重組人參超氧化物歧化酶的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種適合大腸桿菌分泌表達(dá)重組人參超氧化物歧化酶(recombinant ginseng superoxide dismutase，rgSOD)的信號(hào)肽核苷酸序列和編碼人參SOD的SOD核苷酸序列、含有上述核苷酸序列的載體、含有前述載體的工程細(xì)胞以及從該工程細(xì)胞純化rgSOD的方法。優(yōu)化后的超氧化物歧化酶基因非常適合大腸桿菌表達(dá)，具有高表達(dá)、高穩(wěn)定、高分泌的特點(diǎn)。本發(fā)明可高效、簡(jiǎn)便、低成本地獲得rgSOD純品。本發(fā)明還包括通過(guò)上述方法制備的重組人參超氧化物歧化酶在制備治療與人老化相關(guān)疾病或病理癥狀的藥物、食品、保健品及其化妝品中的應(yīng)用。CGMCC No97432014.09.29
【專利說(shuō)明】重組人參超氧化物歧化酶的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及大腸桿菌分泌表達(dá)重組人參超氧化物歧化酶的編碼信號(hào)肽的核苷酸 序列和編碼人參S0D的核苷酸序列、含有上述核苷酸序列的載體、含有前述載體的工程細(xì) 胞和從該工程細(xì)胞純化rcSOD的方法及其用途，屬于基因工程和蛋白質(zhì)生物化學(xué)領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 超氧化物歧化酶（SuperoxideDismutase,EC1. 15. 1. 1，S0D)是一種廣泛存在于動(dòng) 植物、微生物中的金屬酶。能催化生物體內(nèi)超氧自由基（〇2〇發(fā)生歧化反應(yīng)，是機(jī)體內(nèi)〇 2i勺 天然消除劑（黎瑞珍，楊慶建，陳貽銳.超氧化物歧化酶（S0D)活性的測(cè)定及其應(yīng)用研 究.海南瓊州大學(xué)學(xué)報(bào)，2004年10月28日：34-36)。從而清除0 2_，在生物體的自我保護(hù)系 統(tǒng)中起著極為重要的作用。S0D是一種源于生命體的活性物質(zhì)，能消除生物體在新陳代謝過(guò) 程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)。對(duì)人體不斷地補(bǔ)充S0D具有抗衰老的特殊效果（朱漢民，王贊舜.衰 老機(jī)理研究中的超氧物岐化酶.國(guó)外醫(yī)學(xué)老年病分冊(cè)，1985. (1) :49?54 ;胡文蕘，鐘福 孫，韓憲法等.正常人、高血脂癥、心血管病血中過(guò)氧化脂質(zhì)和超氧物岐化酶的分析.生化 藥物雜志，1988 (2) : 48?50)。超氧化物歧化酶是1938年Marn等人首次從牛紅血球中分 離得到超氧化物歧化酶開(kāi)始算起，人們對(duì)S0D的研究己有七十多年的歷史。1969年McCord 等重新發(fā)現(xiàn)這種蛋白，并且發(fā)現(xiàn)了它們的生物活性，弄清了它催化過(guò)氧陰離子發(fā)生歧化反 應(yīng)的性質(zhì)，所以正式將其命名為超氧化物歧化酶。S0D幾乎從人到細(xì)胞，從動(dòng)物到植物，都有 它的存在（Reiss.Ratliversuperoxidedismutasepurificationandagerelat edmodification.EuropanJ.Biochem. 1976, 63:617 ?623)，按其所含金屬輔基不同可 分為三種，第一種是含銅（Cu)鋅（Zn)金屬輔基的稱（Cu.Zn-S0D)，最為常見(jiàn)的一種酶，呈綠 色，主要存在于機(jī)體細(xì)胞漿中；第二種是是含錳（Mn)金屬輔基的稱（Mn-S0D)，呈紫色，存在 于真核細(xì)胞的線粒體和原核細(xì)胞內(nèi)；第三種是含鐵（Fe)金屬輔基的稱（Fe-SOD)，呈黃褐 色，存在于原核細(xì)胞中。
[0003] 人參超氧化物歧化酶（Cu/Zn型）蛋白全長(zhǎng)152個(gè)氨基酸，單個(gè)肽鏈分子量為 15. 3KD，以二聚體形式存在。
[0004] 伴隨生物科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們開(kāi)始了基因工程法表達(dá)S0D，但在大腸桿菌中表達(dá) S0D往往以無(wú)活性的包涵體形式存在，雖然人們嘗試了諸多復(fù)性方法，終究因?yàn)槌杀靖摺?fù) 性率低等原因，很難實(shí)現(xiàn)工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)要求。后來(lái)，科研工作者探討了利用真核生物酵 母分泌表達(dá)，獲得了較為滿意的結(jié)果，目前，上市的重組S0D，均用大腸桿菌胞內(nèi)表達(dá)或酵母 表達(dá)生產(chǎn)，雖然采用高密度發(fā)酵，但表達(dá)水平低，加上由此帶來(lái)的復(fù)雜的純化工藝（需要反 相層析），產(chǎn)率較低，此低產(chǎn)率不能滿足市場(chǎng)需求。除了應(yīng)用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)外，人們也試 圖利用芽孢桿菌、啤酒酵母以及哺乳動(dòng)物細(xì)胞等表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)S0D。采用真核表達(dá)系統(tǒng)能夠 實(shí)現(xiàn)S0D的活性，但遺憾的是，因?yàn)楸磉_(dá)水平低、成本高等因素，目前幾乎沒(méi)有人采用這些 表達(dá)系統(tǒng)來(lái)生產(chǎn)S0D。而大腸桿菌分泌表達(dá)系統(tǒng)的研究是其中最重要的趨勢(shì)。
[0005] 本發(fā)明人通過(guò)多次篩選，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)可用于分泌表達(dá)人參超氧化物歧化酶蛋白的 分泌信號(hào)肽段編碼的基因（SEQIDNO: 1)，與人參超氧化物歧化酶編碼基因（SEQIDNO: 3)融合形成信號(hào)肽-人參超氧化物歧化酶編碼基因，構(gòu)建原核表達(dá)載體后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌 BL21(DE3)細(xì)胞中，從而實(shí)現(xiàn)了rgSOD的高水平分泌表達(dá)rgSOD，在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
[0006] 本發(fā)明系統(tǒng)優(yōu)化、改變了獲得S0D的大腸桿菌工程細(xì)胞的方法，利用大腸桿菌基 因表達(dá)的分泌肽段與S0D融合表達(dá)獲得了更為滿意的結(jié)果，并通過(guò)發(fā)酵工藝的改進(jìn)，同時(shí) 簡(jiǎn)便純化工藝，獲得高表達(dá)、高得率、高活性極具產(chǎn)業(yè)化價(jià)值的一種rgSOD生產(chǎn)方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 基于現(xiàn)有技術(shù)的缺欠，本發(fā)明的目的是提供編碼上述信號(hào)肽的核苷酸序列、含有 該信號(hào)肽核苷酸序列和人參S0D核苷酸序列的載體、含有前述載體的工程細(xì)胞以及從該工 程細(xì)胞純化rgSOD的方法。
[0008] 本發(fā)明的發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，在表達(dá)如SEQIDN0 :3所示的人參S0D核苷酸序列 前，加入如SEQIDN0:1所示的信號(hào)肽核苷酸序列，可以意外地獲得高融合表達(dá)的人參S0D 的載體，且使用該載體表達(dá)的SOD易于純化，純度高、收量大，活性高。
[0009] 在本發(fā)明的又一個(gè)方面，提供了一種在編碼人參超氧化物歧化酶的核苷酸序列前 加入一個(gè)能使人參超氧化物歧化酶表達(dá)后分泌到細(xì)胞壁與原生質(zhì)膜間隙的分泌肽段核酸 序列，所述的核苷酸序列SEQIDNO: 1能夠編碼SEQIDN0 :2所示的氨基酸序列，而且所述 核苷酸序列SEQIDNO: 1與人參超氧化物歧化酶編碼區(qū)序列SEQIDN0 :3融合形成核苷酸 序列SEQIDN0 :5。
[0010] 在本發(fā)明的再一個(gè)方面，提供了一種表達(dá)載體，它含有本發(fā)明上述的核苷酸序列。 優(yōu)選地，所述表達(dá)載體為pET22b。
