專利名稱：超敏感型酵母遺傳毒性致癌物生物傳感器元件盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)，尤其涉及經(jīng)過遺傳基因改造的微生物對環(huán)境化學污染物的監(jiān)測。
背景技術(shù)：
面包酵母是一種簡單真核生物，單細胞，遺傳改造操作簡單，培養(yǎng)簡便快速且環(huán)境友好，適合作為一種模式生物應(yīng)用于生命科學研究中。目前在環(huán)境污染檢測技術(shù)領(lǐng)域中，面包酵母作為一種簡單真核生物越來越被受到重視，一些以面包酵母為模式生物的檢測系統(tǒng)得到了發(fā)展。 遺傳毒性致癌物是指能與DNA反應(yīng)，引起DNA損傷而致癌的化學致癌物，可用生物化學試驗或間接地應(yīng)用遺傳毒性試驗方法來鑒定遺傳毒性致癌物，包括直接致癌物、間接致癌物及某些無機致癌物?，F(xiàn)已發(fā)展了多個基于DNA損傷轉(zhuǎn)錄響應(yīng)的遺傳毒性致癌物的檢測體系，面對高通量，實時監(jiān)測的現(xiàn)實要求，我們?nèi)孕枥^續(xù)創(chuàng)新，開發(fā)高靈敏，高應(yīng)用性的生物傳感器。構(gòu)建一個遺傳毒性致癌物生物傳感器，除了宿主細胞外，還需具備以下兩個基本元件感應(yīng)元件和連接于此后的報告元件。前者利用其自身功能可對DNA損傷進行響應(yīng)，并開啟后者的表達，從而產(chǎn)生可檢測出的信號。本發(fā)明將這兩個元件組合在一起的基因片段稱為生物傳感器元件盒。HUGl (hydroxyurea and UV and gamma radiation induced)可因細胞被輕基脲(hydroxyurea)處理后有顯著性上調(diào)表達，因而被視為當細胞受到DNA損傷及復(fù)制停滯后可起到轉(zhuǎn)錄響應(yīng)的潛在基因。經(jīng)研究顯示HUGl基因受到MECl通路上的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控。在面包酵母中，MECl是磷脂酰肌醇3-激酶家族成員之一，是一個重要的檢驗點基因(checkpoint gene),檢驗點基因可轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)大量調(diào)節(jié)子基因(regulon gene)來啟動DNA修復(fù)，致使細胞周期阻滯，緩解DNA損傷。而研究人員發(fā)現(xiàn)存在于MECl檢驗點信號通路中的基因在遇到復(fù)制阻滯及DNA損傷均可轉(zhuǎn)錄響應(yīng)誘導(dǎo)HUGl的表達。已有報道證明HUGl在一般條件下的表達量很低，但確實受DNA損傷信號的顯著誘導(dǎo)，且靈敏度高，可用作制備生物傳感器的感應(yīng)元件。綠色熒光蛋白(GFP)是從水母中分離出的天然生物發(fā)光蛋白；其性質(zhì)極其穩(wěn)定；無需添加任何底物及輔助因子，即在紫外或藍光的激發(fā)下發(fā)出綠色熒光。它在細菌、真菌、植物和動物細胞中表達時都能發(fā)出熒光，具有活體、原位、實時表達的特點。而酵母增強型綠色熒光蛋白(yEGFP)是一種密碼子優(yōu)化后的增強型綠色熒光蛋白，它可在酵母細胞中增強表達。對比此前廣泛使用的編碼B-gal半乳糖苷酶的報告基因lacZ，GFP具有直接用于活體細胞檢測，并可克服利用酶作為報告基因的一系列缺點(破壞酵母細胞壁，影響酶活顯色的因素復(fù)雜等)，檢測手段多樣、自動化等一系列優(yōu)點，利用綠色熒光蛋白作為制備生物傳感器的效應(yīng)元件，使得環(huán)境中遺傳毒性化合物測評體系更有利地向高通量，快速，便捷的階段發(fā)展。
