本發(fā)明涉及由含纖維素生物質(zhì)制造糖液及低聚木糖的方法。

背景技術(shù)：

以糖為原料的化學(xué)品的發(fā)酵生產(chǎn)工藝在各種工業(yè)原料生產(chǎn)中被利用。近年來廣泛研究不與糧食競爭的以含纖維素生物質(zhì)為原料的糖的制造工藝。其中，由于能源使用量及環(huán)境負(fù)荷少、且糖產(chǎn)量多，因此，使用纖維素酶的方法受到矚目。

另一方面，低聚糖除了低甜味、低卡路里、防齲齒性等特性之外，還具有腸道細(xì)菌的選擇性增殖促進(jìn)效果，作為具有良好地保持腸胃狀況的功能的特定保健用食品等有大量市售。這些低聚糖之中，低聚木糖不易被酸、淀粉酶等消化酶分解，人攝取時不被分解、吸收而到達(dá)大腸，因此，最小有效量為0.2～0.7g/天(菓子総合技術(shù)センター：オリゴ糖ハンドブック)，與其它低聚糖相比，以少一位數(shù)的量發(fā)揮其效果。低聚木糖不僅在人的食品用途中利用，也作為家畜飼料的添加劑利用。

低聚木糖由作為植物的主要構(gòu)成成分之一的木聚糖制造。作為低聚木糖的制造方法，已知通過使高溫高壓水在粉碎了闊葉樹中循環(huán)來水解提取原料中的半纖維素的方法(專利文獻(xiàn)1)，用芽孢桿菌屬微生物生產(chǎn)的木聚糖酶處理木聚糖而由反應(yīng)濾液制造低聚木糖的方法(專利文獻(xiàn)2)，將使半纖維素酶與化學(xué)漿料作用而得的反應(yīng)濾液所含的低聚木糖復(fù)合體通過膜過濾法進(jìn)行濃縮，從濃縮液中分離、回收低聚木糖的方法(專利文獻(xiàn)3)等。

作為制造低聚木糖使用的酶，木聚糖酶是代表性的，已知以木霉屬、枝頂孢屬、鏈霉菌屬、曲霉屬等絲狀菌為代表的各種各樣的微生物生產(chǎn)的纖維素酶包含木聚糖酶活性，而另一方面，也已知也包含將低聚木糖分解成單糖單元的β-木糖苷酶活性。因此，為了有效地生產(chǎn)低聚木糖，需要從微生物生產(chǎn)的纖維素酶中純化木聚糖酶除去β-木糖苷酶、或利用不生產(chǎn)β-木糖苷酶的微生物生產(chǎn)木聚糖酶等，從而排除β-木糖苷酶的影響，但這些方法均會涉及酶的成本增加。

現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)1:日本特許第4557648號公報

專利文獻(xiàn)2:日本特開昭61-242592號公報

專利文獻(xiàn)3:日本特許第3951545號公報

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明所要解決的課題

如上所述，利用酶制造低聚木糖要使用木聚糖酶，但使用包含木聚糖酶活性的纖維素酶的情況下，纖維素酶除聚糖酶活性以外，也包含水解低聚木糖的β-木糖苷酶活性。因此，使用纖維素酶制造低聚木糖是困難的。

于是，本發(fā)明的目的在于，通過構(gòu)建利用纖維素酶一并生產(chǎn)糖液及低聚木糖的工藝，使屬于有價物的糖液及低聚木糖的制造工藝整體中使用的酶量，與以往使用各自的酶制造糖液及低聚木糖的工藝的情況下的酶量相比削減。

用于解決課題的方法

本發(fā)明者們深入研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，能夠在低聚木糖制造中使用將含纖維素生物質(zhì)通過源自絲狀菌的纖維素酶進(jìn)行水解而從該水解物中回收的纖維素酶，從而完成了本發(fā)明。

即，本發(fā)明具有以下[1]～[11]的構(gòu)成。

[1]糖液及低聚木糖的制造方法，包括以下工序(1)～(3)，

工序(1)：將含纖維素生物質(zhì)用源自絲狀菌的纖維素酶進(jìn)行水解，

工序(2)：將工序(1)的水解物進(jìn)行固液分離，使溶液成分通過超濾膜而進(jìn)行過濾，作為非透過液回收纖維素酶，作為透過液回收糖液，

工序(3)：使工序(2)的回收纖維素酶與含有木聚糖的原料作用，回收生成的低聚木糖。

[2]根據(jù)[1]所述的糖液及低聚木糖的制造方法，源自絲狀菌的纖維素酶為源自里氏木霉(trichodermareesei)的纖維素酶。

[3]根據(jù)[1]或[2]所述的糖液及低聚木糖的制造方法，在工序(2)中，工序(1)的水解物的電導(dǎo)率小于16ms/cm。

[4]根據(jù)[1]～[3]中任一項(xiàng)所述的糖液及低聚木糖的制造方法，工序(2)的回收纖維素酶的β-木糖苷酶活性小于工序(1)中使用的源自絲狀菌的纖維素酶的5％。

[5]根據(jù)[1]～[4]中任一項(xiàng)所述的糖液及低聚木糖的制造方法，工序(2)的回收纖維素酶至少包含木聚糖酶。

[6]根據(jù)[1]～[5]中任一項(xiàng)所述的糖液及低聚木糖的制造方法，工序(1)是將含纖維素生物質(zhì)的前處理物利用源自絲狀菌的纖維素酶進(jìn)行水解的工序。

[7]根據(jù)[6]所述的糖液及低聚木糖的制造方法，工序(1)是將含纖維素生物質(zhì)的前處理物所含的固體物用水洗滌而得的物質(zhì)利用源自絲狀菌的纖維素酶進(jìn)行水解的工序。

[8]根據(jù)[1]～[7]中任一項(xiàng)所述的糖液及低聚木糖的制造方法，含有木聚糖的原料是含纖維素生物質(zhì)的前處理物。

[9]根據(jù)[8]所述的糖液及低聚木糖的制造方法，含有木聚糖的原料是將含纖維素生物質(zhì)的前處理物進(jìn)行固液分離而得的溶液成分。

[10]根據(jù)[8]所述的糖液及低聚木糖的制造方法，含有木聚糖的原料是將含纖維素生物質(zhì)的前處理物進(jìn)行固液分離而得的固體成分。

[11]根據(jù)[10]所述的方法，是將包括所述工序(1)～(3)的工藝反復(fù)進(jìn)行的糖液及低聚木糖的制造方法，將工序(3)中得到的水解殘留物作為后段工藝的工序(1)的含纖維素生物質(zhì)的一部分或全部使用。