[0011] 在本發(fā)明的再一個(gè)方面，提供了一種工程細(xì)胞，它是通過(guò)所述表達(dá)載體序列轉(zhuǎn)化 宿主細(xì)胞而獲得的，且表達(dá)載體中整合有編碼重組超氧化物歧化酶的核苷酸序列。
[0012] 優(yōu)選地，所述的工程細(xì)胞是大腸桿菌菌株為BL21 (DE3)。
[0013] 在本發(fā)明的進(jìn)一步方面，提供了 一種生產(chǎn)人參超氧化物歧化酶的表達(dá)方法，包括 以下步驟：在適合表達(dá)條件下，培養(yǎng)本發(fā)明上述的宿主細(xì)胞，從而分泌表達(dá)人參超氧化物歧 化酶；優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌菌株為BL21 (DE3)。所述培養(yǎng)包括：培養(yǎng)分為培養(yǎng) 階段和誘導(dǎo)階段，培養(yǎng)階段培養(yǎng)菌液濃度達(dá)到0D600,誘導(dǎo)期時(shí)間為18-21hr，發(fā)酵及誘導(dǎo) 溫度保持在16_25°C，IPTG用量為0. 05-lmM/L，誘導(dǎo)期的pH值為6-8。所述大腸桿菌宿主 細(xì)胞包括可以用IPTG誘導(dǎo)合成人參超氧化物歧化酶，并且能夠分泌到細(xì)胞壁與原生質(zhì)膜 間隙的大腸桿菌細(xì)胞。
[0014] 在本發(fā)明的另一個(gè)方面，對(duì)表達(dá)后重組人參S0D進(jìn)行了粗提和進(jìn)一步純化。其包 括如下步驟：（1)對(duì)發(fā)酵樣品通過(guò)離心和/或過(guò)濾方式收集菌體，用溶菌酶處理菌體，再通 過(guò)離心方法獲得清液，（2)通過(guò)鹽析和/或超濾進(jìn)行初步純化后，或直接通過(guò)陰離子交換、 疏水層析方法，獲得純度達(dá)到95%以上（如95-99. 9% )的純品，本發(fā)明所制備的重組人參 S0D活性在5500U、或6000U以上。
[0015] 在本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明提供使用上述方法制備的重組人參S0D在制備治 療與人超氧化物歧化酶相關(guān)疾病或病理癥狀的藥物、食品、保健品及其化妝品中的用途。所 述重組人參超氧化物歧化酶含有任一如下氨基酸序列：
[0016]a)SEQIDNO. 2所示氨基酸序列；和/或 [0017]b)SEQIDNO. 4所示氨基酸序列；或 [0018]c)SEQIDNO. 6所示氨基酸序列。
[0019]本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于：（1)優(yōu)化后的鏈接分泌信號(hào)肽基因非常適合大腸桿菌表 達(dá)，具有高表達(dá)、高穩(wěn)定、高分泌的特點(diǎn)；（2)含有分泌信號(hào)肽的超氧化物歧化酶基因的宿 主菌株具有高密度生長(zhǎng)的特性，非常適于基因工程藥物大規(guī)模高密度的發(fā)酵生產(chǎn)。大腸桿 菌表達(dá)的hgSOD以可溶性、具活性形式分泌到細(xì)胞壁與原生質(zhì)膜間隙；產(chǎn)物不須復(fù)性，可以 直接進(jìn)行純化；同時(shí)由于表達(dá)水平高，純化工藝復(fù)雜程度大大簡(jiǎn)化，得率得到大幅度提高； (3)與真核系統(tǒng)表達(dá)相比，成本大大降低，產(chǎn)業(yè)化價(jià)值得到大幅度提升。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1顯示用于編碼本發(fā)明信號(hào)肽的核苷酸序列。
[0021] 圖2本發(fā)明信號(hào)肽的氨基酸序列。
[0022] 圖3顯示用于編碼本發(fā)明天然人參S0D的核苷酸序列。
[0023] 圖4本發(fā)明天然人參S0D的氨基酸序列。
[0024] 圖5顯示用于編碼本發(fā)明重組人參S0D的核苷酸序列。
[0025] 圖6本發(fā)明重組人參S0D的氨基酸序列。
[0026] 圖7用于編碼本發(fā)明信號(hào)肽的核苷酸序列和由其推定的本發(fā)明信號(hào)肽的氨基酸 序列的對(duì)應(yīng)圖。
[0027] 圖8用于編碼本發(fā)明融和表達(dá)的重組人參S0D的核苷酸序列和由其推定的本發(fā)明 融和表達(dá)的重組人參S0D的氨基酸序列的對(duì)應(yīng)圖。
[0028] 圖9是本發(fā)明的一種表達(dá)質(zhì)粒pET-rgSOD的構(gòu)建示意圖。
[0029] 圖10是搖瓶37°C條件下rgSOD表達(dá)電泳圖。各泳道如下：泳道1、誘導(dǎo)前；泳道 2、誘導(dǎo)后，誘導(dǎo)4小時(shí)取樣，SDS-PAGE電泳檢測(cè)表達(dá)情況。
[0030] 圖11是在不同溫度條件下（IPTG濃度為lmM/L)rgS0D表達(dá)電泳圖。誘導(dǎo)20小 時(shí)后，收集菌體，用溶菌酶在37°C條件下，處理2小時(shí)，15000rpm離心10分鐘，取上清， SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)情況。
[0031] 圖12是IPTG濃度對(duì)rgSOD表達(dá)水平的影響。在20°C條件下，分別用0. 6mM、0. 4mM、 0. 2mM、0.ImM濃度的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)20小時(shí)后，收集菌體，用溶菌酶在37°C條件下， 處理2小時(shí)，15000rpm離心10分鐘，取上清，SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)情況。
[0032] 圖13是在6. 5L發(fā)酵罐中rgSOD的表達(dá)情況電泳圖。各泳道如下：泳道1、誘導(dǎo)前 取樣；泳道2、誘導(dǎo)20小時(shí)取樣。
[0033] 圖14是純化后的rgSOD的電泳圖。在6. 5L發(fā)酵罐中表達(dá)rgSOD，收集菌體，用溶 菌酶在37°C條件下，處理2小時(shí)，15000rpm離心10分鐘，取上清，用陰離子交換層析、疏水 層析以后的蛋白SDS-PAGE電泳圖。

【具體實(shí)施方式】
[0034] 為了提供對(duì)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性理解，在下文中以不同的詳細(xì)程度描述了本發(fā)明的某 些方面、模式、實(shí)施方式、變型和特征。
[0035] 在實(shí)施本發(fā)明的過(guò)程中，使用了分子生物學(xué)、基因工程學(xué)、遺傳學(xué)、細(xì)胞分子 生物學(xué)、生物化學(xué)、蛋白質(zhì)生物化學(xué)、蛋白質(zhì)生物化學(xué)工程、制藥工藝學(xué)、醫(yī)學(xué)、生理學(xué)、 病理學(xué)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)學(xué)，Sambrook等（MolecularCloning:ALaboratoryManual, 2nd edition, 1989,ColdSpringHarborLaboratoryPress)等很多傳統(tǒng)技術(shù)和基礎(chǔ)理論。這 些技術(shù)是熟知的。
[0036] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，提供了一種重組人參超氧化物歧化酶，其中，所述 人參超氧化物歧化酶包含任一如下氨基酸序列：
[0037]a)SEQIDN0. 2所示氨基酸序列；和/或
[0038]b)SEQIDN0. 4所示氨基酸序列；或
[0039]c)SEQIDN0.6所示氨基酸序列。
[0040] 在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)分子克隆提供編碼所述信號(hào)肽和人參超氧化 物歧化酶的核苷酸序列。
[0041] 本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)"核苷酸序列"包括基因組DNA、CDNA、合成的DNA和RNA。優(yōu)選地， 其指DNA，更優(yōu)選為編碼序列的cDNA。本發(fā)明還涵蓋編碼具有如本文所定義的特定性質(zhì)的 酶或蛋白的核苷酸序列。本文所用的術(shù)語(yǔ)"核苷酸序列"是指寡核苷酸序列或多核苷酸序 列和其變體、同源物、片段和衍生物（如其部分）。所述核苷酸序列可以是源自基因組或合 成物或重組物，其可以是雙鏈的或單鏈的（無(wú)論其代表正義鏈還是反義鏈）核酸分子。
