專利名稱:在大腸桿菌中表達(dá)作為分泌的重組人干擾素α1b蛋白的制作方法
在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的許多天然分泌蛋白容易降解或形成無生物活性的包涵體。但是,通過采用含分泌載體的宿主,可以將它們分泌到細(xì)胞周質(zhì)中。最近,已經(jīng)研制了將表達(dá)產(chǎn)物傳遞到上清液中的分泌系統(tǒng)。這些系統(tǒng)優(yōu)于分泌系統(tǒng)的方面在于1)將蛋白水解減少到最少,和2)更方便地用于檢測和純化樣品。
已經(jīng)大量研究了采用分泌載體在大腸桿菌中表達(dá)重組產(chǎn)物的方法。這些方法包括利用(1)“易漏的”突變菌株(Gikes et al.,Bio/Technol.,Vol.2,pp259-263.1984);(2)與目的產(chǎn)物共表達(dá)的溶解蛋白質(zhì)(Kobayashi etal.,J.Bacteriol.,Vol.166,pp728-732,1986);(3)天然分泌的蛋白質(zhì)或大腸桿菌的外膜組分與目的產(chǎn)物融合(Nagahari et al.,EMBO J.,Vol.4,pp3589-3592,1985;Mackman et al.,EMBO J.Vol.6,pp2835-2841,1987);和(4)強啟動子和高效的前導(dǎo)序列以提供有效的表達(dá)和分泌(由未知機制導(dǎo)致分泌)目的產(chǎn)物(Pages et al.,J.Bacteriol,Vol.169,pp 1368-1390,1987;Suominen etal.,Gene,Vol.61,pp165-176,1987;Guo et al.,F(xiàn)EMS Microbiol.Lett.,Vol.49,pp279-283,1988;Wong et al.,美國專利No.5,223,407,1993;Wong et al.,歐洲專利No.EP0357291B1,1996)。在這些方法中,最后一種方式最簡單。此外,它使用正常的宿主菌株以便可以得到所需蛋白質(zhì)的最大表達(dá)和最大的細(xì)胞生產(chǎn)量。另外,該方法可以利用體內(nèi)肽酶從信號肽裂解所需產(chǎn)物,由此不需額外的裂解步驟就可從融合蛋白中釋放目的產(chǎn)物。
利用上述的最后一種方法,構(gòu)建稱為Tac盒(Wong et al.,1993&1996上文)的合成分泌盒,以在大腸桿菌中分泌生產(chǎn)重組蛋白。所述Tac盒含有在大腸桿菌中高水平表達(dá)蛋白質(zhì)所必需的所有調(diào)節(jié)元件,包括雜合的tac啟動子,用于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的lac操縱子,共有的核糖體結(jié)合位點,omp.A前導(dǎo)序列和trp A轉(zhuǎn)錄終止子(Wong et al.,1993和1996上文)。為了構(gòu)建分泌載體,將Tac盒克隆到pUC18中,其中還發(fā)現(xiàn)了過表達(dá)Lac阻遏物的lac Iq基因和質(zhì)粒pSC101的分隔元件par(Wong et al.,1993&1996上文)。
除應(yīng)用Tac盒大腸桿菌分泌系統(tǒng)生產(chǎn)各種異源蛋白質(zhì),包括hEGF,hPTH,IL-6和甲狀旁腺激素相關(guān)的肽外(Wong et al.,1993&1996上文;Rabbani et al.,J.Bone Min.Res.,Vol.6[補充1],Abstract 133,S116,1991),存在IPTG誘導(dǎo)的條件下,用Tac盒,表達(dá)源于C.fimi(O’Neill et al.,Gene,Vol.44,pp 325-330,1986a)的cex基因的細(xì)胞外葡聚糖酶(Exg,使用產(chǎn)色底物,對-硝基苯基-β-D-纖維素二糖苷(pNPC)可以方便地檢測表達(dá)產(chǎn)物。),表達(dá)產(chǎn)物的分泌生產(chǎn)將導(dǎo)致細(xì)胞迅速死亡(
圖1),然而,在相同條件下,沒有IPTG時,表達(dá)Exg的細(xì)胞以正常速率生長(圖1)。將在Tac盒分泌載體(上述)和cex基因(O’Neill et al.,上文)之間形成的重組構(gòu)建體稱為tacIQpar8cex(圖2)。
非誘導(dǎo)的和誘導(dǎo)的JM101(tacIQpar8cex)表達(dá)的Exg(Uml-1)總產(chǎn)率方面有很大的差異(圖1和表1),這可能是由于兩種培養(yǎng)物之間活細(xì)胞計數(shù)的不同(圖3)而引起的,但是,兩種培養(yǎng)物分泌的Exg活性(Uml-1)很相似(表1)。結(jié)果表明,兩種培養(yǎng)物均不能有效生產(chǎn)細(xì)胞外Exg。
tacIQpar8cex構(gòu)建體在非誘導(dǎo)條件下,能夠在大腸桿菌中高水平表達(dá)Exg,但是,在誘導(dǎo)表達(dá)Exg后導(dǎo)致的細(xì)胞死亡和不能有效分泌Exg(表1)的結(jié)果表明,它對于分泌生產(chǎn)其他外源蛋白質(zhì)可能不是最佳的。因此,比tac弱的啟動子也許能夠更好地用于提高Exg和其他重組蛋白質(zhì)的表達(dá)并分泌到細(xì)胞外。為此選擇lac(Hawley et al.,Nucleic Acids Res.,Vol.11,pp 2237-2255,1983)和lacUV5啟動子(Russell et al.,Gene,Vol.20,pp.231-243,1982;Silverstoneet al,Proc.Natl.Acad.Sci.U.SA,Vol.66,pp773-779,1970)來檢驗上述假設(shè)。利用點突變(Kunkel,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,Vol.82,pp488-492,1985)技術(shù),構(gòu)建兩個tacIQpar8cex衍生物用于研究,將其稱為lacIQpar8cex(圖4)和lacUV5par8cex(圖5),它們分別含有l(wèi)ac和lacUV5啟動子。
