可以是未經(jīng)純化的粗酶形式，也可以是經(jīng)部分純化或完全純化的形式。優(yōu)選地，控制所述催化過程在溫度為25～35℃，pH值為7.5～8.5的條件下進(jìn)行。優(yōu)選地，所述緩沖溶液為50～100mM磷酸鉀緩沖液。優(yōu)選地，上述制備方法還包括如下提純步驟：待所述催化過程反應(yīng)結(jié)束后，調(diào)節(jié)pH值為1.0～2.0，攪拌20～30min，待冷卻后再經(jīng)過濾水洗干燥后即得3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸成品。更優(yōu)選地，上述制備方法還包括如下精制步驟：將獲得的3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸成品用8-15倍無水乙醇50-60℃水浴條件下攪拌回流0.5-1h，過濾，取濾液進(jìn)行真空減壓濃縮至1/4-1/5體積，再加入4-5倍純水?dāng)嚢?h，過濾，將濾餅真空干燥過夜，即得3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸精制品。優(yōu)選地，上述制備方法中所使用的7α-類固醇脫氫酶為如下（a）或（b）的蛋白質(zhì)：（a）其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示的蛋白質(zhì)，（b）在（a）限定的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸并且在NAD存在下以鵝去氧膽酸為底物具有比氨基酸序列如SEQIDNO：2所示的親本高的7α-類固醇脫氫酶催化活性的由（a）衍生的蛋白質(zhì)。更優(yōu)選地，所述7α-類固醇脫氫酶與如SEQIDNO：2所示的氨基酸序列相比在選自至少一個下述位點處具有至少一個突變：第91位、第92位、第117位、第118位、第195位、第241位以及第243位。更優(yōu)選地，所述7α-類固醇脫氫酶具有至少一個下述突變：D91K、L92R、N117I、V118R、S195A、I241R以及T243A。本發(fā)明還提供了一種7α-類固醇脫氫酶，所述7α-類固醇脫氫酶來源于羊種布魯氏菌Brucellamelitensis，用于催化鵝去氧膽酸制備3α-羥基-7氧代-5β膽烷酸，所述7α-類固醇脫氫酶為如下（a）或（b）的蛋白質(zhì)：（a）其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示的蛋白質(zhì)，（b）在（a）限定的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸并且在NAD存在下以鵝去氧膽酸為底物具有比氨基酸序列如SEQIDNO：2所示的親本高的7α-類固醇脫氫酶催化活性的由（a）衍生的蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，所述7α-類固醇脫氫酶與如SEQIDNO：2所示的氨基酸序列相比在選自至少一個下述位點處具有至少一個突變：第91位、第92位、第117位、第118位、第195位、第241位以及第243位。優(yōu)選地，所述7α-類固醇脫氫酶具有至少一個下述突變：D91K、L92R、N117I、V118R、S195A、I241R以及T243A。有益效果：1、與現(xiàn)有的3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸的制備方法相比，本發(fā)明提供的方法具有操作簡單、反應(yīng)條件溫和易控、反應(yīng)時間短、不使用有機(jī)溶劑、無毒無污染且成本低廉的優(yōu)點，經(jīng)實踐證明，本發(fā)明提供的方法的反應(yīng)時長僅需4～12小時，其對底物的轉(zhuǎn)化率高達(dá)99.8%以上，所獲得的產(chǎn)品的含量在96.8%以上。2、本發(fā)明篩選出了適用于細(xì)胞外生物催化制備3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸的7α-類固醇脫氫酶基因，并在此序列基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化，獲得了活性提高和去除底物抑制的突變體酶，這些突變體酶表現(xiàn)出高的選擇性使得該方法不會形成副產(chǎn)物，這些突變體酶的高催化活性和高專一性使得3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸酶法大規(guī)模生產(chǎn)的成本更低，具有較高的工業(yè)應(yīng)用價值。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，以下實施例是對本發(fā)明的解釋，本發(fā)明并不局限于以下實施例，實施例中未注明具體條件者，按常規(guī)條件或者制造商建議的條件進(jìn)行。