[0042] 在本發(fā)明的一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，提供了一種分離的核酸分子，其中，所述分離的 核酸分子包含任一如下核苷酸序列：
[0043]a)編碼SEQIDN0:2的氨基酸序列的SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列；和/或
[0044]b)編碼SEQIDN0:4的氨基酸序列的SEQIDN0. 3所示的核苷酸序列；或
[0045]c)編碼SEQIDN0:6的氨基酸序列的SEQIDN0. 5所示的核苷酸序列。
[0046] 編碼具有如本文所定義的酶或蛋白的核苷酸序列可以從產(chǎn)生所述酶或蛋白的任 何細(xì)胞或生物中分離得到。用于分離核苷酸序列的各種方法都是本領(lǐng)域熟知的。本文僅為 舉例性質(zhì)，例如利用強(qiáng)變性劑提取總RNA，利用轉(zhuǎn)錄和反轉(zhuǎn)錄方法，產(chǎn)生所述酶或蛋白的生 物的染色體DNA或信使RNA(mRNA)來(lái)構(gòu)建基因組DNA和/或cDNA文庫(kù)。
[0047] 還有，也可以通過(guò)成熟的標(biāo)準(zhǔn)方法通過(guò)合成來(lái)制備編碼所述酶或蛋白的核苷酸序 列，再如，利用自動(dòng)DNA合成儀上合成寡核苷酸，然后將其純化、退火、連接并克隆到適當(dāng)?shù)?載體中。
[0048] 因此，所述核苷酸序列可以是源自混合的基因組和合成來(lái)源、混合的合成和cDNA 來(lái)源、或混合的基因組和cDNA來(lái)源，其根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過(guò)連接源自合成的、基因組的或 cDNA的片段根據(jù)需要而制得。每個(gè)連接的片段對(duì)應(yīng)于整個(gè)核苷酸序列的不同部分。所述 DNA序列也可以使用特定引物通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)來(lái)制備。
[0049] 本文中術(shù)語(yǔ)"PCR"被稱之為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction,PCR) 是指在DNA聚合酶的催化下，通過(guò)變性、退伙，聚合擴(kuò)增等反復(fù)循環(huán)達(dá)到幾何數(shù)量級(jí)擴(kuò)增位 于兩段已知序列之間的DNA區(qū)段。
[0050] 可以使用本發(fā)明的多核苷酸（核苷酸序列）制備引物，如PCR引物，用于可選擴(kuò)增 反應(yīng)的引物；或可以將多核苷酸克隆到載體中。所述引物、和其它片段的長(zhǎng)度可以是至少 12個(gè)、如至少15個(gè)，優(yōu)選為至少20個(gè)、如至少25個(gè)、30個(gè)、35個(gè)或40個(gè)核苷酸，且其也涵 蓋在如本文所用的術(shù)語(yǔ)多核苷酸之內(nèi)。
[0051] 通常，使用重組DNA技術(shù)（即重組的DNA)制備編碼具有如本文所定義的特定性質(zhì) 的酶或蛋白的核苷酸序列。因此，在本發(fā)明的一個(gè)可選實(shí)施方式中，可以使用本領(lǐng)域已知的 化學(xué)方法來(lái)合成全部或部分核苷酸序列。
[0052] 通常，可通過(guò)合成方法來(lái)制備引物，該方法包括以每次一個(gè)核苷酸的方式逐步制 備所需要的核酸序列。本領(lǐng)域中易于獲得使用自動(dòng)化技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)上述方法的技術(shù)。引物 設(shè)計(jì)可以根據(jù)提高純度需要考慮在目的蛋白N端或C端的核苷酸序列加入編碼標(biāo)簽蛋 白（Tagged-proteinexpressionsystem)的核苷酸序列，常見(jiàn)的標(biāo)簽蛋白包括但不限于 His-tag蛋白，F(xiàn)lag-tag蛋白，GST-tag蛋白等。
[0053] 可以重組、合成或通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用的任何方法來(lái)制備根據(jù)本發(fā)明的多 核苷酸（如DNA多核苷酸）。它們也可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行克隆。通常使用重組方法，如使 用PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）克隆技術(shù)來(lái)制備較長(zhǎng)的多核苷酸。這包括制備位于所需要克隆 的脂質(zhì)靶向序列區(qū)域側(cè)翼的一對(duì)引物（如約12至40個(gè)核苷酸），使引物接觸從人參中獲 得的mRNA或cDNA，在可以使所需區(qū)域擴(kuò)增的條件下進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，分離擴(kuò)增的片段 (如通過(guò)在瓊脂糖凝膠上純化反應(yīng)混合物），并回收擴(kuò)增的DNA。可以設(shè)計(jì)引入使其包含適 合的限制性酶識(shí)別位點(diǎn)，以便可以將擴(kuò)增的DNA克隆到適合的克隆載體中。
[0054] 如上所述，可以重組、合成或通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用的任何方法來(lái)制備根據(jù) 本發(fā)明的多核苷酸（如DNA多核苷酸）。它們也可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行克隆。通常使用重 組方法，如使用PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）克隆技術(shù)來(lái)制備較長(zhǎng)的多核苷酸。這包括制備位于 所需要克隆的脂質(zhì)靶向序列區(qū)域側(cè)翼的一對(duì)引物（如約15至30個(gè)核苷酸），使引物接觸從 人參中獲得的mRNA或cDNA，在可以使所需區(qū)域擴(kuò)增的條件下進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，分離擴(kuò) 增的片段（如通過(guò)在瓊脂糖凝膠上純化反應(yīng)混合物），并回收擴(kuò)增的DNA?？梢栽O(shè)計(jì)引入使 其包含適合的限制性酶識(shí)別位點(diǎn)，以便可以將擴(kuò)增的DNA克隆到適合的克隆載體中。酶切 位點(diǎn)的設(shè)計(jì)可以根據(jù)載體克隆位點(diǎn)和編碼具有本文所定義的特定性質(zhì)的酶或蛋白的核苷 酸序列來(lái)設(shè)定，往往在前面加入若干個(gè)保護(hù)堿基，詳細(xì)可以參考PR0MEGA公司提供的保護(hù) 喊基設(shè)定參考手冊(cè)。
[0055] 在本發(fā)明的一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述人參超氧化物歧化酶通過(guò)表達(dá)任一以下所 示的核苷酸序列而獲得：
[0056]a)編碼SEQIDN0:2的氨基酸序列的SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列；和/或
[0057]b)編碼SEQIDN0:4的氨基酸序列的SEQIDN0. 3所示的核苷酸序列；或
[0058]c)編碼SEQIDN0:6的氨基酸序列的SEQIDN0. 5所示的核苷酸序列。
[0059] 術(shù)語(yǔ)"構(gòu)建體"，即指構(gòu)建的載體，其包含載體載體本身的核苷酸序列和依照本發(fā) 明使用的編碼具有本文所定義的特定性質(zhì)的酶或蛋白的核苷酸序列，且其直接或間接地與 啟動(dòng)子連接。在一些【具體實(shí)施方式】中，優(yōu)選構(gòu)建體至少包含本發(fā)明的核苷酸序列，或編碼具 有如本文定義的特定性質(zhì)的酶或蛋白且可操作地與啟動(dòng)子連接的核苷酸序列。
[0060] 術(shù)語(yǔ)"表達(dá)載體"是指能夠在體內(nèi)或體外表達(dá)的構(gòu)建體。其包含載體本身的核苷 酸序列和依照本發(fā)明使用的編碼具有本文所定義的特定性質(zhì)的酶或蛋白的核苷酸序列，且 其直接或間接地與強(qiáng)啟動(dòng)子連接。優(yōu)選地，本發(fā)明的表達(dá)載體包含載體本身的核苷酸序列 和所述信號(hào)肽-人參S0D結(jié)合的核苷酸序列，表達(dá)載體可以被引入到生物（如大腸桿菌宿 主生物）的基因組中。術(shù)語(yǔ)"引入"優(yōu)選涵蓋穩(wěn)定的引入到基因組中。