利用SOE 法(Gene Splicing by Overlap Extension)進行 PCR 基因片段拼接，即通過PCR過程中基因片段的交錯延伸實現(xiàn)拼接。該方法是利用PCR技術(shù)在體外進行有效的基因重組，而且不需要內(nèi)切酶消化和連接酶處理，該技術(shù)使用簡易。由于引物只需要與模板有效結(jié)合，尤其是5’端序列不必與模板完全配對，因此擴增引物的5’端可以添加兩種酶切位點以便于后期克隆。流式細胞技術(shù)是分析細胞中的一個重要領(lǐng)域，該技術(shù)為細胞學研究手段之一，能夠?qū)毎图毎骷吧锎蠓肿舆M行高達每秒上萬個細胞個體的分析，而且一個細胞多參數(shù)分析并可分選細胞。這種以流動的方式(相對靜態(tài)方式)測量細胞與傳統(tǒng)的用熒光鏡檢測細胞比較，具有速度快，精度高，準確性好的特點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是，首先提供一種超敏感型酵母遺傳毒性致癌物生物傳感器元件盒 HUGl-yEGFP-CYCl及其構(gòu)建方法，并將生物傳感器元件盒應(yīng)用于復(fù)合DNA損傷超敏感型面包酵母七基因缺失突變株中，得到超敏感型酵母遺傳毒性致癌物生物傳感器，該生物傳感器大大提高了對檢測環(huán)境中遺傳毒性化學物質(zhì)的敏感性，擴大了檢測范圍，增強檢測手段的靈活性。為了達到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一、超敏感型酵母遺傳毒性致癌物生物傳感器元件盒HUGl-yEGFP-CYCl基因片段的構(gòu)建方法為I、提取野生面包酵母基因組DNA，通過特異性引物，以野生面包酵母基因組DNA為模板，PCR擴增得到HUGl啟動子基因片段；2、提取質(zhì)粒PUG36，通過特異性引物，以PUG36質(zhì)粒DNA為擴增模板，PCR擴增分別得到y(tǒng)EGFP編碼區(qū)基因片段；3、提取質(zhì)粒PUG36，通過特異性引物，以PUG36質(zhì)粒DNA為擴增模板，PCR擴增分別得到終止子CYCl基因片段；4、利用SOE法，通過特異性引物，以HUGl啟動子基因片段、yEGFP編碼區(qū)基因片段、終止子CYCl基因片段按照摩爾比I : I : I的比例為擴增模板，PCR擴增得到超敏感型酵母遺傳毒性致癌物生物傳感器元件盒HUGl-yEGFP-CYCl基因片段；二、超敏感型酵母遺傳毒性致癌物生物傳感器元件盒轉(zhuǎn)入復(fù)合DNA損傷超敏感型面包酵母七基因缺失突變株基因組中，應(yīng)用于遺傳毒性致癌物的檢測I、將超敏感型酵母遺傳毒性致癌物生物傳感器元件盒HUGl-yEGFP-CYCl轉(zhuǎn)入到復(fù)合DNA損傷超敏感型面包酵母七基因缺失突變株基因組中，形成超敏感型面包酵母遺傳毒性致癌物生物傳感器 yapl A cwpl A cwp2 A snq2 A pdr5 A rad A magi A -HUGI-yEGFP-CYCI ；其中復(fù)合DNA損傷超敏感型面包酵母七基因缺失突變株是在對氧化損傷高敏感性的五基因缺失面包酵母突變株(專利申請?zhí)?010105941713)的基礎(chǔ)上，敲除與DNA損傷修復(fù)有關(guān)的MAGl和RADl基因，獲得缺失yapl cwpl cwp2 snq2 pdr5 radl magi七基因的面包酵母突變株。2、超敏感型面包酵母遺傳毒性致癌物生物傳感器可利用流式細胞儀技術(shù)，通過測定綠色熒光蛋白表達的變化情況從而對遺傳毒性致癌物進行檢測。
本發(fā)明的優(yōu)點與效果超敏感型面包酵母遺傳毒性致癌物生物傳感器元件盒HUGl-yEGFP-CYCl關(guān)鍵性優(yōu)點在于，它對遺傳毒性致癌物有較高的靈敏性，檢測操作簡便，人為誤差減小，也可用于直接檢測，具有實現(xiàn)大批量乃至高通量的遺傳毒性化合物實時監(jiān)測的應(yīng)用潛力。與宿主為野生型面包酵母相比，本發(fā)明中宿主為復(fù)合DNA損傷超敏感型面包酵母七基因突變株的超敏感型面包酵母遺傳毒性致癌物生物傳感器，對各類型遺傳毒性致癌物的敏感度均有提高，對于甲磺酸甲酯(MMS)在極低濃度下(25ppm)的檢測靈敏度提高50多倍；對過氧化氫(H2O2)在0. 6mM濃度的檢測靈敏度提高10多倍；對大分子致DNA損傷化合物腐草霉素(Phleomycin)在2. 5 y g/ml濃度的檢測靈敏度提高40倍；宿主為野生型面包酵母的遺傳毒性致癌物生物傳感器，不能檢測到叔丁基過氧化氫(t-BHP)及DNA損傷劑4-硝基喹啉I-氧化物(4-NQ0)甲基紫精(methyl viologen)引起的DNA損傷信號,而超敏感型面包酵母遺傳毒性致癌物生物傳感器均可檢測到這兩種致DNA氧化損傷化合物，并且 有較高的檢測靈敏度。因此超敏感型面包酵母遺傳毒性致癌物生物傳感器的應(yīng)用可提高其檢測靈敏度并擴大其檢測范圍，更能促進環(huán)境遺傳毒性致癌物的實時監(jiān)測平臺的建立。表I、超敏感型面包酵母遺傳毒性致癌物生物傳感器與四種現(xiàn)有的面包酵母遺傳毒性致癌物生物傳感器靈敏度的比較分析，