本發(fā)明提供的3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸的制備方法的具體實施過程如下：將鵝去氧膽酸懸浮于50～100mM磷酸鉀緩沖液（pH8.0）中，用10M的NaOH調(diào)節(jié)pH到8.0，再加入終濃度為10～30mg/mL的丙酮酸鈉并用10M的NaOH調(diào)節(jié)pH到8.0，加入7α-類固醇脫氫酶和乳酸脫氫酶，最后加入終濃度為0.01～0.25mg/mL的NAD，底物終濃度為50～100mg/mL，反應(yīng)在溫度25～35℃、200～400rpm和pH7.5～8.5進(jìn)行，反應(yīng)時間為4h～12h。每隔一定時間取反應(yīng)液用流動相稀釋50～100倍，微孔過濾后進(jìn)樣進(jìn)行液相分析。液相檢測使用PhenomenxGemini5μmNX-C18110A250×4.6mm為分析柱，流動相為乙腈:緩沖溶液（取磷酸二氫鈉0.78g,溶解1L水中，用磷酸調(diào)pH值為3，即可）:甲醇=30:37:40，用0.45um濾膜過濾后備用。柱溫為40℃，示差檢測器（RID），流速為0.8mL/min。待催化過程反應(yīng)結(jié)束后，在快速攪拌的情況下加入鹽酸至pH為1.0～2.0，繼續(xù)攪拌20～30min，待冷卻后過濾、經(jīng)水洗三次后真空干燥后即得3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸成品。成品再用8-15倍無水乙醇50-60℃水浴條件下攪拌回流0.5-1h，過濾，取濾液進(jìn)行真空減壓濃縮至1/4-1/5體積，再加入4-5倍純水?dāng)嚢?h，過濾，將濾餅真空干燥過夜，即得3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸精制品。上述方法中所使用的兩種酶的具體存在形式包括液態(tài)酶、固態(tài)酶以及各種固定化酶，可以是未經(jīng)純化的粗酶形式，也可以是經(jīng)部分純化或完全純化的形式。實施例1含有親本基因的共表達(dá)重組質(zhì)粒pET22b-AH2-LDH的制備將來源于羊種布魯氏菌（Brucellamelitensis）的7α-類固醇脫氫酶基因AH2和來源于魏斯氏菌（Weissellasp）的乳酸脫氫酶基因LDH分別利用引物對5'CGCCATATGATGGGCGCCGACCCGGTTTA3'和5'CCGGAATTCTCAGTCGAGTTCCTGCACGCC3'以及引物對5'CCGGAATTCAAGGAGATATACATATGAAGATCTTCGCGTACGGTA3'和5'CCGCTCGAGTTAATATTCCACCGCAATGC3'通過PCR擴(kuò)增技術(shù)獲得PCR產(chǎn)物后經(jīng)過酶切處理，同時插入到表達(dá)載體pET22b（+）的NdeI和EcoRI位點以及EcoRI位點和XhoI位點，得到共表達(dá)重組質(zhì)粒pET22b-AH2-LDH。經(jīng)DNA測序，確定該被克隆的親本7α-類固醇脫氫酶的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示；確定該被克隆的親本乳酸脫氫酶的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示，其氨基酸序列如SEQIDNO：4所示。實施例2含有7α-類固醇脫氫酶突變體的共表達(dá)重組質(zhì)粒的制備通過反向PCR技術(shù)對7α-類固醇脫氫酶親本進(jìn)行定點突變，在突變位置通過設(shè)計反向引物，利用上下游突變引物擴(kuò)增目的片段，并在引物上引入相應(yīng)突變，以重組質(zhì)粒pET22b-AH2-LDH作為模板進(jìn)行反向PCR，PCR產(chǎn)物經(jīng)DpnI酶消化模板處理后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosetta(de3)，經(jīng)過Amp的篩選后挑取菌落送測序。突變位點及引物設(shè)計如表1所示。PCR體系為：TaKaRaEXTaqHS0.25ul；10×ExTaqBuffer5ul；模板質(zhì)粒1ul；dNTP（2.5mMeach）4ul；上游引物1ul;下游引物1ul；無菌水upto50ul。PCR程序為：首先98℃2min；然后98℃10s，55-56℃30s，72℃7min，30個循環(huán)；最后72℃10min。