的方法
【專利摘要】基于三重信標(biāo)修飾的金納米粒子三聚體的表面增強(qiáng)拉曼散射效應(yīng)檢測水溶液中Hg2+和/或Ag+的方法，屬于重金屬離子的檢測【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明包括通過制備BPS包裹的金納米粒子、設(shè)計(jì)核酸探針、信標(biāo)分子的修飾和重金屬離子Hg2+和/或Ag+的檢測等步驟。本發(fā)明提供了一種基于三重信標(biāo)修飾的金納米粒子三聚體的拉曼信號來檢測水溶液中二價(jià)汞離子和/或銀離子的方法，并且可以做到同時(shí)檢測這兩種離子，此種方法工作量少，節(jié)約成本，靈敏度高，方便快捷。
【專利說明】基于三重信標(biāo)修飾的金納米粒子三聚體的表面增強(qiáng)拉曼散 射效應(yīng)檢測水溶液中Hg2+和/或Ag+的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基于三重信標(biāo)修飾的金納米粒子三聚體的表面增強(qiáng)拉曼散射效應(yīng)來 同時(shí)檢測水溶液中二價(jià)汞離子和/或銀離子的方法，屬于重金屬離子的檢測【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 二價(jià)汞離子和銀離子是兩種主要的有毒重金屬離子，對環(huán)境有著嚴(yán)重的影響并且 對人類的健康有著嚴(yán)重的危害。汞離子可以通過食物鏈富集并且不能通過代謝系統(tǒng)排出， 可以引起心臟，肝，大腦，和其他器官的永久性損傷。并且，銀離子對水生生物也有很大的毒 性。對于汞離子和銀離子的檢測已經(jīng)做出了很大的努力。傳統(tǒng)的檢測方法例如冷凍蒸發(fā)原 子吸收光譜，色譜，和電感耦合等離子質(zhì)譜光譜已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用。然而，這些方法費(fèi)時(shí)費(fèi) 力并且成本高。由于汞離子和銀離子可以特異性的結(jié)合胸腺嘧啶和腺嘌呤堿基形成很強(qiáng)很 穩(wěn)定的T-Hg 2+-T和C-Ag+-C,近些年大量的基于DNA的汞離子和銀離子檢測方法被大量的 發(fā)明。盡管這些傳感方法有很高的靈敏度和特異性，但是大部分都是單重檢測。然而汞離 子和銀離子在環(huán)境中經(jīng)常同時(shí)存在，發(fā)明一種同時(shí)檢測這兩種離子的檢測方法是很有必要 的。由于簡單的樣品前處理方法和超高的靈敏度，表面增強(qiáng)拉曼光譜已經(jīng)作為一種分析技 術(shù)被廣泛的應(yīng)用于化學(xué)和生物傳感。相比于廣泛應(yīng)用的熒光分析方法，在非特定的激光激 發(fā)后，表面增強(qiáng)拉曼散射可以提供特殊分子的指紋圖譜并且金屬粒子周圍的拉曼信標(biāo)可以 保持光穩(wěn)定性。這些優(yōu)點(diǎn)使表面增強(qiáng)拉曼散射成為熒光的一個(gè)很好的替代者，尤其在多重 檢測中。本發(fā)明建立了一種新的基于金納米粒子組裝后的表面增強(qiáng)拉曼散射光譜的生物傳 感器，是一種快速、靈敏、特異性的汞離子和銀離子的多重檢測法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供一種基于三重信標(biāo)修飾的金納米粒子三聚體的表面增強(qiáng)拉 曼散射效應(yīng)來同時(shí)檢測水溶液中二價(jià)汞離子和/或銀離子的方法。