野生型面包野生型面包j野生型面包~ 野生型面包酵母j復(fù)合DNA損傷超 酵母酵母酵母HUGl-yEGFP-C 高靈敏型面包酵母
RNR3-IacZ RNR2-yEGF Rad54-yEG YClHUG1-yEFP-CY
生物傳感器 PFP生物傳感器Cl
生物傳感器生物傳感器生物傳感器
甲磺基甲酯9. 3倍5~i56~i
[25ppm)
過氧化氫約2倍無檢測無檢測21121
(〇.6mM)______
叔丁基過氧化氫無誘導(dǎo)信號無檢測無檢測無誘導(dǎo)信號4. 5倍
(0. 125mM)
4-硝基喹啉I-氧無誘導(dǎo)信號無檢測無檢測無誘導(dǎo)信號22^
化物(Q. 005ug/ml)
腐草霉素無誘導(dǎo)信號20^40^
(2. 5ug/ml)表中所示數(shù)值為誘導(dǎo)表達倍數(shù)，表示檢測得到的信號強度，與空白對照的檢測信號強度之間相除后的檢測結(jié)果；無檢測表示沒有進行檢測。


圖I、遺傳毒性致癌物生物傳感器元件盒HUGl-yEGFP-CYCl應(yīng)用于不同面包酵母株中對DNA烷化劑甲磺酸甲酯(MMS)檢測靈敏度的比較。圖中橫坐標表示DNA烷化劑甲磺酸甲酯(MMS)的濃度；縱坐標表示生物傳感器對DNA烷化劑甲磺酸甲酯(MMS)檢測所得到的相對熒光強度誘導(dǎo)倍數(shù)；_ -曲線表示遺傳毒性致癌物生物傳感器元件盒HUGl-yEGFP-CYCl應(yīng)用于野生型面包酵母中對DNA烷化劑甲磺酸甲酯(MMS)的檢測結(jié)果；-S-曲線表示于遺傳毒性致癌物生物傳感器元件盒HUGl-yEGFP-CYCl應(yīng)用于復(fù)合DNA損傷超敏感型面包酵母七基因突變株中對DNA烷化劑甲磺酸甲酯(MMS)的檢測結(jié)果。
具體實施例方式一、超敏感型酵母遺傳毒性致癌物生物傳感器元件盒的構(gòu)建方法包含下列步驟(I)、從野生面包酵母中提取基因組DNA la、取野生面包酵母，接種于YPD培養(yǎng)液中，在30°C，200轉(zhuǎn)/分鐘的條件下，振蕩培養(yǎng)16小時，得到野生面包酵母菌液；其中Yro培養(yǎng)液的配方重量百分比為酵母膏1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，余者為水；lb、取野生面包酵母菌液I. 5毫升，用4000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘，沉淀物懸于200 微升提取緩沖液中；其中提取緩沖液的配方為曲拉通X-100 2%，十二烷基磺酸鈉1%，氯化鈉0. I摩爾，乙二胺四乙酸I毫摩爾，三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽10毫摩爾，余者為水，pH 8.0；lc、加入0. 3克酸洗玻璃珠、100微升酚、100微升氯仿，震蕩3分鐘后，以12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，吸取上層液體；IcU加入所取液體體積2倍的無水乙醇，在_20°C靜置30分鐘，以12000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，去上清，取沉淀物；le、將沉淀物溶解于20微升無菌水，即為野生酵母基因組DNA ；(2)、擴增HUGl啟動子基因片段野生面包酵母基因組作為擴增模板，通過上游引物HUGl Pro-I :5’AA CTG CAGGCA AAA ACT AGA GCC AAG CC 3’ 和下游引物 HUGl Pro-2 :5’ TTA GAC ATA TAG TTT TTTTTT ATT GCT G 3’，利用PCR技術(shù)，擴增得到HUGl啟動子基因片段(600bp)(3)、擴增yEGFP編碼區(qū)基因片段以及終止子CYCl基因片段質(zhì)粒PUG36 (美國ATCC公司提供)作為擴增模板，通過上游引物yEGFP_l :5’ AAAACT ATA TGT CTA AAG GTG AAG AAT T 3’ 和下游引物 yEGFP-2 :5’ TAC ATG ACT TTG TACAAT TCA TCC ATA C 3’，利用PCR技術(shù)，擴增得到y(tǒng)EGFP編碼區(qū)基因片段(750bp);質(zhì)粒PUG36 作為擴增模板，通過上游引物 CYCl-I :5，TGT ACA AAG TCA TGT AAT TAG TTA TGT C3，和下游引物 CYC1-2 :5，TCCG GAA TTC GGT ACC GGC CGC AAA TTA AAG 3’，擴增得到終止子CYCl基因片段(260bp)；(4)、擴增超敏感型酵母遺傳毒性致癌物生物傳感器元件盒HUGl-yEGFP-CYCl基因片段將上述擴增得到的HUGl啟動子基因片段、yEGFP編碼區(qū)基因片段和終止子CYCl基因片段按摩爾比I : I : I的比例作為擴增模板，通過上游引物HUGl Pro-I :5’AA CTG CAGGCA AAA ACT AGA GCC AAG CC 3’ 和下游引物 CYCl Pro-2 :5’ TCCG GAA TTC GGT ACC GGCCGC AM TTA AAG 3’，擴增得到超敏感型酵母遺傳毒性致癌物生物傳感器元件盒，即基于酵母DNA損傷響應(yīng)的HUGl-yEGFP-CYCl基因片段；其中PCR的條件為94°C 5分鐘；94°C 45秒，55°C 45秒，72°C I分鐘，30個循環(huán)；72°C 5分鐘。二、將超敏感型酵母遺傳毒性致癌物生物傳感器元件盒應(yīng)用于構(gòu)建超敏感型酵母遺傳毒性致癌物生物傳感器，該方法包含下列步驟
(I)、在五基因缺失的對氧化損傷高敏感性的面包酵母(專利申請?zhí)枮?010105941713)的基礎(chǔ)上，再敲除與DNA損傷修復(fù)有關(guān)的MAGl和RADl基因，獲得復(fù)合DNA損傷超敏感型面包酵母七基因缺失突變株，步驟如下la、將質(zhì)粒 Amagl: :hisG_URA3_hisG(參考文獻Jin Chen, et al. (1990)Saccharomyces cerevisiae 3-methyladenine DNA glycosylase has homology to theAlkA glycosylase of E.coli and is induced in response to DNA alkylation damage.The EMBO Journal, vol. 9，pp. 4569-4575)用限制性內(nèi)切酶 EcoR I 和 Bgal II 進行酶切，得到敲除組件 magiA : :hisG-URA3-hisG ；lb、將敲除組件用醋酸鋰轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入對氧化損傷高敏感性的面包酵母中，發(fā)生同源重組，通過SD-Ura選擇性平板篩選得到六基因缺失的面包酵母突變株；lc、將質(zhì)粒 Aradl::Blast (來源于 Dr. E. Perkins NIESH, NC, USA)用限制性內(nèi)切酶SalI進行酶切，得到敲除組件radlA::hiSG-URA3-hisG，將敲除組件用醋酸鋰轉(zhuǎn)化方法 轉(zhuǎn)入六基因缺失的面包酵母突變株中，發(fā)生同源重組，通過SD-Ura選擇性平板篩選得到復(fù)合DNA損傷超敏感型面包酵母七基因缺失突變株，該突變株即為缺失yapl A cwpl A cwp2 Asnq2 A pdr5 A radl A magi A七個基因的面包酵母；(2)將超敏感型酵母遺傳毒性致癌物生物傳感器元件盒HUGl-yEGFP-CYCl基因片段克隆到pBluescipt載體(美國Thermo公司提供)上，利用PstI內(nèi)切酶和EcoRl內(nèi)切酶酶切進行連接，得到克隆pBluescipt-HUGl-yEGFP-CYCl ；(3)、將克隆 pBluescipt-HUGl-yEGFP-CYCl 用 BamHl 內(nèi)切酶和 EcoRl 內(nèi)切酶進行酶切，得到兩端酶切位點為BamHl和EcoRl的酵母靈敏型遺傳毒性致癌物檢測系統(tǒng)傳感元件 UGl-yEGFP-CYCl 