與JM101(tacIQpar8cex)(圖1)相比,JM101(lacIQpar8cex)(圖6)和JMI01(lacUV5par8cex)(圖7)的誘導(dǎo)培養(yǎng)物在生存能力方面均有改善。當(dāng)評價表達(dá)Exg的lacIQpar8cex和lacUV5par8cex構(gòu)建體的效率時,兩種構(gòu)建體的培養(yǎng)物只表達(dá)了低水平的Exg活性(表1)。數(shù)據(jù)表明,這些構(gòu)建體表達(dá)的lacIq基因的阻遏物嚴(yán)謹(jǐn)?shù)卣{(diào)節(jié)著lac和lacUV5啟動子。但是一旦用IPTG誘導(dǎo)除去了阻遏,只有JM101(lacUV5par8cex)的培養(yǎng)物在Exg表達(dá)方面有明顯的增加,而JM101(lacIQpar8cex)的則沒有(表1)。不僅在細(xì)胞內(nèi)樣品中,而且在培養(yǎng)物上清液樣品中也檢測到表達(dá)產(chǎn)物的增加(表1)。盡管兩種培養(yǎng)物表達(dá)的總Exg活性(Uml-1)有相似的水平(表1),JM101(lacUV5par8cex)誘導(dǎo)培養(yǎng)物分泌Exg的活性比未誘導(dǎo)的JM101(tacIQpar8cex)培養(yǎng)物的活性高4倍。因此,可通過誘導(dǎo)JM101(lacUV5par8cex)表達(dá)分泌Exg的方式,研究最佳生長條件以得到表達(dá)并分泌到細(xì)胞外的蛋白質(zhì)最佳產(chǎn)率。
lacUV5par8cex構(gòu)建體表達(dá)高水平細(xì)胞外Exg的能力(表1和圖8)表明了其在大腸桿菌中表達(dá)其他異源蛋白質(zhì)如干擾素α1b并分泌到細(xì)胞外的潛在用途。通過取代cex基因序列,已經(jīng)將人干擾素α1b基因的編碼序列(Wu etal.,F(xiàn)undamental&Clinical Trials of Recombinant Drugs,People’s HealthPress,p.155,1996)克隆在lacUV5par8cex構(gòu)建體中(圖9)??寺『驼T變操作后,在最終的分泌構(gòu)建體中將干擾素α1b基因與ompA前導(dǎo)序列準(zhǔn)確地融合在一起,稱為lacUV5par8INF(圖10)。用免疫學(xué)和生物學(xué)試驗(表2)已經(jīng)確定了用lacUV5par8INF的構(gòu)建體(稱為pINF,圖9)成功地表達(dá)了干擾素α1b蛋白質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明,我們提供了重組DNA構(gòu)建體lacUV5par8INF及其衍生物,重組DNA構(gòu)建體lacUV5par8INF的保藏號為CCTCC M96024.所述的重組DNA構(gòu)建體及其衍生物在原核細(xì)胞、特別是在大腸桿菌菌株中表達(dá)干擾素α1b蛋白質(zhì)和/或具有干擾素α1b蛋白質(zhì)免疫活性和/或生物活性的干擾素α1b蛋白質(zhì)的變異體。由轉(zhuǎn)化的細(xì)胞表達(dá)的干擾素和/或其變異體被分泌到培養(yǎng)基中,用免疫學(xué)方法和/或生物學(xué)方法試驗可以對其進行檢測。還可以用標(biāo)準(zhǔn)層析技術(shù)純化干擾素和/或其變異體,然后采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分析純化的產(chǎn)物。
根據(jù)本發(fā)明,我們提供了重組DNA構(gòu)建體lacUV5par8INF的構(gòu)建方法,該方法是通過將編碼干擾素α1b蛋白質(zhì)的基因序列亞克隆到lacUV5par8cex分泌型載體中而構(gòu)建,所述重組DNA構(gòu)建體能夠表達(dá)干擾素α1b活性蛋白質(zhì)并分泌到細(xì)胞外。
根據(jù)本發(fā)明,我們提供了重組DNA構(gòu)建體lacUV5par8INF的衍生物的構(gòu)建方法,該方法是通過將干擾素α1b基因的突變體或片段亞克隆到lacUV5par8cex分泌型載體中而形成,其能夠表達(dá)干擾素α1b活性蛋白質(zhì)的變異體并分泌到細(xì)胞外。就免疫活性和/或生物活性而言,該變異體在功能上等同于天然干擾素α1b蛋白質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明,我們提供了重組DNA構(gòu)建體lacUV5par8INF的衍生物的構(gòu)建方法,該方法是通過將干擾素α1b基因或其突變體亞克隆到修飾后的lacUV5par8cex重組DNA構(gòu)建體中而形成,lacUV5par8cex的修飾是采用原核生物中常用的啟動子、核糖體結(jié)合序列、opmA前導(dǎo)序列、轉(zhuǎn)錄終止子、lacIq基因和/或par元件取代lacUV5par8cex中的lacUV5啟動子、共有的核糖體結(jié)合序列、opmA前導(dǎo)序列、trpA轉(zhuǎn)錄終止子、lacIq基因和/或par元件而進行的,所述的衍生物均能夠表達(dá)干擾素α1b的活性蛋白質(zhì)或其變異體,例如采用tac或lac啟動子取代lacUV5啟動子,或者用四環(huán)素抗性取代氨芐青霉素抗性等。