發(fā)明的效果

根據(jù)本發(fā)明，通過將在由含纖維素生物質(zhì)制造糖液的工藝中得到的回收纖維素酶在低聚木糖的制造中再利用，能夠降低糖液及低聚木糖的制造成本。

附圖說明

圖1是顯示本發(fā)明的糖液及低聚木糖的制造方法的實(shí)施方式的示意圖。

具體實(shí)施方式

下面，對于用于實(shí)施本發(fā)明的方式，逐個工序地進(jìn)行說明。

[工序(1)：將含纖維素生物質(zhì)利用源自絲狀菌的纖維素酶進(jìn)行水解的工序]

本發(fā)明中使用的含纖維素生物質(zhì)是指包含纖維素成分的生物資源。纖維素是植物細(xì)胞壁的主成分之一，是β-1,4-鍵合而成的葡萄糖的聚合物。對包含纖維素成分的生物資源，沒有特別限制，除可以使用種子植物、蕨類植物、苔蘚植物、藻類、水草等以外，也可以使用廢舊建材等。種子植物分類成裸子植物和被子植物，任一種均能夠優(yōu)選使用。作為裸子植物的具體例，可以舉出杉樹、松樹等。被子植物分類成單子葉植物和雙子葉植物，任一種均能夠優(yōu)選使用，作為單子葉植物的具體例，可以舉出甘蔗渣、柳枝稷、象草、蔗茅、玉米秸稈、玉米芯、稻秸、麥秸、竹、細(xì)竹等，作為雙子葉植物的具體例，可以舉出甜菜漿、桉樹、橡木、白樺、楊樹、柏樹等。

這些含纖維素生物質(zhì)多數(shù)情況下也包含作為在纖維素纖維素微纖絲間存在的多糖類的半纖維素。因此，工序(1)中得到的含纖維素生物質(zhì)的水解物除作為源自纖維素的糖類的葡萄糖以外，也包含作為源自半纖維素的糖類的木糖、阿拉伯糖、甘露糖等。

另外，含纖維素生物質(zhì)也含有作為芳香族高分子的木質(zhì)素、蛋白質(zhì)等，因此，為了使利用源自絲狀菌的纖維素酶的水解效率提高，優(yōu)選使用實(shí)施了前處理的含纖維素生物質(zhì)。作為前處理的方法，可以舉出利用硫酸、醋酸等的酸處理、利用苛性鈉、氨等的堿處理、水熱處理、亞臨界水處理、微粉碎處理、蒸煮處理、化學(xué)制漿處理(作為具體例，可以舉出亞硫酸鹽法蒸煮或硫酸鹽法蒸煮(kraftcooking)。)。對含纖維素生物質(zhì)實(shí)施了前處理的情況下，有時一部分半纖維素水解，可溶化成木糖、阿拉伯糖、甘露糖等、或者由這些糖構(gòu)成的多糖、低聚糖。

工序(1)中使用含纖維素生物質(zhì)的前處理物的情況下，可以使用包含固體物與溶液成分兩者的狀態(tài)、或通過固液分離和/或固體物的洗滌去除包含木糖等的溶液成分的狀態(tài)中的任一狀態(tài)。

對含纖維素生物質(zhì)的前處理方法沒有特別限定，但優(yōu)選將從含纖維素生物質(zhì)的化學(xué)制漿處理物的水解物中回收的纖維素酶用于后段的工序(3)中的低聚木糖的制造。另外，為了降低本發(fā)明的糖液及低聚木糖一并生產(chǎn)工藝整體的成本，優(yōu)選工序(1)中使用的含纖維素生物質(zhì)與工序(3)中使用的含有木聚糖的原料均是由相同的含纖維素生物質(zhì)得到的前處理物。另外，如后所述，工序(3)中優(yōu)選使用通過含纖維素生物質(zhì)的水熱處理、堿處理得到的含有木聚糖的原料，因此，工序(1)中使用的含纖維素生物質(zhì)也可以是這些前處理物。另外，也可以將單一或多種前處理方法組合而制備含纖維素生物質(zhì)和含有木聚糖的原料。例如作為化學(xué)制漿的前工序進(jìn)行水熱處理等前處理水解的情況下，可以回收含有木聚糖的原料作為溶液成分，然后對固體物實(shí)施化學(xué)制漿處理而作為含纖維素生物質(zhì)使用。

本發(fā)明中，將工序(2)中得到的回收纖維素酶用于工序(3)中制造低聚木糖，因此，如后所述回收纖維素酶優(yōu)選與工序(1)中使用的源自絲狀菌的纖維素酶相比，其β-木糖苷酶活性降低。工序(1)的水解物所含的電解質(zhì)越少，越易獲得β-木糖苷酶活性低的回收纖維素酶。即，優(yōu)選工序(1)的水解物的電導(dǎo)率低，具體而言，優(yōu)選小于16ms/cm。進(jìn)一步優(yōu)選小于10ms/cm。所謂電導(dǎo)率，是溶液的電阻的倒數(shù)，其測定方法在jisk0130“電導(dǎo)率測定法通則”中規(guī)定。溶液的電導(dǎo)率用在面積1m²的2個平面電極以1m的距離相對的容器中充滿電解質(zhì)水溶液而測定的電阻的倒數(shù)表示，溶液中的電解質(zhì)越多，電導(dǎo)率越顯示高值。本發(fā)明中的電導(dǎo)率是含纖維素生物質(zhì)的水解物中電解質(zhì)濃度的指標(biāo)，因此在該水解物中殘留固體物的情況下，是指通過離心分離、過濾等進(jìn)行固液分離而得的溶液成分的電導(dǎo)率。

作為將工序(1)的水解物的電導(dǎo)率調(diào)整到小于16ms/cm的方法，例如可以通過將含纖維素生物質(zhì)的前處理中得到的固體物用水洗滌除去電解質(zhì)，從而將水解物調(diào)整到所希望的電導(dǎo)率。通過降低水解物的電導(dǎo)率，能夠在工序(2)中獲得比工序(1)中使用的纖維素酶β-木糖苷酶活性低的回收纖維素酶，可以優(yōu)選在工序(3)的低聚木糖制造工藝中使用。