片段，再克隆到 pM4366 載體(參考文獻W. P. Voth，et al. (2001) Yeastvectors for integration at the HO locus. Nucleic Acids Res. Vol. 29, E59-9)中，用Notl 內(nèi)切酶切下片段 HO-hi sG-URA3-hisG-HUG I-yEGFP-CYCl-HO，；(4)、將 HO-hi sG-URA3-hisG-HUG I-yEGFP-CYCl-HO 片段轉(zhuǎn)入復(fù)合 DNA 損傷超敏感型面包酵母七基因缺失突變株中，篩選得到超敏感型酵母遺傳毒性致癌物生物傳感器，上述轉(zhuǎn)入與篩選方法包含下列步驟4a、將復(fù)合DNA損傷超敏感型面包酵母七基因缺失突變株接種到I毫升YPD培養(yǎng)液，300C，200轉(zhuǎn)/分鐘振蕩條件下，培養(yǎng)16小時；4b、再加入YPD培養(yǎng)液2毫升，300C，200轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)4小時；4c、取I毫升4b中的酵母，以2500轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘，取沉淀物；4d、將沉淀物懸于100毫摩/升的400微升醋酸鋰中，以2500轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘，取沉淀物；4e、將沉淀物懸于100毫摩/升的100微升醋酸鋰中；4f、將2. 0毫克/毫升的鮭魚精單鏈DNA I微升煮沸5分鐘，冰浴后與片段H0_hisG-URA3-hisG-HUG I-yEGFP-CYCl-HO 0. I I微克一起加入到步驟4e的醋酸鋰中，室溫放置5分鐘；4g、再加入280微升濃度為50%的聚乙二醇4000 ；4h、振蕩至混勻，30°C靜置45分鐘；4i、加入39微升二甲基亞砜，42°C熱激5分鐘；
4j、4000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘，取沉淀物，并將沉淀物懸于200微升無菌水中；4k、4000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘，取沉淀物，懸于100微升無菌水中，然后再涂于SD-Ura營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基平板，30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，生長出單菌落，該單菌落即超敏感型酵母遺傳毒性致癌物生物傳感器酵母株；其中SD-Ura選擇性平板的配方為酵母氮源無氨基酸無硫酸銨0. 17%，硫酸銨0.5%，葡萄糖2<%，腺嘌呤0.2(%，色氨酸1%，組氨酸1%，亮氨酸1%，賴氨酸1%，瓊脂粉2%，余者為水；三、超敏感型酵母遺傳毒性致癌物生物傳感器用于檢測遺傳毒性致癌物的方法，該方法包含下列步驟I、將超敏感型酵母遺傳毒性致癌物生物傳感器酵母株接種于Yro培養(yǎng)液中，30°C, 200轉(zhuǎn)/分鐘下振蕩培養(yǎng)16小時；2、將過夜培養(yǎng)的超敏感型酵母遺傳毒性致癌物生物傳感器酵母株菌液用新鮮的YPD選擇性培養(yǎng)液稀釋到細胞密度OD6tltl為0. I ;3、取I毫升稀釋后的超敏感型酵母遺傳毒性致癌物生物傳感器酵母株菌液，加入DNA損傷烷化劑甲基磺酸甲酯，培養(yǎng)8小時；4、取200微升超敏感型酵母遺傳毒性致癌物生物傳感器酵母株菌液，4000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘，棄上清，取沉淀物；加入200微升0. IM PBS溶液，懸浮沉淀物；再次4000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘，棄上清，取沉淀物；加入500微升0. IM PBS溶液，懸浮沉淀物；其中0. IM PBS溶液配方為稱取8克氯化鈉，0.2克氯化鉀，3. 68克十二合磷酸一氫鈉，0. 24克磷酸二氫鉀，溶于雙蒸水中，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值為7. 