本發(fā)明還包括源于lacUV5par8INF的任何突變體,及源于lacUV5par8INF異構(gòu)體(如改變其氨芐青霉素抗性為其他選擇標(biāo)記,例如四環(huán)素抗性標(biāo)記)的任何突變體,表達(dá)干擾素α1b蛋白質(zhì)或其變異體。
根據(jù)本發(fā)明還可將lacUV5par8INF或其衍生物轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)基因生物體中表達(dá)干擾素α1b的活性蛋白質(zhì)或其變異體。
現(xiàn)在參考下列附圖舉例說明本發(fā)明。
圖1說明用Tac盒構(gòu)建的tacIQpar8cex構(gòu)建體(如圖2所示)在大腸桿菌JM101菌株中,經(jīng)(-■-)或不經(jīng)(-□-)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后細(xì)胞外Exg活性。誘導(dǎo)過程為,在2X YT培養(yǎng)基中,30℃約200 RPM振蕩培養(yǎng)細(xì)胞,在A550值約為0.3時,加入IPTG達(dá)到0.1mM的終濃度。所列的數(shù)據(jù)是來自不同試驗(n=3)的平均±SEM值。
圖2是表達(dá)Exg的tacIQpar8cex構(gòu)建體的圖示。標(biāo)明了成熟Exg(cex)的編碼序列,過表達(dá)Lac阻遏物的基因(lacIq),來自pSC101的分隔元件(par),以及氨芐青霉素抗性(AmpR)的bla基因。標(biāo)明了Tac盒的元件tacP=tac啟動子,lacO=lac操縱子,RBS=核糖體結(jié)合位點,ompA=ompA前導(dǎo)序列,STOP=在三個閱讀框架中的串聯(lián)終止密碼子,term=轉(zhuǎn)錄終止子。分別用陰影棒和箭頭表示cex基因的非編碼區(qū)和基因表達(dá)的方向。圖3(A)表示經(jīng)或未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的大腸桿菌JM101(tacIQpar8cex)的存活計數(shù)。誘導(dǎo)條件與在圖1說明中描述的相同。細(xì)菌計數(shù)在2X YT平皿和含氨芐青霉素的2X YT瓊脂平皿上完成。(--□--)標(biāo)明了未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)的大腸桿菌JM101(tacIQpar8cex)在2X YT瓊脂平皿的存活計數(shù)。(-□-)標(biāo)明了未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)的大腸桿菌JM101(tacIQpar8cex)在含氨芐青霉素2X YT瓊脂平皿的存活計數(shù)。(--■--)標(biāo)明了經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)的大腸桿菌JMI01(tacIQpar8cex)在2X YT瓊脂平皿的存活計數(shù),(-■-)標(biāo)明了經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)的大腸桿菌JM101(tacIQpar8cex)在含氨芐青霉素2X YT瓊脂平皿的存活計數(shù)。圖3(B)表示誘導(dǎo)對宿主細(xì)胞致死作用的放大圖。
圖4說明表達(dá)Exg的lacIQpar8cex構(gòu)建體。在該構(gòu)建體中所示的所有元件均與圖2對tacIQpar8cex構(gòu)建體說明中描述的相同,除用lac啟動子(lacP)代替tac啟動子外。
圖5說明表達(dá)Exg的lacUV5par8cex構(gòu)建體。在該構(gòu)建體中所示的所有元件均與圖2對tacIQpar8cex構(gòu)建體注釋中描述的相同,除用lacUV5啟動子(lacUV5P)代替tac啟動子外。
圖6表示經(jīng)或未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的大腸桿菌JM101(lacIQpar8cex)的存活計數(shù)。誘導(dǎo)條件與在圖1說明中描述的相同。細(xì)菌計數(shù)在2X YT平皿和含氨芐青霉素的2X YT瓊脂平皿上完成。(--□--)標(biāo)明了上未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)的大腸桿菌JM101(lacIQpar8cex)在2X YT瓊脂平皿的存活計數(shù)。(-□-)標(biāo)明了未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)的大腸桿菌JM101(lacIQpar8cex)在含氨芐青霉素2X YT瓊脂的平皿存活計數(shù)。(--■--)標(biāo)明了經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)的大腸桿菌JM101(lacIQpar8cex)在2X YT瓊脂平皿的存活計數(shù),(-■-)標(biāo)明了經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)的大腸桿菌JM101(lacIQpar8cex)在含氨芐青霉素2X YT瓊脂平皿的存活計數(shù)。
