專(zhuān)利名稱：一種纖維素酶在大腸桿菌中可溶及分泌表達(dá)重組蛋白的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種纖維素酶蛋白的應(yīng)用，尤其涉及一種纖維素酶蛋白在大腸桿菌中可溶性表達(dá)并分泌表達(dá)重組蛋白的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
機(jī)體中的每一個(gè)細(xì)胞和所有重要組成部分都有蛋白質(zhì)參與。因此，蛋白類(lèi)分子是現(xiàn)代生物技術(shù)和生物制藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的基石。蛋白質(zhì)一直是生物研究的一個(gè)重要方面，獲得大量純化的蛋白質(zhì)樣品是蛋白質(zhì)理化性質(zhì)與功能研究、生物制藥和酶制劑產(chǎn)業(yè)發(fā)展的基礎(chǔ)。為了獲得大量的重組蛋白，人們發(fā)展了多種的蛋白表達(dá)系統(tǒng)，而其中大腸桿菌表 達(dá)系統(tǒng)因其操作簡(jiǎn)單、遺傳背景清楚、技術(shù)成熟、能夠高效的表達(dá)各種異源蛋白等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于研究和生產(chǎn)當(dāng)中。但是，首先大腸桿菌表達(dá)的蛋白大都存在于細(xì)胞內(nèi)，蛋白純化困難；同時(shí)，大腸桿菌缺少蛋白的翻譯后修飾系統(tǒng)，常常不能將翻譯出的多肽鏈正確折疊修飾形成天然構(gòu)象的蛋白質(zhì)，而是形成不可溶的無(wú)功能的包涵體。包涵體中的多肽鏈折疊錯(cuò)誤，必須通過(guò)復(fù)雜的變性復(fù)性過(guò)程才能獲得有功能的蛋白，而復(fù)雜蛋白的復(fù)性過(guò)程的成功率非常低，導(dǎo)致蛋白的回收率非常低。以上這些方面都嚴(yán)重影響了大腸桿菌在重組蛋白生產(chǎn)方面的應(yīng)用。為了克服大腸桿菌在蛋白表達(dá)方面的瓶頸，人們開(kāi)發(fā)了多種促使外源蛋白在大腸桿菌中高效、可溶性及分泌表達(dá)的方法。其中，形成融合蛋白的方法在可溶性表達(dá)和分泌表達(dá)方面被廣泛的利用，并具有良好的效果?，F(xiàn)在普遍使用的融合伴侶蛋白如葡萄球菌A蛋白(SPA)、硫氧還原蛋白、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)或是周質(zhì)蛋白TIoAIII等在融合后可提高蛋白的溶解性；0mpA、OmpF> OsmY或是YebF等蛋白融合后促進(jìn)蛋白的分泌。但是這些融合伴侶蛋白的使用不具有普遍性、同時(shí)受到穩(wěn)定性較差和效率不能達(dá)到生產(chǎn)的要求等因素的困擾。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，選擇一種合適的融合蛋白對(duì)于提高蛋白的溶解性和分泌性是至關(guān)重要，且融合伴侶蛋白在蛋白表達(dá)研究、酶制劑和蛋白藥物生產(chǎn)等方面具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值，因此尋找更為高效的、具有廣泛適用性的融合伴侶蛋白成為目前研究的熱點(diǎn)。本發(fā)明所述的纖維素酶蛋白為一種芽孢桿菌(Bacillus sp. Z_16)來(lái)源的纖維素酶(Cellulase)，其具有較高的水解纖維素的活性，目前主要應(yīng)用于洗滌、紡織、造紙和環(huán)保等方面。我們發(fā)現(xiàn)這種蛋白可以在大腸桿菌中高效可溶、分泌表達(dá)。檢索表明其在大腸桿菌中可溶及分泌表達(dá)的性質(zhì)，以及其作為融和蛋白在大腸桿菌中進(jìn)行重組蛋白的可溶及分泌表達(dá)的應(yīng)用在國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種纖維素酶的蛋白序列，利用此蛋白序列作為融合蛋白，在大腸桿菌中可溶及分泌表達(dá)重組蛋白過(guò)程中的應(yīng)用。其中所述纖維素酶蛋白在大腸桿菌中能高效表達(dá)重組纖維素酶蛋白，并能以融合蛋白形式促進(jìn)其它蛋白的分泌。本發(fā)明所述纖維素酶的蛋白序列在大腸桿菌中可溶及分泌表達(dá)重組蛋白過(guò)程中的應(yīng)用，其中所述蛋白序列是SEQ ID NO :I所不的氣基酸序列，或是與SEQ ID N0:1所不氨基酸序列具有70%及以上同源性的多肽序列。進(jìn)一步的，上述蛋白序列是SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列，或是與SEQ ID NO 2所示氨基酸序列具有70%及以上同源性的多肽序列。優(yōu)選的，上述蛋白序列是SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列，或是與SEQ ID NO :3所示氨基酸序列具有70%及以上同源性的多肽序列。最優(yōu)選的，上述蛋白序列是SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6 或 SEQ ID NO 7所示的氨基酸序列，或是與所述氨基酸序列之一所示的氨基酸序列具有至少70%同源性的多肽序列。本發(fā)明所述纖維素酶的蛋白序列在大腸桿菌中可溶及分泌表達(dá)重組蛋白的方法為將編碼所述纖維素酶蛋白的核苷酸序列與編碼所需表達(dá)蛋白的核苷酸序列連接組成融和基因后克隆入大腸桿菌表達(dá)載體，而后將該載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達(dá)宿主菌中進(jìn)行表達(dá)。上述方法中，可以在本發(fā)明所述伴侶蛋白的末端添加純化標(biāo)簽，以方便可溶性表達(dá)的融合蛋白的純化。