[0061] 在本發(fā)明的一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，提供了 一種表達(dá)載體，其中所述表達(dá)載體含有 任一如下核苷酸序列：
[0062]a)SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列；和/或
[0063]b)SEQIDN0. 3所示的核苷酸序列；或
[0064]c)SEQIDN0. 5所不的核苷酸序列。
[0065] 優(yōu)選地，所述表達(dá)載體為pET22b。
[0066] 如本文所定義的編碼人參SOD的核苷酸序列和信號(hào)肽序列可以存在于載體中，在 該載體中所述核苷酸序列可操作地連接到調(diào)控序列，使得所述調(diào)控序列能夠通過(guò)適合的宿 主細(xì)胞（如大腸桿菌）表達(dá)所述核苷酸序列，即所述載體是表達(dá)載體。本發(fā)明的載體可以 被轉(zhuǎn)化到上述的適合宿主細(xì)胞中，以表達(dá)具有如本文所定義的編碼人參S0D活性的酶或蛋 白。通常根據(jù)其將被引入的宿主細(xì)胞來(lái)選擇載體（如質(zhì)粒、粘粒、病毒或噬菌體載體、基因 組插入物）。本發(fā)明可以涵蓋發(fā)揮等同功能且本領(lǐng)域已知或可知的其它形式的表達(dá)載體。 一旦轉(zhuǎn)化到所選擇的宿主細(xì)胞中，載體可以不依賴宿主細(xì)胞的基因組而復(fù)制并發(fā)揮功能， 或可以自行整合進(jìn)入基因組。
[0067] 所述載體可以包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，如提供抗生素抗性的基因，如提 供氨芐青霉素抗性、卡那霉素抗性、氯霉素抗性或四環(huán)素抗性的基因。載體可以在體外使 用，例如，用于制備RNA或用于轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。
[0068] 表達(dá)載體可以進(jìn)一步包含能使該載體在所述宿主細(xì)胞中復(fù)制的核苷酸序列。所述 載體可以是PET1 -46系列載體（N0VAGEN公司）、pGEX系列載體、pUC系列載體、pACYC系列 載體、pUB系列載體、pE系列載體、pAMB系列載體和plj系列載體。優(yōu)選為pET系列載體， 最優(yōu)選為pET22b。
[0069] 上述核苷酸序列的檢測(cè)是通過(guò)核苷酸序列測(cè)序儀來(lái)完成，同時(shí)通過(guò)各種分子 生物學(xué)軟件來(lái)分析所得到的基因是否是目的基因。常用分析軟件有GENTYX，Vector NTI，GenDOC，DNAman，也可以借助于BLAST和FASTA進(jìn)行離線和/或在線搜索和檢索分析用 以比對(duì)核苷酸序列和蛋白質(zhì)序列。
[0070] 本文所使用的術(shù)語(yǔ)"酶"與術(shù)語(yǔ)"氨基酸序列"和/或術(shù)語(yǔ)"多肽"和/或術(shù)語(yǔ)"蛋 白"同義。在一些實(shí)例中，術(shù)語(yǔ)"氨基酸序列"與術(shù)語(yǔ)"肽"和/或"酶"同義，可以互為替代 使用。
[0071] 本文所使用的術(shù)語(yǔ)"重組人參S0D"與術(shù)語(yǔ)"融和表達(dá)的重組人參S0D"同義。
[0072] 本文術(shù)語(yǔ)"信號(hào)肽"是根據(jù)所用的序列和/或載體，通過(guò)由宿主細(xì)胞表達(dá)編碼人參 S0D的核苷酸序列所產(chǎn)生的人參S0D可以被分泌出或包含在細(xì)胞內(nèi)。信號(hào)序列可以用于指 導(dǎo)編碼序列分泌通過(guò)特定的細(xì)胞膜。所述信號(hào)序列對(duì)人參S0D編碼序列來(lái)說(shuō)可以是天然的 或外源的?？梢允褂媚軌蛑笇?dǎo)所表達(dá)的人參S0D進(jìn)入所選宿主細(xì)胞（優(yōu)選為大腸桿菌BL21 宿主細(xì)胞）分泌途徑的任何信號(hào)肽編碼序列。
[0073] 用于本發(fā)明任一方法和/或應(yīng)用中的編碼人參S0D的核苷酸序列可以編碼天然的 人參S0D或人參S0D變體。例如，用于本發(fā)明的編碼人參S0D的核苷酸序列可以是中所述 的一種。NCBI這些文獻(xiàn)通過(guò)引用并入本文。
[0074] 本文所用的術(shù)語(yǔ)"人參S0D"優(yōu)選地是指具有催化超氧自由基轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫和產(chǎn) 生氧氣功能的酶。
[0075] 優(yōu)選地，用于本發(fā)明任一方法和/或應(yīng)用中的人參S0D是能夠?qū)⒏鞣N有機(jī)體內(nèi)的 超氧自由基轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫和產(chǎn)生氧氣功能。所述有機(jī)體包括但不限于動(dòng)物、植物和微生 物。首選為動(dòng)物，優(yōu)選為人類。
[0076] 在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，可以將編碼信號(hào)肽的核苷酸序列可操作地連接到編 碼所選人參S0D的核苷酸序列。所選人參S0D可以在本文所定義的宿主細(xì)胞中作為融合蛋 白表達(dá)。
[0077] 本發(fā)明還涵蓋由用于本發(fā)明任一方法和/或應(yīng)用中的編碼人參超氧化物歧化酶 的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列。
[0078] 本發(fā)明提供了一種特別適合在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)的人參超氧化物歧化酶的分 泌肽段編碼序列。該序列是根據(jù)大腸桿菌密碼子偏愛(ài)性等原則而篩選出的。設(shè)計(jì)出的專門(mén) 為rgSOD分泌表達(dá)的編碼序列用常規(guī)方法進(jìn)行全基因合成，或通過(guò)PCR方法實(shí)現(xiàn)的。
[0079] 本文中的術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞"包含本發(fā)明的核苷酸序列或編碼具有如本文定義的特定性 質(zhì)的酶或蛋白的核苷酸序列和/或由其獲得的產(chǎn)物的任何細(xì)胞，其與術(shù)語(yǔ)"生物"和/或術(shù) 語(yǔ)"細(xì)菌"和/或術(shù)語(yǔ)"微生物"和/或術(shù)語(yǔ)"細(xì)菌微生物"同義，互為替換使用。如在背景 技術(shù)所描述的含有編碼天然人參S0D酶的天然核苷酸序列的天然人參植物細(xì)胞也包含在 本文術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞"內(nèi)。
[0080] 與本發(fā)明有關(guān)的術(shù)語(yǔ)"工程細(xì)胞"或"轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞"包括任何包含編碼具有如 本文定義的特定性質(zhì)的酶或蛋白的核苷酸序列和/或由其獲得的產(chǎn)物的細(xì)胞，和/或其中 啟動(dòng)子能夠允許編碼具有如本文定義的特定性質(zhì)的酶或蛋白的核苷酸序列在所述生物內(nèi) 表達(dá)。優(yōu)選核苷酸序列被引入到生物的基因組中。術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)基因生物"不涵蓋在處于自身 天然環(huán)境中并同時(shí)受到其同處于自身天然環(huán)境中的天然啟動(dòng)子控制的天然核苷酸編碼序 列。因此，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因生物包括包含以下任何一種或組合的生物：編碼具有如本文定義 的特定性質(zhì)的酶或蛋白的核苷酸序列、本文定義的構(gòu)建體、本文定義的載體、本文定義的質(zhì) 粒、本文定的細(xì)胞或其產(chǎn)物。例如，所述轉(zhuǎn)基因生物還可以包含編碼具有如本文定義的特定 性質(zhì)的酶或蛋白且受到啟動(dòng)子控制的核苷酸序列，其中所述啟動(dòng)子原本并不與重組人參超 氧化物歧化酶編碼基因相連。