[0004] 本發(fā)明的技術(shù)方案，基于三重信標(biāo)修飾的金納米粒子三聚體的表面增強(qiáng)拉曼散射 效應(yīng)來同時(shí)檢測水溶液中二價(jià)汞離子和/或銀離子的方法，具體步驟為： (一）檢測方法的建立 (1)二水合雙(對-磺酰苯基)苯基膦化二鉀鹽（BPS)包裹的20nm金納米粒子的制備：取 150mL錐形瓶和配套的轉(zhuǎn)子，用新鮮配制的王水浸泡24h并用超純水沖洗三次，烘干備用； 取97. 5mL的超純水放入洗滌潔凈的錐形瓶中，在瓶口蓋上保鮮膜防止外界灰塵進(jìn)入；然后 將裝好超純水的瓶子放在可加熱的磁力攪拌儀上，將溫度調(diào)至450°C，調(diào)轉(zhuǎn)速800 r/min， 邊加熱邊攪拌；2 min后加入2. 5mL 4g/L的氯金酸溶液,繼續(xù)加熱至沸騰；迅速加入I. 8mL 10mg/mL的檸檬酸三鈉，觀察溶液顏色變化，待溶液變?yōu)榫萍t色后將溫度調(diào)至250°C繼續(xù) 煮沸20min ;將加熱完畢的溶液降至室溫后濃縮十倍用超純水重懸，加入二水合雙(對-磺 酰苯基）苯基膦化二鉀鹽溶液至終濃度為10mg/mL，振蕩過夜，8000r/min離心10 min,用 0. 5 X TBE重懸，放置在4°C備用，BPS包裹后的Au納米粒子記為AuNP ; (2) 檢測用的核酸探針的設(shè)計(jì)與合成： 巰基修飾的單鏈核酸探針： DNA 1 :5' -SH-TCAGACGTTT TTT-3'， DNA 2 :5' -SH-TCAGGATCCC CCC-3'， DNA 3 :5' -SH-TCAGAGCTTG CGTCATGAGA CGCTCCCCCC ATC -3'， 未做任何修飾的單鏈核酸探針： DNA 4 :5' -GTAGCGAGAT GACGCAAGCT-3'， DNA 5 :5' -AGCGTGAGGC TACTTTTTTC GT-3'， 首先制備金納米粒子和核酸的偶聯(lián)物：把AuNP分別和DNAl，DNA2, DNA3按摩爾終濃度 為I : 1的比例混合在一起，反應(yīng)Ih后加入NaCl溶液至終濃度為50mM，混合均勻反應(yīng)過 夜；形成 AuNP-DNAl，AuNP-DNA2, AuNP-DNA3 ;接下來 DNA4 與 DNA5 和 AuNP-DNA3 按摩爾終濃 度為2 : 2 : 1的比例混合，加入NaCl至終濃度為50mM，放置在95°C水浴鍋中5min，然后 37°C放置8h，離心除去未雜交的DNA，即得到連有金納米粒子的"Y"形DNA骨架AuNP-DNAY ; (3) 信標(biāo)分子的修飾：分別把AuNP-DNAl，AuNP-DNA2, AuNP-DNAY分別與終濃度為5 μ M 的ATP，MATT，NTP信標(biāo)混合，室溫反應(yīng)8h ;然后將修飾了 ATP的AuNP-DNAl和/或修飾了 MATT的AuNP-DNA2與修飾了 NTP的AuNP-DNAY按體積I : I : 1或I : 1的比例混合，即 制備得到檢測用的拉曼探針溶液； (二）重金屬離子Hg2+和/或Ag+的檢測 (4) Ag+的檢測：25nM信標(biāo)分子修飾過的AuNP-DNAY和AuNP-DNA2按體積I : 1混合， 緩沖體系為〇. 5XTBE，終濃度為50mM的NaNO3溶液；含不同濃度的Ag+水溶液（0-0. 