圖7表示經(jīng)或未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的大腸桿菌JM101(lacUV5par8cex)的存活計數(shù)。誘導(dǎo)條件除了在A550值約為1.2時,加入IPTG外,其他均與在圖1說明中描述的相同。細(xì)菌計數(shù)在2X YT平皿和含氨芐青霉素的2X YT瓊脂平皿上完成。(--□--)標(biāo)明了上未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)的大腸桿菌JM101(lacUV5par8cex)在2X YT瓊脂平皿的存活計數(shù)。(-□-)標(biāo)明了未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)的大腸桿菌JM101(lacUV5par8cex)在含氨芐青霉素2X YT瓊脂平皿的存活計數(shù)。(--■--)標(biāo)明了經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)的大腸桿菌JM101(lacUV5par8cex)在2XYT瓊脂平皿的存活計數(shù),(-■-)標(biāo)明了經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)的大腸桿菌誘導(dǎo)培養(yǎng)的大腸桿菌JM101(lacUV5par8cex)在含氨芐青霉素2X YT瓊脂平皿的存活計數(shù)。
圖8表示在經(jīng)(-■-)或未經(jīng)(-□-)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)的大腸桿菌JM101菌株中,由lacUV5par8cex構(gòu)建體(如圖5所示)表達(dá)的細(xì)胞外Exg活性。在圖7的注釋中有誘導(dǎo)條件。所列的數(shù)據(jù)是來自不同試驗(n=3)的平均值±SEM。
圖9說明表達(dá)干擾素α1b蛋白質(zhì)的重組pINF構(gòu)建體的構(gòu)建過程。
圖10說明表達(dá)干擾素α1b蛋白質(zhì)的lacUV5par8INF構(gòu)建體的構(gòu)建過程。實施例1材料和常規(guī)技術(shù)(a)大腸桿菌菌株和培養(yǎng)基分別用大腸桿菌菌株JM101(Yanisch et al.,Gene,Vol.33,pp 103-119,1985)和BW313(Kunkel,同上文)表達(dá)并增殖質(zhì)粒和噬菌體,并用于DNA分子的點突變。從Promega購買大腸桿菌BHM 71-18 mutS(Δ[lac-proAB],thi,supE,mutS215∷Tn10;F’[lacIq,lacZΔM15,proAB+]),按供應(yīng)商的說明用于雙鏈(ds)DNA誘變。
按前述(Sambrook et al.,Molecular CloningA Laboratory Manual,2ndedition,Cold Spring Harbour Laboratotry Press,N.Y.,1989)制備用于培養(yǎng)并維持大腸桿菌菌株的2X YT和M9培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中加入4-羥甲基香豆素β-D-纖維二吡喃糖(MUC,Sigma)達(dá)到0.1mM的終濃度,用于檢測從菌落分泌的Exg活性。用含70μgml-1氨芐青霉素培養(yǎng)基篩選質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的表現(xiàn)AmpR表型的細(xì)胞和存活細(xì)胞,用于時間過程研究。(b)質(zhì)粒和噬菌體構(gòu)建體編碼成熟C.fimi的Exg的cex基因可以從質(zhì)粒pBR325,p510.507(Curry etal.,ApplEnviron.Microbiol.,Vol.54,pp 476-484)的衍生物中的1.8-kb Eco RI-HindIII片段中得到。質(zhì)粒lacIQpar8(Wong et al.,1993&1996,同上)和pBVXα1b[pBV867的異構(gòu)體(Hau,Molecular Virology,pp 635-636,Ke Yun PublicationCo.,1990)]用于構(gòu)建cex基因的表達(dá)及分泌載體和提供干擾素α1b的基因已在有關(guān)的報道中提及。通過將修飾的Tac盒(Wong et al.,1993 & 1996,同上文)(其中缺失tac啟動子)亞克隆到M13mp18噬菌體載體(Yanisch et al.同上文)的EcoRI和HindIII位點而構(gòu)建載體RH1(未發(fā)表的結(jié)果)。該噬菌體構(gòu)建體有利于DNA分子的誘變。(c)DNA操作采用常規(guī)方法(Sambrook et al.,同上文)完成重組DNA技術(shù),包括限制酶消化,DNA修飾,細(xì)胞轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染,常規(guī)的和低熔點的瓊脂糖凝膠電泳。單鏈DNA分子的點突變按已發(fā)表的方法進行(Kunkel,同上文)。除了用尿嘧啶取代的DNA作為模板之外,雙鏈DNA的突變基本上按照Deng和Nickoloff(Anal.Biochem.Vol.200,pp81-88,1992)的點缺失(USE)方法完成。用含尿苷的(0.5ugml-1)2X YT培養(yǎng)基培養(yǎng)的大腸桿菌BW313菌株制備尿苷取代的DNA,然后通過CsCl-梯度離心(Sambrook et al.,同上文)純化。通過雙脫氧測序法(Sanger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,Vol.74,pp5463-5467,1977)確定所得的突變。