4，定容至I升；5、加入I毫克每毫升的溴化丙啶(PI)溶液3微升，混勻，置于冰上，黑暗保存直至使用流式細胞儀進行檢測；6、用流式細胞儀對樣品進行檢測，同時設(shè)定FITC及PE兩激光通道； 7、用Flow Jo流式數(shù)據(jù)分析軟件輸出分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)中的Mean值即檢測樣品的平均熒光強度數(shù)值；8、按照步驟I至步驟7的方法測定未經(jīng)甲基磺酸甲酯處理的超敏感型酵母遺傳毒性致癌物生物傳感器酵母株平均熒光強度數(shù)值，作為空白對照；9、當經(jīng)甲基磺酸甲酯處理的超敏感型酵母遺傳毒性致癌物生物傳感器酵母株溶液平均熒光強度數(shù)值與空白對照的平均熒光強度數(shù)值之比大于2時表明檢出DNA損傷信號。
權(quán)利要求
1.超敏感型酵母遺傳毒性致癌物生物傳感器元件盒，其特征在于，該元件盒為基于酵母DNA損傷響應(yīng)的HUGl -yEGFP-CYCl基因片段。
2.實現(xiàn)權(quán)利要求I所述的超敏感型酵母遺傳毒性致癌物生物傳感器元件盒的構(gòu)建方法，其特征在于，該方法包含下列步驟 (1)從野生面包酵母中提取基因組DNA la、取野生面包酵母，接種于YPD培養(yǎng)液中，在30°C，200轉(zhuǎn)/分鐘的條件下，振蕩培養(yǎng)16小時，得到野生面包酵母菌液； 其中YPD培養(yǎng)液的配方重量百分比為酵母膏1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，余者為水； I b、取野生面包酵母菌液I. 5毫升，用4000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘，取沉淀物懸于20 0微升提取緩沖液中； 其中提取緩沖液的配方為曲拉通X-100 2%,十二烷基磺酸鈉1%，氯化鈉0. I摩爾，乙二胺四乙酸I毫摩爾，三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽10毫摩爾，余者為水，pH 8.0; lc、加入0. 3克酸洗玻璃珠、100微升酚、100微升氯仿，震蕩3分鐘后，以12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，取上層液體； Id、加入所取液體體積2倍的無水乙醇，在_20°C靜置30分鐘，以12000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，去上清，取沉淀物； le、將沉淀物溶解于20微升無菌水，即為野生酵母基因組DNA ； (2)、擴增啟動子基因片段 野生面包酵母基因組作為擴增模板，通過上游引物M/似Pro-I: 5’AA CTG CAG GCAAAA ACT AGA GCC AAG CC 3’ 和下游引物規(guī)/似 Pro-2: 5’ TTA GAC ATA TAG TTT TTT TTTATT GCT G 3’，利用PCR技術(shù)，擴增得到啟動子基因片段； (3)、擴增yEGFP編碼區(qū)基因片段以及終止子CYCl基因片段 質(zhì)粒PUG36作為擴增模板，通過上游引物5’AAA ACT ATA TGT CTA AAG GTGAAG AAT T 3’ 和下游引物5’ TAC ATG ACT TTG TAC AAT TCA TCC ATA C 3 ’，利用PCR技術(shù)，擴增得到編碼區(qū)基因片段； 質(zhì)粒PUG36作為擴增模板，通過上游引物C7C7-1: 5’ TGT ACA AAG TCA TGT AAT TAGTTA TGT C 3’ 和下游引物 6767-2: 5’ TCCG GAA TTC GGT ACC GGC CGC AAA TTA AAG 3’，擴增得到終止子CYCl基因片段； (4)、將上述啟動子基因片段、編碼區(qū)基因片段和終止子CTC7基因片段按摩爾比I :1 1的比例作為擴增模板，通過上游引物Pro-I: 5’ AA CTG CAG GCA AAAACT AGA GCC AAG CC 3，和下游引物 C7C7 Pro-2: 5，TCCG GAA TTC GGT ACC GGC CGC AAATTA AAG 3’，擴增得到超敏感型酵母遺傳毒性致癌物生物傳感器元件盒，即基于酵母DNA損傷響應(yīng)的基因片段； 上述PCR的條件為94°C 5分鐘；94°C 45秒，55°C 45秒，72°C I分鐘，30個循環(huán)；72 °C 5分鐘。
