用于蛋白純化的緩沖液體系的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及純化蛋白的方法，其使用簡化的、不含氯化鈉的緩沖液體系，該體系由用于適當控制溶液pH值的兩個組分(酸堿對)和用于控制離子強度的第三組分組成，其中所述第三組分為鈉鹽共軛堿。
【專利說明】用于蛋白純化的緩沖液體系
發(fā)明領(lǐng)域[0001]本發(fā)明涉及使用一系列色譜單元操作從細胞培養(yǎng)液或發(fā)酵培養(yǎng)液中純化重組蛋白的領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及不含氯化鈉的緩沖液體系，該體系貫穿在蛋白純化的一系列單元操作中使用，其中，酸堿組分連同第三種鈉鹽緩沖液組分以設(shè)定的比例組合，為穩(wěn)健的色譜操作提供充分的對PH值和電導率的控制。
【背景技術(shù)】
[0002]在生物處理工業(yè)中已良好地建立用于回收重組蛋白的正交純化工藝并且其繼續(xù)發(fā)展以提高產(chǎn)量、清除雜質(zhì)、降低產(chǎn)品成本、縮短開發(fā)時間，擴大規(guī)模等。近年來，平臺(platform)方法已明顯成熟，其中需要最低限度的開發(fā)工作的通用模板工藝可用于回收多種亞類的重組蛋白，尤其是單克隆抗體。在這種情況下，用于單克隆抗體和其它蛋白的平臺工藝開發(fā)的核心理念是識別和執(zhí)行適用于多類靶分子的常見的普通單元操作，其能產(chǎn)生一個可以快速設(shè)計可擴大規(guī)模的、穩(wěn)健的工藝的純化步驟的框架。由于開發(fā)針對色譜順序和膜/過濾步驟的操作條件，一個重要的考慮因素是慎重選擇產(chǎn)生穩(wěn)健性和工藝性能提高的緩沖液組分。不用系統(tǒng)化的方法，通過傳統(tǒng)的實驗室規(guī)模的試驗，緩沖液的選擇過程?？僧a(chǎn)生大量的在單元操作到單元操作中并不一定被整合的并且在大規(guī)模生產(chǎn)的實行中可能是麻煩的組分。為了克服這些問題并且限定緩沖液組分的數(shù)量，需要一種整合工藝；此處，我們提出了不含氯化鈉的雙組分緩沖液體系。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]一方面，本發(fā)明涉及通過一系列色譜步驟來純化蛋白的多組分緩沖液體系，其中色譜模式選自蛋白A色譜(protein A chromatography)、陰離子交換色譜，陽離子交換色譜和混合模式色譜，其中所述色譜模式或者在結(jié)合洗脫模式下或者在流通模式下操作，其中所述多組分緩沖液體系包含有機酸、該有機酸的共軛堿的堿金屬鹽或銨鹽以及有機堿，并且其中使用不添加NaCl的緩沖液進行所述色譜模式。
[0004]另一方面，本發(fā)明涉及通過蛋白A色譜法從受污染的溶液中純化蛋白的方法，其包括:(a)用含55mM Tris堿和45mM醋酸的pH約為7.5的蛋白A平衡緩沖液平衡固定在固相上的蛋白A;(b)從受污染的溶液中吸附蛋白至固定在固相上的蛋白A; (c)通過用含55mM Tris堿、45mM醋酸和300mM醋酸鈉的pH約為7.5的第一蛋白A沖洗緩沖液沖洗固相來去除污染物；以及(d)用含1.8mM醋酸鈉和28.2mM醋酸的pH約為3.6的蛋白A洗脫緩沖液來從固相上回收蛋白，其中所有的緩沖液都不添加NaCl。
[0005]另一方面，本發(fā)明涉及通過流通陰離子交換色譜法從受污染的溶液中純化蛋白的方法，其包括:(a)用含55mM Tris堿和45mM醋酸的pH約為7.5的陰離子平衡緩沖液平衡陰離子交換基質(zhì)；(b)向陰離子交換基質(zhì)上樣受污染的溶液并且收集第一流通液；以及(C)向陰離子交換基質(zhì)使用含55mM Tris堿、45mM醋酸和300mM醋酸鈉的陰離子沖洗緩沖液并且收集第二流通液，其中所有的緩沖液都不添加NaCl。