實施例2構(gòu)建重組質(zhì)粒(a)構(gòu)建表達(dá)c.fimi Exg的質(zhì)粒質(zhì)粒lacUV5par8cex的tacIQpar8cex(圖1)構(gòu)建方法如下用EcoRI和PstI酶切質(zhì)粒p510.507,得到含cex基因5’末端區(qū)的0.7kb片段,用T4 DNA聚合酶補平其末端。將該片段克隆到RH1的EcoRV位點以使cex基因的5’部分放在ompA前導(dǎo)序列的下游。該產(chǎn)物稱為中間體I,由于cex基因與ompA前導(dǎo)序列的的融合不精確,使用50bp誘變引物OMPAEXO(5’-CGGCG GCCTC CTTGA GCGTG GTCGC GGCCT GCGCT ACGGT AGCGAAACCA-3’)對其進行突變。所述引物5’末端的前25個堿基與編碼成熟Exg產(chǎn)物的cex基因編碼鏈的前25個堿基互補,而所述引物3’末端的后25個堿基與ompA前導(dǎo)序列編碼鏈的后25個堿基退火。在中間產(chǎn)物I構(gòu)建體中兩個退火片段之間不互補序列在誘變過程中除去,以得到在cex和ompA序列之間準(zhǔn)確的融合。所得的產(chǎn)物,稱為中間產(chǎn)物II,用PstI完全消化,用NmI部分消化以得到0.7-kb片段,然后與載體lacIQpar8(用相同的酶消化)連接,以形成下一個中間產(chǎn)物,tacIQpar8cex’。為了重建cex的完整編碼序列,從部分消化的tacIQpar8cex’構(gòu)建體中分離的較大的XmnI-PstI片段與部分消化的p510.507質(zhì)粒純化的較小的XmnI-PstI片段(1.5-kb)連接。將與lacIQpar8中cex基因完全重建的構(gòu)建體稱為tacIQpar8cex。
用USE方法(Deng et al.,同上文),代替tacIQpar8cex構(gòu)建體中由于cex轉(zhuǎn)錄表達(dá)的啟動子。含lac(Hawley et al.,同上文)或lacUV5啟動子(Russell et al.,同上文)的誘變衍生物分別稱為lacIQpar8cex和lacUV5par8cex,用寡核苷酸NATACLAC(5’-CCGCA TACTT ACTCC CCATA CCCCT GTTTA CACTTTATGC TTCCG GCTCG TATGT TGTGT GGAAT TGTGA GCGGA TAACAATTC-3’)或寡核苷酸TACUV5(5’-GCATA CTTAC TCCCC ATCCCCCTGT TTACA CTTTA TGCTT CCGGC TCGTA TAATG TGTGG AATTGTG-3’)作為引物得到的。劃線的六聚體指這些引物中啟動子的-35和-10區(qū)。(b)構(gòu)建表達(dá)干擾素α1b的質(zhì)粒將含干擾素α1b基因質(zhì)粒pBVXa1b(Hau,同上文)的EcoRI-PstI片段,克隆到已經(jīng)用EcoRV加PstI消化的RH1載體(實施例2a)中以形成重組構(gòu)建體RH1INF,其中干擾素α1b基因在Tac盒(Wong et al.,1993&1996,同上文)中與ompA前導(dǎo)序列融合,在分離兩個遺傳元件的克隆過程中形成7個多余密碼子的序列。然后將ompA-干擾素α1b基因融合作為NruI-PstI片段亞克隆到已經(jīng)用兩種相同的酶消化的lacUV5par8cex構(gòu)建體(圖5)中以形成中間構(gòu)建體pINF(圖9),該構(gòu)建體能夠表達(dá)干擾素α1b類似物,在大腸桿菌表達(dá)的該類似物的成熟蛋白質(zhì)的N-末端含7個外源的氨基酸。
為了形成表達(dá)干擾素α1b的最終構(gòu)建體,lacUV5par8INF,用寡核苷酸INF(5’-ATCCA GGCTG TGGGT CTCAG GGAGA TCACA GGCCT GTGCTACGGT AGCGA AACCA GCCAG-3’)作為誘變引物,首先缺失在RH1INF構(gòu)建體中分開ompA前導(dǎo)序列和干擾素基因序列的7個密碼子。用NruI和PstI酶切誘變產(chǎn)物,所述產(chǎn)物含有與ompA序列精確融合的干擾素基因,然后將含ompA-干擾素基因融合的片段亞克隆到已經(jīng)用相同的兩種酶消化的lacUV5par8cex構(gòu)建體(圖5)中以形成最終的構(gòu)建體lacUV5par8INF(圖10),認(rèn)為該構(gòu)建體能夠在大腸桿菌中表達(dá)經(jīng)加工的成熟干擾素α1b蛋白質(zhì)。實施例3檢測重組產(chǎn)物(a)Exg分泌的持續(xù)研究和活性檢測在各研究中,用來自新鮮轉(zhuǎn)化的菌落作為接種物。在30℃保溫接種的培養(yǎng)基,以約200RPM振蕩達(dá)到所需的A550值(表1和附圖的注釋)。將培養(yǎng)物分成兩部分。一部分(誘導(dǎo)的培養(yǎng)物)加入IPTG達(dá)到0.1mM的終濃度,而另一部分(未誘導(dǎo)的)不誘導(dǎo)。將兩種培養(yǎng)物均按前述保溫培養(yǎng),以兩小時的間隔取樣進行活性檢測、活細(xì)胞計數(shù)和A550濁度測量。為了制備細(xì)胞溶解產(chǎn)物,用一半體積的磷酸鹽緩沖液(Sambrook et al.,同上文)將細(xì)胞沉淀洗滌兩次,然后重懸在一體積的相同緩沖液中,最后以16000psi的壓力通過Frenchpressure mini-cell(SLM Instruments Inc,IL.,USA)3次將其溶解。