3.用權(quán)利要求I所述的超敏感型酵母遺傳毒性致癌物生物傳感器元件盒構(gòu)建超敏感型酵母遺傳毒性致癌物生物傳感器，其特征在于，該構(gòu)建方法包含下列步驟 3a、敲除五基因缺失的對氧化損傷高敏感性的面包酵母中私和似基因，獲得復(fù)合DNA損傷超敏感型面包酵母七基因缺失突變株，步驟如下3al、將質(zhì)粒Z magi: : hisG-URA3-hi sG用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Bgal //進行酶切，得到敲除組件magi J : :hisG-URA3-hisG ； 3a2、將敲除組件用醋酸鋰轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入五基因缺失的對氧化損傷高敏感性的面包酵母中，發(fā)生同源重組，通過SD-Ura選擇性平板篩選得到六基因缺失的面包酵母突變株； 3a3、將質(zhì)粒-d radl: :Blast用限制性內(nèi)切酶SalI進行酶切,得到敲除組件radl」hisG -URA3-hisG，將敲除組件用醋酸鋰轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入六基因缺失的面包酵母突變株中，發(fā)生同源重組，通過SD-Ura選擇性平板篩選得到復(fù)合DNA損傷超敏感型面包酵母七基因缺失突變株，該突變株即為缺失Z cwpl A cwp2A snq2Apdr5A radl A magi A七個基因的面包酵母； 3b、將權(quán)利要求2步驟(4)中的規(guī)基因片段克隆到pBluescipt載體上，利用內(nèi)切酶和內(nèi)切酶酶切進行連接，得到克隆pBluescipt-M/a-j^ff^-CTCV ；3c、將克隆pBluescipt- HUG卜yEGFP-CYCl說BamHl內(nèi)切酶和內(nèi)切酶進行酶切，得到兩端酶切位點為及麗W和及的基因片段，再克隆到PM4366載體中，用艙(7內(nèi)切酶切下片段 HO-hisG-URA3-hisG-HUGl-yEGFP-CYCl-HO ； 3d、將HO-hisG-URA3-hisG-HUGl-yEGFP-CYCl-H0片段用醋酸鋰轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入復(fù)合DNA損傷超敏感型面包酵母七基因缺失突變株中，通過SD-Ura選擇性平板篩選得到超敏感型酵母遺傳毒性致癌物生物傳感器酵母株。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種超敏感型酵母遺傳毒性致癌物生物傳感器元件盒及其構(gòu)建方法，本發(fā)明還公開了應(yīng)用元件盒構(gòu)建超敏感型酵母遺傳毒性致癌物生物傳感器的方法，涉及經(jīng)過遺傳基因改造的微生物對遺傳毒性致癌物的監(jiān)測。將該生物傳感器元件盒應(yīng)用于復(fù)合DNA損傷超敏感型七基因缺失面包酵母突變株中，可提高該生物傳感器元件盒的檢測靈敏性。因此，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有對遺傳毒性致癌物檢測靈敏度高、適用于環(huán)境中低劑量存在的化學致癌物的檢測、對環(huán)境污染物的檢測范圍廣，操作簡便等優(yōu)點。該生物傳感器的發(fā)明可促進環(huán)境有害物質(zhì)實時監(jiān)測平臺的建立。
文檔編號C12R1/645GK102965368SQ20121026330
公開日2013年3月13日 申請日期2012年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月27日
發(fā)明者戴和平, 肖偉, 魏婷, 張超, 張曉華, 劉玉倩 申請人:中國科學院水生生物研究所, 首都師范大學