[0006]另一方面，本發(fā)明涉及通過陽離子交換色譜法從受污染的溶液中純化蛋白的方法，其包括:(a)用含25mM醋酸鈉和12.1mM醋酸的pH約為5.0的陽離子平衡緩沖液平衡陽離子交換基質(zhì)；(b)從受污染的溶液中吸附蛋白至陽離子交換基質(zhì)；(c)通過用含25mM醋酸鈉和12.1mM醋酸的pH約為5.0的第一陽離子沖洗緩沖液沖洗固相來去除污染物；以及(d)用含175mM醋酸鈉和75mM醋酸的pH約為5.0的陽離子洗脫緩沖液來從固相上回收蛋白，其中所有的緩沖液都不添加NaCl。從這個過程中排除氯化鈉確保同時控制和避免高濃度的氯化物溶液對不銹鋼加工設(shè)備的腐蝕影響。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0007]圖1示出了單克隆抗體(mAb)平臺的下游工藝流程圖和用于控制色譜工藝的關(guān)鍵的PH和離子強度范圍。
[0008]圖2示出了為最小化對原料和儲罐的需求，從濃縮物制備理想的大規(guī)模緩沖液的制備圖。
[0009]圖3示出了對于醋酸和Tris堿緩沖液體系的計算和實驗的pH值、離子強度以及緩沖能力的曲線。
[0010]圖4示出了對于檸檬酸和Tris堿緩沖液體系的計算和實驗的pH值、離子強度以及緩沖能力的曲線。
[0011]圖5示出了醋酸和磷酸鈉緩沖液體系的計算和實驗的pH值、離子強度以及緩沖能力的曲線。
[0012]圖6示出了檸檬酸和磷酸鈉緩沖液體系的計算和實驗的pH值、離子強度以及緩沖能力的曲線。
【具體實施方式】
[0013]應當理解，本發(fā)明不限于具體的方法、試劑、化合物、組合物或生物系統(tǒng)，其當然可以變化。還應當理解，本文所用的術(shù)語僅為描述具體的實施方案，而不是為了限制。如本說明書及所附權(quán)利要求書中使用的，除非內(nèi)容明確另有所指，單數(shù)形式“一個”、“一種”和“該”包括所指事物的復數(shù)形式。因此，例如，提及“多肽”包括兩種或多種多肽的組合等。
[0014]當涉及可測量值如量、持續(xù)時間等時，本文所用的“約”是指涵蓋從特定數(shù)值的±20%或±10%的變體(包括±5%、±1%和±0.1%),這樣的變體適于實施所公開的方法。
[0015]除非另有所指，否則本文所用的所有技術(shù)和科學術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常所理解的相同的含義。盡管任何與本文所述的方法和材料相似或相當?shù)姆椒ê筒牧峡捎糜诒景l(fā)明測試的實踐中，但優(yōu)選的材料和方法如本文所述。在描述和請求保護的本發(fā)明中，將用到以下術(shù)語。
[0016]不含氯化鈉的雙組分緩沖液體系的優(yōu)勢是可以由適合于生物加工的各種各樣的緩沖液組分(例如，醋酸和Tris堿)來實現(xiàn)。然而，這一對特定的組分，以及第三鈉鹽共軛堿(即醋酸鈉)，為特別是結(jié)合了陰離子交換色譜和陽離子交換色譜作為捕獲后的精煉步驟的單克隆抗體平臺提供了優(yōu)勢。這類緩沖液物質(zhì)特別適合于蛋白A色譜；其中通常在中性的PH的條件下進行平衡、裝樣和清洗并且洗脫需要變?yōu)榈蚿H值的步驟。此處可以設(shè)計pH值7.0-8.0的醋酸/ Tris堿混合物為平衡進行緩沖，相同pH值的醋酸/醋酸鈉/ Tris堿混合物用于清洗，后者使用高濃度的醋酸鈉增加離子強度以優(yōu)化工藝和清除與產(chǎn)品相關(guān)的雜質(zhì)，以及低PH值(3.6~3.8)的醋酸/醋酸鈉混合物用于洗脫。另一個優(yōu)勢簡單地涉及在相關(guān)的離子交換色譜操作中醋酸鹽和Tris堿緩沖液物質(zhì)的最小靜電吸附或交換。更具體地，因為Tris堿離子在中性pH條件下具有一個正電荷(其中，陰離子交換色譜常用于典型的具有高等電點的抗體)，其大部分留在溶液中，在整個陰離子交換(AEX)的流通步驟中于低的離子強度條件下提供充足的液相緩沖作用。相反，醋酸根離子具有負電荷并且通過陽離子交換色譜保留在溶液中，再次避免了緩沖液的伴離子(co-1ons)交換并且在酸性pH的條件下(例如PH5.0)提供緩沖作用。這種方法有助于在溫和的緩沖液濃度下通過步驟的改變保持恒定的PH值，避免了可導致在雜質(zhì)清除和步驟效率喪失的pH值瞬變[I]、[2]、