表1引物名稱引物序列（5′至3′）D91K+L92R上游GTCGTAACCAAGAGGAAAAGCGAAD91K+L92R下游TTCGCTTTTTCCTCTTGGTTACGACN117I+V118R上游CTTGAATGCATCAGAACCGACGAGN117I+V118R下游CTCGTCGGTTCTGATGCATTCAAGS195A上游AATATTTCGGCCATGGCCGGAS195A下游TCCGGCCATGGCCGAAATATTI241R+T243A上游GGCGCGAGAAAGGCCGATGCGI241R+T243A下游CGCATCGGCCTTTCTCGCGCC實施例3酶液的制備將實施例1和實施例2制備的親本和突變體共表達(dá)重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosetta(de3)，再將獲得的重組大腸桿菌接種在小體積的LB培養(yǎng)基（含有100μg/mL的Amp），30～37℃過夜培養(yǎng)后，以1～5%的接種量轉(zhuǎn)接到一定體積的LB培養(yǎng)基中（含有100μg/mL的Amp），在30～37℃繼續(xù)培養(yǎng)OD600達(dá)到0.6～1.0加入終濃度為0.1mM～1mM的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，在20～37℃誘導(dǎo)表達(dá)10～20h后離心收集菌體。發(fā)酵菌體懸浮于一定體積的50～100mM的磷酸鉀緩沖液（pH8.0）中并超聲波破胞，離心即得含有乳酸脫氫酶與7α-類固醇脫氫酶親本或者與7α-類固醇脫氫酶突變體的粗酶液，可用于酶活力的測定以及3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸的生物催化制備。實施例4酶活力的測定7α-類固醇脫氫酶的酶活測定方法：以鵝去氧膽酸為底物，在一個3mL的反應(yīng)體系中加入10uL的150mM鵝去氧膽酸，100uL的稀釋酶液，NAD+終濃度為0.2mM，在pH8.0和25℃反應(yīng)一定時間，在340nm處測定吸光值增加。乳酸脫氫酶的酶活測定方法：以丙酮酸鈉為底物，在一個3mL的反應(yīng)體系中加入100uL的50mM丙酮酸鈉，100uL的稀釋酶液，NADH終濃度為0.2mM，在pH8.0和25℃反應(yīng)一定時間，在340nm處測定吸光值減少。酶活力的測定結(jié)果如表2所示，其中LDH為乳酸脫氫酶，7α-HSDH為7α-類固醇脫氫酶。表2類型酶活力U/ml溫度穩(wěn)定性pH穩(wěn)定性LDH1017.5±23.54-45℃6.0-9.07α-HSDH親本787.4±14.44-50℃6.0-9.0D91K+L92R856.2±15.44-45℃6.0-9.5N117I+V118R986.5±19.34-45℃6.5-9.0S195A806.4±16.84-50℃6.0-9.0I241R+T243A795.3±13.84-50℃6.0-9.0實施例53α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸的制備參照前述3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸的制備方法的具體實施過程，使用實施例3制備的粗酶液，酶液的投入量以酶液的重量占整個反應(yīng)體系的體積計，控制底物鵝去氧膽酸的終濃度為100mg/mL，其余各具體參數(shù)如表3所示。反應(yīng)4h～12h后測得，底物轉(zhuǎn)化率在99.8%以上，成品含量在96.8%以上，收率為85～95%。表3類型酶液投入量（W/V）丙酮酸鈉投入量NAD+投入量反應(yīng)溫度反應(yīng)pH親本20%20mg/ml0.15mg/ml25℃8.0D91K+L92R20%20mg/ml0.1mg/ml25℃8.0N117I+V118R15%18mg/ml0.1mg/ml30℃8.5S195A20%20mg/ml0.15mg/ml20℃8.0I241R+T243A18%20mg/ml0.13mg/ml30℃8.0實施例63α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸的制備總體系1L，取50g含量為99%的鵝去氧膽酸，懸浮于100mM的磷酸鉀緩沖液（pH8.0），用10MNaOH的調(diào)節(jié)pH到8.0后加入終濃度20g/L的丙酮酸鈉，并依次加入0.09g7α-類固醇脫氫酶凍干粉（S195A突變體酶）和0.07g乳酸脫氫酶凍干粉，最后加入終濃度為0.15g/L的NAD，底物終濃度為50g/L。在25℃、250rpm和pH8.0左右進(jìn)行反應(yīng)4h，轉(zhuǎn)化率達(dá)99.8%。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液滴加鹽酸溶液至pH為1.2，繼續(xù)攪拌30min后待冷卻過濾、經(jīng)水洗三次后真空干燥得到3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸成品67g。成品用900ml無水乙醇60℃水浴條件下攪拌回流1h，過濾取濾液進(jìn)行真空減壓濃縮至200ml體積，再加入1L純水?dāng)嚢?h，過濾，將濾餅真空干燥過夜即得3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸精制品53g。