[0081] 在本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方式中，提供一種工程細(xì)胞，其中所述工程細(xì)胞是通過(guò)轉(zhuǎn) 化上述表達(dá)載體進(jìn)入宿主細(xì)胞后獲得的細(xì)菌細(xì)胞。
[0082] 所述宿主微生物可以是原核或真核生物。本發(fā)明的人參S0D或者編碼人參S0D的 核苷酸序列可獲自于，包括但不限于以下屬的細(xì)菌微生物：埃希氏菌屬（Escherichia)、分 枝桿菌屬（Mycobacterium)、鏈球菌屬（Streptococcus)、乳桿菌屬（Lactobacillus)、脫亞 硫酸菌屬 ?esulfitobacterium)、芽抱桿菌屬（Bacillus)、彎曲桿菌屬（Campylobacter)、 弧菌屬（Vibrionaceae)、木桿菌屬（Xylella)、硫化葉菌屬（Sulfolobus)、氣單胞菌 屬（Aeromonas)、鏈霉菌屬（Streptomyces)、酵母菌屬（Saccharomyces)、乳球菌屬 (Lactococcus)、、曲霉屬（Aspergillus)、裂殖酵母屬（Schizosaccharomyces)、李斯特菌 屬（Listeria)、奈瑟氏球菌屬（Neisseria)、中慢生根瘤菌屬（Mesorhizobium)、雷爾氏菌 屬（Ralstonia)、黃單胞菌屬（Xanthomonas)和假絲酵母屬（Candida);優(yōu)選為埃希氏菌屬 (Escherichia).優(yōu)選為埃希氏菌屬（Escherichia)。
[0083]適宜地，本發(fā)明的人參SOD或者編碼人參SOD的核苷酸序列可以獲自于，優(yōu)選 獲自于以下細(xì)菌微生物：大腸桿菌（E.coli)、芽孢桿菌（Bacillussp)、空腸彎曲桿菌 (Campylobacterjejuni)、弧菌（Vibrionaceae)、苛養(yǎng)木桿菌（Xylellafastidiosa)、硫 橫礦硫葉菌（Sulfolobussolfataricus)、釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae)、嗜 水氣單胞菌（Aeromonashydrophila)、殺鮭氣單胞菌（Aeromonassalmonicida)、天藍(lán) 色鏈霉菌（Streptomycescoelicolor)、龜裂鏈霉菌（Streptomycesrimosus)、分枝桿菌 (Mycobacterium)、化胺性鏈球菌（Streptococcuspyogenes)、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis)、青枯雷爾氏菌（Ralstoniasolanacearum)、野油菜黃單胞菌（Xanthomonas campestris)、地毯草黃單胞菌（Xanthomonasaxonopodis)、近平滑假絲酵母（Candida parapsilosis)、嗜熱鏈球菌（Streptococcusthermophilus)、瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus)、脫齒脫亞硫酸菌（Desulfitobacteriumdehalogenans)、土曲霉（Aspergillus terreus)、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe)、無(wú)害李斯特菌（Listeria innocua)、單核細(xì)胞增多性李斯特菌（Listeriamonocytogenes)、腦膜炎奈瑟氏球菌 (Neisseriameningitidis)、百脈根中慢生根瘤菌（Mesorhizobiumloti)。優(yōu)選為大腸桿 菌細(xì)胞，更優(yōu)選為BL21 (ED3)大腸桿菌細(xì)胞。
[0084] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，制備了一些感受態(tài)細(xì)胞以利于體外載體轉(zhuǎn)入到宿主細(xì) 胞中。常用制備感受態(tài)細(xì)胞包括低溫處理。例如16°C。
[0085] 再者，適合用于本發(fā)明的宿主生物也可以為植物。因此，本發(fā)明還涉及產(chǎn)生具有增 強(qiáng)S0D表達(dá)水平的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其包括以下步驟：利用本文定義的人參過(guò)氧化物歧 化酶（尤其是利用包含本文定義的人參過(guò)氧化物歧化酶的表達(dá)載體或構(gòu)建體）轉(zhuǎn)化植物細(xì) 胞，和由轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞培養(yǎng)出植物。
[0086] 在一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的人參S0D可以是可獲自于，優(yōu)選獲自于大腸桿 菌BL21JZY001(分類命名：大腸埃希氏菌，EscherichiaColi)的人參S0D，所述大腸桿菌 菌株JZY001由吉林省金梓源生物技術(shù)有限公司根據(jù)國(guó)際承認(rèn)用于專利程序的微生物保 藏布達(dá)佩斯條約保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心ChinaGeneral MicrobiologicalCultureCollectionCenter(地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3 號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼：1〇〇1〇1)保藏日為2014年09月29日，保藏號(hào)為 CGMCC9743。
[0087] 在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，對(duì)適合本發(fā)明的細(xì)菌微生物的菌種、培養(yǎng)條件、誘導(dǎo) 條件和表達(dá)發(fā)酵條件等進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)性研究，所述條件還包括溶氧、轉(zhuǎn)速和溫度等外部各種 條件。
[0088] 在獲得工程細(xì)胞后，便可在適合的條件下培養(yǎng)工程細(xì)胞。凡適合于大腸桿菌生長(zhǎng)、 表達(dá)的培養(yǎng)基都可用于本發(fā)明。例如，合適的培養(yǎng)基包括但并不限于以下培養(yǎng)基：LB、馬鈴 薯糖瓊脂培養(yǎng)基、豆芽汁培養(yǎng)基、豌豆瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯-蔗糖-瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯-蔗 糖-瓊脂培養(yǎng)基等，優(yōu)選為L(zhǎng)B培養(yǎng)基。
[0089] 溶氧條件都可以控制，適合的溶氧控制在20-90%。溶氧的維持可以用氧氣、空氣 混合氣體的通入來(lái)解決。
[0090] 在另一優(yōu)選例中，本發(fā)明還通過(guò)發(fā)酵工藝優(yōu)化，進(jìn)一步優(yōu)化了rgSOD的表達(dá)條件。 由于表達(dá)水平高，達(dá)到l〇〇mg/L以上，且為可溶性表達(dá)，給純化工藝帶來(lái)極大便利，通過(guò)二 步層析工藝，大幅度提商廣品得率，得到了表達(dá)量商、比活性商、提純方便、得率商和性狀穩(wěn) 定的rgSOD產(chǎn)品，大大降低生產(chǎn)成本，非常適合大規(guī)模生產(chǎn)。
[0091] 在優(yōu)化基因的5'端與3'端分別引進(jìn)特異性酶切位點(diǎn)，用分子克隆的常規(guī)方法， 將優(yōu)化基因克隆入表達(dá)載體（如pET28、pET22等）。然后，轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)宿主細(xì)胞，用 IPTG誘導(dǎo)，搖瓶表達(dá)選出高表達(dá)工程細(xì)胞。
[0092] 在獲得工程細(xì)胞后，便可在適合的條件下培養(yǎng)工程細(xì)胞。凡適合于大腸桿菌生長(zhǎng)、 表達(dá)的培養(yǎng)基都可用于本發(fā)明。例如，合適的培養(yǎng)基包括（但并不限于）以下培養(yǎng)基：