[3]。另一個重要優(yōu)勢涉及這種物質(zhì)的單一 PKa值和在平臺工藝中對于各個步驟最相關(guān)的PH值條件下的緩沖能力(見圖1)。醋酸鹽緩沖液的單一 PKa值，例如，可讓強酸和強堿的量減少，便可達到降低PH值或在病毒滅活步驟中中和的目的，使通過添加導致的離子強度的增加最小化。在此步驟中，離子強度的最小化是獲得以下陰離子交換色譜的流通步驟的最佳性能的關(guān)鍵。然后，陰離子交換產(chǎn)物的低離子強度使得在陽離子交換色譜步驟中結(jié)合能力變高，完全地整和了在此過程中所有的四個步驟(從緩沖液選擇的角度來看)，并避免了在各個步 驟之間TFUF或稀釋的需要。最后，從過程中排除氯化鈉確?？刂撇⒈苊飧邼舛鹊穆然锶芤簩Σ讳P鋼加工設(shè)備的腐蝕影響。高濃度的氯化物溶液與腐蝕是有關(guān)聯(lián)的，特別是在酸性PH值的水平下(例如在陽離子交換色譜中所需)，并且已被報告成制造設(shè)備的問題[4]。
[0017]本發(fā)明具體涉及在平臺工藝的背景下，使用簡化的酸/堿緩沖液體系結(jié)合鈉鹽緩沖液組分作為氯化鈉、高濃度的Tris堿或用于調(diào)節(jié)離子強度的其它組分的替代品。這種方法會導致跨越3.4~7.7的pH范圍的對pH值和電導率更穩(wěn)健的控制，轉(zhuǎn)而，相對于更傳統(tǒng)的采用了大量緩沖液組分的工藝，提高了各色譜步驟的性能。
[0018]本文替換使用的“多肽”、“肽”和“蛋白”是指氨基酸殘基的聚合物。多肽可以是天然(組織衍生的)起源的、重組的或由原核或真核細胞制品天然表達的，或者是經(jīng)由合成方法化學生產(chǎn)的。該術(shù)語適用于氨基酸聚合物(其中一個或多個氨基酸殘基為相應的天然存在的氨基酸的人工化學模擬物)，也適用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。氨基酸模擬物是指具有與氨基酸的一般的化學結(jié)構(gòu)不同的結(jié)構(gòu)，但作用的方式與天然存在的氨基酸類似的化學化合物。科學和專利文獻充分地描述了非天然殘基。一些示例性的用作天然氨基酸殘基模擬物的非天然組合物和指導如下所述。芳香族氨基酸的模擬物可通過由以下替代而生成:例如D-或L-萘基丙氨酸(naphylalanine) ；D-或L-苯基甘氨酸；D-或L-2噻吩基丙氨酸(thieneylalanine) ;D_或L-1, -2，3-,或4-花基丙氨酸(pyreneylalanine) ; D-或 L-3 噻吩基丙氨酸(thieneylalanine) ; D-或 L-(2_ 吡唳基)-丙氨酸；D-或L- (3-吡啶基)-丙氨酸；D-或L- (2-吡嗪基)-丙氨酸；D-或L- (4-異丙基)-苯基甘氨酸:D-(三氟甲基)-苯基甘氨酸；D-(三氟甲基)-苯丙氨酸:D-對-氟-苯丙氨酸；D-或L-對-聯(lián)苯基苯丙氨酸；K-或L-對-甲氧基-聯(lián)苯基苯丙氨酸:D-或L-2-吲哚(烷基)丙氨酸；和D-或L-烷基丙氨酸，其中烷基可以為取代或未取代的甲基、乙基、丙基、己基、丁基、戍基、異丙基、異丁基、sec-1sotyl、異戍基,或非酸性氨基酸。非天然氨基酸的芳香族環(huán)包括，例如噻唑基、噻吩基(thiophenyl)、吡唑基、苯并咪唑基、萘基、呋喃基、吡咯基，和吡啶基芳香族環(huán)。
[0019]本文所用的“肽”包括作為本文具體舉例說明的那些肽的保守變體的肽。本文所用的“保守變體”表示使用另一生物學上相似的殘基替代氨基酸殘基。保守變體的實例包括但不限于，一個疏水性殘基如異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸、正亮氨酸或甲硫氨酸取代另一個疏水殘基，或一個極性殘基取代另一個極性殘基，如精氨酸取代賴氨酸、谷氨酸取代天冬氨酸、或谷氨酰胺取代天冬酰胺等?？苫ハ嗳〈闹行杂H水性氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸和蘇氨酸?！氨Ｊ刈凅w”還包括使用取代的氨基酸代替未取代的母體氨基酸，條件是取代的多肽的抗體也與未取代的多肽起免疫反應。這樣的保守取代在本發(fā)明的肽的種類的定義之內(nèi)。本文所用的“陽離子的”是指在PH7.4時具有凈正電荷的任何肽。肽的生物活性可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的和本文所述的標準方法測定。 [0020]當關(guān)于蛋白使用“重組”時，表示該蛋白已通過異源核酸或蛋白的引入或者天然核酸或蛋白的改造進行修飾。