對水解反應(yīng)中的含纖維素生物質(zhì)的固體物濃度沒有特別限定，但優(yōu)選1～30重量％的范圍。如果固體物濃度低，則通過水解生成的糖濃度低，有時難以用作發(fā)酵原料。另一方面，如果濃度過高，則有時難以處理。其中，含纖維素生物質(zhì)的重量使用絕干重量計算。絕干重量是指使含纖維素生物質(zhì)在105℃干燥直到變成恒重后的重量。絕干重量的測定可以使用105℃的干燥機(jī)進(jìn)行干燥直到含纖維素生物質(zhì)的重量不變而測定。另外，含木聚糖生物質(zhì)的絕干重量也利用同樣的方法計算。

作為纖維素酶來源的絲狀菌，可以舉出木霉屬(trichoderma)、曲霉屬(aspergillus)、纖維單胞菌屬(cellulomonas)、梭菌屬(clostridium)、鏈霉菌屬(streptomyces)、腐質(zhì)霉屬(humicola)、枝頂孢屬(acremonium)、耙齒菌屬(irpex)、毛霉屬(mucor)、籃狀菌屬(talaromyces)等的微生物。另外，也可以是源自通過對這些微生物用突變劑或紫外線照射等實(shí)施突變處理而纖維素酶生產(chǎn)性提高了的突變株的纖維素酶。

在絲狀菌中，木霉屬微生物由于在水解纖維素時在培養(yǎng)液中大量生產(chǎn)活性高的酶成分，因此可以優(yōu)選在本發(fā)明中使用。作為源自木霉屬微生物的纖維素酶的具體例，可以舉出源自里氏木霉qm9414(trichodermareeseiqm9414)、里氏木霉qm9123(trichodermareeseiqm9123)、里氏木霉rutc-30(trichodermareeseirutc-30)、里氏木霉pc3-7(trichodermareeseipc3-7)、里氏木霉cl-847(trichodermareeseicl-847)、里氏木霉mcg77(trichodermareeseimcg77)、里氏木霉mcg80(trichodermareeseimcg80)、綠色木霉qm9123(trichodermavirideqm9123)的纖維素酶，這些纖維素酶可以單獨(dú)或混合使用。上述源自木霉屬微生物的纖維素酶中，更優(yōu)選的是源自里氏木霉的纖維素酶。

源自絲狀菌的纖維素酶是具有將纖維素和/或半纖維素水解而生成葡萄糖、木糖等單糖的活性的酶組合物，作為酶成分，優(yōu)選包含選自纖維二糖水解酶、內(nèi)切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶及β-木糖苷酶中的1種以上。例如作為源自里氏木霉的纖維素酶的酶成分，可以例示纖維二糖水解酶ⅰ、纖維二糖水解酶ⅱ、內(nèi)切葡聚糖酶ⅰ、內(nèi)切葡聚糖酶ⅲ、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶等，通過這樣的多個酶成分的協(xié)同效果或互補(bǔ)效果，能夠?qū)嵤┯行У睦w維素和/或半纖維素的水解，因此優(yōu)選在本發(fā)明中使用。

纖維二糖水解酶是通過水解纖維素鏈釋放纖維二糖的酶的總稱，作為ec號：ec3.2.1.91記載了歸屬于纖維二糖水解酶的酶群。纖維二糖水解酶ⅰ從纖維素鏈的還原末端側(cè)開始水解反應(yīng)，纖維二糖水解酶ⅱ從非還原末端側(cè)開始水解反應(yīng)。

內(nèi)切葡聚糖酶是以從纖維素分子鏈的中央部分開始水解為特征的纖維素酶的總稱，作為ec號：ec3.2.1.4記載了歸屬于內(nèi)切葡聚糖酶的酶群。

β-葡萄糖苷酶是以作用于纖維寡糖或纖維二糖為特征的酶的總稱，作為ec號：ec3.2.1.21記載了歸屬于β-葡萄糖苷酶的酶群。

木聚糖酶是以作用于半纖維素或特別是木聚糖為特征的酶的總稱，作為ec號：ec3.2.1.8記載了歸木聚糖酶的酶群。

β-木糖苷酶是以作用于低聚木糖為特征的酶的總稱，作為ec號：ec3.2.1.37記載了歸木糖苷酶的酶群。

這樣的纖維素酶成分可以通過凝膠過濾、離子交換、二維電泳等公知方法進(jìn)行分離，對分離而得的成分的氨基酸序列進(jìn)行分析(n末端分析、c末端分析、質(zhì)量分析)，通過與數(shù)據(jù)庫的比較而鑒定。

另外，源自絲狀菌的纖維素酶的酶活性可以以結(jié)晶纖維素、羧甲基纖維素(cmc)、纖維二糖、木聚糖、甘露聚糖等多糖為底物，通過其水解活性進(jìn)行評價。顯示結(jié)晶纖維素分解活性的主要的酶是具有從纖維素末端部分開始水解的特征的纖維二糖水解酶。顯示纖維二糖分解活性的主要的酶是β-葡萄糖苷酶。參與cmc分解活性的主要的酶是纖維二糖水解酶、內(nèi)切葡聚糖酶。顯示木聚糖分解活性的主要的酶是木聚糖酶、β-木糖苷酶。在此，所謂“主要”的含義是來自已知最參與分解的表達(dá)，意味著除此以外的酶成分也參與其分解。

或者也有通過使用4-硝基苯基糖衍生物、4-甲基傘形基糖衍生物等糖衍生物底物，對通過水解反應(yīng)而游離出的色素進(jìn)行定量，從而測定各個酶的活性的方法。