現(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)描述了(Curry et al.,Appl.Environ.Microbiol.Vol.54,pp 476-484,1988)用于熒光檢測Exg活性的MUC平皿試驗(MUCase)方法。如下檢測Exg對pNPC(Gilkes et al.,J.Biol.Chem.,Vol.250,pp10455-10459)的水解活性(pNPCase)。通常,將20μl試驗緩沖液(100mM磷酸鈉,pH7.0)和100μl25mM的pNPC加到100μl適當(dāng)稀釋的樣品中。將所述混合物在37℃保溫30分鐘,然后通過加入1毫升100mM碳酸鈉溶液停止反應(yīng)。在407nm測量最終產(chǎn)物的吸收值。一單位pNPCase每分鐘產(chǎn)生1nmol對-硝基苯酚。用Bradford的方法(Anal.Biochem.,Vol.72,pp248-254,1976)確定蛋白質(zhì)濃度。(b)干擾素α1b的免疫學(xué)和生物學(xué)試驗按照現(xiàn)有技術(shù)所述的(Zhang et al.,Bioproducts J.China,Vol.7,pp73-75,1994)使用兩種抗干擾素α1b的單克隆抗體的兩抗體夾心方法,對重組干擾素α1b進行免疫學(xué)檢測。簡而言之,首先用100μl包被抗體(以20μg/ml的濃度)覆蓋一96孔平板,然后在37℃保溫2小時。除去抗體后,用在Tris緩沖液(pH7.4)中的0.05%吐溫將孔洗滌兩次。然后將各培養(yǎng)物上清液樣品一式兩份加到兩孔中,將所述平板在37℃保溫30分鐘。用0.05%吐溫緩沖液將孔洗滌三次,每孔加入辣根過氧化物酶結(jié)合的抗體,在37℃保溫30分鐘,每孔用吐溫緩沖液洗滌3次,然后在每孔中加入一滴新鮮制備的底物混合物(用在檸檬酸緩沖液中以0.5μg/ml濃度制備的OPD底物溶液將30%過氧化氫稀釋1000倍)。通過向各孔中加入一滴2M硫酸來終止方法。在470nm測量最終反應(yīng)混合物的吸收值。參考用純化的干擾素α1b制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線確定樣品中干擾素的濃度。
參考現(xiàn)有技術(shù)所述的(Personal communication from Shanghai BioproductResearch Institute)的干擾素保護WISH細(xì)胞抵御病毒攻擊的能力來確定干擾素α1b的生物活性。將一單位干擾素的生物活性定義為最大稀釋1ml干擾素樣品可以保護50%的WISH細(xì)胞免于因病毒攻擊而引起的病變(Personalcommunication from Shanghai Bioproduct Research Institute)。結(jié)果A構(gòu)建tacIQpar8cex用Tac盒(Wong et al.,1993&1996,同上文)有效地分泌各種相對小的(<22kD)異源蛋白質(zhì)提示,它可以促進較大蛋白質(zhì)如49-kD C.fimi Exg(O'Neill et al.,1986a,同上文)的分泌。就該酶的N-末端是催化活性所必需的(Warren et al.,proteins,Vol.1,pp335-341,1986)事實來說,確定將Exg的編碼序列,cex(O’Neill et al.,1986a,同上文)在框架中融合,并在Tac盒中緊接在ompA序列后,希望從融合蛋白中精確地裂解掉OmpA信號肽以達(dá)到活性的分泌Exg產(chǎn)物。用分泌構(gòu)建體之一,lacIQpar8(Wong et al.,1993&1996,同上文)作為載體表達(dá)cex基因。在一系列的有關(guān)亞克隆和定點誘變操作(實施例2a)后,將cex基因與在ltcIQpar8中的ompA精確地融合以形成分泌質(zhì)粒,tacIQpar8cex(圖2)。B由taclIQpar8cex構(gòu)建體表達(dá)并分泌Exg篩選表達(dá)Exg的JM101(tacIQpar8cex)時,MUC平皿在UV輻射下,菌落周圍的熒光暈環(huán)的存在(未列出數(shù)據(jù))表明成功地表達(dá)了Exg。以兩小時間隔收集JM101(tacIQpar8cex)誘導(dǎo)的(用IPTG)和未誘導(dǎo)的(不用IPTG)培養(yǎng)物,對樣品中Exg的分布進行分析。盡管沒有用IPTG誘導(dǎo),但是在JM101中Tac盒仍然很強地表達(dá)了cex基因。測定在12小時時間點收集的非誘導(dǎo)樣品的Exg活性(表1),在此階段,所述培養(yǎng)物處于后對數(shù)生長期(數(shù)據(jù)未列出)。酶水平比使用其他系統(tǒng)(Curry et al.,同上文;O’Neill et al.,Appl.Environ.Microbiol.,Vol 52,pp737-743,1986b)的以前報道的水平高2-11倍。此外,在誘導(dǎo)的和非誘導(dǎo)的上清液樣品中均檢測到顯著的活性水平(圖1),這表明了OmpA能夠?qū)xg引導(dǎo)至周質(zhì)中,并從周質(zhì)中分泌到上清液中。
由于在Tac盒構(gòu)建體中存在lacIq基因元件(圖2),所以在沒有IPTG誘導(dǎo)時,異源蛋白質(zhì)的在JM101菌株中的表達(dá)就要受到嚴(yán)格的阻遏(未公開的數(shù)據(jù))。這樣的調(diào)節(jié)可以誘導(dǎo)高密度培養(yǎng)物高水平地表達(dá)重組蛋白質(zhì)。出乎意料地注意到甚至不進行誘導(dǎo)時,JM101(tacIQpar8cex)也表達(dá)很強的Exg,而且誘導(dǎo)的培養(yǎng)物表達(dá)的總活性比其“阻遏”的對應(yīng)物低很多(表1)。所述結(jié)果表明Exg的過表達(dá)對于大腸桿菌細(xì)胞可能是有害的。此外,大量產(chǎn)生的Exg以溶解的形式存在。