[0021]本文所用的“治療性蛋白”指的是(例如)研究者或臨床醫(yī)生所尋找的、可向哺乳動物給藥以引出組織、系統(tǒng)、動物或人類的生物學或醫(yī)學應答的任何蛋白和/或多肽。治療性蛋白可引出多于一種生物學或醫(yī)學應答。而術(shù)語“治療有效量”是指與未接受該量的相應的受試者相比，導致(但不限于)疾病、病癥或副作用痊愈、預防或減輕，或者疾病或病癥進展速率降低的任何量。該術(shù)語在其范圍內(nèi)還包括有效增強正常生理功能的量以及在患者中有效地引起增強或有助于第二種藥物的治療作用的生理功能的量。
[0022]本文所鑒定的所有“氨基酸”殘基為天然的L-構(gòu)型。與標準多肽命名一致，氨基酸殘基的縮寫如下表所示。
[0023]表1:氨基酸的縮寫
[0024]
【權(quán)利要求】
1.通過一系列色譜步驟來純化蛋白的多組分緩沖液體系，其中色譜模式選自親和色譜、陰離子交換色譜，陽離子交換色譜和混合模式色譜，其中所述色譜模式在結(jié)合洗脫模式下或者在流通模式下操作，其中所述多組分緩沖液體系包含有機酸、該有機酸的共軛堿的堿金屬鹽或銨鹽以及有機堿，并且其中使用不添加NaCl的緩沖液進行所述色譜模式。
2.權(quán)利要求1所述的體系，其中使用固定在固相上的超抗原來進行所述親和色譜。
3.權(quán)利要求2所述的體系，其中超抗原選自蛋白A、蛋白G和蛋白L。
4.上述權(quán)利要求中任一項所述的體系，其中所述有機酸選自甲酸、乙酸、乳酸、檸檬酸、蘋果酸、馬來酸、甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、琥珀酸、TES(2-{[三(羥甲基)甲基]氨基}乙磺酸)、M0PS(3-(N-嗎啉代)丙磺酸)、PIPES(哌嗪-N，N'-雙(2-乙磺酸))以及MES (2- (N-嗎啉代)乙磺酸)。
5.上述權(quán)利要求中任一項所述的體系，其中所述有機堿選自Tris堿、Bis-Tris、Bis-Tris-丙烷、Bicine (N，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸)、HEPES (4_2_羥乙基-1-哌嗪乙磺酸)、TAPS(3-{[三(羥甲基)甲基]氨基}丙磺酸)以及Tricine(N-三(羥甲基)甲基甘氨酸)。
6.上述權(quán)利要求中任一項所述的體系，其中所述有機酸的共軛堿為該有機酸的共軛堿的鈉鹽、鉀鹽或銨鹽。
7.上述權(quán)利要求中任一項所述的體系，其中所述有機酸為醋酸。
8.上述權(quán)利要求中任一項所述的體系，其中所述有機堿為Tris堿。
9.上述權(quán)利要求中任一項所述的體系，其中所述有機酸為醋酸以及所述有機酸的共軛堿為鈉鹽。
10.上述權(quán)利要求中任一項所述的體系，其中所述蛋白為抗原結(jié)合蛋白。
11.權(quán)利要求10所述的體系，其中所述抗原結(jié)合蛋白為IgG類的抗體。
12.權(quán)利要求10所述的體系，其中所述抗原結(jié)合蛋白為免疫球蛋白單一可變域。
13.上述權(quán)利要求中任一項所述的體系，其中所述色譜步驟的順序包括蛋白A色譜和流通陰離子交換色譜。
14.上述權(quán)利要求中任一項所述的體系，其中所述色譜步驟的順序包括蛋白A色譜、流通陰離子交換色譜和陽離子交換色譜。
15.上述權(quán)利要求中任一項所述的體系，其中所述色譜步驟的順序包括在pH約為7.5的55mM Tris堿、45mM醋酸的存在下進行的蛋白A色譜。