SEQUENCELISTING<110>眉山市新功生物科技有限公司、邦泰生物工程（深圳）有限公司<120>一種3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸的制備方法及其制備用酶4<160>4<170>PatentInversion3.5<210>1<211>915<212>DNA<213>羊種布魯氏菌（Brucellamelitensis）<400>1atgggcgccgacccggtttacggattacccggatttggcgaccatgaagggcgaacgccc60tttaagcgccttcaggtctcagatatagttgccatccgcacgccggtccgcatcacgccg120gatcgcaaagccttctggagaaaatatatgtcctatgagagcccgttccacctgaatgat180gctgttgcaatcgtcaccggagcggcggcaggtatcggacgggccatcgccggaaccttc240gccaaggctggtgcttcggttgtcgtaaccgaccttaaaagcgaaggcgctgaagccgtt300gcagccgcaataaggcaagctggcggcaaggccatcgggcttgaatgcaacgtaaccgac360gagcagcatcgcgaagccgtcatcaaagcggccctcgatcagttcggcaaaatcactgtt420ctggtcaacaatgcgggtggaggcggccccaagcccttcgatatgccgatgagcgacttt480gaatgggccttcaagctcaatctcttttccctgtttcgcctgtcgcaattggctgcccca540cacatgcagaaggctggcggcggcgcaattctcaatatttcgtccatggccggagaaaat600accaatgtccggatggcctcctatggttcgtccaaggcggcggtcaatcacctcacccgc660aacattgccttcgatgtcggcccaatgggcattcgcgtgaatgccatcgcacccggcgcg720atcaagaccgatgcgctcgcaaccgttctgacgcctgaaatcgaacgcgccatactcaag780cacaagccgcttggccgcctcggcgaagcgcaggatatcgccaatgcggcgctgttcctc840tgttcgcccgccgcagcatggatcagcggtcaggttctcacggtttccggcggcggcgtg900caggaactcgactga915<210>2<211>304<212>PRT<213>羊種布魯氏菌（Brucellamelitensis）<400>2MetGlyAlaAspProValTyrGlyLeuProGlyPheGlyAspHisGlu151015GlyArgThrProPheLysArgLeuGlnValSerAspIleValAlaIle202530ArgThrProValArgIleThrProAspArgLysAlaPheTrpArgLys354045TyrMetSerTyrGluSerProPheHisLeuAsnAspAlaValAlaIle505560ValThrGlyAlaAlaAlaGlyIleGlyArgAlaIleAlaGlyThrPhe65707580AlaLysAlaGlyAlaSerValValValThrAspLeuLysSerGluGly859095AlaGluAlaValAlaAlaAlaIleArgGlnAlaGlyGlyLysAlaIle100105110GlyLeuGluCysAsnValThrAspGluGlnHisArgGluAlaValIle115120125LysAlaAlaLeuAspGlnPheGlyLysIleThrValLeuValAsnAsn130135140AlaGlyGlyGlyGlyProLysProPheAspMetProMetSerAspPhe145150155160GluTrpAlaPheLysLeuAsnLeuPheSerLeuPheArgLeuSerGln165170175LeuAlaAlaProHisMetGlnLysAlaGlyGlyGlyAlaIleLeuAsn180185190IleSerSerMetAlaGlyGluAsnThrAsnValArgMetAlaSerTyr195200205GlySerSerLysAlaAlaValAsnHisLeuThrArgAsnIleAlaPhe210215220AspValGlyProMetGlyIleArgValAsnAlaIleAlaProGlyAla225230235240IleLysThrAspAlaLeuAlaThrValLeuThrProGluIleGluArg245250255AlaIleLeuLysHisLysProLeuGlyArgLeuGlyGluAlaGlnAsp260265270IleAlaAsnAlaAlaLeuPheLeuCysSerProAlaAlaAlaTrpIle275280285SerGlyGlnValLeuThrValSerGlyGlyGlyValGlnGluLeuAsp290295300<210>3<211>996<212>DNA<213>魏斯氏菌（Weissellasp）<400>3atgaagatcttcgcgtacggtattcgtgaagacgagcagccggcgctgaaagcgtggatc60gcggcgcacccggaagtgaccgttgaattcaccgaccaactgctggatccggagaccgcg120aagctggcggaaggctttgacgcggtgaacgtttaccagcaactggattatacccgtgag180accctgaccgcgctgcacgaactgggtatcaacaaaatgagcctgcgtaacgttggcacc240gacaacattgactttgatgcggcgcgtgagttcgattttagcatcagcaacgtgccggtt300tatagcccgaacgcgattgcggaacacagcatcattcagatgagccgtctgctgcgtcgt360accaaggcgatggacgcgaaggtggcgaaacacgatctgcgttgggcgccgaccatcggt420cgtgagatgcgtatgcaaaccgtgggtgttatcggtaccggcaacattggccgtgttgcg480atgaagatcctgaaaggtttcggcgcgaaagtgattgcgtacgacctgtatcacaacgcg540gaagttgaggcggaaggtctgtacgtggacaccctggaggaactgtatgcgcaggcggat600gttattaccctgtacgtgccgggcgttccggcgaatcaccacatgatcaacgcggacagc660attgcgaagatgaaagatggtgtggttatcgttaactgcagccgtggcaacctgatggac720atcgacgatgtgattgcgggtctggatagcggcaagattagcgactttgcgatggatgtg780tatgaggaagaggttggtctgttcaacgtggattggagcaacaaggagtttccggacgcg840aaaatcgcggatctgattgcgcgtgaaaacgtgctggttaccccgcacaccgcgttctac900accaccaaggcggtgctggaaatggttacccaaagcatgaacgcgagcctggcgtttatc960aacggcgagaaaccgagcattgcggtggaatattaa996<210>4<211>331<212>PRT<213>魏斯氏菌（Weissellasp）<400>4MetLysIlePheAlaTyrGlyIleArgGluAspGluGlnProAlaLeu151015LysAlaTrpIleAlaAlaHisProGluValThrValGluPheThrAsp202530GlnLeuLeuAspProGluThrAlaLysLeuAlaGluGlyPheAspAla354045ValAsnValTyrGlnGlnLeuAspTyrThrArgGluThrLeuThrAla505560LeuHisGluLeuGlyIleAsnLysMetSerLeuArgAsnValGlyThr65707580AspAsnIleAspPheAspAlaAlaArgGluPheAspPheSerIleSer859095AsnValProValTyrSerProAsnAlaIleAlaGluHisSerIleIle100105110GlnMetSerArgLeuLeuArgArgThrLysAlaMetAspAlaLysVal115120125AlaLysHisAspLeuArgTrpAlaProThrIleGlyArgGluMetArg130135140MetGlnThrValGlyValIleGlyThrGlyAsnIleGlyArgValAla145150155160MetLysIleLeuLysGlyPheGlyAlaLysValIleAlaTyrAspLeu165170175TyrHisAsnAlaGluValGluAlaGluGlyLeuTyrValAspThrLeu180185190GluGluLeuTyrAlaGlnAlaAspValIleThrLeuTyrValProGly195200205ValProAlaAsnHisHisMetIleAsnAlaAspSerIleAlaLysMet210215220LysAspGlyValValIleValAsnCysSerArgGlyAsnLeuMetAsp225230235240IleAspAspValIleAlaGlyLeuAspSerGlyLysIleSerAspPhe245250255AlaMetAspValTyrGluGluGluValGlyLeuPheAsnValAspTrp260265270SerAsnLysGluPheProAspAlaLysIleAlaAspLeuIleAlaArg275280285GluAsnValLeuValThrProHisThrAlaPheTyrThrThrLysAla290295300ValLeuGluMetValThrGlnSerMetAsnAlaSerLeuAlaPheIle305310315320AsnGlyGluLysProSerIleAlaValGluTyr325330當(dāng)前第1頁1 2 3