盡管從非誘導(dǎo)的和誘導(dǎo)的JM101(tacIQpar8cex)中表達(dá)的Exg的總產(chǎn)率(Uml-1)有很大的不同,但是兩者分泌的Exg活性(Uml-1)很相似(表1)。這表明這兩者培養(yǎng)物都不能有效地生產(chǎn)細(xì)胞外Exg。C IPTG誘導(dǎo)對JM101(tacIQpar8cex)細(xì)胞生存能力的有害作用為了研究Exg對JM101(tacIQpar8cex)生長的抑制作用,在時間過程研究(圖1)中與Exg表達(dá)同時監(jiān)測菌株的生存能力(圖3)。盡管在非誘導(dǎo)條件下所述培養(yǎng)物正常生長,但是IPTG的加入引起細(xì)胞迅速死亡,正如細(xì)胞不能在培養(yǎng)皿中生長(圖3)所表明的。存在IPTG時,不是所有的細(xì)胞都立即死亡,沒有被完全誘導(dǎo)的那些能保持存活(圖3B)。這些細(xì)胞與可能只分裂幾代,而且細(xì)胞計數(shù)無法登記的那些細(xì)胞一起在誘導(dǎo)生長后前期(前8個小時),有可能引起分泌的Exg活性的顯著增加(圖1)。在生長后期(圖1)中檢測到的Exg活性的輕微增加可能是由于少量活細(xì)胞的表達(dá)(圖3B)而引起的,所述細(xì)胞可能是部分誘導(dǎo)的細(xì)胞或只含有少量tacIQpar8cex構(gòu)建體拷貝的細(xì)胞。D利用較弱的啟動子增強Exg表達(dá)盡管tacIQpar8cex構(gòu)建體能夠在大腸桿菌中表達(dá)高水平Exg,但它不能提供可控制的Exg表達(dá)模式并有利于所述酶的有效分泌(表1)使得它不適于分泌生產(chǎn)Exg。Exg表達(dá)的致死作用說明可以用比tac弱的啟動子更好地增強細(xì)胞外Exg的生產(chǎn)。在研究中使用了兩種啟動子lac(Hawley et al.,同上文)和lacUV5(Russell et al.,同上文),后者是前者對降解不敏感的突變體。
利用點突變技術(shù)(Kunkel,同上文)和用于誘變雙鏈DNA分于的USE(Deng et al.,同上文),通過分別使用NTACLAC和TACUV5(實施例2a)構(gòu)建了tacIQpar8cex的兩個衍生物,稱為lacIQpar8cex和lacUV5par8cex。兩個構(gòu)建體除在lacIQpar8cex中的啟動子為lac和lacUV5par8cex的啟動子為lacUV5外,均與tacIQpar8cex相同。E JM101(lacIQpar8cex)和JM101(lacUV5par8cex)的生長研究在兩個新構(gòu)建體中表達(dá)cex基因的弱啟動子lacIQpar8cex和lacUV5par8cex能夠使宿主培養(yǎng)物在沒有IPTG時保持正常生長,還可使其在誘導(dǎo)物存在時保持良好的生長(圖6&7)。JM101(lacIQpar8cex)和JM101(lacUV5par8cex)的誘導(dǎo)培養(yǎng)物與JM101(tacIQpar8cex)(圖3)相比,細(xì)胞的生存能力得到改善。不過,lacUV5par8cex構(gòu)建體的誘導(dǎo)仍對其宿主有一些致死作用(圖7),對采用較低效率的lac啟動子在JM101(lacIQpar8cex)中表達(dá)Exg似乎對細(xì)胞沒有任何有害的作用(圖6)。
盡管在誘導(dǎo)的JM101(lacIQpar8cex)培養(yǎng)物中得到的活細(xì)胞的計數(shù)比其非誘導(dǎo)對應(yīng)底物少,但是在所有的檢測時間點,實際的細(xì)胞計數(shù)是相當(dāng)高的(圖7)。另一點值得注意的是,在誘導(dǎo)的JM101(tacIQpar8cex)培養(yǎng)物(圖3)中發(fā)現(xiàn)的質(zhì)粒的令人驚奇的矯正在JM101(lacUV5par8cex)(圖4)中并未觀察到。F用構(gòu)建體lacUV5par8cex提高細(xì)胞外Exg的生產(chǎn)評價lacIQpar8cex和lacUV5par8cex構(gòu)建體在表達(dá)Exg時的效率。正如由從JM101(lacUV5par8cex)培養(yǎng)物(圖8和表1)中得到的結(jié)果所表明的,在沒有IPTG誘導(dǎo)時,兩種構(gòu)建體的培養(yǎng)物只表達(dá)低水平的Exg活性。數(shù)據(jù)表明,lac和lacUV5啟動子均緊緊地被在這些構(gòu)建體共表達(dá)的lacIq基因的阻遏物所抑制。但是,一旦通過IPTG誘導(dǎo)除去阻遏后,培養(yǎng)物(lacUV5par8cex)(圖8和表1)而不是JM101(lacIQpar8cex)(表1)的Exg生產(chǎn)有明顯的提高。不僅在細(xì)胞內(nèi)樣品中檢測到這種提高,而且在培養(yǎng)物上清液中更明顯(圖8和表1)。誘導(dǎo)的JM101(lacUV5par8cex)分泌的Exg活性是非誘導(dǎo)的JM101(tacIQpar8cex)培養(yǎng)物(圖1)的四倍之多,盡管兩種培養(yǎng)物表達(dá)的總Exg活性(Uml-1)水平相似(表1)。