16.上述權(quán)利要求中任一項所述的體系，其中所述色譜步驟的順序包括在pH約為7.5的55mM Tris堿、45mM醋酸的存在下進行的流通陰離子交換色譜。
17.上述權(quán)利要求中任一項所述的體系，其中所述色譜步驟的順序包括在pH約為5.0的25mM醋酸鈉、12.1mM醋酸的存在下進行的陽離子交換色譜。
18.通過蛋白A色譜法從受污染的溶液中純化蛋白的方法，其包括:(a)用含55mMTris堿和45mM醋酸的pH約為7.5的蛋白A平衡緩沖液平衡固定在固相上的蛋白A ； (b)從受污染的溶液中吸附蛋白至固定在固相上的蛋白A ; (c)通過用含55mM Tris堿、45mM醋酸和300mM醋酸鈉的pH約為7.5的第一蛋白A沖洗緩沖液沖洗固相來去除污染物；以及(d)用含1.8mM醋酸鈉和28.2mM醋酸的pH約為3.6的蛋白A洗脫緩沖液從固相上回收蛋白，其中所有的緩沖液都不添加NaCl。
19.權(quán)利要求18所述的方法，進一步包括在步驟(c)之后并且在步驟(d)之前的以下步驟:通過用含55mM Tris堿和45mM醋酸的pH約為7.5的第二蛋白A沖洗緩沖液沖洗固相以去除污染物，其中所述第二蛋白A沖洗緩沖液不添加NaCl。
20.權(quán)利要求18或19所述的方法，進一步包括在步驟(d)之后的以下步驟:(e)用30mM醋酸、IOOmM HCl將含有回收蛋白的溶液滴定至pH約3.0; (f)使步驟(e)的溶液在約3.0的pH值維持約30至約60分鐘；和(g)用約IM Tris將步驟(f)的溶液的pH調(diào)節(jié)至約 7.5。
21.權(quán)利要求20所述的方法，進一步包括過濾由權(quán)利要求18所述的步驟(g)制備的溶液。
22.通過流通陰離子交換色譜法從受污染的溶液中純化蛋白的方法，其包括:(a)用含55mM Tris堿和45mM醋酸的pH約為7.5的陰離子平衡緩沖液平衡陰離子交換基質(zhì)；(b)向陰離子交換基質(zhì)上樣受污染的溶液并且收集第一流通液；以及(c)向陰離子交換基質(zhì)使用含55mM Tris堿、45mM醋酸和300mM醋酸鈉的pH約為7.5的陰離子沖洗緩沖液并且收集第二流通液，其中所有的緩沖液都不添加NaCl。
23.權(quán)利要求22所述的方法，其中所述受污染的溶液為通過權(quán)利要求18所述的步驟(g)制備的溶液或權(quán)利要求19所述的經(jīng)過濾的溶液。
24.權(quán)利要求22或23所述的方法，其中第一流通液和第二流通液合并成單個合并的流通液。
25.權(quán)利要求22、23或24所述的方法，其中用30mM醋酸、IOOmMHCl將第一流通液、第二流通液和單個合并的流通液的pH調(diào)節(jié)至約5.0。
26.通過陽離子交換色譜法從受污染的溶液中純化蛋白的方法,其包括:(a)用含25mM醋酸鈉和12.1mM醋酸的pH約為5.0的陽離子平衡緩沖液平衡陽離子交換基質(zhì)；(b)從受污染的溶液中吸附蛋白至陽離子交換基質(zhì)；(c)通過用含25mM醋酸鈉和12.1mM醋酸的pH約為5.0的第一陽離子沖洗緩沖液沖洗固相來去除污染物；以及(d)用含175mM醋酸鈉和75mM醋酸的pH約為5.0的陽離子洗脫緩沖液來從固相上回收蛋白，其中所有的緩沖液都不添加NaCl。
27.權(quán)利要求26所述的方法，其中受污染的溶液選自權(quán)利要求20或21所述的第一流通液、權(quán)利要求20或21所述的第二流通液、權(quán)利要求22所述的單個合并的流通液和由根據(jù)權(quán)利要求23所制備的pH經(jīng)調(diào)節(jié)的流通液。
【文檔編號】C07K1/16GK103547589SQ201280024938
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2012年3月29日 優(yōu)先權(quán)日:2011年3月29日
【發(fā)明者】K.E.戈克倫, E.J.蘇達, A.R.烏比拉 申請人:葛蘭素史密斯克萊有限責任公司