[0093] -種優(yōu)選的搖瓶培養(yǎng)條件是：挑取LB平板上的單克隆，以LB為搖瓶培養(yǎng)液，培養(yǎng) 至0D600,用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)18-21小時(shí)，rgSOD產(chǎn)量可達(dá)50-200mg/L。
[0094] 為了大規(guī)模生產(chǎn)rgSOD，需要在發(fā)酵罐上培養(yǎng)工程細(xì)胞，表達(dá)rgSOD，因此對(duì)大腸 桿菌BL21 (DE3)工程細(xì)胞的中試表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)酵規(guī)模從1L到300L，發(fā)酵能力呈線 性放大。優(yōu)化后表達(dá)量大于400mg/L發(fā)酵物。
[0095] 經(jīng)過(guò)本發(fā)明的反復(fù)實(shí)驗(yàn)，表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化如下：
[0096] 1.對(duì)于培養(yǎng)基的選擇而言，發(fā)酵罐發(fā)酵時(shí)可選擇無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，也可在無(wú)機(jī)鹽培 養(yǎng)基基礎(chǔ)上進(jìn)行一定更改，但所含離子成份宜與無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基相似。
[0097] 2.就溫度的控制而言，rgSOD的發(fā)酵及誘導(dǎo)溫度保持在16-25°C。
[0098] 3.就誘導(dǎo)期的pH值而言，誘導(dǎo)期pH控制在6-8;
[0099] 4.就溶氧（D0)的控制而言，D0控制在20-90%。溶氧的維持可以用氧氣/空氣 混合氣體的通入來(lái)解決。
[0100] 5.就補(bǔ)料的流加而言，補(bǔ)料種類宜包括淀粉、葡萄糖等碳源，可單獨(dú)補(bǔ)料或混合補(bǔ) 料。
[0101] 6.就誘導(dǎo)期IPTG濃度而言，常規(guī)誘導(dǎo)濃度都可用于本發(fā)明，通常IPTG濃度控制在 0.l-lmM/L〇
[0102] 7.就氨芐西林使用量而言，要求100mg-400mg，能夠有效地抑制雜菌生長(zhǎng)。
[0103] 8.就誘導(dǎo)時(shí)間而言，沒(méi)有特別限制，通常為18-21小時(shí)，較佳地為20小時(shí)。
[0104] 在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，從發(fā)酵的細(xì)菌中抽提人參S0D蛋白。該抽提過(guò)程就 是所述的粗提，具體包括收集菌體，離心獲得生物量，破壁溶出蛋白，鹽析、過(guò)濾等步驟。
[0105] 表達(dá)的rgSOD存在于細(xì)胞壁與原生質(zhì)膜之間，表達(dá)水平大于200mg/L發(fā)酵物， 使純化復(fù)雜度大大下降。通常，發(fā)酵樣品先以離心或過(guò)濾等方式收集細(xì)胞，然后用溶菌 酶（4-10mg/g菌體）溶解細(xì)胞壁多糖，使目標(biāo)蛋白進(jìn)入上清液體中，上清液含目的蛋白質(zhì) rgSOD。上清液可通過(guò)鹽析、超濾等方法進(jìn)行初步純化后再進(jìn)行層析純化，也可直接進(jìn)行層 析純化，所述鹽析為用0-60%中性硫酸銨分級(jí)粗提蛋白，超濾用超濾膜進(jìn)行過(guò)濾，例如用截 留分子量為10KD的超濾膜進(jìn)行過(guò)濾。
[0106] 在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，對(duì)粗提后的蛋白進(jìn)行進(jìn)一步純化。層析技術(shù)包括 陽(yáng)離子交換層析、陰離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析、疏水層析、親和層析等技術(shù)。經(jīng)不同層 析技術(shù)、層析過(guò)程比較，優(yōu)化的層析方法包括：1.陰離子交換層析：陰離子交換層析介 質(zhì)包括但不限于Q-Sepharose、DEAE-Sepharose。如果發(fā)酵樣品的鹽濃度較高，影響與離 子交換介質(zhì)的結(jié)合，則在進(jìn)行離子交換層析前需降低鹽濃度。樣品可以用稀釋、超濾、透 析、凝膠過(guò)濾層析等手段進(jìn)行平衡緩沖液的更換，直至與對(duì)應(yīng)的離子交換柱平衡液系統(tǒng) 相似，然后上樣，進(jìn)行鹽濃度或pH的梯度洗脫；2.疏水層析：疏水層析介質(zhì)包括但不限于Phenyl-Sepharose、Butyl-Sepharose、Octyle_Sepharose。樣品通過(guò)添加NaCl、（NH4)2S04 等方式提高鹽濃度，然后上樣，通過(guò)降低鹽濃度方法洗脫。通過(guò)疏水層析除去疏水性有較 大差異的雜蛋白。3?凝膠過(guò)濾層析疏水層析介質(zhì)包括（但不限于）Sephacryl、Superdex、 Sephadex類。通過(guò)凝膠過(guò)濾層析更換緩沖體系，或進(jìn)一步精純。
[0107] 經(jīng)過(guò)上述純化可得到rgSOD純品，純化得率通常為40%以上，純度95%以上，純品 得率約200mg/L培養(yǎng)物。
[0108] 純化后的rgSOD可用常規(guī)方法制成各種劑型，如凍干粉針劑。選擇一定的穩(wěn)定劑， 同時(shí)還可添加表面活性劑、抗氧化劑等保護(hù)劑，及適當(dāng)緩沖液進(jìn)行冷凍干燥。得到的制品具 有活性損失小、水分含量低、穩(wěn)定性好、易于長(zhǎng)期保存等特點(diǎn)。rgSOD還可做成水針劑、噴霧 齊U、微球緩釋劑，以及經(jīng)PEG修飾制成長(zhǎng)效制劑等。
[0109] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，構(gòu)建了rgSOD的BL21(ED3)表達(dá)工程細(xì)胞，IPTG誘導(dǎo)，高 水平分泌表達(dá)rgSOD，不需復(fù)性。
[0110] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)例中，經(jīng)過(guò)發(fā)酵參數(shù)優(yōu)化，提高rgSOD的表達(dá)水平。
[0111] 因表達(dá)蛋白屬于胞外分泌型，不需破菌處理。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)例中，經(jīng)過(guò)純 化，得到rgSOD純品，純化得率50 %以上，純度95 %以上，純品得率約200mg/L培養(yǎng)物。
[0112] 在本發(fā)明又一個(gè)實(shí)施方式中，純化后原液加入適當(dāng)輔料，制成rgSOD的注射用粉 針劑。穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，該粉針劑穩(wěn)定。
[0113] 優(yōu)選地，所述孵育溫度和孵育時(shí)間的組合可以有效保證至少5%的S0D活性，優(yōu)選 至少 10% 的S0D活性，優(yōu)選至少 15%、20%、25%、26%、28%、30%、40%、50%、60% 或 75% 的酶或蛋白活性。
[0114] 在再一個(gè)實(shí)施方式中，樣品經(jīng)10KD膜包超濾濃縮置換緩沖液、QSepharose F.F.以及phenylsepharoseF.F.層析以后得到純度大于95%、得率在50%以上的純品。
[0115] 綜上所述，在一個(gè)完整的【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明提供了一種制備重組人參超氧 化物歧化酶的方法，其中，所述方法包括如下步驟：
[0116]a)將如下的任一核苷酸序列克隆入表達(dá)載體pET22b的步驟，所述的核苷酸序列 為：SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列，和/或SEQIDN0. 3所示的核苷酸序列，或SEQID NO. 5所示的核苷酸序列；
[0117]b)將所述表達(dá)載體pET22b轉(zhuǎn)入到宿主細(xì)胞大腸桿菌BL21 (ED3)細(xì)胞的步驟；