上述方法中，可以在本發(fā)明所述伴侶蛋白與所需表達(dá)蛋白之間添加水解酶位點(diǎn)。水解酶優(yōu)選腸激酶、內(nèi)含肽、凝血酶、各種蛋白酶等，以方便表達(dá)蛋白的純化。上述方法中，融合蛋白可以使用層析柱進(jìn)行分離純化，在洗脫前使用相應(yīng)的水解酶進(jìn)行處理，以分離純化目的蛋白。上述方法中，所述重組蛋白主要是蛋白酶類(lèi)，特別是麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)、胰高血糖素樣肽(GLP-I)或酵母糖酰胺酶(Pnglp)。本發(fā)明提供的纖維素酶蛋白或多肽序列可以在大腸桿菌中進(jìn)行可溶性及分泌表達(dá)融合蛋白，同時(shí)本發(fā)明還提供了優(yōu)選的蛋白分離純化方法，為利用大腸桿菌制備蛋白質(zhì)/多肽類(lèi)藥物、各種酶類(lèi)、診斷抗原、抗體以及疫苗等提供了基礎(chǔ)。在蛋白表達(dá)研究、酶制劑和蛋白藥物生產(chǎn)等方面具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。


圖I.纖維素酶(Cel)大腸桿菌高效表達(dá)載體的構(gòu)建圖。圖2.為Cel在大腸桿菌中高效表達(dá)的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果。圖中M :低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)O :攜帶空質(zhì)粒載體的對(duì)照菌體其他條帶為不同誘導(dǎo)時(shí)間的工程菌菌體。圖3.為Cel在大腸桿菌中分泌表達(dá)的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果。圖中M :低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)O :攜帶空質(zhì)粒載體菌株發(fā)酵上清液其他條帶為不同誘導(dǎo)時(shí)間的工程菌發(fā)酵液。
圖4. Cel-⑶與Pnglp融和蛋白在大腸桿菌中高效可溶表達(dá)的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)
果O圖中M :低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)I和2 :均為菌體破碎液中的可溶性Cel-⑶-Pnglp樣品。圖5.融和蛋白中純化的Pnglp的脫糖基化性質(zhì)測(cè)定。圖中底物為變性的RNase BI :對(duì)照2 :Cel-CD_Pnglp 融和蛋白3 :純化自融和蛋白的Pnglp蛋白4 :純化包涵體的的Pnglp融合蛋白。圖6. Cel-⑶與MBP融和蛋白在大腸桿菌中分泌表達(dá)的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果。圖中M :低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)I :攜帶空質(zhì)粒載體的對(duì)照菌體
2，3 :均為Cel-⑶-MBP融和蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的菌體4 :攜帶空質(zhì)粒載體的對(duì)照菌體發(fā)酵液5,6 :均為Cel-⑶-MBP融和蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的發(fā)酵液上清。圖7. Cel-⑶與GLP-I融和蛋白在大腸桿菌中分泌表達(dá)的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果。圖中M :低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)I :攜帶空質(zhì)粒載體的對(duì)照菌體發(fā)酵液2 :均為Cel-⑶-GLP-I融和蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的發(fā)酵液上清。圖8.含有所述引導(dǎo)肽序列的表達(dá)載體的構(gòu)建圖。圖9. CBD在大腸桿菌中分泌表達(dá)的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果。圖中M :核酸分子標(biāo)準(zhǔn)I :引導(dǎo)肽I與CBD融合蛋白發(fā)酵結(jié)果2 :引導(dǎo)肽2與CBD融合蛋白發(fā)酵結(jié)果3 :引導(dǎo)肽3與CBD融合蛋白發(fā)酵結(jié)果
4 :引導(dǎo)肽4與CBD融合蛋白發(fā)酵結(jié)果。圖10. PhoA在大腸桿菌中分泌表達(dá)的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果。圖中M :核酸分子標(biāo)準(zhǔn)I :引導(dǎo)肽I與PhoA融合蛋白發(fā)酵結(jié)果2 :引導(dǎo)肽2與PhoA融合蛋白發(fā)酵結(jié)果3 :引導(dǎo)肽3與PhoA融合蛋白發(fā)酵結(jié)果4 :引導(dǎo)肽4與PhoA融合蛋白發(fā)酵結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖，以較佳實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明詳細(xì)描述，但本所述內(nèi)容不限制本發(fā)明。下列實(shí)施例中未標(biāo)明具體條件的試驗(yàn)方法，基本上都按照分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(NewYork Cold Spring Harbor Laboratory Press)中所述的條件,或是按照相關(guān)試劑或是試劑盒制造商所建議的條件。