5ng/ mL)加入到上述檢測體系中，并在室溫下反應(yīng)lh，使Ag+誘導(dǎo)的DNA雜交反應(yīng)進(jìn)行完全，然 后測定樣品體系的拉曼信號； (5) Hg2+的檢測：檢測方法和步驟（4)類似，只是將AuNP-DNA2換成AuNP-DNAl，Ag+溶 液換成Hg 2+溶液，即經(jīng)過信標(biāo)分子修飾的25nM的AuNP-DNAY和AuNP-DNAl按體積I : 1混 合，緩沖體系為〇. 5XTBE，終濃度為50mM的NaNO3溶液；含0-0. 5ng/mL不同濃度的Hg2+水 溶液加入到上述檢測體系中，并在室溫下反應(yīng)lh，使Hg2+誘導(dǎo)的DNA雜交反應(yīng)進(jìn)行完全，然 后測定樣品體系的拉曼信號； (6) Ag+和Hg2+同時(shí)檢測：檢測方法和步驟（4)類似，只是檢測體系多添加 AuNP-DNAl， 并將Ag+溶液換成Ag+和Hg2+的混合溶液，即經(jīng)過信標(biāo)分子修飾的25nM的AuNP-DNAY與 AuNP-DNAl和AuNP-DNA2按體積I : I : 1混合，緩沖體系為0. 5XTBE，終濃度為50mM的 NaNO3溶液；含0-0. 5ng/mL不同濃度的Ag+和0-0. 5ng/mL Hg2+水溶液加入到上述檢測體系 中，并在室溫下反應(yīng)lh，使Ag+和Hg 2+誘導(dǎo)的DNA雜交反應(yīng)進(jìn)行完全，然后測定樣品體系的 拉曼信號。
[0005] Ag+和Hg2+的計(jì)算定量方法如表1所示。
[0006] 表 1 Iltl8tl dOSOcnr1處的拉曼強(qiáng)度；

【權(quán)利要求】
1.基于三重信標(biāo)修飾的金納米粒子三聚體的表面增強(qiáng)拉曼散射效應(yīng)來同時(shí)檢測水溶 液中二價(jià)汞離子和/或銀離子的方法，其特征在于步驟為： (一） 檢測方法的建立： (1) 二水合雙(對-磺酰苯基)苯基膦化二鉀鹽BPS包裹的20nm金納米粒子的制備：取 150mL錐形瓶和配套的轉(zhuǎn)子，用新鮮配制的王水浸泡24h并用超純水沖洗三次，烘干備用； 取97. 5mL的超純水放入洗滌潔凈的錐形瓶中，在瓶口蓋上保鮮膜防止外界灰塵進(jìn)入；然后 將裝好超純水的瓶子放在可加熱的磁力攪拌儀上，將溫度調(diào)至450°C、調(diào)轉(zhuǎn)速800r/min，邊 加熱邊攪拌；2 min后加入2. 5mL 4g/L的氯金酸溶液，繼續(xù)加熱至沸騰；迅速加入1.8 mL 10mg/mL的檸檬酸三鈉，觀察溶液顏色變化，待溶液變?yōu)榫萍t色后將溫度調(diào)至250°C繼續(xù) 煮沸20min ;將加熱完畢的溶液降至室溫后濃縮十倍用超純水重懸，加入二水合雙(對-磺 酰苯基）苯基膦化二鉀鹽溶液至終濃度為10mg/mL，振蕩過夜，8000 r/min離心lOmin，用 0. 5XTBE重懸，放置在4°C備用，BPS包裹后的Au納米粒子記為AuNP ; (2) 檢測用的核酸探針的設(shè)計(jì)與合成： 巰基修飾的單鏈核酸探針： DNA 1 :5' -SH-TCAGACGTTT TTT-3'， DNA 2 :5' -SH-TCAGGATCCC CCC-3'， DNA 3 :5' -SH-TCAGAGCTTG CGTCATGAGA CGCTCCCCCC ATC -3'， 未做任何修飾的單鏈核酸探針： DNA 4 :5' -GTAGCGAGAT GACGCAAGCT-3'， DNA 5 :5' -AGCGTGAGGC