由于絲狀菌在培養(yǎng)液中產(chǎn)生纖維素酶，因此，可以直接使用其培養(yǎng)液作為粗酶劑，也可以將用公知的方法將酶群純化、制劑化而得的產(chǎn)物作為源自絲狀菌的纖維素酶混合物使用。作為將源自絲狀菌的纖維素酶純化、制劑化而得的產(chǎn)物使用的情況下，也可以將添加了蛋白酶抑制劑、分散劑、溶解促進(jìn)劑、穩(wěn)定劑等酶以外的物質(zhì)的產(chǎn)物作為纖維素酶劑使用。此外，在本發(fā)明中，這些中優(yōu)選使用粗酶物。粗酶物源自在為了使絲狀菌產(chǎn)生纖維素酶而調(diào)制的培養(yǎng)基中將該微生物培養(yǎng)任意時間而得的培養(yǎng)上清。對使用的培養(yǎng)基成分不特別限定，但是為了促進(jìn)纖維素酶產(chǎn)生，一般可以使用添加了纖維素的培養(yǎng)基。而且，作為粗酶物，優(yōu)選直接使用培養(yǎng)液、或使用僅除去了菌體的培養(yǎng)上清。

對粗酶物中的各酶成分的重量比沒有特別限定，例如，源自里氏木霉的培養(yǎng)液中含有50～95重量％的纖維二糖水解酶，其余成分包含內(nèi)切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶等。此外，木霉屬的微生物在培養(yǎng)液中產(chǎn)生強(qiáng)的纖維素酶成分，另一方面關(guān)于β-葡糖苷酶，由于其多數(shù)保持在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞表層，因而培養(yǎng)液中的β-葡糖苷酶活性低。因此可以在粗酶物中進(jìn)一步添加異種或同種的β-葡糖苷酶。作為異種的β-葡糖苷酶，可以優(yōu)選使用源自曲霉屬的β-葡糖苷酶。作為源自曲霉屬的β-葡糖苷酶，可以例示出由ノボザイム社市售的“novozyme188”等。另外，可以在木霉屬的微生物導(dǎo)入基因，培養(yǎng)進(jìn)行了基因重組使其培養(yǎng)液中產(chǎn)生β葡糖苷酶的木霉屬的微生物，使用β-葡萄糖苷酶活性提高了的培養(yǎng)液。

水解反應(yīng)的溫度只要依據(jù)源自絲狀菌的纖維素酶的優(yōu)選反應(yīng)條件，就沒有特別限定，但優(yōu)選為30～75℃的范圍，特別是使用源自木霉屬微生物的纖維素酶的情況下，進(jìn)一步優(yōu)選為40～60℃的范圍。

水解反應(yīng)的ph也同樣地只要依據(jù)源自絲狀菌的纖維素酶的優(yōu)選反應(yīng)條件，就沒有特別限定，但優(yōu)選ph3.0～7.0的范圍，進(jìn)一步優(yōu)選為ph4.0～6.0的范圍。使用源自木霉屬微生物的纖維素酶作為源自絲狀菌的纖維素酶的情況下，其反應(yīng)最適ph為5.0。并且，由于在水解過程中ph發(fā)生變化，因此，優(yōu)選在反應(yīng)液中添加緩沖液，或一邊使用酸、堿保持一定ph一邊進(jìn)行。

優(yōu)選水解反應(yīng)的時間為2小時～200小時的范圍。如果小于2小時，則有時無法獲得足夠的糖生成。另一方面，如果超過200小時，則有時纖維素酶失活而對回收纖維素酶的再利用性造成不良影響。

[工序(2)：將工序(1)的水解物進(jìn)行固液分離，使溶液成分通過超濾膜而進(jìn)行過濾，作為非透過液回收纖維素酶，作為透過液回收糖液的工序]

將工序(1)中得到的水解物進(jìn)行固液分離而得的溶液成分中包含源自絲狀菌的纖維素酶成分及糖成分，這些成分可以通過利用超濾膜的過濾進(jìn)行分離。

作為固液分離的方法，沒有特別限定，可以舉出離心分離、壓濾等。

所謂超濾膜，是截留分子量為300～200,000的膜，簡稱為ultrafiltration膜、uf膜等。此外，超濾膜孔徑過小，難以用電子顯微鏡等對膜表面的細(xì)孔徑進(jìn)行計測，因此用截留分子量的值來代替平均細(xì)孔徑作為孔徑大小的指標(biāo)。所謂截留分子量，像在日本膜學(xué)會編膜學(xué)実験シリーズ(膜學(xué)實(shí)驗(yàn)系列)第iii卷人工膜編編集委員/木村尚史·中尾真一·大矢晴彥·仲川勤(1993年，共立出版)的第92中的記載：“溶質(zhì)の分子量を橫軸に、阻止率を縦軸にとってデータをプロットしたものを分畫分子量曲線とよんでいる。そして阻止率が90％となる分子量を膜の分畫分子量とよんでいる。(以溶質(zhì)的分子量作為橫軸、以截留率作為縱軸，將數(shù)據(jù)作圖而得的曲線叫做截留分子量曲線。而且將截留率為90％的分子量叫做膜的截留分子量)?！蹦菢?，其作為表示超濾膜的膜性能的指標(biāo)是本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的。

在使用超濾膜進(jìn)行的源自絲狀菌的纖維素酶與糖成分的分離中，其截留分子量只要能夠使作為糖液主成分的單糖的葡萄糖(分子量180)、木糖(分子量150)透過且能夠截留源自絲狀菌的纖維素酶就不特別限定，但是優(yōu)選截留分子量為500～100,000，從保證源自絲狀菌的纖維素酶成分的收率、且將對酶反應(yīng)顯示抑制作用的夾雜物質(zhì)與源自絲狀菌的纖維素酶成分分離的觀點(diǎn)出發(fā)，更優(yōu)選為截留分子量5,000～50,000的范圍，進(jìn)一步優(yōu)選為截留分子量10,000～30,000的范圍。

作為超濾膜的材料，可以使用聚醚砜(pes)、聚砜(ps)、聚丙烯腈(pan)、聚1,1-二氟乙烯(pvdf)、再生纖維素、纖維素、纖維素酯、磺化聚砜、磺化聚醚砜、聚烯烴、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸甲酯、聚四氟乙烯等，但是由于再生纖維素、纖維素、纖維素酯受到源自絲狀菌的纖維素酶的分解，因此優(yōu)選使用以pes、pvdf等合成高分子作為材料的超濾膜。