在整個時間過程研究(圖3)中都在非誘導(dǎo)的JM101(tacIQpar8cex)中記錄到高密度的活細(xì)胞,可能能夠解釋從不完全阻遏的tac啟動子表達(dá)的,檢測的(表1)高水平的總Exg。但是如果比較Exg的特異性活性(以蛋白質(zhì)重量(表1)為基礎(chǔ)得到的)或細(xì)胞計數(shù),很清楚地是(特別是在上清液樣品中)后者培養(yǎng)物比前者更有生產(chǎn)力。甚至可以從經(jīng)延長IPTG誘導(dǎo)(圖8)的JM101(lacUV5par8cex)培養(yǎng)物中得到高水平的Exg。G用pINF構(gòu)建體表達(dá)并分泌干擾素α1b使用pINF構(gòu)建體(實施例2b和圖9),用以前描述的(實施例3b)免疫學(xué)和生物學(xué)方法確定在大腸桿菌中表達(dá)干擾素的研究。確定在A550=0.5的細(xì)胞密度,用1mM IPTG誘導(dǎo)12小時和14小時的JM101(pINF)的上清液樣品中是否存在干擾素活性。盡管構(gòu)建體pINF可能只產(chǎn)生在常數(shù)蛋白質(zhì)N-末端含7個額外氨基酸的干擾素α1b的類似物(比真正干擾素的抗原性和生物活性低),單來自兩種試驗的結(jié)果表明在上清液樣品中存在免疫和生物學(xué)活性(表2)。另外,我們的結(jié)果第一次表明干擾素α1b可以在大腸桿菌中表達(dá)并分泌到細(xì)胞外。表一不同重組構(gòu)建體表達(dá)Exg的活性比活(U毫克蛋白-1)活性(U毫升-1) 活性百分比重組構(gòu)建體誘導(dǎo)物 細(xì)胞內(nèi) 培養(yǎng)基上清 細(xì)胞內(nèi) 培養(yǎng)基上清 細(xì)胞內(nèi) 培養(yǎng)基上清tacIQpar8cex-289.3 494.5561.2 65.589.5 10.5tacIQpar8cex+5.0222.52.658.24.395.7lacIQpar8cex-22.0 23.5 9.60.8 92.3 7.7lacIQpar8cex+55.2 90.2 31.3 3.4 90.2 9.8lacUVpar8cex-110.9 63.3 77.3 1.8 97.7 2.3lacUVpar8cex+403.1 1045.4 273.9 248.1 52.5 47.5含不同重組構(gòu)建體的JM101菌株在含有氨芐青霉素的2X YT培養(yǎng)基中生長到A550為0.3時加入或不加入終濃度為0.1mM的IPTG誘導(dǎo)物后,繼續(xù)培養(yǎng)12小時后測定Exg的活性。表二 JM101(pINF)培養(yǎng)物上清中干擾素的活性樣 品IPTG誘導(dǎo)免疫活性(ugml-1) 生物活性(IUml-1)112小時 0.020194224小時 0.02116權(quán)利要求
1.重組DNA構(gòu)建體pINF,lacUV5par8INF,及其衍生物,所述重組DNA構(gòu)建體pINF的保藏號是CCTCC M96024
2.權(quán)利要求1所述的重組DNA構(gòu)建體lacUV5par8INF的構(gòu)建方法,該方法是通過將編碼干擾素α1b蛋白質(zhì)的基因序列亞克隆到lacUV5par8cex分泌型載體中而構(gòu)建,所述重組DNA構(gòu)建體能夠表達(dá)干擾素α1b活性蛋白質(zhì)并分泌到細(xì)胞外。
3.權(quán)利要求1中重組DNA構(gòu)建體lacUV5par8INF的衍生物的構(gòu)建方法,該方法是通過將干擾素α1b基因的突變體或片段亞克隆到lacUV5par8cex分泌型載體中而形成,其能夠表達(dá)干擾素α1b活性蛋白質(zhì)的變異體并分泌到細(xì)胞外。
4.權(quán)利要求1中重組DNA構(gòu)建體lacUV5par8INF的衍生物的構(gòu)建方法,該方法是通過將干擾素α1b基因或其突變體亞克隆到修飾后的lacUV5par8cex重組DNA構(gòu)建體中而形成,lacUV5par8cex的修飾是采用原核生物中常用的啟動子、核糖體結(jié)合序列、ompA前導(dǎo)序列、轉(zhuǎn)錄終止子、lacIq基因和/或par元件取代lacUV5par8cex中的lacUV5啟動子、共有的核糖體結(jié)合序列、ompA前導(dǎo)序列、trpA轉(zhuǎn)錄終止子、lacIq基因和/或par元件而進行的,所述的衍生物均能夠表達(dá)干擾素α1b的活性蛋白質(zhì)或其變異體,例如采用tac或lac啟動子取代lacUV5啟動子,或者用四環(huán)素抗性取代氨芐青霉素抗性等。
5.含權(quán)利要求1中任一重組DNA分子的宿主細(xì)胞。
6.含權(quán)利要求1中任一重組DNA分子的轉(zhuǎn)基因生物體。
7.權(quán)利要求5中的宿主細(xì)胞是原核生物。
8.權(quán)利要求5中的宿主細(xì)胞是大腸桿菌菌株。
9.在權(quán)利要求5的生物體中生產(chǎn)干擾素α1b的方法。
10.在權(quán)利要求5的生物體的培養(yǎng)基中生產(chǎn)干擾素α1b的方法。
11.在權(quán)利要求6的生物體中生產(chǎn)干擾素α1b的方法。
全文摘要
一種采用基因表達(dá)的lacUV5啟動子和OmpA信號肽分泌重組蛋白質(zhì)編碼順序分泌型載體已經(jīng)有效的在大腸桿菌中表達(dá)了Cellulomomas fimi細(xì)胞外葡萄糖酶并分泌到細(xì)胞外。因其很好的特性,已經(jīng)將分泌載體用于生產(chǎn)干擾素α 1b蛋白質(zhì)和具有免疫學(xué)和生物學(xué)活性的干擾素α 1b蛋白質(zhì)變異體和片段。本發(fā)明描述了重組DNA構(gòu)建體lacUV5par8INF及其衍生物的構(gòu)建方法,并描述了應(yīng)用前述分泌載體和其變異體在轉(zhuǎn)基因生物體和原核細(xì)胞、特別是在大腸桿菌菌株和/或其培養(yǎng)基中生產(chǎn)干擾素α 1b和其變異體蛋白質(zhì)的方法。
文檔編號C12N15/21GK1186120SQ9611424
公開日1998年7月1日 申請日期1996年12月24日 優(yōu)先權(quán)日1996年12月24日
發(fā)明者黃允強 申請人:深圳科興生物制品有限公司