TACTTTTTTC GT-3'， 首先制備金納米粒子和核酸的偶聯(lián)物：把AuNP分別和DNA1，DNA2, DNA3按摩爾終濃度 為1 : 1的比例混合在一起，反應(yīng)lh后加入NaCl溶液至終濃度為50mM，混合均勻反應(yīng)過 夜；形成 AuNP-DNAl，AuNP-DNA2, AuNP-DNA3 ;接下來 DNA4 與 DNA5 和 AuNP-DNA3 按摩爾終濃 度為2 : 2 : 1的比例混合，加入NaCl至終濃度為50mM，放置在95°C水浴鍋中5min，然后 37°C放置8h，離心除去未雜交的DNA，即得到連有金納米粒子的"Y"形DNA骨架AuNP-DNAY ; (3) 信標(biāo)分子的修飾：分別把AuNP-DNAl，AuNP-DNA2, AuNP-DNAY分別與終濃度為5 μ Μ 的4-氨基苯硫酚ATP，4-硝基苯硫酚MATT，4-甲氧基芐硫醇ΝΤΡ信標(biāo)混合，室溫反應(yīng)8h，然 后將修飾了 ATP的AuNP-DNAl和/或修飾了 MATT的AuNP-DNA2與修飾了 NTP的AuNP-DNAY 按體積1 : 1 : 1或1 : 1的比例混合，即制備得到檢測用的拉曼探針溶液； (二） 重金屬離子Hg2+和/或Ag+的檢測： (4) Ag+的檢測：25nM經(jīng)過信標(biāo)分子修飾的AuNP-DNAY和AuNP-DNA2按體積1 : 1混 合，緩沖體系為〇. 5XTBE，終濃度為50mM的NaN03溶液；含0-0. 5ng/mL不同濃度的Ag+水 溶液加入到上述檢測體系中，并在室溫下反應(yīng)lh,使Ag+誘導(dǎo)的DNA雜交反應(yīng)進(jìn)行完全，然 后測定樣品體系的拉曼信號； (5) Hg2+的檢測：檢測方法和步驟（4)類似，將AuNP-DNA2換成AuNP-DNAl, Ag+溶液換 成Hg2+溶液，即經(jīng)過信標(biāo)分子修飾的25nM的AuNP-DNAY和AuNP-DNAl按體積1 : 1混合， 緩沖體系為〇. 5XTBE，終濃度為50mM的NaN03溶液；含0-0. 5ng/mL不同濃度的Hg2+水溶 液加入到上述檢測體系中，并在室溫下反應(yīng)lh，使Hg2+誘導(dǎo)的DNA雜交反應(yīng)進(jìn)行完全，然后 測定樣品體系的拉曼信號； (6) Ag+和Hg2+同時(shí)檢測：檢測方法和步驟（4)類似，只是檢測體系多添加 AuNP-DNAl， 并將Ag+溶液換成Ag+和Hg2+的混合溶液，即經(jīng)過信標(biāo)分子修飾的25nM的AuNP-DNAY與 AuNP-DNAl和AuNP-DNA2按體積1 : 1 : 1混合，緩沖體系為0. 5XTBE，終濃度為50mM的 NaN03溶液；含0-0. 5ng/mL不同濃度的Ag+和0-0. 5ng/mL Hg2+水溶液加入到上述檢測體系 中，并在室溫下反應(yīng)lh，使Ag+和Hg2+誘導(dǎo)的DNA雜交反應(yīng)進(jìn)行完全，然后測定樣品體系的 拉曼信號。
【文檔編號】C12Q1/68GK104263837SQ201410535765
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年10月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月13日
【發(fā)明者】匡華, 李斯, 胥傳來, 徐麗廣, 馬偉, 劉麗強(qiáng), 宋珊珊, 吳曉玲 申請人:江南大學(xué)