作為超濾膜的過濾方式，有死端過濾、錯流過濾，但從抑制膜污染的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選錯流過濾。此外，作為使用的超濾膜的膜形態(tài)，可以使用平膜型、螺旋型、管狀型、中空絲型等適宜的形態(tài)。具體而言，可舉出desal社的g-5型、g-10型、g-20型、g-50型、pw型、hwsuf型，koch社的hfm-180、hfm-183、hfm-251、hfm-300、hfk-131、hfk-328、mpt-u20、mps-u20p、mps-u20s，synder社的spe1、spe3、spe5、spe10、spe30、spv5、spv50、sow30，旭化成株式會社制的マイクローザ(注冊商標(biāo))uf系列的相當(dāng)于截留分子量3,000～10,000的膜，日東電工株式會社制的ntr7410、ntr7450等。

工序(1)中使用的源自絲狀菌的纖維素酶的酶成分的一部分在含纖維素生物質(zhì)的水解反應(yīng)中吸附到未分解纖維素、木質(zhì)素這樣的固體成分上。吸附的纖維素酶成分具有偏重，因此，作為利用超濾膜的過濾的非透過液獲得的回收纖維素酶與工序(1)中使用的絲狀菌纖維素酶相比，其β-木糖苷酶活性降低，優(yōu)選在后述的工序(3)中用于制造低聚木糖。回收纖維素酶的β-木糖苷酶活性越低越好，更優(yōu)選降低到小于工序(1)中使用的源自絲狀菌的纖維素酶的5％。

具體而言，回收纖維素酶的β-木糖苷酶活性降低的結(jié)果，優(yōu)選為回收纖維素酶的β-木糖苷酶活性降低到每單位回收纖維素酶的蛋白質(zhì)量小于0.01u/mg。β-木糖苷酶活性可以以4-硝基苯基-β-d-吡喃木糖苷為底物，對通過水解反應(yīng)而游離出的4-硝基苯酚用比色法進(jìn)行定量，由此測定。

并且，為了在工序(3)中使用回收纖維素酶制造低聚木糖，優(yōu)選回收纖維素酶至少包含木聚糖酶。木聚糖酶催化水解木聚糖主鏈的中間，生成低聚木糖的反應(yīng)。源自絲狀菌的纖維素酶的情況下，已知編碼xyn1(gh11)、xyn2(gh11)、xyn3(gh10)、xyn4(gh5)、xyn5b(gh5)、xyn11(gh11)等木聚糖酶的基因。

作為利用超濾膜的過濾的透過液而被回收的糖液是以作為單糖的葡萄糖和木糖為主成分的糖液，可以直接作為后述發(fā)酵工序中的發(fā)酵原料使用，但是為了提高發(fā)酵工序的效率，也可以進(jìn)行進(jìn)一步提高糖濃度的濃縮處理。作為糖液的濃縮處理，可以示例出蒸發(fā)濃縮、減壓濃縮、膜濃縮等，但是通過能量使用量少且能夠分離糖液中所包含的發(fā)酵抑制物質(zhì)的wo2010/067785號中記載的、通過納濾膜和/或反滲透膜進(jìn)行過濾的方法，能夠獲得糖成分濃縮了的濃縮糖液。

通過培養(yǎng)具有將由本發(fā)明獲得的糖液作為發(fā)酵原料來生產(chǎn)化學(xué)品的能力的微生物，能夠制造各種化學(xué)品。這里所謂的作為發(fā)酵原料而使微生物生長繁育，意思是將糖液中所包含的糖成分或氨源作為微生物的營養(yǎng)素進(jìn)行利用，從而進(jìn)行微生物的增殖、生長繁育維持。這樣的化學(xué)品是以糖液中的糖成分作為碳源，在其代謝過程中在生物體內(nèi)外作為化學(xué)品而蓄積產(chǎn)生的。作為化學(xué)品的具體例，可舉出乙醇、1,3-丙二醇、1,4-丁二醇、甘油等醇，乙酸、乳酸、丙酮酸、琥珀酸、蘋果酸、衣康酸、檸檬酸等有機(jī)酸，肌苷、鳥苷等核苷，肌苷酸、鳥苷酸等核苷酸，尸胺等胺化合物。進(jìn)而，本發(fā)明的糖液還能夠應(yīng)用于酶、抗生素、重組蛋白質(zhì)等的生產(chǎn)中。

[工序(3)：使工序(2)的回收纖維素酶與含有木聚糖的原料作用，回收生成的低聚木糖的工序]

如前所述，工序(2)的回收纖維素酶與工序(1)中使用的源自絲狀菌的纖維素酶相比，其β-木糖苷酶活性降低，能夠優(yōu)選用于由含有木聚糖的原料制造低聚木糖。

本發(fā)明中使用的含有木聚糖的原料只要含有木聚糖就沒有特別限定。木聚糖是在植物細(xì)胞的細(xì)胞壁存在的半纖維素的構(gòu)成成分，是在β-1,4-鍵合而成的木糖主鏈上結(jié)合有各種側(cè)鏈的雜多糖。其結(jié)構(gòu)多種多樣，在植物種間不同。例如作為單子葉植物所含的木聚糖，已知阿拉伯木聚糖，在側(cè)鏈有阿拉伯糖殘基。另一方面，作為雙子葉植物所含的木聚糖，已知葡糖醛酸阿拉伯木聚糖、葡糖醛酸木聚糖，在側(cè)鏈有葡萄糖醛酸殘基及阿拉伯糖殘基。進(jìn)而作為雙子葉植物中特別是闊葉樹所含的木聚糖，已知4-o-甲基葡糖醛酸木聚糖，在側(cè)鏈有4-o-甲基葡糖醛酸殘基。另外，作為裸子植物所含的木聚糖，已知4-o-甲基葡糖醛酸阿拉伯木聚糖，在側(cè)鏈有阿拉伯糖殘基及4-o-甲基葡糖醛酸殘基。本發(fā)明中，包含這些中的任一種的物質(zhì)都能夠作為含有木聚糖的原料使用。

因此，工序(1)中作為含纖維素生物質(zhì)舉出的源自生物資源的生物質(zhì)，也能夠作為含有木聚糖的原料利用。單子葉植物的具體例可以舉出甘蔗渣、柳枝稷、象草、蔗茅、玉米秸稈、玉米芯、稻秸、麥秸、竹、細(xì)竹等。另外，雙子葉植物的具體例可以舉出桉樹、橡木、白樺等闊葉樹、其廢材。