[0118]c)將宿主細(xì)胞大腸桿菌BL21 (ED3)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)步驟，培養(yǎng)條件包括：培養(yǎng)分為 培養(yǎng)階段和誘導(dǎo)階段，培養(yǎng)階段培養(yǎng)菌液濃度達(dá)到0D600,誘導(dǎo)時(shí)間為18-21hr，發(fā)酵及誘 導(dǎo)溫度保持在16_25°C，誘導(dǎo)期IPTG濃度在0. 1-0. 2mM/L;
[0119]d)分離純化出融核表達(dá)的重組人參超氧化物歧化酶的步驟，對(duì)發(fā)酵樣品通過(guò)離心 和/或過(guò)濾方式收集菌體，用溶菌酶lmg/g菌體，在37°C條件下，處理2小時(shí)，再通過(guò)離心獲 得清液；
[0120] e)通過(guò)鹽析和/或超濾進(jìn)行初步純化步驟，所述鹽析為用0-60 %中性硫酸銨分級(jí) 粗提蛋白，超濾用超濾膜進(jìn)行過(guò)濾，所述超濾膜為截留分子量為10KD的超濾膜；
[0121]f)通過(guò)陰離子交換、疏水層析方法，從而獲得純度達(dá)到95-99. 9%的重組人參超 氧化物歧化酶的步驟。
[0122] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，提供使用上述方法制備的人參SOD在制備治療與 人超氧化物歧化酶相關(guān)疾病或病理癥狀的藥物、食品、保健品及其化妝品中的用途。所述重 組人參超氧化物歧化酶含有任一如下氨基酸序列 ：
[0123]a)SEQIDN0. 2所示氨基酸序列；和/或
[0124]b)SEQIDN0. 4所示氨基酸序列；或
[0125]c)SEQIDN0.6所示氨基酸序列。
[0126] 上述相關(guān)疾病或病理癥狀包括但不限于：白內(nèi)障、退化性眼底病變，新生兒視網(wǎng)膜 病變、異位性皮膚炎、色素沉著黑斑、老人斑、皮膚過(guò)敏、高血壓、動(dòng)脈硬化、心肌梗塞、心肌 無(wú)力、心律不整、鼻子過(guò)敏、氣喘、肺氣腫、肺纖維化、成人呼吸窘迫癥、老年癡呆、帕金森氏 癥、腦循環(huán)障礙、鐮刀型貧血、蠶豆癥、鉛中毒、腎臟病、蛋白尿、膀胱炎、攝護(hù)腺肥大、腎絲球 發(fā)炎、便秘、口臭、糖尿病及共并發(fā)癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、癌癥、化療副作用手術(shù)、器官移植、肝 炎、更年期、衰老?。╝ging,老化）等。
[0127] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā) 明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī) 條件，例如Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（NewYork:ColdSpringHarborLaboratory Press, 1989) ;Jan-ChristerJanson等，ProteinPurification(JohnWiley&Sonss,Inc., 1998)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0128] 實(shí)施例
[0129] 實(shí)施例1.rgSOD大腸桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建：
[0130] 分泌肽段基因參考大腸桿菌K12菌株分泌蛋白和SEQIDN0:2(圖2)所示膜蛋白 信號(hào)肽設(shè)計(jì)，并全基因合成的，其序列如SEQIDN0 :1所示的DNA片段（圖1)。其中用于 編碼本發(fā)明信號(hào)肽的核苷酸序列與其演繹的本發(fā)明信號(hào)肽的氨基酸序列見(jiàn)圖7。同時(shí)在其 5'端引入Ndel酶切位點(diǎn)。如SEQIDN0 :4所示天然人參超氧化物歧化酶的氨基酸序列 (圖4)和SEQIDN0 :3所示核苷酸序列是已知的（圖3)，如NCBI的Genbank登陸號(hào)分別為 AF034630. 1和AAB87572,目的基因的獲得是根據(jù)天然人參超氧化物歧化酶的氨基酸序列， 用常規(guī)基因合成法，在人參超氧化物歧化酶的氨基酸序列的5'端引入分泌肽段基因，并在 人參超氧化物歧化酶的氨基酸序列的3'端引入Xhol酶切位點(diǎn)，該基因SEQIDN0 :5(圖 5)編碼分泌肽-人參超氧化物歧化酶氨基酸序列如SEQIDN0 :6所示（圖6)。用于編碼 本發(fā)明融和表達(dá)的重組人參S0D的核苷酸序列及其演繹的本發(fā)明融和表達(dá)的重組人參S0D 的氣基酸序列對(duì)應(yīng)關(guān)系見(jiàn)圖8。
[0131] 表達(dá)質(zhì)粒pET-rgSOD的構(gòu)建及高表達(dá)工程細(xì)胞的獲得構(gòu)建過(guò)程如圖9所示。合 成的分泌肽-超氧化物歧化酶全基因用Ndel+Xhol內(nèi)切酶（來(lái)源于NEBBiolab)酶切，同 時(shí)將載體pET22b用相同的Ndel+Xhol進(jìn)行酶切，然后用NEBTAKARADNA連接酶（solution 1，TAKARA，中國(guó)大連）連接入pET22b載體中，得到pET-rgSOD，測(cè)序證實(shí)DNA序列正確無(wú) 誤。然后，將pET-rgSOD質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中，在37°C條件下，用IPTG誘導(dǎo) 4小時(shí)后確定表達(dá)人參超氧化物歧化酶（圖10)。
[0132] 實(shí)施例2溫度對(duì)rgSOD表達(dá)水平的影響
[0133] 取單克隆，接種到LB-級(jí)種子液中，培養(yǎng)17-20hr;取3只50mL培養(yǎng)管，按1 : 50 的比例分別接種于三只5mL培養(yǎng)基的50mL培養(yǎng)管中，培養(yǎng)4hr左右，ImM/LIPTG誘導(dǎo)，誘導(dǎo) 溫度分別為16 °C、25 °C、37 °C，收集菌體，用溶菌酶在37 °C條件下，處理2小時(shí)，15000rpm離 心10分鐘，取上清，SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在搖瓶中表達(dá)rgSOD在16°C、 25°C都幾乎差不多，然而37°C表達(dá)分泌蛋白相對(duì)較少（圖11)。
[0134] 實(shí)施例3IPTG濃度對(duì)rgSOD表達(dá)水平的影響
[0135] 取單克隆，接種到LB-級(jí)種子液中，培養(yǎng)17_20hr;按1 : 50的比例分別接種于5 只裝有5mL培養(yǎng)基的50mL培養(yǎng)管中，37°C培養(yǎng)4hr左右，冷卻到20°C，分別加入IPTG，使培 養(yǎng)基中濃度為〇. 6mM、0. 4mM、0. 2mM、0.ImM誘導(dǎo)，收集菌體，用溶菌酶在37°C條件下，處理2 小時(shí)，15000rpm離心10分鐘，取上清，SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，幾個(gè)梯度濃 度IPTG誘導(dǎo)rgSOD表達(dá)量差不多，用0.ImM的IPTG濃度誘導(dǎo)比較經(jīng)濟(jì)，節(jié)約成本（圖12)。
[0136] 實(shí)施例4.中試發(fā)酵條件選擇及優(yōu)化NBSBioFlo3000發(fā)酵罐（6. 5L)經(jīng)過(guò)上述優(yōu) 化后，rgSOD表達(dá)量約為300mg/L發(fā)酵液，表達(dá)量明顯增加（圖13)。
[0137] 實(shí)施例5.rgSOD純化實(shí)施例4的發(fā)酵物4°C下5000rpm離心10分鐘，收集菌體，用 溶菌酶溶解菌體，溶解酶使用量為lmg/g菌體，37°C溫浴2小時(shí)。離15000rpm離心去除菌 體，收集澄清液。使用Millipore超濾器，超濾膜截流分子量為10KD，超濾時(shí)留取回流液。 上清超濾至體積剩下500ml左右，加入以10mM磷酸鹽緩沖液（PB，pH7. 4)，繼續(xù)超濾；反復(fù) 此程序，直至樣品的電導(dǎo)水平和10mMPB(pH7. 4)緩沖液的電導(dǎo)水平接近。
[0138] 陰離子交換層析：層析介質(zhì)：QSepharoseF.F. (Phamarcia)緩沖液：溶液A:10mM PBS(pH7. 4)，溶液B:10mMPB+1MNaCl(pH7. 4)上樣：將超濾濃縮的rgSOD溶液（1L左右， 電導(dǎo)為4000uS/cm左右）上樣清洗：上樣后用6CV(柱體積，下同）的溶液A清洗層析柱梯 度：清洗后直接用30%溶液B洗脫目標(biāo)蛋白收集：收集30%B洗脫下的蛋白層析。