實(shí)施例I :纖維素酶在大腸桿菌中高效表達(dá)載體的構(gòu)建I.菌株和質(zhì)粒大腸桿菌DH5 α (E. coli DH5 a LacZ ΔΜ15 hsdR recA)大腸桿菌BL21 (DE3) (E. coli BL21 (DE3))大腸桿菌BL21 (DE3) /pLysS (E. coli BL21 (DE3) /pLys)質(zhì)粒pET28a以上菌株和質(zhì)粒均購(gòu)自Novagen公司。2.分子克隆用酶和試劑限制性內(nèi)切酶NcoI、BamHI ；Pfu DNA聚合酶；T4連接酶；蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)均購(gòu)自MBI-Fermentas0Agarose Gel DNA Purification Kit, DNA Fragment Purification Kit 購(gòu)自O(shè)MEGA Ltd.。TIANprep Mini Plasmid Kit 購(gòu)自 TIANGEN。核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)IKb Marker購(gòu)自BioLab。3.方法以Bacillus sp. Z-16基因組DNA為模板，利用引物Cel-F/Cel-R擴(kuò)增編碼Cellulase (縮寫(xiě)為Cel)的基因序列，Cel基因的理論長(zhǎng)度為2475bp。在Cel-Fl/Cel-Rl的兩端分別帶有Ncol/Xhol酶切位點(diǎn)，引物由北京華大基因公司合成Cel-Fl :5’ -TTTTCCATGGAAGGAAACACTCGTGAAGAC-3’ (酶切位點(diǎn) NcoI)Cel-Rl 5 -TTTTCTCGAGTTTTTTCTTAGCCTCATTTTTG-3> (酶切位點(diǎn) XhoI)以Cel-Fl和Cel-Rl為引物，利用PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))體外擴(kuò)增Cel核苷酸序列。DNA 聚合酶為 TransEco FastPfu DNA Polymerase。Bacillus sp. Z_16 纖維素酶 Cel基因的PCR擴(kuò)增體系及條件見(jiàn)表I. I表I. I纖維素酶基因的PCR擴(kuò)增體系及條件
權(quán)利要求
1.一種纖維素酶的蛋白序列在大腸桿菌中可溶及分泌表達(dá)重組蛋白過(guò)程中的應(yīng)用，其中所述蛋白序列是SEQ ID NO :I所示的氨基酸序列，或是與SEQ ID NO :1所示氨基酸序列具有70%及以上同源性的多肽序列。
2.如權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于所述蛋白序列是SEQID NO :2所不的氣基酸序列，或是與SEQ ID NO 2所示氨基酸序列具有70%及以上同源性的多肽序列。
3.如權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于所述蛋白序列是SEQID NO :3所不的氣基酸序列，或是與SEQ ID NO 3所示氨基酸序列具有70%及以上同源性的多肽序列。
4.如權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于所述蛋白序列是SEQID N0:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO :6或SEQ ID NO :7所示的氨基酸序列，或是與所述氨基酸序列之一所示的氨基酸序列具有至少70%同源性的多肽序列。
5.如權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于所述纖維素酶的蛋白序列在大腸桿菌中可溶及分泌表達(dá)重組蛋白的方法為將編碼所述纖維素酶蛋白的核苷酸序列與編碼所需表達(dá)蛋白的核苷酸序列連接組成融和基因后克隆入大腸桿菌表達(dá)載體，而后將該載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達(dá)宿主菌中進(jìn)行表達(dá)。
6.如權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于所述重組蛋白是抗菌肽或酶類(lèi)。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述重組蛋白是麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)、胰高血糖素樣肽(GLP-I)或酵母糖酰胺酶(Pnglp)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種纖維素酶蛋白在大腸桿菌中可溶及分泌表達(dá)重組蛋白的應(yīng)用，其中所述蛋白序列是SEQ ID NO1～7所示的氨基酸序列，或是與SEQ ID NO1～7所示氨基酸序列具有70%及以上同源性的多肽序列，所述重組蛋白是抗菌肽或酶類(lèi)。本發(fā)明為利用大腸桿菌制備蛋白質(zhì)/多肽類(lèi)藥物、各種酶類(lèi)、診斷抗原、抗體以及疫苗等提供了基礎(chǔ)。在蛋白表達(dá)研究、酶制劑和蛋白藥物生產(chǎn)等方面具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/70GK102776216SQ20121026438
公開(kāi)日2012年11月14日 申請(qǐng)日期2012年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月27日
發(fā)明者王圣鈞, 祁慶生, 高冬芳 申請(qǐng)人:山東大學(xué)