如工序(1)中所述，由于通過前處理而酶的水解效率提高，因此將這些含纖維素生物質(zhì)在工序(3)中作為含有木聚糖的原料使用的情況下，優(yōu)選與工序(1)同樣地實(shí)施前處理。前處理的方法也與工序(1)中的前處理同樣地可以舉出利用硫酸、醋酸等的酸處理、利用苛性鈉、氨等的堿處理、水熱處理、亞臨界水處理、微粉碎處理、蒸煮處理、化學(xué)制漿處理(作為具體例可以舉出亞硫酸鹽蒸煮或硫酸鹽蒸煮(kraftcooling)。)。此外，為了獲得高的低聚木糖收率，優(yōu)選盡可能抑制木聚糖分解到木糖的前處理方法，具體而言，優(yōu)選水熱處理、堿處理。

含有木聚糖的原料是含纖維素生物質(zhì)的前處理物的情況下，根據(jù)前處理方法不同，木聚糖有時作為固體物存在，有時作為溶液成分溶出。在本發(fā)明中，任一種情況均能夠?qū)⒑心揪厶堑奈镔|(zhì)作為含有木聚糖的原料使用。另外，可以將含有溶液成分和固體物兩者的狀態(tài)作為含有木聚糖的原料使用，也可以進(jìn)行固液分離而僅使用包含木聚糖的餾分，但為了制造純度高的低聚木糖，優(yōu)選進(jìn)行固液分離而僅將包含木聚糖的餾分作為含有木聚糖的原料使用。

如工序(1)中所述，也可以將水熱處理與化學(xué)制漿處理等一種或多種前處理方法組合來制備含纖維素生物質(zhì)和含有木聚糖的原料。另外，通過含纖維素生物質(zhì)的前處理而得的包含木聚糖的溶液成分多數(shù)情況下也包含木質(zhì)素等雜質(zhì)，因此，也可以將利用膜分離、溶劑提取等方法除去雜質(zhì)而得的物質(zhì)作為含有木聚糖的原料使用。

通過含纖維素生物質(zhì)的前處理而使木聚糖作為溶液成分溶出的情況下，優(yōu)選將含纖維素生物質(zhì)的前處理物進(jìn)行固液分離而僅將溶液成分作為含有木聚糖的原料供與工序(3)的水解。這種情況下，通過以固體物作為工序(1)的含纖維素生物質(zhì)進(jìn)行水解，可以通過一次前處理而同時獲得含纖維素生物質(zhì)和含有木聚糖的原料，因此，在能夠削減制造成本的方面上是有利的。

含纖維素生物質(zhì)的前處理物所含的木聚糖是固體物的情況下，通過在工序(3)中以該固體物作為含有木聚糖的原料進(jìn)行水解，回收生成的低聚木糖，在下一循環(huán)的工序(1)中將工序(3)的水解殘留物作為含纖維素生物質(zhì)使用，由此能夠由水解殘留物中殘余的纖維素制造糖液。即，能夠?qū)⒑心揪厶堑脑系乃鈿埩粑镒鳛楹w維素生物質(zhì)再利用，因此對制造成本削減是有利的。

對含有木聚糖的原料是固體物的情況下的水解反應(yīng)中固體物濃度沒有特別限定，但優(yōu)選1～30重量％的范圍。如果固體物濃度低，則獲得足夠的低聚木糖產(chǎn)量所需的液量增加，因此，有時對后面的低聚木糖純化工序不利。另一方面，如果固體物濃度過高，則有時難以處理。

水解反應(yīng)的溫度與工序(1)同樣地只要依據(jù)源自絲狀菌的纖維素酶的優(yōu)選反應(yīng)條件，就沒有特別限定，但優(yōu)選為30～75℃的范圍，特別是工序(1)中使用源自木霉屬微生物的纖維素酶的情況下，進(jìn)一步優(yōu)選為40～60℃的范圍。

水解反應(yīng)的ph也同樣地只要依據(jù)源自絲狀菌的纖維素酶的優(yōu)選反應(yīng)條件，就沒有特別限定，但優(yōu)選ph3.0～7.0的范圍，進(jìn)一步優(yōu)選為ph4.0～6.0的范圍。工序(1)中使用源自木霉屬微生物的纖維素酶的情況下，其反應(yīng)最適ph為5.0。并且，由于在水解過程中ph發(fā)生變化，因此，優(yōu)選在反應(yīng)液中添加緩沖液，或一邊使用酸、堿保持一定ph一邊進(jìn)行。

水解反應(yīng)的時間優(yōu)選為10分鐘～48小時的范圍。本發(fā)明的低聚木糖優(yōu)選聚合度為2～10的范圍的低聚木糖，特別優(yōu)選以作為腸道細(xì)菌的乳酸菌、雙歧桿菌的同化性良好的聚合度為2(木二糖)和/或聚合度為3(木三糖)的低聚木糖為主成分。如果反應(yīng)時間小于10分鐘，則有時無法獲得足夠的低聚木糖生成。另一方面，如果反應(yīng)時間過長，則有時會由于回收纖維素酶所含的微量的β-木糖苷酶的作用、木聚糖酶的作用而導(dǎo)致低聚木糖分解，作為單糖的木糖增加，因此優(yōu)選在48小時以內(nèi)結(jié)束反應(yīng)。

通過回收纖維素酶的作用而生成的低聚木糖液包含其它種類的雜質(zhì)、殘留物，因此，可以利用過濾、或離子交換樹脂、合成吸附劑、活性碳等吸附劑純化低聚木糖。通過使用吸附劑，能夠除去源自含有木聚糖的原料的著色成分，因此，在加工食品、飲料加工等中的利用性提高。得到的低聚木糖液也可以根據(jù)需要進(jìn)行粉末化。

實(shí)施例

下面，通過實(shí)施例進(jìn)一步具體說明本發(fā)明。但是，本發(fā)明不受其限定。

(參考例1)源自木霉屬微生物的纖維素酶的制備

源自木霉屬微生物的纖維素酶利用以下方法制備。

[預(yù)培養(yǎng)]