[0139]疏水層析：phenyl-sepharose(Phamarcia)緩沖液：溶液A: 10mMPBS(pH7. 4)，溶 液C:10mMPB+3MNaCl(pH7. 4)上樣：將層析1得到的樣品加入固體NaCl至3. 0M，上樣梯 度：1〇〇%A直接清洗收集：收集100%A洗下的目的蛋白樣品經(jīng)過(guò)此2步層析，即陰離子交 換層析、疏水層析以后，純度提高至95% (圖14)、得率在50%以上的rgSOD純品，純品得率 200mg/L培養(yǎng)物。
[0140] S0D的活力測(cè)定方法
[0141] 改良的鄰苯三酚自氧化法簡(jiǎn)單易行，較為實(shí)用?；瘜W(xué)發(fā)光法和光化學(xué)擴(kuò)增法不適 用于測(cè)定Mn-S0D，但對(duì)于Cu/Zn-S0D反應(yīng)極靈敏。Cyte還原法用于Mn-S0D活力測(cè)定結(jié)果 穩(wěn)定，重復(fù)性好。但專一性和靈敏度不夠理想，而且需要特殊儀器，實(shí)際應(yīng)用受到限制。亞 硝酸鹽形成法與CN-抑制劑或SDS處理相結(jié)合，應(yīng)用于Mn-S0D測(cè)定，靈敏度比Cyte還原法 提高數(shù)倍，而且專一性強(qiáng)，重復(fù)性好，操作方便，不需要特殊儀器和設(shè)備，易于實(shí)際應(yīng)用和推 廣，是目前較好的測(cè)定方法之一。通常情況下，S0D酶活性測(cè)定只能應(yīng)用間接活性測(cè)定法。 根據(jù)S0D國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，本公司采用改良Marklund法，即鄰苯三酚自氧化方法。
[0142] 1定義：25°C時(shí)抑制鄰苯三酚自氧話速率50%時(shí)所需要的S0D量為一個(gè)活力單位。
[0143] 2原理：在堿性條件下，鄰苯三酚會(huì)發(fā)生自氧化，可根據(jù)S0D抑制鄰苯三酚自氧化 能力測(cè)定S0D活力。
[0144] 3試劑：A液：pH8.200.lmol/L三槍甲基氨基甲烷（Tris)-鹽酸緩沖液（內(nèi)含 lmmol/LEDTA.2Na)。稱取 1.214gTris和 37.2mgEDTA.2Na溶于 62.4mL0.1mol/L鹽 酸溶液中，用蒸饋水定容至l〇〇ml。B液：4. 5mmol/L鄰苯三酚鹽酸溶液。稱取鄰苯三酚 (A.R) 56. 7mg溶于少量lOmmol/L鹽酸溶于，并定容至lOOmL。
[0145] 4儀器：紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，機(jī)密酸度計(jì)，精確度0.OlpH，離心機(jī)，10mL比色 皿，10mL離心管，玻璃乳缽。
[0146] 5樣品的制備：
[0147] 6分析步驟：鄰苯三酚自氧化速率測(cè)定，在25°C左右，于10mL比色皿中一次加入A 液2. 35mL，蒸餾水2mL，B液0. 15mL。加入B液立即混合并傾入比色皿，分別測(cè)定在325波 長(zhǎng)條件下初始和lmin后吸光值，二者之差即鄰苯三酚自氧化速率AA^OnirT1).本試驗(yàn)確 定AAmOnirT1)為0. 060。S0D活性測(cè)定加樣程序表如下：
[0148]

【權(quán)利要求】
1. 一種重組人參超氧化物歧化酶，其特征在于，所述人參超氧化物歧化酶包含任一如 下氨基酸序列： a) SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列；和/或 b) SEQ ID NO. 4所示氨基酸序列；或 c) SEQ ID NO. 6所示氨基酸序列。
2. 分離的核酸分子，其特征在于，所述分離的核酸分子包含任一如下核苷酸序列： a) 編碼SEQ ID NO:2的氨基酸序列的SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；和/或 b) 編碼SEQ ID N0:4的氨基酸序列的SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列；或 c) 編碼SEQ ID N0:6的氨基酸序列的SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列。
3. -種重組人參超氧化物歧化酶，其特征在于，所述人參超氧化物歧化酶通過(guò)表達(dá)任 一以下所示的核苷酸序列而獲得： a) 編碼SEQ ID NO:2的氨基酸序列的SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；和/或 b) 編碼SEQ ID N0:4的氨基酸序列的SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列；或 c) 編碼SEQ ID N0:6的氨基酸序列的SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列。
4. 一種表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體含有任一如下核苷酸序列： a) SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；和/或 b) SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列；或 c) SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列。
5. 如權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體為pET22b。
6. -種工程細(xì)胞，其特征在于，所述工程細(xì)胞是通過(guò)轉(zhuǎn)化權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體 進(jìn)入宿主細(xì)胞后獲得的細(xì)菌細(xì)胞。
7. 如權(quán)利要求5所述的工程細(xì)胞，其特征在于，所述工程細(xì)胞為大腸桿菌BL21(ED3)細(xì) 胞。
8. -種制備重組人參超氧化物歧化酶的方法，其特征在于，所述方法包括： a) 將權(quán)利要求3所述的任一核苷酸序列克隆入表達(dá)載體pET22b的步驟； b) 將所述表達(dá)載體pET22b轉(zhuǎn)入到宿主細(xì)胞大腸桿菌BL21(ED3)細(xì)胞的步驟； c) 將宿主細(xì)胞大腸桿菌BL21(ED3)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)步驟，培養(yǎng)條件包括：培養(yǎng)分為培養(yǎng) 階段和誘導(dǎo)階段，培養(yǎng)階段培養(yǎng)菌液濃度達(dá)到0D600,誘導(dǎo)時(shí)間為18-21hr，發(fā)酵及誘導(dǎo)溫 度保持在16-25°C，誘導(dǎo)期IPTG濃度在0. 1-0. 2mM/L ; d) 分離純化出融核表達(dá)的重組人參超氧化物歧化酶的步驟，對(duì)發(fā)酵樣品通過(guò)離心和/ 或過(guò)濾方式收集菌體，用溶菌酶lmg/g菌體，在37°C條件下，處理2小時(shí)，再通過(guò)離心獲得清 液； e) 通過(guò)鹽析和/或超濾進(jìn)行初步純化步驟，所述鹽析為用0-60%中性硫酸銨分級(jí)粗提 蛋白，超濾用超濾膜進(jìn)行過(guò)濾，所述超濾膜為截留分子量為10KD的超濾膜； f) 通過(guò)陰離子交換、疏水層析方法，從而獲得純度達(dá)到95-99. 9 %的重組人參超氧化 物歧化酶的步驟。
9. 重組人參超氧化物歧化酶在制備治療與人超氧化物歧化酶相關(guān)疾病或病理癥狀的 藥物、食品、保健品及其化妝品中的用途。
10. 如權(quán)利要求8所述的方法或權(quán)利要求10所述的用途，其特征在于，所述重組人參超 氧化物歧化酶含有任一如下氨基酸序列： a) SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列；和/或 b) SEQ ID NO. 4所示氨基酸序列；或 c) SEQ ID NO. 6所示氨基酸序列。
【文檔編號(hào)】C12N15/70GK104342409SQ201410535835
【公開(kāi)日】2015年2月11日 申請(qǐng)日期:2014年10月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月17日
【發(fā)明者】劉爽, 鄧小霞, 龐玉, 王子華, 孫曉悅 申請(qǐng)人:吉林省金梓源生物科技有限公司