以玉米浸漬液5％(w/v)、葡萄糖2％(w/v)、酒石酸銨0.37％(w/v)、硫酸銨0.14％(w/v)、磷酸二氫鉀0.14％(w/v)、氯化鈣二水合物0.03％(w/v)、硫酸鎂七水合物0.03％(w/v)、氯化鋅0.02％(w/v)、氯化鐵(ⅲ)六水合物0.01％(w/v)、硫酸銅(ⅱ)五水合物0.004％(w/v)、氯化錳四水合物0.0008％(w/v)、硼酸0.0006％(w/v)、七鉬酸六銨四水合物0.026％(w/v)的方式溶解到ro水中，將100ml加入到500ml容量帶擋板的三角燒瓶中，在121℃下高壓釜滅菌15分鐘。放冷后，將與其分開地分別在121℃的溫度下高壓釜滅菌了15分鐘的pe-m和tween80分別以0.01％(w/vol)添加。在該預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中以1×10⁵個/ml的方式接種里氏木霉qm9414，以28℃、180rpm振蕩培養(yǎng)72小時，作為預(yù)培養(yǎng)液(振蕩裝置：taitec制造bio-shakerbr-40lf)。

[主培養(yǎng)]

以玉米浸漬液5％(w/v)、葡萄糖2％(w/v)、纖維素(avicel)10％(w/v)、酒石酸銨0.37％(w/v)、硫酸銨0.14％(w/v)、磷酸二氫鉀0.2％(w/v)、氯化鈣二水合物0.03％(w/v)、硫酸鎂七水合物0.03％(w/v)、氯化鋅0.02％(w/v)、氯化鐵(ⅲ)六水合物0.01％(w/v)、硫酸銅(ⅱ)五水合物0.004％(w/v)、氯化錳四水合物0.0008％(w/v)、硼酸0.006％(w/v)、七鉬酸六銨四水合物0.0026％(w/v)的方式溶解到蒸留水中，將2.5l加入到5l容量的發(fā)酵罐(able制造dpc-2a)中，在121℃下高壓釜滅菌15分鐘。放冷后，將與其分開地分別在121℃的溫度下高壓釜滅菌了15分鐘的pe-m和tween80分別以0.01％添加，接種用前述方法得到的預(yù)培養(yǎng)液250ml。其后，以28℃、300rpm、通氣量1vvm進(jìn)行87小時培養(yǎng)。將得到的培養(yǎng)液進(jìn)行離心分離，培養(yǎng)上清作為粗酶液使用。此外，按照后述的參考例2測定培養(yǎng)上清的蛋白質(zhì)濃度，結(jié)果為10g/l。

(參考例2)蛋白質(zhì)濃度的測定

蛋白質(zhì)濃度使用市售的蛋白質(zhì)濃度測定試劑(quickstartbradfordproteinassay，bio-rad制造)。在恢復(fù)到室溫的蛋白質(zhì)濃度測定試劑250μl中添加稀釋的纖維素酶溶液5μl，在室溫下用酶標(biāo)儀(multiskango，サーモサイエンティフィック制造)測定靜置5分鐘后在595nm下的吸光度。以牛血清白蛋白水溶液為標(biāo)準(zhǔn)液，與校正曲線對照計算出纖維素酶溶液的蛋白質(zhì)濃度。

(參考例3)糖濃度的測定

糖液所含的葡萄糖、木糖、木二糖及木三糖濃度在下述所示的hplc條件下，通過與標(biāo)準(zhǔn)品的比較來定量。

柱：aquityuplcbehamide(waters制造)

流動相a：80％乙腈+0.1％tfa

流動相b：30％乙腈+0.1％tfa

流速：0.12ml/min

在10分鐘內(nèi)使流動相b的比例從0緩慢上升到40％，在10.01分鐘再次僅為流動相a，進(jìn)行分析到20分鐘為止。

檢測方法：elsd(蒸發(fā)光散射檢測器)

溫度：55℃。

(參考例4)β-木糖苷酶活性的測定方法

作為β-木糖苷酶活性，測定4-硝基苯基-β-d-吡喃木糖苷(pnp-xyl)的分解活性。在包含1.1mm底物的55mm醋酸緩沖液(ph5.0)0.9ml中加入酶液0.1ml，在30℃下使其準(zhǔn)確反應(yīng)30分鐘(底物的終濃度1mm，緩沖液的終濃度50mm)后，添加0.1ml的2m碳酸鈉水溶液使反應(yīng)停止，測定405nm下的吸光度(odtest)。對于在底物溶液中依次添加2m碳酸鈉水溶液、酶液而得的樣品也同樣測定405nm下的吸光度作為空白(odblank)。將在上述反應(yīng)體系中1分鐘生成1μmol的4-硝基苯酚的酶量定義為1u，按照下述式計算出活性值(u/ml)。此外，上述反應(yīng)體系中的4-硝基苯酚的毫摩爾分子吸光系數(shù)為17.2l/mmol/cm。

β-木糖苷酶活性(u/ml)＝{(odtest-odblank)×1.1(ml)×酶稀釋倍率}/{17.2×30(分鐘)×0.1(ml)}。

(參考例5)含纖維素生物質(zhì)的前處理

使用橡木、甘蔗渣、白樺三種前處理物作為含纖維素生物質(zhì)。橡木使用制漿了的產(chǎn)物(兵庫漿)作為橡木前處理物1。甘蔗渣及白樺分別按照以下所示的步驟進(jìn)行前處理，作為甘蔗渣前處理物1～4、白樺前處理物1～3使用。

(1)甘蔗渣的水熱處理

將甘蔗渣制漿(固體成分濃度30重量％)，200℃處理10分鐘。水熱處理結(jié)束后進(jìn)行固液分離，將固體物充分洗滌而得的物質(zhì)作為甘蔗渣前處理物1，將溶液作為甘蔗渣前處理物2。

(2)甘蔗渣的堿處理

將相對于每1g甘蔗渣的固體物添加了100mg氫氧化鈉而得的固體成分濃度30重量％的漿在180℃處理10分鐘。堿處理結(jié)束后進(jìn)行固液分離，將固體物充分洗滌而得的物質(zhì)作為甘蔗渣前處理物3，將溶液作為甘蔗渣前處理物4。

(3)白樺的水熱處理

將白樺屑的漿(固體成分濃度30重量％)在150℃下處理4小時。水熱處理結(jié)束后進(jìn)行固液分離，將固體成分充分洗滌而得的物質(zhì)作為白樺樹前處理物1，將溶液作為白樺樹前處理物2。

(4)白樺前處理物2的丙酮分級

添加與前項(xiàng)(3)所得的白樺前處理物2等量的冷丙酮，在冰上攪拌5分鐘后，室溫下靜置。在1小時后進(jìn)行過濾，使所得固體物干燥，作為白樺樹處理物3。

(參考例6)利用源自木霉屬微生物的纖維素酶的含纖維素生物質(zhì)的水解和回收纖維素酶的制備

[工序1：含纖維素生物質(zhì)的水解]

使用橡木前處理物、甘蔗渣前處理物1、甘蔗渣前處理物3中的任一種作為含纖維素生物質(zhì)。在50ml容量離心管中取以絕干重量計為1g的各前處理物，加入ro水制備漿。此外，含水率使用紅外線水分儀(ケツト科學(xué)研究所制造fd-720)，通過使樣品在105℃下干燥而測定。添加稀硫酸將漿的ph調(diào)節(jié)到ph4.7～5.3的范圍內(nèi)，添加1.0ml按照參考例1制備的源自木霉屬微生物的纖維素酶(蛋白質(zhì)濃度：10g/l)、和0.45ml源自黑曲霉的β-葡萄糖苷酶(megazyme制造，e-bgluc，蛋白質(zhì)濃度：1.1g/l)。以最后總重量為10g的方式加入ro水并使固體物終濃度為10重量％，在50℃下使用雜交轉(zhuǎn)子旋轉(zhuǎn)混和24小時(日伸理化株式會社制造sn-06bn)。

[工序2：回收纖維素酶的制備]

將水解物通過離心分離(8,000g、10分鐘)進(jìn)行固液分離，獲得溶液成分和水解殘留物。使回收的溶液成分通過孔徑為0.2μm的精密過濾膜(25mmgd/x注射器過濾器，材質(zhì)：pvdf，geヘルスケア·ジャパン制造)除去微粒后，用截留分子量10,000的超濾膜(vivaspinturbo15材質(zhì)：pes，sartoriusstedimbiotech制造)過濾?；厥辗峭高^側(cè)，作為糖液回收透過側(cè)。對于糖液，按照參考例3測定糖濃度。對于回收纖維素酶液，按照參考例4進(jìn)行β-木糖苷酶活性測定。糖液的糖濃度示于表1，回收纖維素酶液的β-木糖苷酶活性示于表2。

表1

(比較例1)使用源自絲狀菌的纖維素酶水解含有木聚糖的原料

作為含有木聚糖的原料，分別在50ml容量離心管中分別取10ml甘蔗渣前處理物2、10ml白樺前處理物2、10g甘蔗渣前處理物3或白樺前處理物3的漿(固體物濃度10重量％，用稀硫酸調(diào)整到ph5)，添加1.0ml的ro水或1.0ml按照參考例1制備的源自木霉屬微生物的纖維素酶。在50℃下旋轉(zhuǎn)混和6小時后進(jìn)行離心分離(8,000g，10分鐘)，按照參考例3分析上清的糖濃度。

(實(shí)施例1)使用源自木霉屬微生物的回收纖維素酶水解含有木聚糖的原料

用按照參考例6獲得的回收纖維素酶的總量來代替源自木霉屬微生物的纖維素酶，其它與比較例1同樣地實(shí)施水解。將比較例1及實(shí)施例1的糖濃度示于表3。在使用源自作為禾本科植物的甘蔗渣、作為闊葉樹的白樺中的任一者的含有木聚糖的原料的情況下，均是通過使回收纖維素酶作用，與使源自木霉屬微生物的纖維素酶作用的情況相比，生成了更多的低聚木糖。

表3

(實(shí)施例2)含纖維素生物質(zhì)水解物的電導(dǎo)率與回收纖維素酶的β-木糖苷酶活性的關(guān)系

使用橡木前處理物作為含纖維素生物質(zhì)，利用與參考例6同樣的方法進(jìn)行水解及制備回收纖維素酶。但是，在水解反應(yīng)中添加氯化鈉，獲得不同的電導(dǎo)率的水解物。

參考例6中使用的源自黑曲霉的β-葡萄糖苷酶(megazyme制造e-bgluc，蛋白質(zhì)濃度：1.1g/l)是懸浮于3.2m的硫酸銨中的制品，因此用截留分子量10,000的超濾膜(vivaspinturbo15材質(zhì)：pes，sartoriusstedimbiotech制造)加水過濾而進(jìn)行脫鹽，制備稀釋到1,000倍以上的脫鹽酶溶液。在該脫鹽酶溶液中按表4所示的濃度添加氯化鈉，制備各電導(dǎo)率的水解物。對于電導(dǎo)率為9.4ms/cm以上的水解物，使用非脫鹽酶溶液制備。

由各水解物獲得回收纖維素酶液，按照參考例4測定β-木糖苷酶活性。將水解物的電導(dǎo)率和回收纖維素酶的β-木糖苷酶活性示于表4。在水解物的電導(dǎo)率小于16.3ms/cm的情況下，β-木糖苷酶活性小于5％。

(實(shí)施例3)回收纖維素酶的β-木糖苷酶活性與生成低聚木糖的關(guān)系

使用實(shí)施例2中得到的回收纖維素酶，利用與實(shí)施例1同樣的方法實(shí)施甘蔗渣前處理物2的水解。將上清的糖濃度示于表5。

由這些結(jié)果可知，不使用回收纖維素酶的情況下，木聚糖分解到單糖木糖，沒有檢測到低聚木糖，與此相對，通過使用回收纖維素酶，以高糖產(chǎn)量獲得低聚木糖。另外可知，在回收后的β-木糖苷酶的活性降低到小于回收前的5％的情況下，以特別高的糖產(chǎn)量獲得低聚木糖。

產(chǎn)業(yè)可利用性

根據(jù)本發(fā)明中的糖液及低聚木糖的制造方法，回收為了由含纖維素生物質(zhì)制造糖液而使用的源自絲狀菌的纖維素酶，在低聚木糖的制造中再利用，由此能夠削減低聚木糖的制造成本。另外，本發(fā)明中制造的糖液能夠作為各種化學(xué)品的發(fā)酵原料使用。本發(fā)明中制造的低聚木糖能夠作為食品、飼料中的添加劑使用。